EP4214305A1 - Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules humaines en cours de differenciation cardiaque, tissus obtenus a partir de ces microcompartiments et utilisations - Google Patents

Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules humaines en cours de differenciation cardiaque, tissus obtenus a partir de ces microcompartiments et utilisations

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EP4214305A1
EP4214305A1 EP21786099.8A EP21786099A EP4214305A1 EP 4214305 A1 EP4214305 A1 EP 4214305A1 EP 21786099 A EP21786099 A EP 21786099A EP 4214305 A1 EP4214305 A1 EP 4214305A1
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EP
European Patent Office
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cells
cardiac
tissue
compacted
human
Prior art date
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Pending
Application number
EP21786099.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Maxime FEYEUX
Andrea Beth LEONARD
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Treefrog Therapeutics SAS
Original Assignee
Treefrog Therapeutics SAS
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate

Definitions

  • the invention relates to the treatment of cardiac diseases, in particular ischemic heart diseases, by the use of specific cardiac tissues obtained from particular cellular microcompartments comprising human cells expressing genes expressed during cardiac differentiation.
  • cardiovascular disease and in particular ischemic heart disease (which usually leads to myocardial infarction), is the leading cause of death worldwide (Thomas, H. et al. Global Atlas of Cardiovascular Disease 2000-2016: The Path to Prevention and Control.Glob.Heart 13, 143-163 (2016)).
  • hPSC-CMs human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • hPSC-CMs human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
  • hPSC-CMs human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells
  • cardiomyocytes can be used for other applications, in particular as biological pacemakers for the treatment of sinus node dysfunction (Lee, JH, Protze, SI, Laksman, Z., Backx, PH & Keller, GM Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell 21, 179-194. e4 (2017)), or to treat congenital heart disease, such as septal anomalies (Devalla, HD & Passier, R. Cardiac differentiation of pluripotent stem cells and implications for modeling the heart in health and disease . Sc/. Transi. Med.
  • cardiomyocytes derived from hPSC-CM in cardiac cell therapy currently impossible on a suitable clinical scale.
  • production on an industrial scale of cardiac tissues is complex because it is necessary to achieve a compromise between sufficiently mild culture conditions for the survival and proper functioning of the tissues and the constraints of large-volume cultures which inevitably expose the cells to non-physiological stresses (typically hydrodynamic stress in the context of liquid culture in bioreactors).
  • the methods for producing cardiomyocytes from hPSCs in particular present the following problems:
  • micro-supports still leave the cells exposed to mechanical stresses and which can be difficult to remove
  • the object of the invention is therefore to meet all of these needs and to overcome the drawbacks and limitations of the prior art.
  • the invention proposes to go through a key developmental intermediate to obtain compacted tissues of human cardiac cells with particular characteristics and in large quantities, suitable for uses in cell therapy.
  • the subject of the invention is a cellular microcompartment in three dimensions (3D) successively comprising, organized around at least one lumen:
  • At least one inner layer of human cells in the process of cell differentiation into cardiac cells expressing at least one gene chosen from PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 and TBX5, said inner layer having a variable thickness;
  • the inner layer of human cells and the lumen(s) together form a three-dimensional cellular object. If we measure the smallest and the largest thickness of the inner layer of cells along a segment passing through the geometric center of this cellular object, the ratio between the largest thickness and the smallest thickness is greater than or equal to 2.
  • the inner layer thicknesses are measured along the segment passing through the geometric center of the cellular object:
  • the invention therefore specifically relates to a cellular microcompartment successively comprising, organized around at least one lumen:
  • At least one inner layer of human cells in the process of cell differentiation into cardiac cells expressing at least one gene chosen from PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 and TBX5, said inner layer having a variable thickness, the ratio between the largest thickness and the smallest thickness of the internal layer being greater than or equal to 2, the smallest thickness and the largest thickness of the internal layer being the smallest and the largest of the thicknesses of inner layer measured along a segment passing through the geometric center of the cellular object formed by the inner layer and the lumen(s), between the interface of the inner layer and the intermediate layer and the interface of the inner layer and a lumen, and/or between the interface of the inner layer and a lumen and the interface of the inner layer and another lumen,
  • the microcompartment according to the invention therefore comprises cells undergoing cell differentiation, the expression of the PDGFRa/MESP1/NKX2-5/GATA4/MEF2C/TBX20/ISL1/TBX5 genes being associated with intermediate stages of cardiac differentiation.
  • Such a configuration one or more lumens around which are successively organized a layer of human cells undergoing cardiac differentiation with specific thickness characteristics, a layer of isotonic aqueous solution and at least one hydrogel layer) is new.
  • an outer layer of hydrogel and an intermediate layer of isotonic aqueous solution allows a uniform distribution of cells between the microcompartments.
  • the homogeneity between the microcompartments is greatly improved by the prior encapsulation of the hPSCs allowing increased yield and quality compared to existing methods.
  • this layer of hydrogel makes it possible to avoid fusions of microcompartments which are a major source of unfavorable variability for the phenotypic homogeneity and the survival of the cardiac cells produced in the bioreactor.
  • modulation of the WNT pathway used in cardiac differentiation is associated with p-catenin degradation (Lam, ATL et al. Conjoint propagation and differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a defined microcarrier spinner culture. Stem Cell Res. Ther. 5, 1-15 (2014)), a molecule that plays a role in cell-cell adhesion complexes (Brembeck, FH, Rosârio, M. & Birchmeier, W. Balancing cell adhesion and Wnt signaling , the key role of p-catenin. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 51-59 (2006)).
  • the topology of the microcompartment according to the invention makes it possible to protect the cells undergoing cardiac differentiation, despite the fragility of the cell-cell adhesion induced by the modulation of the WNT pathway.
  • the microcompartments according to the invention can be used to obtain compacted tissues of specific differentiated human cardiac cells.
  • a subject of the invention is therefore also the use of a cell microcompartment according to the invention, to obtain a tissue of cardiac cells expressing cardiac troponin C and preferably also alpha-actinin.
  • the invention therefore also relates to compacted cardiac tissues.
  • the subject of the invention is a compacted tissue of cardiac human cells expressing cardiac troponin C (that is to say human cells expressing the gene for cardiac troponin C, the alias of the corresponding gene being TNNC1), obtained from from at least one cellular microcompartment as previously described, by a process comprising the compaction of the internal layer of human cells by total or partial disappearance of the light(s).
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention has a rate of cells expressing cardiac troponin C of at least 50% in number relative to the total number of cells constituting the compacted tissue, even more preferably of at least 60 %, at least 70%, at least 75%, at least 80%, and this rate may be greater than 90%.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention has a level of cells expressing alpha-actinin of at least 50% in number relative to the total number of cells constituting the compacted tissue, even more preferably of at least least least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, and this rate may be greater than 90%.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention has a rate of cells expressing troponin C and alpha-actinin of at least 50% in number relative to the total number of cells constituting the compacted tissue, even more preferably at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, and this rate may be greater than 90%.
  • the cardiac tissues according to the invention obtained by a specific process different from those of the prior art, makes it possible to obtain cardiac tissues with a rate of cells expressing cardiac troponin C and/or alpha-actinin of at least 50%, and preferably at least 75%.
  • the configuration according to the invention during differentiation allows the transmission of auto/paracrine signals within a protected lumen which allows the cells to self-organize in a biomimetic way of the in vivo structuring.
  • This structuring is extremely fragile and requires both mechanical protection and available space, contrary to what is described in Koivisto Janne T. et al. According to the invention, this configuration cannot be implemented either in a confined system or in an unprotected system.
  • the invention proposes a controlled structuring of the environment in the form of a protected self-organization, which allows less sensitivity to small variations in the culture system and therefore greater reproducibility.
  • the heart tissues according to the invention can be used to regenerate ischemic heart tissue. Also, the invention relates to said tissues for their use in the prevention and/or treatment of pathologies, in particular cardiac pathologies.
  • FIG. la is a schematic representation of a sectional view of a cell microcompartment 10 according to the invention, corresponding to the photo represented in figure lb, with an outer layer of hydrogel 12, a layer of isotonic aqueous solution 14, a layer of human cells undergoing cardiac differentiation 16 with greater thickness t2 and a smaller thickness tl, and an internal lumen 18.
  • Figure lb is a phase contrast microscopy image of a microcompartment according to the invention taken at 4x magnification which corresponds to the schematic diagram of Figure la.
  • FIG. 2a is a schematic representation of a sectional view of a cell microcompartment 10 according to the invention, corresponding to the photo shown in Figure 2b, with an outer layer of hydrogel 12, a layer of isotonic aqueous solution 14, a layer of human cells undergoing cardiac differentiation 16 with a greater thickness t2 and a lesser thickness t1, and two internal lumens 18-1 and 18-2, SI representing the thickness of the layer of aqueous solution isotonic 14.
  • Figure 2b is a phase contrast microscopy image of a microcompartment according to the invention taken at 4x magnification which corresponds to the schematic diagram of Figure 2a.
  • FIG. 2c is a phase contrast microscopy image of several microcompartments according to the invention, taken at 4x magnification, each microcompartment with different morphologies.
  • FIG. 3a is a schematic representation of a sectional view of a cell microcompartment 10 according to the invention, corresponding to the photograph shown in Figure 3b, with an outer layer of hydrogel 12, a layer of isotonic aqueous solution 14, a layer of human cells undergoing cardiac differentiation 16 with a greater thickness t2 and a lesser thickness t1, and two internal lumens 18-1 and 18-1, si representing the thickness of the layer of aqueous solution isotonic 14.
  • Figure 3b is a phase contrast microscopy image of a microcompartment according to the invention taken at 4x magnification which corresponds to the schematic diagram of Figure 3a.
  • Figure 4a is a schematic representation of a sectional view of a compacted tissue according to the invention, corresponding to the photo shown in Figure 4b, with an outer layer of hydrogel 12, a layer of isotonic aqueous solution 14, a compacted tissue of differentiated cardiac cells 20.
  • Figure 4b is a microscopy image at phase contrast of a tissue compacted according to the invention in a microcompartment, taken at a 4x magnification which corresponds to the schematic diagram of Figure 4a.
  • FIG. 4c represents phase contrast microscopy images taken at 4x magnification of tissues compacted according to the invention in microcompartments.
  • phase contrast microscopy images taken at 4x magnification.
  • the image on the left shows the differentiated compacted cardiac tissues in the capsule from encapsulated hiPSCs.
  • the image on the right shows the cells obtained by dissociation of cardiac tissues compacted according to the invention.
  • the three images in the top row (a, b and c) are images of encapsulated cells.
  • the three baseline images (d, e, and f) are images of unencapsulated cells.
  • the images in the left column (a and d) represent stem cells induced at the start of differentiation into cardiac cells.
  • the images in the middle column (b and e) represent human cells in the process of cellular differentiation into cardiac cells, 3 to 7 days after the initiation of differentiation.
  • the images in the right column (c and f) represent differentiated cardiac tissues.
  • FIG 8 is a graph which represents the percentage of cells in the tissues (obtained as in Figure 7c and 7f) expressing cardiac troponin C: on the left encapsulated tissues according to the invention (image 7c), on the right tissues not encapsulated (image 7f).
  • FIG. 9 is a graph which represents the rate of cellular amplification between the start of differentiation (obtained as in Figure 7a and 7d) in the tissues: on the left according to the invention encapsulated, on the right not encapsulated.
  • alginate within the meaning of the invention is meant linear polysaccharides formed from ⁇ -D-mannuronate and ⁇ -L-guluronate, salts and derivatives thereof.
  • hydrogel capsule within the meaning of the invention, is meant a three-dimensional structure formed from a matrix of polymer chains, swollen with a liquid and preferably water.
  • cell “expressing a gene” within the meaning of the invention is meant a cell which contains at least 5 times more copies of the RNA transcribed from the DNA sequence of the gene concerned in comparison with a pluripotent cell , preferentially 10 times more copies, preferentially 20 times more copies, preferentially 100 times more copies.
  • human cells within the meaning of the invention is meant human cells or immunologically humanized non-human mammalian cells. Even when this is not specified, the cells, stem cells, progenitor cells and tissues according to the invention consist of or are obtained from human cells or from immunologically humanized non-human mammalian cells.
  • progenitor cell within the meaning of the invention, is meant a stem cell already committed in cell differentiation into cardiac but not yet differentiated cells.
  • embryonic stem cell within the meaning of the invention is meant a pluripotent stem cell of a cell derived from the internal cell mass of the blastocyst.
  • the pluripotency of embryonic stem cells can be assessed by the presence of markers such as the transcription factors OCT4, NANOG and SOX2 and surface markers such as SSEA3/4, Tra-1-60 and Tra-1-81.
  • the embryonic stem cells used in the context of the invention are obtained without destroying the embryo from which they originate, for example using the technique described in Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)): 113-117).
  • human embryonic stem cells can be excluded.
  • pluripotent stem cell or “pluripotent cell” within the meaning of the invention, is meant a cell which has the capacity to form all the tissues present in the entire organism of origin, without however being able to form an entire organism by as such.
  • Human pluripotent stem cells may be referred to herein as hPSCs. They may in particular be induced pluripotent stem cells (iPSC or hiPSC for human induced pluripotent stem cells), embryonic stem cells or MUSE cells (for “Multilineage-differentiating Stress Enduring”).
  • induced pluripotent stem cell within the meaning of the invention is meant a pluripotent stem cell induced to pluripotency by genetic reprogramming of differentiated somatic cells. These cells are notably positive for pluripotency markers, such as alkaline phosphatase staining and expression of NANOG, SOX2, OCT4 and SSEA3/4 proteins. Examples of methods for obtaining induced pluripotent stem cells are described in the articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5): 861-872) and Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106) .
  • differentiated cardiac cells within the meaning of the invention is meant cells which exhibit the phenotype of a cardiomyocyte, that is to say expressing specific markers such as TNNC1 (cardiac troponin C gene) and ACTN2 ( alpha actinin gene) and capable of contracting spontaneously in response to an intracellular calcium signal spontaneously (in the case of immature cardiac cells) or following an electrical or chemical stimulation capable of triggering said calcium signal.
  • TNNC1 cardiac troponin C gene
  • ACTN2 alpha actinin gene
  • Fiber diameter of a compacted cardiac tissue according to the invention or of a microcompartment according to the invention is meant the distance “d” comprised between two tangents to said compacted tissue or to said microcompartment, these two tangents being parallel, such that the entire projection of said compacted tissue or of said microcompartment lies between these two parallel tangents.
  • variable thickness of the inner layer of human cells in the process of cell differentiation is meant within the meaning of the invention the fact that the inner layer in the same microcompartment does not have the same thickness everywhere.
  • implantation or “graft” in the heart within the meaning of the invention, is meant the action of depositing at the level of the heart at a particular location at least one compacted tissue according to the invention.
  • the implantation can be carried out by any means, in particular by injection.
  • microcompartment or “capsule” within the meaning of the invention, is meant a partially or completely closed three-dimensional structure, containing at least one cell.
  • ⁇ culture medium within the meaning of the invention is meant a culture medium animated by internal movements.
  • largest dimension of a compacted cardiac tissue according to the invention or of a microcompartment according to the invention within the meaning of the invention is meant the value of the largest Feret diameter of said compacted tissue or of said microcompartment.
  • smallest dimension of a compacted cardiac tissue according to the invention or of a microcompartment according to the invention within the meaning of the invention is meant the value of the smallest Feret diameter of said compacted tissue or of said microcompartment.
  • tissue or “biological tissue” within the meaning of the invention, is meant the common sense of tissue in biology, that is to say the intermediate level of organization between the cell and the organ.
  • a tissue is a set of similar cells of the same origin (usually derived from a common cell lineage, although they may find their origin by association of distinct cell lineages)., grouped into clusters, networks or bundles (fiber ).
  • a fabric forms a functional whole, that is to say that its cells contribute to the same function.
  • Biological tissues regenerate regularly and are assembled together to form organs.
  • tissue or “compacted cardiac tissue” or “compacted tissue of cardiac cells” within the meaning of the invention, is meant a unit of tissue comprising at least one cardiac tissue consisting at least of differentiated cardiac cells.
  • the tissue is at least partially compacted, that is to say it is composed mainly of cells, in particular its volume is composed of more than 50% cells, preferentially 75% cells, preferentially 90% cells.
  • the tissue may be completely compacted, ie the lights are no longer detectable and/or there is no light.
  • the tissues compacted according to the invention can be called microtissues.
  • light or “lumen” within the meaning of the invention, is meant a volume of aqueous solution topologically surrounded by cells. Preferably, its content is not in diffusive equilibrium with the volume of convective liquid present outside the microcompartment. cellular
  • the invention therefore relates to a cellular microcompartment successively comprising, organized around at least one lumen:
  • At least one inner layer of human cells in the process of cell differentiation into cardiac cells expressing at least one gene chosen from PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 and TBX5 (known as the "inner layer” ),
  • intermediate layer at least one intermediate layer of isotonic aqueous solution
  • outer layer at least one outer layer of hydrogel (called “outer layer”.
  • the microcompartment according to the invention is a three-dimensional structure therefore comprising at least one internal layer of cells. These cells are living human cells undergoing cell differentiation into cardiac cells. This layer of cells is organized in three dimensions in the microcompartment.
  • the human cells undergoing cardiac differentiation present in the microcompartment are cells expressing at least one gene chosen from PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 and TBX5. These genes are specific to cardiac cells in the process of differentiation.
  • the human cells in the process of cardiac differentiation present in the microcompartment express at least two of these genes.
  • human differentiating cardiac cells present in the microcompartment express all of these genes.
  • the inner layer of human cells in the process of cellular differentiation into cardiac cells has a variable thickness.
  • the inner layer of human cells and the lumen(s) together form a three-dimensional cellular object. If one measures the smallest and the largest thickness of the inner layer of cells along a segment passing through the geometric center of this cellular object (shown 22 in Figures 1a, 2a and 3a), the ratio between the largest greatest thickness and the smallest thickness is greater than or equal to 2, preferably greater than or equal to 5.
  • the inner layer thicknesses are measured along the segment passing through the geometric center of the cellular object:
  • Figures 1, 2 and 3 represent examples of cellular microcompartments 10 according to the invention, with an outer layer of hydrogel 12, a layer of isotonic aqueous solution 14, one or more internal lumen(s) 18, 18 -1, 18-2, a layer of human cells in the process of cardiac differentiation 16 with a greater thickness t2 and a lesser thickness t1 (the thicknesses being measured along a segment 22 passing through the geometric center of this object cell formed by the layer 16 and the lumen(s) 18, 18-1, 18-2), the ratio t2/tl being well above 2.
  • the number of human cells in the process of cell differentiation into cardiac cells of the inner layer is preferably between 1 and 100,000 cells, even more preferably between 50 and 50,000 cells, and in particular between 500 and 25,000 cells.
  • Human cells in the process of cell differentiation into cardiac cells of the inner layer have preferentially been obtained from pluripotent stem cells, in particular from human pluripotent stem cells, or possibly from non-pluripotent human cells whose transcriptional profile has been modified. artificially to join that of cardiac progenitors or cardiac cells, typically by forced expression of transcription factors specific for the target cell phenotype.
  • the human cells of the inner layer have been obtained from human pluripotent stem cells after contacting with a solution capable of initiating the differentiation of said stem cells.
  • the intermediate layer of isotonic aqueous solution preferably contains peptide or peptidomimetic sequences capable of binding to integrins.
  • isotonic aqueous solution is meant an aqueous solution having an osmolarity of between 200 and 400 mOsm/L. This layer is located between the inner cell layer and the outer hydrogel layer.
  • the intermediate layer may consist of elements which have been added during the manufacture of the microcompartment and/or of elements added in the microcompartment and/or of elements secreted or induced by the other constituents of the microcompartment.
  • the intermediate layer may in particular comprise or consist of an extracellular matrix and/or a culture medium. If it comprises extracellular matrix, it may be extracellular matrix secreted by cells of the inner layer and/or by extracellular matrix added at the time of preparation/manufacture of the microcompartment.
  • the intermediate layer preferably comprises a mixture of proteins and extracellular compounds necessary for the culture of cells undergoing cardiac differentiation.
  • the intermediate layer comprises structural proteins, such as collagen, laminins, entactin, vitronectin, as well as growth factors, such as TGF-beta and/or EGF.
  • the intermediate layer can consist of or comprise Matrigel® and/or Geltrex® and/or a hydrogel type matrix of vegetable origin such as modified alginates or of synthetic origin or of poly(N- isopropylacrylamide) and poly(ethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) of the Mebiol® type.
  • the intermediate layer can form a gel.
  • the intermediate layer may optionally contain one or more cells.
  • the thickness of the intermediate layer (represented if in FIGS. 1 and 2) is preferably between 30 nm and 300 ⁇ m, even more preferably between 30 nm and 50 ⁇ m.
  • the presence of the intermediate layer promotes the structuring according to the invention of the elements in the microcompartment.
  • the microcompartment and the inner layer of cells within the microcompartment according to the invention are hollow.
  • the microcompartment according to the invention indeed always comprises at least one internal light or lumen which constitutes the hollow part of the microcompartment.
  • the lumen contains a liquid, in particular a culture medium (such as for example a RPMI basal medium with a B27 supplement) and/or a fluid secreted by the cells of the inner layer.
  • a culture medium such as for example a RPMI basal medium with a B27 supplement
  • a fluid secreted by the cells of the inner layer a fluid secreted by the cells of the inner layer.
  • the presence of this hollow part allows the cells to have a small diffusive volume whose composition they can control, promoting so-called autocrine/paracrine cellular communication which is in turn favorable to cardiac differentiation.
  • the microcompartment according to the invention can comprise several lights, at least two lights.
  • This situation has the same advantage vis-à-vis autocrine and paracrine signals as the presence of a single lumen and increases the cells' ability to control the composition of the aqueous solution of the lumen because the cell to volume/cell ratio is then geometrically weaker.
  • the stabilization of such a configuration demonstrates the mechanical protection offered by the microcompartment.
  • the slot(s) preferably represent(s) between 10% and 90% of the volume of the microcompartment according to the invention.
  • the microcompartment includes an outer hydrogel layer.
  • the hydrogel used is biocompatible, that is to say it is not toxic to the cells.
  • the hydrogel layer must allow the diffusion of oxygen and nutrients to supply the cells contained in the microcompartment and allow their survival.
  • the outer layer of hydrogel comprises at least alginate. It may consist exclusively of alginate.
  • the alginate may in particular be a sodium alginate, composed of 80% a-L-guluronate and 20%
  • the hydrogel layer makes it possible to protect the cells from the external environment, to limit the uncontrolled proliferation of the cells, and their controlled differentiation into cells in the process of cardiac differentiation then into cardiac cells, at least into cardiomyocytes.
  • the outer layer is closed or partially closed.
  • the microcompartment is therefore closed or partially closed.
  • the microcompartment is closed.
  • the microcompartment according to the invention can be in any three-dimensional form, that is to say it can have the shape of any object in space.
  • the microcompartment according to the invention is in a spherical or elongated shape. He can in particular be in the form of a hollow spheroid, a hollow ovoid, a hollow cylinder or a hollow sphere.
  • the external layer of the microcompartment that is to say the hydrogel layer, which gives its size and its shape to the microcompartment according to the invention.
  • the diameter of the smallest dimension of the microcompartment according to the invention is between 10 ⁇ m and
  • mm preferably between 100 ⁇ m and 700 ⁇ m. It may be between 10 ⁇ m and 600 ⁇ m, in particular between 10 ⁇ m and 500 ⁇ m.
  • This smaller dimension is important for the survival of the three-dimensional cardiac tissue which will be obtained from the microcompartment according to the invention, in particular to promote the survival of the cardiac cells within the cardiac tissue and to optimize the reorganization as well as the vascularization of the cardiac tissue after implantation in the heart.
  • Its largest dimension is preferably greater than 10 ⁇ m, more preferably between 10 ⁇ m and 1 m, even more preferably between 10 ⁇ m and 50 cm. According to one embodiment, the largest dimension is compatible with the size of the organ and is therefore less than 30 cm (between 10 ⁇ m and 30 cm).
  • the microcompartment according to the invention is particularly useful for obtaining a three-dimensional compacted cardiac tissue, consisting of differentiated human cardiac cells.
  • microcompartment according to the invention can optionally be frozen in order to be stored.
  • the invention also relates to several microcompartments together. Also the invention also relates to a series of cellular microcompartments as described previously comprising at least two cellular microcompartments according to the invention.
  • the series of microcompartments according to the invention is in a culture medium, in particular in an at least partially convective culture medium.
  • the subject of the invention is a series of cellular microcompartments as described above in a closed enclosure, such as a bioreactor, preferably in a culture medium in a closed enclosure, such as a bioreactor .
  • the invention also relates to a process for preparing a microcompartment according to the invention.
  • the method consists in producing cellular microcompartments comprising a hydrogel capsule surrounding:
  • - differentiated cells intended to undergo in the capsule a reprogramming in the capsule so that they become induced pluripotent stem cells capable of differentiating into cardiac cells, at least into cardiomyocytes.
  • the process for preparing a microcompartment according to the invention may comprise at least the implementation of the steps which consist of:
  • the total or partial encapsulation in the hydrogel and the contribution of extracellular matrix combined is a means adapted to allow the differentiation of human pluripotent cells towards the cardiac muscle by accumulating several advantages, in particular: favoring a homogeneous distribution of the cells of the lot within the microcompartments, ii) mechanical protection against hydrodynamic stress inflicted by the bioreactor and limitation of unwanted fusions of microcompartments, iii) organization of a microenvironment locally conserving the extracellular matrix elements promoting good cell survival and organization, iv) maintenance a lumen promoting autocrine and paracrine pathways during differentiation.
  • any process for the production of cellular microcompartments containing inside a hydrogel capsule at least human cells in the process of cardiac differentiation and an isotonic aqueous solution and possibly the addition of other cells, for example of support can be used.
  • a suitable method is in particular described in application WO2018/096277.
  • the encapsulation is carried out by co-injection of three solutions:
  • an isotonic intermediate solution such as for example a sorbitol solution
  • a solution comprising the cells to be encapsulated, culture medium and optionally but preferably extracellular matrix, concentrically via a microfluidic injector which makes it possible to form a jet at the injector outlet consisting of the mixture of the three solutions, said jet fractionating into drops, said drops being collected in a calcium bath which stiffens the hydrogel solution to form the outer layer of each microcompartment, the inner part of each drop being constituted by the solution comprising the encapsulated cells, culture medium and the extracellular matrix.
  • the encapsulation is carried out with a device capable of generating hydrogel capsules using a microfluidic chip.
  • the device can comprise syringe pumps for several solutions injected concentrically using a microfluidic injector which makes it possible to form a jet which splits into drops then collected in a calcium bath.
  • three solutions are loaded onto three syringe pumps: - a hydrogel solution, for example alginate,
  • an isotonic intermediate solution such as for example a sorbitol solution
  • step b) the solution resulting from step b) comprising iPSCs, culture medium and optionally but preferably extracellular matrix.
  • the three solutions are co-injected (injected simultaneously) in a concentric manner thanks to a microfluidic injector or microfluidic chip which makes it possible to form a jet which splits into drops whose outer layer is the hydrogel solution and the heart of the solution comprising the cells to be encapsulated; These drops are collected in a calcium bath which stiffens the alginate solution to form the shell.
  • the hydrogel solution is charged with a direct current.
  • a grounded ring is placed after the tip in the plane perpendicular to the axis of the jet emerging from the microfluidic injector (coextrusion chip) to generate the electric field.
  • the step of producing a cellular microcompartment of the preparation process according to the invention comprises the steps consisting in:
  • a culture medium preferably a culture medium containing the growth factors FGF2 and TGF or molecules reproducing its action on the cell, an inhibitor of the Rho kinase pathway or a molecule reproducing its action on the cell, in particular by limiting cell death.
  • pluripotent stem cells optionally mixing the pluripotent stem cells with an isotonic aqueous solution, preferably an extracellular matrix,
  • the encapsulated cells for the preparation of microcompartments according to the invention are preferably chosen from:
  • stem cells capable of differentiating into cardiac cells, at least into cardiomyocytes preferentially embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, very preferentially induced pluripotent stem cells, and/or, * either progenitor cells capable of differentiating into cardiac cells, at least into cardiomyocytes,
  • - and/or differentiated cells capable of undergoing reprogramming so that they become induced pluripotent stem cells capable of differentiating into cardiac cells, at least into cardiomyocytes.
  • the encapsulated cells can be immuno-compatible with the person intended to receive the differentiated cardiac cells obtained from the microcompartment according to the invention, to avoid any risk of rejection.
  • the encapsulated cells have been taken beforehand from the person in whom the compacted cardiac tissues obtained from the microcompartments according to the invention will be implanted.
  • the differentiation into cells undergoing cardiac differentiation contained in the microcompartment according to the invention can be carried out by any suitable method. This may include a method known as one of the protocols listed in (Dunn, KK & Palecek, SP Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Front. Med. 5, (2018)).
  • the step of inducing cell differentiation of the method according to the invention comprises a step consisting in introducing capsules containing human stem cells capable of being differentiated into human cardiac cells, in a medium of culture containing a WNT pathway activator (such as CHIR99021) for 12 to 72 hours, more preferably 12 to 48 hours.
  • a WNT pathway activator such as CHIR99021
  • the method may comprise a step which consists in incubating the microcompartments in a culture medium containing an inhibitor of the WNT pathway.
  • this step is carried out between 0 and three days after the end of the differentiation induction step (addition of the activator of the WNT pathway), preferably between 12 and 72 hours, in particular between 24 and 48 hours.
  • this step consists in incubating the capsules in a culture medium containing an inhibitor of the WNT pathway, preferably for 12 hours to 48 hours, in particular between 24 to 48 hours.
  • step (b) 0 to 48 hours after step (a) incubating the capsules in a culture medium containing a WNT pathway inhibitor for 12 hours to 48 hours;
  • the culture medium is RPMI with B27 supplement without insulin (during the first 7 days of differentiation) and with insulin (from day 7 of differentiation).
  • the microcompartments according to the invention containing cells in the process of cardiac differentiation, are obtained between 2 and 7 days after the start of the induction of differentiation, preferably between 3 and 7 days after the start of the induction of differentiation, even more preferably between 4 and 6 days after the start of differentiation.
  • the microcompartment according to the invention appears at the time of addition of the WNT pathway inhibitor or after.
  • the light is generated at the time of the formation of the layer of human cells in the process of cardiac differentiation in 3 dimensions, by the cells which multiply and develop.
  • the light may contain a liquid and in particular the culture medium used for implementing the method.
  • the starting stem cells organize themselves into a layer of stem cells in three dimensions around a light in the microcompartment, then during the differentiation this light disappears, and a second light appears to form the microcompartment according to the invention.
  • the method is preferably implemented in a closed enclosure, such as a bioreactor, with a series of microcompartments, even more preferably in a suitable and at least partially convective culture medium.
  • the method according to the invention may optionally also comprise: - a step which consists in dissociating the microcompartment or the series of microcompartments to obtain a suspension of cells or a suspension of clusters of cells; elimination of the capsule can be carried out in particular by hydrolysis, dissolution, piercing and/or rupture by any means that is biocompatible, that is to say non-toxic for the cells.
  • removal can be achieved using phosphate buffered saline, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel includes alginate, and/or laser microdissection, and
  • Reencapsulation is a suitable means for: i) optimizing the standardization of the size and the homogeneity of the compacted cardiac tissues which will then be obtained, ii) ii) allowing an increase in the cellular amplification obtained from the pluripotent stage, and therefore higher yield.
  • the method according to the invention may comprise a step consisting in verifying the phenotype of the cells contained in the microcompartment. This verification can be carried out by identifying the expression by at least part of the cells contained in the microcompartment, of at least one of the following genes PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 and TBX5.
  • the method according to the invention may comprise a step of freezing the microcompartments according to the invention before their use to pursue differentiation into differentiated cardiac cells and to obtain compacted cardiac tissues.
  • the freezing is preferably carried out at a temperature between -190°C and -80°C.
  • Thawing can be done in a lukewarm water bath (preferably 37 degrees) so that the cells thaw fairly quickly.
  • the microcompartments according to the invention before their use to pursue a differentiation into differentiated cardiac cells and to obtain compacted cardiac tissues can be maintained at more than 4° C. for a limited period of time before their use, preferably between 4° C. and 38° C. .
  • microcompartments according to the invention can also be used to pursue differentiation into differentiated cardiac cells and to obtain compacted cardiac tissues, directly after implementation of the method according to the invention, without storage and without freezing.
  • the method can continue to obtain a three-dimensional object in the form of a compacted tissue.
  • the compacted object generally appears between 2 and 10 days after the addition of the WNT pathway inhibitor, especially between 5 and 7 days. Indeed, the addition of the inhibitor is preliminary to the compaction of the cells which continue to differentiate into cardiac cells.
  • the compacted object generally appears between 7 and 14 days after the initiation of differentiation.
  • the cells comprise at least in part differentiated human cardiac cells, preferably at least cardiomyocytes.
  • the method according to the invention may comprise a step of amplifying the cardiac cells in the microcompartment, and optionally one or more re-encapsulation.
  • the resulting compacted heart tissue can be held in the hydrogel capsule. Preferably, it is always surrounded by an isotonic aqueous solution, preferably an extracellular matrix.
  • an isotonic aqueous solution preferably an extracellular matrix.
  • the compacted tissue is preferably stored in a capsule before use.
  • the capsule containing the compacted cardiac tissue can be frozen before removing the hydrogel layer from the capsule.
  • the method according to the invention may comprise a step of freezing the capsules containing the compacted cardiac tissues according to the invention before their use. The freezing is preferably carried out at a temperature between -190°C and -80°C.
  • the capsules containing the compacted cardiac tissues according to the invention before their use as a graft in the heart can be thawed in a lukewarm water bath (preferably 37 degrees) so that the tissue cells thaw fairly quickly.
  • the compacted cardiac tissues according to the invention can be maintained at more than 4° C. for a limited period of time before their use, preferably between 4° C. and 38° C.
  • the method according to the invention may comprise a step consisting in verifying the phenotype of the cells contained in the capsule. This verification can be carried out by identifying the expression of cardiac troponin C by the cardiac cells forming the compacted tissue.
  • the hydrogel layer of the capsule containing the compacted cardiac tissue according to the invention is removed.
  • the elimination of the capsule can be carried out in particular by hydrolysis, dissolution, piercing and/or rupture by any means that is biocompatible, that is to say non-toxic for the cells.
  • removal can be achieved using phosphate buffered saline, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel includes alginate, and/or laser microdissection.
  • the compacted cardiac tissue according to the invention is devoid of hydrogel when it is used as a graft, implanted in a heart.
  • a subject of the invention is also the cardiac tissue obtained according to the method as described previously.
  • a subject of the invention is therefore a compacted tissue of human cardiac cells expressing cardiac troponin C and preferentially alpha-actinin, obtained from at least one cell microcompartment according to the invention.
  • the subject of the invention is a compacted tissue of cardiac human cells expressing cardiac troponin C, obtained from at least one cell microcompartment according to the invention, by a process comprising the compaction (compaction called secondary compaction) of the layer of human cells by total or partial disappearance of the light(s) of said microcompartment.
  • the compacted tissue of human cardiac cells is obtained by a method as described above.
  • the tissue according to the invention is therefore a human tissue comprising at least cells differentiated cardiac cells expressing cardiac troponin C and preferentially alpha-actinin.
  • the compacted tissue according to the invention can also contain other cell types.
  • the cardiac tissue according to the invention has a rate of cells expressing cardiac troponin C of at least 50% in number relative to the total number of cells constituting the compacted tissue, even more preferably of at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 90%.
  • This high rate of cells expressing cardiac troponin C is advantageous for considering uses of the cardiac tissues according to the invention in cell therapy.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention has a level of cells expressing alpha-actinin of at least 50% in number relative to the total number of cells constituting the compacted tissue, even more preferably of at least least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, and this rate may be greater than 90%.
  • This high level of cells expressing alpha-actinin is advantageous for envisaging uses of the cardiac tissues according to the invention in cell therapy.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention has a rate of cells expressing troponin C and alpha-actinin of at least 50% in number relative to the total number of cells constituting the compacted tissue, even more preferably at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, and this rate may be greater than 90%.
  • This high level of cells expressing both troponin C and alpha-actinin is advantageous for envisaging uses of the cardiac tissues according to the invention in cell therapy.
  • this compacted tissue is contractile and has a spontaneous contraction frequency of less than 4 Hz, preferably less than 2 Hz, even more preferably less than 1.7 Hz, in particular less than 1 Hz, and in particular less than 0.5 Hz and possibly be less than 0.25 Hz.
  • This tissue contraction frequency is low, which is a great advantage for its implantation in the heart. Indeed such a frequency makes it possible to avoid an arrhythmia at the time of the grafting of the compacted tissue according to the invention in the heart to be treated.
  • the average human adult heart rate is between 60 and 100 beats per minute (1 to 1.7 Hz).
  • the low frequency of contraction of the compacted cardiac tissues according to the invention reduces the risk of arrhythmia during a transplant of the tissues or cells obtained from these tissues. According to one embodiment, with a spontaneous beat frequency of the tissue according to the invention lower than the heart rate of the patient (recipient), this risk of arrhythmia is further reduced.
  • Reduced spontaneous beat frequency is associated with the maturation of human stem cell-derived cardiomyocytes, with the 3D culture environment enhancing cardiomyocyte maturation.
  • the encapsulation further reduces the contractile frequency of the compacted cardiac tissue.
  • Figure 5 shows that for a given starting cell population, cardiomyocytes differentiated within a microcompartment/capsule (from encapsulated human pluripotent stem cells) have a slower spontaneous beat rate than cardiomyocytes differentiated with the same protocol. (and from the same initial batch of human pluripotent stem cells) but in free suspension culture. Thus, differentiation into cardiomyocytes from encapsulated stem cells decreases the spontaneous contractile rate.
  • Human pluripotent stem cells secrete signaling molecules during the process of cardiac differentiation, which generate a specific paracrine microenvironment necessary for successful differentiation (Kempf, H. et al. Bulk cell density and Wnt/TGFbeta signaling regulate mesendodermal patterning of human pluripotent stem cells Nature Communications 7, (2016)).
  • the presence of the capsule helps to increase and maintain a local concentration of these paracrine factors, which improves the differentiation phenotype, resulting in the reduction of spontaneous beat frequency.
  • the compacted cardiac tissue according to the invention can remain contractile spontaneously for several months. Thus the product is stable over time.
  • cardiac differentiation within the microcompartment may be implemented and/or combined with other techniques, such as electrical stimulation and metabolic or hormonal interventions. Combination with such techniques can further reduce the frequency of spontaneous tissue beats. heart compacted according to the invention before the transplant.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention can be totally or partially encapsulated in an outer layer of hydrogel.
  • the hydrogel capsule may be the original microcompartment of human cells undergoing cardiac differentiation, or it may be a new hydrogel layer if the initial hydrogel layer has been removed , then re-encapsulation at any stage of the process.
  • the encapsulation of the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention makes it possible to protect the tissue, to maintain the frequency of spontaneous contraction below 4 Hz, preferentially below 2 Hz, even more preferentially below 1 Hz, and in particular below 0 .5Hz. It may be less than 0.25 Hz.
  • the mechanism by which the contraction frequency is limited may be linked to the 3D structuring via i) the electrical continuity of the cytoplasms of cardiac cells, ii) and/or the limitation of the quantity of calcium available per cell in the intercellular space of the compacted tissues iii) and/or the mechanical resistance linked to the mechanical continuity of the cytoskeletal elements of the cardiac cells.
  • the encapsulation of the cardiac compacted tissue according to the invention also makes it possible to control the size of the compacted tissue which improves the retention, the integration and the cell survival when it is injected into the heart, in particular in comparison with the injections of single cells , which increases the efficiency of cardiac cell therapy with the compacted tissues according to the invention.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention is not encapsulated in an outer hydrogel layer.
  • the capsule is preferentially removed before use in order to allow the cells of the compacted tissue to implant themselves at the level of the heart after a transplant.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention is preferably completely or partially surrounded by a layer of isotonic aqueous solution, such as an extracellular matrix.
  • This layer of isotonic aqueous solution is located between the packed tissue of human heart cells and the hydrogel layer when the packed heart tissue is encapsulated.
  • the compacted cardiac tissue according to the invention is in three dimensions. It preferably has a spherical or elongated shape. According to a preferred embodiment, the compacted tissue of human heart cells has the shape of a spheroid, ovoid, cylinder or sphere.
  • FIGS. 4 An example of compacted fabric according to the invention is represented in FIGS. 4.
  • the compacted fabric according to the invention is surrounded by a layer of isotonic aqueous solution and an outer layer of hydrogel.
  • it has a diameter or a smaller dimension of between 10 ⁇ m and 1 mm, preferably between 100 ⁇ m and 700 ⁇ m.
  • This smaller dimension is important for its survival, in particular for promoting the survival of cardiac cells within the cardiac tissue and optimizing the reorganization as well as the vascularization of the cardiac tissue after implantation in the heart.
  • Its largest dimension is preferably greater than 10 ⁇ m, more preferably between 10 ⁇ m and 1 m, even more preferably between 10 ⁇ m and 50 cm. According to one embodiment, the largest dimension is compatible with the size of the organ and is therefore less than 30 cm (between 10 ⁇ m and 30 cm).
  • the encapsulation of a controlled number of stem cells and/or the re-encapsulation makes it possible to control the desired size and shape of the cardiac tissues obtained.
  • the size of the cardiac tissues according to the invention may vary depending on the therapeutic use envisaged.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention can be frozen, to promote its storage.
  • the invention allows the production of a large number of quality human cardiac tissues by protecting the tissue units throughout their production by differentiation of pluripotent cells into cardiac cells.
  • Figures 7, 8 and 9 show that for a given starting cell population, the tissues obtained within a microcompartment / capsule passing through a phase in the process of differentiation with the presence of at least one light, then a compaction secondary, presents a much higher rate of cells expressing troponin C, in comparison with tissues differentiated with the same protocol (and from the same initial batch of human pluripotent stem cells) but in culture in free suspension.
  • differentiation into cardiomyocytes in microcompartments and/or by a process comprising secondary compaction makes it possible to increase the quality of cardiac tissues and therefore improves their possibility of use in cell therapy.
  • the compacted tissue of cardiac cells according to the invention can be dissociated into cells.
  • the dissociation can be carried out according to conventional methods known to those skilled in the art, in particular using an enzymatic solution making it possible to separate the cells.
  • the enzymes used can for example be chosen from trypsin, collagenase, accutase and mixtures thereof.
  • the dissociated cells are preferably used in suspension or integrated into a gel such as for example a collagen gel or into a patch.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention can be used as such or else to produce a suspension of cardiac cells.
  • the compacted tissue of human cardiac cells according to the invention is particularly useful for the production of a suspension of cells (graft cells) which can be implanted in the heart of a human being, in particular for the treatment of cardiac pathologies.
  • the shape, size and constitution of the compacted tissue according to the invention promote homogeneous differentiation with an improved yield of cardiac cells within the compacted tissue according to the invention, which can be secondarily dissociated before implantation in the heart.
  • the tissue compacted with human cardiac cells according to the invention is also particularly useful for its use as such as a graft which can be implanted in the heart of a human being, in particular for the treatment of cardiac pathologies.
  • the shape, size and constitution of the compacted tissue according to the invention allow the survival of cardiac cells within the compacted tissue according to the invention, before implantation and the successful implantation, reorganization and vascularization of the graft once implanted in the heart.
  • Another object of the invention is therefore the compacted tissue of human cardiac cells for its use, as such or after dissociation in the form of a suspension of cells, in therapy, in particular in cell therapy, as a medicament, in particular its use in the treatment and/or prevention of a cardiac pathology, in particular in a patient in need thereof, and preferentially in the treatment and/or prevention of an ischemic cardiac disease.
  • the dissociated cells obtained from the tissues according to the invention can be used, they exhibit a higher spontaneous contraction frequency than the compacted cardiac tissues.
  • the slow spontaneous beating rate of differentiated cardiomyocytes within the capsule is not maintained when the cells are dissociated and cultured under 2D conditions ( Figure 6).
  • Treatment means preventive, curative or symptomatic treatment, i.e. any act intended to improve a person's sight temporarily or permanently, and preferably also to eradicate the disease and/or stop or delay the disease progression and/or promote disease regression.
  • the compacted tissues of human cardiac cells according to the invention can be used for the treatment of heart diseases in humans, in particular diseases having caused ischemia of at least part of the heart, such as a heart attack for example, to replace damaged areas.
  • the treatment consists in implanting, grafting the compacted tissues according to the invention or the cells obtained by their dissociation in the heart, at the level of the ventricles of the hearts, in particular the left ventricle, or integrating them into a patch positioned on said ventricles , ideally between the visceral pericardium and the muscular tissue of the ventricle, or what remains of it in a pathological situation.
  • a surgical implantation device suitable for implantation in the heart is very preferably used.
  • These may be in particular needles, cannulas or other device making it possible to deposit the compacted tissues according to the invention or the cells obtained by dissociation of the compacted tissues according to the invention, in the heart such as for example those used for the implantation of stents in the arteries or surgical micro implants.
  • the implantation can be carried out by direct myocardial injection, in particular by sternotomy or with a device based on a catheter: the compacted cardiac tissues according to the invention or the cells obtained from these tissues (with or without the addition of other cell types) are injected into the mid wall of the patient's left ventricle at one or more locations.
  • the implantation can be carried out using an epicardial patch.
  • the compacted cardiac tissues according to the invention or the cells obtained from these tissues (with or without the addition of other cell types) are used in the formation of patches. These patches can then be placed on the epicardial surface of the patient's left ventricle, either by sternotomy or by a surgical procedure involving an incision and injection of the patch into the chest cavity.
  • tissue compacted according to the invention are implanted.
  • the implantation of compacted cardiac tissues according to the invention allows patients suffering from heart diseases, and in particular from ischemic heart diseases, to clinically improve cardiac function, in particular:
  • the invention makes it possible to improve the overall health and the quality of life of the patient, while limiting the risk of arrhythmias induced by the transplant.
  • the compacted tissues according to the invention can be useful as a model of cardiac tissue in particular:
  • the invention also relates to these uses.
  • the image in Figure lb is a phase contrast microscopy image of a microcompartment according to the invention taken at 4x magnification. It was taken 5 days after the start of differentiation (8 days after the initial stem cell encapsulation). The steps used to obtain the microcompartment shown in this figure are as follows:
  • Encapsulated stem cells were cultured in stem cell culture media (mTeSR1) for 3 days.
  • the culture medium was changed from stem cell medium to cardiac differentiation medium containing a molecule activating WNT (CHIR99021).
  • the medium is RPMI medium supplemented with B27 without insulin with CHIR99021 This is considered differentiation day 0.
  • the medium is RPMI medium with B27 supplement without insulin
  • the medium was changed to a cardiac differentiation medium containing a molecule which inhibits the WNT pathway (WNT-C59 or IWR1).
  • the medium is RPMI medium supplemented with insulin-free B27 with WNT-C59 or IWR1.
  • Human induced pluripotent stem cells were encapsulated in an alginate hydrogel (with extracellular matrix added at the time of encapsulation).
  • Encapsulated stem cells were cultured in stem cell culture media (mTeSR1) for 6 days.
  • the culture medium was changed from stem cell medium to cardiac differentiation medium containing WNT activating molecule (CHIR99021).
  • the medium is RPMI medium supplemented with B27 without insulin with CHIR99021 This is considered differentiation day 0.
  • the medium was changed to cardiac differentiation medium without WNT activating molecule.
  • the medium is RPMI medium with B27 supplement without insulin.
  • the medium was changed to a cardiac differentiation medium containing a molecule which inhibits the WNT pathway (WNT-C59 or IWR1).
  • the medium is RPMI medium supplemented with insulin-free B27 with WNT-C59 or IWR1.
  • the image in Figure 3b is a phase contrast microscopy image of a microcompartment according to the invention taken at 4x magnification. It was taken 5 days after the start of differentiation (11 days after the initial stem cell encapsulation). The steps used to obtain the microcompartment shown in these figures are the same as cells to obtain Figures 2b and 2c. The difference lies in a larger number of encapsulated stem cells. 4
  • Figure 4b and 4c are phase contrast microscopy images taken at 4x magnification of tissues compacted according to the invention in microcompartments.
  • the compacted tissues were obtained by continuing the differentiation beyond day 5 (already described in figures 1, 2 and 3):
  • the images presented in Figures 4 relate to tissues compacted > 14 days after the start of differentiation.
  • Figure 5 shows that for a given starting cell population, cardiomyocytes differentiated within the capsule (from encapsulated hiPSC) have a slower spontaneous beat rate than cardiomyocytes differentiated with the same protocol (and from the same initial batch of hiPSC) but in free-suspension culture.
  • Beat frequency in Hz was obtained from a series of phase contrast microscopy images (at a rate of at least 30 frames per second) on a standard tabletop microscope with 4x magnification. Images are phase contrast microscopy images taken at 4x magnification showing encapsulated or free-living stem cells at the start of differentiation (outermost), and final compacted tissues approximately 2 weeks after the start of differentiation (outermost). more internal).
  • an intermediate step with a microcompartment according to the invention is presented on differentiation day 5.
  • FIG. 6 shows that the slow spontaneous beating rate of differentiated cardiomyocytes in the capsule is slightly increased after the capsule is removed, and greatly increased after the cells have been dissociated and placed in 2D culture.
  • the compacted heart tissues have a slower beat frequency than that of the isolated cells obtained by dissociation of said tissues.
  • Beat frequency in Hz
  • the beat frequency for the heart tissues compacted according to the invention encapsulated and then decapsulated was taken approximately 3 weeks after the start of differentiation.
  • Figure 7 shows phase contrast microscopy images taken at 4x magnification.
  • the three images in the top line (a, b and c) are images of cells encapsulated according to the invention.
  • the three baseline images (d, e, and f) are images of unencapsulated cells.
  • the images in the left column (a and d) represent stem cells induced at the start of differentiation into cardiac cells.
  • the images in the middle column (b and e) represent human cells in the process of cellular differentiation into cardiac cells, 3 to 7 days after the initiation of differentiation.
  • the images in the right column (c and f) represent differentiated cardiac tissues.
  • topology is different with and without encapsulation according to the invention. Without encapsulation there is no lumen being differentiated, and the cardiac tissue obtained at the end of differentiation has a very different shape.
  • Figure 8 we see that the percentage of cells in the tissues (obtained as in Figure 7c and 7f) expressing cardiac troponin C is greater than 90% under the conditions of the invention while it is 40 % for cardiac tissues obtained under the same conditions but without encapsulation.

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Abstract

L'invention concerne des microcompartiments cellulaires, chaque microcompartiment comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière : - au moins une couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRα, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, - au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique, et - au moins une couche externe en hydrogel. L'invention a également pour objet les tissus cardiaques obtenus à partir de ces microcompartiments et leur utilisation notamment dans le traitement de pathologies cardiaques.

Description

DESCRIPTION
MICROCOMPARTIMENTS CELLULAIRES COMPRENANT DES CELLULES HUMAINES EN COURS DE DIFFERENCIATION CARDIAQUE, TISSUS OBTENUS A PARTIR DE CES MICROCOMPARTIMENTS ET UTILISATIONS
Domaine technique
L'invention concerne le traitement des maladies cardiaques, notamment de cardiopathies ischémiques, par l'utilisation de tissus cardiaques spécifiques obtenus à partir de microcompartiments cellulaires particuliers comprenant des cellules humaines exprimant des gènes exprimés au cours de la différenciation cardiaque.
Art antérieur
Selon l'organisation Mondiale de la Santé, les maladies cardiovasculaires, et en particulier les cardiopathies ischémiques (qui conduisent généralement à des infarctus du myocarde), sont la principale cause de décès dans le monde (Thomas, H. et al. Global Atlas of Cardiovascular Disease 2000-2016: The Path to Prevention and Control. Glob. Heart 13, 143-163 (2018)).
Actuellement, il n'existe aucune solution satisfaisante pour prévenir ou traiter les conséquences des ischémies cardiaques et en particulier pour traiter les nécroses du muscle cardiaque responsables d'insuffisances cardiaques et de risques d'arrêts du cœur.
Récemment, des recherches ont été menées sur l'utilisation de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines, les hPSC-CM, qui comprennent à la fois des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches pluripotentes induites, pour régénérer les tissus cardiaques perdus ou endommagés afin d'éviter ou de traiter l'insuffisance cardiaque associée (Desgres, M. & Menasché, P. Clinical Translation of Pluripotent Stem Cell Therapies: Challenges and Considerations. Cell Stem Cell 25, 594-606 (2019) ; Bertero, A. & Murry, C. E. Hallmarks of cardiac regeneration. Nat. Rev. Cardiol. 15, 579-580 (2018) ; Jiang, B., Yan, L., Shamul, J. G., Hakun, M. & He, X. Stem Cell Therapy of Myocardial Infarction: A Promising Opportunity in Bioengineering. Adv. Ther. 3, 1900182 (2020) ; Liew, L. C., Ho, B. X. & Soh, B. S. Mending a broken heart: Current strategies and limitations of cell-based therapy. Stem Cell Res. Ther. 11, 1-15 (2020)).
Ces cardiomyocytes peuvent être utilisés pour d'autres applications notamment comme stimulateurs cardiaques biologiques pour le traitement du dysfonctionnement du nœud sinusal (Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H. & Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell 21, 179-194. e4 (2017)), ou pour traiter les cardiopathies congénitales, telles que les anomalies septales (Devalla, H. D. & Passier, R. Cardiac differentiation of pluripotent stem cells and implications for modeling the heart in health and disease. Sc/. Transi. Med. 10, 1-14 (2018)) ou encore pour la modélisation de maladies, ou pour tester des médicaments et candidats médicaments (Tzatzalos, E., Abilez, O. J., Shukla, P. & Wu, J. C. Engineered heart tissues and induced pluripotent stem cells: Macro- and microstructures for disease modeling, drug screening, and translational studies. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 234-244 (2016)).
On estime que la quantité de cellules nécessaire pour régénérer les tissus cardiaques endommagés d'un patient après un infarctus du myocarde est d'environ 1 milliard (Laflamme, M. A. & Murry, C. E. Heart regeneration. Nature 473, 326-335 (2011)) ce qui rend l'utilisation de cardiomyocytes dérivés d'hPSC-CM en thérapie cellulaire cardiaque actuellement impossible à une échelle clinique adaptée. En effet, la production à l'échelle industrielle de tissus cardiaques est complexe car il faut réaliser un compromis entre conditions de culture suffisamment douces pour la survie et le bon fonctionnement des tissus et contraintes de cultures à grands volumes qui immanquablement exposent les cellules à des stress non physiologiques (typiquement le stress hydrodynamique dans le cadre de la culture liquide en bioréacteurs). Les procédés de production de cardiomyocytes à partir d'hPSC présentent en particulier les problèmes suivants :
- Une mauvaise formation des agrégats d'hPSC dans les cultures en suspension avant la différenciation en cardiomyocytes : en effet la formation initiale des agrégats d'hPSC et l'homogénéité sont cruciales pour la reproduction cellulaire et donc pour la qualité du tissu cardiaque obtenu après différenciation ;
- Une perte importante de cellules due à la sensibilité des hPSC à la contrainte de cisaillement et aux impacts lors de la culture en bioréacteur (Lam, A. T. L. et al. Conjoint propagation and differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a defined microcarrier spinner culture. Stem Cell Res. Ther. 5, 1-15 (2014)) ;
- L'impossibilité de combiner une amplification à grande échelle des hPSC et une différenciation cardiaque (Le, M. N. T. & Hasegawa, K. Expansion culture of human pluripotent stem cells and production of cardiomyocytes. Bioengineering 6, (2019)).
Les solutions connues pour limiter ces inconvénients lors de la différenciation cardiaque en suspension dans un bioréacteur nécessitent :
- soit l'utilisation de micro-supports, ainsi que l'arrêt temporaire de l'agitation (Ting, S., Chen, A., Reuveny, S. & Oh, S. An intermittent rocking platform for integrated expansion and differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes in suspended microcarrier cultures. Stem Cell Res. 13, 202-213 (2014))
- soit l'utilisation de lignées cellulaires moins sensibles au cisaillement lors de la différenciation cardiaque (Laco, F. et al. Selection of human induced pluripotent stem cells lines optimization of cardiomyocytes differentiation in an integrated suspension microcarrier bioreactor. Stem Cell Res. Then 11, 1-16 (2020)).
Ces solutions ne sont toutefois pas optimales. En particulier :
- les micro-supports laissent encore les cellules exposées à des contraintes mécaniques et qui peuvent être difficiles à retirer,
- l'arrêt de l'agitation ne permettent pas une diffusion uniforme des nutriments et produits nécessaires à la différenciation, et
- la limitation à une unique lignée cellulaire de départ est extrêmement contraignante et limitative.
On sait également que la perte de cellules au cours de la différenciation en cardiomyocytes peut également être réduite en effectuant une culture directement dans de l'hydrogel en vrac (Kerscher, P. et al. Direct Production of Human Cardiac Tissues by Pluripotent Stem Cell Encapsulation in Gelatin Methacryloyl. ACS Biomater. Sci. Eng. 3, 1499-1509 (2017) ; Li, Q. et al. Scalable and physiologically relevant microenvironments for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Biofabrication 10, (2018)), mais ces méthodes ne sont pas compatibles avec la culture en bioréacteur classique. Pour rendre la méthode compatible avec des bioréacteurs utilisés dans l'industrie, des essais ont été réalisés en encapsulant les cellules dans l'hydrogel, mais ces essais ont été limités aux cellules souches de souris (Agarwal, P. et al. A Biomimetic Core-Shell Platform for Miniaturized 3D Cell and Tissue Engineering. Part. Part. Syst. Charact. 32, 809-816 (2015), Chang, S. et al. Emulsion-based Encapsulation of Pluripotent Stem Cells in Hydrogel Microspheres for Cardiac Differentiation. Biotechnol. Prog. btpr.2986 (2020) doi:10.1002/btpr.2986 ; Zhao, S. et al. Bioengineering of injectable encapsulated aggregates of pluripotent stem cells for therapy of myocardial infarction. Nat. Commun. 7, 1-12 (2016)).
Enfin, on sait que la rétention cellulaire après délivrance dans le cœur des cardiomyocytes est très mauvaise (Hou, D. et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: Implications for current clinical trials. Circulation 112, 150-156 (2005)) ce qui limite l'efficacité de la thérapie cellulaire cardiaque. De plus, lors de la greffe de cardiomyocytes tels qu'obtenus actuellement, pour régénérer des tissus cardiaques, il existe un risque important d'induire une arythmie au patient ce qui limite là encore l'utilisation de la thérapie cellulaire pour le traitement des pathologies cardiaques. En effet, à ce jour, l'un des défis scientifiques les plus cruciaux à surmonter afin d'assurer la sécurité des cellules cardiaques dérivées de cellules souches pour les applications thérapeutiques liées aux maladies cardiaques est l'élimination de l'arythmie induite lors de la greffe (Menasché, P. Cardiac cell therapy: Current status, challenges and perspectives. Archives of Cardiovascular Diseases 113, 285-292 (2020) ; Kadota, S., Tanaka, Y. & Shiba, Y. Heart regeneration using pluripotent stem cells. Journal of Cardiology (2020) doi:10.1016/j.jjcc.2020.03.013 ; Chen, K., Huang, Y., Singh, R. & Wang, Z. Z. Arrhythmogenic risks of stem cell replacement therapy for cardiovascular diseases. Journal of Cellular Physiology (2020) doi:10.1002/jcp.29554). Bien que généralement transitoires, des arythmies ont été observées à la fois chez des porcins (Romagnuolo, R. et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Regenerate the Infarcted Pig Heart but Induce Ventricular Tachyarrhythmias. Stem Cell Reports 12, 967-981 (2019)) et des primates non humains (Ichimura, H. et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature 538, 388-391 (2016) ; Liu, Y.-W. et al. Human embryonic stem cell- derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature biotechnology 36, 597-605 (2018) ; Chong, J. J. H. et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature 510, 273-277 (2014)), grands modèles animaux de régénération après un infarctus du myocarde.
Il existe donc un besoin important pour une solution permettant la production à grande échelle de cardiomyocytes de qualité, pour répondre à une demande indispensable de thérapie cellulaire cardiaque, mais aussi en recherche et développement de molécules- médicament pour juger de leur efficacité et de leur toxicité en phases précliniques, avant d'exposer des patients à ces traitements.
L'objectif de l'invention est par conséquent de répondre à l'ensemble de ces besoins et de pallier les inconvénients et limites de l'art antérieur.
Résumé de l'invention
Pour répondre à cet objectif, l'invention propose de passer par un intermédiaire développemental clé pour obtenir des tissus compactés de cellules cardiaques humaines avec des caractéristiques particulières et en quantité importante, adaptés à des utilisations en thérapie cellulaire.
A cet effet, l'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions (3D) comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière :
- au moins une couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, ladite couche interne ayant une épaisseur variable ;
- au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique, et
- au moins une couche externe en hydrogel.
Au sein du microcompartiment, la couche interne de cellules humaines et la ou les lumière(s) forment ensemble un objet cellulaire en trois dimensions. Si on mesure la plus petite et la plus grande épaisseur de la couche interne de cellules le long d'un segment passant par le centre géométrique de cet objet cellulaire, le ratio entre la plus grande épaisseur et la plus petite épaisseur est supérieur ou égale à 2. Les épaisseurs de couche interne sont mesurées le long du segment passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire :
- a. entre :
* l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire, et
* l'interface de la couche interne et d'une lumière, et/ou - b. entre :
* l'interface de la couche interne et d'une lumière, et
* l'interface de la couche interne et d'une autre lumière.
L'invention a par conséquent pour objet spécifique un microcompartiment cellulaire comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière :
- au moins une couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, ladite couche interne ayant une épaisseur variable, le ratio entre la plus grande épaisseur et la plus petite épaisseur de la couche interne étant supérieur ou égal à 2, la plus petite épaisseur et la plus grande épaisseur de la couche interne étant la plus petite et la plus grande des épaisseurs de couche interne mesurées le long d'un segment passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire formé par la couche interne et la ou les lumière(s), entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et l'interface de la couche interne et d'une lumière, et/ou entre l'interface de la couche interne et d'une lumière et l'interface de la couche interne et d'une autre lumière,
- au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique, et
- au moins une couche externe en hydrogel.
Le microcompartiment selon l'invention comprend donc des cellules en cours de différenciation cellulaire, l'expression des gènes PDGFRa / MESP1 / NKX2-5 / GATA4 / MEF2C /TBX20/ ISL1 / TBX5 étant associée à des stades intermédiaires de la différenciation cardiaque. Une telle configuration (une ou plusieurs lumières autour desquelles sont organisées successivement une couche de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque avec des caractéristiques d'épaisseurs spécifiques, une couche de solution aqueuse isotonique et au moins une couche en hydrogel) est inédite. En effet, il existe plusieurs protocoles connus pour différencier les hPSC en cardiomyocytes qui reposent partiellement ou totalement sur la modulation de la voie WNT (Wingless et lnt-1) (Dunn, K. K. & Palecek, S. P. Engineering scalable manufacturing of high-quality stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac tissue repair. Front. Med. 5, (2018)). Au cours de la différenciation cardiaque dirigée de hPSC, les cellules subissent des changements morphologiques lors de leur transition vers le mésoderme, le mésoderme cardiaque, les progéniteurs cardiaques et finalement vers les myocytes cardiaques. En culture 2D d'hPSC, ces changements sont connus pour être associés à des morphologies distinctes (Palpant, N. J. et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 12, 15-31 (2017)). Ces changements morphologiques n'ont pas été bien décrits dans un système de culture 3D et la topologie de l'objet de l'invention n'a jamais été obtenue et décrite. Or, de façon avantageuse, elle permet d'obtenir ensuite des tissus compactés en grand nombre et présentant des caractéristiques permettant leur utilisation pour régénérer des tissus cardiaques endommagés.
La présence d'une couche externe d'hydrogel et d'une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique permet une distribution uniforme des cellules entre les microcompartiments. Ainsi, l'homogénéité entre les microcompartiments est grandement améliorée par l'encapsulation préalable des hPSC permettant un rendement et une qualité accrue par rapport aux méthodes existantes. Par ailleurs cette couche d'hydrogel permet d'éviter les fusions de microcompartiments qui sont une source majeure de variabilité défavorable pour l'homogénéité phénotypique et la survie des cellules cardiaques produites en bioréacteur.
De plus, la modulation de la voie WNT utilisée dans la différenciation cardiaque est associée à la dégradation de la p-caténine (Lam, A. T. L. et al. Conjoint propagation and differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes in a defined microcarrier spinner culture. Stem Cell Res. Ther. 5, 1-15 (2014)), une molécule qui joue un rôle dans les complexes d'adhérence cellule-cellule (Brembeck, F. H., Rosârio, M. & Birchmeier, W. Balancing cell adhesion and Wnt signaling, the key role of p-catenin. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 51-59 (2006)). Avantageusement, la topologie du microcompartiment selon l'invention permet de protéger les cellules en cours de différenciation cardiaque et ce malgré la fragilité de l'adhérence cellule-cellule induite par la modulation de la voie WNT.
Les microcompartiments selon l'invention peuvent être utilisés pour obtenir des tissus compactés de cellules humaines cardiaques différenciées spécifiques. L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation d'un microcompartiment cellulaire selon l'invention, pour obtenir un tissu de cellules cardiaques exprimant la troponine C cardiaque et préférentiellement également l'alpha-actinine.
L'invention a donc également pour objet des tissus cardiaques compactés. En particulier, l'invention a pour objet un tissu compacté de cellules humaines cardiaques exprimant la troponine cardiaque C (c'est-à-dire des cellules humaines exprimant le gène de la troponine C cardiaque, l'alias du gène correspondant étant TNNC1), obtenu à partir d'au moins un microcompartiment cellulaire tel que précédemment décrit, par un procédé comprenant la compaction de la couche interne de cellules humaines par disparition totale ou partielle de la ou des lumière(s). Préférentiellement le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut être supérieur à 90%. Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant l'alpha-actinine d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut être supérieur à 90%. Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant la troponine C et l'alpha-actinine d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut être supérieur à 90%.
Dans l'art antérieur il a été décrit dans Jing Donghui et al. « Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems », Cell Transplantation, col. 19, no 11, 1 novembre 2010, pages 1397-1492, des tissus cardiaques obtenus par l'encapsulation d'ESC de souris ou humaines dans des billes d'alginate enduites de poly-lysine, puis dissolution du noyau par incubation dans une solution de citrate de sodium. Cette solution, démontrée à partir de cellules souches embryonnaires, n'est pas satisfaisante, la pureté du tissu obtenu, et en particulier le taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque est inférieur à 20% ce qui n'est pas suffisant pour envisager une utilisation en thérapie. Or avec un trop grand nombre d'impuretés cellulaires dans les tissus, ceux-ci présentent un risque pour le patient en introduisant des cellules non désirées dans le muscle cardiaque, au risque de perturber son bon fonctionnement, notamment en perturbant sa conductivité électrique et/ou sa capacité de contraction . De plus, l'utilisation de poly-lysine aux concentrations décrites dans cet article présente un risque de toxicité pour les cellules. De même dans Koivisto Janne T. et al. « Mechanically Biomimetic Gelatin-Gellan Gum Hydrogels for 3D Culture of Beating Human Cardiocytes », Applied Materials & Interfaces, vol. 11, n°23, 12 juin 2019, pages 20589-20602, il est décrit l'encapsulation de cellules au sein d'un hydrogel sans espace disponible pour l'organisation des cellules, a fortiori après prolifération cellulaire qui mécaniquement met sous pression l'hydrogel. Il n'y a pas d'encapsulation dans des microcompartiments et cela ne conduit pas à une fréquence contractile adaptée, ni à un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque suffisant pour une utilisation en thérapie.
Les tissus cardiaques selon l'invention, obtenu par un procédé spécifique et différent de ceux de l'art antérieur, permet d'obtenir des tissus cardiaques avec un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque et/ou l'alpha-actinine d'au moins 50%, et préférentiellement d'au moins 75%. En effet, la configuration selon l'invention en cours de différenciation permet la transmission de signaux auto/paracrine au sein d'un lumen protégé ce qui permet aux cellules de s'autoorganiser d'une façon biomimétique de la structuration in vivo. Cette structuration est extrêmement fragile et nécessite à la fois une protection mécanique et de la place disponible contrairement à ce qui est décrit dans Koivisto Janne T. et al. Selon l'invention, cette configuration ne peut pas se mettre en place ni en système confiné, ni en système non- protégé. En effet la différenciation cardiaque est notoirement peu reproductible in vitro en systèmes classiques (3D comme 2D, https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213671118301504) ce qui traduit une maîtrise incomplète de l'environnement cellulaire. De façon non évidente et surprenant, l'invention propose une structuration maîtrisée de l'environnement sous forme d'une autoorganisation protégée, qui permet une moins grande sensibilité aux petites variations du système de culture et donc une plus grande reproductibilité.
Les tissus cardiaques selon l'invention peuvent être utilisés pour régénérer des tissus cardiaques ischémiés. Aussi, l'invention vise lesdits tissus pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement de pathologies, notamment de pathologies cardiaques.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention et des exemples qui vont suivre.
Brève description des figures
- la Figure la est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un microcompartiment cellulaire 10 selon l'invention, correspondant à la photo représentée sur la figure lb, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution aqueuse isotonique 14, une couche de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque 16 avec une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur tl, et une lumière interne 18.
- la Figure lb est une image de microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme schématique de la Figure la.
- la Figure 2a est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un microcompartiment cellulaire 10 selon l'invention, correspondant à la photo représentée sur la figure 2b, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution aqueuse isotonique 14, une couche de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque 16 avec une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur tl, et deux lumières internes 18-1 et 18-2, SI représentant l'épaisseur de la couche de de solution aqueuse isotonique 14.
- la Figure 2b est une image de microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme schématique de la Figure 2a.
- la Figure 2c est une image de microscopie à contraste de phase de plusieurs microcompartiments selon l'invention, prise à un grossissement 4x, chaque microcompartiment avec différentes morphologies.
- la Figure 3a est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un microcompartiment cellulaire 10 selon l'invention, correspondant à la photographie représentée sur la figure 3b, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution aqueuse isotonique 14, une couche de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque 16 avec une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur tl, et deux lumières internes 18-1 et 18-1, si représentant l'épaisseur de la couche de de solution aqueuse isotonique 14.
- la Figure 3b est une image de microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme schématique de la Figure 3a.
- la Figure 4a est une représentation schématique d'une vue en coupe d'un tissu compacté selon l'invention, correspondant à la photo représentée sur la figure 4b, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution aqueuse isotonique 14, un tissu compacté de cellules cardiaques différenciées 20. la Figure 4b est une image de microscopie à contraste de phase d'un tissu compacté selon l'invention dans un microcompartiment, prise à un grossissement 4x qui correspond au diagramme schématique de la Figure 4a.
- la Figure 4c représente des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x de tissus compactés selon l'invention dans des microcompartiments.
- la Figure 5 comprend :
- un graphique qui représente la fréquence de battement de tissus et/ou cellules obtenue à partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à une fréquence d'au moins 30 images par seconde) sur un microscope de table standard avec un grossissement 4x, et
- des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x montrant les cellules souches encapsulées ou libres au début de la différenciation (les plus externes), et les tissus compactés selon l'invention environ 2 semaines après le début de la différenciation (Al : Agrégats de cellules souches sans capsule ; A2 : Tissus cardiaques compactés dérivés de ces agrégats ; B1 : Tissus cardiaques compactés dans des capsules ; B2 : microcompartiments contenant des cellules cardiaques en cours de différenciation ; B3 : cellules souches encapsulées).
- la Figure 6 comprend :
- un graphique qui représente la fréquence de battement de tissus et/ou cellules obtenue à partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à une fréquence d'au moins 30 images par seconde) sur un microscope de table standard avec un grossissement 4x, et
- des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x. L'image de gauche montre les tissus cardiaques compactés différenciés dans la capsule à partir d'hiPSC encapsulées. L'image de droite montre les cellules obtenues par dissociation de tissus cardiaques compactés selon l'invention.
- la Figure 7 comprend des images de microscopie à contraste de phase prise grossissement
4x. Les trois images de la ligne du haut (a, b et c) sont des images de cellules encapsulées. Les trois images de la ligne du base (d, e et f) sont des images de cellules non encapsulées. Les images de la colonne de gauche (a et d) représentent des cellules souches induites en début de différenciation en cellules cardiaques. Les images de la colonne du milieu (b et e) représentent des cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, 3 à 7 jours après l'initiation de la différenciation. Les images de la colonne de droite (c et f) représentent des tissus cardiaques différenciés.
- La Figure 8 est un graphique qui représente le pourcentage de cellules dans les tissus (obtenus tels qu'à la Figure 7c et 7f) exprimant la troponine C cardiaque : à gauche tissus selon l'invention encapsulés (image 7c), à droite tissus non encapsulés (image 7f).
- La Figure 9 est un graphique qui représente le taux d'amplification cellulaire entre le début de la différenciation (obtenus tels qu'à la Figure 7a et 7d) dans les tissus : à gauche selon l'invention encapsulés, à droite non encapsulés.
Description détaillée de l'invention
Définitions
Par « alginate » au sens de l'invention, on entend des polysaccharides linéaires formés à partir de |3-D-mannuronate et a-L-guluronate, des sels et des dérivés de ceux-ci.
Par « capsule en hydrogel » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes polymères, gonflée par un liquide et préférentiellement de l'eau.
Par cellule « exprimant un gène » au sens de l'invention, on entend une cellule qui contient au moins 5 fois plus de copies de l'ARN transcrit à partir de la séquence d'ADN du gène concerné en comparaison d'une cellule pluripotente, préférentiellement 10 fois plus de copies, préférentiellement 20 fois plus de copies, préférentiellement 100 fois plus de copies.
Par « cellules humaines » au sens de l'invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n'est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l'invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par « cellule progénitrice » au sens de l'invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation cellulaire en cellules cardiaque mais pas encore différenciée.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d'êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l'invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans la présente demaine. Il peut s'agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Des exemples de procédés permettant l'obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917- 1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « cellules cardiaques différenciées » au sens de l'invention on entend des cellules qui présentent le phénotype d'un cardiomyocyte, c'est-à-dire exprimant des marqueurs spécifiques tels que TNNC1 (gène de la troponine C cardiaque) et ACTN2 (gène de l'alpha actinine) et capables de se contracter spontanément en réponse à un signal calcique intracellulaire de façon spontanée (dans le cas de cellules cardiaques immatures) ou suite à une stimulation électrique ou chimique capable de déclencher ledit signal calcique. Par cellules « différenciées » au sens de l'invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui ne sont pas différenciées.
Par « diamètre de Feret » d'un tissu cardiaque compacté selon l'invention ou d'un microcompartiment selon l'invention, on entend la distance « d » comprise entre deux tangentes audit tissu compacté ou audit microcompartiment, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection dudit tissu compacté ou dudit microcompartiment soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « épaisseur variable » de la couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire, on entend au sens de l'invention le fait que la couche interne dans un même microcompartiment, n'a pas la même épaisseur partout.
Par « implantation » ou « greffe » dans le cœur au sens de l'invention, on entend l'action de déposer au niveau du cœur à un endroit particulier au moins un tissu compacté selon l'invention. L'implantation peut être réalisée par tout moyen notamment par injection.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant au moins une cellule.
Par « milieu de culture convectif » au sens de l'invention on entend un milieu de culture animé par des mouvements internes.
Par « plus grande dimension » d'un tissu cardiaque compacté selon l'invention ou d'un microcompartiment selon l'invention au sens de l'invention, on entend la valeur du plus grand diamètre de Feret dudit tissu compacté ou dudit microcompartiment.
Par « plus petite dimension » d'un tissu cardiaque compacté selon l'invention ou d'un microcompartiment selon l'invention au sens de l'invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret dudit tissu compacté ou dudit microcompartiment.
Par « tissu » ou « tissu biologique »au sens de l'invention, on entend le sens commun de tissu en biologie c'est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la cellule et l'organe. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus souvent issus d'un lignage cellulaire commun, bien qu'elles puissent trouver leur origine par association de lignages cellulaires distincts)., regroupées en amas, réseau ou faisceau (fibre). Un tissu forme un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même fonction. Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Par « tissu compacté » ou « tissu cardiaque compacté » ou « tissu compacté de cellules cardiaques » au sens de l'invention, on entend une unité de tissu comprenant au moins un tissu cardiaque constitué au moins par des cellules cardiaques différenciées. Le tissu est au moins partiellement compacté c'est-à-dire qu'il est composé principalement de cellules, en particulier son volume est composé de plus de 50% de cellules, préférentiellement 75% de cellules, préférentiellement 90% de cellules. Le tissu peut être totalement compacté c'est à dire que les lumières ne sont plus détectables et/ou qu'il n'y a aucune lumière. Les tissus compactés selon l'invention peuvent être appelés des microtissus.
Par « lumière » ou « lumen » au sens de l'invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement son contenu n'est pas en équilibre diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l'extérieur du microcompartiment. cellulaires
L'invention a donc pour objet un microcompartiment cellulaire comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière :
- au moins une couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5 (dite « couche interne »),
- au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique (dite « couche intermédiaire »), et
- au moins une couche externe en hydrogel (dite « couche externe »).
Le microcompartiment selon l'invention est une structure tridimensionnelle comprenant donc au moins une couche interne de cellules. Ces cellules sont des cellules humaines, vivantes, en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques. Cette couche de cellules est organisée en trois dimensions dans le microcompartiment.
Les cellules humaines en cours de différenciation cardiaques présentes dans le microcompartiment sont des cellules exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5. Ces gènes sont spécifiques des cellules cardiaques en cours de différenciation. Préférentiellement les cellules humaines en cours de différenciation cardiaques présentes dans le microcompartiment expriment au moins deux de ces gènes. Selon une variante, les cellules humaines en cours de différenciation cardiaques présentes dans le microcompartiment expriment tous ces gènes.
La couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, a une épaisseur variable. Au sein du microcompartiment, la couche interne de cellules humaines et la ou les lumière(s) forment ensemble un objet cellulaire en trois dimensions. Si on mesure la plus petite et la plus grande épaisseur de la couche interne de cellules le long d'un segment passant par le centre géométrique de cet objet cellulaire (représenté 22 sur les figures la, 2a et 3a), le ratio entre la plus grande épaisseur et la plus petite épaisseur est supérieur ou égale à 2, préférentiellement supérieur ou égale à 5. Les épaisseurs de couche interne sont mesurées le long du segment passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire :
- a. entre :
* l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire, et
* l'interface de la couche interne et d'une lumière, et/ou
- b. entre :
* l'interface de la couche interne et d'une lumière, et
* l'interface de la couche interne et d'une autre lumière.
Les figures 1, 2 et 3 représentent des exemples de microcompartiments cellulaires 10 selon l'invention, avec une couche externe d'hydrogel 12, une couche de solution aqueuse isotonique 14, une ou plusieurs lumière(s) interne(s) 18, 18-1, 18-2, une couche de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque 16 avec une plus grande épaisseur t2 et une plus petite épaisseur tl (les épaisseurs étant mesurées le long d'un segment 22 passant par le centre géométrique de cet objet cellulaire formé par la couche 16 et la ou les lumières 18, 18-1, 18-2) , le ratio t2/tl étant bien supérieur à 2.
Sur la figure 1, il n'y a qu'une lumière 18 et par conséquent les épaisseurs de couche interne sont mesurées le long d'un segment 22 passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire formé par la couche 16 et la lumière 18, entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et l'interface de la couche interne et de la lumière 18.
Sur les figures 2 et 3, il y a deux lumières 18-1 et 18-2 et par conséquent les épaisseurs de couche interne sont mesurées le long d'un segment 22 passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire formé par la couche 16 et les lumières 181- 18-2 :
- entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et l'interface de la couche interne et de la lumière 18-1, et
- entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et l'interface de la couche interne et de la lumière 18-2, et
- entre l'interface de la couche interne et de la lumière 18-1 et l'interface de la couche interne et de la lumière 18-2.
Le nombre de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques de la couche interne est préférentiellement compris entre 1 et 100 000 cellules, encore plus préférentiellement entre 50 et 50000 cellules, et notamment entre 500 et 25 000 cellules.
Les cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques de la couche interne ont préférentiellement été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes humaines, ou éventuellement à partir de cellules humaines non pluripotentes dont le profil transcriptionnel a été modifié artificiellement pour rejoindre celui de progéniteurs cardiaques ou de cellules cardiaques, typiquement par expression forcée de facteurs de transcriptions spécifiques du phénotype cellulaire cible. Préférentiellement, les cellules humaines de la couche interne ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes humaines après mise en contact avec une solution capable d'initier la différenciation desdites cellules souches.
La couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique contient préférentiellement des séquences peptidiques ou peptidomimétiques capables de se lier aux intégrines. Par solution aqueuse isotonique on entend une solution aqueuse présentant une osmolarité comprise entre 200 et 400 mOsm/L. Cette couche est située entre la couche interne de cellules et la couche externe en hydrogel. La couche intermédiaire peut être constituée d'éléments qui ont été ajoutés lors de la fabrication du microcompartiment et/ou d'éléments ajoutés dans le microcompartiment et/ou d'éléments sécrétés ou induits par les autres constituants du microcompartiment.
La couche intermédiaire peut notamment comprendre ou être constituée par une matrice extracellulaire et/ou un milieu de culture. Si elle comprend de la matrice extracellulaire, il peut s'agir de matrice extracellulaire sécrétée par des cellules de la couche interne et/ou par de la matrice extracellulaire ajoutée au moment de la préparation/fabrication du microcompartiment.
La couche intermédiaire comprend préférentiellement un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture des cellules en cours de différenciation cardiaque. Préférentiellement, la couche intermédiaire comprend des protéines structurelles, telles que du collagène, des laminines, de l'entactine, de la vitronectine, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Selon une variante, la couche intermédiaire peut consister en ou comprendre du Matrigel® et/ou de la Geltrex® et/ou une matrice type hydrogel d'origine végétale comme des alginates modifiés ou d'origine synthétique ou de copolymère de poly(N-isopropylacrylamide) et de poly(ethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®.
Selon une variante, la couche intermédiaire peut former un gel.
Au niveau de la surface de la couche intermédiaire en contact avec la couche interne de cellules humaines en cours de différenciation, la couche intermédiaire peut éventuellement contenir une ou plusieurs cellules.
L'épaisseur de la couche intermédiaire (représentée si sur les figures 1 et 2) est préférentiellement comprise entre 30 nm et 300 pm, encore plus préférentiellement entre 30 nm et 50 pm.
La présence de la couche intermédiaire favorise la structuration selon l'invention des éléments dans le microcompartiment.
Le microcompartiment et la couche interne de cellules au sein du microcompartiment selon l'invention sont creux. Le microcompartiment selon l'invention comprend en effet toujours au moins une lumière interne ou lumen qui constitue la partie creuse du microcompartiment. La lumière contient un liquide, notamment un milieu de culture (tel que par exemple qu'un milieu basal RPMI avec un supplément en B27) et/ou un liquide sécrété par les cellules de la couche interne. Avantageusement la présence de cette partie creuse permet aux cellules de disposer d'un petit volume diffusif dont elles peuvent contrôler la composition, favorisant une communication cellulaire dite autocrine/paracrine qui est à son tour favorable à la différenciation cardiaque.
Selon un mode de réalisation, tel que représenté sur les figures 2 et 3, le microcompartiment selon l'invention peut comprendre plusieurs lumières, au moins deux lumières. Cette situation présente le même avantage vis-à-vis des signaux autocrine et paracrine que la présence d'une seule lumière et augmente la capacité des cellules de contrôler la composition de la solution aqueuse de la lumière car le ratio cellule par volume/cellules est alors géométriquement plus faible. Par ailleurs la stabilisation d'une telle configuration démontre la protection mécanique offerte par le microcompartiment.
La ou les lumière(s) représente(nt) préférentiellement entre 10% et 90% du volume du microcompartiment selon l'invention.
Le microcompartiment comprend une couche externe en hydrogel. Préférentiellement l'hydrogel utilisé est biocompatible, c'est-à-dire qu'il n'est pas toxique pour les cellules. La couche d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Selon un mode de réalisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Elle peut être constituée exclusivement d'alginate. L'alginate peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de |3-D-mannuronate, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa et une concentration totale comprise entre 0,5 et 5% en masse.
La couche d'hydrogel permet de protéger les cellules du milieu extérieur, de limiter la prolifération incontrôlée des cellules, et leur différenciation contrôlée en cellules en cours de différenciation cardiaques puis en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes.
La couche externe est close ou partiellement close. Le microcompartiment est donc clos ou partiellement clos. Préférentiellement le microcompartiment est clos.
Le microcompartiment selon l'invention peut se présenter sous toute forme en trois dimensions, c'est-à-dire qu'il peut avoir la forme de tout objet de l'espace. Préférentiellement le microcompartiment selon l'invention se présente sous une forme sphérique ou allongée. Il peut en particulier se présenter sous la forme d'un sphéroïde creux, d'un ovoïde creux, d'un cylindre creux ou d'une sphère creuse.
C'est la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la couche d'hydrogel, qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment selon l'invention. Préférentiellement le diamètre la plus petite dimension du microcompartiment selon l'invention est comprise entre 10 pm et
I mm, préférentiellement entre 100 pm et 700 pm. Elle peut être comprise entre 10 pm et 600 pm, notamment entre 10pm et 500 pm. Cette plus petite dimension est importante pour la survie du tissu cardiaque en trois dimensions qui sera obtenu à partir du microcompartiment selon l'invention, en particulier pour favoriser la survie des cellules cardiaques au sein du tissu cardiaque et optimiser la réorganisation ainsi que la vascularisation du tissu cardiaque après implantation dans le cœur.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 10pm, plus préférentiellement comprise entre 10pm et lm, encore plus préférentiellement entre 10pm et 50cm. Selon un mode de réalisation la plus grande dimension est compatible avec la taille de l'organe et est donc inférieure à 30 cm (entre 10pm et 30cm).
Le microcompartiment selon l'invention est particulièrement utile pour obtenir un tissu cardiaque compacté en trois dimensions, constitué de cellules cardiaques humaines différenciées.
Le microcompartiment selon l'invention peut être éventuellement congelé pour être stocké.
II devra ensuite être décongelé pour poursuivre la maturation des cellules cardiaques et obtenir un tissu cardiaque compacté en trois dimensions.
L'invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble. Aussi l'invention vise aussi une série de microcompartiments cellulaires tels que décrits précédemment comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires selon l'invention. Préférentiellement la série de microcompartiments selon l'invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention a pour objet une série de microcompartiments cellulaires tels que décrits précédemment dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur. Procédé d'obtention d'un microcom selon l'invention
L'invention vise également un procédé de préparation d'un microcompartiment selon l'invention.
En particulier le procédé consiste à réaliser des microcompartiments cellulaires comprenant une capsule d'hydrogel entourant :
- des cellules souches ou des cellules progénitrices capables de se différencier en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes, ou
- des cellules différenciées destinées à subir dans la capsule une reprogrammation dans la capsule de façon à ce qu'elles deviennent des cellules souches pluripotentes induites capables de se différencier en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes.
Le procédé de préparation d'un microcompartiment selon l'invention, peut comprendre au moins la mise en œuvre des étapes qui consistent à :
- produire un microcompartiment cellulaire comprenant, à l'intérieur d'une capsule en hydrogel :
* des éléments de solution aqueuse isotonique, préférentiellement de la matrice extracellulaire, sécrétés par les cellules ou apportés par l'opérateur, préférentiellement au moins une partie de la solution aqueuse isotonique étant apportée en plus de la matrice extracellulaire naturellement sécrétée par les cellules,
* des cellules aptes à se différencier en cellules cardiaques,
- induire la différenciation cellulaire au sein du microcompartiment cellulaire, de manière à obtenir au moins une couche creuse en trois dimensions de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5, et éventuellement d'autres cellules.
Avantageusement, l'encapsulation totale ou partielle dans l'hydrogel et l'apport de matrice extracellulaire combinés, est un moyen adapté pour permettre la différenciation de cellules pluripotentes humaines vers le muscle cardiaque en cumulant plusieurs avantages, notamment : favoriser une distribution homogène des cellules du lot au sein des microcompartiments, ii) protection mécanique face aux stress hydrodynamique infligé par le bioréacteur et limitation des fusions non désirées de microcompartiments, iii) organisation d'un microenvironnement conservant localement les éléments de matrice extracellulaire favorisant une bonne survie et une bonne organisation cellulaire, iv) maintien d'un lumen favorisant les voies autocrines et paracrines pendant la différenciation.
Tout procédé de production de microcompartiments cellulaires contenant à l'intérieur d'une capsule d'hydrogel au moins des cellules humaines en cours de différenciation cardiaque et une solution aqueuse isotonique et éventuellement l'ajout d'autres cellules, par exemple de soutien peut être utilisé. Une méthode adaptée est notamment décrite dans la demande WO2018/096277. Préférentiellement l'encapsulation est réalisée par co-injection de trois solutions :
- une solution d'hydrogel,
- une solution intermédiaire isotonique telle que par exemple une solution de sorbitol,
- une solution comprenant les cellules à encapsuler, du milieu de culture et optionnellement mais préférentiellement de la matrice extracellulaire, de manière concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange des trois solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes, lesdites gouttes étant collectées dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la partie interne de chaque goutte étant constituée par la solution comprenant les cellules encapsulées, du milieu de culture et la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation l'encapsulation est réalisée avec un dispositif capable de générer des capsules d'hydrogel à l'aide d'une puce microfluidique. Par exemple le dispositif peut comprendre des pousses seringues pour plusieurs solutions injectées de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes collectées ensuite dans un bain de calcium. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, trois solutions sont chargées sur trois pousse-seringues : - une solution d'hydrogel, par exemple d'alginate,
- une solution intermédiaire isotonique telle que par exemple une solution de sorbitol,
- la solution issue de l'étape b) comprenant des iPSC, du milieu de culture et éventuellement mais préférentiellement de la matrice extracellulaire.
Les trois solutions sont co-injectées (injectées simultanément) de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique ou puce microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche extérieure est la solution d'hydrogel et le cœur de la solution comprenant les cellules à encapsuler ; Ces gouttes sont collectées dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d'alginate pour former la coque.
[001] Pour améliorer la mono-dispersité des microcompartiments cellulaires, la solution d'hydrogel est chargée avec un courant continu. Un anneau à la masse est disposé après la pointe dans le plan perpendiculaire à l'axe du jet sortant de l'injecteur microfluidique (puce de coextrusion) pour générer le champ électrique.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de production d'un microcompartiment cellulaire du procédé de préparation selon l'invention, comprend les étapes consistant à :
- incuber des cellules souches pluripotentes dans un milieu de culture, préférentiellement un milieu de culture contenant les facteurs de croissance FGF2 et TGF ou des molécules reproduisant son action sur la cellule, un inhibiteur de la voie Rho kinase ou une molécule reproduisant son action sur la cellule, notamment en limitant la mort cellulaire.
- éventuellement mélanger les cellules souches pluripotentes avec une solution aqueuse isotonique, préférentiellement une matrice extracellulaire,
- encapsuler le mélange dans une couche d'hydrogel.
Les cellules encapsulées pour la préparation de microcompartiments selon l'invention sont préférentiellement choisies parmi :
- des cellules aptes à se différencier au moins en cellules cardiaques, ces cellules étant :
* soit des cellules souches capables de se différencier en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes, préférentiellement des cellules souches embryonnaires ou des cellules souches pluripotentes induites, très préférentiellement des cellules souches pluripotentes induites, et/ou, * soit des cellules progénitrices capables, de se différencier en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes,
- et/ou des cellules différenciées capables de subir une reprogrammation de façon à ce qu'elles deviennent des cellules souches pluripotentes induites capables de se différencier en cellules cardiaques, au moins en cardiomyocytes.
Les cellules encapsulées peuvent être immuno-compatibles avec la personne destinée à recevoir les cellules cardiaques différenciées obtenues à partir du microcompartiment selon l'invention, pour éviter tout risque de rejet. Dans un mode de réalisation, les cellules encapsulées ont été préalablement prélevées chez la personne dans laquelle les tissus cardiaques compactés obtenus à partir des microcompartiments selon l'invention seront implantés.
La différenciation en cellules en cours de différenciation cardiaque contenues dans le microcompartiment selon l'invention, peut être réalisée par tout procédé adapté. Il peut notamment s'agir d'une méthode connue comme un des protocoles répertoriés dans (Dunn, KK & Palecek, SP Engineering fabrication évolutive de cardiomyocytes dérivés de cellules souches de haute qualité pour la réparation des tissus cardiaques. Front. Med. 5, (2018)).
Le protocole qui est actuellement l'un des plus courants est décrit en détail dans (Burridge, P. W. et al. Génération chimiquement définie de cardiomyocytes humains. Nat. Methods 11, 855-860 (2014)).
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape d'induction de la différenciation cellulaire du procédé selon l'invention, comprend une étape consistant à introduire des capsules contenant des cellules souches humaines aptes à être différenciées en cellules cardiaques humaines, dans un milieu de culture contenant un activateur de voie WNT (tel que CHIR99021) pendant 12 h à 72 h, plus préférentiellement 12 à 48 heures.
En suivant, le procédé peut comprendre une étape qui consiste à incuber les microcompartiments dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de la voie WNT. Préférentiellement, cette étape est réalisée entre 0 et trois jours après la fin de l'étape d'induction de la différenciation (ajout de l'activateur de la voie WNT), préférentiellement entre 12 et 72 heures, notamment entre 24 et 48h. Selon un mode de réalisation préféré, cette étape consiste à incuber les capsules dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de la voie WNT, préférentiellement pendant 12 heures à 48 heures, notamment entre 24 à 48h.
Un mode de réalisation particulier est le suivant :
(a) incuber des cellules souches pluripotentes humaines contenant des capsules dans un milieu de culture contenant un activateur de voie WNT pendant 12 h à 72 h;
(b) 0 à 48 heures après l'étape (a) incuber les capsules dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de voie WNT pendant 12 heures à 48 heures;
Préférentiellement, le milieu de culture est RPMI avec supplément B27 sans insuline (pendant les 7 premiers jours de différenciation) et avec insuline (à partir du jour de différenciation 7).
Préférentiellement les microcompartiments selon l'invention, contenant des cellules en cours de différenciation cardiaques, sont obtenus entre 2 à 7 jours après le début de l'induction de la différenciation, préférentiellement entre 3 et 7 jours après le début de l'induction de la différenciation, encore plus préférentiellement entre 4 et 6 jours après le début de la différenciation. Préférentiellement, le microcompartiment selon l'invention apparaît au moment de l'ajout de l'inhibiteur de la voie WNT ou après.
La lumière est générée au moment de la formation de la couche de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque en 3 dimensions, par les cellules qui se multiplient et se développent. La lumière peut contenir un liquide et en particulier le milieu de culture utilisé pour la mise en oeuvre du procédé.
Selon un mode de réalisation, les cellules souches de départ s'organisent en une couche de cellules souches en trois dimensions autour d'une lumière dans le microcompartiment, puis au cours de la différenciation cette lumière disparaît, et une seconde lumière apparaît pour former le microcompartiment selon l'invention.
Le procédé est préférentiellement mis en œuvre dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur, avec une série de microcompartiments, encore plus préférentiellement dans un milieu de culture adapté et au moins partiellement convectif.
Le procédé selon l'invention, peut optionnellement également comprendre : - une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d'amas de cellules ; l'élimination de la capsule peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d'hydrogel.
La réencapsulation est un moyen adapté pour : i) optimiser la standardisation de la taille et l'homogénéité des tissus cardiaques compactés qui seront obtenus ensuite, ii) ii) permettre une augmentation de l'amplification cellulaire obtenue depuis l'étape pluripotente, et donc un rendement plus élevé.
À tout moment, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à vérifier le phénotype des cellules contenues dans le microcompartiment. Cette vérification peut être réalisée en identifiant l'expression par au moins une partie des cellules contenues dans le microcompartiment, d'au moins un des gènes suivants PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, GATA4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de congélation des microcompartiments selon l'invention avant leur utilisation pour poursuivre une différenciation en cellules cardiaques différenciées et obtenir des tissus cardiaques compactés. La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre -190°C et - 80°C. La décongélation peut être réalisée dans un bain d'eau tiède (37 degrés préférentiellement) pour que les cellules décongèlent assez rapidement. Les microcompartiments selon l'invention avant leur utilisation pour poursuivre une différenciation en cellules cardiaques différenciées et obtenir des tissus cardiaques compactés, peuvent être maintenus à plus de 4°C pendant une durée limitée avant leur utilisation, préférentiellement entre 4°C et 38°C.
Les microcompartiment selon l'invention peuvent également être utilisés pour poursuivre une différenciation en cellules cardiaques différenciées et obtenir des tissus cardiaques compactés, directement après mise en oeuvre du procédé selon l'invention, sans stockage et sans congélation.
Procédé d'obtention d'un tissu cardiaque compacté
Après l'obtention d'un microcompartiment selon l'invention contenant des cellules humaines en cours différenciation, le procédé peut se poursuivre pour obtenir un objet en trois dimensions sous forme d'un tissu compacté.
L'objet compacté apparaît généralement entre 2 et 10 jours après l'ajout de l'inhibiteur de la voie WNT, notamment entre 5 et 7 jours. En effet, l'ajout de l'inhibiteur est préliminaire à la compaction des cellules qui continuent de se différencier en cellules cardiaques.
Ainsi l'objet compacté apparaît généralement entre 7 et 14 jours après l'initiation de la différenciation.
A la fin de la compaction tout ou partie des lumières ont disparu partiellement ou totalement (ont été éliminées partiellement ou totalement par le phénomène de compaction) et les cellules comprennent au moins en partie des cellules humaines cardiaques différenciées, préférentiellement au moins des cardiomyocytes.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape d'amplification des cellules cardiaques dans le microcompartiment, et optionnellement une ou plusieurs réencapsulation.
Le tissu cardiaque compacté obtenu peut être maintenu dans la capsule d'hydrogel. Préférentiellement elle est toujours entourée d'une solution aqueuse isotonique, préférentiellement une matrice extracellulaire. Une capsule contenant un tissu cardiaque compacté en trois dimensions et une couche de solution aqueuse isotonique est représenté sur les figures 4.
Le tissu compacté est préférentiellement stocké dans une capsule avant utilisation. Pour son stockage, la capsule contenant le tissu cardiaque compacté peut être congelée avant élimination de la couche d'hydrogel de la capsule. Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de congélation des capsules contenant les tissus cardiaques compactés selon l'invention avant leur utilisation. La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre -190°C et -80°C. Les capsules contenant les tissus cardiaques compactés selon l'invention avant leur utilisation comme greffon dans le cœur, peuvent être décongelées dans un bain d'eau tiède (37 degrés préférentiellement) pour que les cellules du tissu décongèlent assez rapidement. Les tissus cardiaques compactés selon l'invention, peuvent être maintenus à plus de 4°C pendant une durée limitée avant leur utilisation, préférentiellement entre 4°C et 38°C
Après obtention du tissu cardiaque compacté, à tout moment avant l'implantation dans le cœur, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à vérifier le phénotype des cellules contenues dans la capsule. Cette vérification peut être réalisée en identifiant l'expression de la troponine C cardiaque par les cellules cardiaques formant le tissu compacté.
Préférentiellement, avant utilisation, la couche d'hydrogel de la capsule contenant le tissu cardiaque compacté selon l'invention est éliminée. L'élimination de la capsule peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser.
L'élimination de l'hydrogel est préférentiellement totale, le tissu cardiaque compacté selon l'invention est dépourvu d'hydrogel lorsqu'il est utilisé comme greffon, implanté dans un cœur.
Tissu cardiaque compacté en trois dimensions
L'invention a également pour objet le tissu cardiaque obtenu selon le procédé tel que décrit précédemment. L'invention a par conséquent pour objet un tissu compacté de cellules humaines cardiaques exprimant la troponine C cardiaque et préférentiellement l'alpha- actinine, obtenu à partir d'au moins un microcompartiment cellulaire selon l'invention.
En particulier, l'invention a pour objet un tissu compacté de cellules humaines cardiaques exprimant la troponine C cardiaque, obtenu à partir d'au moins un microcompartiment cellulaire selon l'invention, par un procédé comprenant la compaction (compaction dite compaction secondaire) de la couche de cellules humaines par disparition totale ou partielle de la ou des lumière(s) dudit microcompartiment. Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques est obtenu par un procédé tel que décrit précédemment.
Le tissu selon l'invention est donc un tissu humain comprenant au moins des cellules cardiaques différenciées exprimant la troponine C cardiaque et préférentiellement l'alpha- actinine. Le tissu compacté selon l'invention peut également contenir d'autres types cellulaires.
Avantageusement, le tissu cardiaque selon l'invention présente un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, d'au moins 90%. Ce taux important de cellules exprimant la troponine C cardiaque est avantageux pour envisager des utilisations des tissus cardiaques selon l'invention en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant l'alpha-actinine d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut être supérieur à 90%. Ce taux important de cellules exprimant l'alpha-actinine est avantageux pour envisager des utilisations des tissus cardiaques selon l'invention en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention présente un taux de cellules exprimant la troponine C et l'alpha-actinine d'au moins 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules constituant le tissu compacté, encore plus préférentiellement d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 75%, d'au moins 80%, et ce taux peut être supérieur à 90%. Ce taux important de cellules exprimant à la fois la troponine C et l'alpha-actinine est avantageux pour envisager des utilisations des tissus cardiaques selon l'invention en thérapie cellulaire.
Préférentiellement, ce tissu compacté est contractile et présente une fréquence de contraction spontanée inférieure à 4 Hz, préférentiellement inférieure à 2 Hz, encore plus préférentiellement inférieure à 1,7Hz, en particulier inférieure à 1 Hz, et notamment inférieure à 0,5Hz et pouvant être inférieure à 0,25 Hz. Cette fréquence de contraction du tissu est basse ce qui présente un grand avantage pour son implantation dans le cœur. En effet une telle fréquence permet d'éviter une arythmie au moment de la greffe du tissu compacté selon l'invention dans le cœur à traiter.
La fréquence cardiaque moyenne d'un adulte humain se situe entre 60 et 100 battements par minute (1 à 1,7 Hz). La faible fréquence de contraction des tissus compactés cardiaques selon l'invention réduit le risque d'arythmie lors d'une greffe des tissus ou de cellules obtenues à partir de ces tissus. Selon un mode de réalisation, avec une fréquence de battement spontanée du tissu selon l'invention inférieure à la fréquence cardiaque du patient (receveur), ce risque d'arythmie est encore diminué.
La réduction de la fréquence des battements spontanés est associée à la maturité des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines, l'environnement de culture 3D améliorant la maturation des cardiomyocytes. Selon l'invention l'encapsulation permet encore de réduire la fréquence contractile du tissu cardiaque compacté. La figure 5 montre que pour une population cellulaire de départ donnée, les cardiomyocytes différenciés au sein d'un microcompartiment / capsule (à partir de cellules souches pluripotentes humaines encapsulée) ont un rythme de battement spontané plus lent que les cardiomyocytes différenciés avec le même protocole (et du même lot initial de cellules souches pluripotentes humaines) mais en culture en suspension libre. Ainsi, la différenciation en cardiomyocytes à partir de cellules souches encapsulées diminue la fréquence contractile spontanée.
Les cellules souches pluripotentes humaines sécrètent des molécules de signalisation au cours du processus de différenciation cardiaque, qui génèrent un microenvironnement paracrine spécifique nécessaire au succès de la différenciation (Kempf, H. et al. Bulk cell density and Wnt/TGFbeta signalling regulate mesendodermal patterning of human pluripotent stem cells. Nature Communications 7, (2016)). La présence de la capsule aide à augmenter et à maintenir une concentration locale de ces facteurs paracrines, ce qui améliore le phénotype de différenciation, entraînant la réduction de la fréquence de battement spontané.
Le tissu compacté cardiaque selon l'invention peut rester contractile spontanément pendant plusieurs mois. Ainsi le produit est stable dans le temps.
Selon une variante, la différenciation cardiaque au sein du microcompartiment peut-être mise en œuvre et/ou combinée avec d'autres techniques, telles que la stimulation électrique et les interventions métaboliques ou hormonales. La combinaison avec de telles techniques peuvent permettre de réduire encore la fréquence des battements spontanés du tissu cardiaque compacté selon l'invention avant la greffe.
Le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention peut être encapsulé totalement ou partiellement dans une couche externe d'hydrogel. La capsule d'hydrogel peut être celle d'origine du microcompartiment de cellules humaines en cours de différenciation cardiaque, ou il peut s'agir d'une nouvelle couche d'hydrogel s'il y a eu élimination de la couche d'hydrogel initiale, puis réencapsulation à tout stade du procédé.
L'encapsulation du tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention permet de protéger le tissu, de maintenir la fréquence de contraction spontanée inférieure à 4Hz, préférentiellement inférieure à 2 Hz, encore plus préférentiellement inférieure à 1 Hz, et notamment inférieure à 0,5Hz. Elle peut être inférieure à 0,25 Hz. Le mécanisme selon lequel la fréquence de contraction est limitée peut être lié à la structuration en 3D via i) la mise en continuité électrique des cytoplasmes des cellules cardiaques, ii) et/ou la limitation de la quantité de calcium disponible par cellule dans l'espace intercellulaire des tissus compactés iii) et/ou la résistance mécanique liées à la continuité mécanique des éléments de cytosquelette des cellules cardiaques. L'encapsulation du tissu compacté cardiaque selon l'invention permet également de contrôler la taille du tissu compacté ce qui améliore la rétention, l'intégration et la survie cellulaire lorsqu'il est injecté dans le cœur, notamment en comparaison aux injections de cellules uniques, ce qui augmente l'efficacité de la thérapie cellulaire cardiaque avec les tissus compactés selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention n'est pas encapsulé dans une couche externe en hydrogel. En particulier, la capsule est préférentiellement éliminée avant utilisation afin de permettre aux cellules du tissu compacté de s'implanter au niveau du cœur après une greffe.
Le tissu compacté de cellules cardiaques humaines selon l'invention est préférentiellement entouré totalement ou partiellement d'une couche de solution aqueuse isotonique, telle qu'une matrice extracellulaire. Cette couche de solution aqueuse isotonique est située entre le tissu compacté de cellules cardiaques humaines et la couche d'hydrogel lorsque le tissu compacté cardiaque est encapsulé.
Le tissu compacté cardiaque selon l'invention est en trois dimensions. Il a préférentiellement une forme sphérique ou allongée. Selon un mode de réalisation préféré, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques a la forme d'un sphéroïde, d'un ovoïde, d'un cylindre ou d'une sphère.
Un exemple de tissu compacté selon l'invention est représenté sur les figures 4. Dans cet exemple le tissu compacté selon l'invention est entouré d'une couche de solution aqueuse isotonique et d'une couche externe d'hydrogel.
De façon préférée, il présente un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 10 pm et 1 mm, préférentiellement comprise entre 100 pm et 700 pm. Cette plus petite dimension est importante pour sa survie, en particulier pour favoriser la survie des cellules cardiaques au sein du tissu cardiaque et optimiser la réorganisation ainsi que la vascularisation du tissu cardiaque après implantation dans le cœur.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 10pm, plus préférentiellement comprise entre 10pm et lm, encore plus préférentiellement entre 10pm et 50cm. Selon un mode de réalisation la plus grande dimension est compatible avec la taille de l'organe et est donc inférieure à 30 cm (entre 10pm et 30cm).
L'encapsulation d'un nombre contrôlé de cellules souches et/ou la ré-encapsulation, permet de contrôler la taille et la forme désirée des tissus cardiaques obtenus. Ainsi, la taille des tissus cardiaques selon l'invention peut varier en fonction de l'utilisation thérapeutique envisagée.
Le tissu compacté de cellules cardiaques humaines selon l'invention peut être congelé, pour favoriser son stockage.
Avantageusement, l'invention permet la production d'un nombre important de tissus cardiaques humains de qualité en protégeant les unités tissulaires tout au long de leur production par différenciation de cellules pluripotentes en cellules cardiaques.
Les figures 7, 8 et 9 montrent que pour une population cellulaire de départ donnée, les tissus obtenus au sein d'un microcompartiment / capsule en passant par une phase en cours de différenciation avec la présence d'au moins une lumière, puis une compaction secondaire, présente un taux de cellules exprimant la troponine C beaucoup plus important, en comparaison avec des tissus différenciés avec le même protocole (et du même lot initial de cellules souches pluripotentes humaines) mais en culture en suspension libre. Ainsi, la différenciation en cardiomyocytes dans des microcompartiment et/ou par un procédé comprenant une compaction secondaire permet d'augmenter la qualité des tissus cardiaques et donc améliore leur possibilité d'utilisation en thérapie cellulaire.
Le tissu compacté de cellules cardiaques selon l'invention peut être dissocié en cellules. La dissociation peut être réalisée selon des méthodes classiques connues de l'homme du métier notamment à l'aide d'une solution enzymatique permettant de séparer les cellules. Les enzymes utilisées peuvent par exemple être choisies parmi la trypsine, la collagénase, l'accutase et leurs mélanges. Les cellules dissociées sont préférentiellement utilisées en suspension ou intégrées dans un gel comme par exemple un gel de collagène ou dans un patch.
Utilisations du tissu compacté de cellules cardiaques humaines selon l'invention
Le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention peut être utilisé en tant que tel ou bien pour produire une suspension de cellules cardiaques.
En effet, le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention est particulièrement utile pour la production d'une suspension de cellules (cellules greffons) implantables dans le cœur d'un être humain en particulier pour le traitement de pathologies cardiaques. La forme, la taille et la constitution du tissu compacté selon l'invention favorisent une différenciation homogène avec un rendement amélioré des cellules cardiaques au sein du tissu compacté selon l'invention, qui peut être secondairement dissocié avant implantation dans le cœur.
Le tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'invention est également particulièrement utile pour son utilisation en tant que tel comme greffon implantable dans le cœur d'un être humain en particulier pour le traitement de pathologies cardiaques. La forme, la taille et la constitution du tissu compacté selon l'invention permettent la survie des cellules cardiaques au sein du tissu compacté selon l'invention, avant implantation et la réussite de l'implantation, de la réorganisation et de la vascularisation du greffon une fois implanté dans le cœur.
Un autre objet de l'invention est donc le tissu compacté de cellules cardiaques humaines pour son utilisation, en tant que tel ou après dissociation sous forme d'une suspension de cellules, en thérapie, notamment en thérapie cellulaire, comme médicament, en particulier son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie cardiaque, notamment chez un patient en ayant besoin, et préférentiellement dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie ischémique cardiaque. Bien que les cellules dissociées obtenues à partir des tissus selon l'invention puissent être utilisées, elles présentent une fréquence de contraction spontanée plus élevée que les tissus cardiaques compactés. La vitesse de battement spontanée lente des cardiomyocytes différenciés au sein de la capsule n'est pas maintenue lorsque les cellules sont dissociées et cultivées dans des conditions 2D (figure 6).
Par traitement on entend un traitement préventif, curatif ou symptomatique, c'est-à-dire tout acte destiné à améliorer la vue d'une personne de façon temporaire ou définitive, et préférentiellement également à éradiquer la maladie et/ou arrêter ou retarder la progression de la maladie et/ou favoriser la régression de la maladie.
En effet les tissus compactés de cellules humaines cardiaques selon l'invention peuvent être utilisés pour le traitement de maladies cardiaques chez l'homme, en particulier de maladies ayant entrainer une ischémie d'au moins une partie du cœur, comme un infarctus par exemple, pour remplacer des zones lésées.
Le traitement consiste à implanter, à greffer les tissus compactés selon l'invention ou les cellules obtenues par leur dissociation dans le cœur, au niveau des ventricules du cœurs, en particulier le ventricule gauche, ou de les intégrer à un patch positionné sur lesdits ventricules, idéalement entre le péricarde viscéral et le tissu musculaire du ventricule, ou ce qu'il en reste en situation pathologique. Un dispositif d'implantation chirurgical adapté à une implantation dans le cœur est très préférentiellement utilisé. Il peut s'agir notamment d'aiguilles, de canules ou autre dispositif permettant de déposer les tissus compactés selon l'invention ou les cellules obtenues par dissociation des tissus compactés selon l'invention, dans le cœur comme par exemple ceux utilisés pour l'implantation de stents dans les artères ou de micro implants chirurgicaux.
Selon un exemple de mode de réalisation, l'implantation peut être réalisée par injection myocardique directe, notamment par sternotomie ou avec un dispositif à base de cathéter : les tissus compactés cardiaques selon l'invention ou les cellules obtenues à partir de ces tissus (avec ou sans l'ajout d'autres types de cellules) sont injectés dans la paroi médiane du ventricule gauche du patient à un ou plusieurs endroits.
Selon un autre exemple de mode de réalisation, l'implantation peut être réalisée à l'aide d'un patch épicardique. Les tissus compactés cardiaques selon l'invention ou les cellules obtenues à partir de ces tissus (avec ou sans l'ajout d'autres types de cellules) sont utilisés dans la formation de patchs. Ces patchs peuvent ensuite être placés sur la surface épicardique du ventricule gauche du patient, soit par sternotomie ou par une intervention chirurgicale impliquant une incision et une injection du patch dans la cavité thoracique.
Dans un mode de réalisation, lors d'une même implantation, entre 1 et 1000000 unités de tissu compacté selon l'invention sont implantées.
Dans un mode de réalisation, lors d'une même implantation, entre 104 et 1010 cellules obtenues par dissociation d'unités de tissu compacté selon l'invention sont implantées.
Si nécessaire, il est possible de réaliser plusieurs implantations simultanées ou successives dans différentes zones du cœur, en particulier dans le cas où plusieurs zones séparées sont touchées ou si la zone sur laquelle il faut réaliser la greffe, est trop étendue pour ne réaliser une greffe qu'à un endroit.
De même, sur une même zone, si une seule greffe ne suffit pas, plusieurs implantations peuvent être de nouveau réalisées sur la même zone, dans un laps de temps plus ou moins important.
L'implantation de tissus cardiaques compactés selon l'invention permet aux patients atteints de maladies cardiaques, et en particulier de maladies ischémiques cardiaques d'améliorer cliniquement la fonction cardiaque, notamment :
- d'augmenter les performances contractiles des cellules du cœur (qui peut être mesurée par exemple par la fraction d'éjection du ventricule gauche) et/ou
- d'augmenter l'épaisseur de la paroi ventriculaire.
Ainsi, avantageusement, l'invention permet d'améliorer la santé globale et la qualité de vie du patient, tout en limitant le risque d'arythmies induites par la greffe.
Selon un autre aspect, les tissus compactés selon l'invention peuvent être utiles comme modèle de tissu cardiaque en particulier :
- pour tester des médicaments et candidats médicaments pour leur efficacité sur des pathologies cardiaques et/ou leur effet sur le cœur, et/ou
- pour tester la toxicité cardiaque de substances, composés, compositions ou médicaments. Ainsi l'invention a également pour objet ces utilisations.
L'invention est à présent illustrée par des exemples.
Plusieurs exemples de microcompartiments selon l'invention sont présentés sur les figures 1 à 3, et des exemples de tissus compactés sont présentés sur les figures 4.
L'image de la figure lb une image de microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Elle a été prise 5 jours après le début de la différenciation (8 jours après l'encapsulation initiale des cellules souches). Les étapes utilisées pour obtenir le microcompartiment représenté sur cette figure sont les suivantes :
1. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme ont été encapsulées dans un hydrogel d'alginate (sans ajout de matrice extracellulaire au moment de l'encapsulation).
2. Les cellules souches encapsulées ont été cultivées dans des milieux de culture de cellules souches (mTeSRl) pendant 3 jours.
3. Le 3ème jour, le milieu de culture a été changé du milieu de cellules souches à un milieu de différenciation cardiaque contenant une molécule activant le WNT (CHIR99021). Le milieu est un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec CHIR99021 Ceci est considéré comme le jour de différenciation 0.
4. Le 2ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de différenciation cardiaque sans molécule activant le WNT. Le milieu est un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline
5. Le 3ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de différenciation cardiaque contenant une molécule qui inhibe la voie WNT (WNT-C59 ou IWR1). Le milieu est un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec WNT-C59 ou IWR1.
6. Le 5ème jour de différenciation, la photo de la figures lb a été prise par microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Les images des figures 2b et 2c sont des images de microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Elles ont été prises 5 jours après le début de la différenciation (11 jours après l'encapsulation initiale des cellules souches). Les étapes utilisées pour obtenir le microcompartiment représenté sur ces figures sont les suivantes :
1. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme ont été encapsulées dans un hydrogel d'alginate (avec ajout de matrice extracellulaire au moment de l'encapsulation).
2. Les cellules souches encapsulées ont été cultivées dans des milieux de culture de cellules souches (mTeSRl) pendant 6 jours.
3. Le 6ème jour, le milieu de culture a été changé du milieu de cellules souches à un milieu de différenciation cardiaque contenant une molécule activant le WNT (CHIR99021). Le milieu est un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec CHIR99021 Ceci est considéré comme le jour de différenciation 0.
4. Le 2ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de différenciation cardiaque sans molécule activant le WNT. Le milieu est un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline.
5. Le 3ème jour de différenciation, le milieu a été changé pour un milieu de différenciation cardiaque contenant une molécule qui inhibe la voie WNT (WNT-C59 ou IWR1). Le milieu est un milieu RPMI avec supplément B27 sans insuline avec WNT-C59 ou IWR1.
6. Le 5ème jour de différenciation, les photos des figures 2b et 2c ont été prises par microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x.
Exemple 3
L'image de la figure 3b est une image de microscopie à contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention prise à un grossissement 4x. Elle a été prise 5 jours après le début de la différenciation (11 jours après l'encapsulation initiale des cellules souches). Les étapes utilisées pour obtenir le microcompartiment représenté sur ces figures sont les mêmes que cellules pour obtenir les figures 2b et 2c. La différence réside dans un nombre de cellules souches encapsulées plus important. 4
La figure 4b et 4c sont des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x de tissus compactés selon l'invention dans des microcompartiments. Les tissus compactés ont été obtenus par poursuite de la différenciation au-delà du jour 5 (déjà décrit sur les figures 1, 2 et 3) :
1. Le 7ème jour de différenciation, le milieu de culture a été remplacé par un milieu RPMI avec supplément B27 avec insuline
2. Le milieu a été changé tous les 2-3 jours jusqu'au moment de l'imagerie.
Les images présentées sur les figures 4 concernent des tissus compactés > 14 jours après le début de la différenciation.
Essais corn de battement
La figure 5 montre que pour une population cellulaire de départ donnée, les cardiomyocytes différenciés au sein de la capsule (à partir de hiPSC encapsulé) ont un rythme de battement spontané plus lent que les cardiomyocytes différenciés avec le même protocole (et à partir du même lot initial de hiPSC) mais en suspension libre culture. La fréquence de battement (en Hz) a été obtenue à partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à une fréquence d'au moins 30 images par seconde) sur un microscope de table standard avec un grossissement 4x. Les images sont des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x montrant les cellules souches encapsulées ou libres au début de la différenciation (les plus externes), et les tissus compactés finaux environ 2 semaines après le début de la différenciation (les plus internes). Dans le cas du processus de différenciation encapsulé, une étape intermédiaire avec un microcompartiment selon l'invention est présentée au jour de différenciation 5.
La figure 6 montre que la vitesse lente de battement spontané des cardiomyocytes différenciés dans la capsule est légèrement augmentée après le retrait de la capsule, et très augmentée après que les cellules aient été dissociées et mises en culture 2D. Ainsi, les tissus cardiaques compactés ont une fréquence de battement plus lente que celle des cellules isolées obtenues par dissociation desdits tissus. La fréquence de battement (en Hz) a été obtenue à partir d'une série d'images de microscopie à contraste de phase (à une fréquence d'au moins 30 images par seconde) sur un microscope de table standard avec un grossissement 4x. La fréquence de battement pour les tissus cardiaques compactés selon l'invention encapsulés et puis décapsulés a été prise environ 3 semaines après le début de la différenciation. Environ 3 semaines après la différenciation, une sous-population de tissus compactés selon l'invention a été dissociée et mis dans des conditions de culture 2D pendant 1 semaine avant d'enregistrer la fréquence de battement. Les images sont des images de microscopie à contraste de phase prises à un grossissement 4x. L'image de gauche montre les tissus cardiaques compactés différenciés dans la capsule à partir d'hiPSC encapsulées. L'image de droite montre les cellules obtenues à partir d'un sous-ensemble des tissus cardiaques compactés encapsulés initiaux après avoir été mis dans des conditions de culture 2D.
Essais comparatifs : topologie, amplification cellulaire et nombre de cellules exprimant la troponine C
Des essais comparatifs avec le même procédé de différenciation dans les mêmes conditions expérimentales ont été réalisés pour comparer la différenciation en cellules cardiaques et les tissus obtenus en 3 dimensions avec ou sans encapsulation.
Toutes les cultures ont été réalisées à partir des mêmes cellules initiales prélevées dans une culture 2D. Des agrégats obtenus en 3D sont cultivés (sans ajout de matrice) avec ou sans capsules dans une culture en suspension agitée (sous agitation à 55 rpm). La même densité cellulaire est utilisée au départ (e6 cellules/mL de milieu) au jour 0 de la différenciation (images a) et e)). Le même protocole de différenciation est appliqué dans les deux conditions (avec et sans capsule).
La Figure 7 présente des images de microscopie à contraste de phase prise grossissement 4x. Les trois images de la ligne du haut (a, b et c) sont des images de cellules encapsulées selon l'invention.
Les trois images de la ligne du base (d, e et f) sont des images de cellules non encapsulées.
Les images de la colonne de gauche (a et d) représentent des cellules souches induites en début de différenciation en cellules cardiaques.
Les images de la colonne du milieu (b et e) représentent des cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, 3 à 7 jours après l'initiation de la différenciation. Les images de la colonne de droite (c et f) représentent des tissus cardiaques différenciés.
On constate que la topologie est différente avec et sans encapsulation selon l'invention. Sans encapsulation il n'y a pas de lumen en cours de différenciation, et le tissu cardiaque obtenu en fin de différenciation a une forme très différente. Sur la Figure 8 on constate que le pourcentage de cellules dans les tissus (obtenus tels qu'à la Figure 7c et 7f) exprimant la troponine C cardiaque est supérieur à 90% dans les conditions de l'invention alors qu'il est de 40% pour les tissus cardiaques obtenus dans les mêmes conditions mais sans encapsulation.
Sur la Figure 9 on constate que le taux d'amplification cellulaire entre le début de la différenciation est supérieur à 2 dans les conditions de l'invention alors qu'il est inférieur à 0,5 pour les tissus cardiaques obtenus dans les mêmes conditions mais sans encapsulation.

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Microcompartiment cellulaire (10) en trois dimensions comprenant successivement, organisées autour d'au moins une lumière (18) :
- au moins une couche interne (16) de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques, exprimant au moins un gène choisi parmi PDGFRa, MESP-1, NKX2-5, G AT A4, MEF2C, TBX20, ISL1 et TBX5,
- au moins une couche intermédiaire (14) de solution aqueuse isotonique, et
- au moins une couche externe (12) en hydrogel, la couche interne ayant une épaisseur variable et le ratio entre la plus grande épaisseur (t2) et la plus petite épaisseur (tl) de la couche interne étant supérieur ou égal à 2, la plus petite épaisseur (tl) et la plus grande épaisseur (t2) de la couche interne étant la plus petite et la plus grande des épaisseurs de couche interne mesurées le long d'un segment (22) passant par le centre géométrique de l'objet cellulaire formé par la couche interne et la ou les lumière(s) (18, 18-1, 18-2), entre l'interface de la couche interne et de la couche intermédiaire et l'interface de la couche interne et d'une lumière (18, 18-, 18-2), et/ou entre l'interface de la couche interne et d'une lumière (18-1) et l'interface de la couche interne et d'une autre lumière (18-2).
[Revendication 2] Microcompartiment cellulaire (10) selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ratio entre la plus grande épaisseur (t2) et la plus petite épaisseur (tl) de la couche interne (16) est supérieur ou égal à 5.
[Revendication 3] Microcompartiment cellulaire (10) selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la couche intermédiaire (14) de solution aqueuse isotonique contient des séquences peptidiques ou peptidomimétiques capables de se lier aux intégrines.
[Revendication 4] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux lumières (18-1, 18-2).
[Revendication 5] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules humaines de la couche interne (16) ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes humaines.
[Revendication 6] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il est clos.
[Revendication 7] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe (12) en hydrogel comprend au moins de l'alginate.
[Revendication 8] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il a une forme sphérique ou allongée.
[Revendication 9] Microcompartiment cellulaire (10) selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un sphéroïde creux, d'un ovoïde creux, d'un cylindre creux ou d'une sphère creuse.
[Revendication 10] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 10 pm et 1 mm.
[Revendication 11] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une plus grande dimension comprise entre 10 pm et 50cm.
[Revendication 12] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques de la couche interne (16), est compris entre 1 et 100000 cellules.
[Revendication 13] Microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire en cellules cardiaques de la couche interne, est compris entre 50 et 50 000 cellules.
[Revendication 14] Série de microcompartiments cellulaires (10) comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires selon l'une des précédentes revendications.
[Revendication 15] Série de microcompartiments cellulaires (10) selon la revendication 14, caractérisée en ce que les microcompartiments sont dans un milieu de culture convectif.
[Revendication 16] Série de microcompartiments cellulaires (10) selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que les microcompartiments sont dans le milieu de culture dans une enceinte close.
[Revendication 17] Utilisation d'un microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications 1 à 13, pour obtenir un tissu de cellules cardiaques (20) exprimant la troponine C cardiaque. Utilisation d'un microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications 1 à 13, pour obtenir un tissu de cellules cardiaques (20) exprimant la troponine C cardiaque et l'alpha- actinine.
[Revendication 18] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) exprimant la troponine C cardiaque, obtenu à partir d'au moins un microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications 1 à 13.
[Revendication 19] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) exprimant la troponine C cardiaque et l'alpha actinine, obtenu à partir d'au moins un microcompartiment cellulaire (10) selon l'une des revendications 1 à 13.
[Revendication 20] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques selon l'une des revendications 18 ou 19, obtenu par un procédé comprenant la compaction de la couche interne (16) de cellules humaines par disparition totale ou partielle de la ou des lumière(s) (18, 18-1, 18-2) dudit microcompartiment.
[Revendication 21] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'il est encapsulé totalement ou partiellement dans une couche externe (12) en hydrogel.
[Revendication 22] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 21, caractérisé en ce qu'il est contractile et présentent une fréquence de contraction spontanée inférieure à 2 Hz.
[Revendication 23] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 22, caractérisé en ce qu'il est contractile et présente une fréquence de contraction spontanée inférieure à 0,5 Hz.
[Revendication 24] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 23, caractérisé en ce qu'il présente un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque supérieur à 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules du tissu.
[Revendication 25] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 23, caractérisé en ce qu'il présente un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque et l'alpha-actinine supérieur à 50% en nombre par rapport au nombre total de cellules du tissu.
[Revendication 26] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 24, caractérisé en ce qu'il présente un taux de cellules exprimant la troponine C cardiaque supérieur à 75% en nombre par rapport au nombre total de cellules du tissu.
[Revendication 27] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 26, caractérisé en ce qu'il est congelé.
[Revendication 28] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 18 à 27, pour son utilisation, en tant que tel ou après dissociation en cellules, dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie cardiaque.
[Revendication 29] Tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) pour son utilisation selon la revendication 28, dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie ischémique cardiaque.
[Revendication 30] Utilisation d'un tissu compacté de cellules humaines cardiaques (20) selon l'une des revendications 19 à 29 :
- pour tester des médicaments et candidats médicaments pour leur efficacité sur des pathologies cardiaques et/ou leur effet sur le cœur, et/ou - pour tester la toxicité cardiaque de substances, composés, compositions ou médicaments.
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