WO2023195588A1 - Mcl-1 및 bcl-xl에 동시에 결합하는 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Mcl-1 및 bcl-xl에 동시에 결합하는 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023195588A1
WO2023195588A1 PCT/KR2022/015234 KR2022015234W WO2023195588A1 WO 2023195588 A1 WO2023195588 A1 WO 2023195588A1 KR 2022015234 W KR2022015234 W KR 2022015234W WO 2023195588 A1 WO2023195588 A1 WO 2023195588A1
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bcl
protein
amino acid
acid sequence
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오병하
김성훈
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한국과학기술원
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
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    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
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    • G—PHYSICS
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
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Definitions

  • This invention was made under project number 2020R1A4A3079755 under the support of the Ministry of Science and ICT of the Republic of Korea.
  • the research management agency for the project is the National Research Foundation of Korea, the research project name is “Group Research Support (R&D),” and the research project name is “Structural Structure of the Cell Nucleus.” “Study on the molecular correlation between deformation and cellular aging”, hosted by the Korea Advanced Institute of Science and Technology, and the research period is 2021.06.01 ⁇ 2022.02.28.
  • the present invention relates to proteins that simultaneously bind MCL-1 and BCL-xL and their uses.
  • Apoptosis (programmed-cell death) is an evolutionarily conserved pathway essential for tissue homeostasis, development, and elimination of damaged cells. Deregulation of apoptosis contributes to human diseases including malignancies, neurodegenerative disorders, immune system diseases, and autoimmune diseases.
  • Proteins of the BCL-2 (B-cell lymphoma 2) family regulate the mitochondria-mediated apoptosis pathway, ultimately releasing cytochrome C from mitochondria through MOMP (mitochondrial outer membrane permeabilization).
  • Apoptogenic proteins such as (cytochrome C) and Smac/DIABLO (Second mitochondria-derived activator of caspase/Direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI) are released into the cytoplasm.
  • BCL-2 family proteins include apoptosis-inducing (pro-apoptotic) proteins and anti-apoptotic proteins, and whether apoptosis progresses is determined by the apoptosis-inducing (pro-apoptotic) BCL-2 protein and anti-apoptotic proteins. Depends on the degree of pairing of (anti-apoptotic) BCL-2 protein.
  • One of the characteristics of cancer cells is to avoid apoptosis. By avoiding apoptosis, cell survival rate increases and resistance to anticancer drugs can develop. Because many cancer cells resist apoptosis by upregulating anti-apoptotic BCL-2 family proteins, inhibiting anti-apoptotic BCL-2 family proteins can be an effective cancer treatment method. However, inhibiting only a single anti-apoptotic BCL-2 family protein member has been proven to be mostly ineffective, and when both anti-apoptotic BCL-2 family proteins are targeted simultaneously, a synergistic effect appears and can improve apoptosis. It is known that it can be done.
  • BH3-mimicking small molecules that inhibit anti-apoptotic BCL-2 family proteins are under clinical investigation for administration as single or combination drugs in various malignant tumors, and some of them are already in clinical or preclinical use. It has shown promise in the treatment of solid tumors and hematological malignancies.
  • these BH3 mimetics cannot distinguish between normal cells and cancer cells, so there is a risk of side effects by inhibiting BCL-2 family proteins not only in cancer cells but also in normal cells. If multiple BH3 mimetics are used to inhibit multiple BCL-2 family proteins, the risk of side effects will be greater.
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop a molecule that can induce apoptosis in cancer cells by simultaneously binding to two or more anti-apoptotic BCL-2 family proteins.
  • the present invention was completed by developing a protein that simultaneously binds to MCL-1 and BCL-xL and demonstrating that this protein has excellent apoptosis-inducing activity.
  • the object of the present invention is to provide a protein comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding the protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and an isolated host cell containing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the above protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method of treating cancer comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need of treatment.
  • the present invention provides a protein comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop a molecule that can induce apoptosis in cancer cells by simultaneously binding to two or more anti-apoptotic BCL-2 family proteins. As a result, a protein that simultaneously and specifically binds to MCL-1 and BCL-xL was developed, and it was found that this protein has excellent apoptosis inducing activity.
  • BCL-2 family proteins have at least one BCL-2 homology (BH) domain and are classified into three distinct groups according to their function and number of BH domains: (i) BH1 to BH3 (ii) pro-apoptotic BH3-only proteins (BIM, BID, BAD, PUMA, NOXA and BNIP3) including: etc.), and (iii) anti-apoptotic proteins with three or more BH domains (BCL-2, BCL-B, BCL-W, BCL-xL, BFL-1(A1), and MCL-1) etc).
  • BH3-only proteins induce apoptosis by directly binding to and activating BAX and BAK, or by interfering with the function of the anti-apoptotic BCL-2 protein.
  • inhibiting anti-apoptotic BCL-2 family proteins can be an effective cancer treatment method.
  • inhibiting only a single anti-apoptotic BCL-2 family protein member has been proven to be mostly ineffective, and when both anti-apoptotic BCL-2 family proteins are targeted simultaneously, a synergistic effect appears and can improve apoptosis. It is known that it can be done.
  • amino acid refers to the most basic structural unit of a protein molecule. Looking at the structure of an amino acid, an amino group (-NH 2 ) and a carboxyl group (-COOH) are attached to one carbon atom, to which hydrogen and R groups are connected.
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” and refers to a polymer of amino acids covalently linked by peptide bonds. Proteins must contain at least two amino acids. Such polymers of amino acid residues may contain natural or unnatural amino acid residues and include, but are not limited to, peptides, oligopeptides, dimers, trimers and multimers of amino acid residues, full-length proteins and fragments thereof. As used herein, “protein” includes natural or artificial proteins, protein fragments, and protein analogs.
  • the protein of the present invention can be synthesized using a synthetic method known in the art, for example, by transforming an expression vector containing a nucleic acid molecule expressing the protein into a host cell to synthesize a recombinant protein, or by using solid-phase synthesis techniques.
  • a synthetic method known in the art for example, by transforming an expression vector containing a nucleic acid molecule expressing the protein into a host cell to synthesize a recombinant protein, or by using solid-phase synthesis techniques.
  • the term "specifically binds" or the like has the same meaning commonly known to those skilled in the art, and relates to the interaction of a protein or peptide with a second chemical species, wherein the interaction is It means that it changes depending on the presence of a specific structure of the chemical species. That is, the protein or peptide recognizes and binds to the specific structure of the second chemical species, forming a relatively stable complex under physiological conditions.
  • Specific binding is at least about 1 x 10 -6 M or less (e.g., 9 x 10 -7 M, 8 x 10 -7 M, 7 x 10 -7 M, 6 x 10 -7 M , 5 x 10 -7 M , 4 x 10 -7 M, 3 x 10 -7 M, 2 x 10 -7 M, or 1 x 10 -7 M), preferably 1 x 10 -7 M or less (e.g., 9 x 10 -8 M , 8 x 10 -8 M, 7 x 10 -8 M, 6 x 10 -8 M, 5 x 10 -8 M, 4 x 10 -8 M, 3 x 10 -8 M, 2 x 10 -8 M , or 1 x 10 -8 M), more preferably 1 x 10 -8 M or less (e.g., 9 x 10 -7 M, 8 x 10 -7 M, 7 x 10 -7 M, 6 x 10 -7 M , 5 x 10 -7 M , 4 x 10 -8
  • binding affinity refers to the strength of the sum of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule and its binding partner. Unless otherwise specified, as used herein, “binding affinity” refers to the intrinsic binding affinity that reflects a 1:1 interaction between members of a binding pair. Affinity can generally be expressed in terms of the dissociation constant (K D ). Affinity can be measured by routine methods known in the art, including those described herein.
  • the protein of the present invention can bind to anti-apoptotic BCL-2 family protein.
  • the anti-apoptotic BCL-2 family protein is MCL-1, BCL-xL BCL-2 (B-cell lymphoma 2), BCL-B, BCL-W, BCL-xL (B It may be any one protein selected from the group consisting of -cell lymphoma-extra large) and BFL-1 (A1), but is not limited thereto.
  • the protein of the present invention is MCL-1 (myeloid cell leukemia 1); and any anti-apoptotic agent selected from the group consisting of B-cell lymphoma 2 (BCL-2), BCL-B, BCL-W, B-cell lymphoma-extra large (BCL-xL), and BFL-1 (A1). It can simultaneously bind to BCL-2 family proteins, but is not limited to this.
  • the anti-apoptotic BCL-2 family protein may be BCL-xL, but is not limited thereto.
  • the present inventors specifically bind to MCL-1 (K D of 150 pM) and by adding a 4th helix to ⁇ MCL1, an existing protein with a 3-helix bundle structure, binds to MCL-1 and BCL-xL simultaneously. designed a protein that A binding site for BCL-xL exists in the 4th helix of ⁇ MCL1.
  • the BCL-xL/MCL-1 binding protein designed for the first time in the examples of this specification was named “4H_ ⁇ BM_1” (SEQ ID NO: 3).
  • the “4H_ ⁇ BM_3” was confirmed to have excellent apoptosis inducing activity.
  • the protein that simultaneously binds to the above-described MCL-1 and BCL-xL is the 12th, 15th, 16th, 94th, 97th, 105th, and 136th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • BCL at amino acid residues 137, 139, 140, 143, 144, 146 to 148, 150 to 152, 154, 155, 157, 158, 161 and 162 -xL forms a specific bond, and the 43rd, 46th, 47th, 49th, 50th, 51st, 53rd to 55th, 57th to 59th, 62nd of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. It forms a specific bond with MCL-1 at the 65th, 66th, 100th, 104th, 108th, 111th, and 114th amino acid residues.
  • the protein that simultaneously binds to the above-described MCL-1 and BCL-xL is a BH3-binding groove (BH3-binding) present in the cytoplasmic domain of each of MCL-1 and BCL-xL. It binds specifically to the groove).
  • MCL-1 and BCL-xL consist of one cytoplasmic domain, excluding the transmembrane domain.
  • the cytoplasmic domain of BCL-xL is the portion from the 1st amino acid residue to the 209th amino acid residue in the amino acid sequence of BCL-xL of SEQ ID NO: 7, and the cytoplasmic domain of MCL-1 is the portion from amino acid residue 171 to the 209th amino acid residue of the MCL-1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. It is the part from the 327th amino acid residue to the 327th amino acid residue.
  • the protein that simultaneously binds to the above-mentioned MCL-1 and BCL-xL is the 93rd, 96th, 97th, 100th, 101st, and 104th, 105th, 108th, 111th to 113th, 118th, 121st, 125th, 126th, 129th, 130th, 133rd, 136th, 138th, 139th, 141st, 142nd , 146th, and 193rd to 195th amino acid residues form a specific bond with BCL-xL, and 216th, 220th, 223rd, 224th, 226th to 226th in the amino acid sequence of MCL-1 of SEQ ID NO: 8.
  • the protein of the present invention may include variants of the amino acid sequence within the range that can specifically recognize MCL-1 or the above-mentioned anti-apoptotic BCL-2 family protein.
  • changes can be made to the amino acid sequence of the protein of the present invention to improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the protein.
  • Said variants are said to have "substantial similarity", meaning that when the two peptide sequences are optimally aligned, such as by the programs GAP or BESTFIT using default gap weights, they have at least about 90% sequence identity, more preferably at least about This means sharing 95%, 98%, or 99% sequence identity.
  • residue positions that are not identical differ by conservative amino acid substitutions.
  • a “conservative amino acid substitution” is one in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity). Generally, conservative amino acid substitutions do not substantially change the functionality of the protein.
  • amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • the hydrophobic index of the amino acid may be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine/cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in imparting interactive biological functions to proteins. It is a known fact that similar biological activity can be maintained only when substituted with an amino acid having a similar hydrophobic index.
  • substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophobicity index of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity value of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • Amino acid exchanges in proteins that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
  • the protein of the present invention includes a protein containing minor changes to the above-described amino acid sequence, that is, modifications that have little effect on the tertiary structure and function of the protein. Accordingly, in some embodiments, even if the sequence does not match the above-described sequence, it may have at least 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, or 98% similarity.
  • apoptosis is applied to a protein containing any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the present invention.
  • Polypeptides containing amino acid sequences that increase apoptogenic activity can be fused.
  • the peptide containing an amino acid sequence that increases the apoptosis-inducing activity consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the present invention. It may be fused to the N-terminus and/or C-terminus of a protein containing any one amino acid sequence selected from the group. More specifically, it may be fused to the N-terminus or C-terminus, and most specifically, may be fused to the C-terminus, but is not limited thereto.
  • the peptide containing the amino acid sequence that increases the apoptosis-inducing activity may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, but is not limited thereto.
  • BIM BH3 sequence SEQ ID NO: 9
  • CTS C-terminal sequence
  • the BIM BH3 directly activates BAX/BAK, and the CTS of the BIM is a mitochondrial targeting sequence that promotes apoptosis by promoting the movement of the BIM to the mitochondrial outer membrane, which is the site of action of the anti-apoptotic BCL-2 protein, thus promoting apoptosis as described above.
  • the CTS of the BIM is a mitochondrial targeting sequence that promotes apoptosis by promoting the movement of the BIM to the mitochondrial outer membrane, which is the site of action of the anti-apoptotic BCL-2 protein, thus promoting apoptosis as described above.
  • its inducing activity can be increased.
  • the invention provides a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a protein of the invention.
  • nucleic acids is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include not only natural nucleotides but also sugars or base moieties. Also includes modified analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).
  • the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention is sufficient to be the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention described above, and it is clear to those skilled in the art that it is not limited to any specific nucleotide sequence. Therefore, in a specific embodiment of the present invention, the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence can be either a functionally equivalent codon, or a codon encoding the same amino acid (e.g., due to codon degeneracy, there are six codons for arginine or serine), or a codon encoding a biologically equivalent amino acid. It contains a nucleotide sequence containing.
  • nucleic acid molecule encoding the polypeptide or complex of the present invention is interpreted to also include sequences showing substantial identity with the sequences listed in the sequence listing.
  • the above-mentioned substantial identity is at least 60% when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art.
  • homology e.g., 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, or 69%), more preferably at least 70% homology (e.g., 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, or 79%), more preferably at least 80% or more (e.g., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, or 89%) homology, most preferably at least 90% (e.g., 90%, 91%, 92%, 93%) , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%). All integers between 70% and 100% and decimals therebetween are included within the scope of the present invention with respect to percent homology.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI), etc., and can be accessed on the Internet using blastp, blastn, It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn, and tblastx.
  • BLAST can be accessed through the BLAST page on the ncbi website. The sequence homology comparison method using this program can be found on the BLAST help page of the ncbi website.
  • the present invention provides a recombinant vector containing the above-described nucleic acid molecule.
  • the present invention provides an isolated host cell containing the above-described recombinant vector.
  • the vector is operatively linked to the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention described above.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence.
  • the regulatory sequence thereby regulates transcription and/or translation of the other nucleic acid sequences.
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods are disclosed in Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) , this document is incorporated herein by reference.
  • the vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. Additionally, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.
  • It typically includes a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/translation termination sequence.
  • E. coli is used as a host cell
  • the promoter and operator region of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024 (1984)) and the left-hand promoter of phage ⁇ (pL ⁇ promoter)
  • Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445 (1980) can be used as control sites.
  • vectors that can be used in the present invention include plasmids often used in the art (e.g., pJK hTx, pCDFduet, pCW57.1, pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), phages (e.g., ⁇ gt ⁇ 4B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, and M13, etc.), or viruses (e.g., SV40, etc.).
  • plasmids often used in the art
  • phages e.g., ⁇ gt ⁇ 4B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, and M13, etc.
  • viruses e.g., SV40, etc.
  • the vector of the present invention may be fused with other sequences to facilitate purification of the protein expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA). Because of the additional sequences required for purification, proteins expressed in the host are quickly and easily purified via affinity chromatography.
  • the vector of the present invention may contain an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, and neomycin. and a resistance gene to tetracycline.
  • an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, and neomycin.
  • a resistance gene to tetracycline for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, and neomycin.
  • the vector of the present invention is an expression vector and uses a eukaryotic cell as a host
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell e.g., metallothionein promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adenovirus
  • Viral late promoters, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV can be used and typically have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
  • the vector may additionally carry genes encoding reporter molecules (eg, luciferase and -glucuronidase).
  • reporter molecules eg, luciferase and -glucuronidase
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention can be any host cell known in the art, for example, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3) ) , E. coli strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli These include strains of the genus Bacillus, such as Cis, and strains of the Enterobacteriaceae family, such as Salmonella Typhimurium, Serratia marcescens, and various Pseudomonas species.
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cells e.g., insect cells, and animal cells (e.g., CHO cell lines (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) are used as host cells.
  • animal cells e.g., CHO cell lines (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) are used as host cells.
  • HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines etc.
  • the host cell into which the vector of the present invention is transformed is E. coli .
  • the host cell into which the vector of the present invention is transformed is E. coli Lemo (DE3), but is not limited thereto.
  • the method of transporting the vector of the present invention into a host cell is, when the host cell is a prokaryotic cell, the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973) ), Hanahan method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)) and electroporation (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145 (1988)).
  • the vector can be injected into the host cell.
  • the recombinant vector injected into the host cell can express the recombinant protein of the present invention within the host cell, and in this case, a large amount of protein is obtained.
  • the expression vector contains the lac promoter, gene expression can be induced by treating the host cell with IPTG.
  • Transformed host cells can be cultured using known host cell culture methods or modified methods.
  • the medium for culturing the transformed host cells can be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salt, etc. that E. coli can efficiently utilize.
  • Carbon sources that can be used include carbohydrates such as glucose, fructose, and sucrose; Starch, hydrolyzate of starch; Organic acids such as acetic acid and propionic acid; Includes alcohols such as ethanol, propanol, and glycerol.
  • the nitrogen source is ammonia;
  • Ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate; Peptone, meat extract, yeast extract, corn steeping liquid, casein hydrolyzate, soybean extract, soybean hydrolyzate; Includes various fermented cells and their decomposition products.
  • Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or rotation by rotator.
  • the culture temperature is preferably in the range of 10°C to 40°C, and the culture time is generally 5 hours to 7 days.
  • the pH of the medium is preferably maintained in the range of 3.0 to 9.0 during culture.
  • the pH of the medium can be adjusted with inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, kanamycin, and tetracycline may be added for maintenance and expression of the recombinant vector.
  • a suitable inducer can be added to the medium if necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • indoleacrylic acid can be added to the medium.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the protein of the present invention.
  • composition of the present invention uses the above-described protein of the present invention as an active ingredient, the description of common content between the two is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • cancer refers to aggressive characteristics in which cells divide and grow in defiance of normal growth limits, invasive characteristics that invade surrounding tissues, and metastatic characteristics that spread to other parts of the body. ) is a general term for diseases caused by cells with certain characteristics.
  • cancer includes, but is not limited to, primary cancer, recurrent cancer, and resistant cancer.
  • primary cancer refers to a normal cancer
  • recurrent cancer refers to a cancer that reoccurs after normal cancer treatment
  • resistant cancer shows extremely low sensitivity to the cancer treatment and is not suitable for the treatment. It refers to cancer that does not show improvement, relief, alleviation, or treatment symptoms.
  • typical cancer treatment may include, but is not limited to, surgery, chemotherapy, radiation therapy, hormone therapy, biological therapy, immunotherapy, etc.
  • metastatic cancer means that primary cancer or recurrent cancer that occurred in a specific area has spread to another area.
  • the pharmaceutical composition of the present invention using the protein of the present invention as an active ingredient can be useful in the prevention or treatment of cancer. You can.
  • the protein of the present invention may induce death of cancer cells by promoting apoptosis.
  • the cancer is non-Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, acute-myeloid leukemia, acute-lymphoid leukemia ), multiple myeloma, head and neck cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, glioblastoma, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, colon cancer, oral cancer, pharynx cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, breast cancer , consisting of cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, melanoma, prostate cancer, testicular cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, and mesothelioma. It may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may additionally include a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, or diluent.
  • “Pharmaceutically acceptable” means that the preparation is sterile and free of pyrogens. Suitable pharmaceutical carriers are well known in the pharmaceutical arts. The carrier(s) must be “acceptable” in the sense that it does not adversely affect the efficacy of the active ingredient of the present invention and is not harmful to its recipient. Typically, the carrier will be sterile, pyrogen-free water or saline; However, other acceptable carriers may be used. Accordingly, “pharmaceutically acceptable carrier” and “pharmaceutically acceptable excipient” are intended simply to act as a carrier, i.e., not to have biological activity of their own. Includes the compound(s) used to form part of the preparation, which is not included in the preparation. Pharmaceutically acceptable carriers or excipients are generally safe and non-toxic. Pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients as used herein include all of one or more carriers and/or excipients.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, and gelatin. , calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, etc. It is not limited.
  • Excipients may be one or more carbohydrates, polymers, lipids and minerals.
  • carbohydrates include lactose, sucrose, mannitol, and cyclodextrins, which are added to the composition to enable, for example, lyophilization.
  • polymers include starch, cellulose ethers, cellulose carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, ethylhydroxyethyl cellulose, alginates, carrageenan, hyaluronic acid and its derivatives, polyacrylic acid, polysulfonates, polyethylene.
  • lipids are fatty acids, phospholipids, phosphoric acids, mono-, di-, and triglycerides, ceramides, sphingolipids and glycolipids of all different acyl chain lengths and saturations, egg lecithin, soy lecithin, hydrogenated egg and soy lecithin; They are added to the composition for reasons similar to those for polymers.
  • minerals are talc, magnesium oxide, zinc oxide and titanium oxide, which are added to the composition to obtain benefits such as reduction of liquid build-up or favorable pigment properties.
  • Diluent is intended to mean an aqueous or non-aqueous solution intended to dilute a peptide in pharmaceutical manufacture.
  • the diluent may be one or more of saline, water, polyethylene glycol, propylene glycol, ethanol, or oil (such as safflower oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, or sesame oil).
  • Diluents can also function as buffers.
  • buffer is intended to mean an aqueous solution containing an acid-base mixture with the purpose of stabilizing pH.
  • buffers include Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, phosphate, carbonate, acetate, citrate, glycolate, lactate, borate, ACES, ADA, tartarate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, for example, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intrathecal administration, intracerebral administration, intrasternal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration. and intrarectal administration, etc., but is not limited thereto.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. Usually, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg. As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to prevent or treat the above-mentioned disease.
  • the term “prophylaxis” refers to the prevention or protective treatment of a disease or disease state.
  • treatment means reducing, suppressing, alleviating or eradicating a disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • composition of the present invention can also be used in combination with other pharmaceutically active agents and therapies in addition to the above-described active ingredients.
  • the “combination” may be expressed as simultaneous or concurrent administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be further used in combination with other methods of treating cancer by chemotherapy, radiation therapy, tumor-targeted therapy, adjuvant therapy, immunotherapy or surgery.
  • Therapeutic agents that can be used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention described above include one or more chemotherapeutic agents known in the art (e.g., asparaginase, busulfan, carboplatin, cisplatin, daunorubicin, doxorubicin, fluorouracil) , gemcitabine, hydroxyurea, methotrexate, paclitaxel, rituximab, vinblastine, vincristine), one or more targeted therapies (e.g. bevacizumab, olaparib, PD-1/PD-L1 Specific immune checkpoint inhibitors (e.g.
  • nivolumab pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, cemiplimab, atezolizumab, avelumab, thyslerizumab, spartalizumab (PDR001), set Relimab (JNJ-63723283), toripalimab (JS001), camrelizumab (SHR-1210), sintilimab (IBI308), AB122 (GLS-010), AMP-224, AMP-514/MEDI-0680, BMS936559, JTX-4014, BGB-108, SHR-1210, MEDI4736, FAZ053, BCD-100, KN035, CS1001, BAT1306, LZM009, AK105, HLX10, SHR-1316, CBT-502(TQB2450), A167(KL- A167 ), STI-A101 (ZKAB001), CK-
  • the present invention provides a method of treating cancer comprising the step of administering a pharmaceutical composition containing the above-described protein of the present invention as an active ingredient to a subject in need of treatment.
  • the cancer which is the disease targeted by the treatment method of the present invention, is the same as defined in relation to the disease targeted by the pharmaceutical composition.
  • the subject is a mammal or human.
  • the cancer treatment method of the present invention is a method of administering the above-described pharmaceutical composition to a subject, description of overlapping content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention relates to proteins that simultaneously bind MCL-1 and BCL-xL and their uses.
  • the protein of the present invention can be usefully applied in the prevention or treatment of cancer by simultaneously and specifically binding to MCL-1 and BCL-xL, which are anti-apoptotic BCL-2 family proteins whose expression is increased in various cancer types.
  • Figure 1a shows the process of designing 4H_ ⁇ MCL1 using a computer.
  • Figure 1b shows the process of engrafting the BIM BH3 sequence of the BCL-xL-BIM BH3 structure into the fourth helix of 4H_ ⁇ MCL1.
  • Figure 2A shows model screening, selection, and K D measurement of BCL-xL/MCL-1 binding proteins via surface plasmon resonance (SPR).
  • Figure 2b shows the results of size exclusion chromatography.
  • Figure 2c shows the crystal structure of 4H_ ⁇ BM_1-BCL-xL.
  • BCL-xL binds to both the BCL-xL binding site and the MCL-1 binding site (left), and the determined structure overlapped closely with the designed model with a C ⁇ RMSD of 1.062 ⁇ (center).
  • the picture on the right shows the conserved hotspot residues.
  • Figure 2d shows the conformational changes that occurred in helices ⁇ 2 and ⁇ 3 of BCL-xL.
  • Figure 3a shows the sequence design process to optimize local interaction with helices ⁇ 2 and ⁇ 3 of BCL-xL.
  • Figure 3b shows the SPR analysis results of the three models selected after sequence design.
  • Figure 3c shows the crystal structure of 4H_ ⁇ BM_2-BCL-xL.
  • BCL-xL binds to both the BCL-xL binding site and the MCL-1 binding site (left), binding closely to the designed model in all regions, including BCL-xL helices ⁇ 2 and ⁇ 3, with a C ⁇ RMSD of 0.409 ⁇ .
  • Overlapping (middle).
  • the picture on the right shows the interaction between helices ⁇ 2 and ⁇ 3 of BCL-xL and 4H_aBM_2.
  • Figure 3d shows the interface of BCL-xL with BIM BH3 or 4H_aBM_2.
  • Figure 3e shows the results of structural alignment of 4H_ ⁇ BM_2-MCL-1 and ⁇ MCL1-MCL-1.
  • Figure 3f shows the interaction between 4H_ ⁇ BM_2(I54E/G58E) and MCL-1.
  • a schematic diagram showing the introduction of the I54E/G58E mutation into the 4H_ ⁇ BM_2 and MCL-1 binding sites left.
  • the binding affinity of 4H_ ⁇ BM_2 (I54E/G58E) and MCL-1 was measured by SPR (right).
  • Figure 4a shows a schematic diagram of introducing the I54E/G58E mutation into the MCL-1 binding site and the I143L mutation into the BCL-xL binding site of 4H_ ⁇ BM_2.
  • Figure 4b shows that when the I143L mutation is introduced into the BCL-xL binding site, steric hindrance can be introduced into MCL-1 without affecting BCL-xL binding.
  • Figure 4c shows the binding affinity for anti-apoptotic BCL-2 family proteins measured through SPR.
  • Figure 4d shows the interaction of MCL-1 binding site and MCL-2.
  • the binding affinity of 4H_ ⁇ BM_3 (L147E/G151E) to MCL-1 was measured by SPR (right).
  • Figure 5a shows the results of cell viability analysis of K562, HCT-116, SW620, MEWO, and A375 cancer cell lines.
  • Figures 5b and 5c show the results of Western blot analysis to determine cytotoxicity.
  • Rosetta software was used to design the protein, and the BundleGridSampler mover was used to generate the fourth set of helices to be added to ⁇ MCL1.
  • the model was then visually inspected and interface designs were generated for the ⁇ MCL1 surface and the region within 6 ⁇ of each fourth helix.
  • One model was selected among 200 designed models through total energy score, ⁇ G, interface shape complementarity, and visual inspection.
  • the fourth helix set was connected to the C-terminus of ⁇ MCL1 using the Remodel mover, and the sequence design of the fourth helix and the interface sequence between the fourth helix and ⁇ MCL1 were performed using the FastDesign mover.
  • the BH3 sequence was grafted onto the fourth helix with 7 residues designated as hotspot residues. . Excluding these hotspot residues, sequence design was performed on all residues of the four-helix bundle within 8.3 ⁇ of BCL-xL. Eight out of a total of 500 designed models were selected through total energy score, ⁇ G, interface shape complementarity, and visual inspection. In the second round of design, the crystal structure of 4H_ ⁇ BM_1 in complex with BCL-xL was used for sequence optimization, with only six residues allowed to be changed.
  • BCL-2 family proteins were also expressed using the pJK hTx vector.
  • BCL-2 family protein constructs include BCL-2 (1-34:chimeric loop:92-203), BCL-B (1-177;C30S/C138S), BCL-W (1-164), and BCL-xL. (1-44:85-209), BFL-1 (1-151;C4S/C19S), and MCL-1 (172-321).
  • BirA was expressed in the pCDFduet vector using the BCL-2 protein containing the biotinylation sequence (GLNDIFEAQKIEWHE). The protein was expressed at 18°C in E. coli Lemo (DE3) strain grown in TB medium. Cells were collected by centrifugation, resuspended, and lysed by sonication. The supernatant was loaded onto pre-equilibrated Co-NTA resin (Thermo Fisher Scientific), and bound proteins were eluted with a buffer solution containing 100 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 7.5), and 150 mM imidazole.
  • GLNDIFEAQKIEWHE biotinylation sequence
  • the eluted protein was further purified through size exclusion chromatography using HiLoad 26/60 Superdex 75 column (GE Healthcare).
  • the purified protein was loaded on a Superdex 75 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare), and the apparent mass of the protein complex was estimated based on the elution of the size marker protein.
  • 4H_ ⁇ BM_1 (SEQ ID NO: 3) or 4H_ ⁇ BM_2 (SEQ ID NO: 4) was mixed with BCL-xL, and the resulting complex was separated by size exclusion chromatography using HiLoad 26/60 Superdex 75 column (GE Healthcare). 4H_ ⁇ BM_2 bound to MCL-1 was also purified by the same method. Crystals were obtained using the hanging-drop vapor diffusion method at 20°C. Crystals of 4H_ ⁇ BM_1-BCL-xL were obtained by mixing the complex (52.3 mg/ml) with a precipitation solution containing 4% PEG 3,000 (w/v) and 0.1 M sodium acetate (pH 4.5).
  • Crystals of 4H_ ⁇ BM_2-BCL-xL were obtained by mixing the complex (55 mg/ml) with a precipitation solution containing 10% PEG 10,000 (w/v) and 0.1 M sodium acetate (pH 4.5). Crystals of 4H_ ⁇ BM_2-MCL-1 were obtained by mixing the complex (23.5 mg/ml) with a precipitation solution containing 12% PEG 6,000 (w/v), 0.1 M magnesium chloride, and 0.1 M ADA (pH 6.5). The crystals were briefly soaked in a cryoprotectant solution.
  • the cryoprotectant solution consists of a stock solution additionally containing 17.5% ethylene glycol for 4H_ ⁇ BM_1-BCL-xL and 4H_ ⁇ BM_2-MCL-1 crystals, or 17% ethylene glycol for 4H_ ⁇ BM_2-BCL-xL; It was the same.
  • the X-ray diffraction dataset was collected at beamline 5C at Pohang Accelerator Laboratory, South Korea.
  • the structure of the 4H_ ⁇ BM_1-BCL-xL complex was determined by the single anomalous dispersion method. Afterwards, automatic model construction for electron density and structure refinement was performed using the PHENIX software suite.
  • HEK293T, A375, MEWO, SW620, HCT-116 and K562 cell lines were maintained in DMEM supplemented with antibiotic-antifungal solution and 10% FBS. All cell lines were cultured at 37°C in a humidified incubator containing 5% CO 2 .
  • the pCW57.1 lentiviral vector was used to clone the 3xFLAG-tagged protein and generate lentivirus.
  • HEK293T cells grown in T25 flasks were stained with 2.7 ⁇ g of pCW57.1, 1.4 ⁇ g of pRSV-REV, 1.9 ⁇ g of pMD2.G, and 2.9 ⁇ g of pMDL using Lipo-fectamine 3000 (GE Healthcare) according to the respective manufacturer's instructions.
  • /p RRE vector Additional gene #41393, #12253, #12259, and #12251, respectively.
  • Viral supernatants were harvested and filtered using a 0.45 ⁇ m polyethersulfone filter 72 hours after transfection.
  • the supernatant containing the virus was used immediately or stored as an aliquot at -80°C.
  • A375, MEWO, SW620, HCT-116, and K562 cells were infected with each virus supernatant along with 8 ⁇ g/ml polybrene. Afterwards, the cells were incubated at 37°C for 48 hours and infected pools were selected by treatment with 2 ⁇ g/ml puromycin. Puromycin-resistant pools were used for cell viability analysis and Western blot analysis in the presence or absence of 2 ⁇ g/ml doxycycline.
  • WST-1 (Roche) reagent according to the manufacturer's instructions. Successfully transduced cell lines were seeded in 96-well plates at 5000 cells per well in 100 ⁇ l culture medium. After incubation for 24 hours, 2 ⁇ g/ml doxycycline was added to the culture medium to induce protein expression. For the expression of BIM, doxycycline was used at a concentration 1/100 times lower. After 12 hours of incubation, WST-1 reagent was added, and absorbance was measured at 450 nm and 690 nm using a Spark 10 M microplate reader (Tecan).
  • Antibodies used for Western blot were as follows: anti-FLAG (Sigma, F1804), anti-BCL-xL (Abcam, ab32370), anti-MCL-1 (Abcam, ab32087), anti- ⁇ -H2A.X ( Abcam, ab81299), anti-PARP (Abcam, 191217), anti- ⁇ -actin (Abcam, ab6276), HRP-conjugated anti-rabbit IgG (Abcam, ab205718), and HRP-conjugated anti-mouse IgG (Abcam, ab6728) ).
  • ⁇ MCL1 (SEQ ID NO: 1), a protein with a 3-helix bundle structure, we designed a protein that simultaneously binds to MCL-1 and BCL-xL.
  • ⁇ MCL1 is a de novo designed protein that binds specifically and strongly to MCL-1, and its dissociation constant (K D ) is 150 pM.
  • K D dissociation constant
  • This protein has a BH3-like motif in the second helix that is responsible for interaction with MCL-1. This is clearly confirmed in the ⁇ MCL1-MCL-1 co-crystal structure (PDB entry: 5JSB). In addition to these major sites of intermolecular interaction, two other helices also contribute to MCL-1 binding, improving specificity.
  • 4H_ ⁇ MCL1 was used as a template to engraft the crystal structure of BCL-xL bound to the BIM BH3 peptide.
  • Rosetta's motif grafting protocol with the 'hotspot' option was used to retain the seven highly conserved BH3 residues of BIM (i.e., Ile148, Ala149, Leu152, Ile155, Gly156, Asp157, and Phe159). .
  • any residues (excluding hotspan residues) within 8.3 ⁇ - 10 ⁇ in BCL-xL can be changed, and residues within 8.3 ⁇ - 10 ⁇ in BCL-xL can be repacked ( Additional sequence design limited to repacking was performed.
  • Five hundred models were evaluated according to the following filtering criteria: Rosetta total atomic energy ⁇ -660, interface shape complementarity > 0.62, buried unsatisfied polar atoms ⁇ 3 ( Figure 1b). Considering that motif grafting generally has a high success rate, eight designs were selected through visual inspection. Afterwards, all were cloned and produced in E. coli for experimental verification.
  • Binding to BCL-xL was evaluated using surface plasmon resonance (SPR), and the design with the strongest binding (D81) was selected and designated as “4H_ ⁇ BM_1 (SEQ ID NO: 3)” (FIG. 2A). SPR was performed with various concentrations of the selected design and the dissociation constant (K D ) was determined to be 8.57 nM ( Figure 2a). Using size exclusion chromatography, it was confirmed that this protein could not only bind to MCL-1, but could also bind to BCL-xL and MCL-1 simultaneously. This showed that the MCL-1 binding site of 4H_ ⁇ BM_1 was intact and that BCL-xL and MCL-1 could bind simultaneously without steric hindrance (Figure 2b).
  • the model that showed the highest binding affinity was the 12th amino acid residue Asp to Ile, the 16th amino acid residue Asn to Arg, the 19th amino acid residue Arg to Thr, the 142nd amino acid residue Ala to Glu, and the 146th amino acid residue Thr.
  • the crystal structure of 4H_ ⁇ BM_2-BCL-xL was determined (Table 1). Also for 4H_ ⁇ BM_2BCL-xL, the crystal structure represents a 1:2 complex between 4H_ ⁇ BM_2 and BCL-xL and closely matches the designed model in all regions, including BCL-xL helices ⁇ 2 and ⁇ 3, with a C ⁇ RMSD of 0.409 ⁇ . They matched ( Figure 3c). Through the crystal structure, it was found that substitution of D12I, N16R, and T146R improved intermolecular interactions.
  • Ile12 forms hydrophobic interactions with Ala104 and Phe105 of BCL-xL
  • Arg16 forms electrostatic interactions with the backbone oxygen of Ala104 at the end of BCL-xL helix ⁇ 2.
  • the amino group is hydrogen bonded with Gln111 of BCL-xL, and its b, c, and d carbon atoms are in close contact with Phe105 of BCL-xL, resulting in not only electrostatic interaction but also aliphatic interaction. Contributes to hydrophobic interactions with the moiety (Figure 3c).
  • the MCL-1 binding site of native ⁇ MCL1 is highly specific for MCL-1 with a K D of 0.15 nM, and has much lower affinity for other anti-apoptotic BCL-2 proteins (K D >10 ⁇ M).
  • K D >10 ⁇ M
  • the resulting mutant protein, 4H_ ⁇ BM_2(I54E/G58E), should be able to interact with the anti-apoptotic BCL-2 protein only through the newly designed BCL-xL binding site in the fourth ⁇ -helix.
  • the newly designed BCL-xL binding site bound MCL-1 with significantly higher affinity (K D of 19.2 nM) (Figure 3f).
  • K D 19.2 nM
  • Figure 3f the structural superposition of MCL-1 in the 4H_ ⁇ BM_2-BCL-xL complex was investigated. As a result, it was confirmed that changing the Ile143 hotspot residue to leucine could introduce steric hindrance into MCL-1 without affecting BCL-xL binding.
  • BIM BH3 directly activates BAX/BAK, and the CTS of BIM is a mitochondrial targeting sequence that promotes the movement of BIM to the outer mitochondrial membrane, the site of action of the anti-apoptotic BCL-2 protein. Therefore, it was expected that the two constructs could improve the apoptosis-inducing efficacy of 4H_ ⁇ BM_3.
  • 4H_ ⁇ BM_3, 4H_ ⁇ BM_3_BH3, and 4H_ ⁇ BM_3_CTS bind more strongly to MCL-1 and BCL-xL than full-length human BIM and induce apoptosis.

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Abstract

본 발명은 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 다양한 암종에서 발현이 증가되는 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질인 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에, 특이적으로 결합하여 암의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

MCL-1 및 BCL-XL에 동시에 결합하는 단백질 및 이의 용도
본 발명은 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제번호 2020R1A4A3079755에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 “집단연구지원(R＆D)”, 연구과제명은 “세포핵의 구조적 변형과 세포 노화의 분자적 상관관계 연구”, 주관기관은 한국과학기술원, 연구기간은 2021.06.01 ~ 2022.02.28이다.
본 특허출원은 2022년 4월 6일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0043052호 및 2022년 8월 11일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0100950호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
아폽토시스(apoptosis, programmed-cell death)는 조직 항상성, 발달 및 손상된 세포의 제거에 필수적인 진화적으로 보존된 경로이다. 아폽토시스의 탈조절은 악성 종양, 신경퇴행성 장애, 면역계 질환 및 자가면역 질환을 포함하는 인간 질환에 기여한다.
BCL-2(B-cell lymphoma 2) 계열(family)의 단백질은 미토콘드리아가 매개하는 아폽토시스(apoptosis) 경로를 조절하여 궁극적으로 미토콘드리아에서 MOMP(mitochondrial outer membrane permeabilization, 미토콘드리아 외막 투과화)를 통해 사이토크롬 C(cytochrome C) 및 Smac/DIABLO(Second mitochondria-derived activator of caspase/Direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)와 같은 아폽토시스 유발(apoptogenic) 단백질을 세포질로 방출한다. BCL-2 계열 단백질에는 아폽토시스-유도(pro-apoptotic) 단백질 및 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 단백질이 있으며, 아폽토시스의 진행 여부는 상기 아폽토시스-유도(pro-apoptotic) BCL-2 단백질 및 항-아폽토시스(anti-apoptotic) BCL-2 단백질의 페어링 정도에 의존한다.
암세포의 특징 중 하나는 아폽토시스를 회피하는 것으로, 아폽토시스를 회피함으로써 세포의 생존률이 높아지고 항암제에 대한 내성이 생길 수 있다. 많은 암세포는 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 상향조절하여 아폽토시스에 저항하기 때문에, 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 억제하는 것이 효과적인 암 치료 방법이 될 수 있다. 다만, 단일 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질 구성원만을 억제하는 것은 대부분 효과가 없는 것으로 입증된 바 있으며, 두 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 동시에 대상으로 하는 경우에 시너지 효과가 나타나 아폽토시스를 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 억제하는 BH3-모방 소분자 (BH3-mimicking small molecules)가 다양한 악성 종양에서 단일 또는 조합 약제로 투여되기 위하여 임상 조사중에 있으며, 이들 중 일부는 이미 임상 또는 전임상 단계에서 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에 가능성을 보여주었다. 다만, 이러한 BH3 모방체는 정상 세포와 암세포를 구별할 수 없어 암세포에서 뿐만 아니라 정상 세포에서도 BCL-2 계열 단백질을 억제하여 부작용의 위험이 있다. 복수의 BCL-2 계열 단백질을 억제하기 위하여 복수의 BH3 모방체를 사용할 경우, 그 부작용의 위험은 더 커질 것이다.
따라서, 부작용의 위험 없이 2 이상의 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질에 동시에 결합하여 암세포에서 아폽토시스를 유발하고, 이를 통하여 암을 치료할 수 있는 분자의 개발이 요구되는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 2 이상의 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질에 동시에 결합하여 암세포에서 아폽토시스를 유발할 수 있는 분자를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질을 개발하고, 이 단백질의 아폽토시스 유발 활성(apoptogenic activity)이 우수함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 이를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다.
본 발명자들은 2 이상의 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질에 동시에 결합하여 암세포에서 아폽토시스를 유발할 수 있는 분자를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, MCL-1 및 BCL-xL에 동시에, 특이적으로 결합하는 단백질을 개발하고, 이 단백질의 아폽토시스 유발 활성(apoptogenic activity)이 우수함을 규명하였다.
BCL-2 계열 단백질들은 적어도 하나 이상의 BCL-2 상동 (BCL-2 homology; BH) 도메인을 가지며, 이들은 그 기능 및 BH 도메인 수에 따라 구별되는 다음 3 개의 그룹으로 분류된다: (i) BH1 내지 BH3까지를 포함하는 아폽토시스-유도(pro-apoptotic) 및 기공 형성 단백질(BAX, BAK 및 BOK) (ii) 아폽토시스-유도(pro-apoptotic) BH3-only 단백질(BIM, BID, BAD, PUMA, NOXA 및 BNIP3 등), 및 (iii) 3개 이상의 BH 도메인을 갖는 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 단백질(BCL-2, BCL-B, BCL-W, BCL-xL, BFL-1(A1) 및 MCL-1 등). BH3-only 단백질은 직접적으로 BAX와 BAK에 결합하고 이들을 활성화함으로써, 또는 항-아폽토시스 BCL-2 단백질의 기능에 간섭함으로써 아폽토시스를 유도한다.
많은 암세포는 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 상향조절하여 아폽토시스에 저항하기 때문에, 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 억제하는 것이 효과적인 암 치료 방법이 될 수 있다. 다만, 단일 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질 구성원만을 억제하는 것은 대부분 효과가 없는 것으로 입증된 바 있으며, 두 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 동시에 대상으로 하는 경우에 시너지 효과가 나타나 아폽토시스를 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "아미노산(amino acid)"은 단백질 분자의 가장 기본적인 구성 단위를 의미한다. 아미노산의 구조를 보면 탄소 원자 1개에 아미노기(-NH2)와 카르복실기(-COOH)가 붙어 있으며 여기에 수소와 R기가 연결되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "단백질(protein)"은 "폴리펩타이드(polypeptide)"와 상호교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 중합체를 지칭한다.　단백질은 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 한다. 이러한 아미노산 잔기들의 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기들을 함유할 수 있으며, 아미노산 잔기들의 펩타이드, 올리고펩타이드, 이량체, 삼량체 및 다량체, 전장 단백질 및 이의 단편을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서, "단백질"은 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 유사체를 포함한다. 본 발명의 단백질은 당 업계에 공지된 합성 방법, 예를 들어 단백질을 발현하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환하여 재조합 단백질을 합성하거나, 고체상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 단백질 또는 펩타이드의 제2 화학종과의 상호작용과 관련한 것으로, 상기 상호작용이 상기 화학종의 특정한 구조의 존재에 따라 변함을 의미한다. 즉, 상기 단백질 또는 펩타이드는 상기 제2 화학종의 특정 구조를 인식하여 결합하며, 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 복합체를 형성한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하(예컨대, 9 x 10-7 M, 8 x 10-7 M, 7 x 10-7 M, 6 x 10-7 M, 5 x 10-7 M, 4 x 10-7 M, 3 x 10-7 M, 2 x 10-7 M, 또는 1 x 10-7 M), 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하(예컨대, 9 x 10-8 M, 8 x 10-8 M, 7 x 10-8 M, 6 x 10-8 M, 5 x 10-8 M, 4 x 10-8 M, 3 x 10-8 M, 2 x 10-8 M, 또는 1 x 10-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하(예컨대, 9 x 10-9 M, 8 x 10-9 M, 7 x 10-9 M, 6 x 10-9 M, 5 x 10-9 M, 4 x 10-9 M, 3 x 10-9 M, 2 x 10-9 M, 또는 1 x 10-9 M)의 평형 해리 상수(예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화도(binding affinity)"은 결합 쌍의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단백질은 항-아폽토시스(anti-apoptotic) BCL-2 계열 단백질(BCL-2 family protein)에 결합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질은 MCL-1, BCL-xL BCL-2(B-cell lymphoma 2), BCL-B, BCL-W, BCL-xL(B-cell lymphoma-extra large) 및 BFL-1(A1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단백질은 MCL-1(myeloid cell leukemia 1); 및 BCL-2(B-cell lymphoma 2), BCL-B, BCL-W, BCL-xL(B-cell lymphoma-extra large) 및 BFL-1(A1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질(BCL-2 family protein)에 동시에 결합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질은 BCL-xL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 MCL-1에 특이적으로 결합(150 pM의 KD)하며, 3-나선 번들 구조를 가진 기존의 단백질인 αMCL1에 4 번째 나선을 추가하여, MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질을 디자인하였다. 상기 αMCL1의 4 번째 나선에는 BCL-xL의 결합 부위가 존재한다. 본 명세서의 실시예에서 처음으로 디자인된 BCL-xL/MCL-1 결합 단백질은"4H_αBM_1"(서열번호 3) 로 명명하였다. 4H_αBM_1을 구조적 검증한 이후, 12번째 아미노산 잔기 Asp를 Ile로, 16번째 아미노산 잔기 Asn를 Arg로, 19번째 아미노산 잔기 Arg을 Thr로, 142번째 아미노산 잔기 Ala를 Glu로, 146번째 아미노산 잔기 Thr를 Arg로 치환하여, BCL-xL에 대한 친화도가 4H_αBM_1 보다 40 배 강한 "4H_αBM_2"(서열번호 4)를 추가적으로 디자인하였다. 이후 BCL-xL 결합 부위의 결합 특이성을 향상시키기 위하여, 143번째 아미노산 잔기 Ile를 Leu로 치환한 "4H_αBM_3"(서열번호 5)을 최종적으로 디자인하였으며, 상기 "4H_αBM_3"의 BCL-xL 결합 부위는 820 pM의 KD로 BCL-xL에 결합하고, MCL-1 결합 부위는 196 pM의 KD로 MCL-1에 결합하여, 높은 친화도를 나타냈다. 또한, 상기 "4H_αBM_3"의 BCL-xL 결합 부위는 또 다른 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질인 BCL-2(2.04 nM의 KD) 및 BCL-W(1.59 nM의 KD)에 대해서도 상당한 친화도를 보였다. 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질 BCL-B 및 BFL-1에 대해서는 각각 146 nM의 KD 및 16.4 nM의 KD를 나타냈다. 본 발명의 실시예에서, 상기 "4H_αBM_3"는 우수한 아폽토시스 유발(apoptogenic) 활성을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열의 12번째, 15번째, 16번째, 94번째, 97번째, 105번째, 136번째, 137번째, 139번째, 140번째, 143번째, 144번째, 146번째 내지 148번째, 150번째 내지 152번째, 154번째, 155번째, 157번째, 158번째, 161번째 및 162번째 아미노산 잔기에서 BCL-xL와 특이적인 결합을 형성하며, 서열번호 5의 아미노산 서열의 43번째, 46번째, 47번째, 49번째, 50번째, 51번째, 53번째 내지 55번째, 57번째 내지 59번째, 62번째, 65번째, 66번째, 100번째, 104번째, 108번째, 111번째, 114번째 아미노산 잔기에서 MCL-1과 특이적인 결합을 형성한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질은 MCL-1 및 BCL-xL 각각의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)에 존재하는 BH3-결합 그루브(BH3-binding groove)에 특이적으로 결합한다. MCL-1 및 BCL-xL은 막관통 도메인(transmembrane domain)을 제외하면 하나의 세포질 도메인으로 구성되어 있다. BCL-xL의 세포질 도메인은 서열번호 7의 BCL-xL의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 잔기부터 209번째 아미노산 잔기까지의 부분이며, MCL-1의 세포질 도메인은 서열번호 8의 MCL-1 아미노산 서열에서 171번째 아미노산 잔기부터 327번째 아미노산 잔기까지의 부분이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질은 서열번호 7의 BCL-xL의 아미노산 서열에서 93번째, 96번째, 97번째, 100번째, 101번째, 104번째, 105번째, 108번째, 111번째 내지 113번째, 118번째, 121번째, 125번째, 126번째, 129번째, 130번째, 133번째, 136번째, 138번째, 139번째, 141번째, 142번째, 146번째, 및 193번째 내지 195번째 아미노산 잔기에서 BCL-xL와 특이적인 결합을 형성하며, 서열번호 8의 MCL-1의 아미노산 서열에서 216번째, 220번째, 223번째, 224번째, 226번째 내지 228번째, 231번째, 233번째 내지 235번째, 245번째, 248번째, 249번째, 252번째, 253번째, 256번째, 260번째 내지 263번째, 266번째, 267번째, 270번째, 318번째, 319번째 아미노산 잔기에서 MCL-1과 특이적인 결합을 형성한다.
본 발명의 단백질은 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, MCL-1 또는 상술한 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 단백질의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단백질은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 단백질의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 단백질을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상술한 본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 아폽토시스 유발 활성(apoptogenic activity)을 증가시키는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 융합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아폽토시스 유발 활성을 증가시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 상술한 본 발명의 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다. 보다 구체적으로는 N-말단 또는 C-말단에, 가장 구체적으로는 C-말단에 융합되어 연결될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아폽토시스 유발 활성을 증가시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 4H_αBM_3에 BIM BH3 서열(서열번호 9) 또는 BIM의 CTS(C-terminal sequence)(서열번호 10)을 융합한 경우, 아폽토시스 유발 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 상기 BIM BH3은 BAX/BAK를 직접 활성화하고, 상기 BIM의 CTS는 미토콘드리아 표적 서열로서 BIM이 항-아폽토시스 BCL-2 단백질의 작용 부위인 미토콘드리아 외막으로 이동하는 것을 촉진하여 아폽토시스를 촉진하며, 따라서 상술한 본 발명의 단백질에 융합되는 경우 그 유발 활성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상술한 본 발명의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 충분하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다. 따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 복합체를 인코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 적어도 60% 이상의 상동성(예컨대, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 바람직하게는 적어도 70% 이상의 상동성(예컨대, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 바람직하게는 적어도 80% 이상(예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%)의 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상(예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 70% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이의 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 상술한 본 발명의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동적으로 결합(operatively linked) 된다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pJK hTx, pCDFduet, pCW57.1, pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt·λ4B, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli Lemo(DE3)와 같은 E.coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 동물 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 벡터를 형질전환시키는 숙주세포는 E. coli이다. 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 벡터를 형질전환시키는 숙주세포는 E. coli Lemo(DE3)이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 재조합된 본 발명의 단백질을 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균(E.coli)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.
상기 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 단백질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 단백질을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서, 용어 "암"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭한다. 본 명세서에서, "암"은 원발암, 재발암, 내성암을 포함하고, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 "원발암"은 통상의 암을 뜻하며, "재발암"은 통상의 암 치료 후 재발생된 암을 뜻하고, "내성암"은 상기 암 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 여기서, 통상의 암 치료는 수술, 화학치료, 방사선치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역치료 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, "전이암"은 특정 부위에서 발생한 원발암 또는 재발암이 다른 부위로 전이된 것을 의미한다.
많은 암종에서 암세포는 항-아폽토시스 BLC-2 계열 단백질을 과발현하여 아폽토시스를 회피하고 지속적으로 성장하므로, 본 발명의 단백질을 유효성분으로 이용하는 본 발명의 약제학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단백질은 아폽토시스를 촉진하여 암세포의 사멸을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 암은 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암(head and neck cancer), 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종(glioblastoma), 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 결장암, 구강암, 인두암, 후두암, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 악성 흑색종 (melanoma), 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 제제가 멸균이고 발열원(pyrogen)이 없는 것이다. 적절한 약제학적 담체는 약제학 분야에서 잘 알려져 있다. 상기 담체(들)은 본 발명의 유효성분의 효능에 악영향을 미치지 않고 그의 수용자(recipient)에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능(acceptable)"해야 한다. 전형적으로, 상기 담체는 멸균되고 발열원이 없는 물 또는 식염수일 것이다; 그러나, 다른 허용가능한 담체가 사용될 수 있다. 따라서, "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)" 및 "약제학적으로 허용가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipient)"는 단순히 담체로서 작용하도록 의도된, 즉, 그 자체의 생물학적 활성을 갖는 것으로 의도되지 않는, 제제의 일부를 형성하는데 사용된 화합물(들)을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 일반적으로 안전하고, 무독성이다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제는 1 이상의 담체 및/또는 부형제를 모두 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비 톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
부형제는 하나 이상의 탄수화물, 폴리머, 지질 및 미네랄일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토스, 수크로스, 만니톨, 및 시클로덱스트린을 포함하고, 이것은 예를 들여, 동결건조를 가능하게 하기 위해 조성물에 첨가된다. 폴리머의 예는 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌 옥시드 코폴리머, 상이한 가수분해도(degree of hydrolysis)의 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 및 모든 상이한 분자량의 폴리비닐피롤리돈이고, 이들은 예를 들어, 점도 조절을 위해, 접착을 이루기 위해, 또는 화학적 및 단백질 분해성 분해로부터 지질을 보호하기 위해 상기 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 인산, 모노-, 다이-, 및 트리글리세리드, 세라마이드, 모든 상이한 아실 사슬 길이 및 포화의 스핑고지질 및 당지질, 달걀 레시틴, 콩 레시틴, 수소화된 달걀 및 콩 레시틴이고, 이들은 폴리머에 대한 이유와 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 탈크, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티타늄이고, 이들은 액체 축적의 감소 또는 유리한 색소 특성과 같은 이점을 수득하기 위해 상기 조성물에 첨가된다.
희석제(diluent)는 약제학적 제조에서 펩타이드를 희석할 목적을 갖는 수성 또는 비-수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 하나 이상의 식염수(saline), 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 (홍화유, 옥수수유, 땅콩 기름, 면실유 또는 참기름과 같은) 오일일 수 있다.
희석제는 또한 완충액으로서 기능할 수 있다. 용어 "완충액(buffer)"은 pH를 안정화하는 목적을 갖는 산-염기 혼합물을 함유하는 수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충액의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카르보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르타레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 내 투여, 척수강 내 투여, 뇌내 투여, 흉골내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 mg/kg이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 유효성분 이외에 다른 약제학적 활성 약제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 "조합"은 동시 또는 병용투여로 표현될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 화학치료, 방사선 치료, 종양-표적 치료, 보조 치료, 면역치료 또는 수술에 의해 암을 치료하는 다른 방법과 조합하여 추가로 사용될 수 있다.
상술한 본 발명의 약제학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 치료제로는 당업계에 공지된 1 이상의 화학치료제(예컨대 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴), 1 이상의 표적치료제(예컨대 베바시주맙(bevacizumab), 올라파립(olaparib), PD-1/PD-L1 특이적인 면역 관문 억제제(예컨대 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 더발루맙, 아벨루맙, 세미플리맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 티슬레리주맙, 스파르탈리주맙(PDR001), 세트렐리맙(JNJ-63723283), 토리팔리맙(JS001), 캄렐리주맙(SHR-1210), 신틸리맙(IBI308), AB122(GLS-010), AMP-224, AMP-514/MEDI-0680, BMS936559, JTX-4014, BGB-108, SHR-1210, MEDI4736, FAZ053, BCD-100, KN035, CS1001, BAT1306, LZM009, AK105, HLX10, SHR-1316, CBT-502(TQB2450), A167(KL-A167), STI-A101(ZKAB001), CK-301, BGB-A333, MSB-2311, HLX20, TSR-042, 또는 LY3300054)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 단백질을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법의 대상 질병인 상기 암은 약제학적 조성물의 치료 대상 질환과 관련하여 정의한 것과 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.
본 발명의 암의 치료방법은 상술한 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 다양한 암종에서 발현이 증가되는 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질인 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에, 특이적으로 결합하여 암의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1a는 4H_αMCL1를 컴퓨터를 이용하여 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 1b는 BCL-xL-BIM BH3 구조의 BIM BH3 서열을 4H_αMCL1의 네번째 나선에 접목(engraft)하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2a는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 통한 BCL-xL/MCL-1 결합 단백질의 모델 스크리닝, 선택, KD 측정을 나타낸 것이다.
도 2b는 크기배제 크로마토그래 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 4H_αBM_1-BCL-xL의 결정구조를 나타낸 것이다. BCL-xL이 BCL-xL 결합 부위 및 MCL-1 결합 부위 모두에 결합하며(왼쪽), 결정된 구조는 디자인된 모델과 1.062 Å의 Cα RMSD로 밀접하게 중첩되었다(가운데). 오른쪽 그림은 보존된 핫스팟 잔기를 나타낸 것이다.
도 2d는 BCL-xL의 나선 α2와 α3에 일어난 형태적 변화를 나타낸 것이다.
도 3a는 BCL-xL의 나선 α2 및 α3과의 국소(local) 상호작용을 최적화하기 위한 서열 디자인 과정을 나타낸 것이다.
도 3b는 서열 디자인 후 선택된 3개 모델의 SPR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 4H_αBM_2-BCL-xL의 결정 구조를 나타낸 것이다. BCL-xL이 BCL-xL 결합 부위 및 MCL-1 결합 부위 모두에 결합하며(왼쪽), BCL-xL 나선 α2 및 α3을 포함한 모든 영역(region)에서 디자인된 모델과 0.409 Å의 Cα RMSD로 밀접하게 중첩하였다(가운데). 오른쪽 그림은 BCL-xL의 나선 α2 및 α3와 4H_aBM_2의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 3d는 BCL-xL의 BIM BH3 또는 4H_aBM_2와의 인터페이스(interface)를 나타낸 것이다.
도 3e는 4H_αBM_2-MCL-1 및 αMCL1-MCL-1의 구조적 정렬(structural alignment)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3f는 4H_αBM_2(I54E/G58E)과 MCL-1의 상호작용을 나타낸 것이다. 4H_αBM_2와 MCL-1 결합 부위에 I54E/G58E 돌연변이를 도입한 모식도를 나타낸 것이다(왼쪽). 4H_αBM_2(I54E/G58E)와 MCL-1의 결합 친화도를 SPR로 측정한 것이다(오른쪽).
도 4a는 4H_αBM_2의 MCL-1 결합 부위에 I54E/G58E 돌연변이를, BCL-xL 결합 부위에 I143L 돌연변이를 도입한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4b는 BCL-xL 결합 부위에 I143L 돌연변이를 도입한 경우 BCL-xL 결합에 영향을 미치지 않고 MCL-1에 입체 장애를 도입할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 4c는 SPR을 통하여 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질에 대한 결합 친화도를 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 4d는 MCL-1 결합 부위와 MCL-2의 상호작용을 나타낸 것이다. 원래 MCL-1 결합 부위가 동일한 효능을 유지하는지 여부를 관찰하기 위하여 4H_αBM_3에 L147E 및 G151E 돌연변이를 도입한 모식도를 나타낸 것이다(왼쪽). 4H_αBM_3(L147E/G151E)의 MCL-1에 대한 결합 친화도를 SPR로 측정한 것이다(오른쪽).
도 5a는 K562, HCT-116, SW620, MEWO 및 A375 암 세포주의 세포 생존능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5b 및 도 5c는 세포 독성을 알아보기 위한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실험재료 및 실험방법>
1. 컴퓨터를 이용한 디자인(Computational design)
단백질을 디자인하기 위하여 Rosetta software를 사용하였고, αMCL1에 추가될 네번째 나선 세트를 생성하기 위하여 BundleGridSampler mover를 사용하였다. 그 후, 모델을 시각적으로 검사하고 αMCL1 표면과 각 4번째 나선의 6 Å이내 영역에 대한 인터페이스 디자인을 생성하였다. 총 에너지 점수(total energy score), △△G, 인터페이스 모양 상보성interface shape complementarity) 및 시각적 검사를 통하여 200 개의 디자인된 모델 중 1 개를 선택하였다. Remodel mover를 이용하여 네번째 나선 세트를 αMCL1의 C-말단에 연결하였으며, FastDesign mover를 사용하여 네번째 나선의 서열 디자인 및 네번째 나선과 αMCL1의 인터페이스 서열 디자인을 수행하였다. BIM BH3 펩타이드와 복합체를 이루는 BCL-xL의 결정 구조(PDB entry: 3FLD)를 이용하여 핫스팟 잔기(hotspot residues)로 지정된 7 개의 잔기가 있는 네 번째 나선에 BH3 서열을 모티프 그래프팅(motif grafting)하였다. 이러한 핫스팟 잔기를 제외하고, BCL-xL의 8.3 Å 내의 4-나선 번들(four-helix bundle)의 모든 잔기에 대하여 서열 디자인을 수행하였다. 총 에너지 점수(total energy score), △△G, 인터페이스 모양 상보성interface shape complementarity) 및 시각적 검사를 통하여 총 500 개의 디자인된 모델 중 8 개를 선택하였다. 디자인의 두 번째 라운드에서 BCL-xL과 복합체를 이루는 4H_αBM_1의 결정 구조가 서열 최적화에 사용되었으며, 6 개의 잔기만 변경될 수 있었다.
2. 단백질 발현, 정제 및 크기배제 크로마토그래피(Protein expression, purification, and size-exclusion chromatography)
디자인된 단백질을 인코딩하는 DNA 단편을 합성하였고(IDT), E. coli 또는 포유동물 세포에서 발현시키기 위하여 각각 pJK hTx 또는 pCW57.1 벡터에 클로닝하였다. BCL-2 계열 단백질들도 pJK hTx 벡터를 이용하여 발현하였다. BCL-2 계열 단백질 컨스트럭트로는 BCL-2 (1-34:chimeric loop:92-203), BCL-B (1-177;C30S/C138S), BCL-W (1-164), BCL-xL (1-44:85-209), BFL-1 (1-151;C4S/C19S), MCL-1 (172-321)가 있었다. BCL-2 계열 단백질의 비오틴화를 위하여, 비오틴화 서열(GLNDIFEAQKIEWHE)을 포함하는 BCL-2 단백질을 사용하여 pCDFduet 벡터에서 BirA를 발현시켰다. 단백질은 TB 배지에서 성장한 E.coli Lemo(DE3) 균주에서 18℃에서 발현시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 재현탁하고, 초음파처리에 의해 용해시켰다. 상등액을 pre-equilibrated Co-NTA resin (Thermo Fisher Scientific)에 로딩하였고, 결합된 단백질을 100 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 7.5) 및 150 mM 이미다졸을 포함하는 완충 용액으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 HiLoad 26/60 Superdex 75 column (GE Healthcare)을 사용한 크기배제 크로마토그래피를 통하여 추가 정제하였다. 정성적 결합 분석을 위하여 정제된 단백질을 Superdex 75 Increase 10/300 GL column (GE Healthcare)에 로딩하였고, 크기 마커 단백질의 용출을 기반으로 단백질 복합체의 겉보기 질량(apparent mass)을 추정하였다.
3. 결정화 및 구조 결정(Crystallization and structure determination)
4H_αBM_1(서열번호 3) 또는 4H_αBM_2(서열번호 4)를 BCL-xL와 혼합하고, 생성된 복합체를 HiLoad 26/60 Superdex 75 column(GE Healthcare)를 이용한 크기배제 크로마토그래피로 분리하였다. MCL-1에 결합한 4H_αBM_2도 동일한 방법으로 정제하였다. 20℃에서 현수식 증기확산법(hanging-drop vapor diffusion method)으로 결정을 얻었다. 4H_αBM_1-BCL-xL의 결정은 복합체 (52.3mg/ml)를 4% PEG 3,000(w/v) 및 0.1 M 아세트산나트륨(pH 4.5)이 포함된 침전 용액과 혼합하여 얻었다. 4H_αBM_2-BCL-xL의 결정은 복합체(55 mg/ml)를 10% PEG 10,000 (w/v) 및 0.1 M 아세트산나트륨(pH 4.5)이 포함된 침전 용액과 혼합하여 얻었다. 4H_αBM_2-MCL-1의 결정은 복합체(23.5 mg/ml)를 12% PEG 6,000 (w/v), 0.1 M 염화마그네슘 및 0.1 M ADA (pH 6.5)가 포함된 침전 용액과 혼합하여 얻었다. 결정들을 동결보호제 용액에 잠시 담갔다. 동결보호제 용액은 4H_αBM_1-BCL-xL 및 4H_αBM_2-MCL-1 결정의 경우에는 17.5% 에틸렌 글라이콜을 추가적으로, 또는 4H_αBM_2-BCL-xL의 경우에는 17% 에틸렌 글라이콜을 추가적으로 포함하는 저장용액과 동일한 것이었다. X-선 회절 데이터세트는 대한민국 포항가속기연구소(Pohang Accelerator Laboratory)의 빔라인(beamline) 5C에서 수집하였다. 4H_αBM_1-BCL-xL 복합체의 구조는 단일 이상 분산법(single anomalous dispersion method)에 의해 결정되었다. 그 후, PHENIX software suit를 이용하여 전자 밀도 및 구조 교정(structure refinement)에 대한 자동 모델 구축을 수행하였다. 4H_αBM_2-BCL-xL 및 4H_αBM_2-MCL-1 복합체의 구조는 각각의 디자인 모델을 검색 모델로 사용하여 분자 교체(molecular replacement)를 통해 결정한 다음 PHENIX를 사용하여 구조 교정을 수행하였다. COOT 및 PHENIX 프로그램을 사용하여 수동 모델 구축 및 교정의 반복적인 라운드를 수행하였다. 모든 구조는 PYMOL software를 사용하여 설명되었다. 결정학적 데이터 통계는 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2022015234-appb-img-000001
4. 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)
SPR 데이터를 8 K device (GE Healthcare)로 수집하였다. Series S Biotin CAPture kit (GE Healthcare)를 이용하여 비오틴화된 항-아폽토시스 BCL-2 단백질을 고정하였고, 모든 실험은 HBS-EP + 용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20; GE Healthcare) 내에서 수행되었다. 비오틴화된 항-아폽토시스 BCL-2 단백질은 반응 단위가 100에 도달할 때까지 CAP 칩에 고정되었다. 연속적으로 희석된 분석물을 30 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 분석물은 단일 농도 실험을 위해 20 nM에서 사용하였다. 8 K evaluation software (GE Healthcare)를 사용하여 해리 상수(KD) 및 운동 매개변수(ka 및 kd)를 추정하였다.
5. 세포 배양(Cell culture)
HEK293T, A375, MEWO, SW620, HCT-116 및 K562 세포주는 항생제-항진균 용액 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 유지하였다. 모든 세포주를 37℃에서 5% CO2를 포함하는 가습 배양기에서 배양하였다.
6. 렌티바이러스 생성 및 감염
pCW57.1 렌티바이러스 벡터를 3xFLAG-태깅된 단백질을 클로닝하고 렌티바이러스를 생성하기 위해 사용하였다. T25 플라스크에서 성장한 HEK293T 세포를 Lipo-fectamine 3000 (GE Healthcare)를 이용하여 각 제조사의 지침에 따라 2.7 μg의 pCW57.1, 1.4 μg의 pRSV- REV, 1.9 μg의 pMD2.G 및 2.9 μg의 pMDL g/p RRE 벡터(각각 Addgene #41393, #12253, #12259, and #12251)로 형질감염시켰다. 바이러스 상층액을 수확하고 형질감염 72시간 후에 0.45 μm 폴리에테르설폰 필터를 사용하여 여과하였다. 바이러스가 포함된 상층액은 즉시 사용하거나 -80℃에서 분액(aliquot)으로 보관하였다. A375, MEWO, SW620, HCT-116 및 K562 세포를 8 ㎍/ml 폴리브렌과 함께 각 바이러스 상층액으로 감염시켰다. 그 후 37℃에서 48 시간 인큐베이션하고 2 ㎍/ml 퓨로마이신(puromycin) 처리에 의해 감염된 풀을 선택하였다. 퓨로마이신-내성 풀을 2 ㎍/ml 독시사이클린(doxycycline)의 유무에 따른 세포 생존능 분석 및 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
7. 세포 생존능 분석(Cell viability assay)
세포 생존능을 WST-1(Roche) 시약을 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다. 성공적으로 형질도입된 세포주를 100㎕ 배양 배지에서 웰당 5000개 세포로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 2 ㎍/ml 독시사이클린을 배양 배지에 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. BIM의 발현에는 1/100배 낮은 농도의 독시사이클린을 사용하였다. 12 시간 인큐베이션 후 WST-1 시약을 첨가하였으며, Spark 10 M microplate reader (Tecan)을 사용하여 450 nm 및 690 nm에서 흡광도를 측정하였다.
8. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
독시사이클린 처리 12 시간 후에 세포를 수확하였고 protease inhibitor cocktail(Quartett)과 phosphatase inhibitor cocktail (Sigma)이 보충된 RIPA 완충액(Thermo Fisher Scientific)에서 용해하였다. BIM 검출을 위하여, 범-카스페이스 억제제(pan-caspase inhibitor) Z- VAD-FMK (MedChemExpress)를 독시사이클린 첨가 30 분 전에 첨가하였다. 그 후 세포 용해물을 얼음 위에서 1 시간 동안 인큐베이션하고 4℃에서 30 분 동안 15,000 g에서 원심분리하였다. 전체 세포 용해물의 총 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였다. 동일한 양의 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 이를 1차 항체와 함께 4℃에서 오버나이트 인큐베이션하였고, TBS-T로 3 회 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific)로 화학발광(Chemiluminescence)을 생성하고 ChemiDoc MP (Bio-Rad)를 사용하여 검출하였다. Image Lab (Bio-Rad)을 사용하여 모든 이미지를 분석하였다. 웨스턴 블롯에 사용된 항체는 다음과 같다: anti-FLAG (Sigma, F1804), anti-BCL-xL (Abcam, ab32370), anti-MCL-1 (Abcam, ab32087), anti-γ-H2A.X (Abcam, ab81299), anti- PARP (Abcam, 191217), anti-β-actin (Abcam, ab6276), HRP-conjugated anti-rabbit IgG (Abcam, ab205718), and HRP- conjugated anti-mouse IgG (Abcam, ab6728).
<실시예 1> 컴퓨터를 이용한 BCL-xL/MCL-1 결합 단백질의 디자인(Computational design of a BCL-xL/MCL-1 binding protein)
3-나선 번들 구조를 가진 단백질인 αMCL1(서열번호 1)로 시작하여 MCL-1 및 BCL-xL에 동시에 결합하는 단백질을 디자인하였다. αMCL1는 de novo 디자인된 단백질로, MCL-1에 특이적으로, 강하게 결합하며, 해리 상수(KD)는 150 pM이다. 이 단백질은 MCL-1과의 상호작용을 담당하는 두 번째 나선에 BH3 유사 모티프를 가지고 있다. 이는 αMCL1-MCL-1 공결정 구조(PDB entry: 5JSB)에서 분명히 확인된다. 이러한 분자간 상호작용의 주요 부위 외에도 다른 두 나선도 MCL-1 결합에 기여하여 특이성을 향상시킨다. α-나선 구축(a-helix building), 루프 모델링(loop modeling), 인터페이스 서열 디자인 및 Rosetta software suite를 이용하여 총 200 개의 4-나선 번들을 생성하였다(도 1a). Rosetta 총 원자 에너지값(all atom energy values) 및 시각적 검사를 기반으로 추가 실험을 위한 1 개의 모델을 선택하고, 4H_αMCL1(서열번호 2)로 지정하였다.
4H_αMCL1를 BIM BH3 펩타이드에 결합된 BCL-xL의 결정 구조를 접목(engraft)하기 위한 템플릿(template)으로 사용하였다. 네 번째 나선에 대하여, BIM의 고도로 보존된 7 개의 BH3 잔기(즉, Ile148, Ala149, Leu152, Ile155, Gly156, Asp157 및 Phe159)를 유지하기 위하여 '핫스팟' 옵션이 있는 Rosetta의 motif grafting protocol을 사용하였다. 그 후, 출력된 모델을 대상으로 BCL-xL에서 8.3 Å - 10 Å 이내의 임의의 잔기(핫스판 잔기 제외)가 변경될 수 있고 BCL-xL에서 8.3 Å - 10 Å 이내의 잔기는 리패킹(repacking)에 제한되는 추가적 서열 디자인을 수행하였다. 500 개의 모델을 다음의 필터링 기준에 따라 평가하였다: Rosetta 총 원자 에너지 < -660, 인터페이스 모양 상보성(interface shape complementarity) > 0.62, buried unsatisfied polar atoms ≤ 3(도 1b). 모티프의 접목이 일반적으로 높은 성공률로 이루어짐을 고려하여, 시각적 검사를 통하여 8 개의 디자인을 선정하였다. 그 후 실험적 검증을 위하여 모두를 클로닝하고 E. coli에서 생산하였다.
<실시예 2> BCL-xL/MCL-1 결합 단백질의 생화학적 및 구조적 검증(Biochemical and structural validation of the BCL-xL/MCL-1 binders) - 4H_αBM_1의 디자인
추가 실험을 위해 선택한 8 개 디자인 중 5 개는 용해도가 높았고 균질하게 정제할 수 있었다. 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 사용하여 BCL-xL에 대한 결합을 평가하고, 가장 결합이 강한 디자인(D81)을 선택하고 "4H_αBM_1(서열번호 3)"로 지정하였다(도 2a). 선택된 디자인의 다양한 농도로 SPR을 수행하여 해리 상수(KD)를 8.57 nM으로 측정하였다(도 2a). 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 이 단백질이 MCL-1에만 결합할 수 있을 뿐만 아니라 BCL-xL과 MCL-1에 동시에 결합할 수 있음을 확인하였다. 이로써 4H_αBM_1는 MCL-1 결합 부위가 손상되지 않았으며 BCL-xL과 MCL-1이 입체 장애(steric hinderance) 없이 동시에 결합할 수 있음을 알 수 있었다(도 2b).
그 후, 4H_αBM_1-BCL-xL의 결정 구조를 결정하였다(표 1). αMCL1은 BCL-xL에 대한 친화도가 낮기 때문에(KD = 340 μM) 4H_αBM_1과 BCL-xL이 1:1 복합체를 형성할 것으로 예상하였으나, 결정 구조에서 BCL-xL은 MCL-1 결합 부위와 설계된 BCL-xL 결합 부위 모두에 결합하였다. 이는 결정화 동안 고농도의 단백질이 사용되었기 때문이거나 결정 패킹 상호작용(crystal packing interactions)이 BCL-xL과 MCL-1 결합 부위의 결합을 촉진하기 때문일 수 있다. 결정된 구조는 디자인된 모델과 1.062 Å의 Cα RMSD(root mean square deviation, 평균 제곱근 편차)로 밀접하게 중첩되어 4H_αBM_1 설계가 대체로 정확했음을 확인할 수 있었다(도 2c). 한편, 디자인된 모델에서는 BCL-xL 나선 α2와 α3에 형태적 변화(conformational change)가 있었는데, 원래 형태와 비교하여 나선 α2의 1턴 확장(one-turn extension)과 나선 α3의 느슨한 나선 경향(loosened helical propensity)이 관찰되었다(도 2d). 변경된 BCL-xL 부분이 주요 결정 패킹 상호작용에 관여하지 않는 점에 비추어 볼 때, 이 형태적 변화는 4H_αBM_1과 보다 유리한 상호작용을 형성하기 위한 것으로 보인다. 유사한 구조가 BH3 펩타이드에 결합된 BCL-xL의 다른 결정 구조에서도 발견되며, 이는 BCL-xL의 이 부분이 상황에 따라 두 가지 대체 형태 중 하나를 채택한다는 것을 암시한다.
<실시예 3> 4H_αBM_1-BCL-xL의 결정 구조를 기반으로 한 추가적 디자인(Further computational design based on the crystal structure of 4H_αBM_1-BCL-xL) - 4H_αBM_2의 디자인
변경된 형태가 4H_αBM_1에 결합하는 데 더 에너지적으로 유리하다면, 서열 디자인 단계에서의 BCL-xL 나선 α2 및 α3 근처 아미노산 샘플링은 유효하지 않게 된다. 결정 구조를 템플릿으로 이용하여, 두 나선의 8 Å 내에 속하는 6 개의 선택된 잔기 Asp12, Ala15, Asn16, Arg19, Ala142 및 Thr146의 서열 디자인을 통해 α2 및 α3과의 국소(local) 상호작용을 최적화하고자 하였다(도 3a). 상술한 기준을 사용하여 생성된 모델 50 개 중 3 개를 선택하였고 BCL-xL에 대한 결합 친화도를 추정하였다. 4H_αBM_1과 비교하여 세 가지 디자인 모두 단일 분석 물질 농도에서 SPR 분석에서 향상된 결합 친화도를 나타냈다(도 3b). 가장 큰 결합 친화도를 나타낸 모델은 12번째 아미노산 잔기 Asp가 Ile로, 16번째 아미노산 잔기 Asn이 Arg로, 19번째 아미노산 잔기 Arg이 Thr로, 142번째 아미노산 잔기 Ala이 Glu로, 146번째 아미노산 잔기 Thr이 Arg로 치환된 모델이었으며, 이를 "4H_αBM_2" (서열번호 4)로 지정하였다. 4H_αBM_2의 BCL-xL에 대한 KD가 0.21 nM이었으며, 이는 4H_αBM_1(KD = 8.57 nM)보다 40 배 더 강한 결합을 나타낸다.
이후, 4H_αBM_2-BCL-xL의 결정 구조를 결정하였다(표 1). 4H_αBM_2BCL-xL의 경우에도, 결정 구조는 4H_αBM_2와 BCL-xL 사이의 1:2 복합체를 나타내며 BCL-xL 나선 α2 및 α3을 포함한 모든 영역(region)에서 디자인된 모델과 0.409 Å의 Cα RMSD로 밀접하게 일치하였다(도 3c). 결정 구조를 통하여 D12I, N16R 및 T146R 치환이 분자간 상호작용을 개선함을 알 수 있었다. Ile12는 BCL-xL의 Ala104 및 Phe105와 소수성 상호작용을 형성하는 반면, Arg16은 BCL-xL 나선 α2의 끝에서 Ala104의 백본(backbone) 산소와 정전기적 상호작용을 형성한다. 특히, 4H_αBM_2의 Arg146의 경우, 아미노기는 BCL-xL의 Gln111과 수소결합을 하고, 그것의 b, c, d 탄소 원자는 BCL-xL의 Phe105와 밀접하게 접촉함을 통하여 정전기적 상호작용뿐만 아니라 지방족 부분과의 소수성 상호작용에 기여한다(도 3c).
결정 구조에서 BCL-xL의 용매 접근 가능한 표면의 1511 Å2는 4H_αBM_2에 묻힌다. 이 영역은 우리의 디자인에 사용된 템플릿 구조에서 BH3 펩타이드에 의해 묻힌 BCL-xL 표면의 1160 Å2보다 훨씬 더 넓은 영역이다(PDB entry: 3FDL). 이 더 넓은 영역은 4H_αBM_2의 네 번째 나선의 BH3 유사 모티프와 BCL-xL 사이의 주요 상호 작용뿐만 아니라 첫번째 및 세번째 나선이 제공하는 추가 상호 작용으로 인한 것으로 보인다(도 3d). 이러한 추가 상호작용은 BCL-xL에 대한 4H_αBM_2의 결합 친화도(KD 0.21 nM)가 BCL-xL에 대한 36-mer BIM BH3 펩타이드의 결합 친화도(KD 6.67 nM)보다 훨씬 높은 이유를 설명할 수 있을 것이다.
4H_αBM_2-MCL-1의 결정 구조 역시 결정하였다(도 3e, 표 1). 4H_αBM_2-BCL-xL 복합체와 달리 두 단백질 사이에 1:1 이종이량체를 나타냈으며, 이것은 새로 디자인된 BCL-xL 결합 부위가 MCL-1에 대한 친화도가 더 낮다는 것을 나타낸다. 4H_αBM_2-MCL-1 및 αMCL1-MCL-1(PDB entry: 5JSB)의 구조적 정렬(structural alignment)을 수행한 결과, Cα RMSD이 0.984 Å로, 디자인된 모델이 αMCL1의 3-나선 번들 구조에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 3e).
<실시예 4> 디자인된 결합 부위의 항-아폽토시스 BCL-2 단백질에 대한 친화도(The affinity of the designed binding site for anti-apoptotic BCL-2 proteins) 측정 및 4H_αBM_3의 디자인
원래 αMCL1의 MCL-1 결합 부위는 0.15 nM의 KD로 MCL-1에 대해 매우 특이적이며, 다른 항-아폽토시스 BCL-2 단백질에 대한 친화도는 훨씬 낮다(KD >10 μM). 새로 디자인된 4H_αBM_2의 BCL-xL 결합 부위의 특이성을 평가하기 위해 우리는 먼저 두 번째 α-나선의 MCL-1 결합 부위에 I54E 및 G58E 돌연변이를 도입하였다(도 3f). 이러한 보존된 잔기의 돌연변이는 일반적으로 항-아폽토시스 BCL-2 단백질에 대한 결합을 방지한다. 따라서 생성된 돌연변이 단백질인 4H_αBM_2(I54E/G58E)는 네 번째 α-나선의 새로 디자인된 BCL-xL 결합 부위를 통해서만 항-아폽토시스 BCL-2 단백질과 상호작용할 수 있어야 한다. MCL-1 결합 부위와 달리, 새로 디자인된 BCL-xL 결합 부위는 MCL-1과 상당히 높은 친화도(19.2 nM의 KD)로 결합하였다(도 3f). 결합 특이성을 향상시키기 위하여, 4H_αBM_2-BCL-xL 복합체에서 MCL-1의 구조적 중첩(structural superposition)을 조사하였다. 그 결과, Ile143 핫스팟 잔기를 류신으로 변경하는 경우 BCL-xL 결합에 영향을 미치지 않고 MCL-1에 입체 장애를 도입할 수 있음을 확인하였다. 이 I143L 돌연변이를 포함하는 4H_αBM_2(I143L/I54E/G58E)를 생성하고 6 개의 서로 다른 항-아폽토시스 BCL-2 단백질(즉, BCL-2, BCL-B, BCL-W, BCL-xL, BFL-1 (A1) 및 MCL-1)과의 상호 작용을 측정하였다(도 4c). 그 결과, 예상대로 4H_αBM_2(I143L/I54E/G58E)는 BCL-xL에 대하여 피코몰 범위의 친화도를 유지하면서 MCL-1에 대해 7 배 감소된 친화도(133 nM의 KD)를 나타냈다(도 4c). 이 변이체는 BCL-2(2.04 nM의 KD) 및 BCL-W(1.59 nM의 KD)에 대해 상당히 높은 친화도를 보였고, 이는 BCL-xL과 두 단백질의 높은 서열 상동성을 반영한다. 반면, 변이체는 BCL-B(146 nM의 KD)와 BFL-1(16.4 nM의 KD)에 대해서는 훨씬 낮은 친화도를 보였다. 이 특이성이 강화된 디자인 4H_αBM_2(I143L)를 "4H_αBM_3"(서열번호 5)으로 지정하였다. MCL-1이 BCL-xL 결합 부위에 결합하는 것을 방지하기 위하여 4H_αBM_3에 L147E 및 G151E 돌연변이를 도입하고 원래 MCL-1 결합 부위가 동일한 효능을 유지하는지 여부를 관찰하였다(도 4d). 이 돌연변이체 4H_αBM_3(L147E/G151E)은 MCL-1(196 pM의 KD)에 강하게 결합하였으며, 이는 αMCL1(150 pM의 KD)의 친화도와 유사하였다(도 4d).
<실시예 5> 4H_αBM_3의 아폽토시스 유도 활성(Proapoptotic activity of 4H_aBM_3) 평가
4H_αBM_3의 아폽토시스 유발(apoptogenic) 활성을 평가하기 위한 세포 생존능 실험을 수행하였다. 렌티바이러스를 사용하여 K562, HCT-116, SW620, MEWO 및 A375 암 세포주에서 4H_αBM_3을 발현하였다. 또한, 4H_αBM_3 외에도 4H_αBM_3의 C-말단에 BIM BH3 서열(서열번호 9) 또는 BIM의 C-말단 서열(C-terminal sequence, CTS)(서열번호 10)이 각각 융합된 4H_αBM_3_BH3 및 4H_αBM_3_CTS 컨스트럭트를 제작하였다. BIM BH3는 BAX/BAK를 직접 활성화하며, BIM의 CTS는 미토콘드리아 표적 서열로 BIM이 항-아폽토시스 BCL-2 단백질의 작용 부위인 미토콘드리아 외막으로 이동하는 것을 촉진한다. 따라서, 두 컨스트럭트가 4H_αBM_3의 아폽토시스 유발 효능을 향상시킬 수 있을 것으로 예상하였다.
실험 결과, 빈 벡터(empty vector) 음성 대조군은 어떤 세포주에서도 세포 사멸을 유도하지 않았으며, 각각 MCL-1 또는 BCL-xL만을 표적으로 하는 αMCL1 또는 4H_αBM_3(I54E/G58E)을 발현시킨 경우에도 아폽토시스가 유도되지 않았다. 대조적으로, 4H_αBM_3(MCL-1 및 BCL-xL 모두를 표적화)의 발현은 세포 생존율의 명백한 감소를 유도하였다(K562: 61 %, HCT-116: 79 %, SW620: 35 %, MEWO: 53 % 및 A375: 22 %). 특히, 4H_αBM_3_BH3 및 4H_αBM_3_CTS는 세포 생존율을 더욱 감소시켜(4H_αBM_3_BH3은 K562: 38 %, HCT-116: 56 %, SW620: 23 %, MEWO: 32 % 및 A375: 11 %, 4H_αBM_3_CTS은 K562: 33 %, HCT-116: 50 %, SW620: 27 %, MEWO: 33 % 및 A375: 11 %), 융합된 서열이 4H_αBM_3의 아폽토시스 유발 활성을 향상시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 5a).
다음으로, 우리는 4H_αBM_3, 4H_αBM_3_BH3 및 4H_αBM_3_CTS의 세포독성 활성이 전장 인간 BIM보다 더 강한지 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. BIM은 강한 세포독성을 나타냈지만 초기 발현 수준이 너무 높으므로 유사한 수준의 단백질 발현을 유도하기 위해 1/100배 저농도의 독시사이클린을 사용하였다(도 5a 및 도 5b). 발현 수준을 조절한 실험 결과, 4H_αBM_3, 4H_αBM_3-BH3 및 4H_αBM_3-CTS가 모두 전장 인간 BIM보다 더 강한 세포독성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다(도 5a 및 도 5b). 이 더 높은 세포 독성은 4H_αBM_3의 MCL-1 및 BCL-xL에 대한 결합 친화도가 인간 BIM BH3의 결합 친화도의 8 배 이상으로 강함을 반영하는 것으로 보인다. 우리가 관찰한 세포 사멸은 카스페이스 기질 PARP의 절단과 세포 사멸 마커 γ-H2A.X의 발현으로 확인하였으므로, 아폽토시스에 의한 것일 가능성이 가장 크다(도 5c).
상기 실험을 통하여, 4H_αBM_3, 4H_αBM_3_BH3 및 4H_αBM_3_CTS은 전장 인간 BIM보다 MCL-1 및 BCL-xL에 강하게 결합하여 아폽토시스를 유발함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (12)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 항-아폽토시스(anti-apoptotic) BCL-2 계열 단백질(BCL-2 family protein)에 결합하는 것인, 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 MCL-1(myeloid cell leukemia 1); 및 BCL-2(B-cell lymphoma 2), BCL-B, BCL-W, BCL-xL(B-cell lymphoma-extra large) 및 BFL-1(A1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질(BCL-2 family protein)에 동시에 결합하는 것인, 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항-아폽토시스 BCL-2 계열 단백질은 BCL-xL인, 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 아폽토시스 유발 활성(apoptogenic activity)을 증가시키는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 융합된 것인, 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 아폽토시스 유발 활성을 증가시키는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 C-말단에 융합된 것이고, 상기 아폽토시스 활성을 증가시키는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  8. 제7항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 제8항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질은 아폽토시스를 촉진하여 암세포의 사멸을 유도하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 암은 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma), 급성 골수성 백혈병 (acute-myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (acute-lymphoid leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 경부암(head and neck cancer), 폐암, 비소세포폐암, 교모세포종(glioblastoma), 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 결장암, 구강암, 인두암, 후두암, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 악성 흑색종 (melanoma), 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암 및 중피종 (mesothelioma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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