JP2018042502A - 微生物コロニーの測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】培地を収容する透光性容器の結露により微生物コロニーの光学的観測が妨げられることがない微生物コロニーの測定方法及び測定装置を提供する。
【解決手段】微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、培地１上に載置され、湿潤時に透過性を備える多孔質膜２の表面上で微生物を培養する培養工程と、培養工程の後に、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物４として付着させて微生物５２を染色すると共に多孔質膜を湿潤させる染色工程と、微生物が培養された多孔質膜を、その裏面側が接するように、底部３１が透明な容器３の底面３２に載置する載置工程と、多孔質膜及び容器の底部を介して微生物により発せられる蛍光を観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を行うことを特徴とする。これにより容器の底面側の結露を防止し、底面側からの観測精度が低下するおそれがない。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物コロニーの測定方法及び測定装置に関する。詳しくは、培地上に載置された多孔質膜上で微生物を培養し、形成される微生物コロニーを光学的に観測する微生物コロニーの測定方法及び測定装置に関する。

各種培地上に培養した微生物コロニーに試薬を付着させて染色したり、蛍光を発するようにさせたりすることで光学観測を容易にすることが行われている。また、微生物を含む液体等をメンブレンフィルタにより濾過することにより、そのメンブレンフィルタに微生物を付着させ、そのメンブレンフィルタを培地上に載置して付着させた微生物を培養してコロニーを形成させ、試薬により染色した後に観測することが行われている（例えば、特許文献１、２を参照。）。

例えば、特許文献１に開示されている微生物の計測方法は、シャーレ（透光性容器）内の培地の上に検体を滴下拡散し、この検体入り培地を所定時間だけ培養した後、検体入り培地に試薬を滴下拡散し、顕微鏡で光学観測している。
特許文献２に開示されている生理活性判定方法は、微生物をメンブレンフィルタ上に捕集して培養した後、そのメンブレンフィルタの下面側から浸透させた蛍光染色液でメンブレンフィルタ上の微生物を染色する。その後、顕微鏡で光学観測をしている。

なお、本来、微生物のコロニーは所定の時間をかけて培養した後に検査を行うが、より短い時間が経過したときに微生物を蛍光染色等して顕微鏡観察をする迅速検査を行う場合も多い。そのような場合、微生物を殺菌してガラスプレートに固定したのちに検査を行うため、本来の培養時間をかけて検査を行うための検体と、迅速検査を行うための検体とを別個に用意し、時間毎の検査結果を比較するという煩わしさがあった。このため、微生物のコロニーの検査方法には、１つの検体を用いて迅速検査を行い、その後その検体を本来の時間が経過するまで培養可能であることが求められる。

特開平０７−１４７９９７号公報 特開２００７−０９７５３２号公報

染色剤を用いる微生物コロニーの迅速検査において、故意に殺菌を行わずに迅速に微生物を検査する場合、微生物を安定して保持するために、検査対象を湿潤させたまま容器内に保持する必要がある。この際、検査対象の湿気によって容器内面に結露が生じ、その結露が観察時の妨げとなるという問題があった。そのため、透光性容器を結露が生じないように加温する等、結露を防止するための手段を設ける必要があった。
特許文献１には、透光性容器内の培地上で検体を培養した後、試薬を滴下拡散して顕微鏡で光学観測することが記載されているが、観測時の透光性容器の結露防止については検討されていない。また、迅速検査後に検体を継続して培養可能とすることも検討されていない。
また、特許文献２に記載されているような生理活性判定方法では、メンブレンフィルタ上に形成された微生物コロニーの形状が失われないように、染色剤をメンブレンフィルタの下面側から浸透させて微生物コロニーを染色した後、検体を乾燥させて固定していた。また、検体を乾燥させた後に観察するため、観察後に検体を継続して培養することは考慮されていなかった。

本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、培地を収容する透光性容器の結露により微生物コロニーの光学的観測が妨げられることがなく、且つ観測後に培養を継続できるよう微生物コロニーの形状を維持可能な微生物コロニーの測定方法及び測定装置を提供することを目的とする。

１．微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、培地上に載置され、湿潤時に透過性を備える多孔質膜の表面上で微生物を培養する培養工程と、前記培養工程の後に、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、前記多孔質膜に付着物として付着させて前記微生物を染色すると共に前記多孔質膜を湿潤させる染色工程と、前記微生物が培養された前記多孔質膜を、その裏面側が接するように、底部が透明な容器の底面に載置する載置工程と、前記多孔質膜に励起光を照射し、前記多孔質膜及び前記容器の底部を介して前記微生物により発せられる蛍光を観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を行うことを特徴とする微生物コロニーの測定方法。
２．前記測定工程は、前記容器の底部が上側となるように前記容器を載置し、前記多孔質膜の前記裏面が湿気によって前記容器の底面に付着した状態で前記蛍光を観測する前記１．記載の微生物コロニーの測定方法。
３．前記培養工程は、前記微生物が混ざった溶液をフィルタにより濾過し、当該フィルタを前記多孔質膜として前記培地上に載置することによって前記微生物を培養する前記１．又は２．に記載の微生物コロニーの測定方法。
４．前記染色工程は、前記付着物の安定化剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる前記１．乃至３．に記載の微生物コロニーの測定方法。
５．容器中の検体から微生物のコロニーを検出する微生物コロニーの測定装置であって、前記容器はその底部が透明であり、且つ前記検体を付着させた多孔質膜がその底面に載置されており、前記多孔質膜は所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種により浸潤されており、前記容器をその底部が上方となる向きに載置する載置部と、前記容器に収容された前記多孔質膜に対して励起光を照射する光源部と、前記載置部の上方に設けられ、前記容器の底部を介して前記多孔質膜に付着している前記検体の画像を取得する撮像部と、を備えることを特徴とする微生物コロニーの測定装置。
６．前記載置部に載置された前記容器の上方又は下方に、前記多孔質膜に付着している前記付着物を一定温度に加温するためのヒータを備える前記５．記載の微生物コロニーの測定装置。

本発明によれば、微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、培地上に載置され、湿潤時に透過性を備える多孔質膜の表面上で微生物を培養する培養工程と、培養工程の後に、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物として付着させて微生物を染色すると共に多孔質膜を湿潤させる染色工程と、微生物が培養された多孔質膜を、その裏面側が接するように、底部が透明な容器の底面に載置する載置工程と、多孔質膜に励起光を照射し、多孔質膜及び容器の底部を介して微生物により発せられる蛍光を観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を行い、測定工程時に容器の底面（底部の内側表面）と多孔質膜の間の隙間を付着物が満たしているため、多孔質膜が付着物の表面張力により確実に底面に固定される。また、多孔質膜と容器との間が液状の付着物で満たされているため、容器の底面側に結露が生じることがなく、底面側からの光学的な観測精度が低下するおそれがない。更に、多孔質膜を培地に戻して培養を続行することができ、所定の時間経過後に十分に生育した微生物コロニーを観察することができる。

測定工程は、容器の底部が上側となるように容器を載置し、多孔質膜の裏面が容器の底面に付着した状態で蛍光を観測する場合は、カメラ等の蛍光の観測装置を容器の上方に配設することができ、容器の配設位置を装置下方にすることができる。そして、容器の底部が上側となって、容器底面から多孔質膜が脱落可能な状態になるが、多孔質膜の水分等による表面張力により張り付いており、底面から容易に脱落することがないため、別途多孔質膜を固定する必要がない。
また、容器の開口方向が下向きとなって上側に空気より軽い蒸気が漏れる隙間がなくなるため、蒸気が容器内から逃げにくくなり、多孔質膜の乾燥を抑制することができる。

培養工程は、微生物が混ざった溶液をフィルタにより濾過し、当該フィルタを多孔質膜として培地上に載置することによって微生物を培養する場合には、培地に直接微生物を付着させる工程を不要とし、容易にフィルタ上で培養することができる。
染色工程は、付着物の安定化剤を含む溶媒に付着物を溶かした溶液により多孔質膜を湿潤させることによって、付着物を多孔質膜に付着させる場合には、蛍光をむらなく発するようにすることができる。

本発明の微生物コロニーの測定装置によれば、容器中の検体から微生物のコロニーを検出する微生物コロニーの測定装置であって、容器はその底部が透明であり、且つ検体を付着させた多孔質膜がその底面に載置されており、多孔質膜は所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種により浸潤されており、容器をその底部が上方となる向きに載置する載置部と、容器に収容された多孔質膜に対して励起光を照射する光源部と、載置部の上方に設けられ、容器の底部を介して多孔質膜に付着している検体の画像を取得する撮像部と、を備えるため、検体の撮像時に容器の底面（底部の内側表面）と多孔質膜の間の隙間が付着物で満たされ、多孔質膜が付着物の表面張力により確実に底面に固定される。よって容器の底面側に結露が生じることがなく、底面側からの光学的な観測精度が低下するおそれがない。別途多孔質膜を固定する手段や、結露防止手段を用意する必要もない。また、載置部を撮像部よりも低い位置に配設することができ、装置を卓上で使用するときであっても、載置部への容器の載置、脱離作業が容易となる。また、容器の開口方向が下向きとなるため、容器の開口部分から蒸気が逃げにくく、多孔質膜の乾燥を抑制することができる。更に、多孔質膜を湿潤したまま微生物コロニーを観察できるため、非殺菌性の染色剤によって染色することで、検査後に多孔質膜を培地に戻して微生物の培養を続行することができ、所定の時間経過後に十分に生育した微生物コロニーを観察することができる。
前記載置部に載置された前記容器の上方又は下方に、前記多孔質膜に付着している前記付着物を一定温度に加温するためのヒータを備える場合は、付着物である前記蛍光試薬等の反応を安定させて、より確実に微生物コロニーの蛍光等を観測することができる。

本発明について、本発明による典型的な実施形態の非限定的な例を挙げ、言及された複数の図面を参照しつつ以下の詳細な記述にて更に説明するが、同様の参照符号は図面のいくつかの図を通して同様の部品を示す。
本微生物コロニーの測定方法による光学観測を行うときの構成を説明するための模式図である。 多孔質膜に微生物が付着した状態を示す模式図である。 多孔質膜を培地に載置し、培養により微生物コロニーが形成されている状態を示す模式図である。 シャーレ（透光性容器）に試薬を入れた状態を示す模式図である。 シャーレ（透光性容器）の底面に多孔質膜を載置し、多孔質膜を湿潤、及び微生物コロニーを試薬により染色させている状態を示す模式図である。 微生物コロニーを光学的に観測するための測定装置の例を示す模式図である。 実験例における観察結果を示す画像である。 実験例における観察後の培養後の状態を示す画像である。

ここで示される事項は例示的なもの及び本発明の実施形態を例示的に説明するためのものであり、本発明の原理と概念的な特徴とを最も有効に且つ難なく理解できる説明であると思われるものを提供する目的で述べたものである。この点で、本発明の根本的な理解のために必要である程度以上に本発明の構造的な詳細を示すことを意図してはおらず、図面と合わせた説明によって本発明の幾つかの形態が実際にどのように具現化されるかを当業者に明らかにするものである。

本実施形態に係る微生物コロニーの測定方法は、培地上に載置され、湿潤時に透過性を備える多孔質膜の表面上で微生物を培養する培養工程と、培養工程の後に、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物として付着させて微生物を染色すると共に多孔質膜を湿潤させる染色工程と、微生物が培養された多孔質膜を、その裏面側が接するように、底部が透明な容器の底面に載置する載置工程と、多孔質膜に励起光を照射し、多孔質膜及び容器の底部を介して微生物により発せられる蛍光を観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を備える。

「多孔質膜を湿潤させる」とは、付着物である蛍光試薬や抗体を溶解させたり分散させたりした液を多孔質膜に浸させることをいう。付着物を多孔質膜に湿潤させる程度は、少なくとも多孔質膜を容器の底面に載置したときに、多孔質膜の裏面と容器の底面との隙間を付着物が満たす程度であることが好ましい。また、湿潤の度合いは多孔質膜の大きさや素材で異なり、特に容器をその底面が上方となる向きに配設する場合には、湿潤させる程度は乾燥による剥離若しくは流動による多孔質膜の滑走を起こさないように調整する必要がある。
前記液を多孔質膜に浸す方法は特に問わず、容器中に前記液を入れた後に多孔質膜を容器内に載置する、多孔質膜に前記液を噴霧や滴下する等の任意の方法を選択することができる。また、測定工程に用いる容器に溶液を入れた後に多孔質膜を容器内に載置することにより、染色工程と載置工程とを同時に行ってもよい。

本測定方法により測定することができる微生物は特に問わず、例えば、大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、リステリア、クロストリジウム、バチルス等の、グラム陽性、グラム陰性、好気性、嫌気性を問わずコロニーを形成する細菌等を挙げることができる。
多孔質膜上の微生物を培養させて微生物コロニーを形成するための培地は、対象となる微生物に応じて適宜選択することができ、寒天培地等の固形培地、半流動培地等を用いることができる。また、培地に直接微生物を培養するに限られず、濾過等により微生物を付着させたメンブレンフィルタ等の多孔質膜を培地上に載置し、そのまま微生物を培養してフィルタ上に微生物コロニーを形成させてもよい。
微生物の培養方法は、必要とする観測方法に合わせて通常用いられる培養方法を選択することができる。

蛍光試薬は、検出対象となる微生物コロニーを選択的に染色できるものであればよく、検出する微生物によって適宜選択される。微生物の活性を利用する蛍光染色剤として、例えば、微生物のエステラーゼ活性により染色されるフルオレセインジアセテート等のエステラーゼ系染色剤、呼吸活性により染色される5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride（ＣＴＣ）等のテトラゾリウム塩系染色剤等を挙げることができる。検出対象となる微生物が生産する酵素、及び酵素の誘導体等により蛍光試薬を作用させてもよい。そのような酵素の例として、大腸菌が生成するβグルクロニダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルコシダーゼ等を挙げることができる。

また、蛍光試薬に代わり又は蛍光試薬と共に、特定の微生物と結合して蛍光を発するように装飾された抗体を用いることができる。抗体は、特定の微生物にのみ結合するタンパク質や特異性を備える核酸であり、特定の微生物中の抗原と結合して発色反応（所謂免疫染色）を生じさせることができる。微生物の抗体として、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び合成核酸を用いた核酸アプタマー、ウシ、ウサギ、ヒト、マウス、モルモット及びニワトリ等から精製するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等に、蛍光色素を修飾基として結合させて用いることができる。また、修飾基となる蛍光色素の例としてＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、ＡＰＣ等の蛍光タンパクや、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド等の小分子蛍光色素を挙げることができる。

多孔質膜は、測定工程時に微生物コロニーを構成する微生物が流動して微生物コロニーが溶解等して輪郭が変化しないように、微生物を培養しつつ、培地から脱着可能にするために用いられる。また、蛍光試薬等は多孔質膜に付着されることにより保持される。多孔質膜は、蛍光試薬等によって生じる蛍光物質に対する励起光、及び微生物から発せられる蛍光を、膜厚方向に透過可能である必要がある。励起光及び蛍光を透過可能にする手段は任意に選択することができ、例えば、湿潤時に励起光及び蛍光に対して透過性を備える材質を用いることを挙げることができる。また、多孔質膜を構成する孔内を介して膜厚方向に導光させてもよい。

多孔質膜の平均孔径は、目的に応じ適宜選択することができる。例えば、孔径は、観測目的とする微生物の最小径よりも小さい径とすることができる。微生物より小さな径とすることにより、培地上に載置した後において、孔を介して微生物が流動しないようにしつつ、蛍光試薬等による染色を行うことができる。更に、培地の湿気により湿潤して孔が塞がることで散光を抑制し、透過性が向上した多孔質膜を透過する蛍光の光量が多くなるため、より高感度に測定を行うことができる。このような径の例として、大腸菌等に対し、孔径を０．１〜０．４５μｍとすることを挙げることができる。

蛍光試薬又は抗体は、任意の溶媒に溶解させたり分散させたりした状態で、多孔質膜に付着物として付着される。

多孔質膜に湿潤させる蛍光試薬等の溶液に、検査に効果的な試薬等を添加することができる。このような試薬の例としてｐＨ緩衝剤、界面活性剤、分散剤、細胞透過処理剤等を挙げることができる。これらの試薬は化合物に検定されず、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒を低濃度で添加することもできる。これらを添加することにより染色剤の活性を向上させたり、多孔質膜に蛍光試薬等を湿潤する際に、場所によらず蛍光試薬等の濃度が均一となるように分散させたりすることができ、微生物の染色を均一に行うことができる。また、多孔質膜を培地上に載置したときの蛍光試薬等の溶液の粘性を調節することができ、微生物が遊走したり、微生物コロニーが溶解したりすることによって、微生物コロニーの輪郭が溶解等しないよう制御することができる。更に、蛍光試薬等を付着させた多孔質膜の反りを抑制することができ、多孔質膜の表面を平坦にすることができる。そして、微生物の蛍光が多孔質膜により乱反射して観測精度が低下することを防止することができる。
ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、分散剤、細胞透過処理剤等の種類及び濃度は、微生物の増殖や、蛍光試薬等による染色を過度に阻害しない濃度において適宜選択することができる。

前記容器は、その底部が、微生物に照射する励起光と蛍光試薬等から発する蛍光とを、測定工程のときに観測可能な程度で内外に透過させることができる透明な容器であれば良く、任意に選択することができる。この例としてガラス、樹脂等で作製されたシャーレ等を挙げることができる。前記「透明」は、少なくとも前記励起光及び前記蛍光に対して透光性を備えていればよく、その他の波長の光に対して透光性を備えていなくてもよい。また、多孔質膜が乾燥したり、前記液が流出したりすることを防ぐための蓋を被せることができる。

微生物コロニーの測定を行う測定工程は、容器の底部側又は多孔質膜の表面側から励起光を照射し、容器の底部及び多孔質膜を介して微生物により発せられる蛍光を観測することで行われる。
通常、蓋付きの容器に恒温槽に入っていた微生物を載せた検体を納める作業を行うと、検体により室温より高い温度となった空気が容器の内壁により冷却されて空気中の水蒸気が凝縮して結露する。そして結露によって生じた多数の微小な水滴により蛍光や励起光が散乱するため、正確な観測が困難になる。
これに対して、容器の底部側から蛍光を観測する場合は、容器の底面（底部の内側面）には多孔質膜が接触し、更に隙間が付着物等によって満たされるため、容器の表面に結露が生じることがなく、蛍光や励起光が散乱して観測の妨げになることがない。また、容器の底面部を上向きに設置して、上面から撮影を行うことで、容器の下面、もしくは上面にヒータを置いて多孔質膜を加温する際に、多孔質膜の蒸発を防ぎつつ加温することができる。

照射する励起光は、蛍光試薬又は抗体によって得られる蛍光物質と、観測方法に合わせて適宜選択することができる。
また、微生物から発せられる蛍光を観測する手段は適宜選択することができ、例えば、蛍光顕微鏡等を用いた肉眼観察したり、イメージセンサ等により撮像したりする等を挙げることができる。

以上のような微生物のコロニーの測定方法を行うために好適な装置として、容器中の検体から微生物のコロニーを検出する微生物コロニーの測定装置であって、前記容器はその底部が透明であり、且つ前記検体を付着させた多孔質膜がその底面に載置されており、前記多孔質膜は所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種により浸潤されており、前記容器をその底部が上方となる向きに載置する載置部と、前記容器に収容された前記多孔質膜に対して励起光を照射する光源部と、前記載置部の上方に設けられ、前記容器の底部を介して前記多孔質膜に付着している前記検体の画像を取得する撮像部と、を備える微生物コロニーの測定装置を挙げることができる。

例えば、図６に示す微生物コロニーの測定装置６は、容器３を収容する載置部６１と、光源部６２と、載置部６１の上方に位置し、イメージセンサ等の撮像素子により撮像を行う撮像部６３と、載置部６１と撮像部６３との間に位置する落射照明部６４とを備える。また、載置部６１にヒータ６５を設けることができる。微生物コロニーの測定装置６は、光源部６２から発せられる励起光が落射照明部６４を介して照射されている容器３内の多孔質膜２の表面に形成されている検体（微生物コロニー）の画像を、落射照明部６４を介して撮像部６３により撮像する。光源部６２は、対象となる微生物コロニーの蛍光の励起光を発するための光源であり、その種類を特に問わない。
例えば、光源部６２として、ＬＥＤランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ、レーザ発振器等の光源を挙げることができる。落射照明部６４は、微生物コロニーに照射する光源部６２の光路と、微生物コロニーを撮像する撮像部６３の光路の光軸と、を同一にするためのものであり、ダイクロイックミラーやプリズム等を組み合わせて構成することができる。撮像部６３の撮像素子は、微生物コロニーから発する蛍光の波長により撮像して、その画像を得ることができる手段であればよく、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ、ＳＩＴイメージセンサ等を例示することができる。
また、落射照明部６４、光源部６２又は撮像部６３にダイクロイックミラーや光学フィルタ等を任意に組み合わせて、載置部６１を照射する励起光の波長や、撮像部６３に到達する蛍光の波長を選択したり、波長の切替を行ったりすることができる。
ヒータ６５は、載置部６１に載置された容器３の上方（容器３の底部側）又は下方（容器３の開口側）に設けられたヒータであり、載置された容器３を加温することによって、容器３内の多孔質膜の付着物４である染色剤を暖め、その染色反応を安定させることができる。測定装置６は、載置部６１の下方にヒータ６５を設けているが、これに限られず、容器３上に載置するようにヒータ６５を設けてもよい。容器３上に載置するようにヒータ６５を設ける場合は、ガラスヒータ等の透光性を備えるヒータを使用することができる。

本微生物コロニーの測定方法においては、複数（多重）の染色を行ってもよい。例えば、複数の染色は、２種類以上の複数種類の微生物に対してそれぞれを特定するために、複数の蛍光試薬や抗体を任意に組み合わせて行うことができる。また、複数の微生物コロニーに対して特定の物質を生成しているかを特定するために行うことができる。
複数の染色を行う場合において各染色を分けて行い、染色毎に測定工程を行ってもよい。異なる染色対象の蛍光色素が、同一の蛍光波長をもつ場合でも、その染色対象が重複しない、もしくは一方に包括される場合には、より限定的な対象を染色する染色剤から使用し、順に測定工程を同一波長の蛍光色素を使用する場合は、より限定的波長の蛍光色素から順に測定工程をおこなうことで染色を区別できる。更に、異なる蛍光色素を染色剤ごとに使い分ける場合は、複数の波長を放射する光源によって、複数波長の蛍光を発するようにし、観測時に各波長の蛍光をバンドパスフィルタ等によりそれぞれ選択して観察してもよい。

本微生物コロニーの測定方法により、大腸菌の観測を行った。
（１）培養工程
大腸菌を含む水溶液である検体を多孔質膜２である厚さ０．１ｍｍ、平均孔径０．２μｍの未着色ＰＴＦＥ製メンブレンフィルタ（メルクミリポア社、JGWP02500）によって濾過し、多孔質膜２に測定する微生物５１として大腸菌を付着させた（図２）。大腸菌は、大きさが短軸０．４−０．７μｍ、長軸２．０−４．０μｍ程度の桿状体である。
この多孔質膜２をトリプトソイ寒天平板培地１上に載置した状態で、３７℃の恒温槽内に５時間静置して培養し、大腸菌の微生物コロニー５２を形成させた（図３）。

（２）染色工程及び載置工程
エステラーゼ系染色剤の水溶液４を、容器３であるシャーレに滴下した（約０．０５ｍｌ）（図４）。そして、多孔質膜２を培地１から剥離した後、シャーレの底面３２に載置した。底面３２に載置された多孔質膜２は、付着物４が染みこみ、多孔質膜２が湿潤すると同時に、多孔質膜２表面の微生物コロニー５２が付着物４により染色される。湿潤した多孔質膜２は着色されておらず、且つ透過性を備えており、多孔質膜２の表面の状態が透けて見える（図５）。

（３）測定工程
多孔質膜２を載置したシャーレ３に蓋３２を被せた後、底部３１が上向きとなるようにシャーレ３を蓋３２毎ひっくり返し（図１）、蛍光顕微鏡を備える微生物コロニーの測定装置６に設置した（図６）。このとき、多孔質膜２はシャーレ３の底面３２に付着しているため脱落可能な状態となるが、多孔質膜２とシャーレ３の底面３２との隙間を付着物４が埋め、水の表面張力により多孔質膜２がシャーレ３の底面３２から脱落しないように維持されるため、容易に脱落することはない。また、多孔質膜の温度が３７度となるように装置内のヒータにより加温を開始した。この加温により、染色反応を適度な温度で安定して行うことができ、より確実に蛍光が確認可能となる。
次いで、シャーレ３の底部３１の上方から多孔質膜２に向けて励起光を照射して、底部３１及び多孔質膜２を介して微生物コロニー５２の観察、及び撮影を行った（図１、図６、図７）。
図７に示すように、底部３１及び多孔質膜２を介した状態であっても、微生物コロニー５２から発せられる蛍光を確認することができた。また、微生物コロニー５２の形状も輪郭が崩れたりすることがなく円形状であった。
更に、シャーレ３を測定装置６に設置してから、観察及び撮影が完了するまでの時間は約５分間であり、その期間において多孔質膜２がシャーレ３の底面３２から脱落することはなかった。

更に、撮影後、多孔質膜２を培地１に戻して載置した状態で３７℃の恒温槽に戻し、１６時間静置して追加の培養を行った。その後、多孔質膜２上に十分な大きさまで生育した微生物コロニーを目視による観察、及びデジタルカメラによる撮影を行った（図８）。
また、前記測定工程で蛍光を撮影した画像（図７）と、デジタルカメラで撮影した画像（図８）と、を比較して、微生物コロニーの位置の移動や、消失等の微生物コロニーの溶解や汚染が起きていないかを確認したところ異常は見られず、測定工程が完了した後に培養を継続しても微生物コロニーの形状を維持できることが確認できた。

本発明は以上で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。

１；培地、２；多孔質膜、３；容器（シャーレ）、３１；底部、３２；底面、３３；蓋、４；付着物（蛍光染色剤）、５１；微生物、５２；微生物コロニー、６；測定装置、６１；載置部、６２；光源部、６３；撮像部、６４；落射照明部、６５；ヒ−タ。

Claims (6)

1. 微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、
   培地上に載置され、湿潤時に透過性を備える多孔質膜の表面上で微生物を培養する培養工程と、
   前記培養工程の後に、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、前記多孔質膜に付着物として付着させて前記微生物を染色すると共に前記多孔質膜を湿潤させる染色工程と、
   前記微生物が培養された前記多孔質膜を、その裏面側が接するように、底部が透明な容器の底面に載置する載置工程と、
   前記多孔質膜に励起光を照射し、前記多孔質膜及び前記容器の底部を介して前記微生物により発せられる蛍光を観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、
   を行うことを特徴とする微生物コロニーの測定方法。
2. 前記測定工程は、前記容器の底部が上側となるように前記容器を載置し、前記多孔質膜の前記裏面が前記容器の底面に付着した状態で前記蛍光を観測する請求項１記載の微生物コロニーの測定方法。
3. 前記培養工程は、前記微生物が混ざった溶液をフィルタにより濾過し、当該フィルタを前記多孔質膜として前記培地上に載置することによって前記微生物を培養する請求項１又は２に記載の微生物コロニーの測定方法。
4. 前記染色工程は、前記付着物の安定化剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。
5. 容器中の検体から微生物のコロニーを検出する微生物コロニーの測定装置であって、
   前記容器はその底部が透明であり、且つ前記検体を付着させた多孔質膜がその底面に載置されており、
   前記多孔質膜は所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種により浸潤されており、
   前記容器をその底部が上方となる向きに載置する載置部と、
   前記容器に収容された前記多孔質膜に対して励起光を照射する光源部と、
   前記載置部の上方に設けられ、前記容器の底部を介して前記多孔質膜に付着している前記検体の画像を取得する撮像部と、
   を備えることを特徴とする微生物コロニーの測定装置。
6. 前記載置部に載置された前記容器の上方又は下方に、前記多孔質膜に付着している前記付着物を一定温度に加温するためのヒータを備える請求項５記載の微生物コロニーの測定装置。