WO2023224108A1 - ヌクレオシド誘導体及びその利用 - Google Patents

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WO2023224108A1
WO2023224108A1 PCT/JP2023/018672 JP2023018672W WO2023224108A1 WO 2023224108 A1 WO2023224108 A1 WO 2023224108A1 JP 2023018672 W JP2023018672 W JP 2023018672W WO 2023224108 A1 WO2023224108 A1 WO 2023224108A1
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WO
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group
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hydroxyl
sirna
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PCT/JP2023/018672
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義仁 上野
瞭平 梶野
徳宏 茶野
泰宏 古市
美和 河出
侑里 柿澤
修一 坂本
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株式会社GF・Mille
国立大学法人東海国立大学機構
公益財団法人微生物化学研究会
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • siRNA is an RNA interference agent that uses RNA interference, and antisense nucleic acid (ASO) that uses RNaseH interaction. It is being developed.
  • Patent Document 1 In order to effectively suppress gene expression using these drugs, in addition to the selection of the target site, the ability of the drug to hybridize with the target RNA, nuclease resistance, and cell membrane permeability is required, as well as the drug's specific gene The ability to suppress gene expression based on the expression suppressing effect is required.
  • Patent Document 1 Various modifications to the skeleton have been attempted in order to increase the effectiveness of such drugs.
  • the present inventors have so far investigated modifications of the aminoalkyl group to the 4'-position carbon atom of ribose and various modifications to the 5'-position carbon atom.
  • the aminoalkyl modification at the 4' position has excellent cell membrane permeability and nuclease resistance, but its ability to form a double strand with the target RNA is reduced due to its N-type and S-type compatibility. .
  • the present specification provides nucleoside derivatives and RNA agents using the nucleoside derivatives.
  • the present inventors attempted to introduce a certain aminoalkyl group to the 5'-position carbon atom of ribose, and as a result of various studies, they were able to obtain an S form at the 5'-position. It has been found that when such S-forms are used as siRNA introduction species, they surprisingly exhibit high affinity for target RNA and also exhibit excellent nuclease resistance. It has been difficult to predict such effects for the S form.
  • the siRNA when the S-form was introduced into the 5' terminal region of the passenger strand, the siRNA exhibited excellent nuclease resistance and gene expression suppression ability. This specification provides the following means based on these findings.
  • a nucleoside derivative A derivative represented by the following formula (1).
  • R 1 represents a hydroxyl group, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a protected hydroxyl group
  • R 5 R 6 (n represents 0 or 1, R 5 and R 6 are the same or different, and a hydrogen atom, Indicates any of a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, a mercapto group, a protected mercapto group, a lower alkoxy group, a cyano-lower alkoxy group, an amino group, or a substituted amino group.However, when n is 1, R 5 and R 6 are not both hydrogen atom, a protecting group
  • R 4 represents a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, an azide group, or NHR 7
  • R 7 represents a hydrogen atom or a protecting group for an amino group
  • B represents a purine base or a pyrimidine base.
  • R 1 represents a hydroxyl group or a hydroxyl group in which the hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group
  • X 1 represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • X 2 represents OH (or -), SH (or S-)
  • B represents a purine base or a pyrimidine base.
  • R 1 represents a hydroxyl group or a hydroxyl group in which the hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group
  • X 1 represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • X 2 represents OH (or - ), SH (or S - )
  • B represents a purine base or a pyrimidine base.
  • a passenger strand of siRNA comprising
  • a compound represented by the following formula (4) (In the above formula (4), R 7 represents an acetyl group or a cyclic structure in which oxygen atoms bonded to each other and bonded to R 7 are connected by -C(CH 3 ) 2 -, and R 8 is a hydrogen atom or ( R9 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group, and R10 represents a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, or an azide group.)
  • a method for synthesizing a nucleoside derivative represented by formula (1) comprising: A synthetic method comprising the step of introducing a purine base or a pyrimidine base into the 1'-position carbon atom of an intermediate represented by the following formula (4).
  • R 7 represents an acetyl group
  • R 8 represents a hydroxyl group-protecting group
  • R 9 represents a hydroxyl group-protecting group
  • R 10 represents an azide group.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overview of siRNA disclosed herein. It is a figure which shows the evaluation result of the double chain formation ability of the oligomer containing S form. It is a figure which shows the evaluation result of the nuclease resistance performance of the oligomer containing S form. It is a figure which shows the evaluation result of the nuclease resistance performance of the oligomer containing S form. It is a figure which shows the evaluation result of the nuclease resistance performance of the oligomer containing S form.
  • FIG. 2 is a diagram showing the evaluation results of the gene expression suppressing ability of siRNA having a passenger strand containing an S-form. It is a figure which shows the evaluation result of the gene expression suppression ability of siRNA provided with the guide strand containing S form.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overview of siRNA disclosed herein. It is a figure which shows the evaluation result of the double chain formation ability of the oligomer containing S form. It is a figure which shows the
  • FIG. 3 is a diagram showing the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNA comprising a passenger strand and a guide strand containing S-forms.
  • FIG. 2 is a diagram showing the evaluation results of the gene expression suppressing ability of siRNA having a passenger strand containing an S-form. It is a figure which shows the other evaluation result of the gene expression suppression ability of siRNA provided with the passenger strand containing S form. It is a figure which shows the other evaluation result of the gene expression suppression ability of siRNA equipped with the passenger strand containing S form at both ends. It is a figure which shows the other evaluation result of the gene expression suppression ability of siRNA equipped with the passenger strand containing S form at both ends.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the introduction site of the S-form in the passenger chain and the ability to suppress gene expression. It is a figure which shows the evaluation result of the gene expression suppression ability of siRNA provided with the guide strand containing S form. It is a figure which shows the other evaluation result of the gene expression suppression ability of siRNA provided with the guide strand containing S form.
  • FIG. 3 is a diagram showing evaluation results of nuclease resistance performance of siRNA having a passenger strand containing S-form. It is a figure which shows the other evaluation result of the nuclease resistance performance of siRNA provided with the passenger strand containing S form. It is a figure which shows the other evaluation result of the nuclease resistance performance of siRNA provided with the passenger strand containing S form.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of introducing S-form into siRNA from the viewpoint of nuclease resistance performance. It is a figure which shows the example of introduction of S form into siRNA seen from various viewpoints.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of siRNA against the KNTC2 gene.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of evaluating the ability of siRNA to suppress gene expression against the KNTC2 gene by the ⁇ CT method using GL3 as an internal standard gene.
  • nucleoside derivatives useful in RNA drugs Specifically, nucleoside derivatives (hereinafter also referred to as S-forms) that have an aminopropyl group at the 5' position of ribose in a specific enantiomer (S-form), and RNA drugs that have this S-form at a specific site. Regarding.
  • the S form which is a specific enantiomer, is selected as the species to be introduced into the RNA drug, and is site-specifically introduced into the RNA drug.
  • the double-strand hybridization ability, nuclease resistance ability, and gene expression suppression ability of the RNA drug can be maximized.
  • nucleoside derivatives or salts thereof disclosed in this specification and their uses will be explained.
  • nucleoside derivatives will be described, followed by a discussion of RNA drug designs that include such nucleoside derivatives.
  • the meaning of "lower” in a substituent in a compound described in this specification means that the number of carbon atoms constituting the substituent is up to 10. For example, it usually has 1 to 6 carbon atoms, or 1 to 5 carbon atoms, and has 1 to 4 carbon atoms, and has 1 to 3 carbon atoms.
  • the nucleoside derivative (S-form) disclosed herein is represented by the following formula (1).
  • the S-form is an enantiomer in which a substituent has an S-configuration with respect to the 5'-position carbon atom, which is an asymmetric carbon atom represented by formula (1).
  • a nitrogen atom (N)-containing propyl group is provided as a substituent, bonded to the carbon atom at the 5'-position carbon atom.
  • R 1 represents a hydroxyl group, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a hydroxyl group protected by a protecting group.
  • Alkyl groups include saturated hydrocarbon groups that are linear, branched, cyclic, or combinations thereof. Usually, a lower alkyl group is preferred, and for example, a lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is more preferred, and a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is more preferable. Particularly preferred examples include 1 to 3 lower alkyl groups.
  • Preferred examples of the linear alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, and n-butyl group.
  • methyl group, ethyl group, An n-propyl group is preferable, and a methyl group and an ethyl group are preferable, and a methyl group is preferable.
  • the branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include isopropyl group, isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group, and among these, isopropyl group is particularly preferred.
  • the cyclic alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, and a cyclopropylmethyl group.
  • Alkenyl groups include saturated hydrocarbon groups that are linear, branched, cyclic, or combinations thereof. Usually, a lower alkenyl group is preferred, and examples of the lower alkenyl group include ethenyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 2-methyl -1-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group and the like.
  • Protective groups for hydroxyl groups are well known to those skilled in the art, and for example, Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley and Sons, 2007 edition) can be referred to.
  • Typical examples of protecting groups for hydroxyl groups include aliphatic acyl groups, aromatic acyl groups, lower alkoxymethyl groups, oxycarbonyl groups which may have appropriate substituents, and appropriate substituents.
  • a tetrahydropyranyl group which may have an optional substituent
  • a tetrathiopyranyl group which may have an appropriate substituent
  • a methyl group substituted with a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups (however, the above-mentioned substituents Examples of substituents on aryl include lower alkyl, lower alkoxy, halogen atom, or cyano group), silyl group, and the like.
  • alkoxy group examples include saturated alkyl ether groups that are linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • a lower alkoxy group is preferable, and examples of the lower alkoxy group include a lower alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a lower alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and more preferably a lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, or Alkoxy groups having 1 to 3 carbon atoms are preferred, and alkoxy groups having 1 to 4 carbon atoms are particularly preferred.
  • alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms include methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, and n-butoxy group. Further, preferred examples include isopropoxy group, isobutoxy group, s-butoxy group, and t-butoxy group. Further, cyclopropoxy group and cyclobutoxy group are also preferable, and cyclopropylmethoxy group is also mentioned as a preferable example.
  • particularly preferred examples include aliphatic acyl groups, aromatic acyl groups, and silyl groups. Also, a methyl group substituted with a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups (however, the substituents on the substituted aryl are as described above) is also mentioned as a preferable example.
  • Examples of the aliphatic acyl group include an alkylcarbonyl group, a carboxyalkylcarbonyl group, a halogeno lower alkylcarbonyl group, and a lower alkoxy lower alkylcarbonyl group.
  • alkyl in the alkylcarbonyl group is as explained above. That is, examples of the alkylcarbonyl group include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, pentanoyl group, pivaloyl group, valeryl group, isovaleryl group, octanoyl group, nonanoyl group, decanoyl group, 3-methylnonanoyl group, 8-methylnonanoyl group, 3-ethyloctanoyl group, 3,7-dimethyloctanoyl group, undecanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, tetradecanoyl group, pentadecanoyl group, hexadecanoyl group, 1-methylpentadecanoyl group Noyl group, 14-methylpentadecanoyl group, 13,13-dimethyltetradecanoy
  • an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pentanoyl group, and a pivaloyl group are mentioned as preferable examples, and an acetyl group is mentioned as an especially preferable example.
  • the alkyl in the carboxylated alkylcarbonyl group is as explained above.
  • the substitution position for carboxylation can also be selected as appropriate. That is, examples of the carboxylated alkylcarbonyl group include a succinoyl group, a glutaroyl group, and an adipoyl group.
  • halogen, lower, and alkyl in the halogeno lower alkylcarbonyl group are as explained above.
  • the substitution position of halogen can also be selected as appropriate. That is, examples of the halogeno lower alkylcarbonyl group include a chloroacetyl group, a dichloroacetyl group, a trichloroacetyl group, and a trifluoroacetyl group.
  • alkoxy, alkyl, and lower are as explained above.
  • the position where lower alkoxy is substituted can also be selected as appropriate. That is, examples of the lower alkoxy lower alkylcarbonyl group include a methoxyacetyl group.
  • aromatic acyl group examples include an arylcarbonyl group, a halogenoarylcarbonyl group, a lower alkylated arylcarbonyl group, a lower alkoxylated arylcarbonyl group, a carboxylated arylcarbonyl group, a nitrated arylcarbonyl group, or an arylated arylcarbonyl group.
  • arylcarbonyl group examples include an arylcarbonyl group, a halogenoarylcarbonyl group, a lower alkylated arylcarbonyl group, a lower alkoxylated arylcarbonyl group, a carboxylated arylcarbonyl group, a nitrated arylcarbonyl group, or an arylated arylcarbonyl group.
  • Examples of the arylcarbonyl group include benzoyl group, ⁇ -naphthoyl group, and ⁇ -naphthoyl group, and more preferably benzoyl group.
  • Examples of the halogenoarylcarbonyl group include 2-bromobenzoyl group and 4-chlorobenzoyl group.
  • Examples of the lower alkylated arylcarbonyl group include 2,4,6-trimethylbenzoyl group, 4-toluoyl group, 3-toluoyl group, and 2-toluoyl group.
  • Examples of the lower alkoxylated arylcarbonyl group include 4-anisoyl group, 3-anisoyl group, and 2-anisoyl group.
  • Examples of the carboxylated arylcarbonyl group include 2-carboxybenzoyl group, 3-carboxybenzoyl group, and 4-carboxybenzoyl group.
  • Examples of the nitrated arylcarbonyl group include 4-nitrobenzoyl group, 3-nitrobenzoyl group, and 2-nitrobenzoyl group.
  • Examples of the arylated arylcarbonyl group include 4-phenylbenzoyl group.
  • Examples of the lower alkoxymethyl group include methoxymethyl group, 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl group, ethoxymethyl group, propoxymethyl group, isopropoxymethyl group, butoxymethyl group, and t-butoxymethyl group. Particularly preferred is a methoxymethyl group.
  • Examples of the oxycarbonyl group which may have an appropriate substituent include a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group substituted with a halogen or silyl group, or an alkenyloxycarbonyl group.
  • Examples of the lower alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a t-butoxycarbonylisobutoxycarbonyl group.
  • Examples of the lower alkoxycarbonyl group substituted with halogen or silyl group include 2,2-trichloroethoxycarbonyl group and 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl group.
  • alkenyloxycarbonyl group examples include a vinyloxycarbonyl group.
  • Preferred examples of the above-mentioned tetrahydropyranyl group which may have an appropriate substituent include a tetrahydropyran-2-yl group or a 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, particularly preferably Tetrahydropyran-2-yl group is mentioned.
  • Examples of the tetrathiopyranyl group which may have an appropriate substituent include a tetrahydrothiopyran-2-yl group and a 4-methoxytetrahydrothiopyran-4-yl group, and more preferably a tetrahydrothiopyran-2-yl group.
  • -yl group is mentioned.
  • the substituent on the above-mentioned substituted aryl means lower alkyl, lower alkoxy, halogen, or cyano group.
  • Examples of the methyl group substituted with a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups include benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, ⁇ -Naphthyldiphenylmethyl group, preferably benzyl group and triphenylmethyl group.
  • Other examples include 9-anthrylmethyl 4-methylbenzyl group, 2,4,6-trimethylbenzyl group, and 3,4,5-trimethylbenzyl group, preferably 2,4,6-trimethylbenzyl group. , 3,4,5-trimethylbenzyl group.
  • 4-methoxybenzyl group 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group, preferably 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, A 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group is mentioned.
  • Further examples include 4-chlorobenzyl group and 4-bromobenzyl group.
  • 4-cyanobenzyl group is also mentioned as a preferred example.
  • Silyl groups include trimethylsilyl group, triethylsilyl group, isopropyldimethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, methyldiisopropylsilyl group, methyldi-t-butylsilyl group, triisopropylsilyl group, diphenylmethylsilyl group, diphenylbutylsilyl group. , diphenylisopropylsilylphenyldiisopropylsilyl group.
  • trimethylsilyl group t-butyldimethylsilyl group, triisopropylsilyl group, and diphenylmethylsilyl group
  • trimethylsilyl group t-butyldimethylsilyl group, and diphenylmethylsilyl group. It will be done.
  • Protecting groups for hydroxyl groups can be obtained by chemical methods (e.g., hydrolysis, hydrolysis, electrolysis, photolysis, etc.) or biological methods (e.g., hydrolysis in the human body, etc.). It may also mean a substituent that is cleaved and eliminated by any of the following methods.
  • Preferred examples of the protecting group for the hydroxyl group include hydrolysis or a substituent that is eliminated by hydrolysis. Note that the protected hydroxyl group can be said to be a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with such a protecting group.
  • the protecting group for the hydroxyl group is as described above.
  • a phosphorothioate group is a phosphoric acid group in which one oxygen atom is replaced with a sulfur atom.
  • Protective groups for the protected phosphate group are known to those skilled in the art, and include, for example, a lower alkyl group, a lower alkyl group substituted with a cyano group, an ethyl group substituted with a silyl group, a lower alkyl group substituted with a halogen.
  • aryl group substituted with a nitro group examples include a substituted aralkyl group, an aryl group substituted with a lower alkyl group, an aryl group substituted with a halogen, or an aryl group substituted with a nitro group.
  • the lower alkyl group is as described above.
  • Examples of the lower alkyl group substituted with a cyano group include a 2-cyanoethyl group and a 2-cyano-1,1-dimethylethyl group, and particularly preferably a 2-cyanoethyl group.
  • Examples of the ethyl group substituted with a silyl group include 2-methyldiphenylsilylethyl group, 2-trimethylsilylethyl group, and 2-triphenylsilylethyl group.
  • Examples of the lower alkyl group substituted with halogen include 2,2,2-trichloroethyl group, 2,2,2-tribromoethyl group, 2,2,2-trifluoroethyl group, 2,2,2- A trichloroethyl group is mentioned, and a 2,2,2-trichloroethyl group is particularly preferred.
  • Examples of the lower alkenyl group include ethenyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-methyl-2-propenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 1 -butenyl group, 2-butenyl group, etc.
  • Examples of the lower alkenyl group substituted with a cyano group include 2-cyanoethyl group, 2-cyanopropyl group, and 2-cyanobutenyl group.
  • Examples of the aralkyl group include benzyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, ⁇ -naphthylmethyl group, indenylmethyl group, phenanthrenylmethyl group, anthracenylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, 1-phenethyl group, 2-phenethyl group, 1-naphthylethyl group, 2-naphthylethyl group, 1-phenylpropyl group, 2-phenylpropyl group, 3-phenylpropyl group, 1-naphthylpropyl, 2-naphthylpropyl, Examples include 3-naphthylpropyl, 1-phenylbutyl group, 2-phenylbutyl group,
  • Examples of the aralkyl group whose aryl ring is substituted with a nitro group include 2-(4-nitrophenyl)ethyl group, 0-nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group, 2,4-dinitrobenzyl group, 4-chloro-2 -nitrobenzyl group, etc.
  • the protecting group of phosphoric acid can be protected by chemical methods (e.g., hydrolysis, hydrolysis, electrolysis, or photolysis) or biological methods (e.g., hydrolysis in the human body, etc.). It may also mean a substituent that is cleaved and eliminated by any of the following methods. Preferred examples of the protecting group for phosphoric acid include hydrolysis and substituents that are eliminated by hydrolysis.
  • n represents 0 or 1
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and are a hydrogen atom, a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, a mercapto group, a protected mercapto group, a lower alkoxy group, a cyano-lower alkoxy group, an amino group , or a substituted amino group.
  • n represents 1
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and are a hydrogen atom, a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, a mercapto group, a protected mercapto group, a lower alkoxy group, a cyano-lower alkoxy group, an amino group , or a substituted amino group.
  • R 5 and R 6 will not be hydrogen atoms.
  • the protected hydroxyl group and lower alkoxy group are as already explained
  • Protected mercapto groups are well known to those skilled in the art.
  • the protected mercapto group include, for example, an alkylthio group, an arylthio group, an aliphatic acyl group, and an aromatic acyl group, in addition to those listed above as the hydroxyl group-protecting group.
  • Preferred are aliphatic acyl groups and aromatic acyl groups, particularly preferred are aromatic acyl groups.
  • aromatic acyl groups include benzoyl groups.
  • alkylthio group examples include saturated alkylthio groups that are linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • a lower alkylthio group is preferable, and the lower alkylthio group is preferably a lower alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, or a lower alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms, and more preferably a lower alkylthio group having 1 to 4 carbon atoms. , or an alkylthio group having 1 to 3 carbon atoms are particularly preferred examples.
  • Preferred examples of the saturated alkylthio group having 1 to 4 carbon atoms include methylthio group, ethioltio group, n-propylthio group, and n-butylthio group.
  • alkylthio group a lower alkylthio group is preferable, and preferable examples include methylthio, ethylthio, and t-butylthio groups.
  • Preferred examples include isopropylthio, isobutylthio, s-butylthio, and t-butylthio.
  • Preferred examples include a cyclopropylthio group and a cyclobutylthio group, and a further preferred example includes a cyclopropylmethylthio group.
  • arylthio group examples include benzylthio.
  • the cyano lower alkoxy group is, for example, a linear, branched, cyclic, or a combination thereof alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a cyano group (the number of carbon atoms in the cyano group is Examples include cyanomethoxy, 2-cyanoethoxy, 3-cyanopropoxy, 4-cyanobutoxy, 3-cyano-2-methylpropoxy, or 1- Examples include cyanomethyl-1,1-dimethylmethoxy, and particularly preferred is 2-cyanoethoxy group.
  • a substituted amino group can be selected as R 5 and R 6 .
  • the substituent of the amino group is a lower alkoxy group, a lower alkylthio group, a cyano lower alkoxy group, or a lower alkyl group.
  • the substituted amino groups may be different substituted amino groups.
  • the lower alkoxy group, lower alkylthio group, cyano lower alkoxy group, and lower alkyl group are as described above.
  • R 5 and R 6 when n is 0, at least one of R 5 and R 6 is a substituted amino group, and the other can be anything, phosphor It becomes a roamidite group.
  • a phosphoramidite group in which one of R 5 and R 6 is a substituted amino group and the other is a lower alkoxy group or a cyano lower alkoxy group has good reaction efficiency in the condensation reaction. Yes, particularly preferred.
  • Preferred examples of the substituted amino group include a diethylamino group, a diisopropylamino group, a dimethylamino group, and a particularly preferred example is a diisopropylamino group.
  • a preferred example of the lower alkoxy group in the other substituent of R 5 and R 6 is a methoxy group.
  • a preferred example of the cyano lower alkoxy group is a 2-cyanoethyl group.
  • the phosphoramidite group is -P(OC 2 H 4 CN) (N(CH(CH 3 ) 2 ) or -P(OCH 3 )(N(CH(CH 3 ) 2 ). This is mentioned as a preferable example.
  • R5 and R6 when n is 1, at least one of R5 and R6 is a hydrogen atom, and the other may be anything other than a hydrogen atom; becomes an H-phosphonate group.
  • substituent other than hydrogen examples include a hydroxyl group, a methyl group, a methoxy group, a thiol group, and a particularly preferred example is a hydroxyl group.
  • n 1 and R 5 and R 6 are both lower alkoxy groups, it becomes a phosphonyl group.
  • the lower alkoxy groups in R 5 and R 6 may be the same or different.
  • Preferred examples of the lower alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • R2 is preferably a phosphoric acid group or a protected phosphoric acid group.
  • R 2 is also preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group-protecting group.
  • R 2 examples include a hydrogen atom, an acetyl group, a benzoyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzyl group, a trimethylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, -P(OC 2 H 4 CN) ( Preferred examples include N(CH(CH 3 ) 2 ), -P(OCH 3 )(N(CH(CH 3 ) 2 ), or a phosphonyl group.
  • R 3 represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoric acid group, a protected phosphoric acid group, a phosphorothioate group, or a protected phosphorothioate group. These are as described above.
  • Preferred examples of R3 include a hydrogen atom, a methyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzyl group, a dimethoxytrityl group, a monomethoxytrityl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, or a trimethylsilyl group. Can be mentioned.
  • R 4 represents an azido group (N 3 ⁇ ), a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, or NHR 7 .
  • R 7 include a hydrogen atom or a protecting group for an amino group. The protected hydroxyl group has already been described.
  • Protective groups for amino groups are well known to those skilled in the art, and reference can be made to the above-mentioned references.Specifically, in addition to those listed above as protective groups for hydroxyl groups, for example, benzyl group, methyl Benzyl group, chlorobenzyl group, dichlorobenzyl group, fluorobenzyl group, trifluoromethylbenzyl group, nitrobenzyl group, methoxyphenyl group, methoxymethyl (MOM) group, N-methylaminobenzyl group, N,N-dimethylaminobenzyl group group, phenacyl group, acetyl group, trifluoroacetyl group, pivaloyl group, benzoyl group, phthalimide group, allyloxycarbonyl group, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, t-butoxycarbonyl (Boc) group, 1-methyl-1-(4-biphenyl)
  • TFA trifluoroacetyl
  • pivaloyl group pivaloyl group
  • benzoyl group t-butoxycarbonyl (Boc) group, 1-methyl-1-(4-biphenyl)ethoxycarbonyl (Bpoc) group, 9-fluorenyl
  • protecting groups for amino groups can be obtained by chemical methods (e.g., hydrolysis, hydrolysis, electrolysis, photolysis, etc.) and biological methods (e.g., hydrolysis in the human body, etc.). It may also mean a substituent that is cleaved and eliminated by any method (such as induction with etc.). In particular, hydrolysis or a substituent that is eliminated by hydrolysis is preferred as the protecting group for the amino group.
  • B in the S form includes purine bases and pyrimidine bases.
  • B can be selected from a purin-9-yl group, a 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, a substituted purin-9-yl group, or a substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group.
  • B includes 2,6-dichloropurin-9-yl or 2-oxo-pyrimidin-1-yl. Furthermore, 2-oxo-4-methoxy-pyrimidin-1-yl, 4-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-pyrimidin-1-yl, or 2,6-dimethoxypurine-9- Il is mentioned.
  • 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl with a protected amino group 2-amino-6-bromopurin-9-yl with a protected amino group
  • 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl with a protected amino group Amino-6-hydroxypurin-9-yl, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl with amino group and/or hydroxyl group protected, 2-amino-6-chloropurin-9 with amino group protected -yl, 6-aminopurin-9-yl with a protected amino group, or 4-amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl with a protected amino group.
  • each protecting group for a hydroxyl group and an amino group will be described later.
  • 6-aminopurin-9-yl (adenine), 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl (guanidine), 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl (cytosine), 2- Oxo-4-hydroxy-pyrimidin-1-yl (uracil) or 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl (thymine) can be mentioned.
  • 4-amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl (methylcytosine), 2,6-diaminopurin-9-yl, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl, 6 -mercaptopurin-9-yl, 4-amino-2-oxo-5-chloro-pyrimidin-1-yl, or 2-oxo-4-mercapto-pyrimidin-1-yl.
  • 6-amino-2-methoxypurin-9-yl 6-amino-2-chloropurin-9-yl, 2-amino-6-chloropurin-9-yl, or 2-amino-6-bromopurin-9-yl, Purin-9-yl is mentioned.
  • each of the substituted purin-9-yl group or the substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group include a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, a lower alkoxy group, a mercapto group, a protected mercapto group, a lower alkylthio group, It is any one of an amino group, a protected amino group, an amino group substituted with a lower alkyl group, a lower alkyl group, a lower alkoxymethyl group, or a halogen atom, or a combination of multiple thereof. These substituents will be described later.
  • the substituted purin-9-yl group or the substituent in the substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group will be described later, but in addition to this, a triazole group and a lower alkoxymethyl group are added. It is also preferable.
  • substituted purin-9-yl groups include, for example, 6-aminopurin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, 2-amino-6-chloropurin-9-yl, 2- Amino-6-bromopurin-9-yl, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl, 6-amino-2-methoxypurin-9-yl, 6-amino-2-chloropurin-9-yl, Examples include 6-amino-2-fluoropurin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6-dichloropurin-9-yl, and 6-mercaptopurin-9-yl. If the above-mentioned substituents include an amino group or a hydroxyl group, preferred examples include substituents in which the amino group and/or the hydroxyl group are protected.
  • Substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl includes, for example, 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl, 1H-(1,2,4-triazol-1-yl)-pyrimidin-1-yl, 4-1H-1,4-amino-2-oxo-5-chloro-pyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-methoxy-pyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-mercapto-pyrimidin-1-yl yl, 2-oxo-4-hydroxy-pyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl, or 4-amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl Ile et al.
  • Preferred examples include 2-oxo-4-methoxy-pyrimidin-1-yl and 4-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-pyrimidin-1-yl.
  • the S form may be a salt.
  • the form of the salt is not particularly limited.
  • acid addition salts are exemplified, and they may be in the form of intramolecular counterions.
  • a base addition salt may be formed depending on the type of substituent.
  • pharmaceutically acceptable salts are preferred.
  • the types of acids and bases that form pharmaceutically acceptable salts are well known to those skilled in the art and are described, for example, in J. Ed. Pharm. Sci. , 1-19 (1977) can be referred to.
  • acid addition salts include mineral acid salts and organic acid salts.
  • base addition salts are also mentioned as preferred examples.
  • Examples of mineral acid salts include hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, nitrates, sulfates, hydrogen sulfates, phosphates, and hydrogen phosphates. Usually, hydrochloride and phosphate are mentioned as preferred examples.
  • Examples of organic acid salts include acetate, trifluoroacetate, gluconate, lactate, salicylate, citrate, tartrate, ascorbate, succinate, maleate, fumarate, formate. Examples include salts, benzoates, methanesulfonates, ethanesulfonates, and p-toluenesulfonates. Usually, acetate etc. are mentioned as a preferable example.
  • Examples of base addition salts include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, organic amine salts, and amino acid addition salts.
  • alkali metal salts mentioned above include sodium salts and potassium salts.
  • alkaline earth metal salts include magnesium salts and calcium salts.
  • organic amine salt include triethylamine salt, pyridine salt, procaine salt, picoline salt, dicyclohexylamine salt, diethanolamine salt, triethanolamine salt, tris(hydroxymethyl)aminomethane salt, and the like.
  • addition salts of amino acids include arginine salts, lysine salts, ornithine salts, serine salts, glycine salts, aspartates, and glutamates.
  • the S form or a salt thereof may exist as a hydrate or solvate, and these substances are also included within the scope of the disclosure of this specification.
  • the S form or a salt thereof can be synthesized based on the synthesis method described below.
  • the S-form can be synthesized, for example, by the following method.
  • the S-form has uracil, which is a base with a secondary amino group -NH, as a base
  • the S-form has adenine and guanine, which are bases with a primary amino group, as a base.
  • a synthesis example is shown.
  • the S form as a cytidine derivative can be obtained according to the following scheme. Details of the reactions in the schemes are disclosed in the Examples. In addition, in the following scheme, compound 36 and subsequent compounds are included in the S form.
  • Adenosine derivatives can be obtained according to the following scheme. For example, in the scheme below, compound 53 and subsequent compounds are included in the S form. Details of the reactions in the schemes are disclosed in the Examples.
  • a guanosine derivative can be obtained according to the scheme below.
  • compound 63 and subsequent compounds are included in the S form. Details of the reactions in the schemes are disclosed in the Examples.
  • the S-form described above is useful as a ribonucleoside or ribonucleotide for forming a structural unit of an oligonucleotide.
  • the S-form is linked with known ribonucleotides and/or deoxyribonucleotides, for example, as a phosphoramidide and/or in a form bound to a solid phase, according to known DNA or RNA synthesis methods. It is introduced into the basic framework of Thereby, a base-containing unit, which is a structural unit constituting the backbone of the oligonucleotide, can be constructed.
  • ribonucleotides and/or deoxyribonucleotides that constitute the backbone of the RNA drug may include natural ribonucleotides and/or deoxyribonucleotides, or may include various known chemically modified ribonucleotides and/or deoxyribonucleotides. May contain.
  • Examples of chemically modified ribonucleotides and/or deoxyribonucleotides include LNA, BNA, PNA, modified bases, and the like, as well as nucleotide derivatives represented by the following formula (2).
  • R 1 , R 2 , R 3 and B have the same meanings as these groups in formula (1) except that R 1 represents a fluorine atom.
  • R 1 represents a fluorine atom.
  • ribonucleotides in which R 1 is a fluorine atom ribonucleotides in which OCH 3 is used, ribonucleotides in which R 2 is thiolated, etc. are mentioned. Any of these known chemical modifications can be appropriately synthesized by those skilled in the art or can be obtained commercially.
  • R 7 represents an acetyl group or a cyclic structure in which oxygen atoms bonded to each other and bonded to R 7 are connected by -C(CH 3 ) 2 -
  • R 8 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group. It represents a protecting group
  • R 9 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group protecting group
  • R 10 represents a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, or an azide group.
  • the hydroxyl-protecting group in formula (4) the same embodiments as those for the hydroxyl-protecting group already explained for the nucleoside derivative represented by formula (1) are applied.
  • R 7 represents a cyclic structure in which oxygen atoms bonded to each other and R 7 are connected by -C(CH3) 2 -
  • R 8 represents a hydroxyl group protecting group
  • R 9 represents a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group.
  • the intermediate represented by formula (4) includes compounds 49 to 52 of the synthesis scheme for common intermediates of adenosine nucleoside and guanosine nucleoside described above.
  • Such common intermediates include, for example, in formula (4), R 7 represents an acetyl group or a cyclic structure in which oxygen atoms bonded to each other and bonded to R 7 are connected by -C(CH 3 ) 2 -, and R 8 represents a hydroxyl-protecting group, R 9 represents a hydroxyl-protecting group, and R 10 is a compound representing a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, or an azide group.
  • the protecting group in such a common intermediate is appropriately selected from the above-mentioned protecting groups.
  • Compound 52 can be used as a direct starting material for adenosine and guanosine derivatives.
  • a compound constituting the base moiety By introducing a compound constituting the base moiety into compound 52, adenosine derivatives, guanosine derivatives, etc. useful for synthesizing oligoribonucleotides can be efficiently synthesized.
  • a common intermediate such as compound 52 has the formula (4) in which R 7 represents an acetyl group, R 8 represents a hydroxyl protecting group, R 9 represents a hydroxyl protecting group, and R 10 is a compound representing an azide group.
  • the protecting group in such a common intermediate is appropriately selected from the above-mentioned protecting groups.
  • the intermediate precursor represented by formula (5) includes compounds 47 to 48 of the common intermediate synthesis scheme described above.
  • Compounds 47 and 48 have a 2-propenyl group (allyl group) in the S configuration on the 5' carbon atom of ribose, and various substituents can be introduced by subsequent addition reactions.
  • the protecting group in such an intermediate precursor is appropriately selected from the above-mentioned protecting groups.
  • a method for synthesizing a nucleoside having a purine base such as adenine or guanine as a base among nucleosides represented by formula (1) using a common intermediate represented by formula (4) is also provided. That is, the common intermediate represented by formula (4), in particular, in formula (4), R 7 represents an acetyl group, R 8 represents a hydroxyl group-protecting group, and R 9 represents a hydroxyl group-protecting group.
  • R10 represents a step of introducing a purine base, a pyrimidine base, or a purine base or a pyrimidine base with a protected amino group into the 1'-position carbon atom of a common intermediate, which is a compound representing an azide group.
  • the method may include a step of introducing a base or a purine base with a protected amino group. By doing so, the S form can be obtained by avoiding or suppressing the removal of the protecting group of the amino group in the purine base.
  • a purine base or the like to the 1'-position carbon atom of the common intermediate represented by formula (4) is possible by a glycosylation reaction using ditinic chloride (IV) or the like.
  • a base By introducing a base, one embodiment of the S form represented by formula (1) can be obtained.
  • a desired S form can be obtained by introducing and removing various protecting groups using known methods.
  • the oligonucleotide disclosed herein contains at least one or more base-containing units represented by the following formula (3).
  • the oligonucleotide can contain ribonucleotides and/or deoxyribonucleotides in addition to the base-containing unit represented by the following formula (3).
  • the ribonucleotides include one or more base-containing units (hereinafter also simply referred to as S-containing units) to which ribonucleotides represented by formula (2) described above are linked.
  • R 1 represents a hydroxyl group or a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group.
  • X 1 represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • X 2 represents OH (or O ⁇ ) or SH (S ⁇ ).
  • the oligonucleotide is single-stranded, it may be an oligoribonucleotide or a hybrid of a ribonucleotide and a deoxyribonucleotide.
  • the base length of the oligonucleotide is not particularly limited, and can have a base length depending on the RNA drug described below.
  • oligonucleotides can be chemically synthesized by known DNA/RNA synthesis methods.
  • FIG. 1 illustrates an siRNA that includes a passenger strand and a guide strand, each of which is 21 bases long, and has a 2-base long dangling end at each 3' end.
  • the passenger strand can include one or more S-form-containing units, for example, within the first to ninth bases from its 3' end. Further, the passenger strand can include one or more S-form-containing units within the first to sixth bases from its 5' end.
  • the ability of siRNA to suppress gene expression that is, the ability to activate siRNA, can be maintained or improved.
  • one, two, or three S-containing units are provided from the 3' end to the first base to the third base, and for example, one S-form containing unit is provided from the 3' end to the first base to the fourth base, It may also include 2, 3 or 4 S-containing units.
  • one, two, or three S-form-containing units are provided from the 5' end to the first base to the third base, and for example, one S-form-containing unit is provided from the 5' end to the first base to the fourth base. , 2, 3 or 4 S-containing units.
  • siRNA activity can be maintained or improved.
  • S-form-containing units can be provided on both the 3' end side and the 5' end side.
  • the region other than the 3' end region and the 5' end region that is, the 6th base counting from the 5' end and the 9th base counting from the 3' end
  • siRNA activity is reduced.
  • the passenger strand can include one or more S-form-containing units, for example, within the first to fifth bases from its 3' end. By providing an S-form containing unit in this region, nuclease resistance performance can be improved.
  • first base and the third base of the 3' end of the passenger strand for example, 1 to 3, for example, 2 or 3 S-containing units are provided from the side closest to the 3' end. Can be done. Further, for example, one to four, for example, three or four S-form-containing units may be provided within the first to fourth bases of the 3' end of the passenger strand, from the side closest to the 3' end. Can be done. Further, for example, one to five, for example, four or five S-containing units may be provided from the first base to the fifth base of the 3' end of the passenger strand, from the side closest to the 3' end. Can be done. By doing so, higher nuclease resistance performance can be ensured.
  • the passenger strand should contain, for example, 3, 4, or 5 strands from the 3' end within the first to fifth bases of the 3' end.
  • S-containing units can be provided continuously.
  • one or more S-form-containing units can be provided within the first to sixth bases from the 5' end. Further, for example, it can include 3 or more and 4 or less S-form containing units.
  • the guide strand can include an S-form-containing unit at the 7th base position from the 5' end of the guide strand. By providing the S-form containing unit at this position, the siRNA activation ability can be maintained or improved.
  • the siRNA activation ability will be reduced. Furthermore, for example, providing S-form-containing units at the positions from the first base to the sixth base and the eighth base from the 5' end also reduces the siRNA activation ability.
  • the base lengths of the passenger strand and guide strand of siRNA are not particularly limited, but are, for example, oligoribonucleotide chains of 21 to 25 bases, respectively. Further, as for siRNA, typically, the passenger strand and the guide strand each have a dangling end of 2 bases in length at their 3' ends.
  • the guide strand of siRNA can be provided with 2'-OMe modified ribonucleotides at the first and third bases from the 5' end. Furthermore, a 2'-F modified ribonucleotide can be provided at the second base from the 5' end.
  • an amidite form of R form which is an enantiomer of this S form, was synthesized according to International Publication No. 2018/110678 pamphlet. Furthermore, using these amidite bodies, solid phase supports 39 and 41 in which the S form and the R form were linked were synthesized according to a conventional method.
  • RNA containing S-form and (S)-5'-AP-U showed a decrease of 1.0 °C per modification, which was larger than that of R-form and 4'AP-U. Ta.
  • thermodynamic parameter ( ⁇ D°) was calculated according to a conventional method.
  • the values of ⁇ G° are natural (dsRNA 1), (S)-5'-AP-U (dsRNA 4), 4'-AP-U (dsRNA 2), (R)-5'
  • the absolute value increased in the order of -AP-U (dsRNA 3), which showed a correlation with the above-mentioned T m result.
  • RNA fragments were separated by polyacrylamide electrophoresis (PAGE), and full-length RNA was evaluated by observing fluorescence due to fluorescein in the gel. The results are also shown in Figure 3.
  • siRNA containing S-form The newly synthesized S-form (here, (S)-5'-AP-U) forms a double strand with RNA having a complementary base sequence like 4'-AP-U, and also has nuclease resistance. I mentioned that it can enhance sex. Next, we verified how the introduction of (S)-5'-AP-U into siRNA, which is a functional RNA, affected its properties.
  • siRNA5 to 8 SEQ ID NO: ⁇ 4
  • nuclease resistance was evaluated in the same manner as in Example 3. The results are also shown in FIG.
  • siRNAs (SEQ ID NOs: 3 to 4) into which analogs were introduced were synthesized. Using these siRNAs, their ability to suppress gene expression was evaluated by Dual Luciferase Reporter Assay.
  • RNAi activity siRNA concentrations of 1 nM and 10 nM was evaluated by calculating the ratio of the luminescence intensities of Renilla Luciferase and Firefly Luciferase when introduced into cells. Note that the control used this time was one in which siRNA was not introduced. The results are also shown in Figures 5 to 7.
  • Figure 5 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNA in which only one S-form, etc., synthesized in the passenger strand, which is degraded during RISC formation, was introduced at the locations (1 to 3) shown in the figure.
  • siRNA containing any of the modified nucleic acids exhibited RNAi activity equivalent to that of the natural type, and showed (R)-5'-AP-U and (S)-5'-AP- It was suggested that the introduction of U did not affect RNAi activity.
  • FIG. 6 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNA in which only one S-form or the like was introduced into the guide strand at the locations shown (4 to 6).
  • RNAi activity As shown in FIG. 6, there was a general tendency for RNAi activity to decrease compared to introduction into the passenger strand.
  • the 2nd to 8th bases from the 5′ end of the guide strand are called the seed region and are strictly recognized by Argonaute-2 during RISC formation, so chemical modifications to the seed region generally do not reduce RNAi activity. It is said that there are many.
  • the S-form showed a gene expression suppression ability higher than that of the R-form and comparable to that of 4'-AP-U.
  • siRNA in which an analog was introduced at the 11th position from the 5' end of the guide strand had the highest ability to suppress gene expression
  • siRNA in which an analog was introduced at the 20th position from the 5' end of the guide strand had the highest ability to suppress gene expression. All analogs showed the ability to suppress gene expression equivalent to that of the natural one.
  • FIG. 7 shows the evaluation results of the gene expression ability of siRNAs in which S-forms etc. were introduced at the three locations shown on the passenger strand and at the 3' end shown on the guide strand. As shown in FIG. 7, it was confirmed that all siRNAs were able to suppress target gene expression at a level equivalent to that of natural siRNA. This result suggested that simultaneous modification of both strands of siRNA is possible as long as both the passenger strand and the guide strand are modified at positions where the influence of chemical modification is acceptable.
  • the reagents and conditions were as follows. (a) TPSCl, DMAP, Et 3 N, CH 3 CN, rt, 2 h; (b) 28% NH 3 aq., rt, 2 h; (c) Ac 2 O, pyridine, rt, 12 h, 86 % (3 steps); (d) TBAF (1 M in THF), THF, rt, 6 h, 89%; (e) 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchlorophosphoroamidite, DIPEA, THF, rt, 1.5 h, 88 %.
  • the synthesized compound 58 was subjected to a glycosylation reaction with N 6 -benzoyladenine in the presence of tin (IV) chloride to synthesize adenosine derivative 59.
  • the 2'-position acetyl group was removed by treatment with K 2 CO 3 in CH 3 OH, and Compound 61, in which the 2'-position hydroxyl group was methylated using CH 3 I, was obtained in a yield of 72%.
  • the TBDPS group at the 5' position and the Bn group at the 3' position were deprotected to synthesize compound 64, in which the hydroxyl group at the 3' position was selectively protected with the TBDPS group.
  • the azide group was converted to an amino group by Staudinger reaction, and the resulting amino group was protected with a trifluoroacetyl group.
  • the target (S)-5'-AP-A-Phosphoramidite 68 was synthesized in a yield of 80% by phosphorylation.
  • (S)-5′-AP-G-Phosphoramidite 79 was synthesized.
  • Compound 69 was synthesized in a yield of 75% by subjecting Compound 58 to a glycosylation reaction with 2-amino-6-chloropurine in the presence of TMSOTf.
  • compound 71 was synthesized by methylating the hydroxyl group at the 2' position with CH 3 I.
  • guanosine derivative 72 in which the chlorine atom at position 6 was replaced with an oxygen atom was obtained in a yield of 85%.
  • Figure 8 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNAs in which three consecutive sites (sites 31 to 33) from the 3'-end of the passenger strand were modified with S-type or 2'-OMe.
  • siRNA containing three consecutive S-type modifications in the 3'-terminal region of the passenger strand has the same ability to suppress gene expression as siRNA containing 2'-OMe modification at the same position. became clear.
  • Figure 9 shows the evaluation of the ability to suppress gene expression of siRNA in which three consecutive sites (sites 34 to 36) from the 10th base from the 3'-end of the passenger strand were modified with S-type or 2'-OMe. Show the results. As shown in FIG. 9, siRNA in which S-form was introduced into the central region of the passenger strand had a greatly reduced ability to suppress gene expression compared to siRNA in which 2'-OMe was introduced at the same position.
  • FIG. 10 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNA in which three consecutive sites (site 37) from the 5'-end of the passenger strand were modified with S-type or 2'-OMe.
  • siRNA containing three consecutive S-type modifications in the 5'-terminal region of the passenger strand has the same ability to suppress gene expression as siRNA containing 2'-OMe modification at the same position. became clear.
  • FIG. 11 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNAs containing 3, 4, and 5 consecutive S-type modifications at the 3' and 5' ends of the passenger strand.
  • siRNA containing three or four consecutive S-type modifications at the 3' and 5' ends of the passenger strand is almost equivalent to siRNA containing 2'-OMe modification at the same position. It showed the ability to suppress gene expression.
  • siRNA containing five consecutive S-type modifications had a significantly lower ability to suppress gene expression than siRNA containing 2'-OMe modification at the same position.
  • siRNA with S-forms introduced into the 3' and 5' ends of the passenger strand has gene expression equivalent to that of natural siRNA and siRNA containing 2'-OMe modification at the same position. It was confirmed that it exhibits suppressive ability. Furthermore, it was found that when S-isomer was introduced into the central portion of the passenger chain, the ability to suppress gene expression was reduced more than when modified with 2'-OMe.
  • siRNA containing various S-forms; guide strand evaluation of gene expression suppression ability of siRNA containing various S-forms; guide strand
  • siRNA was synthesized according to the base sequences (SEQ ID NOS: 3 to 4) and the introduction position of the S form shown in FIGS. 13 to 14, and the ability to suppress gene expression was evaluated according to the method of Example 5.
  • Figure 13 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNA with one S-type modification or 2'-OMe modification applied to each site from the 1st base to the 4th base from the 5'-end of the guide strand. . As shown in FIG. 13, it was found that introduction of S-isomer into the 5'-terminal region of the guide strand had a greater tendency to reduce the ability to suppress gene expression than 2-OMe.
  • Figure 14 shows the evaluation results of the ability to suppress gene expression of siRNA with one S-type modification or 2'-OMe modification applied to each site from the 5th base to the 8th base from the 5'-end of the guide strand. .
  • S-type modification or 2'-OMe modification applied to each site from the 5th base to the 8th base from the 5'-end of the guide strand.
  • the S-form when the S-form was introduced at the 7th base from the 5' end of the guide strand, the activity was equivalent to that of the natural siRNA, suggesting that it is effective to introduce the S-form at this site. .
  • the second to eighth regions from the 5′ end of the guide strand are called the Seed region, and it has been reported that this region interacts with many amino acid residues of Argonaute-2.
  • modified nucleic acids that can be introduced into the Seed region are limited to those having sterically small substituents such as 2'-OMe modification, 2'-F modification, and Phosphorothioate modification.
  • the Seed region can be chemically modified, the nuclease resistance of siRNA can be efficiently enhanced. In this respect, it was thought that the S-form has an advantage.
  • siRNA evaluation of nuclease resistance of siRNA containing various S forms
  • the relationship between the introduction position of the S-form and the nuclease resistance of siRNA was evaluated.
  • siRNA was synthesized according to the base sequences (SEQ ID NOS: 3 to 4) and the introduction position of the S form shown in each of FIGS. 15 to 17, and the nuclease resistance performance was evaluated according to the method of Example 3.
  • FIGS. 15 and 16 show the positions of introduction of S-form and 2'-OMe-form into the passenger strand and guide strand, and the evaluation results of siRNA nuclease resistance performance with S-form and the like introduced at various positions.
  • chemical modification of the guide strand is also important for imparting nuclease resistance
  • introduction of S-form into the guide strand reduces the ability to suppress gene expression, so phosphorothioate modification, 2' -OMe form and 2'-F form were introduced.
  • the full chain length can be maintained even after 24 hours. While siRNA remained, with siRNA in which 2'-OMe was introduced at the same position, no full-length siRNA band was observed after 24 hours, and the siRNA was completely degraded. Furthermore, as shown in FIG. 16, S-forms may be introduced at the 1st to 4th bases and the 5th base from the 5' end of the passenger strand, and at the 1st to 4th bases and the 5th base from the 3' end.
  • the band corresponding to the full chain length siRNA of siRNA in which three consecutive S forms were introduced into the 3′-end region was visible even after 12 hours, while the band corresponding to the full-length siRNA in which three consecutive S-forms were introduced into the 3′-end region was observed even after 12 hours;
  • the band corresponding to full-length siRNA was gradually degraded, and the same region of the passenger strand was similar to that of natural siRNA.
  • siRNA used in this example contains a UA sequence in the 3'-terminal region of the passenger strand, and siRNA containing an S form near this UA sequence has improved stability in serum. It became. Therefore, it has been revealed that nuclease resistance can be efficiently improved by introducing the S-form into a position where siRNA is susceptible to degradation, particularly in a sequence where U and A are continuous near the end.
  • the modified form shown in Figure 18 is considered to be one of the preferred examples in terms of nuclease resistance performance. Ta.
  • siRNAs 47 to 49 against the KNTC2 gene were prepared with the sequences shown in Figure 20 (SEQ ID NO: 5 to 6) and chemically modified, and transfected into human colon cancer HCT116 cells using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Then, its ability to suppress gene expression was evaluated. Note that siRNA (SEQ ID NOs: 7 to 8) against GL3 as an internal standard gene was also prepared and evaluated in the same manner.
  • the KNTC2 gene is an important factor for chromosome segregation during the division phase (M phase) of the cell cycle, and by suppressing its expression, it is possible to induce cell death in actively proliferating cells such as cancer cells. .
  • HCT116 cells were seeded at 2.0 ⁇ 10 5 cells/well in a 12-well plate (medium volume: 1 mL/well).
  • siRNA against the KNTC2 gene (final concentration 10 nM) was transfected into HCT116 cells using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) at a final concentration of 10 nM.
  • Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) at a final concentration of 10 nM.
  • cells were replated onto new plates and cultured for an additional 24 hours.
  • total cell RNA was extracted using NucleoSpin RNA Plus Kit (Takara Bio Inc.), and cDNA was synthesized using this as a template using PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio Inc.).
  • Quantitative RT-PCR was performed on the synthesized cDNA using the following primers using Thermal Cycler Dice Real-Time System (Takara Bio Inc.) and TB Green Premix ExTaqII (Takara Bio Inc.).
  • Human ACTB gene 5'-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3 and 5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3' (SEQ ID NOs: 9-10)
  • Human KNTC2 gene 5'-CCTCTCCATGCAGGAGTTAAGA-3 and '5'-GGTCTCGGGTCCTTGATTTTCT-3' (SEQ ID NO: 11-12) PCR reactions were performed in duplicate for each sample, and relative gene expression levels were determined by the ⁇ CT method. The results are shown in FIG.
  • SEQ ID NO: 1 Single-stranded RNA SEQ ID NO: 3, 5, 7: Passenger strand of siRNA SEQ ID NO: 4, 6, 8: Guide strand of siRNA SEQ ID NO: 9 to 12: Primer

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Abstract

以下の式（１）で表される、ヌクレオシドを提供する。 （上記式（１）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、Ｒ2は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、保護されたホスホロチオエート基、又は－Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を表し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なり、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又はホスホロチオエート基を表し、Ｒ4は、水酸基、保護された水酸基、アジド基又はＮＨＲ７を表し、Ｒ７は、水素原子又はアミノ基の保護基を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）

Description

ヌクレオシド誘導体及びその利用
　本願は、2022年5月18日に日本国特許庁に出願した日本国特許出願である特願2022-81913に基づく優先権を主張する出願であり、ここに、当該日本国特許出願の内容を本明細書の一部を構成するものとして援用する。
　本明細書は、ヌクレオシド誘導体及びその利用に関する。
　ｍＲＮＡとハイブリダイズして遺伝子の発現を抑制するように設計されるＲＮＡ薬剤の一つとして、ＲＮＡ干渉を利用するＲＮＡ干渉剤であるｓｉＲＮＡや、RNaseＨ相互作用を利用するアンチセンス核酸（ＡＳＯ）が開発されてきている。
　これらの薬剤を用いて効果的に遺伝子発現を抑制するには、標的部位の選択の他、薬剤の標的ＲＮＡとのハイブリダイズ能、ヌクレアーゼ耐性能、細胞膜透過性能が求められるほか、薬剤固有の遺伝子発現抑制作用に基づく遺伝子発現抑制能が求められる。こうした薬剤の有効性を高めるための骨格部分への種々の修飾が試みられている（特許文献１）。
国際公開第２０１８／１１０６７８号パンフレット
　種々の修飾体が創出されているものの、こうした修飾体の立体異性と上記各種機能についての具体的知見は極めて少ない。さらに、ｓｉＲＮＡやＡＳＯにおける修飾体への導入部位と上記各種機能との関係も必ずしも明らかではなく、特定の修飾体に好適な導入部位を予測することは極めて困難な状況となっている。
　本発明者らは、これまで、リボースの４’位炭素原子に対するアミノアルキル基の修飾や同５’位炭素原子に対する種々の修飾について検討してきた。その過程において、４’位アミノアルキル修飾では、細胞膜透過性能及びヌクレアーゼ抵抗性能に優れるが、そのＮ型－Ｓ型互換異性により標的ＲＮＡとの二本鎖形成能が低下していることがわかった。
　また、同５’位アミノアルキル修飾では、Ｒ体とＳ体との双方が存在する。Ｒ体については、遺伝子発現抑制能に優れることは報告されていたが、Ｓ体については、なんら報告されていなかった。
　本明細書は、ヌクレオシド誘導体及び当該ヌクレオシド誘導体を用いたＲＮＡ薬剤を提供する。
　本発明者らは、ある種のアミノアルキル基を、リボースの５’位炭素原子への導入を試みたところ、種々の検討の結果、５’位についてのＳ体を得ることができた。かかるＳ体をｓｉＲＮＡの導入種として利用するとき、意外にも標的ＲＮＡに対する高い親和性を発揮するとともに優れたヌクレアーゼ耐性も発揮することがわかった。Ｓ体についてのこうした作用を予測することは困難であった。
　さらに、Ｓ体を、パッセンジャー鎖の５’末端領域に導入したところ、ｓｉＲＮＡは、優れたヌクレアーゼ耐性能と遺伝子発現抑制能とを発揮した。本明細書は、これらの知見に基づき、以下の手段を提供する。
［１］ヌクレオシド誘導体であって、
　以下の式（１）で表される、誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （上記式（１）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、Ｒ2は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、保護されたホスホロチオエート基、又は－Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を表し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なり、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、ホスホロチオエート基又は保護されたホスホロチオエート基を表し、Ｒ4は、水酸基、保護された水酸基、アジド基又はＮＨＲ７を表し、Ｒ７は、水素原子又はアミノ基の保護基を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
［２］前記Ｒ１は、メトキシ基である、［１］に記載の誘導体。
［３］前記Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルである、［１］又は［２］に記載の誘導体。
［４］少なくとも以下の式（３）で表される塩基含有単位を含む、オリゴヌクレオチド。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （上記式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｘ1は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）、ＳＨ（又はＳ－）を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
［５］パッセンジャー鎖の３’末端から第１塩基以上第９塩基以内及び／又は前記パッセンジャー鎖の５’末端から第１塩基以上第６塩基以内の範囲に、以下の式（３）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （上記式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｘ1は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）、ＳＨ（又はＳ－）を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
で表される塩基含有単位を１個又は２個以上備える、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖。
［６］ガイド鎖の５’末端から第７塩基の位置に、以下の式（３）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （上記式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｘ1は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）、ＳＨ（又はＳ－）を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
で表される塩基含有単位を備える、ｓｉＲＮＡのガイド鎖。
［７］［５］に記載のパッセンジャー鎖及び／又は［６］に記載のガイド鎖を備える、ｓｉＲＮＡ。
［８］　以下の式（４）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （上記式（４）中、Ｒ7は、アセチル基又は互いに結合してＲ７に結合する酸素原子を－Ｃ（ＣＨ3）2－で連結した環状構造を表し、Ｒ8は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、水酸基、保護された水酸基又はアジド基を表す。）
［９］式（１）で表されるヌクレオシド誘導体の合成方法であって、
　以下の式（４）で表される中間体の１’位炭素原子に、プリン塩基又はピリミジン塩基を導入する工程を含む、合成方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （上記式（４）中、Ｒ7は、アセチル基を表し、Ｒ8は、水酸基の保護基を表し、Ｒ９は水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、アジド基を表す。）
本明細書に開示されるｓｉＲＮＡの概要を示す図である。 Ｓ体を含むオリゴマーの二重鎖形成能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むオリゴマーのヌクレアーゼ抵抗性能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むオリゴマーのヌクレアーゼ抵抗性能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むガイド鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の他の評価結果を示す図である。 両末端にＳ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の他の評価結果を示す図である。 両末端にＳ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の他の評価結果を示す図である。 パッセンジャー鎖におけるＳ体の導入部位と遺伝子発現抑制能との関係を示す図である。 Ｓ体を含むガイド鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むガイド鎖を備えるｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の他の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性能の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性能の他の評価結果を示す図である。 Ｓ体を含むパッセンジャー鎖を備えるｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性能の他の評価結果を示す図である。 ヌクレアーゼ抵抗性能の観点から見た、ｓｉＲＮＡへのＳ体の導入例を示す図である。 種々の観点から見た、ｓｉＲＮＡへのＳ体の導入例を示す図である。 KNTC2遺伝子に対するsiRNAの構成を示す図である。 KNTC2遺伝子に対するsiRNAの遺伝子発現抑制能を、内部標準遺伝子としてのＧＬ３を用いて、ΔＣＴ法にて評価した結果を示す図である。
　本明細書の開示は、ＲＮＡ薬剤に有用なヌクレオシド誘導体に関する。具体的には、アミノプロピル基をリボースの5’位に特定の鏡像異性体（Ｓ型）で備えるヌクレオシド誘導体（以下、Ｓ体ともいう。）と、このＳ体を特定部位に備えるＲＮＡ薬剤とに関する。
　本明細書における開示によれば、特定の鏡像異性体であるＳ体を、ＲＮＡ薬剤の導入種として選択し、かつ、部位特異的にＲＮＡ薬剤に導入する。これにより、ＲＮＡ薬剤の二本鎖ハイブリダイズ能、ヌクレアーゼ耐性能、遺伝子発現抑制能を最大化することができる。
　以下では、本発明の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善されたヌクレオシド誘導体及びその利用を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本発明を実施する際に必須のものではなく、特に本発明の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本発明の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
　以下、本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体又はその塩及びその利用について説明する。説明の都合上、ヌクレオシド誘導体について説明し、その後、かかるヌクレオシド誘導体を含む、ＲＮＡ薬剤デザインについて説明する。
　なお、以下、本明細書において記載される化合物における置換基における「低級」の意は、該置換基を構成する炭素数が、最大１０個までであることを意味している。例えば、通常は炭素数１～６個、又は炭素数１～５個が例示され、また例えば、炭素数１個以上４個以下であり、また例えば、炭素数１個以上３個以下である。
＜ヌクレオシド誘導体＞
　本明細書に開示されるヌクレオシド誘導体（Ｓ体）は、以下の式（１）で表される。Ｓ体は、式（１）で表される不斉炭素原子である５’位炭素原子に関して、置換基がＳ配置の立体配置を採る鏡像異性体である。また、置換基として、窒素原子（Ｎ）含有プロピル基を、５’位炭素原子に炭素原子に結合して備えている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
[Ｒ１について]
　式（１）中、Ｒ1は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基、又は保護基によって保護された水酸基を表す。
＜アルキル基＞
　アルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１～６個の低級アルキル基、又は炭素数１～５個の低級アルキル基がより好ましい例として挙げられ、さらに炭素数１～４個又は炭素数１～３個の低級アルキル基が特に好ましい例として挙げられる。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、又ｎ－ブチル基等が好適な例として挙げられ、このうち、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基が好ましく、また例えばメチル基、エチル基が好ましく、また例えばメチル基が好ましい。また分枝状の炭素数１から４までのアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基等が挙げられ、このうち、イソプロピル基が特に好ましい例として挙げられる。また、環状の炭素数１から４までのアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロプロピルメチル基等が挙げられる。
＜アルケニル基＞
　アルケニル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルケニル基が好ましく、低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基などが挙げられる。
＜水酸基の保護基＞
　水酸基の保護基としては、当業者に周知であって、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００７年版）を参考にすることができる。水酸基の保護基としては、代表的な例を挙げると、例えば、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルコキシメチル基、適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基、適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但し前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン原子、又はシアノ基を意味する。）、又はシリル基等が例示される。
　アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルエーテル基が挙げられる。低級アルコキシ基が好ましく、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１～６個の低級アルコキシ基、又は炭素数１～５個の低級アルコキシ基が挙げられ、さらには炭素数１～４個、又は炭素数１～３個のアルコキシ基が好ましく、炭素数１～４個のアルコキシ基が特に好ましい。炭素数１～４個のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、又はｎ－ブトキシ基等が好ましい例として挙げられる。また、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、又はｔ－ブトキシ基等も好ましい例として挙げられる。また、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基も好ましく、シクロプロピルメトキシ基も好ましい例として挙げられる。
　これらのうち、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基が特に好ましい例として挙げられる。また、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但しその置換アリールにおける置換基は、前述の通り）も好ましい例として挙げられる。
　脂肪族アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基、カルボキシアルキルカルボニル基、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基、又は低級アルコキシ低級アルキルカルボニルが挙げられる。
　アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。すなわち、アルキルカルボニル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３－メチルノナノイル基、８－メチルノナノイル基、３－エチルオクタノイル基、３，７－ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１－メチルペンタデカノイル基、１４－メチルペンタデカノイル基、１３，１３－ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５－メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１－メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、又はヘナイコサイル基が挙げられる。このうち、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基が好ましい例として挙げられ、さらにはアセチル基が特に好ましい例として挙げられる。また前記カルボキシ化アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。カルボキシ化の置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、カルボキシ化アルキルカルボニル基としては、例えばスクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基が挙げられる。
　ハロゲノ低級アルキルカルボニル基における、ハロゲン、低級、及びアルキルについては前述の説明の通りである。ハロゲンの置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基としては、例えばクロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。
　低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基における、アルコキシ及びアルキル、さらに低級については前述の説明の通りである。低級アルコキシが置換する位置などについても適宜選択できる。すなわち、低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基として、例えばメトキシアセチル基が挙げられる。
　芳香族アシル基としては、例えば、アリールカルボニル基、ハロゲノアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシ化アリールカルボニル基、カルボキシ化アリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、又はアリール化アリールカルボニル基が挙げられる。
　アリールカルボニル基としては、例えばベンゾイル基、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基が挙げられ、さらに好ましくはベンゾイル基が挙げられる。前記ハロゲノアリールカルボニル基としては、例えば、２－ブロモベンゾイル基、４－クロロベンゾイル基が挙げられる。前記低級アルキル化アリールカルボニル基としては、２，４，６－トリメチルベンゾイル基、４－トルオイル基、３－トルオイル基、２－トルオイル基が挙げられる。前記低級アルコキシ化アリールカルボニル基としては、例えば４－アニソイル基、３－アニソイル基、２－アニソイル基が挙げられる。
　カルボキシル化アリールカルボニル基としては、例えば２－カルボキシベンゾイル基、３－カルボキシベンゾイル基、４－カルボキシベンゾイル基が挙げられる。前記ニトロ化アリールカルボニル基としては、例えば、４－ニトロベンゾイル基、３－ニトロベンゾイル基、２－ニトロベンゾイル基が挙げられる。前記アリール化アリールカルボニル基としては、例えば、４－フェニルベンゾイル基が挙げられる。
　低級アルコキシメチル基としては、例えばメトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基が挙げられる。特に好ましくはメトキシメチル基が挙げられる。
　適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基、又はアルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。
　低級アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニルイソブトキシカルボニル基が挙げられる。前記ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基としては、２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル基が挙げられる。
　アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基が挙げられる。上記の、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基としては、例えばテトラヒドロピラン－２－イル基、又は、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはテトラヒドロピラン－２－イル基が挙げられる。
　適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基としては、例えばテトラヒドロチオピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基が挙げられ、さらに好ましくはテトラヒドロチオピラン－２－イル基が挙げられる。合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基、においては、前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、又はシアノ基を意味する。
　合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基としては、例えばベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基が挙げられ、好ましくはベンジル基、トリフェニルメチル基が挙げられる。その他に、例えば９－アンスリルメチル４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基が挙げられ、好ましくは、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基が挙げられる。その他の種類として、例えば４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられ、好ましくは４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられる。さらには、例えば４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基が挙げられる。またその他に、例えば４－シアノベンジル基も好ましい例として挙げられる。
　シリル基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ－ｔ－ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリルフェニルジイソプロピルシリル基が挙げられる。このなかでさらに好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられ、特に好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられる。
　水酸基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。水酸基の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。なお、保護された水酸基は、かかる保護基で水素原子が置換された水酸基ということができる。
[Ｒ2について]
　Ｒ2は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、ホスホロチオエート基、保護されたホスホロチオエート基、又は－Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6を表す。水酸基の保護基は、既述のとおりである。ホスホロチオエート基は、リン酸基の１つの酸素原子が硫黄原子で置換された基である。
＜保護されたリン酸基＞
　保護されたリン酸基における保護基は当業者に公知であるが、例えば、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、シリル基で置換されたエチル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、シクロアルキル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、アラルキル基、ニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基、ハロゲンでアリール環が置換されたアラルキル基、低級アルキル基で置換されたアリール基、ハロゲンで置換されたアリール基、又はニトロ基で置換されたアリール基が挙げられる。
　低級アルキル基としては、前述したとおりである。シアノ基で置換された低級アルキル基としては、例えば２－シアノエチル基、２－シアノ－１，１－ジメチルエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２－シアノエチル基が挙げられる。シリル基で置換されたエチル基としては、例えば２－メチルジフェニルシリルエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、２－トリフェニルシリルエチル基が挙げられる。
　ハロゲンで置換された低級アルキル基としては、例えば２，２，２－トリクロロエチル基、２，２，２－トリブロモエチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２，２，２－トリクロロエチル基が挙げられる。前記の低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基などが挙げられる。
　シアノ基で置換された低級アルケニル基としては、例えば２－シアノエチル基、２－シアノプロピル基、２－シアノブテニル基が挙げられる。前記のアラルキル基としては、例えばベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、インデニルメチル基、フェナンスレニルメチル基、アントラセニルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１－フェネチル基、２－フェネチル基、１－ナフチルエチル基、２－ナフチルエチル基、１－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、３－フェニルプロピル基、１－ナフチルプロピル、２－ナフチルプロピル、３－ナフチルプロピル、１－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、３－フェニルブチル基、４－フェニルブチル基が挙げられ、さらに好ましくは、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１－フェネチル基、２－フェネチル基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基が挙げられる。
　ニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基としては、２－（４－ニトロフェニル）エチル基、０－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、２，４－ジニトロベンジル基、４－クロロ－２－ニトロベンジル基などが挙げられる。
　リン酸の保護基は、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。リン酸の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。
＜－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6＞
　Ｓ体のＲ2は、－Ｐ(＝Ｏ)n(Ｒ5)Ｒ6となる場合がある。ｎは０又は１を示し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なり、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。保護された水酸基及び低級アルコキシ基については、既に説明したとおりである。
＜保護されたメルカプト基＞
　保護されたメルカプト基は、当業者において周知である。保護されたメルカプト基としては、例えば上記水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばアルキルチオ基、アリールチオ基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられ、特に好ましくは、芳香族アシル基が挙げられる。芳香族アシル基としてはベンゾイル基が挙げられる。
　アルキルチオ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルチオ基が挙げられる。低級アルキルチオ基が好ましく、低級アルキルチオ基としては、例えば炭素数１～６個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１～５個の低級アルキルチオ基が好ましく、さらには炭素数１～４個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１～３個までのアルキルチオ基が特に好ましい例として挙げられる。炭素数１～４個の飽和アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチオルチオ基、ｎ－プロピルチオ基、ｎ－ブチルチオ基等が好ましい例として例示される。アルキルチオ基としては、低級アルキルチオ基が好ましく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｔ－ブチルチオ基が好ましい例として挙げられる。またイソプロピルチオ基、イソブチルチオ基、ｓ－ブチルチオ基、又はｔ－ブチルチオ基等も好ましい例として例示される。またシクロプロピルチオ基、又はシクロブチルチオ基が好ましい例として挙げられ、さらにシクロプロピルメチルチオ基がさらに好ましい例として例示される。
　アリールチオ基としては、例えばベンジルチオが挙げられる。
　シアノ低級アルコキシ基としては、例えば、シアノ基が置換した直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである炭素数１～５個のアルコキシ基（なお、シアノ基中の炭素の数を含めずに数えた場合）が好ましい例として挙げられ、具体的には例えば、シアノメトキシ、２－シアノエトキシ、３－シアノプロポキシ、４－シアノブトキシ、３－シアノ－２－メチルプロポキシ、又は１－シアノメチル－１，１－ジメチルメトキシ等が挙げられ、特に好ましくは、２－シアノエトキシ基が挙げられる。
　Ｒ5及びＲ6として、置換されたアミノ基が選択できる。そのアミノ基の置換基は、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、又は低級アルキル基のいずれかを示す。なお前記Ｒ5及びＲ6が共に、置換されたアミノ基である場合では、該置換されたアミノ基として互いに異なった置換されたアミノ基であってもよい。前記の低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、及び低級アルキル基は、前述に説明された通りである。
　－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6としては、より具体的には、ホスホロアミダイト基、H－ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられ、ホスホロアミダイト基が特に好ましい例として挙げられる。
　－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが０であり、Ｒ5及びＲ6の少なくとも一方が置換されたアミノ基であり、他方は何であってもよい場合には、ホスホロアミダイト基となる。ホスホロアミダイト基としては、Ｒ5及びＲ6の一方が置換されたアミノ基であり、他方が低級アルコキシ基、又はシアノ低級アルコキシ基であるホスホロアミダイト基が、縮合反応の反応効率が良好であり、特に好ましい。その置換されたアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはジイソプロピルアミノ基が例示される。また、Ｒ5及びＲ6の他方の置換基における低級アルコキシ基としては、メトキシ基が好ましい例として挙げられる。また、シアノ低級アルコキシ基としては、２－シアノエチル基が好ましい例として挙げられる。ホスホロアミダイト基としては、具体的には、－Ｐ（ＯＣ2Ｈ4ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、又は－Ｐ（ＯＣＨ3）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）が好ましい例として挙げられる。
　－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが１であり、Ｒ5及びＲ6の少なくとも一方が水素原子であり、他方は水素原子以外であれば何であってもよい場合には、H－ホスホネート基となる。その、水素以外の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、チオール基等が挙げられ、特に好ましくはヒドロキシル基が例示される。
　また、－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6において、ｎが１であり、Ｒ5及びＲ6が共に低級アルコキシ基である場合には、ホスホニル基となる。なお、Ｒ5及びＲ6における低級アルコキシ基は互いに同一でも相違していてもよい。その低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が好ましい例として挙げられる。ホスホニル基としては、具体的には、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ3）2が挙げられる。
　Ｓ体におけるＲ2としては、例えば、－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6であることが特に好ましい。－Ｐ（＝Ｏ）n（Ｒ5）Ｒ6としては、ホスホロアミダイト基、Ｈ－ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。Ｒ2としては、その他にリン酸基、又は保護されたリン酸基であることも好ましい。さらにＲ2としては、水素原子、又は水酸基の保護基であることも好ましい。
　Ｒ2の具体的な他の例示としては、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基、－Ｐ（ＯＣ2Ｈ4ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、－Ｐ（ＯＣＨ3）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ3）2）、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。
[Ｒ３について]
　Ｒ３は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、ホスホロチオエート基又は保護されたホスホロチオエート基を表す。これらについては、既述のとおりである。Ｒ３としての具体的な例示を挙げると、水素原子、メチル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、tert-ブチルジフェニルシリル基、又はトリメチルシリル基が好ましい例として挙げられる。
[Ｒ４について]
　Ｒ４は、アジド基（Ｎ３－）、水酸基、保護された水酸基、ＮＨＲ７を表す。Ｒ７としては、水素原子又はアミノ基の保護基が挙げられる。保護された水酸基については既に述べた通りである。
　アミノ基に対する保護基は、当業者に周知されており、前述の参考文献を参照することができるほか、具体的には、上記にて水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばベンジル基、メチルベンジル基、クロロベンジル基、ジクロロベンジル基、フルオロベンジル基、トリフルオロメチルベンジル基、ニトロベンジル基、メトキシフェニル基、メトキシメチル（ＭＯＭ）基、Ｎ－メチルアミノベンジル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノベンジル基、フェナシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、フタルイミド基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１－メチル－１－（４－ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２－（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基などが挙げられる。さらに好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１－メチル－１－（４－ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２－（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。
　本発明においてアミノ基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解又は光分解など）及び生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。特に、加水素分解又は加水分解により脱離する置換基がアミノ基の保護基として好ましい。
[Ｂについて]
　Ｓ体におけるＢとしては、プリン塩基又はピリミジン塩基が挙げられる。例えば、Ｂとしては、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基が選択できる。
　また例えば、Ｂとしては、２，６－ジクロロプリン－９－イル、又は２－オキソ－ピリミジン－１－イルが挙げられる。さらに、２－オキソ－４－メトキシ－ピリミジン－１－イル、４－（１H－１，２，４－トリアゾール‐１－イル）－ピリミジン－１－イル、又は２，６－ジメトキシプリン－９－イルが挙げられる。
　また例えば、アミノ基が保護された２－オキソ－４－アミノ－ピリミジン－１－イル、アミノ基が保護された２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル、アミノ基が保護された２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル、アミノ基及び／又は水酸基が保護された２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル、アミノ基が保護された２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、アミノ基が保護された６－アミノプリン－９－イル、又はアミノ基が保護された４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－１－イル基が挙げられる。なお、水酸基及びアミノ基の各保護基については、後述する。
　また例えば、６－アミノプリン－９－イル（アデニン）、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル（グアニジン）、２－オキソ－４－アミノ－ピリミジン－１－イル（シトシン）、２－オキソ－４－ヒドロキシ－ピリミジン－1－イル（ウラシル）、又は２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル（チミン）が挙げられる。
　また例えば、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－１－イル（メチルシトシン）、２，６－ジアミノプリン－９－イル、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル、６－メルカプトプリン－９－イル、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－ピリミジン－１－イル、又は２－オキソ－４－メルカプト－ピリミジン－１－イルが挙げられる。
　また例えば、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、又は２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イルが挙げられる。
　置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基それぞれにおける置換基は、水酸基、保護された水酸基、低級アルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、低級アルキル基で置換されたアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシメチル基、又はハロゲン原子のいずれか一つ、又はそれらの複数の組み合わせのいずれかである。これらの置換基は、後述する。
　Ｓ体におけるＢとしては、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基における置換基は後述するが、これに加えてさらに、トリアゾール基、低級アルコキシメチル基が加わることも好ましい。
　置換プリン－９－イル基の好ましい例としては、例えば、６－アミノプリン－９－イル、２，６－ジアミノプリン－９－イル、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル、２，６－ジメトキシプリン－９－イル、２，６－ジクロロプリン－９－イル、又は６－メルカプトプリン－９－イル等が挙げられる。上述の置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基及び／又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。
　置換２－オキソ－ピリミジン－１－イルとしては、例えば２－オキソ－４－アミノ－ピリミジン－１－イル、１Ｈ－（１，２，４－トリアゾール－１－イル）－ピリミジン－１－イル、４－１Ｈ－１，４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－ピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－メトキシ－ピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－メルカプト－ピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－ヒドロキシ－ピリミジン－1－イル、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル、又は４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－１－イル等が挙げられる。また、２－オキソ－４－メトキシ－ピリミジン－１－イル、又は４－（１Ｈ－１，２，４－トリアゾール‐１－イル）－ピリミジン－１－イルが好ましい例として挙げられる。
　こうしたＢのうち、置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基又は水酸基が保護された置換基が好ましい例として挙げられる。
　Ｓ体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されない。リン酸との塩基との塩であるほか、酸付加塩が例示され、分子内対イオンの形態をとっていてもよい。また例えば、置換基の種類によっては塩基付加塩が形成される場合もある。塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容しうる塩を形成する酸及び塩基の種類は当業者には周知であり、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１－１９（１９７７）に記載しているものなどを参考にすることができる。例えば、酸付加塩としては、鉱酸塩、有機酸塩が挙げられる。また、一個以上の置換基が酸性部分を含有する場合、塩基付加塩も好ましい例として挙げられる。
　鉱酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、リン酸水素酸塩などが挙げられる。通常は、塩酸塩、リン酸塩、が好ましい例として挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はｐ－トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。通常は、酢酸塩等が好ましい例として挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩、有機アミン塩、アミノ酸の付加塩が挙げられる。
　前記のアルカリ金属の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また、アルカリ土類金属の塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等が例示される。また、アミノ酸の付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
　Ｓ体又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本明細書の開示の範囲に含まれる。Ｓ体又はその塩は、後述する合成方法に基づいて合成することができる。
＜Ｓ体の合成方法＞
　Ｓ体は、例えば、以下の方法で合成することができる。以下には、塩基として、第二級アミノ基－ＮＨを有する塩基であるウラシルを有するＳ体と、塩基として第一級アミノ基を有する塩基であるアデニン及びグアニンを有するＳ体とに分けて、合成例を示す。
（ウリジン誘導体、シチジン誘導体）
　以下に示すように、ウリジンを出発物質として、以下のスキームに従って、ウリジンの誘導体としてのＳ体を得ることができる（Ref:Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 6171Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 6171）。なお、以下のスキームにおいて、３５以降の化合物が、Ｓ体に包含される。スキームにおける反応の詳細は、実施例に開示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　また、シチジン誘導体としてのＳ体は、以下のスキームに従い得ることができる。スキームにおける反応の詳細は、実施例に開示される。なお、以下のスキームにおいて、化合物３６以降が、Ｓ体に包含される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（アデノシン誘導体、グアノシン誘導体）
　これらの塩基を有するヌクレオシドについては、以下のスキームに従い、予めＳ体の共通中間体を準備する。この中間体に対して塩基を導入することにより、これらの塩基のアミノ基の保護基の脱保護を回避して、Ｓ体を得ることができる(Ref:Org. Lett., 2001, 22, 3583.）。なお、ウリジンヌクレオシドやチミジンヌクレオシドについてもこの中間体を利用できる。例えば、以下のスキームにおいて、本明細書に開示される中間体は、化合物４９～５２であるが、化合物４７～４８もその前駆体として有用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　アデノシン誘導体は、以下のスキームに従い、得ることができる。例えば、以下のスキームにおいて、化合物５３以降が、Ｓ体に包含される。スキームにおける反応の詳細は、実施例に開示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　グアノシン誘導体は、以下のスキームに従い、得ることができる。例えば、以下のスキームにおいて、化合物６３以降が、Ｓ体に包含される。スキームにおける反応の詳細は、実施例に開示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　以上説明したＳ体は、オリゴヌクレオチドの構造単位を形成するためのリボヌクレオシド又はリボヌクレオチドとして有用である。
　Ｓ体は、ｓｉＲＮＡにおいて、例えば、公知のＤＮＡ又はＲＮＡの合成法に従い、ホスホロアミダイド体として及び／又は固相に結合された形態として、公知のリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチド等が連結してなる基本骨格に導入される。これにより、オリゴヌクレオチドの骨格を構成する構造単位である塩基含有単位を構成することができる。
　なお、ＲＮＡ薬剤の骨格を構成するリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドは、天然のリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよいし、種々の公知の化学修飾されたリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい。
　化学修飾されたリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドとしては、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、塩基の修飾体などの他、例えば、以下の式（２）で表されるヌクレオチド誘導体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　上記式（２）においては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは、Ｒ１に、フッ素原子を表すことを含む以外は、式（１）におけるこれらの基と同義である。典型的には、Ｒ１が、フッ素原子であるリボヌクレオチド、ＯＣＨ３であるリボヌクレオチド、Ｒ２がチオール化されたリボヌクレオチド等が挙げられる。こうした公知の化学修飾体は、いずれも、当業者であれば、適宜合成することができるほか、商業的に入手することができる。
＜Ｓ体を得るための中間体及びＳ体の合成方法＞
　本明細書によれば、以下の式（４）で表されるＳ体を得るための中間体が提供される。また、以下の式（５）で表される中間体前駆体が提供される。さらにまた、本明細書によれば、この中間体を用いたＳ体の合成方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　式（４）において、Ｒ7は、アセチル基又は互いに結合してＲ７に結合する酸素原子を－Ｃ（ＣＨ3）2－で連結した環状構造を表し、Ｒ8は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、水酸基、保護された水酸基又はアジド基を表す。式（４）における、水酸基の保護基については、既に式（１）で表されるヌクレオシド誘導体において説明した水酸基の保護基と同様に態様が適用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　式（５）において、Ｒ7は、互いに結合してＲ７に結合する酸素原子をーＣ（ＣＨ3）2－で連結した環状構造を表し、Ｒ8は、水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水素原子又は水酸基の保護基を表す。式（５）における、水酸基の保護基については、既に式（１）で表されるヌクレオシド誘導体において説明した水酸基の保護基と同様に態様が適用される。
　式（４）で表される中間体としては、既述のアデノシンヌクレオシド及びグアノシンヌクレオシドの共通中間体の合成スキームの化合物４９～５２が包含される。こうした共通中間体は、例えば、式（４）中、Ｒ7は、アセチル基又は互いに結合してＲ７に結合する酸素原子を－Ｃ（ＣＨ3）2－で連結した環状構造を表し、Ｒ8は、水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、水酸基、保護された水酸基又はアジド基を表す化合物である。かかる共通中間体における保護基は、既述の保護基等から適宜選択される。
　アデノシン誘導体及びグアノノシン誘導体の直接の出発物質としては、化合物５２を用いることができる。化合物５２に対して、塩基部分を構成する化合物を導入することで、効率的に、オリゴリボヌクレオチドを合成するのに有用なアデノシン誘導体及びグアノシン誘導体などを合成できる。例えば、化合物５２などの共通中間体は、式（４）中、Ｒ7は、アセチル基を表し、Ｒ8は、水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、アジド基を表す化合物である。かかる共通中間体における保護基は、既述の保護基等から適宜選択される。
　式（５）で表される中間体前駆体としては、既述の共通中間体の合成スキームの化合物４７～４８が包含される。化合物４７及び４８は、リボースの５’位炭素原子に対して、Ｓ配置で２－プロペニル基（アリル基）を備えており、その後の付加反応により、種々の置換基を導入できる。かかる中間体前駆体における保護基は、既述の保護基等から適宜選択される。
　本明細書によれば、式（４）で表される共通中間体を用いて、式（１）で表されるヌクレオシドのうち、塩基としてアデニンやグアニンなどのプリン塩基を備えるヌクレオシドを合成する方法も提供される。すなわち、式（４）で表される共通中間体、なかでも、式（４）中、Ｒ7は、アセチル基を表し、Ｒ8は、水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、アジド基を表す化合物である共通中間体の１’位炭素原子にプリン塩基若しくはピリミジン塩基又はアミノ基が保護されたプリン塩基若しくはピリミジン塩基を導入する工程、なかでもプリン塩基又はアミノ基が保護されたプリン塩基を導入する工程を含むことができる。こうすることで、プリン塩基におけるアミノ基の保護基の脱離を回避又は抑制してＳ体を得ることができる。
　式（４）で表される共通中間体の１’位炭素原子へのプリン塩基などの導入は、第二塩化錫（ＩＶ）などを用いたグリコシル化反応により可能である。塩基を導入することで、式（１）で表されるＳ体の一態様を得ることができる。さらに、公知の方法により、各種の保護基の導入及び脱離などを施すことで、所望のＳ体を得ることができる。
＜リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド＞
　本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも以下の式（３）で表される塩基含有単位を１個又は２個以上含んでいる。オリゴヌクレオチドは、以下の式（３）で表される塩基含有単位のほか、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。リボヌクレオチドとしては、既述の式（２）で表されるリボヌクレオチドが連結された１種又は２種以上の塩基含有単位（以下、単に、Ｓ体含有単位ともいう。）が包含される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表す。これらは、式（１）に関し、既に説明した定義と同義である。また、Ｂは、式（１）に関し、既に説明した定義と同義である。
　式（３）において、Ｘ１は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）又はＳＨ（Ｓ－）を表す。
　オリゴヌクレオチドは、一本鎖であるが、オリゴリボヌクレオチドであってもよいし、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドのハイブリッドであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は、特に限定するものではなく、後述する、ＲＮＡ薬剤に応じた塩基長を備えることができる。
　オリゴヌクレオチドは、既述のとおり、公知のＤＮＡ／ＲＮＡ合成方法により化学的に合成することができる。
（ｓｉＲＮＡ）
　本明細書は、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖及びガイド鎖並びにｓｉＲＮＡを開示する。図１には、それぞれ２１塩基長のパッセンジャー鎖及びガイド鎖を備えて、それぞれの３’末端側に２塩基長のダングリング末端を有するｓｉＲＮＡを例示する。
（パッセンジャー鎖）
　ｓｉＲＮＡ活性化能の観点から、パッセンジャー鎖は、例えば、その３’末端から第１塩基以上第９塩基以内に、Ｓ体含有単位を１個又は２個以上備えることができる。また、パッセンジャー鎖は、その５’末端から第１塩基以上第６塩基以内に、Ｓ体含有単位を１個又は２個以上備えることができる。
　パッセンジャー鎖が、これらの領域のいずれか又は双方に少なくとも１個のＳ体含有単位を備えることで、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能、すなわち、ｓｉＲＮＡ活性化能を維持ないし向上させることができる。
　例えば、３’末端から第１塩基～第３塩基に、１個、２個又は３個のＳ体含有単位を備え、また例えば、３’末端から第１塩基～第４塩基に、１個、２個、３個又は４個のＳ体含有単位を備えるなどしてもよい。また例えば、５’末端から第１塩基～第３塩基に、１個、２個又は３個のＳ体含有単位を備え、また例えば、５’末端から第１塩基～第４塩基に、１個、２個、３個又は４個のＳ体含有単位を備えることもできる。こうした導入形態であっても、ｓｉＲＮＡ活性可能を維持ないし向上させることができる。このようなＳ体含有単位の配列デザインの場合、３’末端側と５’末端側との双方にＳ体含有単位を備えることもできる。
　これに対して、これらの３’末端側領域及び５’末端側領域以外の領域、すなわち、５’末端側から数えて第６塩基と、３’末端側から数えて第９塩基と、に挟まれる中間領域において、１個又は２個以上のＳ体含有単位を備えることで、ｓｉＲＮＡ活性が低下する。
　ヌクレアーゼ抵抗性能の観点から、パッセンジャー鎖は、例えば、その３’末端から第１塩基以上第５塩基以内に、Ｓ体含有単位を１個又は２個以上備えることができる。この領域にＳ体含有単位を備えることで、ヌクレアーゼ抵抗性能を向上させることができる。
　例えば、パッセンジャー鎖の３’末端の第１塩基以上第３塩基以内に、例えば、３’末端に近い側から１個以上３個以下、例えば、２個又は３個のＳ体含有単位を備えることができる。また例えば、パッセンジャー鎖の３’末端の第１塩基以上第４塩基以内に、例えば、３’末端に近い側から１個以上４個以下、例えば３個又は４個のＳ体含有単位を備えることができる。また例えば、パッセンジャー鎖の３’末端の第１塩基以上第５塩基以内に、例えば、３’末端に近い側から１個以上５個以下、例えば４個又は５個のＳ体含有単位を備えることができる。こうすることで、より高いヌクレアーゼ抵抗性能を確保することができる。
　以上のことから、パッセンジャー鎖は、ｓｉＲＮＡ活性化能及びヌクレアーゼ抵抗性能の観点から、例えば、３’末端の第１塩基以上第５塩基以内に、３’末端から３個、４個又は５個のＳ体含有単位を連続して備えることができる。また、ｓｉＲＮＡ活性化能の観点からは、５’末端から第１塩基以上第６塩基以内に１個又は２個以上のＳ体含有単位を備えることができる。また例えば、３個以上４個以下のＳ体含有単位を備えることができる。
（ガイド鎖）
　ガイド鎖は、ｓｉＲＮＡ活性化能の観点から、ガイド鎖の５’末端から第７塩基の位置にＳ体含有単位を備えることができる。この位置にＳ体含有単位を備えることで、ｓｉＲＮＡ活性化能を維持又は向上させることができる。
　一方、上記第７塩基以外の部位に１個又は２個以上のＳ体含有単位を備えることで、ｓｉＲＮＡ活性化能を低下させることになる。また例えば、５’末端から第１塩基から第６塩基及び第８塩基の位置にＳ体含有単位を備えることでもｓｉＲＮＡ活性化能を低下させることになる。
　なお、本明細書において、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖及びガイド鎖の塩基長は特段限定するものではないが、例えば、それぞれ、２１塩基以上２５塩基以下のオリゴリボヌクレオチド鎖である。また、ｓｉＲＮＡとしては、典型的には、パッセンジャー鎖及びガイド鎖がそれぞれの３’末端側に２塩基長のダングリングエンドを備えている。
　ｓｉＲＮＡのガイド鎖には、５’末端から第１塩基及び第３塩基には、２’－ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを備えることができる。また、５’末端から第２塩基には、２’－Ｆ修飾リボヌクレオチドを備えることができる。
　以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
（5′-C-アミノアルキル修飾ヌクレオシドアナログ： (Ｓ)-5′-C-Aminopropyl-2′-O-methyluridineの合成）
　合成スキームを以下に示す。まず、ヌクレオシド糖部の5′位水酸基をアルデヒドへ酸化し、ルイス酸存在下アリルトリメチルシランによる細見-櫻井アリル化反応を用いて、糖部5′位へアリル基を導入した後、アリル基をアジドプロピル基まで変換し、対応するホスホロアミダイト体へ導いた。すなわち、市販のウリジンを出発物質として既知の合成法73,74に基づいて、糖部3′位水酸基をTBDMS基で保護した化合物27を合成した。
　糖部5′位水酸基をPfitzner-Moffatt酸化によりアルデヒドへ変換し、ルイス酸存在下でアリルトリメチルシランを反応させることで、糖部5′位にアリル基を有する化合物29及び30を得た。1H-NMRの解析により、化合物29及び30は互いに5′位の立体配置が異なるジアステレオマーであることが確認できた。
　目的の立体化学である化合物29の5′位水酸基をDMTr基で保護し、ブラウンヒドロホウ素化に続く過酸化水素による酸化反応により、5′位にヒドロキシプロピル基を有する化合物32を得た。生じた水酸基をトシル化し、NaN3によりアジド化した化合物34を合成した。続いて、シュタウディンガー反応によりアジド基をアミノ基へ還元し、生じたアミノ基をトリフルオロアセチル基で保護した。最後に、3′位TBDPS基を脱保護し、生じた水酸基を亜リン酸化することで目的のアミダイト体37を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　試薬及び条件は、以下のとおりであった。(a) EDC HCl, CHCl2CO2H, DMSO/CH2Cl2(1: 1 v/v), -5 °C, 1.5 h; (b) allyltrimethylsilane, BF3 OEt2, CH2Cl2, 0 °C, 1 h, 29: 43% (in 2 steps); 30: 2% (in 2 steps); (c) DMTrCl, 2,6- lutidine, pyridine, 40 °C, 67 h, 83%; (d) 9-BBN, THF then 30% H2O2 aq., 3N NaOH aq., 30 °C, 15 min, 49%; (e) p-TsCl, pyridine, CH2Cl2, r.t., 7 h, 56%; (f) NaN3, DMF, 60 °C, 11 h, 90%; (g) (i) Ph3P, H2O, THF, 40 °C, 16 h, (ii) CF3CO2Et, Et3N, CH2Cl2, r.t., 5 h, 94% (in 2 steps); (h) TBAF/THF, THF, r.t., 14 h, 84%; (i) 2-cyanoethyl-N, N, N´, N´-tetraisopropylphosphoroamidite, 1H-tetrazole, 1-methylimidazole, DMF, r.t., 1 h, 89%.
　なお、このＳ体の鏡像異性体であるＲ体のアミダイト体を、国際公開第2018/110678号パンフレットに準じて合成した。さらに、これらのアミダイト体を用いて、Ｓ体及びＲ体を連結した固相担体３９，４１を常法に従い合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（RNAの化学合成及び合成したＲＮＡの評価）
　実施例１で合成したアミダイト体及び固相担体等を用いて、図２に示す塩基配列（配列番号１～２）及び構成の一本鎖ＲＮＡを公知の固相ホスホロアミダイト法に従い合成し、二本鎖ＲＮＡを準備した。これらの二本鎖ＲＮＡにつき、二重鎖形成能、熱力学的パラメータの算出を行った。
（二重鎖形成能の評価）
　合成し準備した二重鎖RNAを15 °Cから70 °Cまで加熱した際の260 nmにおける吸光度の上昇を測定し、得られたシグモイド曲線から二重鎖50%融解温度 (Tm) を算出した。
　図２に示すように、各オリゴヌクレオチドのTmを測定した結果、アミノプロピル基を導入する位置に関わらず天然のオリゴヌクレオチドと比べ、Tmが減少することが明らかとなった。しかし、ヌクレオシドアナログ間で比較したところ、Ｓ体、(S)-5'-AP-Uを含むRNAでは1修飾当たり1.0 °Cの低下であり、Ｒ体や４’ＡＰ体と比較して大きかった。
（熱力学的パラメータの算出）
　次いで、ファントホッフプロットを用いて310 Kにおける熱力学的パラメータを算出した。オリゴヌクレオチドの二重鎖形成能はエンタルピー変化及びエントロピー変化のバランスにより決定するため、二重鎖の熱力学的な評価は重要な要素である。
今回、二重鎖の形成と解離の平衡がオリゴヌクレオチドの総濃度に依存して変化することを利用した方法を用いた。オリゴヌクレオチドの濃度を8段階 (1, 3, 6, 12, 15, 21, 30, 60M) に調整してTmを測定し、常法に従い、その傾きと切片からΔH°及びΔS°の算出を行った。そして、常法に従い、熱力学的パラメータ（ΔＤ°）を算出した。
　図２に示すように、ΔG°の値は天然 (dsRNA 1)、(S)-5'-AP-U (dsRNA 4)、4'-AP-U (dsRNA 2)、(R)-5'-AP-U (dsRNA 3) の順に絶対値が大きくなっていることから、前述のTmの結果と相関が見られた。
（ヌクレアーゼ抵抗性の評価）
　Ｓ体を導入したオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性へ及ぼす影響をウシ血清 (Bovine serum; BS) を用いて検証した。図３に示したオリゴヌクレオチド二本鎖（配列番号1～２）とＢＳとを３７°Ｃでインキュベートし、経時的にサンプルを分取した。その後、ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）によりＲＮＡ断片を分離し、ゲル中のフルオレセインによる蛍光を観察することで完全鎖長のＲＮＡを評価した。結果を併せて図３に示す。
　図３に示すように、天然のRNA 1では、30 min後に完全鎖長のRNAが消失しているのに対し、各アナログを導入したRNA 2-4（4'-AP-U (dsRNA 2)、(R)-5'-AP-U (dsRNA 3)、(S)-5'-AP-U (dsRNA 4)）では360 minの時点でも完全鎖長のバンドがはっきりと確認できた。さらにRNA 2-4の360 minにおける完全鎖長の残存率を算出したところ、RNA 2: 56%、RNA 3: 42%、RNA 4: 67%であったことから、アナログの導入はRNAのヌクレアーゼ抵抗性を大幅に向上できることが明らかとなり、特に (S)-5'-AP-Uの導入は(R)-5'-AP-U及び4'-AP-Uよりも、RNAへの高いヌクレアーゼ抵抗性の付与が可能であると確認できた。
（Ｓ体を含むｓｉＲＮＡの評価）
　新規に合成したＳ体（ここでは、(S)-5'-AP-U）は4'-AP-Uと同様に相補的な塩基配列を有するＲＮＡと二重鎖を形成し、さらにヌクレアーゼ抵抗性を増強できることを述べた。続いて、機能的なＲＮＡであるsiRNAへの(S)-5'-AP-Uの導入が、その性質にどのような影響を及ぼすかを検証した。
　まず、(S)-5'-AP-U、(Ｒ)-5'-AP-U及び4’-AP-Uを用いて熱的に安定なsiRNA二重鎖（ｓｉＲＮＡ５～８、配列番号３～４）を形成した（図４参照）。これらのｓｉＲＮＡ５～８を用いて、実施例３と同様にしてヌクレアーゼ抵抗性を評価した。結果を図５に併せて示す。
　図４に示すように、天然のｓｉＲＮＡ５では３０ｍｉｎの時点で完全に分解されているのに対し、各アナログを導入したｓｉＲＮＡ６－８では３６０ｍｉｎ後でもｓｉＲＮＡの分解が確認されなかった。したがって、(R)-5'-AP-U及び(S)-5'-AP-Uは4'-AP-Uと同様にsiRNAのヌクレアーゼ抵抗性を大幅に向上できることが明らかとなった。
（Ｓ体を含むｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価）
　(S)-5’-AP-U、(R)-5’-AP-U及び4’-AP-Uを用いて、図５～７にそれぞれ示す塩基配列及び導入部位及び導入個数にこれらのアナログを導入したｓｉＲＮＡ（配列番号３～４）を合成した。これらのｓｉＲＮＡを用いて、その遺伝子発現抑制能をDual Luciferase Reporter Assayにより評価した。この実験ではRenilla Luciferaseを標的としたsiRNAを設計し、細胞へ導入した際のRenilla Luciferase及びFirefly Luciferaseの発光強度の比を計算することでRNAi活性（ｓｉＲＮＡ濃度１ｎＭ及び１０ｎＭ）を評価した。なお、今回使用したコントロールはsiRNAを導入していないものとした。結果を図５～７に併せて示す。
　図５は、RISC形成時に分解されるパッセンジャー鎖に合成したＳ体等を図示される個所（１～３）に1個のみ導入したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図５に示すように、いずれの修飾核酸を含むsiRNAにおいても天然型と同等のRNAi活性を示し、パッセンジャー鎖への(R)-5'-AP-U及び(S)-5'-AP-Uの導入はRNAi活性に影響しないことが示唆された。
　図６は、ガイド鎖にＳ体等を図示される個所（４～６）に１個のみ導入したsiRNAの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図６に示すように、パッセンジャー鎖への導入と比較して、概して、RNAi活性が低下する傾向が見られた。ガイド鎖の5′末端から2-8塩基目はseed領域と呼ばれており、RISC形成時にArgonaute-2に厳密に認識されるため、一般にseed領域への化学修飾はRNAi活性を低下させることが多いとされている。まず、5′末端から8塩基目にアナログを導入したｓｉＲＮＡでは、Ｓ体は、Ｒ体よりは高く、４’－ＡＰ－Ｕと同等程度の遺伝子発現抑制能を示した。次に、ガイド鎖の5′末端から11番目にアナログを導入したsiRNAでは、Ｓ体が最も遺伝子発現抑制能が高く、最後に、ガイド鎖の5′末端から20番目にアナログを導入したsiRNAではいずれのアナログでも天然と同等の遺伝子発現抑制能を示した。
　また、図７は、パッセンジャー鎖の図示される３個所及びガイド鎖の図示される３’末端にＳ体等を導入したｓｉＲＮＡについての遺伝子発現能の評価結果を示す。図７に示すように、いずれのｓｉＲＮＡも、天然のsiRNAと同等のレベルで標的遺伝子の発現を抑制できることが確認された。この結果から、パッセンジャー鎖及びガイド鎖ともに化学修飾による影響が許容される修飾位置であれば、siRNAの両鎖への同時修飾が可能であることが示唆された。
（各種Ｓ体の合成）
（１）(S)-5′-C-Aminopropyl-2′-O-methylcytidineの合成
　(S)-5′-AP-C-phosphoramidite 50の合成を行った。(S)-5′- AP-U-phoshoramidite 35の合成中間体35のウラシル4位のカルボニル基を2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド (TPSCl) を用いて活性化した後、アンモニア水で処理することで4位カルボニル基をアミノ基へ変換した。続いて、Pyridine中で無水酢酸と反応させ、アミノ基をアセチル保護した後、3′位のTBDMS基を脱保護し、生じた水酸基を亜リン酸化することで、目的とする (S)-5′-AP-C-phosphoramidite 50の合成を達成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　試薬及び条件は、以下のとおりであった。(a) TPSCl, DMAP, Et3N, CH3CN, r.t., 2 h; (b) 28% NH3 aq., r.t., 2 h; (c) Ac2O, pyridine, r.t., 12 h, 86% (3 steps); (d) TBAF (1 M in THF), THF, r.t., 6 h, 89%; (e) 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchlorophosphoroamidite, DIPEA, THF, r.t., 1.5 h, 88%.
（２） (S)-5′-C-Aminopropyl-2′-O-methyl-adenosine 及び -guanosine の合成
　これらのＳ体の合成にあたり、共通の中間体を合成した。これらのアナログの塩基に適用される保護基は、塩基性条件下で立つ保護される可能性が高いからである。
（共通中間体）
　共通中間体の合成は、以下の通りに行った。スキームを以下に示す。まず、ジアセトン-D-グルコースを出発物質として、既知の方法80に基づきアルデヒド体51を合成した。 (S)-5′-AP-U-アミダイト体の合成と同様に、ルイス酸存在下でアリルトリメチルシランを反応させ、糖部5位にアリル基を有するリボフラノース誘導体52 及び53を合成した。糖部5位炭素原子の立体化学に関し、化合物52がS配置及び53がR配置であると決定した。
　続いてリボフラノース誘導体52の5位水酸基をBn基で保護するため、NaHにより水酸基を活性した後、BnBrと反応させたところ、予想に反して3位水酸基がBn保護、5位水酸基がTBDPS保護された化合物54が得られた。化合物54をブラウンヒドロホウ素化に続く過酸化水素による酸化反応によりアリル基をヒドロキシプロピル基に変換し、水酸基をトシル化した後、NaN3を反応させることで(S)-5位にアジドプロピル基を有する化合物57へ変換した。1,2-イソプロピリデン基を50%トリフルオロ酢酸水溶液中で脱保護した後、無水酢酸により1,2位水酸基をアセチル化した化合物58を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　以上のスキームにおける試薬及び条件は以下のとおりであった。
(a) allyltrimethylsilane,BF3OEt2,CH2Cl2, 40℃,30min,82%(compound52:compound53=4:1);
(b)BnBr,NaH,DMF,r.t.,16h,78%;
(c)9-BBN,THFthen30%H2O2aq.,3NNaOHaq.,40°C,1h,91%;
(d)p-TsCl,pyridine,CH2Cl2,r.t.,16h,95%;
(e)NaN3,DMF,60°C,8h,90%;
(f)(i)50%CF3CO2Haq.,r.t.,4.5h,(ii)Ac2O,pyridine,r.t.,24h,86%(2steps).
　次いで、以下のスキームで、合成した化合物58を塩化スズ (IV) 存在下でN6-benzoyladenineとのグリコシル化反応に供し、アデノシン誘導体59を合成した。続いて、2′位アセチル基をCH3OH中K2CO3で処理することで除去し、CH3Iを用いて2′位水酸基をメチル化した化合物61を収率72%で得た。次に5′位TBDPS基及び3′位Bn基を脱保護し、3′位水酸基を選択的にTBDPS基で保護した化合物64を合成した。硝酸銀 (I) 存在下でDMTrClと反応させることで5′位水酸基をトリチル化した後、シュタウディンガー反応によるアジド基のアミノ基への変換及び生じたアミノ基をトリフルオロアセチル基で保護した。最終的に化合物66の3′位TBDPS基を脱保護した後、亜リン酸化することで目的の(S)-5′-AP-A-Phosphoramidite 68を収率80%で合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　以上のスキームにおける試薬及び条件は以下のとおりであった。
(a) N6-benzoyl adenine, SnCl4/CH2Cl2, CH3CN, r.t., 2h, 70%; 
(b) K2CO3, CH3OH, 0℃, 30 min, 92%;
(c) CH3I, NaH, THF, 0℃, 2.5h, 72%;
(d) TBAF/THF, THF, r.t., 16h, 92%;
(e) BCl3/CH2Cl2, CH2Cl2, -78℃, 2h, 89%;
(f) TBDPSCl, imidazole, DMF, r.t., 24h, 76%; 
(g) DMTrCl, AgNO3, pyridine, THF, 40℃, 12h, 72%; 
(h) (i) Ph3P, H2O, THF, 45℃, 12h, (ii) CF3CO2Et, Et3N, CH2Cl2, r.t., 24h, 93%; 
(i) TBAF/THF, THF, r.t., 24h, 99%; 
(j) 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorophosphoroamidite, DIPEA, THF, r.t., 1 h, 80%.
　続いて、(S)-5′-AP-G-Phosphoramidite 79の合成を行った。まず、化合物58をTMSOTf 存在下で2-amino-6-chloropurineとのグリコシル化反応に供することで化合物69を収率75%で合成した。続いて、2′位アセチル基を脱保護した後、CH3Iにより2′位水酸基をメチル化した化合物71を合成した。化合物71を3-hydroxypropionitorileとNaHで処理することで、6位の塩素原子を酸素原子に置換したグアノシン誘導体72を収率85%で得た。環外アミノ基をイソブチリル (iBu) 基により保護した化合物73を合成し、その後は (S)-5′-AP-A phosphoramidite 68 と同様の合成経路でグアノシン誘導体73を(S)-5′-AP-G phosphoramidite 79まで変換した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　以上のスキームにおける試薬及び条件は以下のとおりであった。
(a) 2-amino-6-chloropurine, N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide, TMSOTf, toluene, 80℃, 15h, 75%; 
(b) K2CO3, CH3OH, 0℃, 30min, 93%; 
(c) CH3I, NaH, DMF, 0℃, 7h, 69%; 
(d) 3-hydroxypropionitrile, NaH, THF, 0℃, 6h, 85%; 
(e) isobutyric anhydride, DMAP, DMF, 60℃, 13h, 77%; 
(f) TBAF/THF, THF, r.t., 46h, 83% 
(g) (i) BCl3/CH2Cl2, CH2Cl2, -78℃, 4h; (ii) TBDPSCl, imidazole, DMF, 0℃, 29h, 50% (2 steps); 
(h) DMTrCl, AgNO3, pyridine, THF, 40℃, 12h, 92%; 
(i) (i) Ph3P, H2O, THF, 45℃, 22h, (ii) CF3CO2Et, Et3N, CH2Cl2, r.t., 19h, 77% (2 steps); 
(j) TBAF/THF, THF, r.t., 24h, 70%; 
(k) 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorophosphoroamidite, DIPEA, THF, r.t., 1h, 73%.
（各種Ｓ体を含むｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価；パッセンジャー鎖）
　先の実施例で合成した(S)-5′-AP-Ｕ、(S)-5′-AP-C, (S)-5′-AP-A及び(S)-5′-AP-Gの各種Ｓ体を用いて、Ｓ体の導入位置とｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の関係を評価した。なお、対照として、2'-OMeのリボヌクレオチドを用いた。図８～図１１の各図に示す塩基配列（配列番号３～４）及びＳ体の導入位置に従ってｓｉＲＮＡを合成し、実施例５の方法に準じて遺伝子発現抑制能を評価した。なお、対照として、Ｓ体に替えて2'-OMeのリボヌクレオチドを用いた。
　図８は、パッセンジャー鎖の3′-末端から3個ずつ連続した部位（部位３１～３３）をＳ体の修飾又は2'-OMe修飾を施したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図８に示すように、パッセンジャー鎖の3'-末端領域に連続した3個のＳ体修飾を含むｓｉＲＮＡは、同じ位置に2'-OMe修飾を含むｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが明らかとなった。
　図９は、パッセンジャー鎖の3′-末端から１０塩基目から３個ずつ連続した部位（部位３４～３６）をＳ体の修飾又は2'-OMe修飾を施したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図９に示すように、Ｓ体を、パッセンジャー鎖の中央領域に導入したsiRNAでは，同じ位置に2′-OMeを導入したｓｉＲＮＡと比較して、遺伝子発現抑制能が大きく低下した。
　図１０は、パッセンジャー鎖の５′-末端から３個連続した部位（部位３７）をＳ体の修飾又は2'-OMe修飾を施したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図１０に示すように、パッセンジャー鎖の５'-末端領域に連続した3個のＳ体修飾を含むｓｉＲＮＡは、同じ位置に2'-OMe修飾を含むｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが明らかとなった。
　図１１は、パッセンジャー鎖の3'末端および5'末端に3個、4個、5個の連続したＳ体修飾を含むｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図１１に示すように、パッセンジャー鎖の3′末端及び5′末端にそれぞれ3個又は4個の連続したＳ体修飾を含むｓｉＲＮＡは、同じ位置に2′-OMe修飾を含むｓｉＲＮＡとほぼ同等の遺伝子発現抑制能を示した。一方、5個の連続したＳ体修飾を含むｓｉＲＮＡは、同じ位置に2′-OMe修飾を含むｓｉＲＮＡと比べて、遺伝子発現抑制能が大きく低下した。
　以上のことから、図１２に示すように、パッセンジャー鎖3′末端及び5′末端へＳ体を導入したｓｉＲＮＡは、天然型ｓｉＲＮＡ及び同じ位置に2′-OMe修飾を含むｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を示すことが確認された。また、パッセンジャー鎖の中央部分には、Ｓ体を導入すると、２’－ＯＭｅ修飾の場合よりも、遺伝子発現抑制能の低下が大きいことがわかった。
（各種Ｓ体を含むｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価；ガイド鎖）
　実施例７と同様に、Ｓ体を用いて、ガイド鎖にＳ体を導入したｓｉＲＮＡに関して、Ｓ体の導入位置と遺伝子発現抑制能との関係を評価した。図１３～図１４の各図に示す塩基配列（配列番号３～４）及びＳ体の導入位置に従ってｓｉＲＮＡを合成し、実施例５の方法に準じて遺伝子発現抑制能を評価した。
　図１３は、ガイド鎖の５’-末端から１塩基目～４塩基目の各部位に１個のＳ体の修飾又は2'-OMe修飾を施したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図１３に示すように、ガイド鎖の５’－末端領域にＳ体を導入することは、２－ＯＭｅよりも遺伝子発現抑制能を低下させる傾向が大きいことがわかった。
　図１４は、ガイド鎖の５’-末端から５塩基目～８塩基目の各部位に１個のＳ体の修飾又は2'-OMe修飾を施したｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制能の評価結果を示す。図１４に示すように、ガイド鎖の５’－末端領域の７塩基目にＳ体を導入すると、天然ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅ体と同等の遺伝子発現抑制能を発揮できることが明らかであった。
　以上のことから、ガイド鎖の５’末端からガイド鎖の５’末端から１塩基目、２塩基目へのＳ体の導入は、遺伝子発現抑制能を完全に消失させること、３塩基目、４塩基目へのＳ体の導入も、相当程度遺伝子発現能を大きく消失させること、さらに、５塩基目、６塩基目及び８塩基目へのＳ体の導入は、遺伝子発現抑制能を一定程度低下させることが明らかであり、これらの位置は、Ｓ体の導入を回避すべきであることが明らかであった。
　一方、ガイド鎖の５’末端から７塩基目にＳ体を導入した場合、天然型siRNAと同等の活性を示したことから、当該部位にＳ体を導入することは有効であると考えられた。ガイド鎖の5′末端から2～8番目はSeed領域と呼ばれ、この領域ではArgonaute-2の多くのアミノ酸残基と相互作用していることが報告されている。このため、Seed領域へ導入可能な修飾核酸は、2′-OMe修飾及び2′-F修飾、Phosphorothioate修飾のように立体的に小さい置換基を有するものに限られていた。しかし、Seed領域への化学修飾が可能であれば、siRNAのヌクレアーゼ抵抗性を効率的に増強できる。この点において、Ｓ体のメリットがあると考えられた。
（各種Ｓ体を含むｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性の評価）
　Ｓ体の導入位置とｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性との関係を評価した。図１５～図１７の各図に示す塩基配列（配列番号３～４）及びＳ体の導入位置に従ってｓｉＲＮＡを合成し、実施例３の方法に準じてヌクレアーゼ抵抗性能を評価した。
　図１５及び図１６は、パッセンジャー鎖及びガイド鎖へのＳ体及び２’－ＯＭｅ体の導入位置と、種々の位置にＳ体等を導入したｓｉＲＮＡヌクレアーゼ抵抗性能の評価結果を組み合わせて示す。なお、ヌクレアーゼ抵抗性付与のためにはガイド鎖の化学修飾も重要であるが、ガイド鎖へのＳ体の導入は，遺伝子発現抑制能を低下させるため、ガイド鎖においては、ホスホロチオエート修飾、２’－ＯＭｅ体の導入及び2′-F体を導入した。
　図１５に示すように、パッセンジャー鎖の５’末端から１塩基目から３塩基及び３’末端から１塩基目から３塩基目及にＳ体を導入することで、24時間後でも完全鎖長のsiRNAが残存していたのに対し、同様の位置に２’－ＯＭｅ体を導入したsiRNAでは、24時間後時点で完全鎖長siRNAのバンドが確認できず、siRNAは完全に分解された。また、図１６に示すように、パッセンジャー鎖の５’末端から１塩基目～４塩基目及び５塩基目並びに３’末端から１塩基目～４塩基目及び５塩基目にＳ体を導入することで、24時間後でも完全鎖長のsiRNAが残存していたのに対し、同様の位置に２’－ＯＭｅ体を導入したsiRNAについては、図１５と同様に、siRNAは完全に分解された。したがって、Ｓ体は、2′-OMe体アナログと比べ、よりsiRNAのヌクレアーゼ抵抗性を向上させることが明らかとなった。
　次に、Ｓ体のsiRNAのヌクレアーゼ抵抗性能に及ぼす影響を詳細に調べるために，3つの連続したＳ体を、パッセンジャー鎖の3′末端又は5′末端に含むsiRNAのヌクレアーゼ抵抗性能を評価した。結果を図１７に示す。
　図１７に示すように、3′-末端領域に3つの連続したＳ体を導入したｓｉＲＮＡの完全鎖長のsiRNAに対応するバンドは，12時間後でも確認できた一方で，5′-末端域に3つの連続したＳ体を導入したｓｉＲＮＡでは、完全鎖長のsiRNAに対応するバンドは徐々に分解され、パッセンジャー鎖の同領域が天然型のｓｉＲＮＡと同様の結果となった。
　以上の結果から、ｓｉＲＮＡの３′－末端領域へのＳ体の導入は，５′－末端領域に（Ｓ）－５′－ＡＰ修飾を導入した場合に比べ、血清中のヌクレアーゼに対する耐性を効果的に向上できることが明らかとなった。また、本実施例で用いたｓｉＲＮＡでは、パッセンジャー鎖の３′－末端領域にＵＡ配列を含んでおり、このＵＡ配列付近にＳ体を含むｓｉＲＮＡでは血清中での安定性が向上している結果となった。したがって、Ｓ体を、ｓｉＲＮＡの分解を受けやすい位置、特に末端付近のＵとＡが連続した配列へ導入することで効率的にヌクレアーゼ抵抗性を向上できることが明らかとなった。
　また、本実施例で使用したｓｉＲＮＡのガイド鎖への２’－ＯＭｅ体及び２’－Ｆ体の導入状況から、ヌクレアーゼ抵抗性能に関しては、図１８に示す修飾形態が好適例の一つと考えられた。
　また、これまでの実験結果や公知の知見（Ｕｉ－Ｔｅｉルール等）から、ｓｉＲＮＡの遺伝発現抑制能とヌクレアーゼ抵抗性能に関し、図１９に示す修飾形態が好適例の一つとして考えられた。
（定量的RT-PCRによるKNTC2遺伝子発現量の測定） 
　本実施例では、図２０に示す配列（配列番号５～６）及び化学修飾で、KNTC2遺伝子に対するsiRNA４７～４９を作製し、Lipofectamine RNAiMAX（インビトロジェン社）を用いてヒト結腸癌HCT116細胞にトランスフェクトして、その遺伝子発現抑制能について評価した。なお、内部標準遺伝子としてのＧＬ３に対するｓｉＲＮＡ（配列番号７～８）も併せて作製し、同様に評価した。なお、KNTC2遺伝子は細胞周期の分裂期（M期）における染色体分離に重要な因子であり、その発現抑制によって、がん細胞などの増殖が盛んな細胞に細胞死を誘導することが可能である。
　トランスフェクションの前日に、HCT116細胞を、12ウェルプレート（培地量1mL/ウェル）に2.0×105個/ウェルで蒔きこんだ。KNTC2遺伝子に対するsiRNA（最終濃度10nM）を Lipofectamine RNAiMAX（インビトロジェン社）を用いて、最終濃度１０ｎＭでHCT116細胞にトランスフェクトした。KNTC2 siRNAと24時間インキュベーションした後、細胞を新しいプレートに再播種し、さらに24時間培養した。次に、NucleoSpin RNA Plus Kit（タカラバイオ社）を使用して細胞の全RNAを抽出し、それを鋳型としてPrimeScript RTマスターミックス（タカラバイオ社）を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAについて、サーマルサイクラーダイスリアルタイムシステム（タカラバイオ社）とTB Green Premix ExTaqII（タカラバイオ社）を使用して、以下のプライマーにより定量的RT-PCRを行った。
ヒトACTB遺伝子：5'-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3及び5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3'（配列番号９～１０）
ヒトKNTC2遺伝子：5'-CCTCTCCATGCAGGAGTTAAGA-3及び'5'-GGTCTCGGGTCCTTGATTTTCT-3'（配列番号１１～１２）
PCR反応はそれぞれのサンプルについて重複して行い、相対的な遺伝子発現量をΔCT法によって決定した。結果を、図２１に示す。
　図２１に示すように、パッセンジャー鎖の３’末端側にＳ体修飾を導入することで、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性（遺伝子発現抑制能）を妨げないことがわかった。
配列番号１、２：一本鎖ＲＮＡ
配列番号３、５、７：ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖
配列番号４、６、８：ｓｉＲＮＡのガイド鎖
配列番号９～１２：プライマー

Claims (9)

  1. 　ヌクレオシド誘導体であって、
    　以下の式（１）で表される、誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式（１）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表し、Ｒ2は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、保護されたホスホロチオエート基、又は－Ｐ（＝Ｏ）nＲ5Ｒ6（nは０又は１を表し、Ｒ5及びＲ6は、互いに同一又は異なり、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ5及びＲ6が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ3は、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又はホスホロチオエート基を表し、Ｒ4は、水酸基、保護された水酸基、アジド基又はＮＨＲ７を表し、Ｒ７は、水素原子又はアミノ基の保護基を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
  2. 　前記Ｒ１は、メトキシ基である、請求項１に記載の誘導体。
  3. 　前記Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルである、請求項１に記載の誘導体。
  4. 　少なくとも以下の式（３）で表される塩基含有単位を含む、オリゴヌクレオチド。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （上記式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｘ1は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）、ＳＨ（又はＳ－）を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
  5. 　パッセンジャー鎖の３’末端から第１塩基以上第９塩基以内及び／又は前記パッセンジャー鎖の５’末端から第１塩基以上第６塩基以内の範囲に、以下の式（３）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （上記式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｘ1は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）、ＳＨ（又はＳ－）を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
    で表される塩基含有単位を１個又は２個以上備える、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖。
  6. 　ガイド鎖の５’末端から第７塩基の位置に、以下の式（３）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （上記式（３）において、Ｒ１は、水酸基、水素原子がアルキル基若しくはアルケニル基で置換された水酸基を表し、Ｘ1は、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｘ２は、ＯＨ（又はＯ－）、ＳＨ（又はＳ－）を表し、Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基を表す。）
    で表される塩基含有単位を備える、ｓｉＲＮＡのガイド鎖。
  7. 　請求項５に記載のパッセンジャー鎖及び／又は請求項６に記載のガイド鎖を備える、ｓｉＲＮＡ。
  8. 　以下の式（４）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （上記式（４）中、Ｒ7は、アセチル基又は互いに結合してＲ７に結合する酸素原子を－Ｃ（ＣＨ3）2－で連結した環状構造を表し、Ｒ8は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ９は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、水酸基、保護された水酸基又はアジド基を表す。）
  9. 　式（１）で表されるヌクレオシド誘導体の合成方法であって、
    　以下の式（４）で表される中間体の１’位炭素原子に、プリン塩基又はピリミジン塩基を導入する工程を含む、合成方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （上記式（４）中、Ｒ7は、アセチル基を表し、Ｒ8は、水酸基の保護基を表し、Ｒ９は水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、アジド基を表す）
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KAJINO RYOHEI, MAEDA YUSUKE, YOSHIDA HISAE, YAMAGISHI KENJI, UENO YOSHIHITO: "Synthesis and Biophysical Characterization of RNAs Containing ( R )- and ( S )-5′- C -Aminopropyl-2′- O -methyluridines", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 84, no. 6, 15 March 2019 (2019-03-15), pages 3388 - 3404, XP093109480, ISSN: 0022-3263, DOI: 10.1021/acs.joc.8b03277 *

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