WO2023200263A1 - 유비퀴틴 리가제 활성이 증가된 e3 리가제의 u-박스 변이체 - Google Patents

유비퀴틴 리가제 활성이 증가된 e3 리가제의 u-박스 변이체 Download PDF

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김용성
박성욱
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Definitions

  • Ubiquitin a protein composed of 76 amino acids, involves a series of enzyme systems, namely ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), and ubiquitin ligase enzyme (E3), in a cascade format, with E1 activating Ub through an ATP-dependent reaction. Activates and transfers to E2 to form E2 bound to Ub (E2-Ub).
  • E3 which consists of a binding domain and a substrate recognition domain, places the E2-Ub complex and the substrate protein (substrate) in close proximity to promote the movement of Ub from E2-Ub to the lysine residue of the substrate protein.
  • the U-box domain of E4B it can recognize the E2 UbcH5 family and show E3 ligase activity even by using only the short U-box domain consisting of 76 amino acids at the C-terminus out of the total 1302 amino acids of E4B. It is a small 8.8 kDa protein composed of an alpha helix and three beta strands, and does not significantly affect expression and purification even when fused with other proteins, making the development of bioPROTAC easier.
  • E4BU E2 UbcH5c
  • residues L1236, M1237, D1238, M1253, I1257, R1260, H1261, N1264, P1269, F1270, and R1272 of E4BU are found in E2 UbcH5b. It is known to form hydrogen bonds, electrostatic interactions, and hydrophobic bonds with residues A2, K4, R5, K8, K61, F62, S94, P95, and A96.
  • the present invention specifically uses yeast surface display technology to induce poly-ubiquitination (poly-Ub) on the yeast surface, thereby speeding up the ubiquitin-transfer of E2-Ub through allosteric changes known in previous studies.
  • poly-Ub poly-ubiquitination
  • E4BU(NT) which has increased ubiquitination activity by improving
  • the present invention also provides nucleic acids encoding the E4BU variants.
  • Figure 2a is a schematic diagram showing a modeling structure showing the binding between E4BU(NT) and E2 UbcH5b and residues introduced into a library to improve the ubiquitination activity of E4BU(NT).
  • Figure 2c shows the degree of yeast surface protein ubiquitination of E4BU(NT) expressed on the yeast surface and E4BU variants that increased ubiquitination activity by improving the ubiquitin-transfer rate of E2-Ub through allosteric changes using flow cytometry. This is the result of measurement.
  • Figure 3a is a schematic diagram of the E4BU protein fused to the C-terminus of an anti-GFP nanobody.
  • Figure 3e shows size exclusion chromatography after purification of E4BU proteins (vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8)) fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody. This is the result of analysis using.
  • Figure 4a is a schematic diagram of an experiment in which the E4BU protein fused to the C-terminus of an anti-GFP nanobody poly-Ubifies the target protein, GFP, through an in vitro ubiquitination experiment.
  • Figure 4c shows the purification of E4BU proteins (vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8)) fused to the C-terminus of anti-GFP nanobodies in vitro in the presence/absence of ubiquitination test elements. This is the result of analysis using a 4-20% gradient TGX gel under reducing conditions after conducting a ubiquitination experiment.
  • Figure 4e shows the degree of ubiquitination of the anti-GFP nanobody according to the concentration of the E4BU protein (vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8)) fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody.
  • E4BU protein vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8)
  • Figure 4f shows the degree of ubiquitination according to the reaction time of the E4BU protein (vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8)) fused to the C-terminus of the same concentration of anti-GFP nanobody at 1500 nM.
  • An in vitro ubiquitination experiment was performed in which the E4BU protein fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody was reacted under the same conditions for 0, 1.5, 3, 7, 15, 30, and 60 minutes, respectively, and then 15% in reducing conditions. This is the result of analysis using SDS-PAGE or 4-20% gradient TGX gel.
  • Figure 4h shows the degree of ubiquitination according to the reaction time of the E4BU protein (vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8)) fused to the C-terminus of the same concentration of anti-GFP nanobody at 1500 nM.
  • This is the result of an in vitro ubiquitination experiment in which the E4BU protein fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody was reacted for 0, 1.5, 3, 7, 15, 30, and 60 minutes, respectively, and was evaluated through Western blot. .
  • the present invention increases the ubiquitination activity by improving the ubiquitin-transfer rate of E2-Ub through allosteric changes in the U-box domain (E4BU) of E4B, a monomeric U-box-type E3, to the target protein. It concerns the E4BU variant.
  • E4BU U-box domain
  • Nucleic acid is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, the basic structural unit of nucleic acids, include not only natural nucleotides but also analogues with modified sugar or base sites. .
  • the sequence of the nucleic acid encoding the IL21 variant of the invention may be modified. The modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • “Operably linked” means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is a functional linkage between the other nucleic acid sequence. regulates transcription and/or translation.
  • a nucleic acid expression control sequence e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • Strains of the genus Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas, such as Pseudomonas putida ( Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida, Proteus mirabilis, and Staphylococcus (e.g., Staphylocus carnosus) can be used.
  • Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces
  • Pseudomonas such as Pseudomonas putida
  • Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida, Proteus mirabilis
  • Staphylococcus e.g., Staphylocus carnosus
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • Figure 1b shows the results of an in vitro ubiquitination experiment using E4BU (WT) and E4BU variants expressed on the yeast surface, analyzed using flow cytometry.
  • the E4BU(NT) variant library constructed in Example 2 was reacted with purified Avi-6 ⁇ his-E1 UBA1, Avi-6 ⁇ his-E2 Ubch5b, biotinylated Avi-6 ⁇ his-Ub, ATP, and MgCl 2 to produce ubiquitin.
  • oxidation was induced and the biotinylated Avi-6 ⁇ his-Ub was ubiquitinated on the yeast surface protein, selection was performed using SA-PE to select yeast with a high degree of ubiquitination.
  • a total of 4 rounds of FACS selection were performed, with 10 ⁇ M of Avi-6 ⁇ his-E1 UBA1, 100 ⁇ M of biotinylated Avi-6 ⁇ his-Ub, 2 mM ATP, 5 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, and 60 mM NaCl pH 8.0 in all rounds.
  • the same process was carried out under buffer conditions, but in the first screening for each round, the concentration of Avi-6 ⁇ his-E2 UbcH5c protein was set to 1 ⁇ M and the number of yeasts was set to 5 ⁇ 10 8.
  • E4BU variants (E4BU(#7), E4BU(#8), E4BU(#9) that increased the ubiquitination activity by improving the ubiquitin-transfer rate of E2-Ub through allosteric changes selected in Example 3
  • E4BU (#10)) and E4BU (NT) used as a template they were constructed by fusing them to the C-terminus of an anti-GFP nanobody, an antibody fragment capable of targeting a specific protein. .
  • vectors expressing vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10) were constructed.
  • the plate was plated on LB agar solid medium (LB+A) containing 100 ⁇ g/ml ampicillin and cultured at 37°C for 16 hours. After collecting a single colony of the transformant, it was inoculated into 5 mL of LB+A liquid medium and cultured for 18 hours. The pre-culture was inoculated into 250 ml of LB+A liquid medium at an initial inoculation concentration of OD 0.05 and then cultured. The OD600 value was measured using a spectrophotometer (Thermo ScientificTM).
  • IPTG Isopropyl- ß-D-thiogalactopyranosid
  • biotinylated protein For the purified biotinylated protein, imidazole was dialyzed into the final buffer (2mM DTT containing PBS, pH 7.4) using Centrifugal Filters (Satorious). The protein purified through the above process was quantified using absorbance and extinction coefficient at a wavelength of 280 nm.
  • Figure 3b shows vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10) proteins purified in Example 2. It was analyzed through 15% SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions.
  • vhhGFP4-E4BU(NT) and vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10) all have a molecular weight of approximately 25% under reducing or non-reducing conditions.
  • the molecular weight of kDa was confirmed, and it was confirmed to be consistent with the theoretical molecular weight of 25.2 kDa. All of the above five proteins were observed to exhibit 80-90% purity under reducing or non-reducing conditions. This shows that the above five proteins exist as monomers in solution and do not form duplexes or oligomers through unnatural disulfide bonds.
  • Example 7 Confirmation of target binding ability of E4BU variant with increased ubiquitination activity by improving the ubiquitin-transfer rate of E2-Ub through allosteric change fused to the C-terminus of anti-GFP nanobody.
  • the vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10) proteins purified in Example 5 were anti-GFP.
  • the nanobody has the ability to bind to the target protein, GFP, and the E4BU variant protein fused to the C-terminus has the ability to bind to E2 UbcH5b. We sought to evaluate the binding ability of each domain to the target protein through ELISA.
  • Figures 3c and 3d show the GFP or E2 UbcH5b of vhhGFP4-E4BU(NT) and vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10).
  • vhhGFP4-E4BU(NT) and vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10) To confirm specific binding to 1, 10, and 100 nM of biotinylated 6 ⁇ his-GFP and 0.2 and 2.20 ⁇ M of biotinylated Avi-6 ⁇ his-E2 UbcH5b, the binding ability was analyzed by ELISA. It is a result.
  • GFP After purification, it was biotinylated using the standard protocol of the EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin kit (Thermo Fisher Scientific), and used as a protein for ELISA with biotinylated Avi-6 ⁇ his-E2 UbcH5b. It was used.
  • vhhGFP4-E4BU(NT) and vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), and vhhGFP4-E4BU(#10) proteins were placed in a 96-well EIA/RIA plate. After binding at room temperature for 1 hour at a concentration of 5 ⁇ g/ml each, wash three times for 10 minutes with 0.1% PBST (PBS, pH 7.4, 0.1% Tween20).
  • 0.1% PBST PBS, pH 7.4, 0.1% Tween20
  • Example 8 Evaluation of physical properties through size exclusion chromatography of an E4BU variant with increased ubiquitination activity by improving the ubiquitin-transfer rate of E2-Ub through allosteric changes fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody.
  • Figure 3e is a graph showing mAU values at 280 nm using size exclusion chromatography for vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), and vhhGFP4-E4BU(#8) proteins.
  • samples were prepared by preparing 45 ⁇ l of vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), and vhhGFP4-E4BU(#8) proteins at a concentration of 1 mg/ml and inserting them into the insert.
  • 12mM Phosphate, 137Mm NaCl, 2.7mM KCl pH 7.4 buffer (PBS pH 7.4 buffer) was flowed through a Supderdex200 column (7.8 mm ⁇ 300 mm, Sepax Technologies) at a flow rate of 0.75 ml/min, and the pressure and mAU value at 280 nm were measured. We waited until it stabilized and prepared.
  • vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), and vhhGFP4-E4BU(#8) proteins all had a monomer ratio of over 98%, and the 150 kDa used as a size indicator.
  • IgG, 66 kDa BSA, and 29 kDa carbonic anhydrase it was confirmed that it eluted at a time consistent with its size.
  • Figure 4a is a schematic diagram of an experimental method in which an E4BU variant fused with an anti-GFP nanobody converts a target protein to lysine 48-linked poly-Ub under in vitro experimental conditions and analyzes this through SDS-PAGE.
  • Figure 4c shows the results of an in vitro ubiquitination experiment using vhhGFP4-E4BU(NT) and vhhGFP4-E4BU(#8) purified in Example 5 in the presence/absence of ubiquitination elements, followed by reducing conditions. This is the result of analysis using a 4-20% gradient TGX gel.
  • vhhGFP4-E4BU (#8) was observed on average under all concentration conditions except for the concentration condition of 0 nM. It was confirmed that the treated sample showed a darker band intensity, and at 1500 nM, a band intensity that was approximately 25% higher was confirmed.
  • Example 10 Targeting ubiquitin of the E4BU variant, which increased the ubiquitination activity by improving the ubiquitin-transfer rate of E2-Ub through allosteric changes fused to the C-terminus of the anti-GFP nanobody under in vitro ubiquitination experimental conditions. Check reaction speed.
  • Figure 4f shows that in an in vitro ubiquitination experiment using the vhhGFP4-E4BU(NT) and vhhGFP4-E4BU(#8) proteins purified in Example 5, the remaining amount of free Ub according to the reaction time was 0, 1.5, These are the results of in vitro ubiquitination experiments for 3, 7, 15, 30, and 60 minutes and then analyzed using 15% SDS-PAGE or 4-20% gradient TGX gel under reducing conditions.
  • FIG. 4g is a linear graph showing the residual amount of free Ub analyzed using ImageJ software as a result of the experiment of FIG. 4f using a first-order exponential decay equation.
  • the in vitro ubiquitination reaction used in Figure 4f was subjected to electrophoresis in 15% SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. Afterwards, the membrane was blocked for 1 hour in TBST (TBS pH7.4, 0.05% Tween 20) buffer containing 4% BSA. Afterwards, the cells were treated with HRP-fused rabbit anti-GFP antibody (1:1000) or anti-Ub antibody (1:1000) in TBST buffer conditions and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, the membrane was incubated for 1 hour at room temperature using an HRP-fused rabbit anti-mouse antibody (1:4000) or an HRP-fused goat-anti rabbit antibody (1:4000).

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Abstract

본 발명은 유비퀴틴 (Ubiquitin, Ub)가 결합된 E2 (ubiquitin conjugating enzyme) (E2-Ub)의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킬 수 있는 다른 자리 입체적 변화 (allosteric regulation)를 포함하는, E4B의 U-box 도메인 (E4BU) 변이체, 이를 코딩하는 핵산, 발현벡터, 재조합 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

유비퀴틴 리가제 활성이 증가된 E3 리가제의 U-박스 변이체
본 발명은 유비퀴틴 (Ubiquitin, Ub)이 결합된 E2 (ubiquitin conjugating enzyme) (E2-Ub)의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킬 수 있는 다른 자리 입체적 변화 (allosteric regulation)를 포함하는, E4B의 U-box 도메인 (E4BU) 변이체, 이를 코딩하는 핵산, 발현벡터, 재조합 세포 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 세포 내 단백질 분해는 오토파지 경로 (Autophagy pathway)를 통해 오토파고좀 (Autophagosome)과 오토라이소좀 (Autolysosome)을 거쳐 단백질이 분해되는 경로와, 프로테아좀 (proteasome)에 의해 단백질이 분해되는 두 가지 경로를 통해 이뤄지고, 이 중 80%는 유비퀴틴 (Ubiquitin, Ub)에 의해 표지된 후 프로테아좀에 의해 세포질과 핵에서 분해된다. 이러한 유비퀴틴에 의한 단백질 분해 조절 시스템은 손상된 단백질이나 불필요한 단백질을 제거하여 세포의 항상성을 유지하는 기능을 담당할 뿐 아니라, 시간에 따라 정교하게 조절되어야 하는 세포주기 과정이나 전사 조절 과정에도 참여한다.
76개의 아미노산으로 구성된 단백질인 유비퀴틴은 일련의 효소계, 즉 ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), 및 ubiquitin ligase enzyme (E3)가 캐스케이드 형식으로 관여하며, E1이 ATP 의존적 반응에 의해 Ub를 활성화하고, E2로 전달하여 Ub가 결합된 E2 (E2-Ub)를 형성한다. 결합 도메인과 기질 인식 도메인으로 구성된 E3는 이러한 E2-Ub 결합체와 기질단백질 (substrate protein, substrate)을 근접하게 위치시켜 E2-Ub에서 기질단백질의 라이신 잔기로 Ub의 이동을 촉진한다. Ub는 기질단백질에 하나 또는 여러 개의 라이신 잔기에 결합되거나 연속적인 Ub 분자를 유비퀴틴 사슬로 연쇄/다중 표지시키는 폴리-유비퀴틴화 (poly-ubiquitination, poly-Ub)사슬을 형성할 수 있다. 특히 라이신-48 폴리-유비퀴틴 화는 ATP-의존성 단백질 분해효소 복합체인 26S 프로테아좀 (26S proteasome)에 전달되고, 접힘이 풀리며 분해가 되며, 이 과정을 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (ubiquitin-proteasome system, UPS)이라 한다. 이러한 UPS에서 E1은 2개, E2는 38여개, E3는 600개 이상의 종류가 있다고 알려져 있다. 이 중에서 E3는 특징적 도메인 구조 존재여부 및 Ub을 전달하는 기작의 차이에 따라 RING (Really Interesting New Gene)-type E3 ligases, HECT (Homologous to the E6AP Carboxyl Terminus)-type E3 ligases, RBR (RING-Between-RING)-type E3 ligases, 그리고 U-box-type E3 ligases로 나뉘어진다. 이 중에서도 U-box-type과 RING-type E3 ligases가 가장 풍부한 유형으로 각각 U-box 도메인과 RING 도메인을 가지고 있어, E2-Ub complex의 앵커 역할을 한다. U-box 도메인과 RING 도메인은 E2-Ub complex의 Ub와 기질 단백질의 아미노기 사이의 근접성을 제공하기 위해 E2-Ub에 직접적으로 결합을 하여 결합 부위 외의 다른 자리의 입체성 조절을 통해 촉매의 활성을 자극하고, 근접해 있는 기질 단백질의 유비퀴틴화 속도를 제어하게 된다. 이러한 E3는 E2-Ub와 기질단백질 양쪽 모두에 결합하며, 유비퀴틴화 될 기질 단백질을 인지할 수 있는 특이성을 제공한다. 즉, 기질 단백질의 poly-Ub화는 E3 효소에 의해 결정이 되고, 모든 기질 단백질에는 특정 E3가 결합하는 인식 부위와 유비퀴틴화가 진행되는 Ub 연결부위가 존재한다. 약 10만 종의 단백질이 존재하는 세포 내의 환경을 고려하면, 각 E3는 기질 특이성이 있지만, 동시에 중복성 (redundancy)과 다중성 (multiplicity)을 함께 지닌다.
이러한 E3를 통해 표적단백질을 poly-Ub화 시켜 UPS를 통한 단백질의 분해를 유도하는 기술로 연구된 것이 PROTAC (Proteolysis-targeting chimera, PROTAC)기술이다. 일반적으로 PROTAC은 E3 결합 모듈-링커-표적단백질 결합 모듈의 3가지 파트로 구성된 헤테로-2기능성 (hetero-bifunctional) 소분자 의약품으로, 표적 단백질을 인지하여 특이적으로 결합하는 소분자와 E3를 특이적으로 인지하여 결합할 수 있는 소분자를 가운데의 링커로 연결한 물질이 하나의 화합물로 사용되고 있다. 이러한 PROTAC은 표적단백질을 특이적으로 인지하는 소분자가 표적 단백질과 결합하고, E3를 특이적으로 인지하는 소분자가 E3를 인지하여 결합하였을 때, E3와 표적단백질이 위치적으로 가까워지게 되고, E3에 의한 표적 단백질의 poly-Ub화를 유도하게된다. 세포 내부에서의 poly-Ub화의 유도는 결국 ATP-의존성 단백질 분해효소 복합체인 26S 프로테아좀에 poly-Ub화 된 표적단백질이 인지되어 UPS를 통한 분해를 가져오게 된다. 하지만 이러한 PROTAC과 같은 소분자 화합물의 경우 소분자 화합물이라는 근본적인 한계를 가지게 된다. 즉 일반적으로 알려진 소분자 의약품의 단점인 소수성 결합 포켓 (Hydrophobic pocket)이 존재하지 않는 단백질의 표면에는 결합이 어려워 표적하기 어려우며, 세포 특이성을 가지지 못하기 때문에 일반 세포에 작용하여 부작용을 동반할 가능성이 있다. 그리고, 생체분자의약품과 비교하여 반감기가 낮아 생체 내에서 빠른 분해가 되고, 따라서 생체이용률 (bioavailability)이 낮다는 한계점도 갖고 있다. 지금까지 연구된 PROTAC 기술에 활용된 E3는 대표적으로 β-TrCP, MDM2, cIAP/XIAP, VHL, CRBN의 5종이 존재하고 있으며, 일부 E3 ligase의 경우 (예, β-TrCP, MDM2)의 경우 효능이 미약하다. 이러한 한계를 극복하기 위한 방법 중 하나로 소분자 의약품이 아닌 생체분자를 이용하여 표적단백질의 분해를 유도하기위한 기술로 단백질 기반의 표적단백질분해제 (Biological Proteolysis-targeting chimera, BioPROTAC)가 연구되고 있다. BioPROTAC은 기질단백질과 결합하는 바인더(binder)와 E3 결합 모듈 혹은 E2 결합 모듈을 융합한 단백질로, 기질 단백질과의 특이적 결합을 제공하는 모듈은 항체 절편 (nanobody, single chain variable fragment(scFv)) 등을 이용하고, E3 결합 모듈 혹은 E2 결합 모듈은 RING-type E3의 기질수용체 도메인 혹은 U-box-type E3의 U-box 도메인을 이용한다. BioPROTAC은 대표적으로 ubiquibodies, antibody RING-mediated destruction (ARMeD), affinity-directed protein missile (AdPROM) 기술이 있다. 이러한 bioPROTAC의 경우 앞에서 소분자 의약품이 가지고 있던 문제점을 대부분 극복할 수 있어 소수성 결합 포켓 (Hydrophobic pocket)이 존재하지 않는 단백질의 표면에도 결합이 용이하며, 세포 특이성을 가질 수 있어 표적 세포 특이적으로 작용할 수 있고, 소분자 의약품과 비교하여 반감기가 높아 생체이용률 (bioavailability) 또한 높다. 하지만, bioPROTAC은 스스로 세포질 내부에 위치할 수 없어, 세포 내로 전달하기 위해 DNA, mRNA transfection 등의 인위적인 발현 시스템을 사용해야 사용이 가능해, 치료 등의 목적으로 생체 내 적용이 어렵다는 단점이 있다. 최근에 항체-약물결합체 (antibody-drug conjugate, ADC)처럼, 항체-PROTAC 결합체 (antibody-PROTAC conjugate) 기술이 보고되었다. 하지만, 항체-PROTAC 결합체 기술도 E3를 특이적으로 결합할 수 있는 E3 결합 모듈의 개발이 전제되어, 난제 표적단백질에 대한 PROTAC 기술의 한계를 여전히 지닌다. 또한 ADC의 기본적인 한계인 위치 특이적 결합, 제조 등의 CMC (chemistry, manufacturing, control) 문제를 해결해야 하는 단점이 있다.
bioPROTAC에서 표적 단백질의 poly-Ub화를 유도하기 위한 도메인으로 cullin-RING-type E3 (CRLs)와 U-box-type E3가 주로 사용되고 있다. CRLs의 경우 E3중 가장 큰 family로, 8가지 타입으로 나뉘게 되며, CRL 복합체에서 기본적으로 E3 유도체의 경우 주로 cullin-RING E3 ubiquitin ligase (CRLs)로, 복합체를 이루어 기능하는 E3의 scaffold 역할을 하는 1) Cullin, 2) E2-Ub가 결합하는 RING 도메인, 3) 기질 특이성을 결정하는 기질수용체(substrate receptor), 4) cullin과 기질수용체를 연계하는 어댑터 (adaptor)로 구성되어 있다. 특히, 기질수용체는 표적단백질인에 결합하는 도메인 (substrate protein-binding domain)과 어댑터 단백질에 결합하는 어댑터 결합 도메인 (adaptor binding domain)으로 구성되어 있다. 따라서 2개의 도메인으로 구성된 기질수용체는 기질단백질을 E3에 가깝게 위치하도록 하는 역할을 한다. U-box-type E3의 경우 표적단백질과 결합을 하는 표적단백질 결합 도메인과 E2-Ub와 결합하는 U-box 도메인으로 나뉘어져 있고, E2-Ub과 표적단백질을 위치적으로 가깝게 배치하여 E2-Ub의 Ub를 표적단백질로 전달하는 방식을 가진다. U-box-type E3는 다시 단일 단백질 형태의 Monomeric U-box-type E3 (예, E4B)와 Homodimeric U-box-type E3 (예, CHIP, Prp19)로 나뉜다. [Nordquist et al., (2010). Biochemistry 49, 347-355]
U-box-type E3는 Zn이온이 존재해야 접힘이 가능한 RING-type E3와는 달리 Zn이온이 존재하지 않아도 접힘이 가능하여, 엔지니어링에 보다 더 적합한 E3 ligase로 생각된다. 그 중에서도, 대표적인 Monomeric U-box-type E3인 E4B의 U-box 도메인 (E4BU, GenBank accession code: NM_001105562)의 경우 단일분자로 E2-Ub와 결합하여 주변 단백질을 무작위적으로 유비퀴틴화 시키는 특성을 가지고 있고, CHIP이나 Prp19와 같이 homodimeric 형태로 E3 ligase 활성을 보이는 다른 U-box-type E3와는 달리 단일체로 E3 ligase 활성을 가진다. 또한 E4B의 U-box 도메인의 경우 E4B 전체 1302개 아미노산 중 C-말단의 76개의 아미노산으로 이루어진 짧은 U-box 도메인만을 사용하여도 E2 UbcH5 family를 인지하여 E3 ligase의 활성을 보일 수 있고, 4개의 알파 나선과 3개의 베타 가닥으로 이루어진 8.8 kDa 크기의 작은 단백질로 다른 단백질과 융합하여도 발현 및 정제에 큰 영향을 미치지 않아 보다 bioPROTAC의 개발의 용이함을 가지고 있다. 인간 E4BU와 E2 UbcH5c간의 결합을 이루는 구조 결정이 존재하고 있으며 (PDB number: 3L1Z), E4BU의 L1236, M1237, D1238, M1253, I1257, R1260, H1261, N1264, P1269, F1270, R1272 잔기가 E2 UbcH5b의 A2, K4, R5, K8, K61, F62, S94, P95, A96 잔기와 수소 결합, 정전 상호작용, 소수성 결합을 이루는 것으로 알려져 있다.
이러한 기술적 배경하에서, E4BU의 유비퀴틴화 활성 향상을 위해, 이전 연구에서 파지 디스플레이 기술을 이용하여 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 선별을 진행하였으며, 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 D1268N과 N1271T 돌연변이를 가지는 변이체 (E4BU(NT))를 보고하였으며 [Starita et al., (2013) PNAS E1263-E1272], 우리는 E4BU(NT)를 기반으로 하여 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 보다 더 향상시킨 E4BU 변이체를 선별하여 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
상기에 명시된 Monomeric U-box-type E3인 E4B의 U-box 도메인(E4BU)의 표적 단백질로의 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체를 개발하고자 하였다.
본 발명은 구체적으로 효모 표면 디스플레이 기술을 이용하여 효모 표면의 폴리-유비퀴틴화 (poly-ubiquitination, poly-Ub)를 유도하여, 이전 연구에서 알려진 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU(NT)를 기반으로 보다 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 표적 단백질로의 유비퀴틴화 활성을 증가시키는 E4BU 변이체를 개발하고자 하였다.
본 발명은 구체적으로 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 보다 증가시킨 E4BU 변이체를 선별하기 위해 이전 연구에서 알려진 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체인 E4BU(NT)를 기반으로 한 E4BU 라이브러리를 효모 표면에 발현하고, E1 ubiquitin activating enzyme (UBA1, GenBank accession code: NM_153280), E2 ubiquitin conjugating enzyme (UbcH5b, GenBank accession code: NM_181838), Adenosine triphosphate (ATP), Magnesium dichloride (MgCl2), Ub (GenBank accession code: AC126309)와 함께 반응시켜 효모 표면 단백질의 poly-Ub화를 유도하여, 궁극적으로 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 보다 증가시킨 E4BU 변이체를 선별하고자 하였다.
본 발명은 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU의 변이체를 제공한다. 더욱 구체적으로 표 2에서 제시하는 바와 같이 E4BU(NT)의 잔기에 돌연변이가 도입된 E4BU(#7), E4BU(#8), E4BU(#9), E4BU(#10) 변이체를 선별하였다.
본 발명은 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU의 변이체를 사용하여 진행되는 유비퀴틴화 반응에서 증가된 유비퀴틴화 활성을 확인하기 위해, 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합한 형태로 구축하여 표적 단백질의 라이신48-linked poly-Ub화를 관찰하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명에서는 동일한 항-GFP 나노바디의 C-말단에 E4BU(NT) 혹은 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 보다 증가시킨 E4BU의 변이체인 E4BU(#7), E4BU(#8), E4BU(#9), E4BU(#10)을 융합한 BioPROTAC의 경우 생체 외 실험에서 유의미한 라이신48-linked poly-Ub화의 차이를 보이며, 이는 E4BU의 변이체가 표적 단백질로의 유비퀴틴-전이를 보다 빠르게 유도하여 유비퀴틴화 활성이 증가하였음을 제시한다.
또한, 본 발명은 상기 표적 단백질로의 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 유비퀴틴(Ubiquitin, Ub)가 결합된 E2 (ubiquitin conjugating enzyme) (E2-Ub)의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킬 수 있는 다른 자리 입체적 변화 (allosteric regulation)를 포함하는, E4B의 U-box 도메인 (E4BU) 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 E4BU 변이체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 E4BU 변이체의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 세포를 배양하여 E4BU 변이체를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 E4BU 변이체를 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 E4BU 변이체의 제조방법을 제공한다: (1) GFP 표적능을 가지는 나노바디의 C-말단에 E4BU 변이체가 연결된 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 제조된 발현벡터를 단백질 발현용 대장균 세포에 형질전환 하여 발현하는 단계; 및 (3) 상기 발현된 단백질을 정제 및 회수하는 단계.
도 1a은 효모 표면 디스플레이 기술을 이용하여 E4BU 단백질을 효모 표면에 발현시킨 후 효모 표면 단백질의 poly-Ub화를 유도하는 실험의 모식도이다.
도 1b는 유세포분석기를 이용하여 E4BU(WT) 및 E4BU(NT)의 효모 표면 단백질 유비퀴틴화 정도를 측정한 결과이다.
도 2a는 E4BU(NT)와 E2 UbcH5b간의 결합을 나타낸 모델링 구조와, E4BU(NT)의 유비퀴틴화 활성을 향상시키기 위한 라이브러리의 도입 잔기를 표시한 모식도이다.
도 2b는 효모 표면 디스플레이 기술을 통해 효모 표면에 발현된 E4BU(NT)의 유비퀴틴화 활성을 향상시키기 위한 라이브러리의 Fluorescence Associated Cell Sorting (FACS)기기를 이용한 선별 과정이다.
도 2c는 유세포분석기를 이용하여 효모 표면에 발현된 E4BU(NT) 및 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체들의 효모 표면 단백질 유비퀴틴화 정도를 측정한 결과이다.
도 3a는 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질의 모식도이다.
도 3b는 상기 도 3a의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10))을 정제 후 환원성 또는 비 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE를 통해 분석한 것이다.
도 3c는 상기의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10))을 이용하여 GFP에 대한 결합능을 평가하기 위해, ELISA를 통해 GFP 1, 10, 100 nM 농도에 대하여 결합능을 평가한 결과이다.
도 3d는 상기 3a의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10))을 이용하여 E2 UbcH5b에 대한 결합능을 평가하기 위해, ELISA를 통해 E2 UbcH5b 0.2, 2, 20 μM 농도에 대하여 결합능을 평가한 결과이다.
도 3e는 상기 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질 (vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8))을 정제 후 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과이다.
도 4a는 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질이 생체 외 유비퀴틴화 실험에 의해 표적 단백질인 GFP를 poly-Ub화 시키는 실험의 모식도이다.
도 4b는 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8))을 정제하여 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질간의 유비퀴틴화 활성 정도를 비교하기 위해 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8)) 각각의 0, 187, 375, 750 nM 농도에 대하여 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과이다.
도 4c는 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8))을 정제하여 유비퀴틴화 실험 요소의 존재 유/무 조건에서의 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 4-20% gradient TGX gel을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4d는 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8))의 농도에 따른 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위해 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질 0, 187, 375, 750, 1500 nM 농도에 대하여 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient TGX gel을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4e는 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8))의 농도에 따른 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위해 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질 0, 187, 375, 750, 1500 nM 농도에 대하여 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 웨스턴 블랏을 통해 평가한 결과이다.
도 4f는 동일 농도의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8))의 반응 시간에 따른 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위해 1500 nM의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질을 동일 조건에서 각각 0, 1.5, 3, 7, 15, 30, 60분간 반응시키는 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient TGX gel을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4g는 상기 도 4f의 15% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient TGX gel 분석 결과를 이용하여 라이신48-linked poly-Ub화 되지 않은 Ub 단량체의 잔여량을 측정하여 일차 지수적 감쇠 방정식을 통한 선형 그래프로 나타낸 결과이다.
도 4h는 동일 농도의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질(vhhGFP4-E4BU(NT), vhhGFP4-E4BU(#8))의 반응 시간에 따른 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위해 1500 nM의 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 E4BU 단백질을 각각 0, 1.5, 3, 7, 15, 30, 60분간 반응시킨 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 웨스턴블랏을 통해 평가한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 유비퀴틴 (Ubiquitin, Ub)가 결합된 E2 (ubiquitin conjugating enzyme) (E2-Ub)의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킬 수 있는 다른 자리 입체적 변화 (allosteric regulation)를 포함하는, E4B의 U-box 도메인 (E4BU) 변이체에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 Monomeric U-box-type E3인 E4B의 U-box 도메인(E4BU)의 표적 단백질로의 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체에 관한 것이다.
“다른 자리 입체적 변화”는 유비퀴틴 (Ubiquitin, Ub)가 결합된 E2 (ubiquitin conjugating enzyme) (E2-Ub)의 활성 부위 (active site)가 아닌 다른 자리에 결합하여 이루어지는 반응 능력 조절을 의미한다.
본 발명에 따른 E4BU 변이체는 알려진 마우스 E4BU 변이체인 E4BU(NT) [Starita et al., (2013) PNAS E1263-E1272]의 돌연변이를 인간 E4BU에 도입한(D1268N, N1271T) 인간 E4BU(NT)인 서열번호 3의 서열 중 10번째 내지 25번째 아미노산 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
Figure PCTKR2023004990-appb-img-000001
본 발명에 따른 E4BU 변이체는 서열번호 4 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
Figure PCTKR2023004990-appb-img-000002
본 발명은 다른 관점에서, 상기 E4BU 변이체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 E4BU 변이체를 코딩하는 핵산을 분리하여 E4BU 변이체를 재조합적으로 생산할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 본 발명의 IL21 변이체를 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 E4BU 변이체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, CH3A(EW) 및 CH3B(RVT) DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "발현벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. E4BU 변이체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤모글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 E4BU 변이체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 E4BU 변이체의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 세포를 배양하여 E4BU 변이체를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 E4BU 변이체를 회수하는 단계.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 E4BU 변이체의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 유비퀴틴화 활성이 향상된 E4BU 변이체를 선별하기 위한 효모 표면 디스플레이 기술의 고안
본 발명에서는 유비퀴틴화 활성이 향상된 E4BU 변이체를 선별하기 위해서 먼저 효모 표면 디스플레이 기술을 이용하여 효모 표면에 E4BU(WT) 및 E4BU(NT)를 발현하였다. 본 발명에서는 활성화된 RAS 형태를 표적하는 세포침투 간섭항체(inRas37) [Shin, et al., (2020), Sci Adv, 6, eaay2174]의 경쇄 C-말단에 글라이신, 세린으로 이루어진 2개 아미노산 길이의 링커가 달린 인간 E4BU(WT)과 이전 연구에서 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨다 알려진 마우스 E4BU 변이체인 E4BU(NT) [Starita et al., (2013) PNAS E1263-E1272]의 돌연변이를 인간 E4BU에 도입한 (D1268N, N1271T) 인간 E4BU(NT)를 융합한 형태로 효모 (Saccharomyces cerevisiae JAR200)의 표면에 발현하였고, E1 UBA1, E2 UbcH5b, ATP, MgCl2, Ub 조건 하에서 생체 외 유비퀴틴화 반응을 통해 효모 표면 단백질의 poly-Ub화를 유도하였다.
Figure PCTKR2023004990-appb-img-000003
Figure PCTKR2023004990-appb-img-000004
구체적으로 N-말단에 Aga2p가 융합된 형태의 상기 표 1의 서열번호 1의 CT03 경쇄의 C-말단에 글라이신, 세린 링커으로 이루어진 GS 링커가 융합된 상기 표 2의 서열번호 2의 E4BU(WT)과 서열번호 3의 E4BU(NT)를 유전자적으로 합성하여 Aga2p-CT03-GS linker-E4BU 단백질의 순서로 pCTCON 플라스미드에 NheI/BamHI 제한 효소를 이용하여 클로닝하였다. 구축된 플라스미드는 효모에 형질전환하여 SD-CAA + URA(SDU-CAA) 배지 플레이트에서 30 ℃ 조건으로 3일간 배양하였다. 배양된 콜로니는 진탕 플라스크에서, SDU-CAA 배지에 접종하여 2일간 200 rpm, 30 ℃에서 배양하였다. 구체적으로 Na2HPO4 (Biobasic, #S0404) 5.4 g/L, NaH2PO4·H2O(Biobasic, #SB0880) 8.6 g/L, Glucose(Sigma, #G8270) 20 g/L, Yeast nitrogen base(BD, #233520) 1.7 g/L, Ammonium sulfate(Biobasic, #ADB0060) 5 g/L, Bacto casamino acid(BD, #223050) 5 g/L, Uracil (Sigma, #V001964) 0.004 g/L, pH 6.5의 배지 조건에서 진탕 플라스크 (Duran)에 50ml 접종 시, 시작 흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 하여 2일간 200 rpm, 30 ℃에서 배양하였다. 최종 흡광도가 10-12가 되었을 때, SGU-CAA 배지를 이용하여 Aga2p-CT03-GS linker-E4BU의 효모 표면 발현을 유도하였다. 구체적으로 Na2HPO4 5.4 g/L, NaH2PO4·H2O 8.6 g/L, Galactose20 g/L, Yeast nitrogen base 1.7 g/L, Ammonium sulfate 5 g/L, Bacto casamino acid 5 g/L, Uracil 0.004 g/L, pH 6.5 배지 조건에서 시작 흡광도가 0.5-1이 되도록 하여 2일간 200 rpm, 20 ℃에서 배양하였다.
이후 효모 표면에 발현된 E4BU(WT) 및 E4BU 변이체의 효모 표면 단백질의 유비퀴틴화 활성을 측정하기 위해서, 유비퀴틴화 반응 요소들과 반응시켜 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후, 유세포분석기를 이용하여 측정하였다.
도 1a는 효모 표면에 발현된 E4BU(WT) 및 E4BU 변이체의 효모 표면 단백질 poly-Ub화 기작을 모식도로 나타낸 것이다.
도 1b는 효모 표면에 발현된 E4BU(WT) 및 E4BU 변이체를 이용하여 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 결과를 유세포분석기를 이용하여 분석한 것이다.
구체적으로, E4BU(WT) 및 E4BU 변이체가 발현된 효모 107개를 Avi-6×his-E1 UBA1 10μM, Avi-6×his-E2 UbcH5b 1 μM, 바이오틴화된 Avi-6×his-Ub 100 μM, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2와 함께 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 완충액 조건에서 2 시간, 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 배양이 끝난 후, PBSF(PBS pH7.4, 0.1% BSA)로 잔여 요소를 워싱하고 1:100 비율의 Mouse anti-c-myc 항체(9E10),1:600 비율의 Goat anti-mouse IgG Alexa488(Invitrogen, #A11001), 1:600 비율의 SA-PE(Invitrogen, #S866) 시약을 사용하여 효모 표면에 발현된 E4BU(WT) 및 E4BU 변이체의 발현양 및 바이오틴화된 Avi-6×his-Ub에 의한 효모 표면 유비퀴틴화 정도를 측정하였다. 유세포분석기(FACS CaliburTM)를 이용하여 효모 표면 유비퀴틴화를 비교하였을 때, 효모 표면에 발현된 E4BU(WT)과 비교하여 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성의 증가를 유도시키는 것으로 알려진 E4BU(NT) 변이체가 약 1.7 배 더 높은 유비퀴틴화 신호를 보이는 것으로 나타났다. 이는 마우스의 E4BU에 도입되어 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시키는 것으로 알려진 D1139N, N1142T 돌연변이가 인간 E4BU의 D1268N, N1271T로 도입되었을 때에도 동일하게 적용되어 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성의 증가를 유도시킬 수 있는 것과 이러한 돌연변이에 의한 효모 표면 단백질의 유비퀴틴화의 차이를 유세포분석기를 이용하여 유의미하게 확인할 수 있음을 나타낸다. 본 발명에서는 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 보다 증가시킨 E4BU의 변이체를 선별하기 위한 E4BU 라이브러리의 주형으로 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 변이체인 E4BU(NT)를 이용하였다.
해당 실시예에서 사용된 재조합 항원단백질 Avi-6×his-E1 UBA1, Avi-6×his-E2 UbcH5b, Avi-6×his-Ub를 생산하기 위해 pET23m 벡터(Addgene)에 Avi-6×his tag이 붙은 상태로 발현하도록 E1 UBA1, E2 UbcH5b, Ub을 NcoⅠ/BamHI 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 바이오틴화된 항원의 정제를 위해서 상기 발현 플라스미드와 pBirAcm(Avidity, USA) 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 함께 형질전환 시킨 후, 34 μg/ml의 클로로암페니콜 (chloramphenicol)과 100 μg/ml의 암피실린 (ampicillin)이 포함된 LB 아가(agar) 고체 배지(LB+CA)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 형질전환체의 단일 콜로니를 채집 후, LB+CA 액체 배지에 5mL에 접종하고 18시간 배양하였다. 전배양액을 250ml의 LB+CA 액체 배지에 OD 0.05의 초기접종 농도로 접종하여 본배양하고, 분광광도계 (Thermo Scientific™, #51119200)로 OD600값을 측정하여 OD600 0.8에 도달한 시점에 0.5 mM IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid), 50μM D-Biotin 농도가 되도록 첨가 후 20℃, 150 rpm에서 24시간동안 배양하여 발현을 유도하였다. 이후 4℃, 8000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 대장균 세포를 추출(harvest)하고, 20ml의 Tris-HCl pH8.0 버퍼 (50mM Tris, 300mM NaCl, 1mM 2-mercaptoethatnol)로 현탁(resuspension)하여 초음파 세포 분쇄기(SONICS, #VCX 750)를 이용해 세포를 분쇄하였다. 이후 4℃, 15,000 x g에서 20분간 원심 분리하고, 0.45μm SFCA syringe filter(Sartorius, #16533-K)를 이용해 상층액을 여과(filtration)하여 분비된 단백질을 함유하는 배양 상층액을 얻었다. 50ml의 배양 상층액과 Ni-NTA 레진(GE healthcare, #17-5318-02)을 4℃, 1h 동안 결합시킨 후, 상기 혼합액을 컬럼 (Thermo Scientific™, #29924)에 주입하였다. 혼합액을 여과한 후, 해당 칼럼에 30mM의 이미다졸 (imidazole)이 포함된 Tris-HCl pH8.0 버퍼를 주입하여 비선택적으로 칼럼에 잔존해 있는 단백질을 용리시킨 후, 300mM의 이미다졸 (imidazole)을 포함하는 elution buffer를 칼럼에 주입하고, 1분간 정치 후, 바이오틴화된 단백질을 용리시켰다. 정제된 바이오틴화 단백질 대하여 Centrifugal Filters (Satorious, #VS2022)을 이용해 최종 완충액 (2mM DTT containing PBS, pH 7.4)으로 이미다졸을 투석하였다. 상기 과정을 통해 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다. 바이오틴화 되지 않은 단백질의 경우 동일한 실험 조건에서 50μM D-Biotin을 넣어주지 않은 상태로 정제를 진행하였다.
실시예 2. 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체를 선별하기 위한 효모 표면 발현 디스플레이 라이브러리의 구축
본 발명에서 유비퀴틴화 활성이 향상된 E4BU 변이체의 선별을 위한 효모 표면 발현 디스플레이 라이브러리를 구축하기 위해서, E4BU(WT)와 E2 UbcH5b와 같은 family의 E2 UbcH5c간의 구조(PDB:3l1z)를 기반으로 Alphafold2 프로그램을 이용하여 E4BU(NT)와 E2 UbcH5b간의 결합 구조를 모델링하였다.
도 2a는 E4BU(WT)과 E2 UbcH5b와의 결합구조 모델링 결과와 E4BU(NT) 변이체를 주형으로 디제너레이트 코돈을 사용해 구축한 라이브러리의 디자인을 나타낸 모식도이다.
구체적으로 E4BU(WT)과 E2 UbcH5c간의 구조파일과 동일하게 E4BU(NT)의 L1236, M1237, D1238, M1253, I1257, R1260, H1261, N1264, P1269, F1270, R1272 잔기가 E2 UbcH5b의 A2, K4, R5, K8, K61, F62, S94, P95, A96 잔기와 수소 결합, 정전 상호작용, 소수성 결합을 이룰 것으로 예상되었고, E4BU(WT)과 E2 UbcH5c간의 유비퀴틴화 활성의 중요한 역할을 하는 잔기인 D1238, M1253, R1272를 제외한 L1236, M1237, I1257, R1260, H1261, N1264, P1269, 그리고 F1270의 직접적으로 E2 UbcH5b와 상호작용하는 잔기와, 이전 연구에서 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 것으로 예상되는 잔기인 N1268, T1271 잔기까지 포함하여 총 10개의 잔기에 돌연변이를 주는 라이브러리를 구축하였다.
구체적으로, 1236번 잔기에 MTA (AC/T/A), 1237번 잔기에 VHK (ACG/ACT/GT), 1257번과 1260번 잔기에 VNK (ACG/ACGT/GT), 1261번과 1269번 잔기에 NHC (ACGT/ACT/C), 1264번 잔기에 WWT (AT/AT/T),1268번 잔기에 RAT (AG/A/T), 1270번 잔기에 TWT (T/AT/T), 그리고 1271번 잔기에 AMT (A/AC/T)를 코딩하는 디제너레이션 코돈을 각각 사용하여 라이브러리를 구축하였다.
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구체적으로 상기의 표 3에서 표지하는 아미노산과 확률을 기반으로 돌연변이가 부여될 잔기의 라이브러리를 구축하였으며, 구축된 효모 표면 발현 라이브러리는 3.5×107의 다양성을 가지게 구축되었다.
실시예 3. 효모 표면 발현 디스플레이 라이브러리를 이용한 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 선별
상기 실시예 2에서 구축된 E4BU(NT)를 기반으로 디자인된 E4BU 변이체 라이브러리를 이용하여, 사용하는 Avi-6×his-E2 Ubch5b 단백질의 농도를 점차 낮추며 진행한 4 회의 FACS 선별을 통해 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 보다 증가시킨 E4BU 변이체를 선별하였다.
도 2b는 상기 실시예 2에서 구축된 E4BU(NT)를 기반으로 디자인된 E4BU 변이체 라이브러리를 이용하여 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도 향상을 통해 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체를 선별하기 위해 Fluorescence Associated Cell Sorting (FACS)기기를 이용하여 진행된 선별과정을 차수별로 유세포분석기를 이용해 분석한 결과이다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 구축된 E4BU(NT) 변이체 라이브러리를 정제된 Avi-6Хhis-E1 UBA1, Avi-6Хhis-E2 Ubch5b, 바이오틴화된 Avi-6Хhis-Ub, ATP, MgCl2와 반응시켜 유비퀴틴화를 유도하고, 바이오틴화된 Avi-6Хhis-Ub가 효모 표면 단백질에 유비퀴틴화 되었을 때, SA-PE를 이용하여 유비퀴틴화 정도가 높은 효모를 선별하는 방식으로 선별을 진행하였다. 총 4회의 FACS 선별을 진행하며 모든 차수에서 Avi-6Хhis-E1 UBA1 10 μM, 바이오틴화된 Avi-6Хhis-Ub 100 μM, ATP 2 mM, MgCl2 5 mM로, 10 mM HEPES, 60 mM NaCl pH 8.0 완충액 조건에서 동일하게 진행하였지만, 각 차수 별로 1차 선별에서는 Avi-6Хhis-E2 UbcH5c 단백질의 농도를 1 μM, 효모의 숫자는 5Х108로 진행하였고, 2차-4차 선별에서는 Avi-6Хhis-E2 UbcH5c 단백질의 농도를 200 nM, 효모의 숫자는 5Х107의 조건으로 선별을 진행하였다. 차수가 진행됨에 따라 낮은 농도의 Avi-6Хhis-E2 UbcH5b 조건에서 부유화되는 결과를 보였다.
도 2c는 상기 도 2b의 선별 과정을 거쳐 선별된 효모 표면에 발현된 E4BU 변이체와, 동일한 방식으로 효모 표면에 발현된 E4BU(NT)와의 유비퀴틴-전이 유도를 통한 유비퀴틴화 활성 정도 비교를 위해 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 결과를 유세포분석기를 이용하여 분석한 것이다.
구체적으로, E4BU(WT), E4BU(NT) 및 E4BU 변이체가 발현된 효모 107개를 Avi-6×his-E1 UBA1 10μM, Avi-6×his-E2 UbcH5b 1 μM, 바이오틴화된 Avi-6×his-Ub 100 μM, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2와 함께 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 완충액 조건에서 2 시간, 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 배양이 끝난 후, PBSF(PBS pH7.4, 0.1% BSA)로 잔여 요소들을 워싱하고 1:100 비율의 anti-c-myc mouse IgG (9E10),1:600 비율의 Goat anti-mouse IgG Alexa488 (Invitrogen), 1:600 비율의 SA-PE (Invitrogen) 시약을 사용하여 효모 표면에 발현된 E4BU(WT) 및 E4BU 변이체의 발현양 및 바이오틴화된 Avi-6×his-Ub에 의한 효모 표면 유비퀴틴화 정도를 측정하였다. 유세포분석기 (FACS CaliburTM)를 이용하여 효모 표면 유비퀴틴화를 비교하였을 때, 선별되어진 E4BU 변이체가 E4BU(NT)과 비교하여 약 1.2 ~ 2 배 향상되었음을 확인하였다.
실시예 4. 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 구축
도 3a는 항-GFP 나노바디(vhhGFP4)의 C-말단에 GS 링커 및 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체가 융합된 단백질의 모식도이다.
상기 실시예 3에서 선별된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체(E4BU(#7), E4BU(#8), E4BU(#9), E4BU(#10))및 주형으로 사용된 E4BU(NT)의 유비퀴틴화 활성을 확인하기 위해 특정 단백질을 표적할 수 있는 항체 절편인 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합시키는 형태로 구축하였다.
Figure PCTKR2023004990-appb-img-000006
구체적으로 상기 표 4의 서열번호 8의 항-GFP 나노바디 (vhhGFP4)의 C-말단에 글라이신과 세린으로 이루어진 GS 링커 및 E4BU(NT) 혹은 E4BU 변이체 (E4BU(#7), E4BU(#8), E4BU(#9), E4BU(#10))를 유전자적으로 융합하여 6Хhis tag-항-GFP 나노바디-GS 링커-E4BU 변이체의 순서로 pET23m 벡터에 NcoI/BamHI 제한 효소를 이용하여 클로닝하여 vhhGFP4-E4BU(NT)와 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10)를 발현시키는 벡터를 구축하였다.
실시예 5. 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 정제
상기 실시예 4에서 구축된 vhhGFP4 나노바디의 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체인 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10)을 발현 정제하기 위하여, 상기 발현 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후, 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 아가(agar) 고체 배지(LB+A)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 형질전환체의 단일 콜로니를 채집 후, LB+A 액체 배지 5mL에 접종하고 18시간 배양하였다. 전배양액을 250ml의 LB+A 액체 배지에 OD 0.05의 초기접종 농도로 접종하여 본배양하고, 분광광도계(Thermo Scientific™)로 OD600값을 측정하여 OD600 0.8에 도달한 시점에 0.5 mM IPTG(Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid), 농도가 되도록 첨가 후 20℃, 150 rpm에서 24시간동안 배양하여 발현을 유도하였다. 이후 4℃, 8000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 대장균 세포를 추출(harvest)하고, 20ml의 Tris-HCl pH8.0 버퍼(50mM Tris, 300mM NaCl, 1mM 2-mercaptoethatnol)로 현탁(resuspension)하여 초음파 세포 분쇄기를 이용해 세포를 분쇄하였다. 이후 4℃, 15,000 x g에서 20분간 원심 분리하고, 0.45μm SFCA syringe filter를 이용해 상층액을 여과(filtration)하여 분비된 단백질을 함유하는 배양 상층액을 얻었다. 50ml의 배양 상층액과 Ni-NTA 레진을 4℃, 1h 동안 결합시킨 후, 상기 혼합액을 컬럼에 주입하였다. 혼합액을 여과한 후, 해당 칼럼에 30mM의 이미다졸 (imidazole)이 포함된 Tris-HCl pH8.0 버퍼를 주입하여 비선택적으로 칼럼에 잔존해 있는 단백질을 용리시킨 후, 250mM의 이미다졸 (imidazole)을 포함하는 elution buffer를 칼럼에 주입하고, 1분간 정치 후, 바이오틴화된 단백질을 용리시켰다. 정제된 바이오틴화 단백질 대하여 Centrifugal Filters (Satorious)을 이용해 최종 완충액 (2mM DTT containing PBS, pH 7.4)으로 이미다졸을 투석하였다. 상기 과정을 통해 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
실시예 6. 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 SDS-PAGE 분석을 통한 물성 평가
도 3b는 상기 실시예 2에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10) 단백질에 대해 환원성 또는 비환원성 조건에서 15% SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10) 모두 환원성 또는 비환원성 조건에서 약 25 kDa의 분자량을 확인하였으며, 이는 이론적 분자량인 25.2 kDa과 일치함을 확인하였다. 상기 5종의 단백질 모두 환원성 또는 비환원성 조건에서 80-90% 순도를 보이는 것으로 관찰되었다. 이는 상기 5종의 단백질이 용액 상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
실시예 7. 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 표적 결합능 확인.
상기 실시예 5에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10) 단백질은 항-GFP 나노바디로 인해 표적 단백질인 GFP와의 결합능을 가지고, C-말단에 융합된 E4BU 변이체 단백질로 인해 E2 UbcH5b와의 결합능을 가지게 된다. 각각의 도메인의 표적 단백질과의 결합능을 ELISA를 통해 평가하고자 하였다.
도 3c 및 도 3d는 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10)의 GFP 혹은 E2 UbcH5b에 대한 특이적 결합을 확인하기 위해, 1, 10, 100 nM의 바이오틴화 된 6×his-GFP와 0.2, 2. 20 μM의 바이오틴화 된 Avi-6×his-E2 UbcH5b와의 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
해당 실시예에서 사용된 항원 6×his-GFP는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로, 사용된 항원 E2 UbcH5b는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 정제를 진행하였다.
GFP의 경우 정제 후 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin kit(Thermo Fisher Scientific)의 표준 의정서의 방법으로 바이오틴화 시켜주었고, 바이오틴화된 Avi-6×his-E2 UbcH5b와 함께 ELISA를 진행을 위한 단백질로 사용되었다.
구체적으로, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10) 단백질을 96웰 EIA/RIA 플레이트에 각각 5μg/ml 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후, 0.1% PBST (PBS, pH 7.4, 0.1% Tween20)로 10분간 3회 세척한다. 이후 2% PBSB (PBS, pH 7.4, 2% Bovine Serum Albumin(BSA))로 1시간 동안 결합한 후 0.1% PBST로 10분간 3회 세척한다. 바이오틴화된 6×his-GFP 단백질과 바이오틴화된 Avi-6×his-E2 UbcH5b 단백질을 각각 1, 10, 100 nM과 0,2, 2, 20 μM의 농도가 되도록 2% PBSB로 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후 0.1% PBST로 10분간 3회 세척한다. 표지항체로 HRP가 접합된 스트랩타비딘(HRP-conjugated Streptavidin, Thermo Fisher Scientific)을 1:20000의 비율로 희석시켜 결합시킨다. 이후 TMB ELISA solution으로 반응시켜 450nm 흡광도를 정량하였다.
상기 ELISA 분석을 통해 vhhGFP4-E4BU(NT)와 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8), vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10)는 GFP와 E2 UbcH5b 단백질 모두에서 서로 간의 유의미한 차이가 없는 유사한 수준의 결합능을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 효모 표면 발현 라이브러리를 통해 선별된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체들의 유비퀴틴화 활성의 증가는 E2 UbcH5b와의 결합능의 향상으로 인한 것이 아닌, 다른 자리 입체적 변화를 통해 표적 단백질로의 유비퀴틴-전이를 보다 빠르게 유도하여 유비퀴틴화 활성을 증가시키는 것으로 예상되었다.
상기 도 2c의 결과를 기반으로 차후 실험은 효모 표면 발현된 형태에서 낮은 유비퀴틴화 유도 경향성을 보인 vhhGFP4-E4BU(#9), vhhGFP4-E4BU(#10)를 제외하고 높은 유비퀴틴화 유도 경향성을 보인 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8)의 두 개 단백질을 이용하여 실험을 진행하였다.
실시예 8. 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 크기 배재 크로마토그래피를 통한 물성 평가
상기 실시예 6, 7에서 물성에 이상이 없고, GFP 결합능 및 E2 UbcH5b와의 결합능이 문제가 없음을 확인한 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질에 대해 크기 배재 크로마토그래피를 이용하여 물성을 평가하였다.
도 3e는 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질의 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 280nm에서의 mAU 값을 나타낸 그래프이다.
구체적으로, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질을 1mg/ml의 농도로 45μl 준비한 후 인서트에 넣어 샘플을 준비하였다. 12 mM Phosphate, 137Mm NaCl, 2.7 mM KCl pH 7.4 완충액(PBS pH 7.4 완충액)을 0.75 ml/min의 유속으로 Supderdex200 column (7.8 mm × 300 mm, Sepax Technologies)에 흘려 주어 압력과 280nm에서의 mAU 값이 안정화될 때까지 기다려 준비하였다. 이후 준비된 샘플을 동일 유속으로 20μl 로딩하여 40분 동안의 280nm 에서의 mAU 값을 측정하였다. vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질 모두 크기 배재 크로마토그래피 분석 결과 98% 이상의 단량체 비율을 가지는 것을 확인할 수 있었고, 크기 표시로 사용된 150 kDa의 IgG, 66 kDa의 BSA, 29 kDa의 Carbonic anhydrase와 비교하여 크기와 일치하는 시간에 용출됨을 확인하였다.
실시예 9. 생체 외 유비퀴틴화 실험 조건에서 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 표적 유비퀴틴화 활성 확인.
상기 실시예 7번의 결과에서 표적 단백질인 GFP 및 E2 UbcH5b와의 결합능이 유의미한 차이가 없는 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질에 대해서, 실제 표적 단백질의 유비퀴틴화 활성을 비교하기 위해 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행하였다.
도 4a는 항-GFP 나노바디가 융합된 E4BU 변이체가 생체 외 실험 조건에서 표적 단백질을 라이신48-linked poly-Ub화 시키고, 이를 SDS-PAGE를 통해 분석하는 실험 방법에 대한 모식도이다.
구체적으로 6×his-E1 UBA1 (Boston Biochem)과 상기 실시예 1에서 정제된 Avi-6×his-E2 UbcH5b, Avi-6×his-Ub, 상기 실시예 5에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 혹은 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8)의 단백질, ATP, MgCl2를 각 실험의 조건에 맞추어 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 buffer에 정해진 시간동안 반응시킨 후 15% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient TGX gel (Bio-Rad, #456109)을 이용하여 분석을 진행하였다.
도 4b는 상기 실시예 5에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#7), vhhGFP4-E4BU(#8)을 이용하여 각각의 단백질 0, 187, 375, 750 nM의 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과이다.
구체적으로 6×his-E1 UBA1 50 nM, Avi-6×his-E2 UbcH5b 1 μM, vhhGFP4-E4BU 변이체 단백질0, 187, 375, 750 nM, Avi-6×his-Ub 30 μM, 표적 단백질인 6×his-GFP 0.75 μM, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2를 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 buffer에서 50 μl의 부피로 1 시간 반응시켜 주었다. 이후 5%의 2-메르캅토에탄올이 들어간 조건의 5 × SDS-PAGE sample loading buffer 10 μl 첨가 후 95 ℃에서 15분간 끓여주어 유비퀴틴화 반응을 멈춰주었다. 유비퀴틴화가 멈춘 반응물을 4-20% gradient TGX gel에 15 μl 로딩 후, 50 V 조건으로 20분, 90 V 조건으로 100분을 전기영동하여 분석을 진행하였다. 이후 Coomassie Brilliant Blue R-250에서 60 분간 염색 후 단백질 밴드를 확인하였다.
vhhGFP4-E4BU(NT)와 비교하여 vhhGFP4-E4BU(#7)에서는 vhhGFP4-E4BU(NT)와 유사한 정도의 poly-Ub 밴드가 관찰되었고, vhhGFP4-E4BU(#8)를 사용한 반응물에서는 낮은 농도에서도 보다 진한 poly-Ub 밴드를 관찰할 수 있었다. 따라서 이후 실험은 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체 중에서 가장 활성이 좋은 것으로 생각되는 vhhGFP4-E4BU(#8)을 이용하여 실험을 진행하였다.
도 4c는 상기 실시예 5에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8)을 이용하여 유비퀴틴화 실험 요소의 존재 유/무 조건에서의 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 4-20% gradient TGX gel을 이용하여 분석한 결과이다.
구체적으로 6×his-E1 UBA1 50 nM, Avi-6×his-E2 UbcH5b 4 μM, vhhGFP4-E4BU 변이체 단백질3 μM, Avi-6×his-Ub 50 μM, 표적 단백질인 6×his-GFP 1.5 μM, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2를 각각 E1 UBA1 부재 조건, E2 UbcH5b 부재 조건, vhhGFP-E4BU 변이체 단백질 부재 조건, Ub 부재 조건, GFP 부재 조건에서, 부재 조건 단백질 외의 다른 요소는 모두 포함된 상태로 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 buffer에서 50 μl의 부피로 2 시간 반응시켜 주었다. 이후 5%의 2-메르캅토에탄올이 들어간 조건의 5 × SDS-PAGE sample loading buffer 10 μl 첨가 후 95 ℃에서 15분간 끓여주어 유비퀴틴화 반응을 멈춰주었다. 유비퀴틴화가 멈춘 반응물을 4-20% gradient TGX gel에 15 μl 로딩 후, 50 V 조건으로 20분, 90 V 조건으로 100분을 전기영동하여 분석을 진행하였다. 이후 Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, #161436)에서 60 분간 염색 후 단백질 밴드를 확인하였다. 유비퀴틴화 반응 요소 중 E1 UBA, E2 UbcH5b, vhhGFP-E4BU 변이체 그리고 Ub 부재 조건에서는 유비퀴틴화 반응이 진행되지 않아 높은 분자량을 가지는 단백질 밴드가 관찰되지 않았지만, GFP 부재 조건 및 모든 요소가 다 포함되어 있는 조건에서는 라이신48-linked poly-Ub화가 진행되어 높은 분자량을 가지는 단백질 밴드가 관찰되었다.
도 4d는 생체 외 유비퀴틴화 실험에서 사용되는 상기 실시예 5에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8)단백질의 농도에 따른 유비퀴틴화 정도를 확인하기 위해 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 각각의 단백질 0, 187, 375, 750, 1500 nM 농도에 대하여 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행한 후 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient TGX gel을 이용하여 분석한 결과이다.
구체적으로 6×his-E1 UBA1 50 nM, Avi-6×his-E2 UbcH5b 2 μM, vhhGFP4-E4BU 변이체 단백질0, 187, 375, 750, 1500 nM, Avi-6×his-Ub 50 μM, 표적 단백질인 6×his-GFP 0.75 μM, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2를 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 buffer에서 50 μl의 부피로 2 시간 반응시켜 주었다. 이후 5%의 2-메르캅토에탄올이 들어간 조건의 5 × SDS-PAGE sample loading buffer 10 μl 첨가 후 95 ℃에서 15분간 끓여주어 유비퀴틴화 반응을 멈춰주었다. 유비퀴틴화가 멈춘 반응물을 4-20% gradient TGX gel에 15 μl 로딩 후, 50 V 조건으로 20분, 90 V 조건으로 100분을 전기영동하여 분석을 진행하였다. 이후 Coomassie Brilliant Blue R-250에서 60 분간 염색 후 단백질 밴드를 확인하였다. 3 회의 동일 조건 실험 진행 결과 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 모두에서 0의 농도 조건을 제외하고 높은 분자량을 가지는 단백질 밴드가 관찰되었으며, 동일 농도 조건에서 vhhGFP4-E4BU(NT)와 비교하여 vhhGFP4-E4BU(#8)에서 높은 분자량을 가지는 단백질 밴드가 더 강하게 관찰되었으며, 샘플의 밴드 정량화를 위해 ImageJ software (National Institutes of Health, USA)를 이용하여 각 샘플의 밴드를 비교한 결과 750 nM의 농도 조건에서는 약 2 배, 1500 nM의 농도 조건에서는 약 1.5 배의 밴드 강도를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 자유 Ub의 잔여량을 확인하였을 때, 187 nM의 농도 조건에서부터 vhhGFP4-E4BU(NT)와 비교하여 절반 이하의 자유 Ub 잔여량을 보였으며, 1500 nM 농도에서 약 25 %가량의 GFP 단백질 밴드의 감소를 관찰할 수 있었다. 이를 막대그래프를 통하여 분석하였을 때, 잔여 Ub양을 비교한 결과에서는 187 nM, 375 nM, 750 nM에서 vhhGFP4-E4BU(NT)와 vhhGFP4-E4BU(#8)간에 유의미한 차이를 보였고, 높은 분자량을 가지는 poly-Ub 밴드 강도를 비교하였을 때에는 750 nM, 1500 nM에서, GFP의 잔여량을 비교하였을 때에는 750 nM, 1500 nM의 농도 조건에서 vhhGFP4-E4BU(NT)와 vhhGFP4-E4BU(#8)간에 유의미한 차이를 보였다.
SDS-PAGE 상에서는 육안으로 관찰하기 힘든 단백질의 밴드 확인 및, 높은 분자량을 가지는 단백질 밴드를 분석하기 위해서 웨스턴 블랏 실험을 진행하였다.
도 4e는 상기 도 4d 실험에서 사용된 것과 동일한 생체 외 유비퀴틴화 반응물을 이용하여 웨스턴 블랏 실험을 통해 라이신48-linked poly-Ub화 밴드 및 라이신48-linked poly-Ub화 된 GFP 밴드를 관찰한 실험이다.
구체적으로 도 4d 실험에서 사용된 생체 외 유비퀴틴화 반응물을 15% SDS-PAGE에 전기 영동 시킨 뒤, 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시켜주었다. 이후 4% BSA가 함유된 TBST (TBS pH7.4, 0.05% Tween 20) 완충액에서 1 시간동안 막을 블락킹하였다. 이후 TBST 완충액 조건에서 HRP가 융합된 Rabbit anti-GFP 항체(1:1000, Abcam, #ab290) 혹은 anti-K48 Ub linkage 항체(1:1000, Abcam, #ab140601)를 처리 후 상온에서 2 시간동안 반응시켜주었다. 반응이 끝난 막은 HRP가 융합된 Rabbit anti-mouse 항체 (1:4000, Sigma, #9044) 혹은 HRP가 융합된 Goat-anti rabbit 항체 (1:4000, Sigma, #A6154)를 사용하여 상온에서 1 시간 동안 배양되었다. 각 배양 종료 시, 니트로셀룰로오스 막은 5 분동안 3 회 세척하였다. 그 후 West-Q Pico ECL 솔루션 (GenDEPOT)과 ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare)를 사용하여 단백질을 시각화 하였다. 웨스턴 블랏 데이터는 ImageJ software를 이용하여 밴드 강도를 정량화 하였다. Anti-K48 Ub linkage 항체를 이용하여 라이신48-linked poly-Ub가 표지된 높은 분자량의 단백질 밴드를 관찰하였을 때, 0 nM의 농도 조건을 제외한 모든 농도 조건에서 평균적으로 vhhGFP4-E4BU(#8)을 처리한 샘플에서 더 진한 밴드 강도를 보이는 것을 확인하였으며, 1500 nM에서는 약 25%가량 높은 밴드 강도를 확인할 수 있었다. 또한 Rabbit anti-GFP 항체를 이용하여 단백질 밴드를 관찰하였을 때, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질에서 모두 GFP, GFP-Ub (단량체), GFP-Ub (이량체), GFP-Ub (다량체)로 예상되는 단백질 밴드가 확인되었고, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질의 농도가 증가함에 따라 GFP 단백질의 밴드 강도가 약해지는 것을 관찰하였다. 이를 막대 그래프를 통하여 분석하였을 때, 높은 분자량의 poly-Ub 밴드 강도의 경우 1500 nM에서, GFP의 잔여량의 경우 187 nM, 750 nM, 1500 nM의 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 농도에서 유의미한 차이를 보였다.
위 실험을 통하여 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8)를 이용한 생체 외 유비퀴틴화 실험으로 표적 단백질인 GFP 및 다른 유비퀴틴화 요소 단백질에 poly-Ub화 되어 높은 분자량을 가지는 것이 관찰되었고, 이 높은 분자량의 단백질 밴드는 표적 단백질인 GFP가 라이신48-linked poly-Ub가 표지되어 있다는 것을 웨스턴블랏 실험을 통해 확인되었다. 이는 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체인 E4BU(#8)가 항 GFP-나노바디에 융합된 vhhGFP4-E4BU(#8)가 선별의 주형으로 사용된 E4BU(NT)가 융합된 vhhGFP4-E4BU(NT)와 비교하여 더 진한 밴드를 보이는 것을 통해, vhhGFP4-E4BU(NT) 보다 vhhGFP4-E4BU(#8)가 보다 더 표적 단백질의 라이신48-linked poly-Ub화 유도에 효과적임을 확인하였다.
실시예 10. 생체 외 유비퀴틴화 실험 조건에서 항-GFP 나노바디 C-말단에 융합된 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체의 표적 유비퀴틴화 반응 속도 확인.
상기 실시예 9번 실험에서 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질을 이용해서 생체 외 유비퀴틴화 실험을 진행하였을 때, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8)의 처리 농도에 따라 라이신48-linked poly-Ub화 정도가 달라지고, vhhGFP4-E4BU(NT)과 비교하여 vhhGFP4-E4BU(#8)의 라이신48-linked poly-Ub화 되는 정도가 더 강함을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 실험을 통해 확인하였다. 그 후 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 유비퀴틴화 반응 속도를 직접적으로 계산하여 차이를 분석하기 위하여, 유비퀴틴화 반응 시간에 따른 자유 Ub의 잔여량을 측정하는 실험을 진행하였다.
도 4f는 상기 실시예 5에서 정제된 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8)단백질을 사용한 생체 외 유비퀴틴화 실험에서, 반응 시간에 따른 자유 Ub의 잔여량을 확인하기 위해 0, 1.5, 3, 7, 15, 30, 60 분간 생체 외 유비퀴틴화 실험을 반응한 후 환원성 조건에서 15% SDS-PAGE 혹은 4-20% gradient TGX gel을 이용하여 분석한 결과이다.
구체적으로 6×his-E1 UBA1 50 nM, Avi-6×his-E2 UbcH5b 2 μM, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질 1.5 μM, Avi-6×his-Ub 8 μM, 표적 단백질인 6×his-GFP 0.75 μM, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2를 10 mM HEPES, 60 mM NaCl, pH 8.0 buffer에서 50 μl의 부피로 0, 1.5, 3, 7, 15, 30, 60 분간 반응시켜 주었다. 이후 5%의 2-메르캅토에탄올이 들어간 조건의 5 × SDS-PAGE sample loading buffer 10 μl 첨가 후 95 ℃에서 15분간 끓여주어 유비퀴틴화 반응을 멈춰주었다. 유비퀴틴화가 멈춘 반응물을 4-20% gradient TGX gel에 15 μl 로딩 후, 50 V 조건으로 20분, 90 V 조건으로 100분을 전기영동하여 분석을 진행하였다. 이후 Coomassie Brilliant Blue R-250에서 60 분간 염색 후 단백질 밴드를 확인하였다. 3 회의 동일 조건 실험 진행 결과 vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 모두에서 생체 외 유비퀴틴화 실험의 반응 시간이 증가함에 따라 자유 Ub의 잔여량이 점차 감소하는 것을 확인하였다. vhhGFP4-E4BU(NT)의 경우, 반응 시간 30분 이상 부터 유의미한 자유 Ub의 잔여량의 감소가 관찰되었고, vhhGFP4-E4BU(#8)에서는 15분 이상의 반응 시간부터 유의미한 자유 Ub의 잔여량의 감소가 관찰되었다. 샘플의 밴드 정량화를 위해 ImageJ software를 이용하여 각 샘플의 밴드를 비교하였다.
도 4g는 상기 도 4f의 실험의 결과를 ImageJ software로 분석한 자유 Ub의 잔여량을 일차 지수적 감쇠 방정식을 이용하여 선형 그래프로 나타낸 결과이다. 그래프를 확인하였을 때, 반응 시간이 7 분이 지난 시점에서부터 유의미한 자유 Ub 잔여량의 차이가 확인되었고, 일차 지수적 감쇠 방정식을 통해 자유 Ub의 반감기를 확인하였을 때, vhhGFP4-E4BU(NT)의 경우 Ub(t 1/2)=16.5 ± 2.6 분, vhhGFP4-E4BU(#8)의 경우 Ub(t1/2)=5.6 ± 1.3 분으로 측정되어 vhhGFP4-E4BU(#8)가 vhhGFP4-E4BU(NT)보다 약 3 배 정도 빠른 자유 Ub 잔여량의 감소를 보임을 확인하였으며, 7분, 15분 조건에서 잔여 Ub 량의 유의미한 차이를 보였다.
도 4h는 상기 도 4f 실험에서 사용된 것과 동일한 생체 외 유비퀴틴화 반응물을 이용하여 웨스턴 블랏 실험을 통해 유비퀴틴화 밴드 및 라이신48-linked poly-Ub화 된 GFP 밴드를 관찰한 실험이다.
상기 도 4f에서 사용된 생체 외 유비퀴틴화 반응물을 15% SDS-PAGE에 전기 영동 시킨 뒤, 니트로셀룰로오스 막에 트랜스퍼시켜주었다. 이후 4% BSA가 함유된 TBST (TBS pH7.4, 0.05% Tween 20) 완충액에서 1 시간동안 막을 블락킹하였다. 이후 TBST 완충액 조건에서 HRP가 융합된 Rabbit anti-GFP 항체 (1:1000) 혹은 anti-Ub 항체 (1:1000)를 처리 후 상온에서 2 시간동안 반응시켜주었다. 반응이 끝난 막은 HRP가 융합된 Rabbit anti-mouse 항체 (1:4000) 혹은 HRP가 융합된 Goat-anti rabbit 항체 (1:4000)를 사용하여 상온에서 1 시간 동안 배양되었다. 각 배양 종료 시, 니트로셀룰로오스 막은 5 분동안 3 회 세척하였다. 그 후 West-Q Pico ECL 솔루션과 ImageQuant LAS 4000 mini를 사용하여 단백질을 시각화 하였다. 웨스턴 블랏 데이터는 ImageJ software를 이용하여 밴드 강도를 정량화 하였다. Anti-Ub 항체를 이용하여 Ub이 표지된 단백질 밴드를 관찰하였을 때, 0 분의 반응 시간 조건을 제외한 모든 반응 시간 조건에서 높은 분자량을 가지는 단백질 밴드가 관찰되었고, vhhGFP4-E4BU(NT)에서는 15 분 이후의 반응 시간 조건부터, vhhGFP4-E4BU(#8)에서는 7 분 이후의 반응 시간 조건부터 유의미한 자유 Ub의 잔여량 감소가 확인되었다. 또한 Rabbit anti-GFP 항체를 이용하여 단백질 밴드를 관찰하였을 때, vhhGFP4-E4BU(NT) 및 vhhGFP4-E4BU(#8) 단백질에서 모두 GFP, GFP-Ub (단량체), GFP-Ub (이량체), GFP-Ub (다량체)로 예상되는 단백질 밴드가 확인되었다.
위 실험을 통하여 vhhGFP4-E4BU(NT)와 비교하여 vhhGFP4-E4BU(#8)이 약 3배가량 빠른 자유 Ub 잔여량의 감소를 보임을 확인하였다.
본 발명에 따른 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체는 E2(UbcH5b)-Ub와 결합하여 다른 자리 입체적인 변화를 통해 기존의 E4BU 단백질보다 향상된 표적단백질의 라이신48-linked poly-Ub화를 유도할 수 있다. 구체적으로 E1 UBA1, E2 UbcH5b, ATP, MgCl2, Ub와의 반응 조건 하에서 기존의 E4BU(WT)과 E4BU(NT) 변이체와 비교하여 보다 빠르게 유비퀴틴-전이를 유도하여 기질 단백질로의 향상된 라이신48-linked poly-Ub화를 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체가 항-GFP 나노바디의 C-말단에 융합된 BioPROTAC의 경우, 표적 단백질(GFP)의 라이신48-linked poly-Ub화가 유도되고, 이는 기질 특이성을 가질 수 있는 항체절편과 다른 자리 입체적 변화를 통해 E2-Ub의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킨 E4BU 변이체가 융합되었을 때 다양한 표적 단백질의 라이신48-linked poly-Ub화를 유도할 수 있음을 보여준다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (7)

  1. 유비퀴틴 (Ubiquitin, Ub)가 결합된 E2 (ubiquitin conjugating enzyme) (E2-Ub)의 유비퀴틴-전이 속도를 향상시켜 유비퀴틴화 활성을 증가시킬 수 있는 다른 자리 입체적 변화 (allosteric regulation)를 포함하는, E4B (Monomeric U-box-type E3)의 U-box 도메인 (E4BU) 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 서열 중 10번째 내지 25번째 아미노산 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된, E4BU 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 4 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 E4BU 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 E4BU 변이체를 코딩하는 핵산.
  5. 제4항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  6. 제4항의 핵산 또는 제5항의 발현벡터로 형질전환된 재조합 세포.
  7. 다음 단계를 포함하는 E4BU 변이체의 제조방법:
    (a) 제6항의 재조합 세포를 배양하여 E4BU 변이체를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 E4BU 변이체를 회수하는 단계.
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