WO2023198519A1 - Extraits de fleurs de crocus sativus, compositions les comprenant et leurs utilisations dans les soins buccaux - Google Patents

Extraits de fleurs de crocus sativus, compositions les comprenant et leurs utilisations dans les soins buccaux Download PDF

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WO2023198519A1
WO2023198519A1 PCT/EP2023/058789 EP2023058789W WO2023198519A1 WO 2023198519 A1 WO2023198519 A1 WO 2023198519A1 EP 2023058789 W EP2023058789 W EP 2023058789W WO 2023198519 A1 WO2023198519 A1 WO 2023198519A1
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WO
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crocus sativus
extract
composition
flowers
flower extract
Prior art date
Application number
PCT/EP2023/058789
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Elodie OGER
Imane GARCIA
Christophe CAPALLERE
Sandrine PINACOLO
Laura MOURET
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Isp Investments Llc
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    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
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    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of oral hygiene and treatment therapy of oral pathologies. It relates more particularly to compositions comprising extracts of Crocus sativus flowers for oral hygiene or protection of the oral cavity.
  • the invention also relates to compositions comprising extracts of Crocus sativus flowers for their therapeutic uses in the prevention and treatment of conditions of the oral cavity, in particular bleeding, inflammation, tooth loosening or loss of conjunctival substance associated with it. periodontitis and gingivitis caused by the bacteria Porphyromonas gingivalis.
  • the oral cavity is colonized by a large number of microorganisms making up the oral microbiome.
  • the microorganisms are essentially commensal bacteria which are organized to maintain the balance of this ecosystem, which does not exclude the presence of pathogenic bacteria.
  • the oral cavity is very frequently the seat of pathologies such as gingivitis and periodontitis. Gingivitis is a reversible inflammatory condition, generally caused by an accumulation of bacterial biofilm, which manifests itself by gingival redness, edema, sometimes bleeding, but without tooth loss.
  • Periodontitis characterized by resorption of the alveolar bone, destruction of the periodontal ligament and ultimately the loosening of the teeth.
  • Periodontitis One of the major causes of periodontitis is the imbalance of the oral microbiome, associated with a weakness in the immune response. Certain pathogenic bacteria then combine to supplant the commensal bacteria.
  • gingival secretes an enzyme called gingipain allowing the bacteria to capture the iron contained in the heme of host tissues. This enzyme is also involved in the breakdown of cell junctions of the gingival epithelium, induction of inflammation, gum edema, bleeding tendency and destruction of type I and III collagen fibers of connective tissue. gingival.
  • the problem that the invention proposes to solve is to provide a new active ingredient capable of targeting the activity of the gingipain enzyme, in order to specifically limit the pathogenic activity of the bacterium Porphyromonas gingivalis while preserving the microbiome. oral and limit the consequences of periodontitis and gingivitis.
  • the inventors have in fact discovered that an extract of Crocus sativus flowers had an inhibitory effect on the enzymatic activity of gingipain and could effectively limit the development of the bacterium Porphyromonas gingivalis associated with periodontitis and gingivitis.
  • Crocus sativus is a herbaceous plant of the Iridaceae family mainly cultivated for the pistil of its flowers called saffron, used in food as a spice or for its antioxidant and anti-inflammatory properties, particularly in oral or dental conditions ( Forouzanfar A. et al., Iran J Med Sci.2016 May;41).
  • Most of the extracts described in the prior art are extracts of pistils or whole flowers, therefore including the pistil. These extracts have the disadvantage of containing a high quantity of compounds such as safranal, a substance classified as a skin irritant, eye irritant and skin sensitizer according to the harmonized global classification system (UN-GHS).
  • Patent documents CN11330420A, CN102657747A and CN109646535A describe extracts obtained from flowers devoid of pistils obtained using absolute ethanol or hydro-ethanolic solvents.
  • Patent FR2928835B1 describes the preparation of an extract of Crocus sativus petals obtained by maceration for several days in 70% ethanol.
  • the extract obtained contains approximately 50% of flavonoid-type polyphenols including a significant quantity of kaempferol, which gives it skin depigmenting properties.
  • Hydroalcoholic solvents with a high alcohol content as used in patent document FR2928835B1 are also capable of extracting allergenic compounds such as geraniol or linalool because they are molecules having a strong affinity for this type. of solvent.
  • the present invention describes the use of a mainly aqueous hydroalcoholic solvent. Thus, the extraction of these unwanted compounds is reduced.
  • the inventors have shown that the extract of the invention does not contain any of the 57 substances identified as potential cosmetic allergens by the Scientific Committee for Consumer Safety.
  • the extraction yield of polar phytocompounds, such as proteins, amino acids or phenolic acids is improved, compared to hydro-ethanolic extraction.
  • Another problem that the invention therefore proposes to solve is to provide a new aqueous extract of Crocus sativus prepared from whole flowers devoid of pistils and not comprising allergenic, irritating or potentially toxic molecules, for its use. in oral hygiene care or the prevention and treatment of oral pathologies.
  • the use of a mainly aqueous hydroalcoholic solvent also has the advantage of increasing the extraction yield of phytocompounds of interest such as sugars, amino acids, proteins, vitamins and acids. organic, which we find little or nothing in the extracts of the prior art.
  • the raw material of the invention only includes Crocus sativus flowers devoid of pistils meeting the naturalness requirement of the market.
  • the above extract is obtained by maceration of flowers devoid of pistils in a predominantly aqueous hydro-polyalcoholic solvent comprising 20 to 50% alcohol by weight relative to the total weight of solvent, the alcohol being able to be chosen from propanediol, propylene glycol, butylene glycol and pentanediol.
  • the second object of the invention is an oral hygiene or therapeutic composition comprising, as active ingredient, an effective quantity of Crocus sativus extract, and a physiologically acceptable medium.
  • the third object of the invention is the non-therapeutic use of the composition for oral hygiene.
  • the fourth object of the invention is a composition comprising an extract of Crocus sativus flowers for its therapeutic use in the prevention or treatment of conditions of the oral cavity and in particular gingivitis and/or periodontitis.
  • FIG.2 Modulation of the activity of gingipain specific to lysine by a 1% Crocus sativus extract ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description
  • FIG.3 Test for inhibition of hemolysis induced by the bacterium Porphyromonas gingivalis in the presence of a 1% Crocus sativus extract.
  • FIG.4 Measurement of the expression of CD14+ and CD163 markers on the surface of type 2 macrophages, treated or not with 1% Crocus sativus extract.
  • hydro-polyalcoholic is meant the mixture of at least one polyol and water, the latter comprising at least two alcohol radicals, more precisely from 2 to 9 alcohol radicals and from 3 to 12 carbon atoms.
  • organic acids we mean derivatives of the catabolism of amino acids, fatty acids and sugars comprising an acid function.
  • This group includes alpha-hydroxylated (AHA) or polyhydroxylated carboxylic acids such as lactic, malic, citric acids, carboxylic acids derived from fruit sugars or any other parts of plants such as uronic acids, or even diacids such that succinic acid ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description
  • phenolic compounds or “polyphenols” we mean molecules of plant origin which have an aromatic ring carrying one or more hydroxyl groups, such as phenolic acids, flavonoids or their derivatives, tannins and all other polyphenols.
  • flavonoids we mean phenolic compounds all sharing the same basic structure formed by two aromatic rings linked by three carbons.
  • glycosylated flavonoids we mean flavonoids linked to one or more sugars such as kaempferol sophoroside, kaempferol glucoside and quercetin diglucoside.
  • phytocompounds of interest we mean all the molecules present in the Crocus sativus flower extract of the invention and in particular, sugars, phenolic compounds, proteins, amino acids, vitamins and organic acids, potentially responsible for the beneficial biological effects observed. When a range of values is described, the limits of this range must be understood as explicitly including all the intermediate values of the range.
  • a value range between 1% and 10% should be understood to include 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, and 10%. as well as all decimal values between 1% and 10%.
  • the numerical percentage values are percentages by weight, that is to say the weight of a compound relative to the total weight of the mixture envisaged, unless otherwise specified.
  • the compositions described in the present application may “include”, “consist of” or “consist essentially of”, the essential compounds or the optional ingredients. [0042] “Consist essentially of” means that the composition or component may include additional ingredients, if these additional ingredients do not modify the basic characteristics or the new characteristics of the composition or of the use described in the present application.
  • a “physiologically acceptable medium” designates a vehicle suitable for contact with the mucous membranes, without toxicity, irritation, response ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description undue and similar allergic or intolerance reaction, and proportionate to a reasonable benefit/risk ratio.
  • topical application is meant the fact of applying to the surface of a mucous membrane the composition comprising the extract of Crocus sativus flowers according to the invention.
  • anti-hemolytic is meant a compound which has the property of preventing the destruction of red blood cells induced by the bacterium Porphyromonas gingivalis.
  • orientation of the inflammatory response is meant: the stimulation of a particular category of the macrophage population with the aim of obtaining an anti-inflammatory or pro-inflammatory type response.
  • effective quantity we designate the minimum quantity of extract according to the invention necessary to obtain at least one of the desired biological activities, in particular reducing the enzymatic activity of gingipains, reducing hemolysis, presenting an anti- inflammatory or any other biological marker studied, without this quantity being toxic.
  • the first subject of the invention is an extract of flowers of the species Crocus sativus, obtained by the following process: [0050] In step a), the fresh flowers or dry devoid of pistils, are placed in the presence of a predominantly aqueous hydro-polyalcoholic solvent comprising 20 to 50% alcohol by weight relative to the total weight of the solvent. [0051] For the purposes of the invention, the hydro-polyalcoholic solvent is therefore a mixture of between 20 and 50% (w/w) of polyalcohol in water. [0052] The Crocus sativus flowers used do not have pistils, that is to say that the three red stigmas of the pistil which constitutes saffron were manually removed.
  • Dried Crocus sativus flowers are preferably used. ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description [0054] Preferably, the flowers are crushed before being brought into contact with the hydro-polyalcoholic solvent, in order to optimize the exchanges between the extractive solution and the plant material. [0055] Preferably, the plant material / extraction solution ratio is preferably between 0.5 to 20% w/w, more preferably between 2 and 10% and even more preferably this ratio is 2.5 %.
  • the hydro-polyalcoholic solvents used have a solubility parameter as well as a dynamic viscosity three times higher than the mono-alcoholic solvents.
  • the extraction yield according to the process of the invention is improved and is around 40%, which is a yield that is difficult to achieve by dipping techniques. extraction by maceration.
  • the polyalcohol is chosen from propanediol, propylene glycol, butylene glycol or pentanediol, or any mixture of these solvents.
  • the hydro-polyalcoholic solvent is propanediol or butylene glycol at a ratio of 25% to 35% alcohol.
  • the hydro-polyalcoholic solvent preferably comprises 30% alcohol.
  • the hydro-polyalcoholic solvent is propanediol at a ratio of 30%.
  • the presence of propanediol in the extraction solvent also has the advantage of stabilizing the phytocompounds of the final extract throughout the extraction and contributes to protecting the extract from contamination by microorganisms. ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description [0063] In step b), the mixture is gently stirred for 30 minutes to two hours at a temperature between room temperature and 80°C.
  • the moderate agitation is of the mixing type.
  • the temperature is adjusted and maintained preferably between 20 and 60°C, more preferably between 30 and 50°C, even more preferably at 45°C.
  • the maceration time is between 30 minutes and 1.5 hours and even more preferably the maceration time is 1 hour.
  • the pH is controlled and must be between 4.0 and 7.0.
  • step c) the mixture obtained in b) is purified to eliminate the solid plant material and recover the liquid part.
  • This purification step can be carried out by any method known to those skilled in the art, but preferably the purification is carried out by centrifugation and in particular by centrifugation at 4000 g for 10 min.
  • step d the extract obtained in the previous step is clarified by at least six sequential filtration steps using filters with decreasing porosities ranging from 30 to 0.2 ⁇ m.
  • step e sterilizing filtration is carried out on a sterile filter with a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • the pH is measured but it is not adjusted and must be between 4.5 and 6.5.
  • Crocus sativus flower extract [0073] The extract obtained by the process described above is analyzed and has the following characteristics, it has an amber to dark amber color, the extract has a slightly viscous consistency and a slightly opalescent to opalescent.
  • the density is 1.01 to 1.04 g/cm 3 , the pH is between 4.5 and 6.5.
  • This extract contains 9 to 13 g/kg of dry matter, and includes 5.5 to 8.5 g/kg of total sugars, 2.5 to 5.5 g/kg of proteins, 0.35 to 0.55 g/kg of amino acids, 0.6 to 1.2 g/kg of organic acids, 0.4 to 1.2 g/kg of total phenolic compounds including 150 to 450 mg/kg of kaempferol sophoroside, 5 to 30 mg/kg of kaempferol glucoside and 10 to 40 mg/kg of quercetin diglucoside.
  • the extract obtained therefore comprises from 0.17 g/kg to 0.55 g/kg of flavonoid type polyphenols.
  • the extract obtained also comprises 1.2 to 3.4 mg/kg of B vitamins including 0.5 to 1.5 mg/kg of vitamin B5.
  • the extract thus obtained can optionally be diluted in a physiologically acceptable solvent for therapeutic use.
  • physiologically acceptable solvents we can cite water, glycerol, ethanol, propanediol as well as its natural version from corn, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated diglycols or propoxylated, cyclic polyols or any mixture of these solvents.
  • compositions comprising an extract of Crocus sativus flowers
  • a second aspect of the invention is an oral hygiene or therapeutic composition comprising, as active ingredient, an effective quantity of the extract of Crocus sativus flowers, and a physiologically acceptable environment.
  • the effective quantity of the Crocus sativus flower extract of the invention corresponds to a concentration of between 0.5% and 10%, preferably to a concentration of between 0.8%. and 2%, and even more preferably at a concentration of 1%.
  • the composition usable according to the invention can be applied by any appropriate route, in particular oral, or external topical, and the formulation of the compositions will be adapted by those skilled in the art.
  • the compositions according to the invention are in a form suitable for topical application which can be in more or less form. ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description less fluid whether it is a mouthwash or a gel.
  • compositions must therefore contain a physiologically acceptable medium with an appropriate pH, that is to say compatible with the oral mucosa, the skin and the appendages, without risk of discomfort during their application and cover all suitable cosmetic forms.
  • a physiologically acceptable medium commonly used in the envisaged field of application, mention may be made, for example, of adjuvants necessary for the formulation, such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, preservatives, perfumes. , odor absorbers, etc.
  • adjuvants necessary for the formulation such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, preservatives, perfumes. , odor absorbers, etc.
  • compositions comprising an extract of Crocus sativus flowers
  • the third object of the invention is the non-therapeutic use of the composition for oral hygiene.
  • This particular embodiment of the invention concerns a subject having healthy oral mucous membranes and wishing to apply care to prevent the appearance of pathologies such as periodontitis or gingivitis or to protect their oral cavity and in particular their gums.
  • a fourth aspect of the invention is a composition comprising the extract of Crocus sativus flowers of the invention for its therapeutic use for the prevention or treatment of conditions of the oral cavity.
  • the application is preferably a topical application.
  • the conditions of the oral cavity concerned are bleeding, inflammation, gingival recession, dental loosening or loss of conjunctival substance associated with periodontitis and gingivitis.
  • ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description [0089]
  • the present invention aims to provide a new active ingredient capable of targeting the activity of the gingipain enzyme, in order to specifically limit the activity of the bacterium Porphyromonas gingivalis while preserving the microbiome oral.
  • the oral cavity conditions concerned are periodontitis and/or gingivitis, when these pathologies are caused by the bacterium Porphyromonas gingivalis.
  • the specificity of the inhibition of gingipain activity was evaluated by measuring the collagenase activity of gingipain in the presence of the Crocus sativus extract of the invention at 1%.
  • the Crocus sativus flower extract of the invention was tested on certain biological markers associated with the virulence of the bacterium Porphyromonas gingivalis, cell lysis mechanisms as well as the inflammatory response.
  • the Crocus sativus flower extract of the invention has demonstrated its effectiveness in inhibiting the activity of gingipains secreted by Porphyromonas gingivalis and more particularly gingipains specific to arginine.
  • the invention thus also relates to a composition comprising an extract of Crocus sativus flowers of the invention for its therapeutic use in which the gingipain enzymes and more particularly the gingipain enzymes specific to arginine are inhibited.
  • the Crocus sativus flower extract of the invention has also demonstrated its effectiveness in preventing the lysis of red blood cells.
  • the Crocus sativus flower extract of the invention has also demonstrated its effectiveness in directing and increasing the anti-inflammatory response. ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description
  • the extract of Crocus sativus flowers of the invention also has an anti-bleeding action, demonstrated by an anti-hemolytic activity on human red blood cells.
  • Crocus sativus flower extract of the invention allowed an increase in the recruitment of macrophages involved in the anti-inflammatory response, and in particular M2 type macrophages.
  • Examples [0101] By way of illustration, examples of embodiments of the method according to the invention are described below.
  • Example 1 Preparation of an extract of Crocus sativus flowers Extraction process [0102] In a first step a), 25g of Crocus sativus flowers devoid of pistils and dried are crushed then mixed with 975g of a mixture of distilled water and propanediol at a ratio of 70/30%, i.e.
  • Crocus sativus flower extract thus obtained is characterized by an amber to dark amber color, having a slightly viscous and opalescent consistency for a density of 1.03 g/cm 3 whose pH is 5.7.
  • This extract has been analyzed by standard methods and contains a quantity ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description of dry matter of 12 g/Kg, sugar level of 8.7g/kg, amino acids of 0.55 g/kg, phenolic compounds of 0.85 g/kg and proteins of 4.5 g/kg.
  • the analyzes were carried out on several extracts in order to establish a concentration range for each molecule analyzed. Methods used: [0110] The overall composition of the extract is presented in Table 1. [0111] The dry weight of the extract was measured after evaporation (12 hours of steaming at 105°C). [0112] The total sugar content was measured by the following method: dissolution of the extract in concentrated sulfuric acid then reaction with phenol to form a colored complex. The absorbance of the complex is measured spectrophotometrically at 490 nm. Sugar content is determined using a standard glucose curve.
  • the free amino acid content of the extract was evaluated by the following method: disruption of the amine and carboxylic functions using the ninhydrin reagent. The absorbance of the colored complex is measured spectrophotometrically at 570 nm. The quantification is determined using a standard curve produced from a pool of amino acids [0114] The total content of phenolic compounds was evaluated by the following method: reduction of the extract by the Folin-Ciocalteu reagent and spectrophotometric measurement at 760 nm. Quantification of phenolic molecules is carried out using a gallic acid standard curve.
  • the protein content was evaluated by the following method: colorimetric reaction using the Biuret reagent combined with the Folin and Ciocalteu reagent and spectrophotometric measurement at 550 nm. Quantification is carried out using a BSA (Bovine Serum Albumin) standard curve.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • WATERS ACQUITY Qda mass spectrometer
  • the samples were separated on an EC 150/4.6 Nucleoshell RP 18plus-5 ⁇ m (150x4.6 mm) column (Macherey Nagel: 763236.46) by an Agilent 1260 HPLC system (Agilent Technologies). The flow rate was 0.3 ml/min.
  • the mobile phases consisted of a 0.01% formic acid (HCOOH) solution and acetonitrile.
  • the mobile phases consisted of an aqueous solution of 20 mmol of ammonium acetate, 0.1% formic acid and a 65/35 methanol/acetonitrile solution of 20 mmol of ammonium acetate, 0.1% formic acid.
  • [0126] [Table 6] B2- B3-a- B3-b-Acid B5-Acid ac v es enzymes gngpanes geg .
  • the supernatant is placed in the presence of a chromogenic substrate specific for the activity of gingipains RgP or KgP (respectively benzoyl-arginine-p-nitroanilide (TGPpNA) or benzoyl-lysine-p-nitroanilide (BAPNA).
  • TGPpNA benzoyl-arginine-p-nitroanilide
  • BAPNA benzoyl-lysine-p-nitroanilide
  • the measurements are carried out in the presence or absence of the Crocus sativus flower extract of Example 1 at 1% final in water (volume/volume) or in the presence of a reference inhibitor; iodoacetamide at 10 mM.
  • the release of the chromophore p-nitroaniline is quantified every 15 minutes for 2 hours by spectrophotometry at 405 nm.
  • the activity of gingipain is calculated as a percentage of the maximum OD obtained for the control (CTR) RgP or the control (CTR) KgP at 2 hours.
  • Example 3 Evaluation of the sativus flower extracts from Example 1 of the antihemolytic activity on human red blood cells.
  • the pellet is taken up with the PBS-0.05%BSA solution in order to have a 1% red blood cell solution.
  • the Porphyromonas Gingivalis bacteria is cultivated in Shaedler broth supplemented with vitamin K for 24 to 48 hours, in the presence or absence of the 1% Crocus sativus flower extract from Example 1.
  • the broths containing the bacteria are then centrifuged at 10,000 xg, 5 minutes at 4°C.
  • the bacteria are taken up in 1X PBS so as to obtain an aliquot having an OD of between 0.5 and 1.0 UDO.
  • orientation we mean the ability of the extract to promote a pro-inflammatory response (involving M1 type macrophages) or an anti-inflammatory response (involving M2 type macrophages).
  • This orientation is measured by the analysis of cluster present on the surface of macrophage cells specific to the inflammatory response using a flow cytometer.
  • a population of macrophages comprising few CD14 and CD163 clusters being specific for an M1 type response and conversely a population rich in CD14 and CD163 being specific for an M2 type response.
  • Protocol From fresh blood, specialized PBMC cells (peripheral blood mononuclear cells) are isolated by centrifugation on a Ficoll gradient. After centrifugation, the PBMC cells are recovered by aspiration of a cell ring present between the different phases. CD14 cells are isolated by positive selection on CD14-labeled magnetic beads.
  • the cells are rinsed with a cold PBS/BSA/EDTA solution repeated several times.
  • the cells thus obtained are seeded in culture dishes or culture flasks containing a specific attachment medium. After 2 to 3 hours of incubation, the medium is aspirated and replaced with a culture medium promoting the proliferation and differentiation of PBMC cells into M1 and M2 type macrophage cells.
  • the specific differentiation of the cells into M1 macrophage type is achieved through the supply of GMCSF in the medium and into M2 macrophage type with MCSF for 24 hours.
  • the Crocus sativus flower extract from Example 1 or the PBS control at a final concentration of 1% (volume/volume) is added 24 hours before the start of terminal differentiation of the cells.
  • Results the application of the Crocus sativus flower extract of Example 1 at 1% in the macrophage culture medium for 24 hours induced an increase in the M2 type anti-inflammatory response resulting in an increase in the number of cells presenting the CD14 cluster at its ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Surface description (going from 69.3% to 95.9% of the total population, an increase of 37.6%), as illustrated in [Fig.4] as well as an increase in MFI ( going from 115.3 to 489.1, an increase of 324.2%) as illustrated in [Fig.5].
  • the CD163 cluster specialized in the anti-inflammatory response, is also increased (from 81.1% to 92.9%, an increase of 14.7%) as well as its MFI (from 129.9% to 303.3%, an increase of 134.2%).
  • the above results indicate that the 1% extract of Crocus sativus flowers allows regulation of the immune response, thus promoting the anti-inflammatory response.
  • Example 5 Formulation of a mouthwash containing the extract of Crocus sativus flowers [0144] [Table 7] Ingredients % (v/v) i fl l' l 1 1 [01 sativus [0146] [Table 8] Ingredients % (v/v) i fl l' l 1 1 ISP ⁇ BV22 ⁇ 198PCT Description Xylitol 2.0 hi l 1

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Abstract

La présente invention concerne des compositions pour l'hygiène buccale comprenant des extraits de fleurs de Crocus sativus et leurs utilisations pour protéger la cavité buccale. L'invention porte encore sur des compositions thérapeutiques pour leurs utilisations dans la prévention et le traitement des affections de la cavité buccale, notamment les parodontites et les gingivites.

Description

ISP‐BV22‐198PCT                  Description  Description Titre de l'invention : Extraits de fleurs de Crocus sativus, compositions les comprenant et leurs utilisations dans les soins buccaux Domaine technique [0001] La présente invention relève du domaine technique de l’hygiène buccale et du traitement thérapeutique des pathologies buccales. Elle concerne plus particulièrement des compositions comprenant des extraits de fleurs de Crocus sativus pour l’hygiène buccale ou la protection de la cavité buccale. L’invention concerne également des compositions comprenant des extraits de fleurs de Crocus sativus pour leurs utilisations thérapeutiques dans la prévention et le traitement des affections de la cavité buccale, notamment les saignements, l’inflammation, le déchaussement dentaire ou la perte de substance conjonctivale associés aux parodontites et aux gingivites provoquées par la bactérie Porphyromonas gingivalis. Arrière-plan technique de l’invention [0002] La cavité buccale est colonisée par de très nombreux micro-organismes composant le microbiome oral. Dans une cavité buccale saine, les micro- organismes sont essentiellement des bactéries commensales qui s’organisent pour maintenir l’équilibre de cet écosystème, ce qui n’exclue pas la présence de bactéries pathogènes. [0003] La cavité buccale est très fréquemment le siège de pathologies telles que la gingivite et la parodontite. La gingivite est une affection inflammatoire réversible, généralement provoquée par une accumulation de biofilm bactérien, qui se manifeste par des rougeurs gingivales, un œdème, quelquefois des saignements, mais sans déchaussement dentaire. Si la gingivite n’est pas traitée à temps, l’inflammation peut devenir chronique et évoluer en parodontite, caractérisée par une résorption de l'os alvéolaire, une destruction du ligament parodontal et in fine le déchaussement des dents. [0004] Une des causes majeures de la parodontite est le déséquilibre du microbiome buccal, associé à une faiblesse de la réponse immunitaire. Certaines bactéries pathogènes s’associent alors pour supplanter les bactéries commensales. Cette association de bactéries a été décrite sous le nom de « red complex » et se compose des espèces Porphyromonas gingivalis, Tannerella ISP‐BV22‐198PCT                  Description  forsythia et Treponema denticola (Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL Jr. in J Clin Periodontol.1998 ;25(2):134-144). [0005] Porphyromonas gingivalis joue un rôle prépondérant dans la formation d’un biofilm (Hajishengallis G, Darveau RP, Curtis MA., Nat Rev Microbiol. 2012;10(10):717-725) et dans la stratégie d’évitement du système immunitaire (Hajishengallis G., J Oral Biosci.2011 ;53(3):233–240). [0006] Porphyromonas gingivalis sécrète une enzyme appelée gingipaïne permettant à la bactérie de capter le fer contenu dans l’hème des tissus hôtes. Cette enzyme est également impliquée dans la dégradation des jonctions cellulaires de l’épithélium gingival, l’induction de l’inflammation, l’œdème des gencives, une tendance au saignement et une destruction des fibres de collagène de type I et III du tissu conjonctif gingival. [0007] Le problème que l’invention se propose de résoudre est de fournir un nouvel ingrédient actif capable de cibler l’activité de l’enzyme gingipaïne, afin de limiter spécifiquement l’activité pathogène de la bactérie Porphyromonas gingivalis tout en préservant le microbiome oral et de limiter les conséquences de la parodontite et de la gingivite. [0008] Les inventeurs ont en effet découvert qu’un extrait de fleurs de Crocus sativus avait un effet inhibiteur sur l’activité enzymatique de la gingipaïne et pouvait limiter efficacement le développement de la bactérie Porphyromonas gingivalis associée à la parodontite et à la gingivite. [0009] Le Crocus sativus est une plante herbacée de la famille des Iridaceae surtout cultivée pour le pistil de ses fleurs appelé safran, utilisé dans l’alimentation comme épice ou pour ses propriétés antioxydante et antiinflammatoire, en particulier dans les affections buccales ou dentaires (Forouzanfar A. et al., Iran J Med Sci.2016 May ;41). [0010] La plupart des extraits décrits dans l’art antérieur sont des extraits de pistils ou de fleurs entières, comprenant donc le pistil. Ces extraits présentent l’inconvénient de contenir une quantité élevée de composés tels que le safranal, substance classée irritante cutanée, irritante oculaire et sensibilisante cutanée selon le système harmonisé de classification mondiale (UN-GHS). ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0011] Les documents de brevet CN11330420A, CN102657747A et CN109646535A décrivent des extraits obtenus à partir de fleurs dépourvues de pistils obtenus en utilisant de l’éthanol absolu ou des solvants hydro-éthanoliques. [0012] On citera encore le brevet FR2928835B1 qui décrit la préparation d’un extrait de pétales de Crocus sativus obtenu par une macération de plusieurs jours dans de l’éthanol à 70%. L’extrait obtenu contient environ 50% de polyphénols de type flavonoïdes dont une quantité importante de kaempférol, ce qui lui confère des propriétés dépigmentantes de la peau. [0013] Les solvants hydro-alcooliques à forte teneur en alcool tels qu’utilisés dans le document brevet FR2928835B1 sont également susceptibles d’extraire des composés allergéniques tels que le géraniol ou le linalol car ce sont des molécules ayant une forte affinité pour ce type de solvant. [0014] La présente invention décrit l’utilisation d’un solvant hydro-alcoolique principalement aqueux. Ainsi, l’extraction de ces composés indésirables est réduite. Les inventeurs ont montré que l’extrait de l’invention ne contient aucune des 57 substances identifiées comme allergènes cosmétiques potentiels, par le Comité Scientifique pour la Sécurité des Consommateurs. De plus le rendement d’extraction de phytocomposés polaires, tels que les protéines, les acides aminés ou les acides phénoliques est amélioré, comparativement à une extraction hydro-éthanolique. [0015] Un autre problème que se propose donc de résoudre l’invention est de fournir un nouvel extrait aqueux de Crocus sativus préparé à partir des fleurs entières dépourvues de pistils et ne comprenant pas de molécules allergéniques, irritantes ou potentiellement toxiques, pour son utilisation dans les soins d’hygiène buccales ou la prévention et le traitement des pathologies buccales. [0016] L’utilisation d’un solvant hydro-alcoolique principalement aqueux présente également l’avantage d’augmenter le rendement d’extraction de phytocomposés d’intérêt tels que les sucres, les acides aminés, les protéines, les vitamines et les acides organiques, que l’on ne retrouve pas ou peu dans les extraits de l’art antérieur. [0017] La matière première de l’invention, ne comprend que les fleurs de Crocus sativus dépourvues de pistils répondant à l’exigence de naturalité du marché de ISP‐BV22‐198PCT                  Description  l’hygiène et des soins oraux-buccaux actuel tout en présentant une efficacité biologique remarquable. Résumé de l’invention [0018] Les inventeurs ont développé un nouvel extrait de Crocus sativus comprenant de 9 à 13 g/Kg de matière sèche, de 5,5 à 8,5 g/kg de sucres totaux, de 2,5 à 5,5 g/kg de protéines, de 0,35 à 0,55 g/Kg d’acides aminés, de 0,6 à 1,2 g/kg d’acides organiques, de 0,4 à 12 g/kg de composés phénoliques totaux dont de 150 à 450 mg/kg de kaempférol sophoroside, de 5 à 30 mg/kg de kaempférol glucoside et de 10 à 40 mg/kg de quercétine diglucoside. [0019] Dans un mode de réalisation particulier, l’extrait ci-dessus est obtenu par macération de fleurs dépourvues de pistils dans un solvant hydro-polyalcoolique majoritairement aqueux comprenant de 20 à 50 % d’alcool en poids par rapport au poids total de solvant, l’alcool pouvant être choisi parmi le propanediol, le propylène glycol, le butylène glycol et le pentanediol. [0020] L’invention a pour deuxième objet une composition d’hygiène buccale ou thérapeutique comprenant, en tant qu’ingrédient actif, une quantité efficace de l’extrait de Crocus sativus, et un milieu physiologiquement acceptable. [0021] L’invention a pour troisième objet l’utilisation non thérapeutique de la composition pour l’hygiène buccale. [0022] L’invention a pour quatrième objet une composition comprenant un extrait de fleurs de Crocus sativus pour son utilisation thérapeutique dans la prévention ou le traitement des affections de la cavité buccale et notamment la gingivite et/ou la parodontite. Brève description des dessins [0023] L’invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, illustrés au regard des figures annexées dans lesquelles : [0024] [Fig.1] Modulation de l’activité de la gingipaïne spécifique de l’arginine, par un extrait de Crocus sativus à 1%. [0025] [Fig.2] Modulation de l’activité de la gingipaïne spécifique de la lysine par un extrait de Crocus sativus à 1% ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0026] [Fig.3] Test d’inhibition de l’hémolyse induite par la bactérie Porphyromonas gingivalis en présence d’un extrait de Crocus sativus à 1%. [0027] [Fig.4] Mesure de l’expression des marqueurs CD14+ et CD163 à la surface des macrophages de type 2, traités ou non avec l’extrait Crocus sativus à 1%. [0028] [Fig.5] Mesure de la fluorescence relative moyenne des marqueurs CD14 et CD163 à la surface des macrophages de type 2, traités ou non avec l’extrait Crocus sativus à 1%. Description détaillée de l’invention Définitions [0029] Tous les termes utilisés dans la présente description ont le sens le plus largement connus sauf mention contraire. Pour les besoins de l’invention les termes suivants sont définis comme suit : [0030] On entend par « cavité buccale » la zone délimitée par les dents, la langue, le palais dur et le palais mou et essentiellement revêtue d’une muqueuse. On distingue la muqueuse masticatoire (gencive et palais dur), la muqueuse de recouvrement (labiale, palatine, vestibulaire, du plancher de la bouche, et des faces latérales de la langue), tandis que la muqueuse des lèvres et celle de la face dorsale de la langue constituent les éléments composants la muqueuse spécialisée. [0031] On entend par « hygiène buccale » des soins préventifs ou de protection, non thérapeutiques, concernant la cavité buccale saine. [0032] On entend par « fleur de Crocus sativus », la fleur entière constituée par les pétales et les étamines mais dépourvue de pistils. [0033] On entend par « hydro-polyalcoolique » le mélange d’au moins un polyol et d’eau, ce dernier comprenant au moins deux radicaux alcool, plus précisément de 2 à 9 radicaux alcool et de 3 à 12 atomes de carbone. [0034] Par " acides organiques " on entend des dérivés du catabolisme des acides aminés, des acides gras et des sucres comprenant une fonction acide. Ce groupe comprend les acides carboxyliques alpha-hydroxylés (AHA) ou polyhydroxylés tels que les acides lactique, malique, citrique, les acides carboxyliques dérivés de sucres de fruits ou de toutes autres parties de plantes tels que les acides uroniques, ou encore les diacides tels que l'acide succinique ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0035] Par « composés phénoliques » ou « polyphénols » on entend les molécules d’origine végétale qui possèdent un cycle aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles, tels que les acides phénoliques, les flavonoïdes ou leurs dérivés, les tannins et tous autres polyphénols. [0036] Par « flavonoïdes » on entend, les composés phénoliques partageant tous une même structure de base formée par deux cycles aromatiques reliés par trois carbones. [0037] Par « flavonoïdes glycosylés » on entend les flavonoïdes liés à un ou plusieurs sucres tels que le kaempférol sophoroside, le kaempférol glucoside et la quercétine diglucoside. [0038] Par « phytocomposés d’intérêt », on entend l’ensemble des molécules présentes dans l’extrait de fleur de Crocus sativus de l’invention et notamment, les sucres, les composés phénoliques, les protéines, les acides aminés, les vitamines et les acides organiques, potentiellement responsables des effets biologiques bénéfiques observés. [0039] Quand une gamme de valeur est décrite, les bornes de cette gamme doivent être comprises comme incluant explicitement toutes les valeurs intermédiaires de la gamme. Par exemple, une gamme de valeur comprise entre 1% et 10% doit être comprise comme incluant 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, et 10 %, ainsi que toutes les valeurs décimales entre 1 % et 10 %. [0040] Les valeurs numériques en pourcentage sont des pourcentages en poids, c’est-à-dire le poids d’un composé par rapport au poids total du mélange envisagé, sauf spécifié autrement. [0041] Les compositions décrites dans la présente demande peuvent « comprendre », « consister en » ou « consister essentiellement en », les composés essentiels ou les ingrédients optionnels. [0042] « Consister essentiellement en » signifie que la composition ou le composant peut inclure des ingrédients additionnels, si ces ingrédients additionnels ne modifient pas les caractéristiques de bases ou les nouvelles caractéristiques de la composition ou de l’utilisation décrite dans la présente demande. [0043] Un « milieu physiologiquement acceptable » désigne un véhicule adapté pour une mise en contact avec les muqueuses, sans toxicité, irritation, réponse ISP‐BV22‐198PCT                  Description  allergique indue et similaire ou réaction d’intolérance, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable. [0044] Par « application topique » on désigne le fait d’appliquer à la surface d’une muqueuse la composition comprenant l’extrait de fleurs de Crocus sativus selon l’invention. [0045] On entend par « anti-hémolytique » un composé qui a la propriété d’empêcher la destruction des globules rouges induite par la bactérie Porphyromonas gingivalis. [0046] On entend par « orientation de la réponse inflammatoire » : la stimulation d’une catégorie particulière de la population de macrophages dans le but d’obtenir une réponse de type anti inflammatoire ou pro inflammatoire. [0047] Par « quantité efficace » on désigne la quantité minimum d’extrait selon l’invention nécessaire pour obtenir au moins une des activités biologiques recherchées, notamment diminuer l’activité enzymatique des gingipaïnes, diminuer l’hémolyse, présenter une activité anti-inflammatoire ou tout autre marqueur biologique étudié, sans que cette quantité ne soit toxique. [0048] Il est bien entendu que l’invention concerne les mammifères et plus particulièrement l’être humain. Procédé d’extraction des fleurs de Crocus sativus [0049] L’invention a pour premier objet un extrait de fleurs de l’espèce Crocus sativus, obtenu par le procédé suivant : [0050] A l’étape a), les fleurs fraiches ou sèches dépourvues de pistils, sont mises en présence d’un solvant hydro-polyalcoolique majoritairement aqueux comprenant de 20 à 50 % d’alcool en poids par rapport au poids total du solvant. [0051] Au sens de l’invention, le solvant hydro-polyalcoolique est donc un mélange compris entre 20 et 50 % (p/p) de polyalcool dans l’eau. [0052] Les fleurs de Crocus sativus utilisées sont dépourvues de pistils, c’est-à-dire qu’on leur a retiré manuellement les trois stigmates rouges du pistil qui constitue le safran. [0053] On utilise de préférence des fleurs de Crocus sativus séchées. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0054] De préférence, les fleurs sont broyées avant la mise en présence du solvant hydro-polyalcoolique, afin d’optimiser les échanges entre la solution extractives et la matière végétale. [0055] De préférence, le rapport matière végétale / solution d’extraction est de préférence compris entre 0,5 à 20 % en poids/poids, plus préférentiellement compris entre 2 et 10 % et encore plus préférentiellement ce ratio est de 2,5 %. [0056] Les solvants hydro-polyalcooliques utilisés possèdent un paramètre de solubilité ainsi qu’une viscosité dynamique trois fois plus élevée que les solvants mono-alcooliques. L’extraction de molécules plus complexes de type protéines, polysaccharides et polyphénols est donc favorisée en comparaison avec un solvant mono-alcoolique tout en permettant d’entrainer également dans le processus d’extraction de petites molécules tels que sucres et acides organiques. [0057] En comparaison d’une extraction réalisée dans de l’eau pure, le rendement d’extraction selon le procédé de l’invention est amélioré et se situe à environ 40%, ce qui est un rendement difficilement atteignable par des techniques d’extraction par macération. [0058] Dans un mode de réalisation avantageux le polyalcool est choisi parmi le propanediol, le propylène glycol, le butylène glycol ou le pentanediol, ou tout mélange de ces solvants. [0059] Dans un mode de réalisation préféré, le solvant hydro-polyalcoolique est le propanediol ou le butylène glycol à un ratio de 25 % à 35 % d’alcool. [0060] Dans un autre mode de réalisation préféré le solvant hydro-polyalcoolique comprend de préférence 30% d’alcool. [0061] Dans un autre mode de réalisation préféré, le solvant hydro-polyalcoolique est le propanediol à un ratio de 30%. [0062] La présence de propanediol dans le solvant d’extraction présente également l’avantage de stabiliser les phytocomposés de l’extrait final tout au long de l’extraction et contribue à protéger l’extrait des contaminations par les microorganismes. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0063] A l’étape b), le mélange est mis sous agitation douce pendant 30 minutes à deux heures à une température comprise entre la température ambiante et 80°C. [0064] Avantageusement, l’agitation modérée est de type brassage. [0065] La température est ajustée et maintenue de préférence entre 20 et 60°C, plus préférentiellement entre 30 et 50°C, encore plus préférentiellement à 45°C. [0066] Avantageusement, le temps de macération est compris entre 30 minutes et 1,5 heures et encore plus préférentiellement le temps de macération est de 1 heure. [0067] A la fin de l’étape b) le pH est contrôlé et doit se situer entre 4,0 et 7,0. [0068] A l’étape c), le mélange obtenu en b) est purifié pour éliminer la matière solide végétale et récupérer la partie liquide. [0069] Cette étape de purification peut être effectuée par toute méthode connue de l’homme du métier, mais de préférence la purification est effectuée par centrifugation et en particulier par centrifugation à 4000g pendant 10 min. [0070] A l’étape d), on réalise une clarification de l’extrait obtenu à l’étape précédente par au moins six étapes de filtrations séquentielles en utilisant des filtres de porosités décroissantes allant de 30 à 0,2μm. [0071] A l’étape e), une filtration stérilisante est réalisée sur un filtre de porosité 0,22μm stérile. [0072] Le pH est mesuré mais il n’est pas ajusté et doit se trouver entre 4,5 et 6,5. Extrait de fleurs de Crocus sativus [0073] L’extrait obtenu par le procédé décrit ci-dessus est analysé et présente les caractéristiques suivantes, il a une couleur ambrée à ambrée foncée, l'extrait a une consistance légèrement visqueuse et d’aspect légèrement opalescent à opalescent. La densité est de 1.01 à 1.04 g/cm3, le pH se situe entre 4,5 et 6,5. Cet extrait contient de 9 à 13 g/Kg de matière sèche, et comprend de 5,5 à 8,5 g/kg de sucres totaux, de 2,5 à 5,5 g/kg de protéines, de 0,35 à 0,55 g/Kg d’acides aminés, de 0,6 à 1,2 g/kg des acides organiques, de 0,4 à 1,2g/kg de composés phénoliques totaux dont de 150 à 450 mg/kg de kaempférol sophoroside, de 5 à 30 mg/kg de kaempférol glucoside et de 10 à 40 mg/kg de quercétine diglucoside. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0074] L’extrait obtenu comprend donc de 0,17 g/kg à 0,55 g/kg de polyphénols de type flavonoïdes. [0075] L’extrait obtenu comprend également de 1,2 à 3,4 mg/kg de vitamines B dont 0,5 à 1,5 mg/kg de vitamine B5. [0076] L’extrait ainsi obtenu peut optionnellement être dilué dans un solvant physiologiquement acceptable pour un usage thérapeutique. A titre d’exemples illustratifs et non limitatifs de solvants physiologiquement acceptables, on peut citer l’eau, le glycérol, l’éthanol, le propanediol ainsi que sa version naturelle issue du maïs, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants. L’ajout de conservateurs peut également être envisagé pour garantir la conservation optimale de l’extrait dans le temps. De la glycérine associée à tous types de conservateurs hydrosolubles tels que du sodium benzoate ou du potassium sorbate à la concentration finale de 0,5 % ou encore du phénoxyéthanol à la concentration finale de 1,5 %. [0077] Un des avantages d’une telle dilution, outre d’obtenir exactement les concentrations en phytocomposés recherchées, est d’améliorer la stabilité et la conservation de l’extrait végétal ou tout mélange de ces solvants. Compositions comprenant un extrait de fleurs de Crocus sativus [0078] Un deuxième aspect de l’invention est une composition d’hygiène buccale ou thérapeutique comprenant, en tant qu’ingrédient actif, une quantité efficace de l’extrait de fleurs Crocus sativus, et un milieu physiologiquement acceptable. [0079] Dans un mode de réalisation avantageux, la quantité efficace de l’extrait de fleurs Crocus sativus de l’invention correspond à une concentration comprise entre 0,5 % et 10 %, de préférence à une concentration comprise entre 0,8 % et 2 %, et encore plus préférentiellement à une concentration de 1%. [0080] La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier. [0081] Préférentiellement, les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l’application par voie topique pouvant être sous forme plus ou ISP‐BV22‐198PCT                  Description  moins fluide que ce soit un bain de bouche ou un gel. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable avec un pH adapté, c’est-à-dire compatible avec la muqueuse orale, la peau et les phanères, sans risque d’inconfort lors de leur application et couvrent toutes les formes cosmétiques adaptées. [0082] A titre de milieu physiologiquement acceptable communément utilisé dans le domaine d'application envisagé, on peut citer par exemple des adjuvants nécessaires à la formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d’odeur, etc. [0083] Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l’invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,1 à 25 % du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l’invention est un gel, l’agent épaississant peut représenter de 10 à 25 % en poids et de préférence de 20 à 25 % en poids par rapport au poids total de la composition. Utilisations des compositions comprenant un extrait de fleurs de Crocus sativus [0084] L’invention a pour troisième objet l’utilisation non thérapeutique de la composition pour l’hygiène buccale. [0085] Ce mode de réalisation particulier de l’invention, concerne un sujet ayant des muqueuses buccales saines et souhaitant y appliquer des soins pour prévenir l’apparition de pathologies de type parodontite ou gingivite ou protéger sa cavité buccale et notamment ses gencives. [0086] Un quatrième aspect de l’invention est une composition comprenant l’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention pour son utilisation thérapeutique pour la prévention ou le traitement des affections de la cavité buccale. [0087] Dans ce mode de réalisation de l’invention l’application est de préférence une application par voie topique. [0088] Dans un mode de réalisation particulier, les affections de la cavité buccale concernées sont les saignements, l’inflammation, la récession gingivale, le déchaussement dentaire ou la perte de substance conjonctivale associés aux parodontites et aux gingivites. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0089] La présente invention a pour objet de fournir un nouvel ingrédient actif capable de cibler l’activité de l’enzyme gingipaïne, afin de limiter spécifiquement l’activité de la bactérie Porphyromonas gingivalis tout en préservant le microbiome oral. [0090] Dans un mode de réalisation particulier, les affections de la cavité buccale concernées sont les parodontites et/ou les gingivites, lorsque ces pathologies sont provoquées par la bactérie Porphyromonas gingivalis. [0091] La spécificité du potentiel antibactérien d’une composition comprenant l’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention, jusqu’à une concentration de 10% (v/v), a été testée en utilisant les bactéries commensales Streptococcus mutans et Streptococcus gordoni. Aucune inhibition de croissance de ces deux souches bactériennes n’a été observée. [0092] La spécificité de l’inhibition de l’activité gingipaïne a été évaluée en mesurant l’activité collagénase de la gingipaïne en présence de l’extrait de Crocus sativus de l’invention à 1%. Aucune réduction d'activité collagénase n'a été observée. [0093] L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention a été testé sur certains marqueurs biologiques associés à la virulence de la bactérie Porphyromonas gingivalis, aux mécanismes de lyse cellulaire ainsi qu’à la réponse inflammatoire. [0094] L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention a démontré son efficacité dans l’inhibition de l’activité des gingipaïnes sécrétées par Porphyromonas gingivalis et plus particulièrement les gingipaïnes spécifiques de l’arginine. [0095] L’invention a ainsi encore pour objet une composition comprenant un extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention pour son utilisation thérapeutique dans laquelle les enzymes gingipaïnes et plus particulièrement les enzymes gingipaïnes spécifiques de l’arginine sont inhibées. [0096] L’inhibition de l’activité des enzymes gingipaïnes sur le tissu gingival permet de limiter la destruction de l’épithélium gingival et de la matrice conjonctivale. [0097] L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention a également démontré son efficacité sur la prévention de la lyse des globules rouges. [0098] L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention a également démontré son efficacité sur l’orientation et l’augmentation de la réponse anti-inflammatoire. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0099] L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention a également une action anti-saignement, démontrée par une activité anti hémolytique sur des hématies humaines. [0100] L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’invention a permis une augmentation du recrutement des macrophages impliqués dans la réponse anti inflammatoire, et en particulier les macrophages de type M2. Exemples [0101] A titre illustratif, des exemples de mode de réalisation du procédé selon l’invention sont décrits ci-dessous. Exemple 1 : Préparation d’un extrait de fleurs de Crocus sativus Procédé d’extraction [0102] Dans une première étape a), 25g de fleurs Crocus sativus dépourvues de pistils et séchées sont broyées puis mélangées à 975 g d’un mélange d’eau distillée et propanediol à un ratio de 70/30%, soit 2,5 % de matière première engagée dans le procédé et 97,5 % du mélange eau/propanediol pour un poids total de 1 kg. [0103] b) Le mélange est mis sous agitation douce pendant une heure à une température de 45°C afin que le processus de macération se déroule. [0104] c) Le mélange obtenu en b) est ensuite purifié par centrifugation à 4000g pendant 10 min, de manière à sédimenter la matière végétale résiduelle dans le culot et récolter le surnageant. [0105] d) On réalise une clarification du surnageant obtenu à l’étape précédente par des étapes de filtrations séquentielles au moins six filtrations de porosité décroissante allant de 30 à 0.2μm. [0106] e) Une dernière étape de filtration stérilisante est réalisée à 0,22μm. [0107] f) Le pH est mesuré mais ne doit pas être ajusté. [0108] L’extrait de fleur de Crocus sativus ainsi obtenu est caractérisé par une couleur ambrée à ambrée foncée, présentant une consistance légèrement visqueuse et opalescente pour une densité de 1.03 g/cm3 dont le pH est à 5,7 Cet extrait a été analysé par des méthodes standards et contient une quantité ISP‐BV22‐198PCT                  Description  de matière sèche de 12 g/Kg, un taux de sucre à 8,7g/kg, des acides aminés à 0,55 g/kg, des composés phénoliques de 0,85 g/kg et des protéines de 4,5 g/kg. Caractérisation de l’extrait de fleurs de Crocus sativus [0109] Les analyses ont été réalisées sur plusieurs extraits afin d’établir une gamme de concentration pour chaque molécule analysée. Méthodes utilisées : [0110] La composition globale de l’extrait est présentée dans le tableau 1. [0111] Le poids sec de l’extrait a été mesuré après évaporation (12h d’étuvage à 105°C). [0112] La teneur totale en sucres a été mesurée par la méthode suivante : dissolution de l’extrait dans l'acide sulfurique concentré puis réaction avec du phénol pour former un complexe coloré. L'absorbance du complexe est mesurée par spectrophotométrie à 490 nm. La teneur en sucre est déterminée à l'aide d'une courbe standard de glucose. [0113] La teneur en acides aminés libres de l'extrait a été évaluée par la méthode suivante : rupture des fonctions amine et carboxylique par le réactif ninhydrine. L'absorbance du complexe coloré est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm. La quantification est déterminée en utilisant une courbe standard réalisée à partir d’un pool d'acides aminés [0114] La teneur totale en composés phénoliques a été évaluée par la méthode suivante : réduction de l’extrait par le réactif de Folin-Ciocalteu et mesure spectophotométrique à 760 nm. La quantification des molécules phénoliques est effectuée à l'aide d'une courbe standard d'acide gallique. [0115] La teneur en protéines a été évaluée par la méthode suivante : réaction colorimétrique par le réactif de Biuret combiné au réactif de Folin et Ciocalteu et mesure spectrophotométrique à 550nm. La quantification est effectuée à l'aide d'une courbe standard de BSA (Bovine Sérum Albumine). [0116] [Tableau 1] Extrait de fleurs de Crocus sativus
Figure imgf000016_0001
ISP‐BV22‐198PCT                  Description  Acide aminés libres (mg/kg) 350 - 550
Figure imgf000017_0001
e ecu e pa a ayse c o aogap que qu e aue pe o a ce , couplée à un spectromètre de masse ACQUITY Qda (WATERS) équipé d’une sonde electrospray en mode négatif. Les échantillons ont été séparés sur une colonne Luna Omega SUGAR 100A 3μm (150x4,6 mm) (Phenomenex: H21- 180323) par un système HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies). Le débit était de 0,8 ml / min. Les phases mobiles consistaient en une solution aqueuse 20 mmol d’acétate d’ammonium et 95/5 (ACN/H20) 20 mmol acétate d’ammonium. [0118] [Tableau 2] Glucose X lit l /K F t /K
Figure imgf000017_0002
e a a e ecu e pa c o aogap e qu e coup e u eceu UV fixé à la longueur d’onde 254nm. Les échantillons sont séparés sur une colonne Uptisphere Strategy C18-25μm (250 x4.6 mm) US5C182-250/046 (Interchim: UE2.6AQ-100/046). Le débit était de 1mL/min. Les phases mobiles consistaient en une solution d’acide phosphorique (H3PO4) à 0,1 % et d’acétonitrile. Les échantillons et standards sont dérivés avec du phenylisothiocyanate. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0120] [Tableau 3] Histidine Arginine Sérine Glycine Acide Thréonine Proline Alanine Valine ( m) ( m) ( m) ( m) Glutami ue ( m) ( m) ( m) ( m)
Figure imgf000018_0001
qu e aue pe o a ce coup e u eceu . es échantillons sont séparés sur une colonne Uptisphere CS evolution 100 mm x 4.6 mm x 2.6 μm (Interchim, UE2-6AQ-100046) par un système Agilent 1200 (Agilent technologies). Le débit était de 0.8mL/min. Les phases mobiles consistaient en une solution d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % et de méthanol. [0122] [Tableau 4] Kaempférol Kaempférol Quercétine diglucoside ée
Figure imgf000018_0002
pa a ayse c o aogap que qu e aue pe o a ce, coup e u spectromètre de masse ACQUITY Qda (WATERS) équipé une source d’ions électrospray en mode négatif. Les échantillons ont été séparés sur une colonne EC 150 / 4,6 Nucleoshell RP 18plus-5μm (150x4,6 mm) (Macherey Nagel : 763236.46) par un système HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies). Le débit était de 0,3 ml / min. Les phases mobiles consistaient en une solution d'acide formique (HCOOH) à 0,01 % et d'acétonitrile.
ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0124] [Tableau 5] Acide Acide Acide Acide Acide [012 a
Figure imgf000019_0001
ayse c o a og ap que qu e au e pe o a ce, coup e u spectromètre de masse ACQUITY Qda (WATERS) équipé d’une source d’ions électrospray en mode positif. Les échantillons ont été séparés sur une colonne EC 150 / 4,6 Nucleoshell RP 18plus-5μm (150x4,6 mm) (Macherey Nagel : 763236.46) par un système HPLC Agilent 1260 (Agilent Technologies). Le débit était de 0,5 ml / min. Les phases mobiles consistaient en une solution aqueuse 20 mmol d’acétate d’ammonium, 0.1% acide formique et une solution 65/35 méthanol/acétonitrile à 20 mmol d’acétate d’ammonium, 0.1% acide formique. [0126] [Tableau 6] B2- B3-a- B3-b-Acide B5-Acide
Figure imgf000019_0002
ac v es enzymes gngpanes g e g . [0128] Principe : Les enzymes gingipaïnes font partie des facteurs de virulence de la bactérie Porphyromonas gingivalis. Les gingipaïnes ont la capacité de digérer un large spectre de protéines de l’hôte. Il existe des enzymes gingipaïne spécifiques de la lysine (KgP) ou spécifiques de l’arginine (RgP). [0129] Protocole : La bactérie Porphyromonas gingivalis est cultivée dans un bouillon Shaedler supplémenté en vitamine K pendant quarante-huit heures. Le bouillon contenant les bactéries est ensuite centrifugé à 10000 x g, 5 minutes à 4°C et le culot de bactéries est rincé deux fois avec du PBS 1X. Les bactéries sont ensuite reprises dans du PBS 1X de manière à obtenir un aliquote de densité optique ISP‐BV22‐198PCT                  Description  (DO) égale à 1 et un aliquote de DO = 2. Les aliquotes de DO=1 et DO=2 sont incubés à 37°C pendant 1h puis centrifugés à 10000 x g, 10 minutes à température ambiante. Le surnageant est mis en présence d’un substrat chromogénique spécifique de l’activité des gingipaïnes RgP ou KgP (respectivement le benzoyl-arginine-p-nitroanilide (TGPpNA) ou le benzoyl-lysine- p-nitroanilide (BAPNA). L’hydrolyse de la liaison arginine ou lysine, libère le chromophore p-nitroaniline qui peut être quantifié par colorimétrie. [0130] Les mesures sont réalisées en présence ou absence de l’extraits de fleurs de Crocus sativus de l’exemple 1 à 1% final dans l’eau (volume/volume) ou en présence d’un inhibiteur de référence ; l’iodoacétamide à 10 mM. La libération du chromophore p-nitroaniline est quantifié toutes les 15 minutes pendant 2 heures par spectrophotométrie à 405 nm. L’activité de la gingipaïne est calculée en pourcentage de la DO maximale obtenue pour le contrôle (CTR) RgP ou le contrôle (CTR) KgP à 2h. [0131] Résultats : En présence de l’extraits de fleurs de Crocus sativus de l’exemple 1 à 1%, on observe une baisse de l’activité enzymatique allant jusqu’à 85,5% par rapport au CTR RgP pour le temps 2h comme illustré à la [Fig.1]. En revanche, il n’y a aucune baisse d'activité par rapport au CTR KgP en présence de l’extrait de fleurs de Crocus sativus à 1% ([Fig.2]). [0132] Conclusion : L’extrait de fleurs de Crocus sativus à 1% a un effet inhibiteur des gingipaïnes spécifiques de l’arginine et n’a pas d’effet sur les gingipaïnes spécifiques de la lysine. En inhibant l’activité des gingipaïnes les bactéries Porphyromonas gingivalis n’ont plus l’outil qui leur permet de lyser les jonctions cellulaires mais aussi de détériorer les protéines de la matrice extracellulaire. Les gingipaïnes étant l’un des facteurs de virulence les plus importants de P.gingivalis, leurs inhibitions ont pour effet de limiter le développement de ces bactéries et ainsi prévenir l’apparition des gingivites et des parodontites. [0133] Exemple 3 : Evaluation de l’extraits de fleurs de sativus de l’exemple 1 de l’activité anti hémolytique sur des globules rouges humain. [0134] Principe : Certains agents pathogènes sécrètent des enzymes qui possèdent une capacité à lyser la membrane des globules rouges (hématies) et provoquer ainsi une libération de l’hémoglobine dans le milieu : c’est l’activité hémolytique. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0135] Protocole : Du sang frais humain conservé à température ambiante est centrifugé à 1500 x g pendant 10 minutes, le surnageant est éliminé et les hématies contenues dans le culot sont reprises avec 50 ml d’une solution de PBS – 0.05% BSA. Le milieu est agité par retournement. L’opération est répétée 3 fois afin de bien laver les cellules pour éliminer l’hémoglobine extracellulaire. Après le dernier rinçage, le maximum de surnageant est éliminé puis le culot est repris avec la solution de PBS-0.05%BSA afin d’avoir une solution d’hématies à 1%. La bactérie Porphyromonas Gingivalis est cultivée dans un bouillon Shaedler supplémenté en vitamine K pendant 24 à 48 heures, en présence ou en absence de l’extrait de fleurs de Crocus sativus à 1% de l’exemple 1. Les bouillons contenant les bactéries sont ensuite centrifugés à 10000 x g, 5 minutes à 4°C. Les bactéries sont reprises dans du PBS 1X de manière à obtenir un aliquote ayant une DO comprise entre 0.5 et 1.0 UDO. Dans un puits d’une plaque 96 puits, 100 μL de suspension bactérienne sont mis en contact avec 100 μL de solution d’hématies à 1% et 50 μL d’extrait de Crocus sativus à la concentration testée (1% dans PBS volume/volume) ou 50μL de PBS pour les conditions contrôle. Ce mélange est ensuite placé sous agitation à 37°C pendant 24h, suivi d’une centrifugation à 1500 x g. L’absorbance du surnageant est lue avec un lecteur de microplaque à une longueur d’onde de 410 nm. Les échantillons sont déposés en cinq répliquats par essai, avec deux essais indépendants (essai 1 et essai 2). [0136] Résultat : L’application de l’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’exemple 1 à 1% induit une baisse de l’hémolyse comprise entre 48 et 78% par rapport au contrôle négatif après une incubation de 24 heures. Lorsque les bactéries P.gingivalis sont pré-incubées avec l’extrait de fleurs de Crocus sativus à 1% pendant 24 heures, la baisse de l’hémolyse est comprise entre 88 et 99%. Les résultats sont illustrés par la [Fig.3]. [0137] L’hémolyse des globules rouges libère de l’hémoglobine riche en groupements hème dont la bactérie P.gingivalis à besoin pour se développer. L’inhibition de l’hémolyse induit la privation de P.gingivalis en hème, ce qui a pour conséquence de freiner le développement de cette bactérie et de prévenir les saignements des gencives observés lors de gingivites et parodontite. ISP‐BV22‐198PCT                  Description  [0138] Exemple 4 Evaluation de l’extraits de fleurs de sativus de l’exemple 1 de l’orientation de la réponse inflammatoire impliquant des macrophages dérivés de cellules PBMC [0139] Principe : le but de cette expérience est de tester un actif pour déterminer si cet extrait possède un potentiel d’orientation de la réponse immunitaire. Par orientation on entend la capacité de l’extrait à favoriser une réponse pro inflammatoire (impliquant les macrophages de type M1) ou une réponse anti inflammatoire (impliquant les macrophages de type M2). Cette orientation est mesurée par l’analyse de cluster présent à la surface des cellules macrophages spécifique de la réponse inflammatoire à l’aide d’un cytomètre de flux. Une population de macrophages comprenant peu de cluster CD14 et CD163 étant spécifique d’une réponse de type M1 et à l’inverse une population riche en CD14 et CD163 étant spécifique d’une réponse de type M2. [0140] Protocole : A partir de sang frais, des cellules spécialisées PBMC (cellules mononucléaires périphériques du sang) sont isolées par centrifugation sur gradient de Ficoll. Après centrifugation, les cellules PBMC sont récupérées par aspiration d’un anneau cellulaire présent entre les différentes phases. Les cellules CD14 sont isolées par sélection positive sur billes magnétiques marquées CD14. Après isolement, les cellules sont rincées par une solution de PBS/BSA/EDTA froid répété plusieurs fois. Les cellules ainsi obtenues sont ensemencées dans des boites de cultures ou des flacons de culture contenant un milieu spécifique d’accrochage. Après 2 à 3 heures d’incubation, le milieu est aspiré et remplacé par un milieu de culture favorisant la prolifération et la différentiation des cellules PBMC en cellules macrophages de type M1 et M2. La différentiation spécifique des cellules en type macrophages M1 se fait grâce à l’apport de GMCSF dans le milieu et en type macrophage M2 avec du MCSF pendant 24h. L’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’exemple 1 ou le contrôle PBS à une concentration finale de 1% (volume/volume) est ajouté 24h avant le début de la différentiation terminale des cellules. Les cellules sont ensuite détachées de leur support après l’action de trypsine pour analyse par cytométrie de flux. [0141] Résultats : l’application de l’extrait de fleurs de Crocus sativus de l’exemple 1 à 1% dans le milieu de culture des macrophages pendant 24h a induit une augmentation de la réponse anti inflammatoire de type M2 se traduisant par une augmentation du nombre de cellules présentant le cluster CD14 à sa ISP‐BV22‐198PCT                  Description  surface (passant de 69,3% à 95,9% de la population totale soit une augmentation de 37.6%), tel qu’illustré dans la [Fig.4] ainsi qu’une augmentation du MFI (passant de 115,3 à 489,1 soit une augmentation de 324,2%) tel qu’illustré dans la [Fig.5]. De plus le cluster CD163, spécialisé de la réponse anti inflammatoire, est aussi augmenté (passant de 81,1% à 92.9% soit une augmentation de 14.7%) ainsi que son MFI (passant de 129,9% à 303.3% soit une augmentation de 134.2%). [0142] Les résultats ci-dessus indiquent que l’extrait de fleurs de Crocus sativus à 1% permet une régulation de la réponse immunitaire favorisant ainsi la réponse anti inflammatoire. [0143] Exemple 5 Formulation d’un bain de bouche contenant l’extrait de fleurs de Crocus sativus [0144] [Tableau 7] Ingredients % (v/v) i fl l’ l 1 1 [01 sativus
Figure imgf000023_0001
[0146] [Tableau 8] Ingredients % (v/v) i fl l’ l 1 1
Figure imgf000023_0002
ISP‐BV22‐198PCT                  Description  Xylitol 2.0 hi l 1
Figure imgf000024_0001

Claims

ISP‐BV22‐198                  Revendications    Revendications [Revendication 1] Extrait de fleurs de Crocus sativus comprenant de 9 à 13 g/Kg de matière sèche, de 5,5 à 8,5 g/kg de sucres totaux, de 2,5 à 5,5 g/kg de protéines, de 0,35 à 0,55 g/Kg d’acides aminés, de 0,6 à 1,2 g/kg d’acides organiques, de 0,4 à 12 g/kg de composés phénoliques totaux dont de 150 à 450 mg/kg de kaempférol sophoroside, de 5 à 30 mg/kg de kaempférol glucoside et de 10 à 40 mg/kg de quercétine diglucoside, ledit extrait étant caractérisé en ce qu’il est obtenu par le procédé comprenant les étapes suivantes : a) les fleurs fraiches ou sèches dépourvues de pistils, sont mises en présence d’un solvant hydro-polyalcoolique majoritairement aqueux comprenant de 20 à 50 % d’alcool en poids par rapport au poids total du solvant, b) le mélange est mis sous agitation douce pendant 30 minutes à deux heures à une température comprise entre la température ambiante et 80°c, c) le mélange obtenu en b) est purifié pour éliminer la matière solide végétale et récupérer la partie liquide, d) l’extrait obtenu à l’étape précédente est clarifié par au moins six étapes de filtrations séquentielles en utilisant des filtres de porosités décroissantes allant de 30 à 0,2μm, e) une filtration stérilisante est réalisée en utilisant un filtre de porosité de 0,22μm. [Revendication 2] Extrait de fleurs de Crocus sativus la revendication 1, caractérisé en ce qu’à l’étape a) les fleurs sont séchées et broyées. [Revendication 3] Extrait de fleurs de Crocus sativus de l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’à l’étape a), le solvant hydro-polyalcoolique est le propanediol ou le butylène glycol à un ratio compris entre 25 % et 35 %. [Revendication 4] Extrait de fleurs de Crocus sativus de l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’à l’étape a), le solvant hydro-polyalcoolique est le propanediol à un ratio de 30 %. ISP‐BV22‐198                  Revendications    [Revendication 5] Extrait de fleurs de Crocus sativus de l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’à l’étape b), le mélange est mis sous agitation douce pendant 30 minutes à une heure trente à une température comprise entre 30°C et 50°C [Revendication 6] Composition d’hygiène buccale ou thérapeutique comprenant, en tant qu’ingrédient actif, une quantité efficace de l’extraits de fleurs de Crocus sativus de l’une des revendications 1 à 5, et un milieu physiologiquement acceptable [Revendication 7] Composition selon la revendication 6, dans laquelle la quantité efficace d’extrait de fleurs Crocus sativus correspond est à une concentration comprise entre 0,5 % et 10 %, de préférence à une concentration comprise entre 0,8 % et 2 % et encore plus préférentiellement à une concentration de 1%. [Revendication 8] Utilisation non thérapeutique de la composition selon la revendication 6 pour l’hygiène buccale. [Revendication 9] Composition selon la revendication 6, pour son utilisation thérapeutique dans la prévention et le traitement des affections de la cavité buccale. [Revendication 10] Composition pour son utilisation thérapeutique selon la revendication 9, dans laquelle les affections de la cavité buccale sont les saignements, l’inflammation, la récession gingivale, le déchaussement dentaire ou la perte de substance conjonctivale associés aux parodontites et aux gingivites. [Revendication 11] Composition pour son utilisation thérapeutique selon la revendication 9, dans laquelle les affections de la cavité buccale sont provoquées par la bactérie Porphyromonas gingivalis. [Revendication 12] Composition pour son utilisation thérapeutique selon la revendication 11, dans laquelle l’activité des enzymes gingipaïnes sécrétées par la bactérie Porphyromonas gingivalis est inhibée. ISP‐BV22‐198                  Revendications    [Revendication 13] Composition pour son utilisation thérapeutique selon la revendication 12, dans laquelle les enzymes gingipaïnes sont les gingipaïnes spécifiques de l’arginine.
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