WO2023190864A1 - 食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステム - Google Patents

食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステム Download PDF

Info

Publication number
WO2023190864A1
WO2023190864A1 PCT/JP2023/013171 JP2023013171W WO2023190864A1 WO 2023190864 A1 WO2023190864 A1 WO 2023190864A1 JP 2023013171 W JP2023013171 W JP 2023013171W WO 2023190864 A1 WO2023190864 A1 WO 2023190864A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganisms
food
growth rate
estimating
membrane filter
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/013171
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
謙太郎 津田
央登 田宮
Original Assignee
日本新薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日本新薬株式会社 filed Critical 日本新薬株式会社
Publication of WO2023190864A1 publication Critical patent/WO2023190864A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for estimating the growth rate of microorganisms in foods, a method for evaluating the shelf life of foods, and a system for estimating the speed of microbial growth in foods, which enables rapid evaluation of the shelf life (best-before date, etc.) of foods. be.
  • a method for evaluating the shelf life (best-before date, etc.) of solid foods such as ham is to take the food as a sample, inoculate it with microorganisms, store it for a predetermined period of time, and then grind and dilute the sample and place it in a petri dish.
  • a common method is to collect microorganisms, pour them onto an agar medium, culture them on a plate for about 2 days, and count the colonies formed by the microorganisms to measure the growth rate of the microorganisms and evaluate their shelf life (colony counting method). .
  • FIG. 11 is a micrograph of the ham surface inoculated with microorganisms (yeast), where (a) shows the ham surface 0 hours after inoculation, and (b) shows the ham surface 18 hours after inoculation.
  • yeast microorganisms
  • the diluted sample after inoculating and storing microorganisms as described above is filtered through a membrane filter to capture and fix the microorganisms, and then colored with fluorescent dye, etc.
  • various methods have been proposed for counting the number of microorganisms using an image analysis device, a laser scanning device, etc. (see Patent Documents 1 and 2, etc.).
  • Patent Documents 1 and 2 it is necessary to dye microorganisms with a fluorescent dye or the like, which increases drug costs. Furthermore, even when applying the methods disclosed in Patent Documents 1 and 2 to evaluate the shelf life of food, the process of grinding and diluting the food is necessary, so there is room for consideration in this regard. . In other words, since a method for non-destructively and quickly evaluating the shelf life of solid foods has not been sufficiently established, there is room to consider such a method.
  • the present invention was developed in view of these circumstances, and it is possible to non-destructively and quickly evaluate the shelf life (best-before date, etc.) of food while reducing the cost and labor associated with such evaluation. , a method for estimating the rate of microbial growth in foods, a method for evaluating the shelf life of foods, and a system for estimating the rate of microbial growth in foods.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems.
  • the present inventors discovered that if it is possible to directly observe microorganisms present on the surface of foods without the aforementioned treatments such as filtration, fixation, or staining, it would be possible to We considered that it would be possible to estimate the growth rate of microorganisms that grow on the surface of foods, and to non-destructively evaluate the shelf life of foods.
  • the present inventors placed a hydrophilic membrane filter on the surface of food and inoculated microorganisms onto the hydrophilic membrane filter. This makes it easier to observe the growth rate of microorganisms, and the growth rate of microorganisms inoculated onto the hydrophilic membrane filter placed on the surface of the food is significantly different compared to when the microorganisms are directly inoculated onto the surface of the food. I discovered that there was no such thing.
  • the gist of the present invention is the following [1] to [9].
  • [1] A step of placing a hydrophilic membrane filter on the surface of a food sample and inoculating microorganisms onto the hydrophilic membrane filter; a step of photographing microorganisms growing on the hydrophilic membrane filter over time using a microscope; Quantifying the area of microorganisms from the images taken over time; estimating the growth rate of microorganisms based on the quantified data; A method for estimating the rate of microbial growth in foods with [2] The method for estimating the growth rate of microorganisms in food according to [1], wherein the step of quantifying the area of the microorganisms is performed by image analysis using a computer.
  • [4] A step of placing a hydrophilic membrane filter on the surface of a food sample and inoculating microorganisms onto the hydrophilic membrane filter; a step of photographing microorganisms growing on the hydrophilic membrane filter over time using a microscope; Quantifying the area of microorganisms from the images taken over time; estimating the growth rate of microorganisms based on the quantified data; using the estimated growth rate to predict the time required to reach a predetermined number of microorganisms that cannot be tolerated in the food; A method for evaluating the shelf life of foods.
  • a system comprising an estimation device capable of estimating the growth rate of microorganisms from the amount of change, A system for estimating the growth rate of microorganisms in food, wherein the test object is a food sample in which a hydrophilic membrane filter is placed on the surface, and microorganisms are inoculated onto the hydrophilic membrane filter.
  • the digitization device is an image analysis device using a computer.
  • the estimation device is a calculation device using a computer.
  • the method for estimating the microbial growth rate of the present invention can nondestructively and quickly evaluate the shelf life (best-before date, etc.) of foods while reducing costs and labor. Further, the microbial growth rate estimation system of the present invention can non-destructively and quickly estimate the growth rate of microorganisms in foods while reducing cost and labor.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing an example of a system for measuring and evaluating the dynamics of microorganisms inoculated into food samples.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing the inoculation state of microorganisms in the food sample.
  • These are micrographs showing the dynamics when a hydrophilic membrane filter is placed on an agar medium and yeast cells are inoculated, with (a) showing 0 hours of inoculation and (b) showing 9 hours of inoculation.
  • image-processed micrographs showing the dynamics when yeast cells were inoculated with a hydrophilic membrane filter placed on the agar medium, (a) at 0 hours of inoculation, (b) at 9 hours of inoculation. Show eyes.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing an example of a system for measuring and evaluating the dynamics of microorganisms inoculated into food samples.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing the inoculation state of microorganism
  • FIG. 2 is a graph showing the rate of change in yeast cell area over time in Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a graph diagram showing a prediction formula showing the rate of change over time in the number of yeast in Example 1 and a plot of the actually measured number of yeast in the conventional method. It is a micrograph of Example 2, (a) shows 0 hours of inoculation, (b) shows 12 hours of inoculation. These are image-processed micrographs of Example 2, where (a) shows 0 hours after inoculation, and (b) shows 12 hours after inoculation.
  • FIG. 2 is a graph showing the rate of change in yeast cell area over time in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph diagram showing a prediction formula showing the rate of change in the number of yeast over time in Example 2 and a plot of the actually measured number of yeast in the conventional method.
  • a method for estimating the growth rate of microorganisms in food involves placing a hydrophilic membrane filter on the surface of a food sample, and placing a hydrophilic membrane filter on the surface of the food sample.
  • a step of inoculating microorganisms (step A), a step of photographing the microorganisms growing on the hydrophilic membrane filter over time using a microscope (step B), and a step of photographing the microorganisms growing on the hydrophilic membrane filter over time (step B).
  • the method includes a step of quantifying the area of the area (step C), and a step of estimating the growth rate of microorganisms based on the numerical data (step D).
  • this evaluation method which is an embodiment of the present invention
  • a hydrophilic membrane filter is placed on the surface of a food sample, and microorganisms are placed on the hydrophilic membrane filter.
  • a step of inoculating (step A) a step of photographing the microorganisms growing on the hydrophilic membrane filter over time using a microscope (step B), and determining the area of the microorganisms from the images taken over time.
  • step C a step of quantifying (step C), a step of estimating the growth rate of microorganisms based on the digitized data (step D), and using the estimated growth rate, and a step (step E) of predicting the time required to reach a predetermined number of microorganisms.
  • the above-mentioned “food sample” is not particularly limited as long as it can be mounted on a hydrophilic membrane filter (other than a sample exhibiting a liquid state); for example, a food sample collected from the food itself.
  • a hydrophilic membrane filter other than a sample exhibiting a liquid state
  • solid culture media such as agar media that reflect the ingredients of the food, and liquid foods (drinks, etc.) solidified with agar, etc. This is intended to include solid media (sample).
  • the above-mentioned “photographing over time” indicates that photographing is performed every predetermined period of time, but the predetermined period of time does not need to be constant.
  • imaging over time includes not only intermittent imaging but also continuous imaging.
  • step A a hydrophilic membrane filter is placed on the surface of the food sample, and microorganisms are inoculated onto the hydrophilic membrane filter.
  • the food sample is a sample taken directly from the food, there is no need to grind or dilute the food, which has the advantage of reducing cost and labor.
  • the size of the food sample is not particularly limited as long as it does not interfere with microscopic observation.
  • the water activity (Aw) of the food sample is usually determined from the viewpoint that nutrients, etc. (source of growth of microorganisms) contained in the food sample can be sufficiently transferred together with water onto the hydrophilic membrane filter. It is 0.60 to 1.00, preferably 0.80 to 1.00, more preferably 0.90 to 1.00.
  • hydrophilic membrane filter used in step A for example, a membrane filter made of resin such as polytetrafluoroethylene, polyvinylidene fluoride, polyethersulfone, etc., which has been appropriately treated to make it hydrophilic, can be used.
  • a commercial product may be used as the hydrophilic membrane filter, and as a commercial product, for example, Omnipore membrane filter JHWP01300 manufactured by Merck is preferably used.
  • the pore size of the hydrophilic membrane filter is preferably such that it does not allow inoculated microorganisms to pass through, but allows nutrients, etc. (microorganism growth source) contained in the food sample to pass through. Depending on the type of target microorganism, the pore size is 0.
  • the thickness is preferably 1 to 10.0 ⁇ m, more preferably 0.2 to 0.7 ⁇ m.
  • the size of the hydrophilic membrane filter is not particularly limited as long as it does not interfere with microscopic observation. On the other hand, the thickness thereof is usually 10 to 150 ⁇ m, preferably 50 to 100 ⁇ m. When the thickness of the hydrophilic membrane filter is within the above range, nutrients and the like (source of growth of microorganisms) contained in the food sample can be more efficiently transferred through water onto the hydrophilic membrane filter.
  • the microorganisms inoculated onto the hydrophilic membrane filter include microorganisms that affect the deterioration of the quality of the target food, and microorganisms that are commonly used in microorganism-based foods such as fermented foods.
  • microorganisms include food spoilage bacteria such as yeast, lactic acid bacteria, spore bacteria, and Escherichia coli, and useful microorganisms such as yeast used in bread fermentation, lactic acid bacteria used as yogurt starters, and Bacillus natto. can be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the fermentation rate of the target food can be calculated.
  • the microorganism inoculation is diluted with water or an aqueous solution, for example, to a cell count of 50 to 2000 cells/ ⁇ L (preferably 100 to 1000 cells/ ⁇ L, more preferably 200 to 500 cells/ ⁇ L).
  • the aqueous solution include physiological saline, phosphate buffered saline, and peptone-added physiological saline.
  • step B microorganisms growing on the hydrophilic membrane filter are photographed over time using a microscope.
  • FIG. 1 is a camera
  • 2 is a light source
  • 3 is an objective lens
  • 4 is a personal computer
  • 5 is a food sample
  • 6 is a hydrophilic membrane filter
  • 7 is a microorganism.
  • FIG. 2 schematically shows the state of microorganisms inoculated onto the hydrophilic membrane filter on the surface of the food sample.
  • 5 is the food sample
  • 6 is the hydrophilic membrane filter
  • 7 indicates microorganisms.
  • the camera 1, light source 2, and objective lens 3 represent a microscope configuration for taking microphotographs, and are not particularly limited, but an example thereof includes the following microscope configuration.
  • the photographing of the microorganisms is not particularly limited, but is usually carried out at an ambient temperature of 4 to 45°C, and can be arbitrarily set depending on the type of food and microorganisms and the purpose.
  • the method for taking the microscopic photographs is not particularly limited, but it is possible to photograph the state immediately after inoculation of the microorganisms, as well as to take photographs over time, and to use conventional colony counting methods when using the food sample and microorganisms. It is preferable that the photographing be completed within 1/2 or less (preferably 1/3 or less) of this time. In this way, the present estimation method and present evaluation method can estimate the growth rate of microorganisms with a shorter observation time than the conventional method. Furthermore, as mentioned above, the above-mentioned imaging over time may be either intermittent imaging or continuous imaging, but if intermittent imaging is performed, the estimation accuracy and work In terms of balance with the amount, it is preferable to take pictures every 3 hours, and more preferably every hour.
  • step C the area of microorganisms is quantified for each of the plurality of images taken over time.
  • a step is usually performed by image analysis using a computer such as a personal computer.
  • the areas occupied by the microorganisms are filled in using image processing software, and the filled areas (white areas in each figure) are
  • the area of the microorganism can be quantified from the image.
  • Such quantification can eliminate individual differences among microorganisms (differences in the growth state of each cell), so it is possible to eliminate individual differences in microorganisms (differences in the growth state of each cell), so it is possible to photograph the growing microorganisms over time at multiple different locations on the membrane filter, and to analyze each individual microorganism. It is preferable to quantify the area of microorganisms in each location and calculate the sum or average.
  • the plurality of locations may be two, but is preferably three or more locations for better accuracy.
  • the process of filling out the area occupied by microorganisms on the image using image processing software can be done manually by visually identifying the cells, but for efficiency, machine learning (support vector machine or deep learning) can be used. This may be done automatically using a program that has been created.
  • steps B and C may be performed in parallel by a microbial detection system configured to perform them automatically.
  • step D the growth rate of microorganisms is estimated based on the quantified data. In other words, by comparing the digitized data, it is possible to determine the change in cell image area over time t (time from the first photograph to the last photograph), starting from the same cell of the microorganism.
  • the coefficient k can be obtained by substituting a plurality of data obtained from the equation into the following equation (1) and making an approximation.
  • equation (1) is based on the growth curve of microorganisms (microorganisms grow logarithmically immediately after inoculation).
  • e is the base of the natural logarithm (Napier's number) (same as in equation (2) below).
  • FIG. 5 is a graph of the equation (1), and shows that the value of the coefficient k is found to be 0.4553 as a result of substituting and approximating the plurality of data.
  • FIG. 6 shows the obtained prediction formula in a semi-logarithmic graph, and also shows the measured values obtained by the conventional method (colony counting method) superimposed on the graph.
  • the derivation of the coefficient k and the prediction formula in step D is preferably performed by calculation using a computer such as a personal computer from the viewpoint of efficiency.
  • This estimation method which includes each of the above steps (Processes A to D), is different from the conventional method, as shown in Figure 6, as can be seen from the fact that the actual measurement value (value obtained by the conventional method) is included in the prediction formula. It has the same level of reliability.
  • this estimation method can reduce the observation time for microorganisms (the time from inoculation to the end of imaging) to less than half of the time required for the conventional colony counting method. Furthermore, by adjusting the ambient temperature, etc., it can be reduced to 1/3 or less.
  • step E the estimated growth rate is used to predict the time required to reach a predetermined number of microorganisms that cannot be tolerated in the food.
  • the number of microorganism cells (the number of food spoilage bacteria) that cannot be tolerated in food is often set at 100,000 cells/g.
  • the derived prediction formula is redisplayed in the linear graph of FIG. 6 with the vertical axis expressed as a logarithm, and the time required to reach 100,000 pieces/g is calculated (18 hours in the graph of FIG. 6). It is possible to predict the shelf life of food.
  • the number of microorganisms that cannot be tolerated in the food can be freely set depending on the purpose.
  • a computer program is used to automatically calculate the shelf life of the food based on the derived prediction formula. It may also be predicted.
  • This evaluation method which includes each of the above steps (Processes A to E), uses this estimation method, and as mentioned above, since there is an actual value (value measured by the conventional method) in the prediction formula, it is different from the conventional method. It has excellent reliability comparable to that of the method (see Figure 6).
  • this evaluation method utilizes this estimation method, it can be performed in less than half the time required to evaluate the shelf life of food using the conventional colony counting method. It has the advantage that it can be carried out in 1/3 or less time by devising conditions and the like.
  • the system for estimating the growth rate of microorganisms in foods may be any system that utilizes this estimation method, and is not particularly limited.
  • a photographing device having a microscope a digitizing device capable of quantifying the area of microorganisms on a subject from images of the subject photographed over time with the photographing device, and changes in the area over time.
  • an estimation device capable of estimating the growth rate of microorganisms from the amount the test subject is a food sample in which a hydrophilic membrane filter is placed on the surface, and microorganisms are inoculated onto the hydrophilic membrane filter. It is preferable that the microbial growth rate in food can be estimated efficiently in a short time.
  • the photographing device is not particularly limited as long as it is a device that can perform the step B, and for example, the system described in the present estimation method (a system equipped with a camera, a light source, an objective lens, and a personal computer) can be used. Can be used.
  • the digitization device is not particularly limited as long as it is a device that can perform the step C, but an image analysis device using a computer such as a personal computer is preferable because of its excellent versatility.
  • the estimating device is not particularly limited as long as it is a device capable of performing the step D, but it is preferably a computing device using a computer such as a personal computer due to its excellent versatility.
  • this estimation system can evaluate the shelf life of the food by estimating the growth rate of the food spoilage bacteria in the target food. Furthermore, by estimating the growth rate of the bacteria, it can be used to determine conditions for suppressing the growth of the bacteria.
  • the microorganism is a useful microorganism
  • estimating the growth rate of the useful microorganism in the target food can be used to determine the conditions for proper growth of the microorganism. For example, when the useful microorganism is yeast, the fermentation rate of the target food can be estimated.
  • this estimation method, this evaluation method, and this estimation system can nondestructively and quickly evaluate the shelf life of food while reducing the cost and labor associated with such evaluation. In other words, work that would take at least several days using conventional methods can be reduced to a few hours.
  • this estimation method, this evaluation method, and this estimation system it is possible to collect data regarding food shelf life (best-before date, etc.) more quickly and efficiently than before, so computers such as personal computers and Using learning algorithms (neural networks, etc.), based on the accumulated data, we determine optimal conditions (quantity conditions for food additives that are not too much or too little to improve shelf life, etc., types of food additives, acidity, salinity) , adjustment conditions such as moisture content, etc.) can be efficiently searched and calculated.
  • This estimation method, this evaluation method, and this estimation system can be effectively used for businesses that take advantage of these advantages (for example, providing information on optimal conditions, supplying materials and services associated with it, etc.) .
  • Example 1 First, an agar medium (potato dextrose agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was prepared as a food sample, and a hydrophilic membrane filter (Omnipore membrane filter JHWP01300, manufactured by Merck) was placed on its surface. Next, yeast (Pichia anomala) was diluted with phosphate buffered saline to give 500 cells/2 ⁇ L, and 2 ⁇ L was inoculated onto the membrane filter by dropping it (see FIG. 1). Then, yeast growing on the membrane filter at room temperature (25° C.) was photographed over time using a microscope configured as shown below (see FIGS. 1 and 2; magnification: 20 times).
  • agar medium potato dextrose agar medium, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • a hydrophilic membrane filter Omnipore membrane filter JHWP01300, manufactured by Merck
  • Camera GigE camera DMK33GX249e with heat sink, manufactured by The Imaging Source Light source: LED spot lighting SLSI-22W, manufactured by Sigma Koki Objective lens: Long working objective lens PAL-20, manufactured by Sigma Koki
  • FIG. 3 shows the yeast Y 0 immediately after inoculation (0th hour), and (b) shows the yeast Y 0 grown 9 hours after inoculation (9th hour) starting from the yeast Y 0 shown in (a). Yt of yeast is shown.
  • the degree of change in the area occupied by yeast was calculated using image processing software, and the number of cells Nt at time t was predicted.
  • imageJ open source
  • the yeast image area obtained was quantified as the number of pixels (total number of pixels).
  • An example of the image that has been filled out is shown in FIG.
  • the symbol Y 0 P in FIG. 4(a) indicates the filled-in image area of the yeast Y 0 in FIG. 3(a), and the symbol YtP in FIG. 4(b) indicates the area of the yeast Y 0 in FIG. 3(b).
  • the image area is shown filled in.
  • Table 1 The numerical results are shown in Table 1 below.
  • the following yeast image area shows the total of each digitized value for three different locations (three scenes).
  • FIG. 6 shows the prediction formula in a semi-logarithmic graph, and also shows the actually measured number of microorganisms (yeast number) in the conventional method (colony counting method). From FIG. 6, it can be seen that the plot of the actually measured number of microorganisms (the number of yeast) is approximately on the graph of the prediction formula. Therefore, it can be seen that the prediction formula is as reliable as the conventional method. As shown in Figure 6, from the above prediction formula, it is possible to estimate the time (approximately 18 hours in this graph) required for the number of microorganisms to reach an unacceptable level in food (100,000 microorganisms/g in this case). It is possible. In addition, as mentioned above, the prediction formula can be derived in a shorter time than the conventional colony counting method, so the shelf life of the food of the present invention can be evaluated in a shorter time than the conventional method. I can do it.
  • Example 2 Yeast growing on the membrane filter was photographed over time in the same manner as in Example 1, except that roast ham (morning fresh roast ham, manufactured by Ito Ham Co., Ltd.) was used as the food sample.
  • roast ham morning fresh roast ham, manufactured by Ito Ham Co., Ltd.
  • FIG. 7 shows an example of an image obtained by the photographing.
  • (a) shows yeast Z 0 immediately after inoculation (hour 0)
  • (b) shows yeast Z 0 grown from yeast Z 0 shown in (a) 12 hours after inoculation (12 hours).
  • Yeast Zt is shown.
  • the degree of change in the area occupied by yeast was calculated using image processing software, and the number of cells Nt at time t was predicted.
  • imageJ open source
  • the yeast image area obtained was quantified as the number of pixels (total number of pixels).
  • An example of the image that has been filled out is shown in FIG.
  • the symbol Z 0 P in FIG. 8(a) indicates the filled-in image area of yeast Z 0 in FIG. 7(a)
  • the symbol ZtP in FIG. 8(b) indicates the area of the yeast Z 0 in FIG. 7(b).
  • the image area is shown filled in.
  • Table 2 The numerical results are shown in Table 2 below.
  • the following yeast image area shows the total of each digitized value for three different locations (three scenes).
  • FIG. 9 is a graph of the approximated equation (1).
  • FIG. 10 shows the prediction formula in a semi-logarithmic graph, and also shows the actually measured number of microorganisms (yeast number) in the conventional method (colony counting method). From FIG. 10, it can be seen that the plot of the actually measured number of microorganisms (the number of yeast) is approximately on the graph of the prediction formula. Therefore, it can be seen that the prediction formula is as reliable as the conventional method. As shown in Figure 10, from the above prediction formula, it is possible to estimate the time (approximately 28 hours in this graph) required to reach the unacceptable number of microorganisms in food (100,000 microorganisms/g in this case). It is possible.
  • this estimation method By using this estimation method, this evaluation method, and this estimation system, it is possible to non-destructively and quickly evaluate the shelf life of food while reducing the cost and labor associated with such evaluation. In other words, work that would take at least several days using conventional methods can be reduced to a few hours. Furthermore, with this estimation method, this evaluation method, and this estimation system, it is possible to collect data regarding food shelf life (best-before date, etc.) more efficiently than before, using computers such as personal computers and the Internet. Based on the accumulated big data, the optimal conditions (for example, adjusting the quantity of food additives, the type of food additives, acidity, salinity, water content, etc. to improve shelf life, etc.) Conditions, etc.) can be searched efficiently. Therefore, this estimation method, this evaluation method, and this estimation system should be used effectively for businesses that take advantage of these advantages (for example, providing information on optimal conditions, supplying materials and services associated with it, etc.) I can do it.
  • these advantages for example, providing information on optimal conditions, supplying materials and services associated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

評価に伴うコストや労力を減少化させつつ、食品の日持ち（賞味期限等）等を非破壊的かつ迅速に評価することが可能な、食品における微生物増殖速度の見積り方法を提供するため、食品試料５の表面に親水性メンブレンフィルター６を載置し、前記親水性メンブレンフィルター６上に微生物７を接種する工程と、前記親水性メンブレンフィルター６上で増殖する微生物７を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程と、前記経時的に撮影された画像から、微生物７の面積を数値化する工程と、前記数値化されたデータに基づいて、微生物７の増殖速度を見積もる工程と、を備えた。

Description

食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステム
　本発明は、食品の日持ち（賞味期限等）等を迅速に評価することが可能な、食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステムに関するものである。
　例えば、ハムなどの固形状の食品の日持ち（賞味期限等）を評価する手法としては、その食品を試料とし、微生物を接種して所定時間保存し、その試料をすりつぶして希釈したものをシャーレに採り、寒天培地を流し入れ２日程度平板培養し、その微生物が形成したコロニーをカウントすることにより、微生物の増殖速度を測定し、日持ちを評価するといった手法（コロニーカウント法）が、一般的である。
　なお、図１１は、ハム表面に微生物(酵母)を接種したときの顕微鏡写真であり、(a）は接種０時間目のハム表面を示し、(b)は接種１８時間目のハム表面示す。図示のように、ハム表面を直接顕微鏡観察しても、どれが微生物（酵母）なのか判別が難しい。そのため、一般的に、前記のような手法が採用されている。
　しかしながら、前記の手法では、食品をすりつぶしたものを希釈して試料とし培養する必要があり、(1)食品をすりつぶす手間や、食品をすりつぶすために各測定時点で新たな固形試料が必要となる、(2)カウントするのに適したコロニー数となるよう（希釈液１ｇに対し細胞数が３０～３００個程度になるよう）希釈する必要があるため、そのように希釈倍率を制御するのが難しい、(3)カウントするのに適したコロニー形成やコロニー数となるまで培養するのに時間がかかり、カウントするのにも時間がかかる、等といった問題がある。特に、(2)の問題は、どれくらいの桁数の細胞が存在しているのか見当がつかないことから、段階的に希釈した多くの懸濁液を作製して評価することが必要となるため、コストや労力の増大につながり、(3)の問題は、時間や労力などに多大な影響を及ぼす。これらのことから、予てより、その代替法が望まれている。
　そのようななか、食品における微生物計測を迅速に行う手法として、前記のように微生物を接種して保存した後に希釈した試料を、メンブレンフィルターでろ過して微生物を捕捉および固定し、蛍光染料等で着色した後、画像分析装置、レーザー走査装置等により微生物数を計数する手法が各種提案されている（特許文献１，２等参照）。
特開２０００－２１００９９号公報 特開２００７－２０５２８号公報
　しかしながら、特許文献１，２に開示されている手法では、微生物を蛍光染料等で染色する必要があり、その分の薬剤コストがかかる。
　また、特許文献１，２に開示されている手法を適用して食品の日持ちを評価する場合であっても、食品をすりつぶして希釈する工程は必要なため、この点においては検討の余地がある。換言すると、従来、固形状の食品の日持ちを非破壊的かつ迅速に評価する手法が充分に確立されていなかったことから、そのような手法を検討する余地がある。
　本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、その評価に伴うコストや労力を減少化させつつ、食品の日持ち（賞味期限等）等を非破壊的かつ迅速に評価することが可能な、食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステムを提供するものである。
　本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた。その研究の過程で、本発明者らは、食品の表面に存在する微生物を、先述のような、ろ過して固定や染色等を行うといった処理をせずに直接観察することができれば、その食品の表面で増殖する微生物の増殖速度を見積もることができ、食品の日持ち等を非破壊的に評価することが可能となるのではないかと検討した。
　しかしながら、食品の表面に存在する微生物を、固定や染色等を行わずに直接観察することは、食品の光透過性や表面構造の問題から難しい。
　そこで、本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、食品の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種したところ、親水性メンブレンフィルターが担体（土台）となり、微生物の増殖度合いが観察しやすくなるとともに、前記食品の表面に載置された親水性メンブレンフィルターに接種された微生物の増殖速度が、食品の表面に直接接種された場合と比べて差異がないことを突き止めた。
　そして、前記親水性メンブレンフィルターに接種された微生物の顕微鏡画像を経時的に撮影し、顕微鏡画像ごとに微生物が占める面積を数値化し、経時による前記数値の変化の程度（係数）を算出し、これを所定の予測式に代入することによって、食品の表面で増殖する微生物の増殖速度を見積もることができることを見出した。
　すなわち、これにより、食品をすりつぶす等の工程を必要とせず、しかも、従来のコロニーカウント法のように、カウントするのに適したコロニー形成やコロニー数となるまで培養しなくとも、迅速に、その食品に許容され得ない所定の微生物数に達するのに要する時間を予測することができるようになる、つまりは非破壊かつ迅速にその食品の日持ち（賞味期限等）等を評価することができるようになる。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［９］を、その要旨とする。
［１］　食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種する工程と、
前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程と、
前記経時的に撮影された画像から、微生物の面積を数値化する工程と、
前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もる工程と、
を備えた食品における微生物増殖速度の見積り方法。
［２］　前記微生物の面積を数値化する工程を、コンピューターを利用した画像解析により行う、［１］に記載の食品における微生物増殖速度の見積り方法。
［３］　前記微生物の増殖速度を見積もる工程を、コンピューターを利用した計算により行う、［１］または［２］に記載の食品における微生物増殖速度の見積り方法。
［４］　食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種する工程と、
前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程と、
前記経時的に撮影された画像から、微生物の面積を数値化する工程と、
前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もる工程と、
前記見積もられた増殖速度を用いて、食品に許容され得ない所定の微生物数に達するのに要する時間を予測する工程と、
を備えた食品の日持ち評価方法。
［５］　前記微生物の面積を数値化する工程を、コンピューターを利用した画像解析により行う、［４］に記載の食品の日持ち評価方法。
［６］　前記微生物の増殖速度を見積もる工程を、コンピューターを利用した計算により行う、［４］または［５］に記載の食品の日持ち評価方法。
［７］　顕微鏡を有する撮影装置と、前記撮影装置で経時的に撮影された被検体の画像から被検体上の微生物の面積を数値化することが可能な数値化装置と、前記面積の経時的変化量から微生物の増殖速度を見積もることが可能な見積装置とを備えたシステムであって、
前記被検体が、食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターが載置され、かつ前記親水性メンブレンフィルター上に微生物が接種されたものである、食品における微生物増殖速度の見積りシステム。
［８］　前記数値化装置が、コンピューターを利用した画像解析装置である、［７］に記載の食品における微生物増殖速度の見積りシステム。
［９］　前記見積装置が、コンピューターを利用した計算装置である、［７］または［８］に記載の食品における微生物増殖速度の見積りシステム。
　本発明の微生物増殖速度の見積り方法は、コストや労力を減少化させつつ、食品の日持ち（賞味期限等）等を非破壊的かつ迅速に評価することができる。また、本発明の微生物増殖速度の見積りシステムは、コストや労力を減少化させつつ、食品における微生物の増殖速度を非破壊的かつ迅速に見積もることができる。
食品試料に接種された微生物の動態を測定・評価するためのシステムの一例を示す説明図である。 前記食品試料における微生物の接種状態を示す説明図である。 寒天培地上に親水性メンブレンフィルターを載置して酵母細胞を接種したときの動態を示す顕微鏡写真であり、(a）は接種０時間目、(b)は接種９時間目を示す。 前記寒天培地上に親水性メンブレンフィルターを載置して酵母細胞を接種したときの動態を示す顕微鏡写真を画像処理したものであり、(a）は接種０時間目、(b)は接種９時間目を示す。 実施例１における酵母細胞面積の時間ごとの変化割合を示すグラフ図である。 実施例１における酵母数の時間ごとの変化割合を示す予測式と、従来法における実測酵母数のプロットを示すグラフ図である。 実施例２の顕微鏡写真であり、（a)は接種０時間目、(b)は接種１２時間目を示す。 実施例２の顕微鏡写真を画像処理したものであり、（a)は接種０時間目、(b)は接種１２時間目を示す。 実施例２における酵母細胞面積の時間ごとの変化割合を示すグラフ図である。 実施例２における酵母数の時間ごとの変化割合を示す予測式と、従来法における実測酵母数のプロットを示すグラフ図である。 食品（ハム）表面に酵母細胞を接種したときの顕微鏡写真であり、(a）は接種０時間目のハム表面を示し、(b)は接種１８時間目のハム表面を示す。
　つぎに、本発明の実施の形態について詳しく説明する。ただし、本発明は、この実施の形態に限られるものではない。
　なお、本発明において「Ｘ～Ｙ」（Ｘ，Ｙは任意の数字）と表現する場合、特にことわらない限り「Ｘ以上Ｙ以下」の意とともに、「好ましくはＸより大きい」または「好ましくはＹより小さい」の意も包含する。
　また、「Ｘ以上」（Ｘは任意の数字）または「Ｙ以下」（Ｙは任意の数字）と表現した場合、「Ｘより大きいことが好ましい」または「Ｙ未満であることが好ましい」旨の意図も包含する。
　本発明の一実施形態である、食品における微生物増殖速度の見積り方法（以下、「本見積り方法」という）は、食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種する工程（工程Ａ）と、前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程（工程Ｂ）と、前記経時的に撮影された画像から、微生物の面積を数値化する工程（工程Ｃ）と、前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もる工程（工程Ｄ）と、を備えている。
　また、本発明の一実施形態である食品の日持ち評価方法（以下、「本評価方法」という）は、食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種する工程（工程Ａ）と、前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程（工程Ｂ）と、前記経時的に撮影された画像から、微生物の面積を数値化する工程（工程Ｃ）と、前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もる工程（工程Ｄ）と、前記見積もられた増殖速度を用いて、食品に許容され得ない所定の微生物数に達するのに要する時間を予測する工程（工程Ｅ）と、を備えている。
　ここで、前記の「食品試料」とは、親水性メンブレンフィルターが載置可能なもの（液状を呈する試料以外のもの）であれば特に限定されるものではなく、例えば、食品そのものから採取した、固形状、ゲル状、クリーム状といった態様を示す試料の他、食品の成分を反映させた寒天培地等の固形状の培地（試料）や、液体状の食品（飲料等）を寒天等で固めた固形状の培地（試料）も含む趣旨である。
　また、前記の「経時的に撮影」とは、所定時間経過毎に撮影を行うことを示すが、その所定時間は一定である必要はない。さらに、前記の「経時的に撮影」は、断続的な撮影のみならず、連続的な撮影を含む趣旨である。
　以下、前記各工程（工程Ａ～Ｅ）について詳しく説明する。
＜＜微生物増殖速度の見積り方法＞＞
〔工程Ａ〕
　工程Ａでは、食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種することが行われる。
　前記食品試料が、食品からそのまま採取した試料等であるため、食品をすりつぶして希釈等する必要がなく、コストや労力の削減の点で優れているといった利点を有している。
　前記食品試料の大きさは、顕微鏡観察に支障が生じなければ、特に限定されるものではない。
　また、前記食品試料の水分活性（Ａｗ）は、食品試料が有する栄養素等（微生物の増殖源）を水とともに親水性メンブレンフィルター上に移行させることが十分に行われることができる観点から、通常、０．６０～１．００であり、好ましくは０．８０～１．００、より好ましくは０．９０～１．００である。
　工程Ａで用いる親水性メンブレンフィルターとしては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン等の樹脂製メンブレンフィルターを適宜親水化処理したもの等を使用することができる。前記親水性メンブレンフィルターは、市販品を用いてもよく、市販品としては、例えば、Merck社製のオムニポアメンブレンフィルター JHWP01300等が好ましく用いられる。
　前記親水性メンブレンフィルターの孔径は、接種する微生物は通さないが食品試料が有する栄養素等（微生物の増殖源）は通すものであることが好ましく、対象とする微生物の種類にもよるが、０．１～１０．０μｍであるものが好ましく、０．２～０．７μｍであるものがより好ましい。
　また、前記親水性メンブレンフィルターの大きさは、顕微鏡観察に支障が生じない程度であれば、特に限定されるものではない。
　一方、その厚みは、通常、１０～１５０μｍであり、５０～１００μｍの厚みであるものが好ましい。前記親水性メンブレンフィルターの厚みが前記範囲内であると、食品試料が有する栄養素等（微生物の増殖源）を、水分をとおして親水性メンブレンフィルター上により効率よく移行させることができる。
　また、工程Ａにおいて、前記親水性メンブレンフィルター上に接種される微生物としては、対象となる食品の品質低下に影響を与える微生物や、発酵食品等の微生物利用食品に通常用いられる微生物が用いられる。このような微生物としては、例えば、酵母，乳酸菌，芽胞菌，大腸菌等の食品腐敗菌や、パン発酵に用いられる酵母，ヨーグルトのスターター（種菌）として使用される乳酸菌，納豆菌等の有用微生物等が挙げられる。これらは単独でもしくは二種以上併せて用いられる。
　本見積り方法によって、食品腐敗菌の増殖速度を予測することにより、その対象となる食品の日持ちを評価したり、その菌の増殖を抑える条件等を決定したりすることができる。また、本見積り方法によって、有用微生物の増殖速度を予測し、微生物の増殖が適正になされる条件等を決定することができる。例えば、有用微生物が酵母である場合には、その対象となる食品の発酵速度を算出することができる。
　そして、前記微生物の接種は、例えば、水や水溶液によって、５０～２０００個／μＬの細胞数（好ましくは１００～１０００個／μＬ、より好ましくは２００～５００個／μＬ）となるよう希釈されたものを、前記親水性メンブレンフィルター上に０．２５～８μＬ（好ましくは０．５～４μＬ、より好ましくは１～２μＬ）滴下することにより行うことができる。
　なお、前記水溶液としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ペプトン加生理食塩水等が挙げられる。
〔工程Ｂ〕
　工程Ｂでは、前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影することが行われる。
　ここで、本見積り方法および本評価方法において、食品試料表面の親水性メンブレンフィルター上に接種された微生物の動態を測定・評価するためのシステムの一例を図１に示す。図１において、１はカメラ、２は光源、３は対物レンズ、４はパーソナルコンピューター、５は食品試料、６は親水性メンブレンフィルター、７は微生物を示す。また、図２は、前記食品試料表面の親水性メンブレンフィルター上に接種された微生物の状態を模式的に示したものであり、図２において、５は食品試料、６は親水性メンブレンフィルター、７は微生物を示す。
　前記カメラ１、光源２、対物レンズ３は、顕微鏡写真を撮影するための顕微鏡構成を示すものであり、特に限定されるものではないが、その一例として、下記に示す顕微鏡構成が挙げられる。
　＜顕微鏡構成＞
　　カメラ：ヒートシンク付GigEカメラ DMK33GX249e、The Imaging Source社製
　　光源：LEDスポット照明 SLSI-22W、シグマ光機社製
　　対物レンズ：長作動対物レンズ PAL-20、シグマ光機社製
　前記微生物の撮影は、特に限定されるものではないが、通常、雰囲気温度４～４５℃の条件下で行われ、食品および微生物の種類や目的に応じて任意に設定することができる。
　前記顕微鏡写真の撮影方法は、特に限定されるものではないが、微生物の接種直後の状態を撮影するとともに、経時的に撮影し、当該食品試料および微生物を用いたときの従来のコロニーカウント法にかかる時間の１／２以下の時間内（好ましくは１／３以下の時間内）に、撮影終了するよう行われることが好ましい。
　このように、本見積り方法および本評価方法は、従来法に対して短時間の観察で微生物の増殖速度を見積もることができる。
　また、前記経時的な撮影は、先に述べたように、断続的な撮影であっても、連続的な撮影であってもよいが、断続的な撮影を行うのであれば、見積もり精度と作業量とのバランスの点から３時間毎に撮影することが好ましく、１時間毎に撮影することがより好ましい。
〔工程Ｃ〕
　工程Ｃでは、前記経時的に撮影された複数の画像について、画像ごとに微生物の面積を数値化することが行われる。このような工程は、通常、パーソナルコンピューター等のコンピューターを利用した画像解析により行われる。
　すなわち、図４(a)，(b)に示すように、前記経時的に撮影された画像において、当該微生物が占める部分を画像処理ソフトウェアで塗り潰し、塗り潰された部分（各図において白塗く塗りつぶされた部分）の面積をソフトウェアにより画素数（ピクセルの総数）として算出することにより、前記画像から微生物の面積を数値化することができる。
　このような数値化は、微生物の個体差（各細胞の生育状態差）を排除することができる点から、前記メンブレンフィルター上の異なる複数の箇所において、増殖する微生物を経時的に撮影し、各箇所の微生物の面積を数値化し、その合計ないし平均をとることが好ましい。前記複数の箇所としては、２箇所であってもよいが、より精度に優れる点から３箇所以上であることが好ましい。
　また、画像上の微生物が占める部分を画像処理ソフトウェアで塗り潰す処理は、目視で細胞を判別して手動で行ってもよいが、効率化を図る点から機械学習（サポートベクターマシンやディープラーニング）させたプログラムを用いて自動的に行ってもよい。
　さらに、工程Ｂおよび工程Ｃを、これらを自動的に行うように設定された微生物検出システムにより並行して行ってもよい。
〔工程Ｄ〕
　工程Ｄでは、前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もることが行われる。
　すなわち、前記数値化されたデータを対比することにより、微生物の同一細胞を起点とした、時間ｔ（最初の撮影時から最後の撮影時までの時間）における細胞画像面積の変化がわかるため、経時的に得られた複数のデータを下記の式（１）に代入し、近似させることにより、係数ｋを求めることができる。ここで、式（１）は、微生物の増殖曲線（接種直後の微生物が対数的に増殖する）に基づくものである。式（１）において、ｅは自然対数の底（ネイピア数）である（下記の式（２）において同じ）。また、図５は、式（１）をグラフ化したものであり、前記複数のデータを代入し、近似させた結果、係数ｋの値が０．４５５３と求められたものを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　続いて、前記で算出した係数ｋの値を、下記の式（２）に代入することにより、時間ｔにおける細胞数Ｎｔの予測式を得ることができる。図６は、得られた予測式を片対数グラフで示すとともに、従来法（コロニーカウント法）で得られた実測値をグラフに重ねて示したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　工程Ｄにおける前記係数ｋや予測式の導出等は、効率化の点からパーソナルコンピューター等のコンピューターを利用した計算により行うことが好ましい。
　前記各工程（工程Ａ～Ｄ）を備えた本見積り方法は、図６に示すように、予測式上に実測値（従来法で得られた値）があることからもわかるとおり、従来法と同程度の信頼性に優れるものである。
　また、本見積り方法は、先に述べたように、微生物の観察時間（接種から撮影終了までの時間）を、従来法であるコロニーカウント法にかかる時間の１／２以下にすることができ、さらに、雰囲気温度等を工夫することにより１／３以下にすることができる。
＜＜食品の日持ち評価方法＞＞
　本評価方法は、本見積り方法の工程Ａ～Ｄに、さらに工程Ｅを加えたものである。
〔工程Ｅ〕
　工程Ｅでは、前記見積もられた増殖速度を用いて、食品に許容され得ない所定の微生物数に達するのに要する時間を予測することが行われる。
　通常、食品に許容され得ない微生物の細胞数（食品腐敗菌数）は１０００００個／ｇを基準とすることが多い。このため、前記導出された予測式を、縦軸を対数で示した図６の直線グラフに表示し直し、例えば１０００００個／ｇに達するのに要する時間を算出する（図６のグラフでは１８時間程度を示している）ことにより、食品の日持ち期間を予測することができる。
　なお、前記食品に許容され得ない微生物数は、目的に応じて適宜自由に設定することができる。
　また、前記のように予測式を別のグラフに表示し直して食品の日持ち期間を予測するのではなく、コンピュータープログラムを利用して、導出された予測式から自動的に、食品の日持ち期間を予測するようにしてもよい。
　前記各工程（工程Ａ～Ｅ）を備えた本評価方法は、本見積方法を利用しており、前記のとおり予測式上に実測値（従来法により測定された値）があることから、従来法と同程度の信頼性に優れるものである（図６参照）。
　また、本評価方法は、本見積方法を利用するものであるため、従来法であるコロニーカウント法から食品の日持ちを評価するのにかかる時間の１／２以下の時間で行うことができ、さらに条件等を工夫することにより１／３以下の時間で行うことができる、という利点を有する。
＜＜食品における微生物増殖速度の見積りシステム＞＞
　食品における微生物増殖速度の見積りシステム（以下「本見積りシステム」とすることがある）は、本見積り方法を利用するものであればよく、特に限定されるものではない。
　しかし、顕微鏡を有する撮影装置と、前記撮影装置で経時的に撮影された被検体の画像から被検体上の微生物の面積を数値化することが可能な数値化装置と、前記面積の経時的変化量から微生物の増殖速度を見積もることが可能な見積装置とを備え、前記被検体が、食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターが載置され、かつ前記親水性メンブレンフィルター上に微生物が接種されたものであると、短時間で効率よく食品における微生物増殖速度を見積ることができる点で好ましい。
　前記撮影装置としては、前記工程Ｂが実行可能な装置であれば特に限定するものではなく、例えば、前記本見積り方法で説明したシステム（カメラ、光源、対物レンズ、パーソナルコンピューターを備えたシステム）を用いることができる。
　また、前記数値化装置としては、前記工程Ｃが実行可能な装置であれば特に限定するものではないが、汎用性に優れる点でパーソナルコンピューター等のコンピューターを利用した画像解析装置であることが好ましい。
　そして、前記見積装置としては、前記工程Ｄが実行可能な装置であれば特に限定するものではないが、汎用性に優れる点でパーソナルコンピューター等のコンピューターを利用した計算装置であることが好ましい。
　本見積りシステムは、微生物が食品腐敗菌の場合では、対象となる食品における食品腐敗菌の増殖速度を見積もることで、前記食品の日持ちを評価することができる。また、その増殖速度を見積もることで、その菌の増殖を抑える条件等を決定するのに利用することができる。
　一方、微生物が有用微生物の場合では、対象となる食品における有用微生物の増殖速度を見積もることで、微生物の増殖が適正になされる条件等を決定するのに利用することができる。例えば、有用微生物が酵母である場合には、対象となる食品の発酵速度を見積もることができる。
　このように、本見積り方法、本評価方法、および本見積りシステムは、その評価等に伴うコストや労力を減少化させつつ、食品の日持ちを非破壊的かつ迅速に評価することが可能である。
　すなわち、従来の方法では少なくとも数日かかっていた作業を、数時間に短縮することが可能である。
　さらに、本見積り方法、本評価方法、および本見積りシステムにより、食品の日持ち（賞味期限等）等に関するデータを従来よりも迅速かつ効率的に収集することができるため、パーソナルコンピューター等のコンピューターや機械学習アルゴリズム（ニューラルネットワーク等）を利用し、その蓄積したデータに基づいて、最適条件（日持ち等を良くするために過不足ない食品添加物の量的条件、食品添加物の種類、酸度，塩度，水分量等の調整条件等）を効率よく探索したり、算出したりできる。
　本見積り方法、本評価方法、および本見積りシステムは、これらの利点を利用したビジネス（例えば、最適条件の情報提供やそれに付随する物資の供給やサービスの提供等）に有効に活用することができる。
　つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　まず、食品試料として寒天培地(ポテトデキストロース寒天培地、日水製薬社製)を準備し、その表面に、親水性のメンブレンフィルター(オムニポアメンブレンフィルター JHWP01300、Merck社製)を載置した。つぎに、酵母(Pichia anomala)を５００個／２μＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、前記メンブレンフィルター上に２μＬを滴下することにより接種した（図１参照）。
　そして、室温（２５℃）での、前記メンブレンフィルター上で増殖する酵母を、以下に示す構成の顕微鏡を用いて、経時的に撮影した（図１および図２参照。倍率：２０倍）。
　＜顕微鏡構成＞
　　カメラ：ヒートシンク付GigEカメラ DMK33GX249e、The Imaging Source社製
　　光源：LEDスポット照明 SLSI-22W、シグマ光機社製
　　対物レンズ：長作動対物レンズ PAL-20、シグマ光機社製
　ここで、前記撮影により得られた画像の一例を図３に示す。図３において、(a）は接種直後（０時間目）の酵母Y0を示し、(b)は接種から９時間後（９時間目）の（a)で示した酵母Y0を由来として増殖した酵母Ytを示す。
　つぎに、前記経時的に撮影された複数の画像から、酵母が占める面積の変化の度合いを画像処理ソフトウェアにより算出し、時間tにおける細胞数Ntの予測を行った。
　詳しくは、ImageJ（オープンソース）により、時間ごと（０時間目、３時間目、４時間目、５時間目、６時間目）の同一細胞に由来する酵母の画像面積を塗り潰した後、その塗り潰された酵母画像面積を画素数(ピクセルの総数)として数値化した。前記塗り潰しを行った画像の一例を図４に示す。図４(a)の符号Y0Pは、図３(a)の酵母Y0の画像面積を塗り潰したものを示し、図４(b)の符号YtPは、図３(b)の酵母Ytの画像面積を塗り潰したものを示す。
　前記数値化した結果を下記の表１に示す。なお、下記の酵母画像面積（細胞画像面積）は、互いに異なる３箇所（３場面）について、それぞれ数値化したものの合計を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その後、前記のように算出した細胞画像面積を、前記の式（１）に代入し、近似させることにより、係数kを求めた結果、係数kの値は０．４５５３であった。
　続けて、前記の係数kの値を、前記の式（２）に代入し、時間tにおける細胞数Ntの予測式を得た。
　図６は、前記予測式を片対数グラフで示すとともに、従来法（コロニーカウント法）における実測微生物数（酵母数）を重ねて示したものである。図６から、実測微生物数（酵母数）のプロットは、概ね前記予測式のグラフ上にあることがわかる。したがって、前記予測式は、従来法と同程度に信頼性の高いものであることがわかる。
　そして、図６に示されるように、前記予測式から、食品に許容され得ない微生物数（このケースでは１０００００個／ｇ）に達するのに要する時間（このグラフでは１８時間程度）を見積もることが可能である。
　また、前記予測式は、先に述べたとおり、従来法であるコロニーカウント法よりも短時間で導出することができるため、本発明の食品の日持ち評価は従来法に比べて短時間で行うことができる。
［実施例２］
　食品試料としてロースハム（朝のフレッシュロースハム、伊藤ハム社製）を用いた以外は、実施例１と同様にしてメンブレンフィルター上で増殖する酵母を経時的に撮影した。
　前記撮影により得られた画像の一例を図７に示す。図７において、(a）は接種直後（０時間目）の酵母Z0を示し、(b)は接種から１２時間後（１２時間目）の（a)で示した酵母Z0を由来として増殖した酵母Ztを示す。
　つぎに、前記経時的に撮影された複数の画像から、酵母が占める面積の変化の度合いを、画像処理ソフトウェアにより算出し、時間tにおける細胞数Ntの予測を行った。
　詳しくは、ImageJ（オープンソース）により、時間ごと（０時間目、５時間目、６時間目、７時間目、８時間目）の同一細胞に由来する酵母の画像面積を塗り潰した後、その塗り潰された酵母画像面積を画素数(ピクセルの総数)として数値化した。前記塗り潰しを行った画像の一例を図８に示す。図８(a)の符号Z0Pは、図７(a)の酵母Z0の画像面積を塗り潰したものを示し、図８(b)の符号ZtPは、図７(b)の酵母Ztの画像面積を塗り潰したものを示す。
　前記数値化した結果を下記の表２に示す。なお、下記の酵母画像面積（細胞画像面積）は、互いに異なる３箇所（３場面）について、それぞれ数値化したものの合計を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その後、前記のように算出した細胞画像面積を、前記の式（１）に代入し、近似させることにより、係数kを求めた結果、係数kの値は０．３１７４であった。
　なお、図９は、近似させた式（１）をグラフ化したものである。
　続けて、前記の係数kの値を、前記の式（２）に代入し、時間tにおける細胞数Ntの予測式を得た。
　図１０は、前記予測式を片対数グラフで示すとともに、従来法（コロニーカウント法）における実測微生物数（酵母数）を重ねて示したものである。図１０から、実測微生物数（酵母数）のプロットは、概ね前記予測式のグラフ上にあることがわかる。したがって、前記予測式は、従来法と同程度に信頼性の高いものであることがわかる。
　そして、図１０に示されるように、前記予測式から、食品に許容され得ない微生物数（このケースでは１０００００個／ｇ）に達するのに要する時間（このグラフでは２８時間程度）を見積もることが可能である。
　前記実施例においては、本発明における具体的な形態について示したが、前記実施例は単なる例示にすぎず、限定的に解釈されるものではない。当業者に明らかな様々な変形は、本発明の範囲内であることが企図されている。
　本見積り方法、本評価方法、および本見積りシステムにより、その評価等に伴うコストや労力を減少化させつつ、食品の日持ちを非破壊的かつ迅速に評価することが可能である。すなわち、従来の方法では少なくとも数日かかっていた作業を、数時間に短縮することが可能である。さらに、本見積り方法、本評価方法、および本見積りシステムにより、食品の日持ち（賞味期限等）等に関するデータを従来よりも効率的に収集することができるため、パーソナルコンピューター等のコンピューターやインターネットを利用し、その蓄積したビッグデータに基づいて、最適条件（例えば、日持ち等を良くするために過不足ない食品添加物の量的条件や食品添加物の種類、酸度，塩度，水分量等の調整条件等）を効率よく探索できるようになる。
　そのため、本見積り方法、本評価方法、および本見積りシステムは、これらの利点を利用したビジネス（例えば、最適条件の情報提供やそれに付随する物資の供給やサービスの提供等）に有効に活用することができる。
　１：カメラ
　２：光源
　３：対物レンズ
　４：パーソナルコンピューター
　５：食品試料
　６：親水性メンブレンフィルター
　７：微生物

Claims (9)

  1. 　食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種する工程と、
    前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程と、
    前記経時的に撮影された画像から、微生物の面積を数値化する工程と、
    前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もる工程と、
    を備えた食品における微生物増殖速度の見積り方法。
  2. 　前記微生物の面積を数値化する工程を、コンピューターを利用した画像解析により行う、請求項１記載の食品における微生物増殖速度の見積り方法。
  3. 　前記微生物の増殖速度を見積もる工程を、コンピューターを利用した計算により行う、請求項１または２記載の食品における微生物増殖速度の見積り方法。
  4. 　食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターを載置し、前記親水性メンブレンフィルター上に微生物を接種する工程と、
    前記親水性メンブレンフィルター上で増殖する微生物を、顕微鏡を用いて経時的に撮影する工程と、
    前記経時的に撮影された画像から、微生物の面積を数値化する工程と、
    前記数値化されたデータに基づいて、微生物の増殖速度を見積もる工程と、
    前記見積もられた増殖速度を用いて、食品に許容され得ない所定の微生物数に達するのに要する時間を予測する工程と、
    を備えた食品の日持ち評価方法。
  5. 　前記微生物の面積を数値化する工程を、コンピューターを利用した画像解析により行う、請求項４記載の食品の日持ち評価方法。
  6. 　前記微生物の増殖速度を見積もる工程を、コンピューターを利用した計算により行う、請求項４または５記載の食品の日持ち評価方法。
  7. 　顕微鏡を有する撮影装置と、前記撮影装置で経時的に撮影された被検体の画像から被検体上の微生物の面積を数値化することが可能な数値化装置と、前記面積の経時的変化量から微生物の増殖速度を見積もることが可能な見積装置とを備えたシステムであって、
    前記被検体が、食品試料の表面に親水性メンブレンフィルターが載置され、かつ前記親水性メンブレンフィルター上に微生物が接種されたものである、食品における微生物増殖速度の見積りシステム。
  8. 　前記数値化装置が、コンピューターを利用した画像解析装置である、請求項７記載の食品における微生物増殖速度の見積りシステム。
  9. 　前記見積装置が、コンピューターを利用した計算装置である、請求項７または８記載の食品における微生物増殖速度の見積りシステム。
PCT/JP2023/013171 2022-03-31 2023-03-30 食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステム WO2023190864A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-059578 2022-03-31
JP2022059578 2022-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023190864A1 true WO2023190864A1 (ja) 2023-10-05

Family

ID=88202776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/013171 WO2023190864A1 (ja) 2022-03-31 2023-03-30 食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステム

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023190864A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004344087A (ja) * 2003-05-23 2004-12-09 Matsushita Electric Ind Co Ltd 微生物計量における計量方法および液体培地および微多孔膜支持体
JP2007195454A (ja) * 2006-01-26 2007-08-09 Kao Corp カビの形態観察方法
JP2010246442A (ja) * 2009-04-14 2010-11-04 Panasonic Corp 乳酸菌数計測方法および乳酸菌数計測装置
JP2018042502A (ja) * 2016-09-14 2018-03-22 株式会社槌屋 微生物コロニーの測定方法及び測定装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004344087A (ja) * 2003-05-23 2004-12-09 Matsushita Electric Ind Co Ltd 微生物計量における計量方法および液体培地および微多孔膜支持体
JP2007195454A (ja) * 2006-01-26 2007-08-09 Kao Corp カビの形態観察方法
JP2010246442A (ja) * 2009-04-14 2010-11-04 Panasonic Corp 乳酸菌数計測方法および乳酸菌数計測装置
JP2018042502A (ja) * 2016-09-14 2018-03-22 株式会社槌屋 微生物コロニーの測定方法及び測定装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UBALDI M RODRIGUES, R .G. KROLL: "Rapid selective enumeration of bacteria in foods using a microcolony epifluoresccnce microscopy technique", JOURNAL O{ APPLIED BACTERIOLOGY, vol. 64, 1 January 1988 (1988-01-01), pages 65 - 78, XP055616169 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Beyenal et al. Quantifying biofilm structure: facts and fiction
CN102288606B (zh) 基于机器视觉的花粉活力测定方法
JP2001245694A (ja) 微生物コロニーに対する生長改変剤の作用の測定方法
Pernthaler et al. In situ classification and image cytometry of pelagic bacteria from a high mountain lake (Gossenkollesee, Austria)
Fung Rapid methods and automation for food microbiology
Schlapp et al. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms—A quantitative confocal microscopy approach
EP4125064A1 (en) Method and system for prediction of microorganism growth using artificial intelligence
Maeda et al. Colony fingerprint for discrimination of microbial species based on lensless imaging of microcolonies
Gatti et al. Fluorescence microscopy for studying the viability of micro‐organisms in natural whey starters
Ogawa et al. Noise-free accurate count of microbial colonies by time-lapse shadow image analysis
Willemse et al. SParticle, an algorithm for the analysis of filamentous microorganisms in submerged cultures
Yin et al. A close to real-time prediction method of total coliform bacteria in foods based on image identification technology and artificial neural network
Sharma et al. A constant depth film fermenter to grow microbial biofilms
WO2023190864A1 (ja) 食品における微生物増殖速度の見積り方法、食品の日持ち評価方法、および食品における微生物増殖速度の見積りシステム
Rattanasomboon et al. Growth and enumeration of the meat spoilage bacterium Brochothrix thermosphacta
WO2019070975A1 (en) ENVIRONMENT FOR DEVELOPING APPLICATIONS FOR EVALUATION PROCESSING OF BIOLOGICAL SAMPLES
US20220101568A1 (en) Image generation system, image generation method, and non-transitory computer-readable storage medium
Zotta et al. Viability staining and detection of metabolic activity of sourdough lactic acid bacteria under stress conditions
JP6329680B1 (ja) 細菌の迅速検査報告方法
WO2015045012A1 (ja) コロニー検査プログラム、コロニー検査装置およびコロニー検査方法
Buchanan Acquisition of microbiological data to enhance food safety
EP3714897B1 (en) Artificial sputum, method of producing an artificial sputum
Caruso et al. Combined fluorescent antibody assay and viability staining for the assessment of the physiological states of Escherichia coli in seawaters
RU2755766C1 (ru) Способ экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах
WO2019176012A1 (ja) 画像処理方法、画像処理装置、ユーザインタフェース装置、画像処理システム、およびサーバ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23780872

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18685453

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024512791

Country of ref document: JP