WO2023214055A1 - Microtissu hepatique particulier en trois dimensions et utilisations dans le traitement de l'insuffisance hepathique - Google Patents

Microtissu hepatique particulier en trois dimensions et utilisations dans le traitement de l'insuffisance hepathique Download PDF

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WO2023214055A1
WO2023214055A1 PCT/EP2023/062012 EP2023062012W WO2023214055A1 WO 2023214055 A1 WO2023214055 A1 WO 2023214055A1 EP 2023062012 W EP2023062012 W EP 2023062012W WO 2023214055 A1 WO2023214055 A1 WO 2023214055A1
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microtissue
liver
cells
microcompartment
hepatic
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Maxime FEYEUX
Dilyana TODOROVA
Elise WARTER
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Treefrog Therapeutics
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Definitions

  • the present invention relates to the treatment of liver failure by the use of a liver microtissue obtained from particular cellular microcompartments.
  • the invention relates in particular to a particular hepatic microtissue, its preparation process and its uses.
  • the liver is one of the most complex organs in the human body. An integral part of the digestive system, the liver is constantly supplied with nutritious or toxic substances resulting from digestion. The processing of these substances by the liver is essential for the body and has the following objectives:
  • the liver is composed of a wide variety of cells, such as hepatocytes, bile duct cells (cholangiocytes), stellate cells (Ito cells), Kupffer cells, mesenchymal stem cells and endothelial cells.
  • Hepatocytes are the most represented liver cells and are responsible for the majority of liver functions, from the synthesis of fatty acids to the production of urea through the synthesis of plasma proteins.
  • Cholangiocytes are the polarized epithelial cells forming the walls of the bile ducts. They have a role in regulating the secretion of bile and in collecting it in order to transport it from the hepatocytes to the intestine.
  • liver transplantation ensures good vascularization as well as signaling functions and interactions with other liver cells and with cells of the immune system.
  • the main causes of liver failure are viral infections, drug overdoses, immunological disorders, hereditary diseases or blood circulation disorders.
  • the recommended treatment is liver transplantation.
  • liver transplantation represents the standard treatment for people with end-stage liver disease.
  • liver transplantation can only be carried out if the liver is of good quality in order to avoid the risks associated with the transplant such as infections, cancers, excessively long immunosuppression and major surgery.
  • isolated hepatocytes appeared to be an attractive approach, however clinical trials remained few and inconclusive, limited by the poor survival, integration and expansion of isolated hepatocytes following transplantation in vivo, factors therefore limiting the effects. short and long term therapeutics. Indeed, isolated hepatocytes from donors have a very limited capacity for proliferation in vivo and in vitro. In addition, isolated hepatocytes placed in culture tend to enter a dedifferentiation process, thus reducing the chances of obtaining a sufficient number of mature hepatocytes.
  • hepatocytes derived from pluripotent cells are very difficult to cultivate on a large scale and generate excessive production costs.
  • the expected cost for the production of autologous liver grafts from induced pluripotent stem cells is around $9.7 million.
  • liver cells with better functional characteristics.
  • These protocols remain complex and require stages of dissociation, reaggregation or co-cultures with in particular mesenchymal stem cells and endothelial cells. These additional steps add additional risks, increasing the total cost and decreasing control of the finished product.
  • liver microtissue comprising several liver cell phenotypes, producible on a large scale and directly transplantable, to meet an essential demand for liver grafts.
  • the objective of the invention is therefore to meet all of these needs and to overcome the disadvantages and limitations of the prior art.
  • the invention proposes a particular hepatic microtissue, suitable for uses in cell therapy and in particular in the fight against hepatic insufficiency.
  • the subject of the invention is a three-dimensional hepatic microtissue, the largest dimension of which is between 500 and 700 pg, expressing the CYP3A4 monooxygenase with an activity of at least 75,000 RLU per million cells and producing at least 18pg of urea per million cells per 24 hours.
  • the activity of CYP3A4 associated with the production of urea makes it possible to guarantee a hepatic microtissue comprising at least functional hepatic cells.
  • liver cells secrete at least 75 pg of albumin per million cells per 24 hours.
  • hepatic microtissue exhibits metabolic activity similar to a healthy liver.
  • the invention concerns a hepatic microtissue comprising at least 3 different phenotypes of hepatic cells, said microtissue cells having all been obtained from induced pluripotent stem cells encapsulated in a single microcompartment closed in three dimensions.
  • the liver microtissue has sufficient cellular diversity to restore and/or improve liver functions in a lasting manner.
  • the liver microtissue comprises at least immature hepatocytes, mature hepatocytes and cholangiocytes.
  • the liver microtissue comprises at least:
  • liver cells of which at least 40% of liver cells are cells expressing cytokeratin 19 (CK19), and
  • the cells expressing CD73 and CD90 are mesenchymal stem cells and the cells expressing CK19 are cholangiocytes.
  • the phenotypic composition of the hepatic microtissue is close to that of a healthy human liver.
  • the liver microtissue according to the invention comprises:
  • the organization of the hepatic microtissue is close to the organization of the hepatic tissue during development, which allows it in particular to promote its integration into the liver and the proper execution of metabolic functions in the treated liver.
  • the liver microtissue is in an ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or ellipsoidal shape.
  • the liver microtissue is in an ellipsoidal shape.
  • the ellipsoidal shape of the microtissue helps promote the survival of the hepatic microtissue.
  • a greater portion of hepatic microtissues are integrated by the treated liver.
  • the liver microtissue according to the invention comprises at least one bile duct and/or at least one glycogen granule.
  • the liver microtissue comprises:
  • liver cells including between 20 and 60% of cells expressing CK19, and
  • the invention also relates to a set of several three-dimensional hepatic microtissues in a medium, of which at least one hepatic microtissue is a hepatic microtissue according to the invention.
  • at least 50% (by number) of the hepatic microtissues of the set of hepatic microtissues are hepatic microtissues according to the invention.
  • the invention relates to a three-dimensional closed cellular microcompartment comprising an external hydrogel layer defining an internal part, said internal part comprising at least one hepatic microtissue according to the invention.
  • the microcompartment according to the invention makes it possible to guarantee a microenvironment suitable for the culture of pluripotent stem cells and their differentiation into cells constituting the microtissue according to the invention. Indeed, such a microcompartment makes it possible to reproduce the in vivo conditions of the cellular microenvironment during hepatic organogenesis.
  • the invention also relates to a set of cellular microcompartments according to the invention.
  • the invention relates to a method for preparing a microcompartment or a set of microcompartments comprising at least the implementation of the following steps, the production of a microcompartment comprising induced pluripotent stem cells, the induction of cellular differentiation within the microcompartment so as to obtain at least 3 different phenotypes of liver cells.
  • the invention relates to a hepatic microtissue according to the invention or a microcompartment containing it, or a set of hepatic microtissues according to the invention or a set of microcompartments containing them, for its use as a medicine, preferably in prevention or treatment.
  • liver failure caused by diseases such as hepatic fibrosis and cirrhosis, steatosis, non-alcoholic steatosis, hepatitis, metabolic liver diseases, diseases linked to secretion of factors VIII, alpha 1 antitrypsin, IX and/or VWF, Wilson's disease and hereditary hemochromatosis.
  • Figure la is a comparative representation of the expression of genes of interest (E ⁇ MES, CXCR4, HHEX, PROXI, AFP, ASGR1) during differentiation depending on the differentiation protocol.
  • genes of interest E ⁇ MES, CXCR4, HHEX, PROXI, AFP, ASGR1
  • Figure lb is a comparative representation of the expression of genes of interest (SOX17, FOXA2, TBX, HNF4A, ALB, KT18) during differentiation depending on the differentiation protocol.
  • Figure 1 is a comparative representation of the expression of genes of interest (GATA4, HNF1B, SOX9, KT19, TAT) during differentiation depending on the differentiation protocol.
  • Figure 2 is a comparative representation of the expression of the genes of interest (E ⁇ MES, CXCR4, FOXA2, SOX17) depending on the culture conditions.
  • Figure 3 is a comparative representation of the expression of proteins of interest (SOX17, FOXA2) as a function of culture conditions, 5 days after the start of differentiation.
  • Figure 4a is a comparative representation of the expression of the genes of interest (PROX1, TBX, AFP, KT18, KT19, HNF4A) depending on the culture conditions.
  • Figure 4b is a comparative representation of the expression of the genes of interest (HNF1B, SOX9, ASGR1, ALB, TAT)) depending on the culture conditions.
  • Figure 5 is a comparative representation of the expansion factor for 30 days depending on the culture conditions.
  • Figure 6 is a graphical representation of albumin secretion during differentiation as a function of culture conditions.
  • Figure 7 is a graphical representation of urea production during differentiation as a function of culture conditions.
  • Figure 8 is a graphical representation of CYP3A4 activity as a function of culture conditions.
  • Figure 9 is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment presenting hepatocytes.
  • Figure 10a is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment from D-0 to D-9 after the start of differentiation.
  • Figure 10b is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment from D-12 to D-30 after the start of differentiation.
  • Figure 10c is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment of D-15 after the start of differentiation.
  • Figure lOd is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment of D-20 after the start of differentiation.
  • Figure 10e is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment of D-30 after the start of differentiation.
  • Figure 11 is a set of images obtained by confocal microscopy of a microcompartment identifying certain liver cell phenotypes.
  • Figure 12a is a set of images obtained by confocal microscopy:
  • Figure 12b is a set of images obtained by confocal microscopy:
  • Figure 12c is a set of images obtained by confocal microscopy of the tissue at the injection site with the vehicle alone (basal medium containing 50% matrigel) without graft in Balb/c mice.
  • Figure 12d is a set of images obtained by confocal microscopy of microtissues according to the invention before transplantation.
  • Figure 13a is a graphical representation of the secretion of AlAT (alpha-1 antitrypsin) before transplantation of single cells differentiated in 2D (2D) and microtissues according to the invention (Invention).
  • AlAT alpha-1 antitrypsin
  • Figure 13b is a graphical representation of the detection of AlT (alpha-1 antitrypsin) in the serum of Balb/c mice before (day 0), on day 2 and on day 6 after transplantation with single cells differentiated in 2D (SC), with microtissues the invention (MT) and with the vehicle alone (control).
  • AlT alpha-1 antitrypsin
  • alginate within the meaning of the invention is meant linear polysaccharides formed from p-D-mannuronate and ⁇ -L-guluronate, salts and derivatives thereof.
  • hydrogel capsule or “hydrogel microcompartment” within the meaning of the invention, is meant a three-dimensional structure formed from a matrix of polymer chains, swollen by a liquid and preferably water.
  • human cells within the meaning of the invention is meant human cells or immunologically humanized non-human mammalian cells. Even when this is not specified, the cells, stem cells, progenitor cells and tissues according to the invention are constituted or are obtained from human cells or from immunologically humanized non-human mammalian cells.
  • embryonic stem cell within the meaning of the invention is meant a pluripotent stem cell derived from the internal cell mass of the blastocyst.
  • the pluripotency of embryonic stem cells can be assessed by the presence of markers such as transcription factors OCT4, NANOG and SOX2 and surface markers such as SSEA3/4, Tra-1-60 and Tra-1-81.
  • the embryonic stem cells used in the context of the invention are obtained without destruction of the embryo from which they are derived, for example using the technique described in Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)): 113-117). Alternatively, human embryonic stem cells may be excluded.
  • a cell surrounded only by cells in a microtissue within the meaning of the invention, is meant a cell which is neither in contact with a lumen nor in contact with the exterior of the microtissue.
  • mutant cell within the meaning of the invention is meant a cell carrying at least one mutation.
  • pluripotent stem cell or “pluripotent cell” within the meaning of the invention, is meant a cell which has the capacity to form all the tissues present in the entire organism of origin, without being able to form an entire organism in as such.
  • Human pluripotent stem cells may be referred to as hPSCs in the present application. These may in particular be induced pluripotent stem cells (iPSC or hiPSC for human induced pluripotent stem cells), embryonic stem cells or MUSE cells (for “Multilineage-differentiating Stress Enduring”).
  • induced pluripotent stem cell within the meaning of the invention is meant a pluripotent stem cell induced to pluripotency by genetic reprogramming of differentiated somatic cells. These cells are notably positive for markers of pluripotency, such as alkaline phosphatase staining and expression of NANOG, SOX2, OCT4 and SSEA3/4 proteins. Examples of processes for obtaining stem cells induced pluripotents are described in the articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5): 861-872) and Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106) .
  • progenitor cell within the meaning of the invention is meant a stem cell already engaged in differentiation into liver cells but not yet differentiated.
  • Féret diameter of a microcompartment (or part of a microcompartment) or of a microtissue according to the invention we mean the distance “d” between two tangents to said microcompartment (or to said part) or microfabric, these two tangents being parallel, such that the entire projection of said microcompartment (or said part) or of the microfabric is included between these two parallel tangents.
  • a Féret diameter of the internal part of the microcompartment is measured between two interfaces of the internal part and the external layer of the microcompartment, that is to say the distance “d” between two tangents to said internal part, these two tangents being parallel, such that the entire projection of said internal part is included between these two parallel tangents.
  • variable thickness of a layer within the meaning of the invention is meant the fact that the layer for the same microcompartment or the same microfabric does not have the same thickness everywhere.
  • microcompartment or “capsule” within the meaning of the invention is meant a partially or completely closed three-dimensional structure, containing several cells.
  • microtissue or “liver microtissue” within the meaning of the invention is meant a three-dimensional human tissue comprising at least liver cells and the largest dimension of which is less than 1 mm.
  • medium within the meaning of the invention is meant an aqueous solution encompassing cells or microtissues, compatible with the survival, development and/or metabolism of cells. It may be a culture medium.
  • ⁇ culture medium within the meaning of the invention is meant a culture medium animated by internal movements.
  • mutation within the meaning of the invention is meant a genetic or epigenetic mutation, preferably a functional mutation. It may in particular be a one-off modification of the genetic sequence, a structural variant, an epigenetic modification, or a modification of mitochondrial DNA.
  • “functional mutation” within the meaning of the invention is meant a transmissible genetic or epigenetic modification which confers a gain or loss of function or potential loss of function to the mutant cell concerned. This is preferably a mutation leading to a modification of the phenotype of the mutant cell concerned. Very preferably it is a change in the genome sequence and/or the epigenome which alters the therapeutic potential of a population of cells, either by increasing the risk associated with the therapy produced or by reducing the benefit provided. by the therapy produced.
  • smallest dimension of a microcompartment or a layer of cells within the meaning of the invention we mean the value of the smallest Feret diameter of said microcompartment.
  • light or “lumen” in the sense of the invention we mean a volume of aqueous solution topologically surrounded by cells. Preferably its content is not in diffusive equilibrium with the volume of convective liquid present outside the microcompartment.
  • smallest radius of the internal part of a microcompartment according to the invention is meant half the value of the smallest Féret diameter of the internal part of the microcompartment.
  • average radius of the internal part of a microcompartment is meant the average of the radii of the smallest compartment, each radius corresponding to half the value of a Féret diameter of the internal part of the microcompartment.
  • the expansion rate is measured by taking the ratio of the number of cells counted on day X of the culture divided by the number of cells at the start of the culture (day of encapsulation or day of culturing).
  • large-scale culture is meant a cell culture method adapted for a production batch of hepatic microtissue making it possible to treat at least 1 patient, preferably 10 patients, more preferably 100 patients, even more preferably more than 1000 patients.
  • phenotype of a microtissue is meant the presence of mature hepatocytes characterized by the expression of albumin and the absence of expression of alphafetoprotein and cytokeratin 19.
  • liver bud according to the invention is meant a cellular organization characterized by a cellular extension of the endoderm of the embryonic foregut which gives rise to the parenchyma of the liver and the bile duct. This is a particular conformation giving rise to hepatocytes and cholangiocytes.
  • URL is meant the relative unit of light. It corresponds to the measurement of the quantity of light produced by a bioluminescence reaction. This measurement can be carried out using a luminometer.
  • the subject of the invention is therefore a three-dimensional hepatic microtissue, the largest dimension of which is between 500 and 700 pm, expressing the CYP3A4 monooxygenase with an activity of at least 75,000 URL per million cells and producing at least 18pg of urea per million cells per 24 hours.
  • Cytochromes P450 are hemoproteins participating in the oxidative metabolism of many molecules. Cytochrome P450 are enzymes involved in the biotransformation of exogenous compounds, both in the phenomena of detoxification and intoxication by the formation of reactive entities. The most abundant human hepatic form (CYP3A4) is responsible for the metabolism of more than 60% of drugs. Its presence within the microcompartment is a functional guarantee. Urea is a nitrogen product resulting from the catabolism of proteins. It is exclusively synthesized in the liver via the urea cycle and the quantity of urea formed depends on the quantity of proteins ingested, protein catabolism and the state of liver function.
  • a CYP3A4 activity of at least 75,000 RLU per million cells associated with a urea production of at least 18pg per million cells per 24 hours guarantees the presence of mature hepatocytes as well as sufficient metabolic activity to guarantee a significant effect on the affected liver functions.
  • the activity of CYP3A4 is at least 80,000 URLs, even more preferably at least 100,000 URLs.
  • the liver microtissue produces at least 40 pg of urea per million cells per 24 hours, even more preferably at least 60 pg, in particular at least 80 pg
  • the liver microtissue according to the invention has a metabolic activity close to a healthy liver.
  • hepatic microtissue is particularly effective in restoring the functions of the treated liver.
  • the liver microtissue according to the invention comprises between 50 and 99% liver cells.
  • the liver microtissue according to the invention can be obtained from induced pluripotent stem cells.
  • the liver microtissue can be obtained from stem cells, progenitor cells and/or cells capable of differentiating into liver cells.
  • the liver microtissue is obtained from induced pluripotent stem cells encapsulated in a single three-dimensional closed microcompartment.
  • the hepatic microtissue preferably comprises hepatic cells secreting at least 75 pg of albumin per million cells per 24 hours, even more preferably at least 150 pg, in particular at least 250 pg.
  • the liver microtissue is obtained from induced pluripotent stem cells and comprises liver cells secreting at least 75 pg of albumin per million cells per 24 hours at least 20 days after the start of differentiation.
  • Albumin is the most abundant protein in the blood. Produced by the liver, albumin is responsible in particular for stabilizing blood pressure and transporting many substances.
  • an albumin production of at least 75 pg per million cells per 24 hours is an indicator of the proper functioning of the hepatic microtissue.
  • the liver microtissue comprises at least 3 different phenotypes of liver cells, all of the cells of the microtissue having all been obtained from induced pluripotent stem cells encapsulated in a single microcompartment closed in three dimensions.
  • the liver microtissue comprises at least 4 different phenotypes of liver cells, even more preferably at least 5.
  • the liver microtissue according to the invention has a cellular diversity important to reproduce the hepatic microenvironment.
  • the diversity and their proximity of the cells present in the hepatic microtissue allows a significant number of cellular interactions thus cooperating in the realization of numerous metabolic and transport functions.
  • the cellular diversity found in the hepatic microtissue according to the invention is obtained from induced pluripotent stem cells in a single microcompartment closed in three dimensions. In this way, the different cell types can organize themselves within the microcompartment reproducing the hepatic microenvironment.
  • all the cells of the microtissue were all obtained by differentiation of induced pluripotent stem cells encapsulated in a single microcompartment closed in three dimensions, preferably said induced pluripotent stem cells all being of the same lineage.
  • microtissue Very preferably all the cells of the microtissue were all obtained from induced pluripotent stem cells encapsulated in a single microcompartment closed in three dimensions, by a single differentiation process implemented in said microcompartment.
  • the induced pluripotent stem cells before differentiation into microtissue according to the invention form a cyst in the microcompartment.
  • all the cells of the microtissue have all been obtained from at least one cyst of induced pluripotent stem cells encapsulated in a single microcompartment closed in three dimensions, preferably by differentiation, in particular by a single differentiation process implemented in said microcompartment.
  • the microenvironment of the microcompartment from which the microtissue according to the invention is obtained reproduces the conditions of hepatic organogenesis.
  • the microcompartment according to the invention makes it possible to limit the various physical constraints and/or stress and promotes interactions between the different cell types within the microcompartment.
  • the liver microtissue according to the invention comprises at least immature hepatocytes, mature hepatocytes and cholangiocytes.
  • it includes at least:
  • AFP alphafetoprotein
  • ALB albumin
  • CK19 cytokeratin 19
  • -cholangiocytes characterized by the expression of cytokeratin 19 and the absence of expression of albumin and alphafetoprotein.
  • the liver microtissue according to the invention comprises hepatoblasts.
  • Hepatoblasts can be characterized by the expression of alphafetoprotein, albumin and cytokeratin 19.
  • liver cell phenotypes guarantees a multifactorial effect on liver functions. This effect can help restore or optimize certain liver functions.
  • the liver microtissue comprises at least 50% mature and/or immature hepatocytes.
  • the liver microtissue comprises within the liver cells between 20 and 60% (by number) of cells expressing cytokeratin 19.
  • Cells expressing cytokeratin 19 are preferentially cholangiocytes.
  • the liver cells are preferentially chosen from mature hepatocytes, immature hepatocytes, hepatoblasts, cholangiocytes and mixtures thereof.
  • the liver microtissue may also include cells expressing CD73 and CD90.
  • Cells expressing CD73 and CD90 are preferentially mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells are a cell population well known for their properties on tissue repair and regeneration, particularly of the liver.
  • the presence of mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells of the patient to be treated makes it possible to guarantee effectiveness of tissue repair of the liver presenting liver failure.
  • the microfabric according to the invention comprises at least:
  • - liver cells preferably at least immature hepatocytes, mature hepatocytes, cholangiocytes, and
  • CD73 and CD90 preferably at least mesenchymal stem cells.
  • the liver microtissue comprises at least:
  • liver cells of which between 20 and 60% (by number) of the cells are cells expressing cytokeratin 19, and
  • the hepatic microtissue preferably comprises (number percentages):
  • liver cells between 50 and 99% of liver cells, preferably between 20 and 60% (by number) of the cells are cells expressing cytokeratin 19, and
  • the hepatic microtissue according to the invention may also comprise other cells, such as in particular Ito cells (stellate cells), Kupffer cells, endothelial cells, hepatoblasts.
  • the liver microtissue comprises:
  • the liver microtissue according to the invention may also comprise smooth muscle cells and/or fibroblasts.
  • the cell phenotypes included in the hepatic microtissue are preferentially compatible with the hepatic microenvironment.
  • liver microtissue according to the invention makes it possible to repair and regenerate the diseased liver so as to restore the affected functions.
  • the concentration of mature hepatocytes, cholangiocytes and mesenchymal stem cells ensures a lasting effect during cell therapy. It is particularly important during culture to obtain a content of mature and/or immature hepatocytes greater than 50% in order to obtain a sufficient effect as soon as possible after microtissue transplantation.
  • a concentration of mature and/or immature hepatocytes below 50% would limit the effectiveness of the graft and would require a graft volume that is all the greater as the concentration (in number) of hepatocytes is low. Indeed it is estimated that at least 5% of the liver mass in functional hepatocytes is necessary for the treatment of acute liver failure for example and metabolic insufficiencies of the liver such as diseases linked to secretion of factor VIII and factor IX and VWF, Wilson's disease and hereditary hemochromatosis require the same order of magnitude.
  • Mature hepatocytes express albumin but do not express alphafetoprotein. These markers are easily identifiable and quantifiable by detection methods well known to those skilled in the art such as flow cytometry.
  • the hepatic microtissue comprises at least one lumen, at least one cell in contact both with a lumen and with the environment external to the microtissue and at least one cell surrounded only by cells.
  • such an organization is characteristic of a functional microtissue ready to be used in cell therapy.
  • microtissue is possible in particular thanks to the presence of polarized hepatic cells making it possible to structure and organize the microtissue.
  • the microtissue may contain polarized liver cells.
  • the polarization of liver cells in the microcompartment may be an indicator of the formation of a functional microtissue.
  • the liver microtissue according to the invention does not comprise human embryonic stem cells.
  • the liver microtissue according to the invention can be in ellipsoidal shape.
  • the ellipsoidal shape of the microtissue allows it to promote the survival and integration of the hepatic microtissue.
  • its ellipsoidal shape allows it to facilitate its flow in the blood vessels in the case of administration by injection via the vascular route (in an embodiment via the portal vein) but also their flow through the blood vessels.
  • breast of a cannula if administration is by intratissue graft.
  • the improvement in the injection of the hepatic microtissue leads to an improvement in the integration of the hepatic microtissue by the liver of the treated patient.
  • the liver microtissue according to the invention preferably has a diameter or smallest dimension between 100 and 300 pm, preferably between 150 and 280 pm.
  • the largest dimension of the hepatic microtissue is preferably less than 1mm, and is very preferably between 500 and 700pm.
  • the size of the hepatic microtissue is adapted for administration by the portal vein.
  • the liver microtissue according to the invention may comprise between 300 and 14,000 cells, preferably between 500 and 8,000, even more preferably between 900 and 5,000, in particular 4,500 cells.
  • the liver microtissue comprises at least one bile duct.
  • the bile ducts collect bile produced by liver cells to transport it to the gallbladder.
  • the presence of at least one bile duct within the hepatic microtissue promotes the proper functioning of the microtissue within the liver and the reconstruction of defective bile ducts.
  • the liver microtissue comprises at least one glycogen granule.
  • Glycogen serves as storage of carbohydrates in the body, it is mainly stored in the liver. Under the action of insulin, liver cells store glucose in the form of glycogen. Under the action of glucagon, liver cells hydrolyze glycogen and release glucose into the blood. The presence of glycogen granules in the liver cell is a physiological element of the functioning of its metabolism and therefore of its function. Thus, the presence of at least one glycogen granule in the hepatic microtissue guarantees favorable conditions for the functioning of the hepatic microtissues for optimal therapeutic effect.
  • the liver microtissue comprises at least one bile duct and at least one glycogen granule.
  • the liver microtissue according to the invention can be obtained by differentiation of induced pluripotent stem cells at least 20 days, preferably at least 30 days after encapsulation in a three-dimensional closed microcompartment of 1 to 200 induced pluripotent stem cells, preferably between 5 and 150, in particular between 15 and 80.
  • the liver microtissue can be obtained from the encapsulation in a three-dimensional closed microcompartment of 1 to 200 induced pluripotent stem cells, preferably between 5 and 150, in particular between 15 and 80.
  • the induced pluripotent strains form a cyst in the microcompartment before differentiation into cells of the hepatic microtissue according to the invention.
  • the invention also relates to a set of hepatic microtissues comprising at least one hepatic microtissue according to the invention.
  • a set of hepatic microtissues comprising at least one hepatic microtissue according to the invention.
  • it is a set of several three-dimensional hepatic microtissues in a medium, of which at least one hepatic microtissue is a hepatic microtissue according to the invention.
  • At least 50% (by number) of the hepatic microtissues of the set of hepatic microtissues are hepatic microtissues according to the invention.
  • the set of liver microtissues according to the invention is suitable for administration to patients with liver failure.
  • Administration can be carried out by injection into a biocompatible solution.
  • the injection can be made into the portal vein so as to reach the liver without dispersion into the general circulation, directly into the liver or ectopically.
  • the injection is ectopic it can be carried out in the abdomen or under the renal capsule.
  • the effective quantity of the set of microtissue injected into the patient corresponds to a mass between 1 and 20% of the mass of the liver of the treated patient, preferably between 2 and 10%, in particular 5%.
  • the invention relates to a microcompartment comprising at least one hepatic microtissue according to the invention.
  • the microcompartment according to the invention comprises an external hydrogel layer.
  • the hydrogel used is biocompatible, that is to say it is not toxic to cells.
  • the outer hydrogel layer must allow the diffusion of oxygen and nutrients to supply the cells contained in the microcompartment and allow their survival.
  • the external hydrogel layer comprises at least alginate. It can consist exclusively of alginate.
  • the alginate may in particular be a sodium alginate, composed of 80% a-L-guluronate and 20% p-D-mannuronate, with an average molecular mass of 100 to 400 kDa and a total concentration of between 0.5 and 5% by mass.
  • the outer hydrogel layer is devoid of cells.
  • the outer hydrogel layer makes it possible in particular to protect the cells from the mechanical stress of bioreactors, to limit potentially toxic molecules when accumulated in the middle.
  • the average thickness of the outer layer can be variable. It is preferably between 20 and 60 pm, more preferably between 30 and 40 pm. The ratio between the smallest radius of the internal part and this thickness is preferably between 2 and 10 pm.
  • the microcompartment according to the invention advantageously has an expansion rate of induced pluripotent stem cells of at least times 15, 20 days after the start of differentiation.
  • the invention thus promotes amplification with a high expansion rate, which consequently reduces the culture time to obtain a functional microtissue.
  • the microcompartment according to the invention can be obtained after encapsulation of induced pluripotent stem cells with or without addition of natural or synthetic extracellular matrix.
  • the microcompartment according to the invention comprises in its internal part the extracellular matrix such as Matrigel® and/or Geltrex® and/or a hydrogel type matrix of plant origin such as modified or original alginates synthetic or copolymer of poly(N-isopropylacrylamide) and poly(ethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®.
  • the extracellular matrix such as Matrigel® and/or Geltrex®
  • a hydrogel type matrix of plant origin such as modified or original alginates synthetic or copolymer of poly(N-isopropylacrylamide) and poly(ethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®.
  • the microcompartment according to the invention can be obtained after encapsulation of induced pluripotent stem cells without addition of any extracellular matrix element.
  • the extracellular matrix elements may be peptide or peptidomimetic sequences, protein mixtures, extracellular compounds or structural proteins, such as collagen, laminins, entactin, vitronectin, as well as growth factors or cytokines.
  • the induced pluripotent stem cells differentiate into liver tissue for a period of at least 20 days, preferably at least 30 days.
  • the microcompartment provides a microenvironment favorable to the development of hepatic microtissue. Indeed, during differentiation within the microcompartment, the cells organize themselves to form a structure similar to a liver bud. This liver bud is found during organogenesis hepatic in vivo, it is this particular structure which gives rise to hepatocytes and cholangiocytes. The presence of a structure similar to a liver bud during the formation of liver microtissue is an indicator of good tissue quality.
  • the liver microtissue according to the invention is preferentially obtained after the formation of a structure similar to a liver bud in a single microcompartment closed in three dimensions.
  • the microcompartment according to the invention makes it possible to isolate the induced pluripotent stem cells from the mechanical constraints present within the bioreactor. This mechanical isolation allows the microtissue to establish and maintain a topology that approximates the spatial and structural organization of hepatic organogenesis existing in vivo.
  • the cells maintain their conformation, thus allowing better proliferation while maintaining a functional phenotype. Consequently, this makes it possible to reduce the number of passages and reduce the culture time necessary to reach the final number of liver cells necessary.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention were preferentially obtained after at least two cycles of cell division after encapsulation in an external hydrogel layer of 1 to 200 induced pluripotent stem cells, preferably between 5 and 150, in particular between 15 and 80.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention were obtained after at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles of cell division after encapsulation in an external layer of hydrogel, preferably at least 5, even more preferably at least 6, to obtain up to 8000 mature hepatocytes per microcompartment.
  • mature hepatocytes present in the microcompartment were obtained after at least six rounds of cell division after encapsulation of the cells in the outer hydrogel layer.
  • the number of cell divisions for implementing the method according to the invention is less than 100, even more preferably less than 30.
  • the microcompartment is obtained after at least 2 passes after encapsulation, more preferably at least 3, 4 or 5 passes.
  • Each passage can last for example between 2 and 10 days, especially between 2 and 4 days.
  • the microcompartment is obtained after at least one re-encapsulation, more preferably between 1 and 14 re-encapsulations, in particular between 2 and 7 re-encapsulations.
  • a re-encapsulation corresponds to a new passage and each encapsulation cycle corresponds to a passage.
  • the microcompartment according to the invention was obtained in less than 30 days after encapsulation, even more preferably in less than 20 days after encapsulation of at least 1 induced pluripotent stem cell in the internal part defined by the external layer in hydrogel, preferably 5, 20 and up to 100.
  • the microcompartment according to the invention can contain between 100 and 14,000 cells, preferably between 300 and 10,000 cells, even more preferably between 300 and 5,000, more particularly at least 50 mature hepatocytes and at least 20 cholangiocytes.
  • the microcompartment according to the invention protects the induced pluripotent stem cells from mechanical stress, thus making it possible to obtain an expansion rate particularly suited to large-scale culture.
  • the microcompartment according to the invention can be in any three-dimensional form, that is to say it can have the shape of any object in space.
  • the microcompartment may have any shape compatible with cell encapsulation.
  • the microcompartment according to the invention is in a spherical or elongated or ellipsoidal or substantially spherical or elongated shape. It may have the shape of an ovoid, a cylinder, a spheroid or a sphere or substantially this shape.
  • the outer layer of the microcompartment that is to say the hydrogel layer, which gives its size and shape to the microcompartment according to the invention.
  • the smallest dimension of the microcompartment according to the invention is between 150 pm and 500 pm, preferably between 200 pm and 450 pm.
  • Its largest dimension is preferably greater than 350 pm, more preferably between 350 pm and 600 pm.
  • microcompartment according to the invention can optionally be frozen for storage. It should then preferably be thawed before use.
  • the invention also relates to several microcompartments according to the invention used together.
  • the invention also relates to a set or series of microcompartments comprising at least two cellular microcompartments in three dimensions, characterized in that at least one microcompartment is a microcompartment according to the invention.
  • the series of microcompartments according to the invention is in a culture medium, in particular in an at least partially convective culture medium.
  • a culture medium suitable for the culture of induced pluripotent stem cells can be used, such as for example the medium “HCM Hepatocyte Culture Medium BulletKit (Lonza)” or “Medium E from William (Thermofisher Scientific)” as long as the concentration of dissolved salts is compatible with maintaining the crosslinking of alginate by divalent cations.
  • the subject of the invention is a series of cellular microcompartments in a closed enclosure, such as a bioreactor, preferably in a culture medium in a closed enclosure, such as a bioreactor.
  • a closed enclosure such as a bioreactor
  • the microcompartments are arranged in a culture medium in a closed bioreactor.
  • the set or series of microcompartments according to the invention preferably comprises between 2 and 1016 microcompartments.
  • the microcompartment according to the invention is suitable for large-scale culture by providing hepatic microtissues presenting a functional phenotype in particular with regard to their detoxifying (particularly the activity of CYP3A) and secretory (particularly the secretion of albumin) guaranteeing optimal effectiveness in vivo.
  • liver microtissue According to the invention
  • the hepatic microtissue or the microcompartment according to the invention can be used for all applications, in particular as a drug, in particular in cell therapy in humans.
  • the subject of the invention is a hepatic microtissue according to the invention or a set of hepatic microtissues comprising at least one hepatic microtissue according to the invention, or a microcompartment according to the invention or a set of microcompartments comprising at least one microcompartment according to the invention.
  • the invention for its use as a medicine, in particular in cell therapy.
  • the invention also relates to a method of therapeutic treatment which consists of grafting and/or injecting microtissues according to the invention into humans, in particular as a treatment in cell therapy.
  • the liver microtissue or the microcompartment according to the invention can be used in the prevention or treatment of symptoms associated with liver failure, in particular acute, chronic or acute-on-chronic liver failure.
  • the liver microtissue or the microcompartment according to the invention can be used in the prevention or treatment of diseases such as fibrosis, cirrhosis, steatosis, non-alcoholic steatosis, hepatitis, metabolic liver diseases such as as diseases linked to secretion of factor VIII and factor IX and VWF, Wilson's disease and hereditary hemochromatosis.
  • diseases such as fibrosis, cirrhosis, steatosis, non-alcoholic steatosis, hepatitis, metabolic liver diseases such as as diseases linked to secretion of factor VIII and factor IX and VWF, Wilson's disease and hereditary hemochromatosis.
  • diseases such as fibrosis, cirrhosis, steatosis, non-alcoholic steatosis,
  • the subject of the invention is a hepatic microtissue according to the invention or a set of hepatic microtissues comprising at least one hepatic microtissue according to the invention, or a microcompartment according to the invention or a set of microcompartments comprising at least one microcompartment according to the invention.
  • the invention for its use, in the prevention or treatment of symptoms associated with liver failure, in particular acute, chronic or acute-on-chronic liver failure, in particular in the prevention or treatment of liver diseases such as fibrosis , cirrhosis, steatosis, non-alcoholic steatosis, hepatitis, metabolic liver diseases such as diseases linked to secretion of factor VIII and factor IX and VWF.
  • the invention also relates to a hepatic microtissue according to the invention or a set of hepatic microtissues comprising at least one hepatic microtissue according to the invention, or a microcompartment according to the invention or a set of microcompartments comprising at least one microcompartment according to the invention , for its use in the evaluation of molecules or in the modeling of liver diseases.
  • Process for preparing microcompartments and microtissues according to the invention also relates to a process for preparing microcompartments according to the invention.
  • the process for preparing a microcompartment or a set of microcompartments according to the invention may comprise the following steps:
  • a closed three-dimensional cellular microcompartment comprising, inside an external hydrogel layer, induced pluripotent stem cells, and optionally extracellular matrix elements or a natural or synthetic extracellular matrix,
  • -(b) induce cellular differentiation within the cellular microcompartment, so as to obtain a microcompartment comprising liver cells.
  • the preparation of the microcompartment of step (a) can be carried out in any culture medium suitable for the culture of induced pluripotent stem cells such as mTeSRTMl or mTeSRPIus media from Stemcell technologies, StemMACSTM iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec or StemFlex from thermofisher Scientific).
  • mTeSRTMl or mTeSRPIus media from Stemcell technologies
  • StemMACSTM iPS-Brew XF StemMACSTM iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec or StemFlex from thermofisher Scientific).
  • the microcompartment of step (a) can be obtained by encapsulation of 1 to 150 induced pluripotent stem cells, preferably at least 50, in particular at least 100.
  • the encapsulation is implemented according to techniques known to those skilled in the art. Indeed, any method of producing cellular microcompartments containing inside an external layer of hydrogel and cells can be used for implementing the preparation process according to the invention.
  • it is possible to prepare microcompartments by adapting the method and the microfluidic device described in Alessandri et al., 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) » Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, pp. 1593-1604), according to the steps described below.
  • step (a) is implemented by adding extracellular matrix elements or a natural or synthetic extracellular matrix.
  • step (a) is implemented without adding extracellular matrix elements or extracellular matrices or a natural or synthetic extracellular matrix.
  • step (a) is preferably implemented in a device capable of generating hydrogel capsules using a microfluidic chip.
  • the device can include syringe pumps for several solutions injected concentrically using a microfluidic injector which makes it possible to form a jet which is divided into drops then collected in a calcium bath.
  • hydrogel solution for example alginate
  • an isotonic intermediate solution preferably an isotonic solution not containing a divalent cation such as Ca2+ Mg2+ to avoid crosslinking of the hydrogel too early in the injector, such as for example a sorbitol solution,
  • a solution comprising induced pluripotent stem cells and culture medium
  • the three solutions are co-injected (injected simultaneously) concentrically using a microfluidic injector or microfluidic chip which makes it possible to form a jet which splits into drops whose layer exterior is the hydrogel solution and the heart is the solution of step (a) comprising the induced pluripotent stem cells; These drops are collected in a calcium bath which crosslinks and/or gels the alginate solution to form the shell.
  • the hydrogel solution is preferentially charged with a direct current at (between 1 and lOkV).
  • a ground ring can optionally be placed at a distance from the tip of between 1mm and 20 cm, preferably 3mm to 10 cm, even more preferably 1cm to 5cm, from the tip in the plane perpendicular to the axis of the jet emerging from the microfluidic injector (coextrusion chip) to generate the electric field.
  • the invention proposes in particular to modify the flow rate of the coextruded solutions and the final opening of the co-extrusion chip.
  • flow rate we mean the flow rate of each solution which arrives at the injector.
  • final opening of the co-extrusion chip is meant the internal opening of the output channel of the chip.
  • - for the flow rate we preferentially go from a value between 20 and 40 ml/h for each coextruded solution for the standard sizes of capsules known from the prior art, to a value between 45 and 150 ml/h, preferably between 45 and 110 mL per hour for a variant of the invention, - for the diameter of the final opening of the coextrusion chip (microfluidic injector) which goes from a value preferably between 50 and 120 pm for the standard sizes of capsules known from the prior art, to a diameter value comprised between 150 and 300 pm, preferably between 180 and 240 pm.
  • step (a) the encapsulation of step (a) is carried out using a microfluidic injector whose final opening diameter is between 150 and 300 pm, preferably between 180 and 240 pm , and with the flow rate of each of the 3 solutions between 45 and 150 mL/h, preferably between 45 and 110 mL/h.
  • step (a) of preparing a microcompartment can be carried out with stem cells, progenitor stem cells or cells capable of differentiating into liver cells.
  • Step (b) of cell differentiation is preferably carried out for at least 20 days, even more preferably at least 30 days.
  • step (b) the cells become organized in an organization similar to that of a liver bud.
  • This organization is typically marked by the structuring in the form of two cellular subpopulations presenting two different organizations, one of the epithelial type (that is to say in the form of an apico-basally polarized cell base and presenting tight junctions and the other of mesenchymal type, that is to say without apicobasal organization and presenting focal junctions.
  • the differentiation of the induced pluripotent stem cells from step (b) into hepatic microtissue can be carried out by any known differentiation process as described in Raggi, et al, Stem cell Report 2022 or Mallanna and Duncan, Curr Protoc Cell Bil, 2014.
  • steps (a) and/or (b) are carried out with permanent or sequential stirring. This agitation is important because it maintains the homogeneity of the culture environment and avoids the formation of any diffusive gradient.
  • step (b) is carried out in hypoxia conditions, more preferably the first 5 days of differentiation are carried out in hypoxia conditions.
  • microcompartments comprising at least 100, preferably at least 500, at least 800, at least 1000, in particular at least 3000 cells.
  • the method according to the invention is preferably implemented in a closed enclosure such as a closed bioreactor.
  • the invention also relates to a method for preparing a liver microtissue comprising the implementation of the steps:
  • a closed three-dimensional cellular microcompartment comprising, inside an external hydrogel layer, induced pluripotent stem cells, and optionally extracellular matrix elements or a natural or synthetic extracellular matrix,
  • liver microtissue of ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or ellipsoidal shape comprising at least 300 cells expressing CYP3A4 monooxygenase with activity of at least 75,000 RLU per million cells and producing at least 18pg urea per million cells per 24 hours.
  • Step (c) consists of dissociating the microcompartment to obtain a hepatic microtissue; the elimination of the external hydrogel layer can be carried out in particular by hydrolysis, dissolution, drilling and/or rupture by any biocompatible means, that is to say non-toxic for the cells.
  • removal can be accomplished using phosphate buffer saline, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel includes alginate, and/or laser microdissection.
  • Step (c) of removing the outer layer of hydrogel makes it possible to recover the hepatic microtissue of ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or ellipsoidal shape comprising at least 300 cells corresponding to at least 3 different phenotypes of liver cells.
  • the liver microtissue recovered in step (c) has an ellipsoidal shape.
  • the liver microtissue resulting from step (c) may comprise at least 300, in particular between 300 and 14,000, even more preferably between 900 and 5,000 cells.
  • the hepatic microtissue resulting from step (c) comprises at least one lumen, at least one cell in contact with both a lumen and with the environment external to the microtissue, and at least one cell surrounded only by cells.
  • the method according to the invention makes it possible to produce on a large scale the hepatic microtissue according to the invention so as to form a set of hepatic microtissues capable of forming up to 20% of the mass of the liver of the patient to be treated in less than 50 days, preferably in less than 40 days, particularly in less than 35 days.
  • the method according to the invention comprises at least one reencapsulation of the liver microtissue after step (c), that is to say at least two encapsulation cycles.
  • each encapsulation cycle corresponds to a passage.
  • the number of cell divisions of the entire process (for all of the passages) is at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cell division cycles.
  • Each re-encapsulation may include:
  • the elimination of the external hydrogel layer can be carried out in particular by hydrolysis, dissolution, drilling and/or rupture by any biocompatible means, that is to say non-toxic for the cells.
  • removal can be accomplished using phosphate buffer saline, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel includes alginate and/or laser microdissection, and -a step re-encapsulation of all or part of the liver microtissue in a hydrogel capsule.
  • Re-encapsulation is a suitable means for increasing cellular amplification obtained from the pluripotent stage, and reducing the risk of mutation.
  • Re-encapsulation consists of eliminating the outer layer of hydrogel, preferably resuspending in a partially or totally dissociated manner the cells which were in the form of cysts in the microcompartments and restarting the steps of the process.
  • re-encapsulation comprises the following steps: - (i) remove the outer hydrogel layer,
  • liver microtissue in a hydrogel layer so as to form a microcompartment of ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or ellipsoidal shape, comprising an external hydrogel layer defining a portion internal, the smallest radius or the average radius of said internal part being at least 300 pm;
  • Compartmentalization in microcompartments makes it possible to eliminate microcompartments containing more mutated cells than other capsules. Even if the mutated cells grow rapidly, they will reach the capsular confluence which will contain their multiplication. Compartmentalization also makes it possible not to contaminate the entire cell population, and also to eliminate capsules containing mutant cells, at any time, in particular before a reencapsulation step. This sorting can be done either by online analysis, or by eliminating filled capsules more quickly than others, for example.
  • At least one of the steps is carried out at a temperature adapted to the survival of the cells, between 4 and 42°C.
  • the temperature during cell proliferation should preferably be between 32 and 37°C to avoid triggering mutations by reducing the performance of repair enzymes.
  • the temperature must be low (ideally around 4°C) to manage the stress of the cells in step (c).
  • the method according to the invention may comprise a step consisting of verifying the phenotype of the cells contained in the microcompartment. This verification can be carried out by identifying the expression by at least part of the cells contained in the microcompartment, of specific markers of the desired phenotype chosen from:
  • the cellular microcompartments obtained according to the methods of the invention can then be frozen before any use. Freezing is preferably carried out at a temperature between -190°C and -80°C. Thawing can be carried out by immersing the sealed freezing vehicle (screwable vial or plastic bag) in a lukewarm water bath (preferably 37 degrees) so that the cells thaw fairly quickly.
  • the microcompartments according to the invention before their use can be maintained at more than 4°C for a limited period before their use, preferably between 4°C and 38°C.
  • the invention especially favors amplification with a high expansion rate, which consequently reduces the culture time and the number of divisions to obtain a very large number of functional lymphocytes.
  • the liver microtissue according to the invention can be obtained from any known differentiation process.
  • iPSCs were cultured on vitronectin-coated T75 flasks and were regularly passaged using ReLeSR dissociation reagent (Stem Cell Technologies). All experiments were performed with iPSCs between passages 20 and 26.
  • Encapsulation of iPSCs was carried out in alginate microcapsules of similar size between the two protocols A and B and in the presence of extracellular matrix.
  • the iPSCs were first detached with accutase into small groups of 3 to 5 cells and resuspended at a concentration of 0.8E6 cells/ml in a mix composed of 50% Matrigel and 50% mTESRl medium. containing lOpM of Rhock inhibitor (Y-27632) and encapsulated adapting the method and the microfluidic device described in Alessandri et al., 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)”, Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, pp. 1593-1604).
  • the encapsulated cells were resuspended in mTESRl medium containing 1OpM Rhock inhibitor in a proportion of 0.2 ml of capsule per 1 ml of total medium.
  • the cells were allowed to form cysts in the capsules for 96 hours under shaking conditions, using a 30ml ABLE bioreactor (Reprocell), at 37°C and 5% CO2 with a change of medium every 24 hours in medium mTESRl.
  • the medium was replaced with RPMI medium, containing ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 without insulin and 100ng/ml Activin A.
  • the medium was replaced by RPMI medium, containing for protocol A: ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 without insulin, supplemented with 20ng/ml of BMP-4, 5ng/ml of bFGF , lpM of A83-01 (inhibitor of the TGF beta pathway) and 4pM of IWP-2 (inhibitor of the Wnt pathway).
  • protocol B ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 without insulin, supplemented with 20ng/ml of BMP-4 and 5ng/ml bFGF. From day 11 to day 15, the medium consisted of RPMI medium, containing ImM Ca2+, 2% KOSR, B27 with insulin, supplemented with 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng /ml bFGF and 20ng/ml BMP-4.
  • HCM medium without EGF (Lonza), supplemented with 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF, 20ng/ml BMP-4, 20ng/ml Oncostatin M, lOpM Dexamethasone and 1% KOSR.
  • the medium was composed of HCM medium plus EGF, supplemented with 20ng/ml Oncostatin M, 1OpM Dexamethasone and 1% KOSR.
  • the medium consisted of HCM medium plus EGF, lOpM Dexamethasone and 1% KOSR.
  • qPCR was performed on a Roche LightCycler® 480 instrument.
  • Example 2 Differentiation into hepatocytes within the microcompartment according to the invention versus in two dimensions.
  • the iPSCs were first detached with accutase in small groups of 3 to 5 cells and resuspended at a concentration of 10E6 cells/ml in mTESRl medium containing 1OpM of Rhock inhibitor (Y-27632) and encapsulated adapting the method and the microfluidic device described in Alessandri et al., 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)”, Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p.
  • the encapsulated cells were resuspended in mTESRl medium containing 1OpM of Rhock inhibitor at 0.5E6 cells/ml, the proportion of capsules relative to the medium not exceeding 20%.
  • the cells were allowed to form agglutinates in the capsules for 24 h under shaking conditions, using a 30 ml ABLE bioreactor (Reprocell), at 37°C and 5% CO2.
  • the medium was replaced with RPMI medium, containing ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 without insulin and 100ng/ml Activin A.
  • the medium was replaced with RPMI medium, containing ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 without insulin, supplemented with 20ng/ml BMP-4 and 5ng/ml bFGF.
  • the medium consisted of RPMI medium, containing ImM Ca2+, 2% KOSR, B27 with insulin, supplemented with 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF and 20ng/ml BMP-4.
  • HCM medium without EGF (Lonza), supplemented with 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF, 20ng/ml BMP-4, 20ng/ml Oncostatin M, lOpM Dexamethasone and 1% KOSR.
  • the medium was composed of HCM medium plus EGF, supplemented with 20ng/ml Oncostatin M, 1OpM Dexamethasone and 1% KOSR.
  • the medium consisted of HCM medium plus EGF, lOpM Dexamethasone and 1% KOSR.
  • the medium was changed daily from day 1 to day 25, and every other day from day 25.
  • iPSCs were dissociated into single cells using accutase and placed on 6-well plates coated with Matrigel in mTESRl medium containing 1OpM of Rhock inhibitor at a density of 1x105 cells/cm2. Differentiation was initiated 24 h after plating using the same differentiation protocol and medium composition as for the 3D capsules.
  • qPCR was performed on a Roche LightCycler® 480 instrument.
  • the expansion rate is measured by taking the ratio of the number of cells counted on day X of the culture divided by the number of cells at the start of the culture (day of encapsulation or day of culturing). The expansion rate or amplification factor was measured during differentiation. Monitoring of the expansion rate during the differentiation process is shown in Figure 5. We find an expansion rate of at least times 15, 20 days after the start of differentiation. Assessment of albumin and urea production
  • the conditioned medium was sampled periodically 24 h ( ⁇ 2 h) after the medium change and stored at ⁇ 80°C.
  • the levels of secreted albumin and urea in the medium were measured using the Human Albumin ELISA Kit (Invitrogen) and the Quantichrom Urea Assay Kit (Gentaur), respectively, according to the instructions. from the manufacturer.
  • the quantity of molecules secreted in 24 h was then normalized by the number of cells according to the count carried out after dissociation for each time point.
  • Cyp3A4 activity was performed using the P450-GloTM CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA (Promega) according to the manufacturer's instructions. Briefly, a sample of the 3D capsules containing the microtissues was decapped and the number of cells in a given volume of capsules containing the microtissues was determined. The decapped microtissues corresponding to 1E5 cells, or 1E5 cells which have been differentiated in 2D, were mixed with 50 ⁇ l of the 3pM proluciferin substrate P450-Glo in a 96-well round-bottom plate and incubated for 3 h at 37°C, 5 %CO2.
  • the objective of this example is to characterize the morphology of the cells within the microcompartment during differentiation.
  • HES Hematoxylin-Eosin-Saffron
  • Microtissues were fixed inside the capsules in a solution of 4% paraformaldehyde in PBS with calcium for 1 hour at room temperature. After being rinsed with Ca2+-free PBS to remove the capsules, they were permeabilized in 1% Triton X-100 for 30-60 minutes at room temperature. The microtissues were incubated with the primary antibody solution for 72 h at 4°C with shaking. After washing with PBS, they were incubated with a solution of labeled secondary antibodies (Alexa Fluor, Life Technologies) and DAPI overnight at 4°C with shaking and protected from light.
  • labeled secondary antibodies Alexa Fluor, Life Technologies
  • phalloidin-DAPI For structural imaging by phalloidin-DAPI, the staining was done while preserving the capsules (the decapping step before permeabilization was skipped, the washes were done with PBS containing calcium). The microtissues were incubated with DAPI and Phal loidi ne for 72 hours at 4°C with shaking. After washing with PBS, the cells were mounted on a slide with a spacing of 0.5 mm. Image acquisition was carried out on a confocal microscope (SP5, Leica).
  • the objective of this study is to inoculate immunocompetent mice with hepatocytes derived from stem cells, prepared in the form of cell suspension or microtissues according to the invention, with a view to evaluating their survival and function in vivo.
  • mice The study was carried out on 10-week-old female Balb/cByJ (Mus musculus) mice.
  • mice Seven (7) animals were housed in the animal room. Ventilation and air treatment were carried out by frequent renewals and the temperature was controlled around 21-22°C. Humidity was maintained around 50%. Lighting artificial was maintained 12 hours a day. The quantity and access to food (pellets) and drink (tap water) were monitored daily. The cages were changed once a week and environmental enrichment was done to minimize anxiety.
  • microtissues according to the invention obtained according to Example 1, suspended in a culture medium, were used: approximately 3x106 cells per tube diluted in 170pL of basal medium. Before inoculation, 170pL of Matrigel® was added to each tube.
  • a skin incision in the right flank of the mouse was made in order to prepare a subcutaneous pocket.
  • the microtissue suspension was then injected into this pocket using a pipette before closing the wound with surgical glue to prevent diffusion of the suspension.
  • Suspension of cells cells obtained according to the protocol of Example 2 “Differentiation of hepatocytes in 2D”, suspended in a culture medium, were used: approximately 3x106 cells per tube in 120pL of basal medium. Before inoculation, 120pL of Matrigel® was added to each tube.
  • Control solution a solution of basal medium (vehicle) of lOOpL was mixed with lOOpL of Matrigel®. This solution was injected subcutaneously following the same process as that used for the microtissues and the cell suspension. Sample collection:
  • the grafts including surrounding skin to maintain structure, were harvested as follows:
  • the grafts were removed, fixed, paraffin embedded, sectioned and stained with HES (hematoxylin eosin saffron) and with antibodies specific for the human cell marker Steml21 (detects human cytoplasmic proteins), the liver cell markers albumin and CytK19 (cytokeratin 19).
  • HES hematoxylin eosin saffron
  • microtissues were also stained with HES, albumin and
  • microtissues according to the invention before transplantation are microtissues according to the invention before transplantation.
  • Histological analysis of the grafts on day 2 after transplantation revealed the presence of rounded microtissues positive for the human cell marker Steml21 in mice transplanted with the liver microtissues according to the invention, confirming that the microtissues detected are of original origin. human.
  • Some of the cells composing the microtissues were positive for the hepatocyte marker albumin and some cells, mainly those located at the periphery of the microtissues, were positive for the collangiocytic marker CytK19. Cellular organization and compartmentalization of cells expressing albumin and CytK19 after in vivo transplantation were similar to those observed in microtissues before transplantation.
  • mice transplanted with 2D-generated single cells only rare cells positive for the human cell marker Steml21, albumin, and cytokeratin 19 were detected at day 2 after transplantation.
  • FIG 13a graphic representation of the secretion of AlAT before transplantation of single cells differentiated in 2D (2D) and microtissues according to the invention (Invention).
  • 13b graphic representation of the detection of AlT in the serum of Balb/c mice before (day 0), on day 2 and on day 6 after transplantation with single cells differentiated in 2D (SC), with microtissues of the invention (MT) and with vehicle alone (control).
  • SC single cells differentiated in 2D
  • MT microtissues of the invention
  • liver microtissues according to the invention are capable of secreting a higher level of AlAT than the cells differentiated in 2D.
  • concentration of human AlAT is higher in the serum of mice transplanted with the microtissues according to the invention than in that of mice transplanted with single cells.
  • concentration of human AlAT is lower, even undetectable, on day 0. It is higher on day 2 after transplantation and decreases on day 6 while still being significant and higher than that of single cells differentiated in 2D.
  • These data are consistent with the histological results and show that the microtissues according to the invention persist over time and are more functional after transplantation than single cells differentiated in 2D, even in an immunocompetent mouse model. Overall, these results show that the liver microtissues according to the invention and grafted as 3D objects survive after transplantation in immunocompetent mice, and have better and longer survival after transplantation than liver cells generated in 2D and grafted as a single cell suspension.

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Abstract

L'invention concerne un microtissu hépatique un microtissu hépatique particulier dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700 µm et exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d'au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18µg d'urée par million de cellules par 24 heures. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel microtissu hépatique et ses utilisations dans le traitement ou la prévention de l'insuffisance hépatique.

Description

MICROTISSU HÉPATIQUE PARTICULIER EN TROIS DIMENSIONS ET UTILISATIONS DANS LE TRAITEMENT DE L'INSUFFISANCE HEPATIQUE
Domaine technique
La présente invention se rapporte au traitement de l'insuffisance hépatique par l'utilisation d'un microtissu hépatique obtenu à partir de microcompartiments cellulaires particulier. L'invention a en particulier pour objet un microtissu hépatique particulier, son procédé de préparation et ses utilisations.
Art antérieur
Le foie est un des organes les plus complexes du corps humain. Partie intégrante du système digestif, le foie est constamment approvisionné en substances nutritives ou toxiques issues de la digestion. Le traitement de ces substances par le foie est essentiel pour l'organisme et à comme objectifs :
- le stockage et la répartition des nutriments issus de la digestion
- la dégradation des substances toxiques
- la synthèse de la plupart des protéines du sang, et
-la production de bile.
Pour assurer ces fonctions, le foie est composé d'une grande variété de cellules, tels que des hépatocytes, des cellules des voies biliaires (cholangiocytes), des cellules étoilées (cellules de Ito), des cellules de Kupffer, des cellules souches mésenchymateuse et des cellules endothéliales.
Les hépatocytes sont les cellules hépatiques les plus représentées et sont responsables de la majorité des fonctions hépatiques, de la synthèse des acides gras à la production de l'urée en passant par la synthèse de protéines plasmatiques.
Les cholangiocytes sont les cellules épithéliales polarisées formant les parois des voies biliaires. Ils ont un rôle dans la régulation de la sécrétion de la bile et dans la collecte de celle-ci afin de la transporter des hépatocytes vers l'intestin.
Les autres cellules assurent une bonne vascularisation ainsi que des fonctions de signalisation et d'interactions avec les autres cellules hépatiques et avec les cellules du système immunitaire. Lorsque le foie ne peut plus assurer ses fonctions, on parle d'insuffisance hépatique. Les principales causes d'insuffisances hépatiques sont les infections virales, les surdoses médicamenteuses, les désordres immunologiques, les maladies héréditaires ou des troubles de la circulation du sang. Lorsque l'atteinte aux fonctions du foie est irréversible, le traitement recommandé est la transplantation de foie.
Ainsi, la transplantation de foie représente le traitement standard pour les personnes atteintes d'une maladie hépatiques en phase terminale.
Il existe aujourd'hui de grandes difficultés à trouver des donneurs d'organes pouvant fournir un foie ayant une qualité suffisante pour la réalisation d'une greffe.
Comme toute transplantation d'organe, la transplantation hépatique peut s'effectuer uniquement si le foie présente une bonne qualité afin d'éviter les risques associés à la greffe tels que des infections, des cancers, une immunosuppression trop longue et une chirurgie lourde.
Aujourd'hui, seulement 2/3 des patients peuvent bénéficier d'une greffe et seulement lorsque leur qualité de vie s'est très largement dégradée. Par ailleurs, le coût à prévoir pour une transplantation hépatique est de l'ordre de 1M€ (soit 1M$) aux Etats-Unis.
Face à ces problématiques, plusieurs solutions innovantes ont pu voir le jour.
La transplantation d'hépatocytes isolés est apparue comme une approche séduisante, cependant les essais cliniques sont restés peu nombreux et peu concluant, limités par les faibles survie, intégration et expansion des hépatocytes isolés suite à la greffe in vivo, facteurs par conséquent limitant des effets thérapeutiques à court et à long terme. En effet, les hépatocytes isolés issus de donneurs présentent une capacité de prolifération in vivo et in vitro très limitée. De plus, les hépatocytes isolés mis en culture ont tendance à entrer dans un processus de dédifférenciation diminuant ainsi les chances d'obtenir un nombre suffisant d'hépatocytes matures.
Bien que cette technique permette de traiter un nombre important de patients, la dose administrée est bien souvent insuffisante et présente un risque lors de l'injection d'échappement des cellules dans la circulation générale.
Cela est principalement dû à la difficulté pour des cellules uniques de s'intégrer au sein du foie, ainsi qu'une mauvaise qualité induite par la préparation des cellules primaires et leur culture in vitro et au rejet d'une partie des hépatocytes malgré l'immunosuppression. Par conséquent, le faible nombre de donneurs d'hépatocytes, la stabilité et la fonctionnalité limitée de ces hépatocytes constituent un frein à leur utilisation
Le développement de protocoles de différenciation guidée de cellules souches pluripotentes, c'est-à-dire de cellules souches embryonnaires et de cellules souches pluripotentes induites, a cependant permis d'obtenir une source quasi inépuisable d'hépatocytes.
Bien que prometteurs, les hépatocytes dérivés de cellules pluripotentes sont très difficilement cultivables à grande échelle et engendrent des coûts de production démesurés. A titre d'exemple, le coût prévu pour la production de greffons hépatiques autologue issu de cellules souches pluripotentes induites est de l'ordre de 9,7 millions de dollars.
A ce jour, les protocoles de différenciations guidés ne permettent pas de produire une diversité de phénotypes de cellules fonctionnelles et notamment suffisamment d'hépatocytes matures, les cellules obtenues conservent des caractéristiques d'hépatocytes du foie fœtal avec notamment une expression persistante d'alpha-foetoprotéine ainsi qu'une faible production d'albumine.
Néanmoins, certains protocoles permettent d'obtenir des cellules hépatiques avec de meilleures caractéristiques fonctionnelles. Ces protocoles restent complexes et nécessitent des étapes de dissociations, de réagrégation ou de co-cultures avec notamment des cellules souches mésenchymateuses et des cellules endothéliales. Ces étapes supplémentaires ajoutent des risques supplémentaires, augmentant le cout total et diminuant la maîtrise du produit fini.
Pour une application en thérapie cellulaire, il est nécessaire de pouvoir adapter les procédés existants pour : i) obtenir une production avec un nombre d'étapes limitées pour être efficace à grande échelle, ii) améliorer l'intégration des cellules greffées. Les techniques développées aujourd'hui ne permettent pas de produire de microtissu hépatique obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites adapté à la culture à grande échelle et présentant des hépatocytes fonctionnels.
Les processus de production actuels de microtissu hépatiques sont encore trop complexes, présentent des de multiples étapes et donc un coût très important, et sont difficiles à mettre à grande échelle.
Il existe donc un besoin important pour une solution permettant une production à grande échelle de microtissu hépatique comprenant plusieurs phénotypes de cellules hépatiques, productible à grande échelle et directement transplantable, pour répondre à une demande indispensable de greffons hépatiques.
L'objectif de l'invention est par conséquent de répondre à l'ensemble de ces besoins et de pallier les inconvénients et limites de l'art antérieur.
Résumé de l'invention
Pour répondre à cet objectif, l'invention propose un microtissu hépatique particulier, adapté à des utilisations en thérapie cellulaire et notamment dans la lutte contre les insuffisances hépatiques.
A cet effet, l'invention a pour objet un microtissu hépatique en trois dimensions dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700pm, exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d'au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18pg d'urée par million de cellules par 24 heures.
Avantageusement, l'activité de la CYP3A4 associée à la production d'urée permet de garantir un microtissu hépatique comprenant au moins des cellules hépatiques fonctionnelles.
Préférentiellement, les cellules hépatiques sécrètent au moins 75pg d'albumine par million de cellules par 24h.
Ainsi, le microtissu hépatique présente une activité métabolique similaire à un foie en bonne santé.
Selon un autre objet, l'invention concernant un microtissu hépatique comprenant au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques, lesdites cellules du microtissu ayant toutes été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
Avantageusement, le microtissu hépatique possède une diversité cellulaire suffisante pour restaurer et/ou améliorer les fonctions du foie de manière durable.
Préférentiellement, le microtissu hépatique comprend au moins des hépatocytes immatures, des hépatocytes matures et des cholangiocytes.
Selon un objet préféré de l'invention, le microtissu hépatique comprend au moins :
- des cellules hépatiques, dont au moins 40% des cellules hépatiques sont des cellules exprimant la cytokératine 19 (CK19), et
- des cellules exprimant CD73 et CD90. Préférentiellement, les cellules exprimant CD73 et CD90 sont des cellules souches mésenchymateuse et les cellules exprimant CK19 sont des cholangiocytes.
Avantageusement, la composition phénotypique du microtissu hépatique est proche de celle d'un foie humain en bonne santé.
Préférentiellement, le microtissu hépatique selon l'invention comprend :
- au moins un lumen,
- au moins une cellule du microtissu en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu, et
- au moins une cellule entourée uniquement de cellules.
Avantageusement, l'organisation du microtissu hépatique est proche de l'organisation du tissu hépatique en cours de développement, ce qui lui permet notamment de favoriser son intégration dans le foie et la bonne exécution des fonctions métaboliques dans le foie traité. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le microtissu hépatique se présente sous une forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou ellipsoïdale. Préférentiellement, le microtissu hépatique se présente sous une forme ellipsoïdale.
Avantageusement, la forme ellipsoïdale du microtissu permet de favoriser la survie du microtissu hépatique. Ainsi, une plus grande partie des microtissus hépatiques sont intégrés par le foie traité.
Préférentiellement, le microtissu hépatique selon l'invention comprend au moins un canal biliaire et/ou au moins un granule de glycogène.
Selon un objet préféré de l'invention, le microtissu hépatique comprend :
- entre 50 et 99 % de cellules hépatiques dont entre 20 et 60% de cellules exprimant CK19, et
- entre 1 et 20 % de cellules exprimant CD73 et CD90.
L'invention a également pour objet un ensemble de plusieurs microtissus hépatiques en trois dimensions dans un milieu, dont au moins un microtissu hépatique est un microtissu hépatique selon l'invention. Préférentiellement, au moins 50% (en nombre) des microtissus hépatiques de l'ensemble de microtissus hépatiques, sont des microtissus hépatiques selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un microcompartiment cellulaire clos en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'invention.
Le microcompartiment selon l'invention permet de garantir un microenvironnement adapté à la culture de cellules souches pluripotentes et à leur différenciation en cellules constituant le microtissu selon l'invention. En effet, un tel microcompartiment permet de reproduire les conditions in vivo du microenvironnement cellulaire lors de l'organogénèse hépatique.
L'invention a également pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un microcompartiment ou d'un ensemble de microcompartiments comprenant au moins la mise en œuvre des étapes suivantes, la production d'un microcompartiment comprenant des cellules souches pluripotentes induites, l'induction d'une différenciation cellulaire au sein du microcompartiment de manière à obtenir au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques.
Enfin, l'invention vise un microtissu hépatique selon l'invention ou un microcompartiment le contenant, ou un ensemble de microtissus hépatiques selon l'invention ou un ensemble de microcompartiments les contenant, pour son utilisation comme médicament, préférentiellement dans la prévention ou le traitement de l'insuffisance hépatique provoquée par des maladies telles que la fibrose et la cirrhose hépatiques, la stéatose, la stéatose non alcoolique, les hépatites, les maladies métaboliques du foie, les maladies liées à une sécrétion des facteurs VIII, alpha 1 antitrypsine, IX et/ou VWF, la maladie de Wilson et l'hémochromatose héréditaire.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention et des exemples qui vont suivre.
Brève description des figures
La Figure la est une représentation comparative de l'expression des gènes d'intérêts (EÛMES, CXCR4, HHEX, PROXI, AFP, ASGR1) au cours de la différenciation en fonction du protocole de différenciation.
La Figure lb est une représentation comparative de l'expression des gènes d'intérêts (SOX17, FOXA2, TBX, HNF4A, ALB, KT18) au cours de la différenciation en fonction du protocole de différenciation. La Figure le est une représentation comparative de l'expression des gènes d'intérêts (GATA4, HNF1B, SOX9, KT19, TAT) au cours de la différenciation en fonction du protocole de différenciation.
La Figure 2 est une représentation comparative de l'expression des gènes d'intérêts (EÛMES, CXCR4, FOXA2, SOX17) en fonction des conditions de culture.
La Figure 3 est une représentation comparative de l'expression de protéines d'intérêts (SOX17, FOXA2) en fonction des conditions de culture, 5 jours après le début de la différenciation.
La Figure 4a est une représentation comparative de l'expression des gènes d'intérêts (PROX1, TBX, AFP, KT18, KT19, HNF4A) en fonction des conditions de culture.
La Figure 4b est une représentation comparative de l'expression des gènes d'intérêts (HNF1B, SOX9, ASGR1, ALB, TAT)) en fonction des conditions de culture.
La Figure 5 est une représentation comparative du facteur d'expansion pendant 30 jours en fonction des conditions de culture.
La Figure 6 est une représentation graphique de la sécrétion d'albumine au cours de la différenciation en fonction des conditions de culture.
La Figure 7 est une représentation graphique de la production d'urée au cours de la différenciation en fonction des conditions de culture.
La Figure 8 est une représentation graphique de l'activité de la CYP3A4 en fonction des conditions de culture.
La Figure 9 est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment présentant des hépatocytes.
La Figure 10a est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment de J-0 à J-9 après le début de la différenciation.
La Figure 10b est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment de J-12 à J-30 après le début de la différenciation.
La Figure 10c est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment de J-15 après le début de la différenciation.
La Figure lOd est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment de J-20 après le début de la différenciation.
La Figure 10e est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment de J-30 après le début de la différenciation. La Figure 11 est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale d'un microcompartiment identifiant certains phénotypes de cellules hépatiques.
La Figure 12a est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale :
- de greffons unicellulaires au jour 2 (receveurs 1 et 2, ligne du haut) après la transplantation chez des souris Balb/c,
- de greffons de micro-tissus au jour 2 (receveurs 4 et 5, ligne du bas) après la transplantation chez des souris Balb/c.
La Figure 12b est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale :
- de greffons unicellulaires au jour 6 (receveurs, ligne du haut) après la transplantation chez des souris Balb/c,
- de greffons de micro-tissus au jour 6 (receveur 6, ligne du bas) après la transplantation chez des souris Balb/c.
La Figure 12c est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale du tissu au site d'injection avec le véhicule seul (milieu basal contenant 50% de matrigel) sans greffon chez les souris Balb/c.
La Figure 12d est un ensemble d'images obtenu par microscopie confocale de microtissus selon l'invention avant la transplantation.
La Figure 13a est une représentation graphique de la sécrétion d'AlAT (alpha-1 antitrypsine) avant transplantation de cellules uniques différenciées en 2D (2D) et de microtissus selon l'invention (Invention).
La Figure 13b est une représentation graphique de la détection d'AlT (alpha-1 antitrypsine) dans le sérum de souris Balb/c avant (jour 0), au jour 2 et au jour 6 après la transplantation avec des cellules uniques différenciées en 2D (SC), avec des microtissus l'invention (MT) et avec le véhicule seul (contrôle).
Description détaillée de l'invention
Définitions
Par « alginate » au sens de l'invention, on entend des polysaccharides linéaires formés à partir de p-D-mannuronate et a-L-guluronate, des sels et des dérivés de ceux-ci.
Par « capsule en hydrogel » ou « microcompartiment en hydrogel » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes polymères, gonflée par un liquide et préférentiellement de l'eau.
Par « cellules humaines » au sens de l'invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n'est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l'invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Selon une variante les cellules souches embryonnaires d'êtres humains peuvent être exclues.
Par « une cellule entourée uniquement de cellules » dans un microtissu au sens de l'invention, on entend une cellule qui n'est ni en contact avec un lumen ni en contact l'extérieur du microtissu.
Par « cellule mutante » au sens de l'invention, on entend une cellule porteuse d'au moins une mutation.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l'invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans la présente demande. Il peut s'agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Des exemples de procédés permettant l'obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917- 1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « cellule progénitrice » au sens de l'invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation en cellules hépatiques mais pas encore différenciée.
Par « diamètre de Féret » d'un microcompartiment (ou d'une partie d'un microcompartiment) ou d'un microtissus selon l'invention, on entend la distance « d » comprise entre deux tangentes audit microcompartiment (ou à ladite partie) ou du microtissu, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection dudit microcompartiment (ou de ladite partie) ou du microtissu soit compris entre ces deux tangentes parallèles. Un diamètre de Féret de la partie interne du microcompartiment est mesuré entre deux interfaces de la partie interne et de la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la distance « d » comprise entre deux tangentes à ladite partie interne, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection de ladite partie interne soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « épaisseur variable » d'une couche, on entend au sens de l'invention le fait que la couche pour un même microcompartiment ou un même microtissu, n'a pas la même épaisseur partout.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules.
Par « microtissu » ou « microtissu hépatique » au sens de l'invention on entend un tissu humain en trois dimensions comprenant au moins des cellules hépatiques et dont la plus grande dimension est inférieure à 1mm.
Par « milieu » au sens de l'invention on entend une solution aqueuse englobant des cellules ou des microtissus, compatible avec la survie, le développement et/ou le métabolisme des cellules. Il peut s'agir d'un milieu de culture.
Par « milieu de culture convectif » au sens de l'invention on entend un milieu de culture animé par des mouvements internes.
Par « mutation » au sens de l'invention, on entend une mutation génétique ou épigénétique, préférentiellement une mutation fonctionnelle. Il peut s'agir en particulier d'une modification ponctuelle de la séquence génétique, d'un variant structurel, d'une modification épigénétique, ou d'une modification de l'ADN mitochondrial.
Par « mutation fonctionnelle » au sens de l'invention, on entend une modification génétique ou épigénétique transmissible qui confère un gain ou perte de fonction ou perte de fonction potentielle à cellule mutante concernée. Il s'agit préférentiellement d'une mutation entraînant une modification du phénotype de la cellule mutante concernée. Très préférentiellement il s'agit d'un changement de la séquence du génome et/ou de l'épigénome qui altère le potentiel thérapeutique d'une population de cellules, soit en augmentant le risque associé à la thérapie produite soit en diminuant le bénéfice apporté par la thérapie produite.
Par « plus petite dimension » d'un microcompartiment ou d'une couche de cellules au sens de l'invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret dudit microcompartiment. Par « lumière » ou « lumen » au sens de l'invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement son contenu n'est pas en équilibre diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l'extérieur du microcompartiment.
Par « plus petit rayon » de la partie interne d'un microcompartiment selon l'invention, on entend la moitié de la valeur du plus petit diamètre de Féret de la partie interne du microcompartiment.
Par « rayon moyen » de la partie interne d'un microcompartiment selon l'invention, on entend la moyenne des rayons du plus petit compartiment, chaque rayon correspondant la moitié de la valeur d'un diamètre de Féret de la partie interne du microcompartiment.
Par « taux d'expansion à X jours » selon l'invention, on entend une mesure de la prolifération cellulaire au temps t=X. Le taux d'expansion est mesuré en faisant le ratio du nombre de cellule comptées au jour X de la culture divisé par le nombre de cellule au départ de la culture (jour de l'encapsulation ou jour de mise en culture).
Par « culture à grande échelle » selon l'invention, on entend une méthode de culture cellulaire adaptée pour un lot de production de microtissu hépatique permettant de traiter au moins 1 patient, préférentiellement 10 patients, plus préférentiellement 100 patients, encore plus préférentiellement plus de 1000 patients.
Par « phénotype fonctionnel » d'un microtissu selon l'invention, on entend la présence d'hépatocytes matures caractérisés par l'expression d'albumine et l'absence d'expression d'alphafoetoprotéine et de cytokératine 19. Par « bourgeon hépatique » selon l'invention, on entend une organisation cellulaire caractérisé par une extension cellulaire de l'endoderme de l' intestin antérieur embryonnaire qui donne naissance au parenchyme du foie et de la voie biliaire. Il s'agit d'une conformation particulière donnant naissance aux hépatocytes et aux cholangiocytes.
Par « URL » selon l'invention, on entend l'unité relative de lumière. Elle correspond à la mesure de la quantité de lumière produite par une réaction de bioluminescence. Cette mesure peut s'effectuer à l'aide d'un luminomètre.
Microtissu hépatique
L'invention a donc pour objet un microtissu hépatique en trois dimensions dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700 pm, exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d'au moins 75000 URL par million de cellules et produisant au moins 18pg d'urée par million de cellules par 24 heures.
Les cytochromes P450 sont des hémoprotéines participant au métabolisme oxydatif de nombreuses molécules. Les cytochrome P450 sont des enzymes impliqués dans la biotransformation de composés exogènes, aussi bien dans les phénomènes de détoxication que d'intoxication par formation d'entités réactives. La forme hépatique humaine la plus abondante (CYP3A4) est responsable du métabolisme de plus de 60% des médicaments. Sa présence au sein du microcompartiment est une garantie fonctionnelle. L'urée est un produit azoté issu du catabolisme des protéine. Elle est exclusivement synthétisée au niveau du foie via le cycle de l'urée et la quantité d'urée formée dépend de la quantité de protéines ingérées, du catabolisme protéique et de l'état de la fonction hépatique. Une activité de la CYP3A4 d'au moins 75000 RLU par million de cellules associé à une production d'urée d'au moins 18pg par million de cellules par 24 heures garantit la présence d'hépatocytes matures ainsi qu'une activité métabolique suffisante pour garantir un effet significatif sur les fonctions du foie atteintes.
Préférentiellement, l'activité de la CYP3A4 est d'au moins 80000 URL, encore plus préférentiellement d'au moins 100000 URL.
Selon un mode de réalisation préféré, le microtissu hépatique produit au moins 40pg d'urée par million de cellules par 24 heures, encore plus préférentiellement au moins 60pg, notamment au moins 80pg Avantageusement, le microtissu hépatique selon l'invention présente une activité métabolique proche d'un foie en bonne santé. Ainsi, le microtissu hépatique est particulièrement efficace pour rétablir les fonctions du foie traité.
De façon préférée, le microtissu hépatique selon l'invention comprend entre 50 et 99% de cellules hépatiques.
Le microtissu hépatique selon l'invention peut être obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites.
Selon une variante, le microtissu hépatique peut être obtenu à partir de cellules souches, de cellules progénitrices et/ou de cellules capables de se différencier en cellules hépatiques. Préférentiellement, le microtissu hépatique est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
Le microtissu hépatique comprend préférentiellement des cellules hépatiques sécrétant au moins 75pg d'albumine par million de cellules par 24h, encore plus préférentiellement au moins 150pg, notamment au moins 250pg.
Selon un mode de réalisation particulier, le microtissu hépatique est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites et comprend des cellules hépatiques sécrétant au moins 75pg d'albumine par million de cellules par 24h au moins 20 jours après le début de la différenciation.
L'albumine est une protéine la plus abondante dans le sang. Produite par le foie, l'albumine est responsable notamment de la stabilisation de la pression sanguine et du transport de nombreuses substances.
Avantageusement, une production d'albumine d'au moins 75pg par million de cellules par 24h est un indicateur du bon fonctionnement du microtissu hépatique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le microtissu hépatique comprend au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques, toutes les cellules du microtissu ayant toutes été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
Préférentiellement, le microtissu hépatique comprend au moins 4 phénotypes différents de cellules hépatiques, encore plus préférentiellement au moins 5.
Avantageusement, le microtissu hépatique selon l'invention présente une diversité cellulaires importante permettant de reproduire le microenvironnement hépatique. La diversité et leur proximité des cellules présentes dans le microtissu hépatique permet un nombre important d'interactions cellulaires coopérant ainsi à la réalisation de nombreuses fonctions métaboliques et de transport.
La diversité cellulaire retrouvée dans le microtissu hépatique selon l'invention est obtenue à partir de cellules souches pluripotentes induites dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions. De cette façon, les différents types cellulaires peuvent s'organiser au sein du microcompartiment reproduisant le microenvironnement hépatique.
Selon un mode de réalisation préféré, toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions, préférentiellement lesdites cellules souches pluripotentes induites étant toutes de la même lignée.
Très préférentiellement toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions, par un unique procédé de différenciation mis en oeuvre dans ledit microcompartiment.
Préférentiellement, les cellules souches pluripotentes induites avant différenciation en microtissu selon l'invention forment un cyste dans le microcompartiment. Aussi, de façon préférée, toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues à partir d'au moins un cyste de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions, préférentiellement par différenciation, en particulier par un unique procédé de différenciation mis en oeuvre dans ledit microcompartiment.
Avantageusement, le microenvironnement du microcompartiment à partir duquel est obtenu le microtissu selon l'invention, reproduit les conditions de l'organogénèse hépatique. En effet, le microcompartiment selon l'invention permet de limiter les différentes contraintes physiques et/ou stress et favorise les interactions entre les différents types cellulaires au sein du microcompartiment.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le microtissu hépatique selon l'invention comprend au moins des hépatocytes immatures, des hépatocytes matures et des cholangiocytes. Préférentiellement, il comprend au moins :
- des hépatocytes immatures, caractérisés par l'expression d'alphafoetoprotéine (AFP) et d'albumine (ALB) et l'absence d'expression de cytokératine 19 (CK19)
- des hépatocytes matures caractérisés par l'expression d'albumine et l'absence d'expression d'alphafoetoprotéine et de cytokératine 19
-des cholangiocytes caractérisés par l'expression de cytokératine 19 et l'absence d'expression d'albumine et d'alphafoetoprotéine.
Selon une variante, le microtissu hépatique selon l'invention comprend des hépatoblastes. Les hépatoblastes peuvent être caractérisés par l'expression de l'alphafoetoprotéine, d'albumine et de la cytokératine 19.
La présence de ces phénotypes de cellules hépatiques garantit un effet multifactoriel sur les fonctions hépatiques. Cet effet pouvant permettre de rétablir ou optimiser certaines fonctions hépatiques.
Dans un mode de réalisation particulier, le microtissu hépatique comprends au moins 50% d'hépatocytes matures et/ou immatures.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le microtissu hépatique comprend au sein des cellules hépatiques entre 20 et 60% (en nombre) de cellules exprimant la cytokératine 19.
Les cellules exprimant la cytokératine 19 sont préférentiellement des cholangiocytes.
Dans le contexte de l'invention, les cellules hépatiques sont préférentiellement choisies parmi les hépatocytes matures, les hépatocytes immatures, les hépatoblastes, les cholangiocytes et leurs mélanges.
Le microtissu hépatique peut comprendre également des cellules exprimant CD73 et CD90. Les cellules exprimant CD73 et CD90 sont préférentiellement des cellules souches mésenchymateuses.
Les cellules souches mésenchymateuses sont une population cellulaire bien connue pour ses propriétés sur la réparation et la régénération tissulaires notamment du foie. Avantageusement, la présence de cellules souches mésenchymateuses issus de cellules souches pluripotentes induites du patient à traiter permet de garantir une efficacité de la réparation tissulaire du foie présentant une insuffisance hépatique.
Ainsi dans un mode de réalisation particulier, le microtissu selon l'invention comprend au moins :
- des cellules hépatiques, préférentiellement au moins des hépatocytes immatures, des hépatocytes matures, des cholangiocytes, et
- des cellules exprimant CD73 et CD90, préférentiellement au moins des cellules souches mésenchymateuses.
De façon préférée, le microtissu hépatique comprends au moins :
- des cellules hépatiques dont entre 20 et 60% (en nombre) des cellules sont des cellules exprimant la cytokératine 19, et
- des cellules exprimant CD73 et CD90.
Le microtissu hépatique comprend préférentiellement (pourcentages en nombre) :
- entre 50 et 99 % de cellules hépatiques, dont préférentiellement dont entre 20 et 60% (en nombre) des cellules sont des cellules exprimant la cytokératine 19, et
- entre 1 et 20% de cellules exprimant CD73 et CD90.
Le microtissu hépatique selon l'invention peut également comprendre d'autres cellules, telles que notamment des cellules de Ito (cellules étoilées), des cellules de Kupffer, des cellules endothéliales, des hépatoblastes. Ainsi, dans un autre mode de réalisation particulier, le microtissu hépatique comprend :
- des hépatocytes matures, des hépatocytes immatures, des hépatoblastes, des cholangiocytes,
- des cellules de Ito et/ou des cellules de Kupffer et/ou des cellules endothéliales,
- et éventuellement des cellules souches mésenchymateuses.
Selon une variante, le microtissu hépatique selon l'invention peut comprendre également des cellules musculaires lisses et/ou des fibroblastes.
Les phénotypes de cellules compris dans le microtissu hépatique sont préférentiellement compatible avec le microenvironnement hépatique.
La diversité cellulaire proposée par le microtissu hépatique selon l'invention permet de réparer et régénérer le foie malade de façon à rétablir les fonctions atteintes.
La concentration en hépatocytes matures, cholangiocytes et en cellules souches mésenchymateuses permet de garantir un effet durable lors de la thérapie cellulaire. Il est particulièrement important lors de la culture d'obtenir une teneur en hépatocytes matures et/ou immatures supérieure à 50% afin d'obtenir un effet suffisant dans les plus brefs délais après la greffe de microtissus.
Une concentration en hépatocytes matures et/ou immatures inférieure à 50% limiterait l'efficacité du greffon et imposerait un volume de greffe d'autant plus important que la concentration (en nombre) en hépatocytes est faible. En effet il est estimé qu'au moins 5% de la masse du foie en hépatocytes fonctionnels est nécessaire pour le traitement de l'insuffisance hépatique aigüe par exemple et les insuffisances métaboliques du foie telles que les maladies liées à une sécrétion de facteur VIII et facteur IX et VWF, la maladie de Wilson et l'hémochromatose héréditaire nécessitent le même ordre de grandeur.
Les hépatocytes matures expriment l'albumine mais n'expriment pas l'alphafoetoprotéine. Ces marqueurs sont facilement identifiables et quantifiables par des méthodes de détection bien connues de l'homme du métier telle que la cytométrie en flux.
De façon particulièrement préférée, le microtissu hépatique comprend au moins un lumen, au moins une cellule en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu et au moins une cellule entourée uniquement de cellules.
Dans le contexte de l'invention, une telle organisation est caractéristique d'un microtissu fonctionnel prêt à être utilisé en thérapie cellulaire.
L'organisation particulière du microtissu est possible notamment grâce à la présence de cellules hépatiques polarisées permettant de structurer et d'organiser le microtissu.
Ainsi, le microtissu peut contenir des cellules hépatiques polarisées. La polarisation des cellules hépatiques dans le microcompartiment peut être un indicateur de la formation d'un microtissu fonctionnel.
Le microtissu hépatique selon l'invention ne comprend pas de cellules souches embryonnaires d'êtres humains.
Le microtissu hépatique selon l'invention peut se présenter sous forme ellipsoïdale.
Avantageusement, la forme ellipsoïdale du microtissu permet une de favoriser la survie et l'intégration du microtissu hépatique. Lorsque le microtissu hépatique est injecté dans la circulation générale, sa forme ellipsoïdale lui permet de faciliter son écoulement dans les vaisseaux sanguins dans le cas d'une administration par injection par voie vasculaire (dans une réalisation via la veine porte) mais aussi leur écoulement au sein d'une canule si l'administration se fait par greffe intratissulaire. L'amélioration de l'injection du microtissu hépatique engendre une amélioration de l'intégration du microtissu hépatique par le foie du patient traité.
Le microtissu hépatique selon l'invention présente préférentiellement un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 100 et 300 pm, préférentiellement entre 150 et 280pm. La plus grande dimension du microtissu hépatique est préférentiellement quant à elle inférieure à 1mm, et est très préférentiellement comprise entre 500 et 700pm.
Avantageusement, la taille du microtissu hépatique est adaptée pour une administration par la veine porte.
Le microtissu hépatique selon l'invention peut comprendre entre 300 et 14000 cellules, préférentiellement entre 500 et 8000, encore plus préférentiellement entre 900 et 5000, notamment 4500 cellules.
De façon préférée, le microtissu hépatique comprend au moins un canal biliaire. Les canaux biliaires recueillent la bile produite par les cellules hépatiques pour l'acheminer vers la vésicule biliaire. La présence d'au moins un canal biliaire au sein du microtissu hépatique favorise le bon fonctionnement du microtissu au sein du foie et la reconstruction des canaux biliaires défectueux.
Selon un autre mode de réalisation, le microtissu hépatique comprend au moins un granule de glycogène. Le glycogène sert de stockage des glucides dans l'organismes, il est principalement stocké dans le foie. Sous l'action de l'insuline, les cellules hépatiques stockent le glucose sous forme de glycogène. Sous l'action du glucagon, les cellules hépatiques vont hydrolyser le glycogène et libèrent le glucose dans le sang. La présence de granules de glycogène dans la cellule hépatiques est un élément physiologique du fonctionnement de son métabolisme et donc de sa fonction. Ainsi, la présence d'au moins un granule de glycogène dans le microtissu hépatique garantit des conditions favorables au fonctionnement des microtissus hépatiques pour un effet thérapeutique optimal.
Préférentiellement, le microtissu hépatique comprend au moins un canal biliaire et au moins un granule de glycogène.
Le microtissu hépatique selon l'invention peut être obtenu par différenciation de cellules souches pluripotentes induites au moins 20 jours, préférentiellement au moins 30 jours après l'encapsulation dans un microcompartiment clos en trois dimensions de 1 à 200 cellules souches pluripotentes induites, préférentiellement entre 5 et 150, notamment entre 15 et 80. De façon préférée, le microtissu hépatique peut être obtenu à partir de l'encapsulation dans un microcompartiment clos en trois dimensions de 1 à 200 cellules souches pluripotentes induites, préférentiellement entre 5 et 150, notamment entre 15 et 80. Préférentiellement les souches pluripotentes induites forment un cyste dans le microcompartiment avant différenciation en cellules du microtissu hépatique selon l'invention.
L'invention a également pour objet un ensemble de microtissus hépatiques comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'invention. Préférentiellement il s'agit d'un ensemble de plusieurs microtissus hépatiques en trois dimensions dans un milieu, dont au moins un microtissu hépatique est un microtissu hépatique selon l'invention.
Selon une variante, au moins 50% (en nombre) des microtissus hépatiques de l'ensemble de microtissus hépatiques, sont des microtissus hépatiques selon l'invention.
L'ensemble de microtissus hépatiques selon l'invention est adapté pour être administré aux patients présentant une insuffisance hépatique. L'administration peut être effectuée par injection dans une solution biocompatible. L'injection peut s'effectuer dans la veine porte de façon à atteindre le foie sans dispersion dans la circulation générale, directement dans le foie ou de façon ectopique. Lorsque l'injection est ectopique elle peut se réaliser dans l'abdomen ou sous la capsule rénale.
De façon préférée, la quantité efficace de l'ensemble de microtissu injecté au patient correspond à une masse entre 1 et 20% de la masse du foie du patient traité, préférentiellement entre 2 et 10%, notamment 5%.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un microcompartiment comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'invention.
Le microcompartiment selon l'invention comprend une couche externe en hydrogel. Préférentiellement l'hydrogel utilisé est biocompatible, c'est-à-dire qu'il n'est pas toxique pour les cellules. La couche externe d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Selon un mode de réalisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Elle peut être constituée exclusivement d'alginate. L'alginate peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de p-D-mannuronate, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa et une concentration totale comprise entre 0,5 et 5% en masse. La couche externe en hydrogel est dépourvue de cellules.
La couche externe d'hydrogel permet notamment de protéger les cellules du stress mécanique des bioréacteurs, de limiter les molécules potentiellement toxiques quand accumulées dans le milieu.
L'épaisseur moyenne de couche externe peut être variable. Elle est préférentiellement comprise entre 20 et 60pm, plus préférentiellement entre 30 et 40pm. Le ratio entre le plus petit rayon de la partie interne et cette épaisseur est préférentiellement comprise entre 2 et 10 pm.
Le microcompartiment selon l'invention présente avantageusement un taux d'expansion des cellules souches pluripotentes induites d'au moins fois 15, 20 jours après le début de la différenciation.
L'invention favorise ainsi l'amplification avec un taux d'expansion élevé, ce qui par conséquent diminue le temps de cultures pour obtenir un microtissu fonctionnel.
Le microcompartiment selon l'invention peut être obtenu après encapsulation de cellules souches pluripotentes induites avec ou sans ajout de matrice extracellulaire, naturelle ou de synthèse.
Selon une variante, le microcompartiment selon l'invention comprend dans sa partie interne de la matrice extracellulaire telle que du Matrigel® et/ou de la Geltrex® et/ou une matrice type hydrogel d'origine végétale comme des alginates modifiés ou d'origine synthétique ou de copolymère de poly(N-isopropylacrylamide) et de poly(éthylène glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®.
Selon une variante, le microcompartiment selon l'invention peut être obtenu après encapsulation de cellules souches pluripotentes induites sans ajout d'aucun élément de matrice extracellulaire. Les éléments de matrice extracellulaire peuvent être les séquences peptidiques ou peptidomimétiques, les mélanges de protéines, les composés extracellulaires ou les protéines structurelles, telles que collagène, des laminines, de l'entactine, de la vitronectine, ainsi que des facteurs de croissance ou des cytokines.
Au sein du microcompartiment, les cellules souches pluripotentes induites se différencie en tissu hépatique pendant une période d'au moins 20 jours, préférentiellement au moins 30 jours.
De manière inattendue, le microcompartiment propose un microenvironnement favorable au développement d'un microtissu hépatique. En effet, durant la différenciation au sein du microcompartiment, les cellules s'organisent pour former une structure similaire à un bourgeon hépatique. Ce bourgeon hépatique est retrouvé au cours de l'organogénèse hépatique in vivo, c'est cette structure particulière qui donne naissance aux hépatocytes et aux cholangiocytes. La présence d'une structure similaire à un bourgeon hépatique lors de la formation du microtissu hépatique est un indicateur de la bonne qualité du tissu.
Ainsi, le microtissu hépatique selon l'invention est préférentiellement obtenu après la formation d'une structure similaire à bourgeon hépatique dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
Le microcompartiment selon l'invention permet d'isoler les cellules souches pluripotentes induites des contraintes mécaniques présentes au sein du bioréacteur. Cette isolation mécanique permet au microtissu de mettre en place et de maintenir une topologie qui se rapproche de l'organisation spatiale et structurelle de l'organogénèse hépatique existant in vivo.
De façon inattendue, après au moins 20 jours, préférentiellement 30 jours, de différenciation au sein du microcompartiment les cellules conservent leur conformation permettant ainsi d'avoir une meilleure prolifération tout en maintenant un phénotype fonctionnel. Par conséquent cela permet de réduire le nombre de passages et de réduire le temps en culture nécessaire pour atteindre le nombre de cellules hépatiques final nécessaire.
Les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été préférentiellement obtenues après au moins deux cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel de 1 à 200 cellules souches pluripotentes induites, préférentiellement entre 5 et 150, notamment entre 15 et 80.
De façon préférée, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été obtenus après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel, préférentiellement au moins 5, encore plus préférentiellement au moins 6, pour obtenir jusqu'à 8000 hépatocytes matures par microcompartiment. Par exemple, les hépatocytes matures présents dans le microcompartiment ont été obtenus après au moins six cycles de division cellulaire après l'encapsulation des cellules dans la couche externe en hydrogel.
Préférentiellement le nombre de divisions cellulaires pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention est inférieur à 100, encore plus préférentiellement inférieur à 30.
Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages après l'encapsulation, plus préférentiellement au moins 3, 4 ou 5 passages. Chaque passage peut durer par exemple entre 2 et 10 jours, notamment entre 2 et 4 jours.
De façon préférée, le microcompartiment est obtenu après au moins une ré-encapsulation, plus préférentiellement entre 1 et 14 ré-encapsulations, notamment entre 2 et 7 réencapsulations. Très préférentiellement une ré-encapsulation correspond à un nouveau passage et chaque cycle d'encapsulation correspond à un passage.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention a été obtenu en moins de 30 jours après l'encapsulation, encore plus préférentiellement en moins de 20 jours après encapsulation d'au moins 1 cellule souche pluripotente induite dans la partie interne définie par la couche externe en hydrogel, préférentiellement 5, 20 et jusqu'à 100.
Le microcompartiment selon l'invention peut contenir entre 100 et 14000 cellules, préférentiellement entre 300 et 10000 cellules, encore plus préférentiellement entre 300 et 5000, plus particulièrement au moins 50 hépatocytes matures et au moins 20 cholangiocytes. Avantageusement, le microcompartiment selon l'invention protège les cellules souches pluripotentes induites du stress mécanique permettant ainsi d'obtenir un taux d'expansion particulièrement adapté à la culture à grande échelle.
Le microcompartiment selon l'invention peut se présenter sous toute forme en trois dimensions, c'est-à-dire qu'il peut avoir la forme de tout objet de l'espace. Le microcompartiment peut avoir n'importe quelle forme compatible avec l'encapsulation de cellules. Préférentiellement le microcompartiment selon l'invention se présente sous une forme sphérique ou allongée ou ellipsoïdale ou sensiblement sphérique ou allongée. Il peut avoir la forme d'un ovoïde, d'un cylindre, d'un sphéroïde ou d'une sphère ou sensiblement cette forme.
C'est la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la couche d'hydrogel, qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment selon l'invention. Préférentiellement la plus petite dimension du microcompartiment selon l'invention est comprise entre 150 pm et 500 pm, préférentiellement entre 200 pm et 450 pm.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 350 pm, plus préférentiellement comprise entre 350 pm et 600 pm.
Le microcompartiment selon l'invention peut être éventuellement congelé pour être stocké. Il devra ensuite être préférentiellement décongelé avant son utilisation.
L'invention a également pour objet plusieurs microcompartiments selon l'invention utilisés ensemble.
L'invention a également pour objet un ensemble ou série de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l'invention.
De façon préférée, la série de microcompartiments selon l'invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif. Tout milieu de culture adapté à la culture de cellules souches pluripotentes induites peut être utilisé, tel que par exemple le milieu « HCM Hepatocyte Culture Medium BulletKit (Lonza)» ou «Milieu E de William (Thermofisher Scientific) » dès lors que la concentration en sels dissouts est compatible avec le maintien de la réticulation de l'alginate par les cations divalents.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention a pour objet une série de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur. Ainsi, préférentiellement, les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur clos.
L'ensemble ou série de microcompartiments selon l'invention comprend préférentiellement entre 2 et 1016 microcompartiments.
Ainsi, le microcompartiment selon l'invention est adapté à la culture à grande échelle en fournissant des microtissus hépatiques présentant un phénotype fonctionnel notamment vis- à-vis de leur capacités détoxificatrices (particulièrement l'activité de CYP3A) et sécrétrices (particulièrement la sécrétion d'albumine) garantissant une efficacité optimale in vivo.
Utilisation du microtissu hépatique selon l'invention
Le microtissu hépatique ou le microcompartiment selon l'invention peut être utilisé pour toutes applications, en particulier comme médicament, en particulier en thérapie cellulaire chez l'Homme.
Ainsi, l'invention a pour objet un microtissu hépatique selon l'invention ou un ensemble de microtissus hépatiques comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'invention, ou un microcompartiment selon l'invention ou un ensemble de microcompartiments comprenant au moins un microcompartiment selon l'invention, pour son utilisation comme médicament, en particulier en thérapie cellulaire. L'invention vise également une méthode de traitement thérapeutique qui consiste à greffer et/ou injecter des microtissus selon l'invention chez l'Homme, notamment comme traitement en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, le microtissu hépatique ou le microcompartiment selon l'invention peut être utilisé dans la prévention ou le traitement des symptômes associées à une insuffisance hépatique notamment une insuffisance hépatique aiguë, chronique ou aiguë-sur-chronique. De façon préférée, le microtissu hépatique ou le microcompartiment selon l'invention peut être utilisé dans la prévention ou le traitement de maladie telle que la fibrose, la cirrhose, la stéatose, la stéatose non alcoolique, les hépatites, les maladies métaboliques du foie telles que les maladies liées à une sécrétion de facteur VIII et facteur IX et VWF, la maladie de Wilson et l'hémochromatose héréditaire. En effet toutes ces indications sont traitables par greffe de foie et c'est précisément ce que la greffe d'un ensemble de microtissus selon l'invention rétablissant les fonctions hépatiques est appelé à solutionner.
Ainsi, l'invention a pour objet un microtissu hépatique selon l'invention ou un ensemble de microtissus hépatiques comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'invention, ou un microcompartiment selon l'invention ou un ensemble de microcompartiments comprenant au moins un microcompartiment selon l'invention, pour son utilisation, dans la prévention ou le traitement des symptômes associées à une insuffisance hépatique notamment une insuffisance hépatique aiguë, chronique ou aiguë-sur-chronique, en particulier dans la prévention ou le traitement de maladie hépatiques telle que la fibrose, la cirrhose, la stéatose, la stéatose non alcoolique, les hépatites, les maladies métaboliques du foie telles que les maladies liées à une sécrétion de facteur VIII et facteur IX et VWF.
L'invention concerne également un microtissu hépatique selon l'invention ou un ensemble de microtissus hépatiques comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'invention, ou un microcompartiment selon l'invention ou un ensemble de microcompartiments comprenant au moins un microcompartiment selon l'invention, pour son utilisation dans l'évaluation de molécules ou dans la modélisation des maladies hépatiques.
Procédé de préparation de microcompartiments et de microtissus selon l'invention L'invention vise également un procédé de préparation de microcompartiments selon l'invention. Le procédé de préparation d'un microcompartiment ou d'un ensemble de microcompartiments selon l'invention, peut comprendre les étapes suivantes :
-(a) préparation d'un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos comprenant, à l'intérieur d'une couche externe en hydrogel, des cellules souches pluripotentes induites, et éventuellement des éléments de matrices extracellulaires ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse,
-(b) induire une différenciation cellulaire au sein du microcompartiment cellulaire, de manière à obtenir un microcompartiment comprenant des cellules hépatiques.
La préparation du microcompartiment de l'étape (a) peut être réalisée dans tout milieu de culture adapté à la culture de cellules souches pluripotentes induites tel que les milieux mTeSR™l ou mTeSRPIus de Stemcell technologies, StemMACS™ iPS-Brew XF ( Miltenyi Biotec ou StemFlex de thermofisher Scientific).
Le microcompartiment de l'étape (a) peut être obtenu par encapsulation de 1 à 150 cellules souches pluripotente induites, préférentiellement au moins 50, notamment au moins 100.
Préférentiellement l'encapsulation est mise en œuvre selon les techniques connues de l'homme du métier. En effet, toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à l'intérieur d'une couche externe d'hydrogel et des cellules peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé de préparation selon l'invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604), conformément aux étapes décrites ci-dessous.
Préférentiellement l'étape (a) est mise en œuvre en ajoutant des éléments de matrices extracellulaires ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse. Selon une variante, l'étape (a) est mise en œuvre sans ajouter d'éléments de matrice extracellulaire ni de matrices extracellulaires ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse.
Dans le contexte de l'invention, l'étape (a) est préférentiellement mise en œuvre dans un dispositif capable de générer des capsules d'hydrogel à l'aide d'une puce microfluidique. Par exemple le dispositif peut comprendre des pousses seringues pour plusieurs solutions injectées de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes collectées ensuite dans un bain de calcium. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, deux ou trois solutions chargées sur deux ou trois pousse-seringues :
- une solution d'hydrogel, par exemple d'alginate,
- optionnellement une solution intermédiaire isotonique préférentiellement une solution isotonique ne contenant pas de cation divalent tel que Ca2+ Mg2+ pour éviter une réticulation de l'hydrogel trop précoce dans l'injecteur, telle que par exemple une solution de sorbitol,
- une solution comprenant des cellules souches pluripotentes induites et du milieu de culture Les trois solutions sont co-injectées (injectées simultanément) de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique ou puce microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche extérieure est la solution d'hydrogel et le cœur la solution de l'étape (a) comprenant les cellules souches pluripotentes induites ; Ces gouttes sont collectées dans un bain de calcium qui réticule et/ou gélifie la solution d'alginate pour former la coque.
Pour améliorer la mono-dispersité des microcompartiments cellulaires, la solution d'hydrogel est préférentiellement chargée avec un courant continu à (entre 1 et lOkV). Un anneau à la masse peut éventuellement être disposé à une distance de la pointe comprise entre 1mm et 20 cm, préférentiellement 3mm à 10 cm, encore plus préférentiellement 1cm à 5cm, de la pointe dans le plan perpendiculaire à l'axe du jet sortant de l'injecteur microfluidique (puce de coextrusion) pour générer le champ électrique.
Selon l'invention, il est nécessaire de générer des capsules dont la partie interne a un rayon moyen ou plus petit rayon d'au moins 100pm. Pour générer des capsules avec de telles dimensions avec une puce de coextrusion (injecteur microfluidique ou puce microfluidique) l'invention propose notamment de modifier le débit des solutions coextrudées et l'ouverture finale de la puce de co-extrusion. Par débit on entend le débit de de chaque solution qui arrive à l'injecteur. Par ouverture finale de la puce de co-extrusion, on entend l'ouverture interne du canal de sortie de la puce.
- pour le débit : on passe préférentiellement d'une valeur comprise entre 20 et 40 ml/h pour chaque solution coextrudée pour les tailles standards de capsules connues de l'art antérieur, à une valeur comprise entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL par heure pour une variante de l'invention, - pour le diamètre de l'ouverture finale de la puce de coextrusion (injecteur microfluidique) qui passe d'une valeur préférentiellement comprise entre 50 et 120 pm pour les tailles standards de capsules connues de l'art antérieur, à une valeur de diamètre comprise entre 150 et 300 pm, préférentiellement entre 180 et 240 pm.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier l'encapsulation de l'étape (a) est réalisée à l'aide d'un injecteur microfluidique dont le diamètre d'ouverture finale est compris entre 150 et 300 pm, préférentiellement entre 180 et 240 pm, et avec le débit de chacune des 3 solutions compris entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL/h.
Selon une variante, l'étape (a) de préparation d'un microcompartiment peut être réalisée avec des cellules souches, des cellules souches progénitrices ou des cellules capables de se différentier en cellules hépatiques.
L'étape (b) de différenciation cellulaire s'effectue préférentiellement pendant au moins 20 jours, encore plus préférentiellement au moins 30 jours.
Au cours de la différenciation de l'étape (b) les cellules s'organisent dans une organisation similaire à celle d'un bourgeon hépatique. Cette organisation est typiquement marquée par la structuration sous forme de deux sous populations cellulaires présentant deux organisations différentes, l'une de type épithéliale (c'est-à-dire sous forme d'assise cellulaire polarisée apico-basalement et présentant des jonctions serrées et l'autre de type mésenchymateux c'est-à-dire sans organisation apicobasale et présentant des jonctions focales.
La différenciation des cellules souches pluripotentes induites de l'étape (b) en microtissu hépatique peut s'effectuer par tout procédé de différenciation connus tels que décrit dans Raggi, et al, Stem cell Report 2022 ou Mallanna et Duncan, Curr Protoc Cell Bil, 2014.
Selon un mode de réalisation, les étapes (a) et/ou (b) sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Cette agitation est importante car elle maintient l'homogénéité de l'environnement de culture et évite la formation de tout gradient diffusif.
Préférentiellement, l'étape (b) est réalisée en condition d'hypoxie, plus préférentiellement les 5 premiers jours de différenciations sont réalisés en condition d'hypoxie.
De façon inattendue, la différenciation en condition d'hypoxie permet d'obtenir un meilleur taux d'expansion.
La mise en œuvre du procédé selon l'invention, permet d'obtenir des microcompartiments comprenant au moins 100, préférentiellement au moins 500, au moins 800, au moins 1000, notamment au moins 3000 cellules.
Le procédé selon l'invention est préférentiellement mis en œuvre d'une enceinte close tel qu'un bioréacteur clos.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un microtissu hépatique comprenant la mise en œuvre des étapes :
-(a) préparation d'un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos comprenant, à l'intérieur d'une couche externe en hydrogel, des cellules souches pluripotentes induites, et éventuellement des éléments de matrices extracellulaires ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse,
-(b) induire une différenciation cellulaire au sein du microcompartiment cellulaire de façon à différencier les cellules souches pluripotentes induites en cellules hépatiques
-(c) éliminer la couche externe d'hydrogel pour récupérer le microtissu hépatique de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou ellipsoïdale comprenant au moins 300 cellules exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d'au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18pg d'urée par million de cellules par 24 heures.
L'étape (c) consiste à dissocier le microcompartiment pour obtenir un microtissu hépatique ; l'élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser.
L'étape (c) d'élimination de la couche externe d'hydrogel permet de récupérer le microtissu hépatique de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou ellipsoïdale comprenant au moins 300 cellules correspondant à au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques.
Préférentiellement, le microtissu hépatique récupéré à l'étape (c) se présente de forme ellipsoïdale.
Le microtissu hépatique issu de l'étape (c) peut comprendre au moins 300, notamment entre 300 et 14000, encore plus préférentiellement entre 900 et 5000 cellules. Le microtissu hépatique issu de l'étape (c) comprend au moins un lumen, au moins une cellule en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu, et au moins une cellule entourée uniquement de cellules.
Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de produire à grande échelle le microtissu hépatique selon l'invention de façon à former un ensemble de microtissus hépatiques pouvant former jusqu'à 20% de la masse du foie du patient à traiter en moins de 50 jours, préférentiellement en moins de 40 jours, notamment en moins de 35 jours.
Dans une variante préférée, le procédé selon l'invention comprend au moins une réencapsulation du microtissu hépatique après l'étape (c), c'est-à-dire au moins deux cycles d'encapsulation. Préférentiellement chaque cycle d'encapsulation correspond à un passage. Dans cette variante du procédé (au moins une ré-encapsulation des cellules après l'étape (c)) le nombre de divisions cellulaires de l'ensemble du procédé (pour l'ensemble des passages) est d'au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire. Dans un procédé selon l'invention il peut y avoir plusieurs ré-encapsulations, préférentiellement entre 1 et 100, notamment entre 1 et 10 ré-encapsulation(s).
Chaque ré-encapsulation peut comprendre :
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir un microtissu hépatique ; l'élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser, et -une étape de ré-encapsulation de tout ou partie du microtissu hépatique dans une capsule d'hydrogel. La ré-encapsulation est un moyen adapté pour une augmentation de l'amplification cellulaire obtenue depuis l'étape pluripotente, et diminuer les risques de mutation.
La ré-encapsulation consiste à éliminer la couche externe d'hydrogel, préférentiellement à remettre en suspension de manière partiellement ou totalement dissociées les cellules qui étaient sous forme de cystes dans les microcompartiments et à remettre en oeuvre les étapes du procédé.
Selon un mode de réalisation la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes : - (i) éliminer la couche externe en hydrogel,
- (ii) remettre en suspension le microtissu hépatique qui étaient contenu dans le microcompartiment
- (iii) encapsuler le microtissu hépatique dans une couche d'hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou ellipsoïdale, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d'au moins 300 pm ;
- (iv) cultiver les microcompartiments obtenus dans un milieu de culture
- (vii) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
La compartimentalisation dans des microcompartiments permet d'éliminer les microcompartiments contenant d'avantage de cellules mutées que les autres capsules. Même si les cellules mutées ont une croissance rapide elles vont atteindre la confluence capsulaire qui va contenir leur multiplication. La compartimentalisation permet aussi de ne pas contaminer l'intégralité de la population cellulaire, et également d'éliminer les capsules contenant des cellules mutantes, à tout moment, en particulier avant une étape de réencapsulation. Ce tri peut être fait soit par analyse en ligne, soit par élimination des capsules remplies plus rapidement que les autres par exemple.
Dans un mode de mise en oeuvre, au moins une des étapes (préférentiellement toutes les étapes) est réalisée à une température adaptée à la survie des cellules, comprise entre 4 et 42°C. La température lors de la prolifération cellulaire doit être préférentiellement entre 32 et 37°C pour éviter de déclencher des mutations en baissant la performance des enzymes de réparation. De même, de façon préférée, la température doit être basse (idéalement environ 4°C) pour gérer le stress des cellules à l'étape (c).
À tout moment, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à vérifier le phénotype des cellules contenues dans le microcompartiment. Cette vérification peut être réalisée en identifiant l'expression par au moins une partie des cellules contenues dans le microcompartiment, de marqueurs spécifiques du phénotype recherché choisis parmi :
- l'expression d'alphafoetoprotéine, albumine et de cytokératine 19 pour caractériser les hépatoblastes l'expression d'alpha-foetoprotéine et d'albumine et l'absence d'expression de cytokératine 19 pour caractériser les hépatocytes immatures
- l'expression d'albumine et l'absence d'expression d'alphafoetoprotéine ni de cytokératine 19 pour caractériser les hépatocytes matures l'expression de cytokératine et l'absence d'expression d'albumine et d'alphafoetoprotéine pour caractériser les cholangiocytes
-l'expression de CD31 pour caractériser les cellules endothéliales
-l'expression de CD90 et CD73 pour caractériser les cellules souches mésenchymateuses. Les microcompartiments cellulaires obtenus selon les procédés de l'invention peuvent ensuite être congelés avant toute utilisation. La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre -190°C et -80°C. La décongélation peut être réalisée par immersion du véhicule de congélation étanche (ampoule vissable ou poche plastique) dans un bain d'eau tiède (37 degrés préférentiellement) pour que les cellules décongèlent assez rapidement. Les microcompartiments selon l'invention avant leur utilisation peuvent être maintenus à plus de 4°C pendant une durée limitée avant leur utilisation, préférentiellement entre 4°C et 38°C.
L'invention favorise surtout l'amplification avec un taux d'expansion élevé, ce qui par conséquent diminue le temps de culture et le nombre de divisions pour obtenir un nombre de lymphocytes fonctionnels très important.
Exemple :
Exemple 1 : protocole de différenciation
Le microtissu hépatique selon l'invention peut s'obtenir à partir de tout procédé de différenciation connus.
Pour démontrer cela, les inventeurs ont adapté 2 protocoles connus de l'art antérieur. Le protocole A décrit dans Raggi, et al, Stem cell Report 2022 et le protocole B adapté à partir de Mallanna et Duncan, Curr Protoc Cell Bil, 2014 et Raggi et al, Stem Cell Reports, 2022.
Matériel et méthode
Les iPSCs ont été cultivées sur des flacons T75 recouverts de vitronectine et ont été régulièrement passées en utilisant le réactif de dissociation ReLeSR (Stem Cell Technologies). Toutes les expériences ont été réalisées avec des iPSCs entre les passages 20 et 26.
L'encapsulation des iPSCs a été effectuée dans des microcapsules d'alginate de taille similaire entre les deux protocoles A et B et en présence de matrice extracellulaire.
Pour le protocole A :
Diamètre minimal sur l'axe long=220pm
Diamètre maximal sur l'axe long= 550pm
Diamètre moyen sur l'axe long=415pm
Pour le protocole B :
Diamètre minimal sur l'axe court=200pm
Diamètre maximal sur l'axe court= 385pm
Diamètre moyen sur l'axe court=295pm
Les iPSCs ont d'abord été détachées avec de l'accutase en petits groupes de 3 à 5 cellules et remises en suspension à une concentration de 0,8E6 cellules/ml dans un mix composé à 50% de Matrigel et 50% de milieu mTESRl contenant lOpM d'inhibiteur de Rhock (Y-27632) et encapsulées adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604). Les cellules encapsulées ont été remises en suspension dans un milieu mTESRl contenant lOpM d'inhibiteur Rhock dans une proportion de 0.2 ml de capsule pour 1 ml de milieu total. On a laissé les cellules former des cystes dans les capsules pendant 96h dans des conditions d'agitation, en utilisant un bioréacteur ABLE de 30ml (Reprocell), à 37°C et 5% de CO2 avec un changement de milieu toutes les 24h dans du milieu mTESRl.
La différenciation a été initiée 96h après l'encapsulation en passant au milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 1% de sérum de remplacement KnockOut (KOSR), B27 sans insuline, 100ng/ml Activin A et 3pM CHIR-99021 pendant 2 jours.
Pendant les 3 jours suivants, le milieu a été remplacé par un milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 sans insuline et 100ng/ml Activin A.
Ensuite, pendant les 5 jours suivants, le milieu a été remplacé par un milieu RPMI, contenant pour le protocole A : ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 sans insuline, supplémenté avec 20ng/ml de BMP-4, 5ng/ml de bFGF, lpM de A83-01 (inhibiteur de la voie TGF beta) et 4pM de IWP-2 (inhibiteur de la voie Wnt).
Pour le protocole B : ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 sans insuline, supplémenté avec 20ng/ml de BMP-4 et 5ng/ml de bFGF.Du jour 11 au jour 15, le milieu était composé de milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 2% KOSR, B27 avec insuline, supplémenté avec 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF et 20ng/ml BMP-4.
Au jour 16, le milieu a été changé en milieu HCM sans EGF (Lonza), supplémenté avec 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF, 20ng/ml BMP-4, 20ng/ml Oncostatine M, lOpM Dexamethasone et 1% KOSR.
A partir du jour 20 et pendant les 5 jours suivants, le milieu était composé du milieu HCM plus EGF, supplémenté avec 20ng/ml Oncostatine M, lOpM Dexamethasone et 1% KOSR.
A partir du 25ème jour, le milieu était composé du milieu HCM plus EGF, lOpM Dexamethasone et 1% KOSR.
Analyse de l'expression génique
L'analyse de l'expression génique a été réalisée par RT-Q-PCR.
La qPCR a été réalisée sur un instrument LightCycler® 480 de Roche. L'expression de chaque gène a été normalisée par l'expression des gènes de référence YWHAZ, NONO et VCP. Les données sont exprimées en 2Adelta Ct, où delta Ct=Ct du gène - Ct moyen des gènes de référence.
Les résultats sont présentés à la figure la, lb et le. Ces résultats montrent que le microtissu hépatique selon l'invention peut être obtenu avec tout procédé de différenciation adapté.
Exemple 2 : Différenciation en hépatocytes au sein du microcompartiment selon l'invention versuss en deux dimensions.
L'encapsulation des iPSCs a été effectuée dans des microcapsules d'alginate présentant les caractéristiques ci-dessous :
Diamètre minimal sur l'axe long = 450pm
Diamètre maximal sur l'axe long = 685pm
Diamètre moyen sur l'axe long = 575pm
Diamètre minimal sur l'axe court = 313pm
Diamètre maximal sur l'axe court = 546pm
Diamètre moyen sur l'axe court = 423pm
Pour l'encapsulation des iPSCs dans des microcapsules d'alginate d'environ 575pm de diamètre moyen et en absence de matrice, les iPSCs ont d'abord été détachées avec de l'accutase en petits groupes de 3 à 5 cellules et remises en suspension à une concentration de 10E6 cellules/ml dans un milieu mTESRl contenant lOpM d'inhibiteur de Rhock (Y-27632) et encapsulées adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604). Les cellules encapsulées ont été remises en suspension dans un milieu mTESRl contenant lOpM d'inhibiteur Rhock à 0,5E6 cellules/ml, la proportion de capsules par rapport au milieu ne dépassant pas 20%. On a laissé les cellules former des agglutinats dans les capsules pendant 24h dans des conditions d'agitation, en utilisant un bioréacteur ABLE de 30ml (Reprocell), à 37°C et 5% de CO2.
La différenciation a été initiée 24h après l'encapsulation en passant au milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 1% de sérum de remplacement KnockOut (KOSR), B27 sans insuline, 100ng/ml Activin A et 3pM CHIR-99021 pendant 2 jours.
Pendant les 3 jours suivants, le milieu a été remplacé par un milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 sans insuline et 100ng/ml Activin A.
Ensuite, pendant les 5 jours suivants, le milieu a été remplacé par un milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 1% KOSR, B27 sans insuline, supplémenté avec 20ng/ml de BMP-4 et 5ng/ml de bFGF.Du jour 11 au jour 15, le milieu était composé de milieu RPMI, contenant ImM Ca2+, 2% KOSR, B27 avec insuline, supplémenté avec 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF et 20ng/ml BMP-4.
Au jour 16, le milieu a été changé en milieu HCM sans EGF (Lonza), supplémenté avec 20ng/ml HGF, 3pM CHIR-99021, 5ng/ml bFGF, 20ng/ml BMP-4, 20ng/ml Oncostatine M, lOpM Dexamethasone et 1% KOSR.
A partir du jour 20 et pendant les 5 jours suivants, le milieu était composé du milieu HCM plus EGF, supplémenté avec 20ng/ml Oncostatine M, lOpM Dexamethasone et 1% KOSR.
A partir du 25ème jour, le milieu était composé du milieu HCM plus EGF, lOpM Dexamethasone et 1% KOSR.
Le milieu a été changé quotidiennement du jour 1 au jour 25, et tous les deux jours à partir du jour 25.
Figure imgf000035_0001
Les iPSCs ont été dissociées en cellules individuelles en utilisant l'accutase et placées sur des plaques à 6 puits recouvertes de Matrigel dans un milieu mTESRl contenant lOpM d'inhibiteur de Rhock à une densité de 1x105 cellules/cm2. La différenciation a été initiée 24h après le placage en utilisant le même protocole de différenciation et la même composition de milieu que pour les capsules 3D.
Analyse de l'expression génique
L'analyse de l'expression génique a été réalisée par RT-Q-PCR.
La qPCR a été réalisée sur un instrument LightCycler® 480 de Roche. L'expression de chaque gène a été normalisée par l'expression des gènes de référence YWHAZ, NONO et VCP. Les données sont exprimées en 2Adelta Ct, où delta Ct=Ct du gène - Ct moyen des gènes de référence.
La comparaison de l'expression génique entre les hépatocytes obtenus en deux dimensions versus trois dimensions sont illustrés dans la figure 2 afin de vérifier l'induction de l'endoderme pendant la différenciation. L'expression des gènes EÛMES, CXCR4, FOXA2 et SOX17 montre que la différenciation passe bien par une étape transitoire de différenciation endodermique vers l'endoderme définitif, passage attendu pour générer des cellules hépatiques à partir de cellules pluripotentes.
L'analyse de l'expression protéique des marqueurs de l'endoderme a été réalisée au jours 5 et est représentée à la figure 3. Ces résultats montrent que la différenciation progresse selon une séquence conforme aux attentes de l'homme de l'art c'est-à-dire via l'endoderme définitif et vers le bourgeon hépatique.
Une analyse de l'expression des gènes au cours des protocoles de différenciation est représentée aux figures 4a et 4b. Ces résultats montrent que la différenciation progresse vers une composition cohérente avec la cible de le composition cellulaire du foie, notamment des hépatocytes.
Mesure du taux d'expansion :
Le taux d'expansion est mesuré en faisant le ratio du nombre de cellule comptées au jour X de la culture divisé par le nombre de cellule au départ de la culture (jour de l'encapsulation ou jour de mise en culture). Le taux d'expansion ou facteur d'amplification a été mesuré au cours de la différenciation. Le suivi du taux d'expansion pendant le processus de différenciation est représenté à la figure 5. On retrouve un taux d'expansion d'au moins fois 15, 20 jours après le début de la différenciation. Évaluation de la production d'albumine et d'urée
Pour évaluer la production d'albumine et d'urée, le milieu conditionné a été échantillonné périodiquement 24 heures (±2 h) après le changement de milieu et stocké à -80°C. Les niveaux d'albumine et d'urée sécrétés dans le milieu ont été mesurés à l'aide du kit ELISA pour l'albumine humaine (Invitrogen) et du kit de dosage de l'urée Quantichrom (Gentaur), respectivement, conformément aux instructions du fabricant. La quantité de molécules sécrétées en 24h a ensuite été normalisée par le nombre de cellules selon le comptage effectué après dissociation pour chaque point temporel.
Les résultats sont présentés aux figures 6 et 7. On constate que la sécrétion d'albumine et la production d'urée sont plus importantes dans les microcompartiments selon l'invention.
Mesure de l'activité de la CYP3A4 :
L'activité de Cyp3A4 a été réalisée à l'aide du test P450-Glo™ CYP3A4 avec Luciferin-IPA (Promega) selon les instructions du fabricant. En bref, un échantillon des capsules 3D contenant les microtissus a été décapsulé et le nombre de cellules dans un volume donné de capsules contenant les microtissus a été déterminé. Les microtissus décapsulés correspondant aux cellules 1E5, ou aux cellules 1E5 qui ont été différenciées en 2D, ont été mélangés avec 50pl du substrat proluciférine P450-Glo 3pM dans une plaque à 96 puits à fond rond et incubés pendant 3h à 37°C, 5%CO2. Pour chaque condition, 5 répétitions ont été effectuées, le milieu de culture cellulaire seul et les iPSCs ont été utilisés comme contrôles négatifs. Par la suite, 25 pl du milieu de culture de chaque puits ont été transférés dans une plaque de luminomètre blanche opaque à 96 puits et mélangés avec 25 pl de réactif de détection de la luciférine. La plaque a été incubée pendant 20 minutes à température ambiante et la luminescence a été lue à l'aide du lecteur de microplaques Spectramax i3x (Molecular devices) avec un temps d'intégration de 1 seconde par puits. Le signal net a été calculé en soustrayant les valeurs de luminescence de fond des puits de contrôle sans cellules.
Les résultats sont présentés à la figure 8. On constate une activité de la CYP3A4 significativement plus importante des cellules encapsulées dans le microcompartiment selon l'invention.
Figure imgf000037_0001
selon l'invention
L'objectif de cet exemple est de caractériser la morphologie des cellules au sein du microcompartiment durant la différenciation.
Histologie
Les échantillons de microtissus hépatiques ont été fixés avec une solution de fixation AFA pendant 24h à température ambiante, lavés avec du PBS et pré-emboîtés en histogel. Après déshydratation dans des bains successifs d'éthanol, d'acétone et de xylène, les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et sectionnés au microtome à l'épaisseur de 5pm. Coloration Hématoxyline-Eosine-Safran (HES)
Après élimination de la paraffine, les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline de Harris et de l'éosine G. Après déshydratation, les sections ont été colorées avec du Safran et montées avec de l'Entellan. Le cytoplasme cellulaire est coloré en rose, les noyaux en bleu- violet et la matrice extracellulaire en jaune-rosé.
Coloration PAS (Periodic-Acid-Schiff)
Après élimination de la paraffine, les sections ont été prétraitées avec de l'acide perodique à 1%, suivi d'une coloration successive avec le réactif de Schiff et l'hématoxyline de Mayer. Le glycogène est coloré en rose et les noyaux en bleu-violet.
Les images issues de la coloration sont représentées à la figure 9. On distingue bien la forme cubique caractéristique des hépatocytes ainsi que la présence des granules de glycogène au sein du microcompartiment.
Immunofluorescence sur les microtissus 3D
Les microtissus ont été fixés à l'intérieur des capsules dans une solution de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS avec calcium pendant 1 heure à température ambiante. Après avoir été rincés avec du PBS sans Ca2+ afin d'enlever les capsules, ils ont été perméabilisés dans du Triton X-100 à 1% pendant 30-60 minutes à température ambiante. Les microtissus ont été incubés avec la solution d'anticorps primaire pendant 72h à 4°C sous agitation. Après lavage avec du PBS, ils ont été incubés avec une solution d'anticorps secondaires marqués (Alexa Fluor, Life Technologies) et du DAPI pendant une nuit à 4°C sous agitation et à l'abri de la lumière.
Pour l'imagerie structurelle par phalloïdine-DAPI, la coloration a été faite en conservant les capsules (l'étape de décapsulation avant perméabilisation a été sautée, les lavages ont été faits avec du PBS contenant du calcium). Les microtissus ont été incubés avec le DAPI et la Phal loidi ne pendant 72h à 4°C sous agitation. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été montées sur une lame avec un espacement de 0,5mm. L'acquisition des images a été réalisée sur un microscope confocal (SP5, Leica).
Tableau 1 :
Figure imgf000039_0001
L'évolution de la morphologie du microcompartiment a été réalisé pendant 30 jours au cours de la différenciation. Ces résultats sont représentés aux figure 10a à 10e. On peut observer la présence de structures particulières, telles que la formation d'une structure similaire à un d'un bourgeon hépatique au jours 7 et une organisation cellulaire caractéristique du microtissu hépatique selon l'invention. En effet, on distingue au moins un lumen, au moins une cellule en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu, et au moins une cellule entourée uniquement de cellules. En plus de l'étude de la morphologie, les inventeurs ont pu caractériser la présence d'au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatique au sein du microcompartiment, 30 jours après le début de la différenciation (Figure 11).
Greffe de microtissus selon l'invention et évaluation de la survie cellulaire après transplantation chez la souris comparée à la transplantation d'hépatocytes sous forme de cellules uniques obtenus en 2D
L'objectif de cette étude est d'inoculer à des souris immunocompétentes des hépatocytes dérivés de cellules souches, préparés sous forme de suspension cellulaire ou de microtissus selon l'invention, en vue d'une évaluation de leur survie et fonction in vivo.
Les conditions de l'étude sont décrites ci-dessous :
Animaux :
L'étude a été réalisée sur des souris femelles Balb/cByJ (Mus musculus) âgées de 10 semaines.
Sept (7) animaux ont été hébergés dans l'animalerie La ventilation et le traitement de l'air ont été réalisés par des renouvellements fréquents et la température a été contrôlée autour de 21-22°C. L'humidité a été maintenue autour de 50 %. L'éclairage artificiel a été maintenu 12 heures par jour. La quantité et l'accès à la nourriture (granulés) et à la boisson (eau du robinet) ont été contrôlés quotidiennement. Les cages ont été renouvelées une fois par semaine et l'enrichissement de l'environnement a été fait pour minimiser l'anxiété.
Procédé d'injection :
Au jour 42 de la différenciation hépatique, les cellules générées en 2D (selon l'exemple 2 « Différenciation des hépatocytes en 2D », ont été dissociées en cellules uniques et les microtissus hépatiques générés selon l'invention (selon l'exemple 1) ont été décapsulés.
Suspension de microtissus : des mircotissus selon l'invention obtenus selon l'exemple 1, suspendus dans un milieu de culture, ont été utilisés : environ 3x106 cellules par tube dilué dans 170pL de milieu basal. Avant l'inoculation, 170pL de Matrigel® ont été ajoutés à chaque tube.
Pour pouvoir effectuer l'inoculation sous-cutanée d'un tel volume, c'est-à-dire 340pL, une incision cutanée dans le flanc droit de la souris a été réalisée afin de préparer une poche sous-cutanée. La suspension de microtissus a ensuite été injectée dans cette poche à l'aide d'une pipette avant la fermeture de la plaie avec de la colle chirurgicale pour empêcher la diffusion de la suspension.
Suspension de cellules : des cellules obtenues selon le protocole de l'exemple 2 « Différenciation des hépatocytes en 2D », suspendus dans un milieu de culture, ont été utilisées : environ 3x106 cellules par tube dans 120pL de milieu basal. Avant l'inoculation, 120pL de Matrigel® ont été ajoutés à chaque tube.
Pour pouvoir réaliser l'inoculation sous-cutanée de ce volume de 240pL, une incision cutanée au niveau du flanc droit de la souris a été réalisée afin de préparer une poche sous-cutanée. La suspension cellulaire a ensuite été injectée dans cette poche à l'aide d'une pipette avant de refermer la plaie avec de la colle chirurgicale pour éviter la diffusion de la suspension.
Solution contrôle : une solution de milieu basal (véhicule) de lOOpL a été mélangée à lOOpL de Matrigel®. Cette solution a été injectée par voie sous-cutanée en suivant le même procédé que celui utilisé pour les microtissus et la suspension cellulaire. Prélèvement d'échantillons :
Des échantillons de sang ont été prélevés par saignée rétro-orbitaire pour la préparation du sérum (environ 80pL) sur toutes les souris disponibles :
- Avant l'inoculation des cellules, jour 0, n=7
- Deux jours après l'inoculation, jour 2, n=7
- Six jours après l'inoculation, jour 6, n=3
Les greffons, y compris la peau environnante afin de conserver la structure, ont été prélevés comme suit :
- Deux jours après l'inoculation, jour 2, n=4 o n=2 pour la suspension cellulaire o n=2 pour les microtissus
- Six jours après l'inoculation, jour 6, n=3 o n=l pour la suspension cellulaire o n=l pour les microtissus o n=l pour le véhicule
Les greffons ont été prélevés, fixés, inclus en paraffine, sectionnés et colorés au HES (hématoxyline éosine safran) et avec des anticorps spécifiques pour le marqueur cellulaire humain Steml21 (détecte les protéines cytoplasmiques humaines), les marqueurs cellulaires hépatiques albumine et CytK19 (cytokératine 19).
Avant la transplantation, les microtissus ont également été colorés avec HES, albumine et
CytK19.
Prélèvement d'échantillons :
Les images obtenues par microscopie optique (microscope Leica DM2000) sont présentées sur les figures 12a à 12d :
- 12a :
* greffons unicellulaires au jour 2 (receveurs 1 et 2, ligne du haut) après la transplantation chez des souris Balb/c,
* greffons de micro-tissus au jour 2 (receveurs 4 et 5, ligne du bas) après la transplantation chez des souris Balb/c.
- 12b :
* greffons unicellulaires au jour 6 (receveurs, ligne du haut) après la transplantation chez des souris Balb/c,
* greffons de micro-tissus au jour 6 (receveur 6, ligne du bas) après la transplantation chez des souris Balb/c.
- 12c : tissu au site d'injection avec le véhicule seul (milieu basal contenant 50% de matrigel) sans greffon chez les souris Balb/c.
- 12d : microtissus selon l'invention avant la transplantation.
L'analyse histologique des greffons au jour 2 après la transplantation a révélé la présence de microtissus de forme arrondie positifs pour le marqueur cellulaire humain Steml21 chez les souris transplantées avec les microtissus hépatiques selon l'invention, confirmant que les microtissus détectés sont d'origine humaine. Certaines des cellules composant les microtissus étaient positives pour le marqueur hépatocytaire albumine et certaines cellules, principalement celles situées en périphérie des microtissus, étaient positives pour le marqueur collangiocytaire CytK19. L'organisation cellulaire et la compartimentation des cellules exprimant l'albumine et la CytK19 après la transplantation in vivo étaient similaires à celles observées dans les microtissus avant la transplantation.
Chez les souris transplantées avec des cellules uniques générées en 2D, seules de rares cellules positives pour le marqueur cellulaire humain Steml21, l'albumine et la cytokératine 19 ont été détectées au jour 2 après la transplantation.
La présence de cellules exprimant Steml21 et la CytK19 était encore détectable au jour 6 chez les souris transplantées avec les microtissus, aucune cellule positive pour Steml21 ou la CytK19 n'était présente chez les souris transplantées avec les cellules uniques. Enfin, dans la zone d'infiltration des cellules immunitaires chez la souris transplantée avec le véhicule seul (contrôle), aucune cellule positive à Steml21, albumine ou cytokératine 19 n'a été détectée. Par ailleurs la présence d'AlAT humaine a été analysée dans les sérums de souris Balb/c transplantées (analyses avant la transplantation (jour 0), au jour 2 et au jour 6 après la transplantation). La présence d'AlAT (alpha-1 antitrypsine) humaine a été analysée par ELISA. La sécrétion d'AlAT par les cellules et les microtissus avant la transplantation a également été analysée. Les résultats obtenus sont présentés sur les figures 13a et 13 b :
13a : représentation graphique de la sécrétion d'AlAT avant transplantation de cellules uniques différenciées en 2D (2D) et de microtissus selon l'invention (Invention).
13b : représentation graphique de la détection d'AlT dans le sérum de souris Balb/c avant (jour 0), au jour 2 et au jour 6 après la transplantation avec des cellules uniques différenciées en 2D (SC), avec des microtissus l'invention (MT) et avec le véhicule seul (contrôle).
Ces résultats montrent que les microtissus hépatiques selon l'invention sont capables de sécréter un niveau plus élevé d'AlAT que les cellules différenciées en 2D. Conformément à l'observation histologique, la concentration d'AlAT humaine est plus élevée dans le sérum des souris transplantées avec les microtissus selon l'invention que dans celui des souris transplantées avec des cellules uniques. La concentration d'AlAT humaine est plus faible, voire indétectable, au jour 0. Elle est plus élevée au jour 2 après la transplantation et diminue au jour 6 tout en étant toujours importante et supérieure à celle des cellules uniques différenciées en 2D. Ces données sont cohérentes avec les résultats histologiques et montrent que les microtissus selon l'invention persistent dans le temps et sont plus fonctionnels après la transplantation que les cellules uniques différenciées en 2D, même dans un modèle de souris immunocompétente. Dans l'ensemble, ces résultats montrent que les microtissus hépatiques selon l'invention et greffés en tant qu'objets 3D survivent après la greffe chez des souris immunocompétentes, et ont une survie meilleure et plus longue après la greffe que les cellules hépatiques générées en 2D et greffées en tant que suspension cellulaire unique.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Microtissu hépatique en trois dimensions, dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700 pm, exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d'au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18pg d'urée par million de cellules par 24 heures.
[Revendication 2] Microtissu hépatique selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu'il comprend entre 50 et 99% de cellules hépatiques.
[Revendication 3] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites
[Revendication 4] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
[Revendication 5] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules hépatiques sécrètent au moins 75pg d'albumine par million de cellules par 24h.
[Revendication 6] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites et en ce que les cellules hépatiques sécrètent au moins 75pg d'albumine par million de cellules par 24h au moins 20 jours après le début de la différenciation.
[Revendication 7] Microtissu hépatique en trois dimensions selon l'une des précédentes revendications, comprenant au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques, caractérisé en ce que toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
[Revendication 8] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microtissu hépatique comprend des hépatocytes immatures, des hépatocytes matures et des cholangiocytes.
[Revendication 9] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microtissu hépatique comprend au moins : - des hépatocytes immatures caractérisés par l'expression d'alpha-foetoprotéine et d'albumine et l'absence d'expression de cytokératine 19,
- des hépatocytes matures caractérisés par l'expression d'albumine et l'absence d'expression d'alphafoetoprotéine et de cytokératine 19, et
-des cholangiocytes caractérisés par l'expression de cytokératine et l'absence d'expression d'albumine et d'alphafoetoprotéine.
[Revendication 10] Microtissu selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microtissu hépatique comprend des cellules exprimant CD73 et CD90.
[Revendication 11] Microtissu hépatique selon la précédente revendication, caractérisée en ce que les cellules exprimant CD73 et CD90 sont des cellules souches mésenchymateuses.
[Revendication 12] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce le microtissu hépatique comprend au moins des cellules hépatiques dont entre 20 et 60% des cellules des cellules hépatiques sont des cellules exprimant la cytokératine 19.
[Revendication 13] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues à partir de la différenciation d'au moins un cyste de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions.
[Revendication 14] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, comprenant :
- au moins un lumen,
- au moins une cellule en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu, et
- au moins une cellule entourée uniquement de cellules.
[Revendication 15] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il présente une forme ellipsoïdale.
[Revendication 16] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules hépatiques sont polarisées.
[Revendication 17] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend entre 50 % et 99 % de cellules hépatiques dont entre 20 % et 60 % des cellules hépatiques sont des cellules exprimant la cytokératine 19, et entre 1 % et 20 % de cellules exprimant CD73 et CD90.
[Revendication 18] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il présente un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 100 pm et 300 pm.
[Revendication 19] Microtissu hépatique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une plus grande dimension comprise entre 500 pm et 700 pm.
[Revendication 20] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend entre 300 et 14000 cellules.
[Revendication 21] Microtissu hépatique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un canal biliaire.
[Revendication 22] Microtissu hépatique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un granule de glycogène.
[Revendication 23] Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules hépatiques sont choisies parmi les hépatocytes matures, les hépatocytes immatures, les hépatoblastes, les cholangiocytes et leurs mélanges.
[Revendication 24] Microcompartiment clos en trois dimensions, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins un microtissu hépatique selon l'une des revendications 1 à 23.
[Revendication 25] Microcompartiment cellulaire selon la revendication 24, caractérisé en ce que le microcompartiment est obtenu 20 jours après l'encapsulation de 1 à 200 cellules souches pluripotentes induites dans la partie interne définie par la couche externe en hydrogel.
[Revendication 26] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisé en ce qu'il présente un taux d'expansion d'au moins fois 15, 20 jours après le début de la différenciation.
[Revendication 27] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce que l'épaisseur de la couche externe est variable et comprise entre 20 et 60um.
[Revendication 28] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l'alginate.
[Revendication 29] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 28, caractérisé en ce qu'il comprend des éléments de matrice extracellulaire ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse dans la partie interne entre la couche externe et le microtissu hépatique.
[Revendication 30] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 29, caractérisé en ce qu'il présente un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 300 pm et 400pm.
[Revendication 31] Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 30, caractérisé en ce qu'il présente une plus grande dimension comprise entre 400 pm et 600pm.
[Revendication 32] Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31.
[Revendication 33] Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur.
[Revendication 34] Microtissu selon l'une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31 pour son utilisation comme médicament.
[Revendication 35] Microtissu selon l'une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de symptômes associés à une insuffisance hépatique.
[Revendication 36] Microtissu ou microcompartiment pour une utilisation selon la revendication 35, dans lequel l'insuffisance hépatique est une insuffisance hépatique aiguë, chronique ou aiguë-sur-chronique.
[Revendication 37] Microtissu selon l'une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention de maladies métaboliques du foie.
[Revendication 38] Microtissu selon l'une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention de la fibrose et la cirrhose hépatiques, la stéatose, la stéatose non alcoolique, les hépatites les maladies liées à une sécrétion de facteur VIII et facteur IX et VWF, la maladie de Wilson, l'hémochromatose héréditaire.
[Revendication 39] Procédé de préparation d'un microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31, comprenant les étapes consistant à :
- a) produire un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos comprenant, à l'intérieur d'une couche externe en hydrogel, des cellules souches pluripotentes induites, et éventuellement des éléments de matrice extracellulaire ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse,
- b) induire une différenciation cellulaire au sein du microcompartiment cellulaire, de manière à obtenir un microcompartiment comprenant des cellules hépatiques.
[Revendication 40] Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que le procédé de différenciation cellulaire de l'étape b) dure au moins 20 jours
Procédé selon l'une des revendications 39 à 40, caractérisé qu'à l'étape a) entre 40 et 150 cellules souches pluripotentes induites sont présentes dans le microcompartiment.
Procédé de préparation d'un microtissu hépatique selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend : - mettre en œuvre un procédé de préparation d'un microcompartiment selon l'une des revendications 24 à 31,
- éliminer la couche externe d'hydrogel pour récupérer le microtissu hépatique.
PCT/EP2023/062012 2022-05-06 2023-05-05 Microtissu hepatique particulier en trois dimensions et utilisations dans le traitement de l'insuffisance hepathique WO2023214055A1 (fr)

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