WO2023178911A1 - 一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法 - Google Patents

一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法 Download PDF

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杨霜
蒋军红
高子媛
徐明明
葛威
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Definitions

  • the invention belongs to the technical field of biomolecule analysis reagents, and specifically relates to a method for solid-phase fucose glycoprotein enrichment and fucose glycosylation enzyme digestion analysis (SPFucE).
  • Glycosylation is an important post-translational modification of proteins, involved in growth, differentiation, inflammation and other processes in organisms.
  • Fucose is one of the important carbohydrates in the glycan chain, and fucosylation is the process of transferring fucose from GDP-fucose to its substrate catalyzed by fucosyltransferase.
  • Fucosylation transferases FUTs
  • FUTs Fucosylation transferases
  • Fucosylation transferases are usually involved in the synthesis of terminal glycan structures, and therefore, the transfer of fucose residues to glycans is considered the end point of the glycosylation process.
  • Fucosylation is divided into core fucosylation and branched-chain fucosylation according to the position of fucose in the glycan linkage.
  • FUT can catalyze processes such as the biosynthesis of blood H and Lewis antigens, selectin-mediated leukocyte diapedesis, host-pathogen interactions, and modification of signaling
  • Abnormal fucose glycosylation modification plays an important role in the occurrence and development of diseases and therefore can be used as a disease biomarker for diagnosis or prognosis.
  • Abnormal fucosylation is usually closely related to the expression of fucosyltransferase and fucosidase. Abnormal changes in fucosylation exist in many diseases, including lung cancer, liver cancer, oral cancer and Alzheimer's disease. Silence, etc.
  • abnormal fucosylation of alpha-fetoprotein is approved by the US Food and Drug Administration (FDA) as a biomarker for hepatocellular carcinoma.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • fucose glycoproteins from complex protein samples and detecting fucose structure and expression, it can be used as a disease-specific biomarker and can also show the progression and prognosis of the disease.
  • the main methods for enriching fucosylated proteins include lectin enrichment.
  • AAL, UEAI, LCA and AAO lectins are often used to enrich fucosylated proteins, but the lectin method has poor specificity and sensitivity. Low disadvantages.
  • AAL, UEAI, LCA and AAO lectins are often used to enrich fucosylated proteins, but the lectin method has poor specificity and sensitivity. Low disadvantages.
  • the purpose of the present invention is to provide a method based on solid-phase fucose glycoprotein enrichment and fucose glycosylation enzyme digestion analysis.
  • a method based on solid-phase fucose glycoprotein enrichment and fucose glycosylation enzyme digestion analysis including the steps:
  • the initial concentration of the protein is 6-8ug/ul.
  • step (5) of step (1) the concentration of urea in the sample is ⁇ 1.6M.
  • step (6) of step (1) the mass ratio of trypsin to sample is 1:50-1:100.
  • the enrichment of core fucosylated glycoproteins includes: obtaining glycopeptides containing fucose glycosylation sites or enriching core fucosylated glycopeptides. way.
  • obtaining a glycopeptide containing fucose glycosylation sites includes:
  • enriched core fucosylated glycopeptides include:
  • Endo M enzyme digestion add NH 4 HCO 3 buffer and Endo M enzyme to the purified polypeptide sample, incubate overnight, and vacuum freeze-dry to obtain the sample;
  • step 3 the enrichment of branched fucose glycosylated glycoproteins includes:
  • the mass spectrometry analysis includes: re-analyzing glycopeptides containing fucose glycosylation sites or core fucose glycosylated glycopeptides or branched-chain fucose glycosylated glycopeptides. Dissolve in FA-containing ACN to obtain a sample, which is analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry to obtain primary and secondary mass spectra.
  • the chromatographic mobile phase is 10-50% ACN, and the mass spectrometry energy is CE26-32.
  • Informatics software performs fucosylated protein and fucosylation site analysis.
  • the invention provides a method based on solid-phase fucose glycoprotein enrichment and fucose glycosylation enzyme digestion analysis, which can specifically enrich fucose and analyze fucose sugar from complex protein polypeptides.
  • Peptides have a wide range of applications, such as: they can specifically enrich fucose-glycosylated proteins from complex protein samples, and can perform qualitative and quantitative analysis, improving the sensitivity and specificity of detecting fucose-glycosylated proteins.
  • Figure 2 is a schematic diagram of Endo H and Endo F3 enzyme digestion in the present invention
  • Figure 3 is a schematic diagram of the oxidation of fucose, mannose and galactose in the present invention
  • Figure 4 is a schematic diagram of the work flow using fucosidase digestion in the present invention.
  • Figure 5 is a schematic diagram of the workflow of using Endo M enzyme digestion to enrich fucosylated glycopeptides in the present invention
  • Figure 6 is a schematic diagram of enzymatic digestion using fucosidase and mannosidase in the present invention.
  • the present invention has developed a method based on solid-phase fucose glycoprotein enrichment and fucose glycosylation enzyme cleavage analysis. It enriches complex protein samples from complex protein samples through the specific reaction of endoglycosidase fucose glycopeptides. Fucose glycoproteins and analysis of fucose glycoprotein structure and abundance can be used as biomarkers for disease diagnosis.
  • references herein to "one embodiment” or “an embodiment” refer to a particular feature, structure, or characteristic that may be included in at least one implementation of the invention. "In one embodiment” appearing in different places in this specification does not all refer to the same embodiment, nor is it a separate or selective embodiment that is mutually exclusive with other embodiments.
  • AAL refers to petitgrain agglutinin
  • AAO refers to Aspergillus oryzae agglutinin
  • UEAI refers to ebony lectin I
  • LCA refers to lens agglutinin.
  • Figure 1 is a schematic workflow diagram of the preparation of glycopeptides in the present invention through solid phase enrichment of fucose glycosylated glycopeptides.
  • a method based on solid-phase fucose glycoprotein enrichment and fucose glycosylation enzyme digestion analysis includes the following steps:
  • Subject saliva was collected from 9 a.m. to 11 a.m. Subjects were asked to avoid eating, drinking, smoking, or using any oral hygiene products for at least one hour before collection. 5 minutes before collection, subjects were asked to rinse their mouths with water 2-3 times to ensure a clean mouth. Without stimulation, collect naturally secreted whole saliva and place it in a 50ml centrifuge tube. Collect 5 ml of saliva over 10 minutes. The entire process takes place on ice. After collection, the saliva samples were centrifuged at 12,000 rpm at 4°C for 25 minutes. Discard the precipitate, collect the supernatant, and add 100X protease inhibitor to the supernatant to obtain salivary protein.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of Endo H and Endo F3 enzyme digestion in the present invention.
  • the solid square represents N-acetylglucosamine
  • the shaded square represents N-acetylgalactosamine
  • the solid circle represents galactose
  • the shaded circle represents mannose
  • the solid triangle represents fucose.
  • Endo H and Endo F3 can hydrolyze sample glycopeptides with or without Contains the ⁇ (1,4) glycosidic bond between two N-acetylglucosamines in the core fucosylated glycopeptide.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the oxidation of fucose, mannose, and galactose in the present invention, where a is fucose, b is mannose, and c is galactose.
  • a fucose
  • b mannose
  • c galactose.
  • the ortho-diol structures of these three monosaccharides can be oxidized to ortho-dialdehyde structures by sodium periodate.
  • step 5 React the sample purified in step 3 with the hydrazide resin treated in step 4 at room temperature for 4 hours.
  • Method 2 Enrich core fucosylated glycopeptides, (please refer to Figure 5.
  • Figure 5 is a schematic workflow diagram of using Endo M enzyme digestion to enrich fucosylated glycopeptides in the present invention.
  • the dark color The square represents N-acetylglucosamine
  • the light square represents N-acetylgalactosamine
  • the solid circle represents galactose
  • the shaded circle represents mannose
  • the triangle represents fucose
  • the curved structure represents peptides.
  • Endo M can hydrolyze the ⁇ (1,4) glycosidic bond between the two N-acetylglucosamine in the core fucosylated glycopeptide in the sample glycopeptide.
  • Figure 6 is a schematic diagram of enzymatic digestion using fucosidase and mannosidase in the present invention.
  • the solid square represents N-acetylglucosamine
  • the shaded square represents N-acetylgalactosamine.
  • the solid The circle represents galactose
  • the shaded circle represents mannose
  • the triangle represents fucose.
  • FIG 6 after hydrolysis by a1-2,4,6 fucosidase and mannosidase, only a1- 3 Fucosylated glycopeptides.
  • step 5 React the sample purified in step 3 with the hydrazide resin treated in step 4 at room temperature for 4 hours.
  • the sample is analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry to obtain primary and secondary mass spectra;
  • LC/MS results were analyzed using MaxQuant software and GlycReSoft software. Fucosylated proteins unique to lung cancer patients and healthy subjects can be identified. After labeling glycopeptides with TMT or IBT, we can quantitatively analyze the expression differences of fucosylated proteins between lung cancer patients at different stages and healthy subjects, develop appropriate glycoprotein markers, and detect lung cancer patients through a simple method. Specificity and sensitivity of staging.
  • Fucosylation modifications are commonly upregulated in different cancer cells, and SPFucE was used to identify unique fucosylated proteins between lung cancer cells and normal lung epithelial cells. After treating cells with fucosylation inhibitors and labeling them with TMT or IBT, the changes in fucosylated proteins between lung cancer cells and healthy lung epithelial cells were quantitatively analyzed and the signaling pathways affected by fucosylation were analyzed and identified. Analysis of upstream and downstream regulatory factors related to signaling pathways is of great significance for identifying potential drug targets in lung cancer in the future.
  • Alveolar lavage fluid is particularly important for studying lung disease markers and discovering disease-related molecules.
  • Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) is used to collect samples from the lungs for testing. During this procedure, a saline solution is passed through the bronchoscope to clean the airways and collect a sample of fluid.
  • BALF can play an important role in making accurate and confident diagnoses of specific forms of interstitial lung disease.
  • BALF nucleated immune cell patterns can often provide useful information for diagnostic evaluation and reduce the need for more invasive procedures, such as surgical lung biopsy.
  • Bronchoalveolar lavage fluid has been widely used to identify biomarkers of lung disease. Using the present invention, fucose glycoprotein markers related to lung cancer or inflammation can be found in alveolar lavage fluid.
  • the present invention provides a method based on solid-phase fucoprotein enrichment and fucosylation enzyme digestion analysis, which is useful for discovering disease cells, clinical tissues and human bodies. It is of great significance to study fucosylated disease markers in body fluid specimens, as well as early diagnosis and prognostic markers of diseases.

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Abstract

一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，包括步骤：提取得到蛋白质，然后将蛋白水解得到多肽和糖肽，接着用糖苷内切酶处理，包括①将肽段用糖苷内切酶处理，然后将糖肽氧化结合到酰肼树脂上，通过岩藻糖糖苷酶水解后获取岩藻糖糖基化位点或去岩藻糖糖肽；②将糖肽用糖苷内切酶处理，再使用亲水相互作用色谱得到完整岩藻糖糖肽。也可将糖蛋白或者酶切糖肽，经氧化和与酰肼结合，酶切得到支链α1,3-岩藻糖糖肽。最后用质谱对岩藻糖肽和含有岩藻糖基化位点的肽段进行分析。基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法对发现疾病细胞、临床组织和人体体液标本中具有岩藻糖基化的疾病标志物，以及疾病早期诊断和预后标志物的研究等方面有着重要意义。

Description

一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法 技术领域
本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法(SPFucE)。
背景技术
糖基化是重要的蛋白翻译后修饰，涉及生物体内的生长、分化、炎症等过程。岩藻糖是聚糖链中的重要碳水化合物之一，岩藻糖基化是在岩藻糖基转移酶的催化下，将岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到其底物的过程。岩藻糖基化转移酶(FUT)通常参与末端聚糖结构的合成，因此，将岩藻糖残基转移到聚糖被认为是糖基化过程的终点。根据岩藻糖在聚糖连接位置，岩藻糖基化分为核心岩藻糖基化和支链岩藻糖基化。FUT可催化血液H和路易斯抗原的生物合成、选择素介导的白细胞渗出、宿主-病原体相互作用以及信号通路的修饰等过程。
异常岩藻糖糖基化修饰在疾病的发生和发展过程中发挥了重要的作用，因此可以作为诊断或预后的疾病生物标志物。异常岩藻糖糖基化通常与岩藻糖糖转移酶和岩藻糖苷酶的表达密切相关，许多疾病存在岩藻糖基化的异常改变的现象，包括肺癌、肝癌、口腔癌和阿尔兹海默症等。例如甲胎蛋白异常岩藻糖糖基化是美国食品药品监督管理局(FDA)批准作为肝细胞癌的生物标志物。因此，通过从复杂蛋白样本中富集岩藻糖糖蛋白并检测岩藻糖结构和表达，可以作为疾病特异性生物标志物，也可以显示疾病的进展和预后状况。目前富集岩藻糖基化蛋白质的方法主要有凝集素富集，例如AAL、UEAI、LCA和AAO凝集素等常用于富集岩藻糖糖基化蛋白质，但具有凝集素方法特异性差和灵敏度低等缺点。目前缺乏一种高效便捷的方法能够富集岩藻糖糖蛋白质及分析特异链接岩藻糖糖蛋白结构和丰度。
因此，有必要研发一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法来解决现有技术中鉴定岩藻糖糖蛋白标志物的问题。
发明内容
本发明目的是提供一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法。
本发明的一种技术方案是：
一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，包括步骤：
1)唾液蛋白、细胞蛋白或组织蛋白的提取；
2)蛋白多肽和糖肽制备；
3)核心岩藻糖糖基化糖蛋白富集或支链岩藻糖糖基化糖蛋白富集；
4)质谱分析。
进一步的，在步骤2)中，所述蛋白多肽和糖肽制备包括：
(1)蛋白酶解：
①根据测定浓度取蛋白溶于尿素中，轻微振荡，直至蛋白完全溶解，获得样品；
②向所述样品中加入二硫苏糖醇，孵育；
③向所述样品中加入碘乙酰胺，避光于室温孵育；
④向所述样品中加入二硫苏糖醇，孵育，以淬灭剩余未反应的碘乙酰胺；
⑤向所述样品中加入HPLC水，调节所述样品的pH为8-9；
⑥添加胰蛋白酶，孵育过夜，获得样品溶液；
(2)多肽纯化：
①在所述样品溶液中加入三氟乙酸，直至pH下调至2-3；
②将所述样品溶液加入预先处理的C18萃取柱中，重复操作多次；
③使用三氟乙酸多次清洗所述C18萃取柱；
④在所述样品溶液中加入三氟乙酸，直至pH下调至2-3，重复多次，获得多肽；
⑤将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化后的多肽样品。
进一步的，在步骤(1)的①中，所述蛋白的起始浓度为6-8ug/ul。
进一步的，在步骤(1)的⑤中，所述样品中尿素的浓度＜1.6M。
进一步的，在步骤(1)的⑥中，所述胰蛋白酶与样品的质量比为1：50-1： 100。
进一步的，在步骤3)中，所述核心岩藻糖糖基化糖蛋白富集包括：获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽或富集核心岩藻糖糖基化糖肽两种方式。
进一步的，所述获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽包括：
(a)Endo H和Endo F3酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入GlycoBuffer 3缓冲液，再加入糖苷内切酶H和的糖苷酶切酶F3混合酶，孵育过夜，获得混合物；
(b)糖肽氧化和固相结合：
①向所述混合物中加入高碘酸钠避光反应，获得氧化后的样本；
②向所述样本中加入TFA；
③用C18柱子纯化所述样本，获得纯化后的样本；
④取酰肼树脂加入至离心管中，再加入去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次，获得处理后的酰肼树脂；
⑤将所述纯化后的样本与所述处理后的酰肼树脂反应，获得样品；
(c)岩藻糖苷酶酶切：向所述样品中加入GlycoBuffer 1缓冲液，再加入α1-2,4,6岩藻糖苷酶，孵育，涡旋离心并收集液体，再使用含有TFA的ACN多次洗脱并收集液体，将收集的液体合并，真空冷冻干燥，获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽。
进一步的，所述富集核心岩藻糖糖基化糖肽包括：
(a)Endo M酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入NH 4HCO 3缓冲液和Endo M酶，孵育过夜，真空冷冻干燥，获得样品；
(b)亲水相互作用色谱：
①将所述样品溶解于含有TFA的ACN中。
②将所述样品加入预先处理的Amide-80色谱柱中，重复操作多次；
③使用含有TFA的ACN清洗萃取柱多次；
④使用60％含有0.1％TFA的ACN、40％含有0.1％TFA的ACN和0.1％TFA依次洗脱样品，并收集洗脱液；
⑤将所述洗脱液合并，真空冷冻干燥，获得核心岩藻糖糖基化糖肽。
进一步的，在步骤3)中，所述支链岩藻糖糖基化糖蛋白富集包括：
(a)α1-2,4,6岩藻糖苷酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入GlycoBuffer  1缓冲液，再加入α1-2,4,6岩藻糖苷酶O和半乳糖苷酶的混合酶，孵育过夜，获得混合物；
(b)糖肽氧化和固相结合：
①向所述混合物中加入高碘酸钠避光反应，获得氧化后的样本；
②向所述样本中加入TFA；
③用C18柱子纯化所述样本，获得纯化后的样本；
④取酰肼树脂加入至离心管中，再加入去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次，获得处理后的酰肼树脂；
⑤将所述纯化后的样本与所述处理后的酰肼树脂反应，获得样品；
(c)岩藻糖苷酶酶切：向所述样品中加入Tris-HCl，再加入α1-2,3,4岩藻糖苷酶，孵育后，涡旋离心并收集液体，再使用含有TFA的ACN洗脱多次并收集液体，将收集的液体合并，真空冷冻干燥样品，获得支链岩藻糖糖基化糖肽。
进一步的，在步骤4)中，所述质谱分析包括：将含岩藻糖糖基化位点的糖肽或核心岩藻糖糖基化糖肽或支链岩藻糖糖基化糖肽重新溶于含FA的ACN中，获得样品，将所述样品用液相色谱-质谱分析，获得一级和二级质谱，色谱流动相为10-50％ACN，质谱能量CE26-32，用结合生物信息学软件进行岩藻糖基化蛋白质和岩藻糖基化位点分析。
本发明提供了一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，能从复杂的蛋白多肽中，特异性富集岩藻糖并分析岩藻糖糖肽，应用广泛，如：可以从复杂的蛋白质样本中特异性富集岩藻糖糖基化蛋白质，并且可以进行定性和定量分析，提高了检测岩藻糖糖基化蛋白质的灵敏性和特异性，操作简便；可以用于任何生物样本岩藻糖糖基化蛋白质和岩藻糖糖基化位点分析；通过本方法可以进行岩藻糖糖基化相关疾病生物标志物分析，从而发现疾病早期诊断，发展，预后生物标志物；可以用于高通量处理和分析样本，提高样本处理效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，
图1为本发明中糖肽制备通过固相富集岩藻糖糖基化糖肽的工作流程示意图；
图2为本发明中采用Endo H和Endo F3酶切的示意图；
图3为本发明中岩藻糖，甘露糖，半乳糖氧化的示意图；
图4为本发明中采用岩藻糖苷酶酶切的工作流程示意图；
图5为本发明中采用Endo M酶切富集岩藻糖基化糖肽的工作流程示意图；
图6为本发明中使用岩藻糖苷酶和甘露糖苷酶酶切的示意图。
具体实施方式
本发明开发了一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，通过糖苷内切酶岩藻糖糖肽特异性反应，从复杂蛋白样本中富集岩藻糖糖蛋白质及分析岩藻糖糖蛋白结构和丰度，可以用作疾病诊断的生物标志物。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
最后，本发明中AAL是指苦橙叶凝集素；AAO是指米曲霉菌凝集素； UEAI是指乌木凝集素I；LCA是指晶状体凝集素。
实施例1
请参阅图1，图1为本发明中糖肽制备通过固相富集岩藻糖糖基化糖肽的工作流程示意图。如图1所示，一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法(SPFucE)，包括如下步骤：
1.蛋白提取：
(1)唾液收集及唾液蛋白的提取
在上午9点到11点收集受试者唾液。受试者被要求在收集之前至少一小时内避免进食、饮水、吸烟或使用任何口腔清洁产品。收集前5分钟，要求受试者用清水漱口2-3次，确保口腔清洁。在无刺激的情况下，收集自然分泌的全唾液，置于50ml离心管中。在10分钟内收集5毫升唾液。整个过程在冰上进行。收集完成后将唾液样本于4℃，12000rpm离心25分钟。弃掉沉淀，收集上清液，将上清液加入100X蛋白酶抑制剂，获得唾液蛋白。
或，
(2)细胞蛋白提取
980ul RIPA裂解液中加入10ul 100X蛋白酶抑制剂和10ul 100X磷酸酶抑制剂混合物，将细胞用1X PBS溶液清洗3次后加入1ml RIPA裂解液混合物，用细胞刮将细胞收集于EP管中(1.5-2.0ml离心管)，使用超声破碎仪在冰上破碎30s，在冰上冷却30s，重复操作4-6次。将EP管于离心机上离心(4℃，12000rpm，15min)，取上清，获得细胞蛋白。
或，
(3)组织蛋白提取
取100mg生物组织于EP管中，用PBS冲洗3次，加入RIPA裂解液混合物200ul，用研磨或其它方式将组织捣碎，然后于超声破碎仪在冰上破碎30s，在冰上冷却30s，重复操作4-6次。将EP管于离心机上离心(4℃,12000rpm，15min)，取上清，获得组织蛋白。
从(1)、(2)或(3)中，取2-4微升蛋白，稀释5-10倍，用BCA测试蛋白的浓度。
2.蛋白多肽和糖肽制备
(1)蛋白酶解
①根据测定浓度取200ug-2000ug的蛋白溶于8M尿素，轻微振荡，直至蛋白完全溶解，获得样品(建议蛋白起始浓度在6-8ug/ul)；
②向样品中加入总体积1/10的100mM二硫苏糖醇，37℃孵育30分钟；
③向样品中加入总体积1/10的160mM碘乙酰胺，避光于室温孵育30-60min；
④再向样品中加入总体积1/10的100mM二硫苏糖醇，37℃孵育30分钟，以淬灭剩余未反应的碘乙酰胺；
⑤向样品中加入5-10倍体积HPLC水(使得样品中尿素的浓度＜1.6M)，再使用现配1M NH 4HCO 3去调节溶液的pH为8-9；
⑥以1：50-1：100的胰蛋白酶-样品蛋白质量比添加胰蛋白酶(Promega,Madison,WI,美国)，并在37℃条件下，孵育过夜，获得样品溶液。
(2)多肽纯化
①在样品溶液中加入三氟乙酸(TFA，>99％，w/v)，直至pH下调至2-3；
②将样品溶液加入预先处理的C18萃取柱中，重复操作2次；
③使用1mL的0.1％三氟乙酸(TFA，100mL HPLC水中加入100uL三氟乙酸)清洗萃取柱4-6次；
④在样品溶液中加入三氟乙酸(TFA，>99％，w/v)，直至pH下调至2-3，重复2次，获得多肽；
⑤将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化的多肽样品。
3.核心岩藻糖基化糖蛋白富集或支链岩藻糖基化糖蛋白富集
(1)核心岩藻糖基化糖蛋白富集
方法一：获得含岩藻糖基化位点的糖肽
(a)Endo H和Endo F3酶切，(请参阅图2，图2为本发明中采用Endo H和Endo F3酶切的示意图。在图中，实心方形代表N-乙酰氨基葡萄糖胺，阴影方形代表N-乙酰半乳糖胺，实心圆形代表半乳糖，阴影圆形代表为甘露糖，实心三角形代表岩藻糖，如图2所示，Endo H和Endo F3可以水解样品糖肽中含或不含核心岩藻糖基化糖肽中两个N-乙酰氨基葡萄糖胺之间的β(1,4)糖苷键。)本步骤具体如下：
向纯化后的多肽样品中加入1X GlycoBuffer 3缓冲液(最佳反应条件为20ug糖肽与10ul 1X GlycoBuffer缓冲液形成10ul的总反应体积)(New England BioLabs,MA，美国)，再加入10-15U的糖苷内切酶H(Endo H)(New England BioLabs,MA，美国)和10-15U的糖苷酶切酶F3(Endo F3)(New England BioLabs,MA，美国)混合酶(每20ug糖肽加入10-15U糖苷内切酶H和10-15U糖苷内切酶F3)，37℃，孵育过夜，获得混合物。
(b)糖肽氧化和固相结合，(请参阅图3，图3为本发明中岩藻糖，甘露糖，半乳糖氧化的示意图，其中，a为岩藻糖，b为甘露糖，c为半乳糖，如图3所示，这三种单糖的邻二醇结构可以被高碘酸钠氧化为邻二醛结构。)本步骤具体如下：
①向混合物中加入10mM高碘酸钠避光反应1小时，获得氧化后的样
本；
②向样本中加入10倍0.1％TFA；
③用C18柱子纯化样本；
④取100-150ul酰肼树脂(Thermo Fisher Scientific,MA,美国)，加入到1.5-2.0毫升离心管，加入450-550ul去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次；
⑤将第③步纯化后的样本与经第④步处理后的酰肼树脂在室温反应4h。
(c)岩藻糖苷酶酶切，(请参阅图4，图4为本发明中采用岩藻糖苷酶酶切的工作流程示意图。在图中实心方形代表N-乙酰氨基葡萄糖胺，阴影方形代表N-乙酰半乳糖胺，阴影圆形代表为甘露糖，实心圆形-NH-NH 2代表酰肼树脂，曲线状结构代表肽段。如图4所示，岩藻糖的邻二醇被氧化为临二醛后，与酰肼树脂结合。通过a1-2，4，6岩藻糖苷酶酶切后可以从酰肼树脂释放得到含岩藻糖基化位点的肽段。)本步骤具体如下：
向样品中加入200微升的1X GlycoBuffer 1缓冲液，再加入20-30U的α1-2,4,6岩藻糖苷酶(New England BioLabs,MA，美国)，37℃，孵育2h后，涡旋离心并收集液体。再使用50％ACN(0,1％TFA)洗脱两次并收集液体。将两次收集的液体合并，真空冷冻干燥样品，获得含岩藻糖基化位点的肽段。
方法二：富集核心岩藻糖基化糖肽，(请参阅图5，图5为本发明中采 用Endo M酶切富集岩藻糖基化糖肽的工作流程示意图。在图中深色方形代表N-乙酰氨基葡萄糖胺，浅色方形代表N-乙酰半乳糖胺，实心圆形代表半乳糖，阴影圆形代表甘露糖，三角形代表岩藻糖，曲线状结构代表肽段。如图5所示，Endo M可以水解样品糖肽中不含核心岩藻糖基化糖肽中两个N-乙酰氨基葡萄糖胺之间的β(1，4)糖苷键。)本步骤具体如下：
(a)Endo M酶切
向纯化后的多肽样品中加入200-250微升25mM NH 4HCO 3(PH:7-9)缓冲液、以及2微升Endo M酶，37℃孵育过夜，真空冷冻干燥样品。
(b)亲水相互作用色谱(HILIC)
①将样品溶解于500ul 80％ACN(0.1％TFA)中。
②将样品加入预先处理的Amide-80色谱柱(用1.0-1.2毫升的TFA和80％含有0.1％TFA的CAN分别处理三次后)中，重复操作2次；
③使用80％含有0.1％TFA的ACN清洗萃取柱3次(1.0-1.2毫升)；
④使用400-500微升60％含有0.1％TFA的ACN、400-500微升40％含有0.1％TFA的ACN和400-500微升0.1％TFA依次洗脱样品并收集洗脱液；
⑤将洗脱液合并真空冷冻干燥样品。
(2)富集支链岩藻糖基化糖肽
(a)α1-2,4,6岩藻糖苷酶切
向2(2)⑤中得到的纯化后的多肽样品中加入一定量的GlycoBuffer 1缓冲液(最佳反应条件为20ug糖肽与10ul 1X GlycoBuffer缓冲液形成10ul的总反应体积)(New England BioLabs,MA，美国)，再加入4-40U的α1-2,4,6岩藻糖苷酶O(New England BioLabs,MA，美国)(每20ug糖肽加入4-6U的α1-2,4,6岩藻糖苷酶O)和70-100U半乳糖苷酶(New England BioLabs,MA，美国)(每1ug糖肽加入7-10U的半乳糖苷酶)混合酶，37℃，孵育过夜，获得混合物。(请参阅图6，图6为本发明中使用岩藻糖苷酶和甘露糖苷酶酶切的示意图，在图中实心方形代表N-乙酰氨基葡萄糖胺，阴影方形代表N-乙酰半乳糖胺，实心圆形代表半乳糖，阴影圆形代表甘露糖，三角形代表岩藻糖。如图6所示，经过a1-2,4,6岩藻糖苷酶和甘露糖苷酶水解后，可以得到只含有a1-3岩藻糖基化的糖肽。
(b)糖肽氧化和固相结合：
①向混合物中加入10mM高碘酸钠避光反应1小时，获得氧化后的样本；
②向样本中加入10倍0.1％TFA；
③用C18柱子纯化样本；
④取100-150ul酰肼树脂(Thermo Fisher Scientific,MA,美国)，加入到1.5-2.0毫升离心管，加入450-550ul去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次；
⑤将第③步纯化后的样本与经第④步处理后的酰肼树脂在室温反应4h。
(c)岩藻糖苷酶酶切
向样品中加入200微升的20mM Tris-HCl(PH＝6.8)，再加入20-30U的α1-2,3,4岩藻糖苷酶(Genovis)，37℃，孵育2h后，涡旋离心并收集液体。再使用50％ACN(0,1％TFA)洗脱两次并收集液体。将两次收集的液体合并，真空冷冻干燥样品，获得含岩藻糖基化位点的肽段。
4.质谱分析(LC-MS/MS)
将第三步富集得到的含岩藻糖基化位点的肽段或核心岩藻糖基化糖肽或支链岩藻糖基化糖肽样品重新溶于50％ACN(0.2％FA)；
将样品用液相色谱-质谱分析，获得一级和二级质谱；
色谱流动相为10-50％ACN，质谱能量CE26-32，用结合生物信息学软件进行岩藻糖基化蛋白质和岩藻糖基化位点分析。
实施例2
富集肺癌患者与健康受试者唾液或组织中岩藻糖基化蛋白质
LC/MS结果分析使用MaxQuant软件和GlycReSoft软件。可以鉴定出肺癌患者和健康受试者特有的岩藻糖基化蛋白质。采用TMT或IBT标记糖肽后，可以通过定量分析不同分期的肺癌患者与健康受试者之间岩藻糖基化蛋白的表达差异，开发合适的糖蛋白标志物，通过简便的方法检测肺癌患者分期的特异性和敏感性。
实施例3
富集肺癌细胞与正常肺上皮细胞中岩藻糖基化蛋白质
岩藻糖基化修饰在不同癌症细胞中普遍上调，使用SPFucE鉴定出肺癌细胞和正常肺上皮细胞之间的特有的岩藻糖基化蛋白质。使用岩藻糖基化抑 制剂处理细胞后并采用TMT或IBT标记，定量分析肺癌细胞和健康肺上皮细胞之间岩藻糖基化蛋白质变化并分析识别受岩藻糖基化影响的信号通路。对信号通路相关上下游调节因子进行分析，对于未来鉴定肺癌中潜在药物靶点具有重要意义。
实施例4
富集肺癌肺泡灌洗液与非癌症肺泡灌洗液的岩藻糖糖蛋白
肺泡灌洗液对研究肺部疾病标志物和发现疾病相关分子尤其重要。支气管肺泡灌洗液(BALF)用于从肺部收集样本进行测试。在此过程中，将盐溶液通过支气管镜以清洗气道并采集液体样本。BALF在对特定形式的间质性肺病进行准确和自信的诊断方面可以发挥重要作用。当BALF与全面的临床信息和高分辨率计算机断层扫描结合使用时，BALF有核免疫细胞模式通常可以为诊断评估提供有用的信息，并减少进行更具侵入性的操作的需要，例如外科肺活检。支气管肺泡灌洗液已被广泛用于识别肺部疾病的生物标志物。采用本发明，可发现肺泡灌洗液中与肺癌或者炎症相关的岩藻糖糖蛋白标志物
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于固相岩藻糖蛋白富集及岩藻糖基化酶切分析的方法，对发现疾病细胞、临床组织和人体体液标本中具有岩藻糖基化的疾病标志物，以及疾病早期诊断和预后标志物的研究等方面有着重要意义。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

  1. 一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，包括步骤：
    1)唾液蛋白、细胞蛋白或组织蛋白的提取；
    2)蛋白多肽和糖肽制备；
    3)核心岩藻糖基化糖蛋白富集或支链岩藻糖基化糖蛋白富集；
    4)质谱分析。
  2. 根据权利要求1所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述蛋白多肽和糖肽制备包括：
    (1)蛋白酶解：
    ①根据测定浓度取蛋白溶于尿素中，轻微振荡，直至蛋白完全溶解，获得样品；
    ②向所述样品中加入二硫苏糖醇，孵育；
    ③向所述样品中加入碘乙酰胺，避光于室温孵育；
    ④向所述样品中加入二硫苏糖醇，孵育，以淬灭剩余未反应的碘乙酰胺；
    ⑤向所述样品中加入HPLC水，调节所述样品的pH为8-9；
    ⑥添加胰蛋白酶，孵育过夜，获得样品溶液；
    (2)多肽纯化：
    ①在所述样品溶液中加入三氟乙酸，直至pH下调至2-3；
    ②将所述样品溶液加入预先处理的C18萃取柱中，重复操作多次；
    ③使用三氟乙酸多次清洗所述C18萃取柱；
    ④在所述样品溶液中加入三氟乙酸，直至pH下调至2-3，重复多次，获得多肽；
    ⑤将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化后的多肽样品。
  3. 根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(1)的①中，所述蛋白的起始浓度为6-8ug/ul。
  4. 根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(1)的⑤中，所述样品中尿素的浓度＜1.6M。
  5. 根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于：在步骤(1)的⑥中，所述胰蛋白酶与样品的质量比为1：50-1：100。
  6. 根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述核心岩藻糖基化糖蛋白富集包括：获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽或富集核心岩藻糖糖基化糖肽两种方式。
  7. 根据权利要求6所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，所述获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽包括：
    (a)Endo H和Endo F3酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入GlycoBuffer 3缓冲液，再加入糖苷内切酶H和的糖苷酶切酶F3混合酶，孵育过夜，获得混合物；
    (b)糖肽氧化和固相结合：
    ①向所述混合物中加入高碘酸钠避光反应，获得氧化后的样本；
    ②向所述样本中加入TFA；
    ③用C18柱子纯化所述样本，获得纯化后的样本；
    ④取酰肼树脂加入至离心管中，再加入去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次，获得处理后的酰肼树脂；
    ⑤将所述纯化后的样本与所述处理后的酰肼树脂反应，获得样品；
    (c)岩藻糖苷酶酶切：向所述样品中加入GlycoBuffer 1缓冲液，再加入α1-2,4,6岩藻糖苷酶，孵育，涡旋离心并收集液体，再使用含有TFA的ACN多次洗脱并收集液体，将收集的液体合并，真空冷冻干燥，获得含岩藻糖糖基化位点的糖肽。
  8. 根据权利要求6所述的一种基于固相岩藻糖蛋白富集及岩藻糖基化酶切分析的方法，其特征在于，所述富集核心岩藻糖基化糖肽包括：
    (a)Endo M酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入NH 4HCO 3缓冲液和Endo M酶，孵育过夜，真空冷冻干燥，获得样品；
    (b)亲水相互作用色谱：
    ①将所述样品溶解于含有TFA的ACN中。
    ②将所述样品加入预先处理的Amide-80色谱柱中，重复操作多次；
    ③使用含有TFA的ACN清洗萃取柱多次；
    ④使用60％含有0.1％TFA的ACN、40％含有0.1％TFA的ACN和0.1％TFA依次洗脱样品，并收集洗脱液；
    ⑤将所述洗脱液合并，真空冷冻干燥，获得核心岩藻糖基化糖肽。
  9. 根据权利要求2所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述支链岩藻糖糖基化糖蛋白富集包括：
    (a)α1-2,4,6岩藻糖苷酶切：向所述纯化后的多肽样品中加入GlycoBuffer1缓冲液，再加入α1-2,4,6岩藻糖苷酶O和半乳糖苷酶的混合酶，孵育过夜，获得混合物；
    (b)糖肽氧化和固相结合：
    ①向所述混合物中加入高碘酸钠避光反应，获得氧化后的样本；
    ②向所述样本中加入TFA；
    ③用C18柱子纯化所述样本，获得纯化后的样本；
    ④取酰肼树脂加入至离心管中，再加入去离子水预处理，去掉过滤液，重复操作两次，获得处理后的酰肼树脂；
    ⑤将所述纯化后的样本与所述处理后的酰肼树脂反应，获得样品；
    (c)岩藻糖苷酶酶切：向所述样品中加入Tris-HCl，再加入α1-2,3,4岩藻糖糖苷酶，孵育后，涡旋离心并收集液体，再使用含有TFA的ACN洗脱多次并收集液体，将收集的液体合并，真空冷冻干燥样品，获得支链岩藻糖糖基化糖肽。
  10. 根据权利要求7、8、9中的任意一项所述的一种基于固相岩藻糖糖蛋白富集及岩藻糖糖基化酶切分析的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述质谱分析包括：将含岩藻糖基化位点的糖肽或核心岩藻糖糖基化糖肽或支链岩藻糖糖基化糖肽重新溶于含FA的ACN中，获得样品，将所述样品用液相色谱-质谱分析，获得一级和二级质谱，色谱流动相为10-50％ACN，质谱能量CE26-32，用结合生物信息学软件进行岩藻糖糖基化蛋白质和岩藻糖糖基化位点分析。
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