FR3124193A3 - Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions ou un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe (12) en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne (14) comprenant au moins :- des éléments de matrice extracellulaire (16), et- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales (18) organisée en trois dimensions autour d’une lumière (20),le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un tel microcompartiment ou ensemble de microcompartiment.
Description
L’invention concerne la culture de cellules souches pluripotentes en trois dimensions.
Art antérieur
La culture de cellules ex vivo est un domaine qui suscite un intérêt croissant. Les cellules cultivées peuvent être de tout type. Il peut s’agir aussi bien de cellules différenciées avec différents phénotypes, de cellules progénitrices que de cellules souches. Une avancée importante dans les techniques de culture cellulaire est l'introduction de systèmes de culture tridimensionnels.
Les cultures en trois dimensions sont en effet avantageusement plus proches des systèmes naturels in vivo, et peuvent être utilisées pour de nombreuses applications en particulier dans le développement de thérapies. Une technologie particulièrement adaptée est celle décrite dans la demande WO2018 /096277 qui consiste en des microcompartiments cellulaires en trois dimensions pour la culture de cellules souches.
Toutefois, malgré leur efficacité, les systèmes de culture 3D existants présentent encore des limites en termes de rendement et de taux de croissance des cellules pour se rapprocher encore plus des taux d’expansion in vivo et de la durée des cycles tout en assurant le maintien d’un phénotype épithélial stable.
L’objectif de l’invention est de proposer une solution de culture cellulaire de souches pluripotentes en trois dimensions répondant à l’ensemble de ces besoins et palliant les inconvénients et limites de l’art antérieur pour une culture encore plus quantitative et toujours au moins aussi qualitative.
En travaillant sur le développement de microcompartiments cellulaires pour la culture de cellules souches pluripotentes en 3D, les inventeurs ont mis au point un système permettant d’augmenter le nombre maximal de cellules pluripotentes contenues dans un microcompartiment tout en conservant un phénotype épithélial organisé autour d’une lumière.
Selon l’invention, le maintien d’un ensemencement faible de cellules permet d’augmenter le facteur d’amplification entre l’ensemencement des cellules dans le microcompartiment et la récolte du microcompartiment contenant les cellules amplifiées. Or, dans les systèmes existants, des microcompartiments comprenant quelques cellules à l’ensemencement (1 à 3 en particulier) meurent ou relance leur croissance avec un taux de latence ce qui nuit au rendement de la culture et augmente la durée nécessaire de culture encapsulée.
Selon l’invention, ces problématiques sont liées en particulier à des microcompartiments de trop petites tailles, et notamment à des microcompartiments dont le volume de la partie interne est trop faible.
Aussi l’invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions avec une couche externe et une partie interne, dont la partie interne a des dimensions suffisamment importantes pour permettre un taux de croissance important et une grande quantité de cellules au moment de la récolte du microcompartiment, en partant d’un faible ensemencement de cellules au départ.
En particulier, l’invention vise un microcompartiment en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , ladite partie interne comprenant au moins :
- des éléments de matrice extracellulaire, et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales organisée en trois dimensions autour d’une lumière,
le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne étant d’au moins 100 µm, préférentiellement au moins 200 µm.
- des éléments de matrice extracellulaire, et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales organisée en trois dimensions autour d’une lumière,
le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne étant d’au moins 100 µm, préférentiellement au moins 200 µm.
Avantageusement un tel agencement permet d’augmenter le nombre maximal de cellules pluripotentes contenues dans un microcompartiment tout en conservant un phénotype épithélial autour d’une lumière (cyste). La taille du microcompartiment selon l’invention est choisi pour permettre la croissance de plusieurs cystes tout en préservant une distance de diffusion compatible avec la physiologie des cellules.
L’invention a également pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions comprenant au moins un microcompartiment cellulaire selon l’invention, préférentiellement en suspension liquide dans un bioréacteur.
Les microcompartiments selon l’invention peuvent être utiles pour différentes applications et notamment dans la prévention et/ou le traitement de pathologies.
Les microcompartiments cellulaires selon l’invention peuvent être obtenus en particulier par la mise en œuvre d’un procédé de préparation spécifique comprenant les étapes suivantes :
- (a) incuber des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
(b) mélanger les cellules souches pluripotentes induites issues de l’étape (a) avec une matrice extracellulaire
- (b) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ;
- (c) cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- (d) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- (e) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu d’inhibiteur de l’apoptose, et
- (f) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
- (a) incuber des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
(b) mélanger les cellules souches pluripotentes induites issues de l’étape (a) avec une matrice extracellulaire
- (b) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ;
- (c) cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- (d) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- (e) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu d’inhibiteur de l’apoptose, et
- (f) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Ce procédé permet d’obtenir des microcompartiments selon l’invention avec au moins deux cystes de cellules souches pluripotentes induites.
D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention et des exemples qui vont suivre.
Brève description des figures
[Description détaillée de l’invention
Définitions
Par « alginate » au sens de l’invention, on entend des polysaccharides linéaires formés à partir de β-D-mannuronate et α-L-guluronate, des sels et des dérivés de ceux-ci.
Par « capsule en hydrogel » ou « microcompartiment en hydrogel » au sens de l’invention, on entend une structure tridimensionnelle formée à partir d’une matrice de chaînes polymères, gonflée par un liquide et préférentiellement de l’eau.
Par cellules « différenciées » au sens de l’invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui ne sont pas différenciées ou des cellules progénitrices qui sont en cours de différenciation.
Par « cellules humaines » au sens de l’invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n’est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l’invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par « cellule mutante » au sens de l’invention, on entend une cellule porteuse d’au moins une mutation.
Par « cellule progénitrice » au sens de l’invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation cellulaire mais pas encore différenciée.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l’invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l’invention sont obtenues sans destruction de l’embryon dont elles sont issues, par exemple à l’aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d’êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l’invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans la présente demaine. Il peut s’agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l’invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l’expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Des exemples de procédés permettant l’obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « diamètre de Feret » d’un microcompartiment selon l’invention, on entend la distance « d » comprise entre deux tangentes audit microcompartiment, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l’ensemble de la projection dudit microcompartiment soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « épaisseur variable » de la couche interne de cellules humaines en cours de différenciation cellulaire, on entend au sens de l’invention le fait que la couche interne dans un même microcompartiment, n’a pas la même épaisseur partout.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l’invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules.
Par « milieu de culture convectif » au sens de l’invention on entend un milieu de culture animé par des mouvements internes.
Par « plus grande dimension » d’un microcompartiment ou d’un amas de cellule ou d’une couche de cellules au sens de l’invention, on entend la valeur du plus grand diamètre de Feret dudit microcompartiment.
Par « plus petite dimension » d’un microcompartiment ou d’une couche de cellules au sens de l’invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret dudit microcompartiment.
Par « plus petit rayon » d’un
Par « tissu » ou « tissu biologique »au sens de l’invention, on entend le sens commun de tissu en biologie c’est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la cellule et l’organe. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus souvent issus d’un lignage cellulaire commun, bien qu’elles puissent trouver leur origine par association de lignages cellulaires distincts)., regroupées en amas, réseau ou faisceau (fibre). Un tissu forme un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même fonction. Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Par « lumière » ou « lumen » au sens de l’invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement son contenu n’est pas en équilibre diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l’extérieur du microcompartiment.
Microcompartiments cellulaires
L’invention a donc pour objet un microcompartiment (10) en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe (12) en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne (14) comprenant au moins :
- des éléments de matrice extracellulaire (16), et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales (18) organisée en trois dimensions autour d’une lumière (20),
le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm, préférentiellement au moins 200 µm.
- des éléments de matrice extracellulaire (16), et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales (18) organisée en trois dimensions autour d’une lumière (20),
le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm, préférentiellement au moins 200 µm.
La partie interne (14) peut comprend également des zones liquides sans éléments de matrice extracellulaire.
Préférentiellement, le volume de la partie interne (14) représente au moins 20% du volume total du microcompartiment, préférentiellement au moins 40%.
Le microcompartiment est préférentiellement clos.
La couche externe comprend préférentiellement de l’alginate.
Le microcompartiment selon l’invention comprend au moins 1000, préférentiellement au moins 5000, notamment au moins 10 000 cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animale.
Selon une variante représentée sur la et 4b au moins deux cystes ont fusionné.
Selon un mode de réalisation les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues l’encapsulation dans la partie interne d’une couche externe d’hydrogel, de 1 à 10 cellules, préférentiellement de 1 à 5, le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm.
Le microcompartiment selon l’une l’invention peut être utilisé comme médicament.
L’invention a également pour objet un ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’invention. Préférentiellement, les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur clos.
L’épaisseur moyenne de couche externe peut être variable. Elle est préférentiellement comprise entre 5 et 100um, plus préférentiellement entre 20 et 60um.
Le rayon moyen de la partie interne est préférentiellement supérieur à 100um, plus préférentiellement entre 200 et 400um
Le ratio entre le rayon moyen de la partie interne (14) et cette épaisseur est préférentiellement comprise entre 2 et 10.
Le microcompartiment selon l’invention comprend une couche externe en hydrogel. Préférentiellement l’hydrogel utilisé est biocompatible, c’est-à-dire qu’il n’est pas toxique pour les cellules. La couche d’hydrogel doit permettre la diffusion d’oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Selon un mode de réalisation, la couche externe d’hydrogel comprend au moins de l’alginate. Elle peut être constituée exclusivement d’alginate. L’alginate peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d’α-L-guluronate et 20% de β-D-mannuronate, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa et une concentration totale comprise entre 0,5 et 5% en masse. La couche en hydrogel est dépourvue de cellules.
La couche d’hydrogel permet notamment de protéger les cellules du milieu extérieur, de limiter la prolifération incontrôlée des cellules, et leur différenciation en cas de différenciation.
Le microcompartiment selon l’invention comprend des cystes de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales. Pour chaque cyste les cellules forment au moins une couche organisée en trois dimensions dans le microcompartiment entourant une lumière.
Le microcompartiment peut comprendre également des cellules en suspension dans le microcompartiment.
Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s’entend d’une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes peuvent être en particulier des cellules souches pluripotentes induites (IPS), des cellules MUSE (« Multilineage-differentiating Stress Enduring ») que l’on trouve dans la peau et la moelle osseuse des mammifères adultes, ou des cellules souches embryonnaires (ES).
Selon une variante particulièrement adaptée de l’invention, le microcompartiment selon l’invention comprend des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales.
Si les cellules encapsulées dans le microcompartiment sont destinées à être utilisées en thérapie cellulaire chez l’être humain, les cellules peuvent être immuno-compatibles avec la personne destinée à les recevoir pour éviter tout risque de rejet.
Les cellules présentes dans le microcompartiment sont porteuses de peu, voire d’aucune mutation fonctionnelle.
Les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention ont été préférentiellement obtenues après au moins deux cycles de division cellulaire après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel d’au moins une cellule.
De façon préférée, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel d’au moins 1 cellules, préférentiellement entre 1 et 5, entre 1 et 10, entre 1 et 15, entre 1 et 20, entre 1 et 30, entre 1 et 40, entre 1 et 50, entre 1 et 60, entre 1 et 100 cellules. Par exemple, les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues après au moins six cycles de division cellulaire après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel d’au moins 1 cellule, préférentiellement entre 1 et 50 cellules.
Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages après l’encapsulation, plus préférentiellement au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 passages. Chaque passage peut durer par exemple entre 2 et 15 jours, notamment entre 3 et 10 jours.
De façon préférée le microcompartiment est obtenu après au moins une ré-encapsulation, plus préférentiellement entre 1 et 14 ré-encapsulations, notamment entre 2 et 7 ré-encapsulations. Très préférentiellement une ré-encapsulation correspond à un nouveau passage et chaque cycle d’encapsulation correspond à un passage.
Préférentiellement la totalité des cellules encapsulées initialement dans le microcompartiment avant le premier cycle de division cellulaire représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Ainsi, selon l’un mode de réalisation, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire, après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel de cellule(s) représentant un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Préférentiellement, dans le microcompartiment selon l’invention, les cellules représentent plus de 50% en volume par rapport au volume du microcompartiment, encore plus préférentiellement plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% en volume par rapport au volume du microcompartiment.
Le microcompartiment selon l’invention comprend plusieurs cellules, préférentiellement au moins 1000, notamment au moins 10000.
En plus de la couche externe et des cellules, le microcompartiment selon l’invention peut comprendre un milieu de culture et/ou au moins une solution aqueuse isotonique.
Le milieu de culture est un milieu adapté aux cellules présentes dans le microcompartiment selon les connaissances de l’homme du métier.
La solution aqueuse isotonique contient préférentiellement des séquences peptidiques ou peptidomimétiques capables de se lier aux intégrines. Par solution aqueuse isotonique on entend une solution aqueuse présentant une osmolarité comprise entre 200 et 400 mOsm/L. Cette couche est préférentiellement située entre (a) la ou les couche(s) de cellules et/ou d’assise(s) de cellules, et (b) la couche externe en hydrogel.
Elle peut être constituée d’éléments qui ont été ajoutés lors de la fabrication du microcompartiment et/ou d’éléments ajoutés dans le microcompartiment et/ou d’éléments sécrétés ou induits par les autres constituants du microcompartiment.
La solution isotonique peut notamment comprendre ou être constituée par une matrice extracellulaire et/ou un milieu de culture.
Le microcompartiment comprend de la matrice extracellulaire : il peut s’agir de matrice extracellulaire sécrétée par des cellules de la couche interne et/ou par de la matrice extracellulaire ajoutée au moment de la préparation/fabrication du microcompartiment.
La de solution istonique comprend préférentiellement un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture des cellules en cours de différenciation. Préférentiellement, la couche intermédiaire comprend des protéines structurelles, telles que du collagène, des laminines, de l’entactine, de la vitronectine, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l’EGF. Selon une variante, la couche intermédiaire peut consister en ou comprendre du Matrigel® et/ou de la Geltrex® et/ou une matrice type hydrogel d’origine végétale comme des alginates modifiés ou d’origine synthétique ou de copolymère de poly(N-isopropylacrylamide) et de poly(éthylène glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®.
Selon une variante, la solution isotonique peut former un gel.
Au niveau de la surface de la solution isotonique en contact avec une couche de cellules pluripotentes, la solution isotonique peut éventuellement contenir une ou plusieurs cellules.
Préférentiellement la solution isotonique présente un module d’Young compris entre 0,05 et 3 kDa. Le module d’Young peut être mesuré par toute méthode connue de l’homme du métier, en particulier par mesure de la rhéologie de gels de même composition que la couche intermédiaire ou bien par AFM (microscopie à force atomique).
Une solution aqueuse isotonique, préférentiellement de matrice extracellulaire, avec de telles valeurs de module d’Young permettent d’améliorer le maintien du phénotype cellulaire et l’intégrité génomique des cellules contenues dans cette couche intermédiaire pendant les divisions cellulaires.
La lumière de chaque cyste peut contenir un liquide, notamment du milieu de culture et/ou un liquide sécrété par les cellules. Avantageusement la présence de cette partie creuse permet aux cellules de disposer d’un petit volume diffusif dont elles peuvent contrôler la composition, favorisant une communication cellulaire.
La couche de cellules pluripotente formant un cyste au sein du microcompartiment est creuse. Un cyste est un agencement tridimensionnel en monocouche ou assise épithélial sphérique entourant un lumen central. La lumière est préférentiellement générée, au moment de la formation du cyste, par les cellules qui se multiplient et se développent sur la couche de matrice extracellulaire.
La conformation sous forme de cyste permet de réduire les pressions subies par les cellules souches par rapport aux cultures 2D ou en agrégats. Cette configuration permet de diminuer la mortalité cellulaire, d’augmenté le facteur d’amplification de la culture. Par conséquence cela permet de réduire le nombre de passages et dissociation nécessaire ; de réduire le temps en culture nécessaire pour atteindre le nombre de cellules final nécessaire. Collectivement ces améliorations participent aussi au maintien de l’intégrité génétique des cellules souches dans les microcompartiments.
Le microcompartiment cellulaire selon l’invention est clos ou partiellement clos, c’est à dire que la couche externe est close ou partiellement close. Préférentiellement le microcompartiment est clos.
Le microcompartiment selon l’invention peut se présenter sous toute forme en trois dimensions, c’est-à-dire qu’il peut avoir la forme de tout objet de l’espace. Le microcompartiment peut avoir n’importe quelle forme compatible avec l’encapsulation de cellules. Préférentiellement le microcompartiment selon l’invention se présente sous une forme sphérique ou allongée ou sensiblement sphérique ou allongée. Il peut avoir la forme d’un ovoïde, d’un cylindre, d’un sphéroïde ou d’une sphère ou sensiblement cette forme. Il peut en particulier se présenter sous la forme d’un sphéroïde creux, d’un ovoïde creux, d’un cylindre creux ou d’une sphère creuse.
C’est la couche externe du microcompartiment, c’est-à-dire la couche d’hydrogel, qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment selon l’invention. Préférentiellement la plus petite dimension du microcompartiment selon l’invention est comprise entre 10 µm et 1 mm, préférentiellement entre 100 µm et 700 µm. Elle peut être comprise entre 10 µm et 600 µm, notamment entre 10µm et 500 µm.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 10µm, plus préférentiellement comprise entre 10µm et 1m, encore plus préférentiellement entre 10µm et 50cm.
Le microcompartiment selon l’invention peut être utilisé pour toute application, en particulier comme médicament en thérapie cellulaire chez l’homme ou l’animal.
Le microcompartiment selon l’invention peut être éventuellement congelé pour être stocké. Il devra ensuite être décongelé avant son utilisation.
L’invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble.
Aussi, l’invention vise aussi un ensemble ou une série de microcompartiments cellulaires tels que décrits précédemment comprenant au moins un microcompartiment cellulaires selon l’invention.
L’ensemble de microcompartiments selon l’invention comprend préférentiellement entre 2 et 1016 microcompartiments.
De façon préférée la série de microcompartiments selon l’invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l’invention a pour objet une série de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu’un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu’un bioréacteur.
La présence d’une couche externe d’hydrogel et éventuellement d’une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique permet une distribution uniforme des cellules entre les microcompartiments. Par ailleurs cette couche d’hydrogel permet d’éviter les fusions de microcompartiments qui sont une source majeure de variabilité défavorable pour l’homogénéité phénotypique des cellules.
Procédé d’obtention d
e
micr
o
compartiment
s
selon l’invention
L’invention vise également un procédé de préparation de microcompartiments selon l’invention.
Le procédé de préparation d’un microcompartiment ou d’un ensemble de microcompartiments selon l’invention, peut comprendre les étapes suivantes :
- (a) incuber des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
(b) mélanger les cellules souches pluripotentes induites issues de l’étape (a) avec une matrice extracellulaire
- (b) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ;
- (c) cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- (d) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- (e) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu d’inhibiteur de l’apoptose, et
- (f) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
- (a) incuber des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales dans un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
(b) mélanger les cellules souches pluripotentes induites issues de l’étape (a) avec une matrice extracellulaire
- (b) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ;
- (c) cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- (d) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- (e) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu d’inhibiteur de l’apoptose, et
- (f) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Dans le procédé selon l’invention la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (b) représentent préférentiellement un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
L’inhibiteur de l’apoptose peut par exemple être un ou plusieurs inhibiteur(s) des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), ou tout autre inhibiteur de l’apoptose connu de l’homme du métier. L’inhibiteur de l’apoptose doit permettre de promouvoir la survie des cellules, et dans le cas de la présence d’une matrice extracellulaire, leur adhérence des cellules à la matrice extracellulaire au moment de la formation de la couche externe d’hydrogel autour de ladite matrice extracellulaire.
Le procédé selon l’invention peut comprendre une étape préalable de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique. Cette étape est particulièrement importante dans le cas de cellules adhérentes.
Les cellules encapsulées sont en suspension sous forme de cellules uniques et/ou d’amas ou ensemble(s) de cellule(s) (« cluster(s) »). De façon préférée, les cellules uniques représentent moins de 50% en nombre de la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (b). En effet il est préférable d’encapsuler des amas de cellules car cela diminue la déségrégation chromosomique et par conséquent diminue l’apparition de nouvelles mutagenèses et participe au maintien l’intégrité génomique des cellules.
Préférentiellement chaque amas de cellules encapsulé initialement à l’étape (b) a une plus grande dimension inférieure à 20% de la plus grande dimension d’un microcompartiment dans lequel il est encapsulé, encore plus préférentiellement inférieure à 10%. En effet les amas de cellules ne doivent pas avoir une trop grande taille par rapport à la taille du microcompartiment car un dimension trop grande de ces amas cellulaires initiaux, pourrait entrainer, lors des divisions cellulaires, une confluence cellulaire plus précoce dans la capsule ; cette confluence trop précoce de toute ou partie des capsules, pourrait entrainer une augmentation des pressions intracellulaires et entrainer un stress cellulaire, impactant notamment la ségrégation chromosomique.
Selon une variante, le procédé selon l’invention peut comprendre une étape de mélange des cellules à une matrice extracellulaire, soit avant l’étape (a) soit simultanément à l’encapsulation à l’étape (b).
Très préférentiellement, les étapes (c), (d) et (e) sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Cette agitation est importante car elle maintient l’homogénéité de l’environnement de culture et évite la formation de tout gradient diffusif. Par exemple, elle permet un contrôle homogène de niveau d’oxygénation cellulaire ; évitant ainsi les phénomènes de nécrose lié à l’hypoxie, ou de stress oxydatif lié à l’hyperoxie. En évitant une augmentation de la mortalité cellulaire et/ou du stress oxydatif, l’agitation participe au maintien de l’intégrité génétique.
Le procédé selon l’invention est préférentiellement mis en œuvre d’une enceinte close tel qu’un bioréacteur clos.
Le nombre cycles de divisions cellulaires à l’étape (e) est d’au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 cycles de division cellulaire.
Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages ( un passage correspondant ici à un cycle complet des étapes (a), (b), et (e), optionnellement (c) et (d)), plus préférentiellement au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 passages. Chaque passage peut durer par exemple entre 2 et 15 jours, notamment entre 3 et 8 jours.
Dans une variante préférée, le procédé selon l’invention comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (e), c’est-à-dire au moins deux cycles d’encapsulations. Préférentiellement chaque cycle d’encapsulation correspond à un passage. Dans cette variante du procédé (au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (e)) le nombre de divisions cellulaires de l’ensemble du procédé (pour l’ensemble des passages) est d’au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire.
Dans un procédé selon l’invention il peut y avoir plusieurs ré-encapsulation, préférentiellement entre 1 et 100, notamment entre 1 et 10 ré-encapsulation.
Chaque ré-encapsulation peut comprendre :
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d’amas de cellules ; l’élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c’est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l’élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d’ions divalents, une enzyme comme l’alginate lyase si l’hydrogel comprend de l’alginate et/ou la microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d’hydrogel.
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d’amas de cellules ; l’élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c’est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l’élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d’ions divalents, une enzyme comme l’alginate lyase si l’hydrogel comprend de l’alginate et/ou la microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d’hydrogel.
La ré-encapsulation est un moyen adapté pour une augmentation de l’amplification cellulaire obtenue depuis l’étape pluripotente, et diminuer les risques de mutation.
Selon un mode de réalisation la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes :
- (i) éliminer la couche externe en hydrogel,
- (ii) remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
- (iii) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ;
- (iv) préférentiellement cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l’apoptose , préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- (v) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- (vi) cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et
- (vii) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
- (i) éliminer la couche externe en hydrogel,
- (ii) remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
- (iii) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ;
- (iv) préférentiellement cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l’apoptose , préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- (v) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- (vi) cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et
- (vii) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
La compartimentalisation dans des microcompartiments permet d’éliminer les microcompartiments contenant d’avantage de cellules mutées que les autres capsules. Même si les cellules mutées ont une croissance rapide elles vont atteindre la confluence capsulaire qui va contenir leur multiplication. La compartimentalisation permet aussi de ne pas contaminer l’intégralité de la population cellulaire, et également d’éliminer les capsules contenant des cellules mutantes, à tout moment, en particulier avant une étape de ré-encapsulation. Ce tri peut être fait soit par analyse en ligne, soit par élimination des capsules remplies plus rapidement que les autres par exemple.
Selon une variante de l’invention, les cellules sont des cellules souches pluripotentes organisées en cystes directement à partir de cellules souches pluripotentes, ou à partir de cellules différenciées qui seront reprogrammées en cellules pluripotentes à l’intérieur de la capsule d’hydrogel lors de la formation des microcompartiments.
L’incubation de l’étape (a) et/ou (ii) est conduite préférentiellement pendant un temps compris entre quelques minutes et quelques heures, préférentiellement entre 2 minutes et 2 heures, plus préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.
L’étape (c) et/ou (iv) de culture avec un inhibiteur de l’apoptose est conduite pendant un temps compris entre 2 et 48 heures, préférentiellement pendant un temps compris entre 6 et 24 heures, plus préférentiellement pendant un temps compris entre 12 et 18 heures.
L’étape de rinçage peut être réalisée par un ou plusieurs rinçages, dans des milieux de culture successifs exempts d’inhibiteurs des voies RHO/ROCK, moins de 48h, préférentiellement moins de 24 heures, plus préférentiellement entre 12 et 18 heures après le début de l’étape (c) et/ou (iv).
Dans un mode de mise en œuvre, au moins une des étapes (préférentiellement toutes les étapes) est réalisée à une température adaptée à la survie des cellules, comprise entre 4 et 42°C. La température lors de la prolifération cellulaire doit être préférentiellement entre 32 et 37°C pour éviter de déclencher des mutations en baissant la performance des enzymes de réparation. De même, de façon préférée, la température doit être basse (idéalement environ 4°c) pour gérer le stress des cellules à l’étape (b).
Selon une variante, les agents de reprogrammation cellulaire peuvent être ajoutés à l’étape (a) et/ou (b) et/ou (c) et/ou (ii) et/ou (iii) et/ou (iv). Préférentiellement il s’agit d’agents de reprogrammation cellulaire non perméants vis-à-vis de la couche d’hydrogel. L’ajout d’agents de reprogrammation est particulièrement pertinent lorsque les cellules encapsulées initialement sont des cellules différenciées que l’on veut dédifférencier notamment jusqu’au stade pluripotent. L’homme du métier sait procéder à la reprogrammation d’une cellule différenciée en une cellule souche en réactivant l’expression des gènes associés au stade embryonnaire au moyen de facteurs spécifiques, désignés dans la présente invention comme « agents de reprogrammation ». A titre d’exemples, on peut citer les méthodes décrites dans Takahashiet al.,2006 (« Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors » Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676), Banet al.,2009 (« Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome » Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009; 85(8):348-62) et dans la demande internationale WO2010/105311 ayant pour titre « Production of reprogrammed pluripotent cells ». Les agents de reprogrammation sont avantageusement co-encapsulés avec les cellules différenciées, de manière à concentrer le produit et à favoriser le contact avec l’ensemble des cellules. Dans le cas d’agents de reprogrammation perméants à la couche d’hydrogel, il est possible d’ajouter lesdits agents dans le milieu de culture après l’étape d’encapsulation. Les agents de reprogrammation permettent d’imposer aux cellules une succession de changements phénotypiques jusqu’au stade pluripotent. Avantageusement, l’étape de reprogrammation est réalisée en utilisant des milieux de culture spécifiques, favorisant ces changements phénotypiques. Par exemple, les cellules sont mis en culture dans un premier milieu comprenant 10% de sérum humain, ou bovin, dans un milieu minimum essentiel de Eagle (DMEM) supplémenté avec un inhibiteur des récepteurs sérine/thréonine protéine kinase (tel que le produit SB-431542 (C22H16N4O3)), un ou plusieurs inhibiteurs des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), tels que du thiazovivin et/ou Y-27632, des facteurs de croissance des fibroblastes, tel que du FGF-2, de l’acide ascorbique et des antibiotiques, tels que la Trichostatin A (C17H22N2O3). Puis le milieu de culture est remplacé par du milieu favorisant la multiplication des cellules pluripotentes, tel que le milieu mTeSR®1.
À tout moment, le procédé selon l’invention peut comprendre une étape consistant à vérifier le phénotype des cellules contenues dans le microcompartiment. Cette vérification peut être réalisée en identifiant l’expression par au moins une partie des cellules contenues dans le microcompartiment, d’au moins un gène spécifique du phénotype recherché.
Les microcompartiments cellulaires obtenus selon les procédés de l’invention peuvent ensuite être congelés avant toute utilisation. La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre -190°C et -80°C. La décongélation peut être réalisée dans un bain d'eau tiède (37 degrés préférentiellement) pour que les cellules décongèlent assez rapidement. Les microcompartiments selon l’invention avant leur utilisation peuvent être maintenus à plus de 4°C pendant une durée limitée avant leur utilisation, préférentiellement entre 4°C et 38°C.
En particulier La structure en 3 dimensions des cellules dans le microcompartiment et le pourcentage faible voir nul de cellules isolées lors de l’encapsulation (la majorité des cellules étant encapsulées sous forme d’amas de cellules), diminue la déségrégation chromosomique et par conséquent diminue l’apparition de nouvelles mutagenèses.
L’invention favorise surtout l’amplification avec un facteur d’amplification élevé, ce qui par conséquent diminue le temps de culture et le nombre de divisions pour obtenir un nombre de cellules très important, et limite donc de nouvelles mutagenèses.
La protection des cellules grâce à la couche externe et la présence de matrice extracellulaire lorsqu’elle est présente diminue déségrégation chromosomique et limite le stress mécanique des cellules, et par conséquent diminue l’apparition de nouvelles mutagenèses.
Toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à l’intérieur d’une capsule d’hydrogel de la matrice extracellulaire et des cellules souches pluripotentes peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé de préparation selon l’invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandriet al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604), conformément aux étapes décrites ci-dessous.
Pour la mise en œuvre de l’invention il est nécessaire de générer des capsules dont la partie interne a une taille d’au moins 100µm. Pour générer des capsules de plus grand diamètre 2 paramètres doivent modifiés simultanément
Les débits on passe de entre 20 et 40 ml/h à entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL par heure
- Le diametre de l’ouverture final de la puce de coextrusion passe de entre 50 et 120 µm à entre 150 et 300 µm, préférentiellement entre 180 et 240 µm.
L’invention est à présent illustrée
par
un
exemple
et des résultats comparatifs
Les figures 1 montrentdes capsules d’hydrogel creuse permettant la croissance de plusieurs cystes de cellules souches pluripotentes humaines dans le micro-compartiment central.
Les figures 2 montrent une image de microscopie, à J6,5 post encapsulation montrant une pluralité de capsules d’alginates creuses contenant des cellules souches pluripotentes humaines.la barre d’échelle est de 500um. Les micrcompartiments selon l’invention comprennent plusieurs colonies de cellules souches 3D. En moyenne, on observe 2,6 colonies (cystes) par capsule à ce stade de la culture. Ces colonies présentent toutes une configuration cystique homogène avec un diamètre moyen de 170um.
Les figures 3 montrenet une pluralité de capsules multi cystes cultivées en suspension en bioréacteur
Paramètres clés et résultats de la mise à l'échelle de C-STEM dans un bioréacteur de 10 litres
L'encapsulation des hiPSCs et la culture en suspension ont été réalisées pendant 2 cycles séparés. Le niveau d'oxygène cible de 20% d'oxygène dissous est décrit comme une condition hypoxique (à l'inverse des bioréacteurs avec un niveau d'oxygène dissous de 100% qui sont décrits comme normoxiques). Une stratégie d'alimentation par lots a été appliquée, entraînant une augmentation du volume de travail et une diminution de la concentration des capsules. La densité cellulaire peut être exprimée en millions de cellules par millilitre de capsules. Le volume de la capsule récoltée est mesuré dans un cylindre de verre gradué et rapporté à la quantité de cellules. Le facteur d'amplification (AF) et le temps de doublement de la population (PDT) sont définis après la description du texte principal. Le niveau de doublement de la population (PDL) est défini comme PDL(t)= ln(AF) / ln(2). La viabilité a été évaluée par le nucleocounter NC-3000 (Chemometech). Les cellules décapsulées et dissociées ont été fixées et colorées pour OCT4, SOX2 et NANOG et analysées par cytométrie de flux, BD Accuri C6 plus (Tableau S1).
Figures 4 : serie de photo issue d’une VideoMicroscopie d’une « capsule multi-cyste »
L’observation est réalisée en transmission avec une biostation IM Nikon avec un objectif 10x. Le diamètre externe moyen de la capsule quasi-sphérique est de 288um comme indiqué par la barre d’echelle de 100um. Le cliché initial a été réalisé 4 jours après l’encapsulation. La séquence illustre la croissance de plusieurs colonies de cellules souches pluripotentes dans une capsule d’hydrogel creuse. Ces colonies sont cultivées dans un micro-compartment 3D clos, définit extérieurement par une couche d’alginate réticulé. Le compartiment interne est décris comme étant creux, dans le sens où il ne contient pas d’alginate réticulé. Le compartiment interne contenant les cellules contient également de la matrice extracellulaire (ici Matrigel) qui est visible en microscopie par une granulosité différente de celle de l’alginate.
Lors de l’encapsulation le volume injecté dans les micro-compartiments internes est issu à 50% du mix cellules/matrice et à 50% d’une solution isomolaire de sorbitol (cf. méthode). Ainsi l’espace interne est à minima 50% liquide.
Initialement les 3 colonies ont une configuration cystique homogène avec des diamètres respectifs de 76um, 100um et 78um (cyste en bas a droite de l’image). A ce stade initial l’épaisseur épithéliale de ces cystes est respectivement de 10um 13um et 12um. On observe que les 2 cytes en hauts a gauche de la capsule, rentrent progressivement en contact et fusionnent leurs lumières interne ainsi que leurs épithéliums. Il en résulte une colonie de cellules souches de plus grande dimension qui a également une structure cystique circulaire et symétrique.
54h après le début de l’observation (image 9), les 2 colonies cystiques présentes dans la capsule entrent en contact. A ce stade les diamètres de ces cystes sont de 232 et 175um. Les épaisseurs respectives de la couche cellulaire de ces cystes sont respectivement de 36 et 24um. On observe que le contact entre ces colonies n’est pas suivi d’une fusion des lumières ou des épithélium. La limite entre ces 2 structures reste clairement identifiable sur le dernier et 12eme cliché (75eme heure).
On observe un décalage de 20um vers la gauche de la plus grande des colonies qui semble repoussée par la petite colonie. Malgré un léger aplatissement de la zone de contacte entre les 2 colonies, leurs structures cystiques symétriques restent cependant maintenue pour chacune des 2 colonies, avec des épaisseurs de couche cellulaire homogène de 50 et 40um respectivement. Cette croissance des colonies encapsulées et leur habilité vraisemblable à se repoussées dans l’espace capsulaire interne est facilité par le caractère au moins partiellement liquide de cet espace creux interne. De plus, l’utilisation de matrices extracellulaires progressivement dégradable comme le matrigel, permet encore d’avantage aux cellules de croitre dans un environnement 3D plus permissif que lors d’une encapsulation en bille pleine d’hydrogel; et permet ainsi de maintenir une structure cystique épithélial malgré les forces générées par la multiplication cellulaire.
Au total, l’espace intra-capsulaire creux partiellement liquide permet aux colonies de cellules souches 3D de croitre tout en préservant un phénotype épithélial cystique stable. La stabilité de ce phénotype, permet une bonne homogénéité phénotypique des cellules produites et un procédé de bioproduction robuste/fiable.
illustrant la persistance du phenotype cystique lors de la croissance de plusieurs cyste
séquence « Multi-cyste” fusion en capsule
AAuto-organisation et Luminogenese de colonies 3D de cellules souches à l’interieur du micro-compartiment. Formation des cystes de cellules souches encapsulés
BCroissance des Cystes de cellules souches : augmentation progressive du diamètre du cyste, diamètre de la lumière et épaisseur du cyste.
CLes cystes rentre en contacte
CLes cystes rentre en contacte
DLes cystes fusionnent leurs couches cellulaires
ELes cystes fusionnent également leurs lumières internes et il en résulte un unique cyste de taille plus importante.
Claims (12)
- Microcompartiment (10) en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe (12) en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne (14) comprenant au moins :
- des éléments de matrice extracellulaire (16), et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales (18) organisée en trois dimensions autour d’une lumière (20),
le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm. - Microcompartiment (10) selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la partie interne (14) comprend également des zones liquides sans éléments de matrice extracellulaire.
- Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) est d’au moins 200 µm.
- Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le volume de la partie interne (14) représente au moins 20% du volume total du microcompartiment, préférentiellement au moins 40%.
- Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il est clos.
- Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l’alginate.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend au moins 1000 cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animale.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’au moins deux cystes ont fusionné.
- Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues l’encapsulation dans la partie interne d’une couche externe d’hydrogel, de 1 à 10 cellules, le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm.
- Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, pour son utilisation comme médicament.
- Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’une des précédentes revendications.
- Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur clos.
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