WO2023171671A1 - 環状アミドの製造方法 - Google Patents

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WO2023171671A1
WO2023171671A1 PCT/JP2023/008594 JP2023008594W WO2023171671A1 WO 2023171671 A1 WO2023171671 A1 WO 2023171671A1 JP 2023008594 W JP2023008594 W JP 2023008594W WO 2023171671 A1 WO2023171671 A1 WO 2023171671A1
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cyclic
reaction
manufacturing
cyclic peptide
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PCT/JP2023/008594
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新一郎 布施
乙華 社本
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国立大学法人東海国立大学機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/12—Cyclic peptides with only normal peptide bonds in the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cyclic amide.
  • Cyclic amides represented by ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, etc. are the 15th and 42nd most common structures among the 351 types of ring structures contained in commercially available pharmaceuticals (for example, see Non-Patent Document 1). ). Furthermore, among cyclic amides, cyclic peptides having multiple amide bonds have higher metabolic stability and target selectivity than non-cyclic peptides, and are therefore useful for drugs such as antibacterial agents, immunosuppressants, and antitumor agents. It is known to be useful as Therefore, there is a need for a simple method for synthesizing cyclic amides and cyclic peptides.
  • a phosphonium-based peptide condensing agent such as hexafluorophosphate (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium (PyBOP) is used as a method for synthesizing a cyclic peptide
  • head-to-tail synthesis is possible. It is known that it is easy to obtain a target peptide while avoiding side reactions in a cyclization reaction (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • such phosphonium-based peptide condensing agents are more expensive than common condensing agents, and also have the problem of generating large amounts of impurities derived from the condensing agent.
  • Non-Patent Document 4 As a method for synthesizing cyclic peptides, the present inventors have reported that cyclic peptides can be synthesized in higher yields than conventional synthesis methods when inexpensive and highly active triphosgene is used as a condensing agent (e.g. , see Non-Patent Document 4). However, with the method of Non-Patent Document 4, it is not possible to obtain a cyclic peptide with a sufficient yield depending on the substrate. Therefore, it cannot be said to be an excellent method for synthesizing cyclic peptides that can cyclize a wide variety of peptides.
  • Non-Patent Documents 5 and 6 As a method for synthesizing a cyclic peptide, there are reports using ethyl chloroformate, which is cheaper than triphosgene, as a condensing agent (for example, see Non-Patent Documents 5 and 6). However, Non-Patent Documents 5 and 6 only report that specific peptides can be cyclized, and no cyclic peptides have been obtained in sufficiently high yields. In addition, there are reports of methods for synthesizing cyclic peptides using isobutyl chloroformate as a condensing agent (for example, see Non-Patent Documents 7 to 9).
  • Non-Patent Document 8 shows that a certain type of cyclic peptide can be synthesized in a higher yield than when using ethyl chloroformate
  • Non-Patent Document 9 almost the same conditions as in Non-Patent Document 8 are used for other substrates. It is clear that the yield is significantly reduced when applied to Furthermore, in Non-Patent Documents 5 to 9, attempts have been made to improve the yield even slightly by performing the cyclization reaction under low temperature conditions over a long period of time. It is not something that can be synthesized.
  • the present invention was made in view of the current state of the prior art described above, and its main purpose is to provide a method for producing various cyclic amides by cyclizing them in a short time using an inexpensive condensing agent. purpose.
  • the present inventors have conducted extensive research in order to achieve the above objectives. As a result, by selecting a specific condensing agent and a specific tertiary amine compound, various acyclic compounds having terminal amino groups and carboxyl groups can be cyclized in a short time using an inexpensive condensing agent. We found that a wide variety of cyclic amides can be obtained. Based on such knowledge, the present inventors conducted further research and completed the present invention. That is, the present invention includes the following configurations.
  • R represents an optionally substituted divalent organic group. R may form a ring together with adjacent nitrogen atoms.
  • R A represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group.
  • R 1 , R 2 and R 3 are the same or different and represent an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted heteroaryl group. Alternatively, two or more of R 1 , R 2 and R 3 may be linked to form a ring (excluding a pyridine ring) which may have one or more heteroatoms or substituents. good.
  • a manufacturing method including a step of reacting with a tertiary amine compound represented by (excluding tributylamine, diisopropylethylamine and triethylamine).
  • Section 2. The manufacturing method according to Item 1, wherein R is a divalent hydrocarbon group that may have an amide bond and/or a substituent.
  • R A is the same as above. Two or more R A 's may be the same or different.
  • R C , R N and R P are the same or different and represent a divalent organic group. R C , R N and R P may each form a ring together with adjacent nitrogen atoms.
  • n represents an integer of 0 or more. However, when n is an integer of 2 or more, n R Ps may be the same or different.
  • a cyclic peptide represented by The cyclic amide precursor has the general formula (2a):
  • Item 3 The manufacturing method according to Item 1 or 2, which is a cyclic peptide precursor represented by:
  • Item 4. The manufacturing method according to Item 3, wherein R C , R N and R P are the same or different and are divalent hydrocarbon groups which may have a substituent.
  • Section 5 The manufacturing method according to item 3 or 4, wherein n is an integer of 2 or more.
  • Item 5 The manufacturing method according to any one of Items 1 to 5, wherein the X is a chlorine atom.
  • Item 7 The production method according to any one of Items 1 to 6, wherein Y is a branched alkyl group.
  • Section 8. The manufacturing method according to any one of Items 1 to 7, wherein Y is an isopropyl group.
  • Item 9 The manufacturing method according to any one of Items 1 to 8, wherein at least one of R 1 , R 2 and R 3 is a methyl group.
  • Item 10 The manufacturing method according to any one of Items 1 to 9, wherein at least two of R 1 , R 2 and R 3 are methyl groups.
  • Item 11 The production method according to any one of Items 1 to 10, wherein the reaction step is performed in a solvent containing an aprotic polar solvent.
  • Section 12. The production method according to any one of Items 1 to 11, wherein the reaction temperature in the reaction step is 0 to 100°C.
  • Section 13 The production method according to any one of Items 1 to 12, wherein the reaction time of the reaction step is less than 10 minutes.
  • Item 14 The production method according to any one of Items 1 to 13, wherein the reaction step is performed by a flow method.
  • Item 15 The production method according to any one of Items 1 to 14, wherein the reaction step is performed by a microflow method.
  • various cyclic amides can be synthesized in a short time by reacting a cyclic amide precursor, a specific condensing agent, and a specific tertiary amine compound.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the general configuration of a microflow reactor.
  • Cyclic peptide 16 (Versicotide D analog; L-MeAla-L-Phe-L-MeAla-L-Phe-L-Ala) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 obtained in Example 9-1.
  • Example 9-2 is a chromatogram of its epimer, cyclic peptide 17 (Versicotide D analogue epimer) represented by SEQ ID NO: 7 obtained in Example 9-2 (Column: GLscience InertsilTM ODS-3 5 ⁇ m, 4.6 mm ⁇ 75mm, solvent: methanol + 0.1% formic acid/H 2 O + 0.1% formic acid (0-13 minutes: 0-100%, 13-16 minutes: 100%, 16-17 minutes: 0%, 17-22 minutes :0%), flow rate: 1.0 mL/min, detection wavelength: 254 nm, temperature: 40°C).
  • the method for producing a cyclic amide of the present invention includes a step of reacting a cyclic amide precursor, a condensing agent, and a tertiary amine compound.
  • the activated C-terminus carboxyl group and the other terminal amino group (hereinafter referred to as the "C-terminus") can be activated. It is considered that the cyclization reaction with the N-terminus (referred to as "N-terminus”) can also proceed rapidly. In this case, since the reaction is carried out under near-neutral conditions in a short time, the method of the present invention can be applied to a variety of substrates. Furthermore, the method of the present invention can avoid epimerization and dimerization associated with cyclization.
  • the C-terminus of the cyclic amide precursor can be selectively activated. , it is possible to obtain a cyclic amide in high yield.
  • the microflow method when the microflow method is used, by appropriately selecting the condensing agent and the base, a yield that is unimaginable with conventional peptide synthesis methods (>99%) can be achieved. It is also possible to quantitatively obtain cyclic peptides.
  • Cyclic amide The cyclic amide that is the object of the present invention has the general formula (1):
  • R represents an optionally substituted divalent organic group. R may form a ring together with adjacent nitrogen atoms.
  • R A represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group. It is a compound represented by
  • the group represented by R is an optionally substituted divalent organic group.
  • the divalent organic group represented by R is preferably a divalent hydrocarbon group that may have an amide bond and/or a substituent, and the hydrocarbon group may be substituted, for example.
  • Examples include an alkyl group and an optionally substituted aryl group.
  • the alkyl group represented by R is not particularly limited and includes, for example, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms (especially 1 to 6 carbon atoms) such as a methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, and n-pentyl group.
  • branched alkyl groups having 3 to 10 carbon atoms such as isopropyl, isobutyl, sec-butyl, and tert-butyl, and, for example, cyclopentyl
  • cyclic alkyl groups having 3 to 10 carbon atoms especially 5 to 8 carbon atoms
  • cyclohexyl group and cyclohexyl group especially 5 to 8 carbon atoms
  • the aryl group represented by R is not particularly limited, and any of a monocyclic aryl group, a condensed aryl group, and a polycyclic aryl group can be employed, such as a phenyl group, a naphthyl group, an anthracenyl group, a phenanthrenyl group, and a biphenyl group. , terphenyl group (any of o-terphenyl group, m-terphenyl group, and p-terphenyl group can be adopted. The same applies hereinafter), fluorenyl group, pyrenyl group, triphenylenyl group, etc. having 6 or more carbon atoms. 18 aryl groups (particularly 6 to 14) are mentioned.
  • the amide bond of the hydrocarbon group represented by R may be substituted with a hydrogen atom.
  • the hydrocarbon group represented by R may have a substituent.
  • substituents include, without particular limitation, hydroxyl group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.), the above alkyl group, the above aryl group, alkoxy group, carboxyl group, amino group, etc. It will be done.
  • the number of substituents, if any, is not particularly limited and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • the substituent of the hydrocarbon group represented by R may have a protecting group.
  • a protecting group any known protecting group can be employed, such as an alkyl-type protecting group such as a triphenylmethyl group (Trt); a silyl-type protecting group such as a tert-butyldimethylsilyl group (TBS).
  • Aryl type protecting groups such as p-methoxybenzyl group (PMB) and p-methoxyphenyl group (PMP); Amide type protecting groups such as formyl group and acetyl group (Ac); Phthalimide type protection such as phthaloyl group (Phth) Group; benzyloxycarbonyl group (Cbz), tert-amyloxycarbonyl group (Aoc), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc), tert-butyloxycarbonyl group (Boc), allyloxycarbonyl group (Alloc), Carbamate type protecting groups such as 2,2,2-triethoxycarbonyl group (Troc); 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group (Npys), 2-nitrobenzenesulfonyl group (Ns), (2-trimethylsilyl)-ethane Examples include sulfonamide type protecting groups such as sulfonyl group (SMB
  • the number of protecting groups, if present, is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • R A is a hydrogen atom or a hydrocarbon group.
  • Examples of the hydrocarbon group represented by R A include an alkyl group and an aryl group.
  • the alkyl group represented by R A is not particularly limited, and includes, for example, methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, etc. having 1 to 10 carbon atoms (especially 1 to 6 carbon atoms).
  • branched alkyl groups having 3 to 10 carbon atoms (especially 3 to 6 carbon atoms) such as isopropyl group, isobutyl group, sec-butyl group, and tert-butyl group can also be mentioned.
  • the aryl group represented by R A is not particularly limited, and any of a monocyclic aryl group, a condensed aryl group, and a polycyclic aryl group can be employed, such as phenyl group, naphthyl group, anthracenyl group, phenanthrenyl group, and biphenyl group.
  • Examples include aryl groups having 6 to 18 carbon atoms (especially 6 to 14 carbon atoms) such as terphenyl group, fluorenyl group, pyrenyl group, and triphenylenyl group.
  • the cyclic amide that is the object of the present invention is a cyclic peptide
  • the cyclic amide that is the object of the present invention has the general formula (1a):
  • R A is the same as above. Two or more R A 's may be the same or different.
  • R C , R N and R P are the same or different and represent a divalent organic group.
  • R C , R N and R P may each form a ring together with adjacent nitrogen atoms.
  • n represents an integer of 0 or more. However, when n is an integer of 2 or more, n R Ps may be the same or different.
  • R C , R N and R P are the same or different and are divalent organic groups.
  • the divalent organic groups represented by R C , R N and R P are preferably divalent hydrocarbon groups which may have a substituent, and examples of the hydrocarbon group include unsubstituted Examples include an optionally substituted alkyl group and an optionally substituted aryl group.
  • the alkyl groups represented by R C , R N and R P are not particularly limited, and include those having 1 to 10 carbon atoms such as methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, and n-pentyl group.
  • linear alkyl groups especially 1 to 6
  • branched alkyl groups having 3 to 10 carbon atoms especially 3 to 6
  • isopropyl isobutyl, sec-butyl, and tert-butyl groups.
  • cyclic alkyl groups having 3 to 10 carbon atoms (especially 5 to 8 carbon atoms) such as cyclopentyl and cyclohexyl groups.
  • the aryl group represented by R C , R N and R P is not particularly limited, and any of a monocyclic aryl group, a condensed aryl group, and a polycyclic aryl group can be adopted, such as a phenyl group, a naphthyl group, an anthracenyl group, etc.
  • Examples include aryl groups having 6 to 18 carbon atoms (especially 6 to 14 carbon atoms) such as phenanthrenyl group, biphenyl group, terphenyl group, fluorenyl group, pyrenyl group, and triphenylenyl group.
  • the hydrocarbon groups represented by R C , R N and R P may have a substituent.
  • substituents include, without particular limitation, hydroxyl group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.), the above alkyl group, the above aryl group, alkoxy group, carboxyl group, amino group, etc. It will be done.
  • the number of substituents, if any, is not particularly limited and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • the substituents of the hydrocarbon groups represented by R C , R N and R P may have a protecting group.
  • any known protecting group can be employed, such as an alkyl-type protecting group such as a triphenylmethyl group (Trt); a silyl-type protecting group such as a tert-butyldimethylsilyl group (TBS).
  • Aryl type protecting groups such as p-methoxybenzyl group (PMB) and p-methoxyphenyl group (PMP); Amide type protecting groups such as formyl group and acetyl group (Ac); Phthalimide type protection such as phthaloyl group (Phth) Group; benzyloxycarbonyl group (Cbz), tert-amyloxycarbonyl group (Aoc), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc), tert-butyloxycarbonyl group (Boc), allyloxycarbonyl group (Alloc), Carbamate type protecting groups such as 2,2,2-triethoxycarbonyl group (Troc); 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group (Npys), 2-nitrobenzenesulfonyl group (Ns), (2-trimethylsilyl)-ethane Examples include sulfonamide type protecting groups such as sulfonyl group (SMB
  • the number of protecting groups, if present, is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • the method of the present invention attempts to synthesize a cyclic peptide using a non-cyclic peptide as a cyclic peptide precursor, and R C , R N
  • the groups represented by and R P correspond to the groups represented by R C , R N and R P that the non-cyclic peptide has. From this, the groups represented by R C , R N and R P constitute an amino acid together with the adjacent amino group and carboxyl group, and are preferably amino acid residues.
  • amino acid residue refers to a divalent group obtained by removing an amino group and a carboxyl group from an amino acid having an amino group and a carboxyl group in one molecule.
  • the amino acid residues represented by R C , R N and R P are the C-terminal amino acid residue, N-terminal amino acid residue, and non-terminal amino acid residue of the cyclic peptide precursor, respectively, which will be described later. Originates from In addition, since a cyclic peptide consists of a repeating structure of mutually equal amino acid residues and peptide bonds, the amino acid residues represented by R C , R N and R P are mutually equal. That is, determining the amino acid residues represented by R C , R N and R P in a cyclic peptide is equivalent to determining the position of a peptide bond formed by cyclization by the method of the present invention.
  • the amino acid residues represented by R C , R N and R P should be selected appropriately, taking into consideration the reactivity (that is, ease of cyclization) of the C-terminus and N-terminus of the derived cyclic peptide precursor. is preferred.
  • an amino acid residue that is easily activated when used as the C-terminal amino acid residue of the cyclic peptide precursor can be designated as R C
  • the N-terminal amino acid residue that tends to attack and cyclize amino acid residues can be designated as RN .
  • both natural amino acid residues and synthetic amino acid residues can be employed as the amino acid residues represented by R C , R N and R P , such as glycine (Gly), alanine, etc. (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (ILE), phenylalanine (Phe), serine (Ser), threonine (Thr), lysine (Lys), 5-hydroxylysine (Hyl), arginine (Arg ), aspartic acid (Asp), asparagine (Asn), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), cysteine (CySH), cystine (Cyss), cysteic acid (Cya), methionine (Met), tyrosine (Tyr), thyroxine (Thy), proline (Pro), hydroxyproline (Hyp), tryptophan (Trp), histidine (His), ⁇ -alanine, N-methyl
  • amino acid residues having a protecting group can be adopted depending on the type of functional group to be protected.
  • amino acid residues having an amino group or a carboxyl group in its side chain it is preferably an amino acid residue having a protecting group from the viewpoint of avoiding side reactions.
  • the deprotection step can be reduced, atomic efficiency can be improved, and waste can be reduced. From this viewpoint, amino acid residues that do not have a protecting group are preferred. According to the method of the present invention, even if the amino acid residue does not have a protecting group, side reactions originating from the side chain are unlikely to occur.
  • any known protecting group can be employed, such as an alkyl-type protecting group such as a triphenylmethyl group (Trt); a tert-butyldimethylsilyl group (TBS), etc.
  • an alkyl-type protecting group such as a triphenylmethyl group (Trt); a tert-butyldimethylsilyl group (TBS), etc.
  • silyl-type protecting groups p-methoxybenzyl group (PMB), p-methoxyphenyl group (PMP), and other aryl-type protecting groups; formyl group, acetyl group (Ac), and other amide-type protecting groups; phthaloyl group (Phth) Phthalimide-type protecting groups such as; benzyloxycarbonyl group (Cbz), tert-amyloxycarbonyl group (Aoc), 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc), tert-butyloxycarbonyl group (Boc), allyloxycarbonyl group (Alloc), carbamate type protecting groups such as 2,2,2-triethoxycarbonyl group (Troc); 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group (Npys), 2-nitrobenzenesulfonyl group (Ns), (2 Examples include sulfonamide-type protecting groups such as -trimethylsilyl)-
  • n is an integer of 1 or more, and from the viewpoint of structural stability of the cyclic peptide and improvement in yield, n is preferably 2 to 100, more preferably 3 to 40.
  • n R Ps may be the same or different.
  • the above-mentioned cyclic peptide tends to have high metabolic stability and high cell membrane permeability. For this reason, it is used, for example, as a material for drugs such as antibacterial agents, immunosuppressants, antitumor agents, brain function improving agents, hair quality improving agents, antipruritic agents, skin care products, quasi-drugs, health supplements, cosmetics, etc. be able to.
  • drugs such as antibacterial agents, immunosuppressants, antitumor agents, brain function improving agents, hair quality improving agents, antipruritic agents, skin care products, quasi-drugs, health supplements, cosmetics, etc. be able to.
  • the above cyclic amide includes, for example,
  • cyclic peptide 11 L-Ala-L-Tyr (OBn)-L-Leu-L-Ala-Gly
  • Cyclic peptide 12 L-Trp-L-Phe-L-Leu-L-Ala-Gly
  • Cyclic peptide 13 L-Trp-L-Phe-L-Leu-L-Ala-Gly
  • cyclic peptide 14 L-Phe-L-Pro-L-Ser-L- Phe-Gly
  • cyclic peptide 15 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (L-Pro-L-Val-L
  • Cyclic amide precursor used in the present invention has the general formula (2):
  • the cyclic amide precursor has the general formula (2a):
  • cyclic amide precursor used in the present invention it is possible to employ a cyclic amide precursor that has been cyclized so far, or a cyclic amide precursor that has not been cyclized so far. It can also be adopted. According to the method of the present invention, cyclic amide precursors that have been cyclized can be cyclized with high yield, and various cyclic amide precursors that have not been cyclized can be cyclized with high yield. The body can be cyclized. Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to provide an amide library and a peptide library for drug discovery screening.
  • the above cyclic amide precursor includes, for example,
  • cyclic peptide precursor 21 (HL-Ala-L-Tyr (OBn)-L-Leu-L consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) -Ala-Gly-OH)
  • cyclic peptide precursor 22 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (HL-Trp-L-Phe-L-Leu-L-Ala-Gly-OH)
  • Cyclic peptide precursor 23 (HL-Phe-L-Pro-L-Ser (OBn)-L-Phe-Gly-OH) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • Cyclic peptide precursor 24 (HL-Phe-L-Pro-L-Ser-L-Phe-Gly-OH) consisting of Cyclic peptide precursor 26 (HL-MeAla-L-Phe -L
  • Condensing agent that can be used in the present invention has the general formula (3):
  • X represents a halogen atom.
  • Y represents an optionally substituted alkyl group.
  • It is a compound represented by.
  • Examples of the halogen atom represented by is more preferable.
  • the alkyl group represented by Y is not particularly limited and has a straight carbon number of 1 to 10 (especially 1 to 6) such as n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, etc.
  • branched alkyl groups having 3 to 10 carbon atoms (especially 3 to 6 carbon atoms) such as isopropyl group, sec-butyl group, and tert-butyl group can also be mentioned.
  • the alkyl group represented by Y is preferably a branched alkyl group having 3 to 10 carbon atoms, and a branched alkyl group having 3 to 6 carbon atoms. A group is more preferable, and an isopropyl group is even more preferable.
  • the condensing agent used in the present invention includes, for example,
  • These condensing agents can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the condensing agent used is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range. From the viewpoint of suppressing the formation of impurities and improving yield, the amount is preferably about 0.1 to 10 mol, more preferably about 0.2 to 5 mol, and 0.5 to 3 mol, per 1 mol of the cyclic amide precursor. A molar level is more preferable.
  • the tertiary amine compound that can be used in the present invention has the general formula (4):
  • R 1 , R 2 and R 3 are the same or different and represent an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted heteroaryl group. Alternatively, two or more of R 1 , R 2 and R 3 may be linked to form a ring (excluding a pyridine ring) which may have one or more heteroatoms or substituents. good.
  • a compound represented by excluding tributylamine, diisopropylethylamine and triethylamine).
  • "excluding tributylamine” means excluding tri-n-butylamine, tri-s-butylamine, tri-t-butylamine, and triisobutylamine.
  • the alkyl group represented by R 1 , R 2 and R 3 is not particularly limited, and examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group.
  • straight chain alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms (especially 1 to 6 carbon atoms) such as Also included is the branched alkyl group in 6).
  • the aryl group represented by R 1 , R 2 and R 3 is not particularly limited, and any of a monocyclic aryl group, a condensed aryl group, and a polycyclic aryl group can be employed, for example, Examples include aryl groups having 6 to 18 carbon atoms (especially 6 to 14 carbon atoms) such as phenyl group, naphthyl group, anthracenyl group, phenanthrenyl group, biphenyl group, terphenyl group, fluorenyl group, pyrenyl group, and triphenylenyl group.
  • the heteroaryl group represented by R 1 , R 2 and R 3 is not particularly limited, and either a monocyclic heteroaryl group or a polycyclic heteroaryl group can be adopted, such as a pyrrolidyl group.
  • pyrrolyl group tetrahydrothienyl group, thienyl group, oxolanyl group, furanyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, thiazolyl group, oxazolyl group, piperidyl group, pyridyl group, pyrazyl group, indolyl group, isoindolyl group, benzimidazolyl group, quinolyl group, Examples include isoquinolyl group and quinoxalyl group.
  • the alkyl group, aryl group and heteroaryl group represented by R 1 , R 2 and R 3 may have a substituent.
  • substituents include, without particular limitation, a hydroxyl group, a halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.), the above alkyl group, the above aryl group, an alkoxy group, an amino group, and the like.
  • the number of substituents, if any, is not particularly limited and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • R 1 , R 2 and R 3 may be linked to form a ring (excluding a pyridine ring) which may have one or more heteroatoms or substituents.
  • the above-mentioned ring is not particularly limited and includes, for example, an aziridine ring, an azirine ring, a diaziridine ring, a diazirine ring, an azetidine ring, an azeto ring, a diazeto ring, a pyrrolidine ring, a pyrrole ring, an imidazolidine ring, an imidazole ring, and a piperidine ring. , a piperazine ring, a morpholine ring, and the like.
  • At least one of R 1 , R 2 and R 3 is a methyl group, and at least two of R 1 , R 2 and R 3 are methyl groups. It is more preferable.
  • tertiary amine compounds used in the present invention include, for example:
  • the tertiary amine compounds that can be used in the present invention include dimethylbenzylamine (Me 2 NBn), trimethylamine (Me 3 N), dimethylethylamine (Me 2 NEt), and dimethyl n-hexyl from the viewpoint of improving yield.
  • Amine (Me 2 Nn-Hex), 1-methylpyrrolidine is preferred, dimethylbenzylamine (Me 2 NBn), trimethylamine (Me 3 N), dimethylethylamine (Me 2 NEt), dimethyl n-hexylamine (Me 2 Nn- Hex) is more preferred.
  • tertiary amine compounds can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the tertiary amine compound used is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range. From the viewpoint of the yield of the desired cyclic amide, economic efficiency, etc., the amount is preferably about 0.1 to 10 mol, more preferably about 0.2 to 5 mol, and 0.5 mol to 1 mol of the cyclic amide precursor. More preferably, the amount is about 3 mol. It should be noted that as the amount of the tertiary amine compound used increases, the yield of the target cyclic amide improves, but even if an excessive amount of the tertiary amine compound is used, the yield of the target cyclic amide hardly improves. . For this reason, it is preferable to adjust the amount of the tertiary amine compound as appropriate, taking into account the economical aspect.
  • reaction solvent The reaction step of the present invention is not particularly limited, and can be carried out in any organic solvent, water, or a mixed solvent thereof in which the substrate is dissolved, but from the viewpoint of solubility of the substrate, aprotic Preferably, the reaction is carried out in a solvent containing a polar solvent.
  • the aprotic polar solvent used in the reaction step of the present invention is not particularly limited, but includes ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone; ether solvents such as 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, and diethyl ether; Examples include amide solvents such as N,N-dimethylformamide and N,N-diethylformamide, sulfoxide solvents such as dimethylsulfoxide, nitrile solvents such as acetonitrile, and mixtures thereof. Among these, from the viewpoints of substrate solubility, low reactivity, ease of removal, and environmental impact, ether solvents, nitrile solvents, etc. are preferred, and 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, acetonitrile, etc. are more preferred. These solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • a solvent for dissolving a cyclic amide (precursor) or cyclic peptide (precursor) that is difficult to dissolve only in an organic solvent it is preferable to employ a mixed solvent of water and an aprotic polar solvent. It is more preferable to employ a mixed solvent of acetonitrile, water and 1,4-dioxane, water and tetrahydrofuran.
  • the mixing ratio of the above mixed solvent water: aprotic polar solvent
  • the cyclic amide that is the object of the present invention can be produced by reacting the cyclic amide precursor, the condensing agent, and the tertiary amine compound. There are no particular restrictions on the reaction, and all components can be added simultaneously or sequentially.
  • the reaction step of the present invention can be carried out by either a batch method or a flow method.
  • the flow method is more preferred from the viewpoint of high safety and ease of scale-up, and the microflow method is even more preferred from the viewpoint of enabling precise control of reaction temperature and reaction time.
  • the batch method refers to a batch operation, specifically, a method in which substances participating in a reaction are charged into a reaction vessel or a reaction device all at once, reacted, and taken out after reaching equilibrium or a certain reaction rate. It means a series of operations up to.
  • the flow method refers to a continuous operation, specifically, an operation in which raw materials and substances necessary for their processing are continuously fed into a device at a fixed rate (flow rate) and discharged. do.
  • the microflow method means a flow method (continuous operation) using a microflow reactor.
  • a microflow reactor includes, for example, a channel for transporting a fluid containing raw materials or intermediates used in a reaction, a pump for sending the fluid into the channel, and a mixer for mixing the fluid. , is provided.
  • the reaction between the condensing agent and the tertiary amine compound may be carried out in the microflow reactor, and the highly reactive active species generated by the reaction between the condensing agent and the tertiary amine compound and , the reaction with the cyclic amide precursor may be carried out in a microflow reactor.
  • a fluid containing a cyclic amide precursor and a tertiary amine compound and a fluid containing a condensing agent other than the fluid were placed in a microflow reactor. It is preferable to mix and react using .
  • the method for producing a cyclic amide of the present invention is not limited to being carried out using a microflow reactor; for example, a batch container that has a small volume and can provide a high stirring speed may be used.
  • the volume of the mixing section of the batch container may be 1 to 100 mL, or 5 to 50 mL.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the general configuration of a microflow reactor 1.
  • the microflow reactor 1 can include a tank 11 containing a first liquid, a tank 12 containing a second liquid, and a tank 13 containing a third liquid.
  • the first liquid may contain a cyclic amide precursor
  • the second liquid may contain a tertiary amine compound
  • the third liquid may contain a condensing agent.
  • the first liquid may include a cyclic amide precursor and a tertiary amine compound
  • the second liquid may include a condensing agent
  • the third liquid may include a reaction terminator.
  • a mixture of at least the first liquid and the second liquid and a third liquid may be mixed in the microflow reactor; and the second liquid may be mixed in a microflow reactor.
  • the microflow reactor 1 can include channels f1, f2, f3, f4, and f5 for transporting fluid.
  • the inner diameter of the flow path may be, for example, 0.1 to 10 mm, or 0.3 to 1 mm.
  • the microflow reactor 1 can be equipped with mixers 31 and 32 for mixing fluids.
  • the mixer is not particularly limited, for example, a V-shaped mixer, a T-shaped mixer, or the like, which achieves mixing of fluids by flowing the fluids therein, can be used. In such a mixer, the interfacial area of two liquids is increased by the swirling flow generated within the flow path, and two or more reaction liquids can be easily mixed in a few milliseconds.
  • the inner diameter of the flow path inside the mixer may be, for example, 0.1 to 10 mm, or 0.2 to 1 mm.
  • the inner diameter of the flow path can be defined as the diameter of the inner portion of the flow path (the portion through which the fluid passes) in a cross section of the flow path in a direction perpendicular to the length direction of the flow path.
  • the inner diameter of the flow path may be the diameter when the shape of the inner portion of the flow path is converted into a perfect circle based on area.
  • the tanks 11, 12, 13 and 14, the mixers 31 and 32, and the flow paths f1, f2, f3, f4 and f5 are made of, for example, resin such as plastic or elastomer, glass material, metal, ceramic, etc. obtain.
  • the tank 11 is connected to a pump 21, and the operation of the pump 21 allows the first liquid contained in the tank 11 to move within the flow path f1 and flow into the mixer 31.
  • the tank 12 is connected to a pump 22, and by operation of the pump 22, the second liquid contained in the tank 12 can move within the flow path f2 and flow into the mixer 31. Then, the first liquid and the second liquid are mixed by the mixer 31 to become a first mixed liquid, which can be sent to the flow path f4.
  • the tank 13 is connected to a pump 23, and when the pump 23 operates, the liquid stored in the tank 13 moves in the flow path f3, flows into the mixer 32, and is mixed with the first mixed liquid. This becomes a second mixed liquid and can be sent to the flow path f5.
  • the second liquid mixture may be stored in the tank 14.
  • the microflow reactor 1 it is easy to increase the area for heat exchange per volume of reaction solution.
  • the reaction time can be easily controlled by adjusting the flow rate and the length of the channel. Therefore, it is easy to strictly control the reaction solution, and as a result, it is easy to minimize the progress of undesired side reactions, and it is easy to improve the yield of the target product.
  • the method for producing a cyclic amide of the present invention can be carried out by a liquid phase method, it is easy to scale up.
  • the target compound, the cyclic amide can be obtained through normal isolation and purification steps, if necessary.
  • the present invention allows for the production of cyclic peptides in high yield by using a condensing agent that produces fewer impurities after the reaction and is easy to remove. Since it is easy to obtain, these steps can be omitted or simplified, and it can be directly used for crystallization and analysis.
  • additives may be used as appropriate within a range that does not impair the effects of the present invention.
  • the additives include surfactants, peptide coupling agents, crown ethers, metal salts, and the like.
  • the reaction temperature in the reaction step of the present invention is preferably 0 to 100°C, more preferably 20 to 80°C, from the viewpoint of improving cyclization efficiency, suppressing epimerization, suppressing dimerization, shortening reaction time, etc. Preferably, 40 to 80°C is more preferable.
  • the reaction time can be the time for the cyclization reaction to proceed, and from the viewpoint of improving the cyclization yield, suppressing epimerization, etc., it is preferably 10 seconds to 12 hours, more preferably 10 seconds to 6 hours, and 10 seconds. More preferably 1 hour.
  • the reaction time can be less than 10 minutes, more preferably less than 5 minutes, even more preferably less than 1 minute. can do.
  • a neutral tertiary amine compound reacts with a neutral compound to generate an ionic acylammonium cation, which is a highly reactive active species.
  • This ionic acylammonium cation easily reacts with ionic carboxylates.
  • the reason why the yield of cyclic amide and cyclic peptide is easily improved by the method of the present invention is that the acylammonium cation obtained by the reaction of the condensing agent and the tertiary amine compound selects the C-terminus of the cyclic amide precursor. This can be explained by the fact that the cyclization reaction proceeds rapidly.
  • the method of the present invention can be applied to a variety of substrates because the reaction can be carried out in a short time under near-neutral conditions. Furthermore, in the method of the present invention, epimerization and dimerization accompanying cyclization can be suppressed by the reaction step proceeding according to the above reaction mechanism, and preferably, epimerization and dimerization accompanying cyclization can be suppressed. materialization can be substantially avoided.
  • Example 1 Study of tertiary amine compounds and solvents (model substrate)
  • the method for producing a cyclic amide of the present invention proceeds in two steps: (i) activation of the C-terminus of a cyclic amide precursor and (ii) cyclization condensation. Therefore, in order to search for conditions that enable selective activation of the C-terminus of the cyclic amide precursor, studies were conducted using model substrates with simple structures as models for each terminal. Potassium salt of 3-phenylpropionic acid 1 (0.100 M, 1.0 molar equivalent), a C-terminal model substrate, and 2-phenylethylamine 2 (0.100 M, 1.0 molar equivalent), an N-terminal model substrate.
  • a tertiary amine compound (0.100M, 1.0 molar equivalent) was dissolved in a mixed solvent of solvent X and water, and isopropyl chloroformate (0.050M, 1.0 molar equivalent) was dissolved in solvent Y.
  • a mixed solvent solution of potassium salt 1 of 3-phenylpropionic acid and 2-phenylethylamine 2 was injected into a V-shaped mixer at a flow rate of 2.40 mL/min, and a solution of solvent Y of isopropyl chloroformate was injected at a flow rate of 4.80 mL/min.
  • the reaction was carried out at 60°C for 30 seconds (Table 1).
  • Example 2 Examination of ionic interactions (model substrate) In Example 1, dimethylbenzylamine (Me 2 NBn), which gave amide 3 with the highest C-terminal selectivity, was used to investigate the improvement in reactivity due to the combination of the above-mentioned ionic electrophile and nucleophile. (Table 2). That is, in the reaction of potassium salt 1 of 3-phenylpropionic acid, 2-phenylethylamine 2, and isopropyl chloroformate under the same concentration, equivalent, temperature, and time conditions as in the study of bases in Table 1, lithium chloride was added and C We decided to observe changes in terminal selectivity.
  • C-terminal selectivity (7+8)/9 was calculated from the ratio of the combined yield of C-terminal products 7 and 8 and the yield of N-terminal product 9 (Table 2).
  • Moderate to high C-terminal selectivity was observed in the reaction between C-terminal model 5a derived from glycine (Gly) and N-terminal models 6a and 6c derived from Gly and alanine (Ala) (Example 3-1 and 3-3).
  • high C-terminal selectivity was observed in the reaction between 5a and the N-terminal model 6d derived from bulkier N-methylalanine (MeAla), and a large amount of C-terminal product 7 was obtained ( Example 3-4).
  • Example 4 Synthesis of cyclic peptides (protected Stellarin G) The reaction conditions for cyclic peptide synthesis were investigated (Table 4). Stellarin G, a 5-residue cyclic peptide known as a Chinese medicinal herb, was selected as a model substrate for a cyclic peptide. Cyclic peptide precursor 21 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (HL-Ala-L-Tyr (OBn)-L-Leu-L-Ala-Gly-OH.HCl, 0.010M, 1.
  • cyclic peptide 11 (protected Stellarin G; L-Ala-L-Tyr (OBn)-L-Leu-L-Ala-Gly) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was calculated by HPLC-UV analysis. did. When dimethylbenzylamine (Me 2 NBn) was used as 1.0 molar equivalent, the yield was 62%, which was moderate, but by adding an excess amount of 2.0 molar equivalent, the yield was as high as 99%. (Table 4, Examples 4-1 and 4-2). Furthermore, even when the base equivalent was increased, cyclic peptide 11 was successfully obtained quantitatively (Table 4, Example 4-3).
  • the cyclization in the method of the present invention proceeds by the same reaction mechanism as when using the above-mentioned model substrate.
  • the highly reactive active species of dimethylbenzylamine and isopropyl chloroformate have extremely high reactivity and can quickly activate the C-terminus of the cyclic peptide precursor, and the subsequent reaction is also rapid, resulting in a high yield of cyclic peptide 11. It is considered that the company succeeded in obtaining a high rate.
  • Example 5 Synthesis of cyclic peptides (Stellarin G analogs)
  • Stellarin G analogs were selected as model substrates for cyclic amides and cyclic peptides. Specifically, the tyrosine (Tyr) residue of the protected Stellarin G of Example 4 was replaced with a phenylalanine (Phe) residue, and the alanine (Ala) residue was replaced with a tryptophan (Trp) residue, resulting in the following.
  • a cyclic peptide was prepared as described.
  • Cyclic peptide precursor 22 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (HL-Trp-L-Phe-L-Leu-L-Ala-Gly-OH TFA, 0.010M, 1.0 molar equivalent ), potassium hydroxide (0.020 M, 2.0 molar equivalents), and dimethylbenzylamine (Me 2 NBn, 0.020 M, 2.0 molar equivalents) in a 1:1 mixed solution of acetonitrile and water (flow rate 2.0 molar equivalents).
  • a 1:1 mixed solution of acetonitrile and water (flow rate 2 .40 mL/min) and a solution of isopropyl chloroformate (0.015 M, 3 molar equivalents) in acetonitrile (flow rate 4.80 mL/min) were introduced into the V-mixer at 60° C. by a syringe pump.
  • the mixture in the middle of the reaction was introduced into a reaction tube (inner diameter 0.8 mm, length 2388 mm, volume 1200 ⁇ L, reaction time 10 seconds) at the same temperature, and after reaching a steady state over 30 seconds, the mixture after the reaction was cooled to room temperature. into the test tube for 120 seconds.
  • Example 7 Synthesis of cyclic peptide (Dianthin I) The applicability of the present invention to unprotected cyclic amides and cyclic peptides was investigated. Dianthin I, a cyclic peptide, was produced in the same manner as in Example 6, except that the protecting group of the amino acid residue was removed, that is, the protecting group benzyl group was replaced with a hydrogen atom.
  • Cyclic peptide precursor 24 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (HL-Phe-L-Pro-L-Ser-L-Phe-Gly-OH TFA, 0.010M, 1.0 molar equivalent ), potassium hydroxide (0.020 M, 2.0 molar equivalents), and dimethylbenzylamine (Me 2 NBn, 0.030 M, 3.0 molar equivalents) in a 1:1 mixed solution of acetonitrile and water (flow rate 2.0 molar equivalents).
  • cyclic peptide 14 (Dianthin I; L-Phe-L-Pro-L-Ser-L-Phe-Gly) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 was 62%.
  • the present invention can also be applied to cyclic amides and cyclic peptide precursors that do not have protecting groups.
  • Example 8 Synthesis of cyclic peptides (protected Heterophyllin J) Furthermore, in order to examine whether the present invention is applicable to different cyclic amides and cyclic peptides, we used Heterophyllin J, a 5-residue cyclic peptide known as a Chinese herbal medicine for diuresis and torticollis, as a model substrate for cyclic amides and cyclic peptides. Selected. Cyclic peptide precursor 25 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (HL-Pro-L-Val-L-Tyr (OBn)-L-Ala-Gly-OH ⁇ TFA, 0.010M, 1.
  • a mixed solution of acetonitrile and water (flow rate 2.40 mL/ A solution of isopropyl chloroformate (0.010 M, 2 molar equivalents) in acetonitrile (flow rate 4.80 mL/min) was introduced into the V-mixer at 60° C. using a syringe pump.
  • the mixture in the middle of the reaction was introduced into a reaction tube (inner diameter 0.8 mm, length 2388 mm, volume 1200 ⁇ L, reaction time 10 seconds) at the same temperature, and after reaching a steady state over 30 seconds, the mixture after the reaction was cooled to room temperature. into the test tube for 150 seconds.
  • RME Reaction Mass Efficiency
  • Cyclic peptide precursor 26 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (HL-MeAla-L-Phe-L-MeAla-L-Phe-L-Ala-OH ⁇ TFA, 0.010M, 1.0 molar equivalent), and an acetonitrile solution (flow rate 2.40 mL/min) of dimethylbenzylamine (Me 2 NBn, 0.020 M, 2.0 molar equivalent), and isopropyl chloroformate (0.010 M, 2.0 molar equivalent). acetonitrile solution (flow rate 4.80 mL/min) was introduced into the V-shaped mixer at 60° C. using a syringe pump.
  • reaction tube inner diameter 0.8 mm, length 2388 mm, volume 1200 ⁇ L, reaction time 10 seconds
  • reaction time 10 seconds the mixture after the reaction was cooled to room temperature. and poured into test tubes for 180 seconds.
  • the reaction mixture was mixed with 5 mL of 1M HCl aqueous solution and stirred for 2 minutes.
  • the mixed solution was poured into 50 mL of ethyl acetate (EtOAc), and the organic layer was washed with 1M aqueous HCl, saturated brine, dried over magnesium sulfate ( MgSO4 ), filtered, and concentrated in vacuo at room temperature.
  • EtOAc ethyl acetate
  • the epimer of the Versicotide D analog produced in Example 9-1 was selected as a model substrate for cyclic amide and cyclic peptide. Specifically, except for using cyclic peptide 27 (HL-MeAla-L-Phe-L-MeAla-L-Phe-D-Ala-OH ⁇ TFA), which is an epimer of cyclic peptide precursor 26. Cyclic peptide 17 was produced in the same manner as in Example 9-1.
  • Example 9-1 and Example 9-2 (Versicotide D analogs and epimers thereof) was determined by HPLC-UV analysis (column: GLscience InertsilTM ODS-3 5 ⁇ m, 4.6 mm x 75 mm, solvent). : Methanol + 0.1% formic acid/H 2 O + 0.1% formic acid (0-13 minutes: 0-100%, 13-16 minutes: 100%, 16-17 minutes: 0%, 17-22 minutes: 0%) , flow rate: 1.0 mL/min, detection wavelength: 254 nm, temperature: 40°C). The results are shown in Table 5 and FIG. 2.
  • the retention time of cyclic peptide 16 was 11.8 minutes (Figure 2a), and the retention time of the epimer cyclic peptide 17 was 12.2 minutes ( Figure 2b).
  • Figure 2a The retention time of cyclic peptide 16 (L-form) corresponding to the cyclic peptide precursor 26 was obtained, and in Example 9-2, the cyclic peptide corresponding to the cyclic peptide precursor 27 was obtained. Only 17 (D form) was obtained.
  • the present invention can substantially suppress epimerization during cyclization. Accordingly, in the present invention, it is possible to separately produce optical isomers by selecting corresponding cyclic amide precursors and cyclic peptide precursors. In the present invention, for example, a cyclic peptide substantially free of D-amino acids can be synthesized.
  • Cyclic peptide 16 (Versicotide D analog) was produced in the same manner as Example 9-1 except that the reaction temperature was changed to 20°C (Example 9-3).
  • the present invention allows cyclization even at relatively low reaction temperatures without detectable epimerization (Table 5).
  • HATU 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate (HATU, 1.0 molar equivalent) under dilute conditions. 5 molar equivalents), 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 0.1 molar equivalents), and diisopropylethylamine (i-Pr 2 NEt, 3 molar equivalents) in a batch process at 20 °C in anhydrous acetonitrile. Cyclization was carried out (Table 5, Comparative Example 9-1).
  • the post-reaction mixture was washed with 5% HCl followed by saturated aqueous sodium bicarbonate (NaHCO 3 ), dried over magnesium sulfate (MgSO 4 ), filtered and concentrated in vacuo at room temperature.
  • the NMR spectrum of the obtained cyclic peptide matched the NMR spectrum of the D-form Versicotide D analog (corresponding to Example 9-2) corresponding to cyclic peptide precursor 27, which is an epimer of cyclic peptide precursor 26. .
  • the obtained cyclic peptide was evaluated by HPLC-UV analysis, the results were consistent with those of Versicotide D analogue, which is D-form.
  • a Versicotide D analog was produced by the method of Posoda et al. in the same manner as Comparative Example 9-1, except that the reaction temperature was set at 60° C. (Table 5, Comparative Example 9-2).
  • a Versicotide D analog was produced by the method of Posoda et al. in the same manner as Comparative Example 9-2, except that the solvent was replaced with dichloromethane (Table 5, Comparative Example 9-3).
  • Table 5 it was confirmed that in the method of Posoda et al., the undesired D-form Versicotide D analog was produced in a larger amount than the target L-form, regardless of the reaction temperature.
  • Cyclic peptide precursor 28 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (HL-MeAla-L-Leu-L-MePhe-Gly-OH TFA, 0.010M, 1.00 molar equivalent), diisopropylethylamine (i-Pr 2 NEt, 0.020 M, 2.00 molar equivalents) and dimethylbenzylamine (Me 2 NBn, 0.030 M, 3.00 molar equivalents) in acetonitrile (flow rate 2.40 mL/min) and chloroformic acid.
  • SEQ ID NO: 8 HL-MeAla-L-Leu-L-MePhe-Gly-OH TFA, 0.010M, 1.00 molar equivalent
  • i-Pr 2 NEt diisopropylethylamine
  • Me 2 NBn dimethylbenzylamine
  • a solution of isopropyl (0.015 M, 3.00 molar equivalents) in acetonitrile (flow rate 4.80 mL/min) was introduced into the V-mixer at 60° C. using a syringe pump.
  • the mixture in the middle of the reaction was introduced into a reaction tube (inner diameter 0.8 mm, length 7164 mm, volume 3600 ⁇ L, reaction time 30 seconds) at the same temperature, and after reaching a steady state over 30 seconds, the mixture after the reaction was cooled to room temperature. into the test tube for 120 seconds.
  • the present invention can also be applied to 4-residue cyclic peptides with large distortions. Even when 10 molar equivalents of cyclic peptide precursor 28 were used, cyclic peptide 18 was obtained by similar RME. No dimer of the cyclic peptide precursor 28 was detected in the produced cyclic peptide 18 under any concentration conditions. In this way, the present invention makes it possible to avoid dimerization associated with cyclization.
  • cyclic peptide precursor 28 (HL-MeAla-L-Leu-L-MePhe-Gly-OH, 0.1 mM, 1.0 molar equivalent) in acetonitrile (MeCN) or dimethylformamide ( DMF) solution, chlorodiisopinocampheylborane (DIPCl, 3.2 molar equivalents), hydroxybenzotriazole (HOBt, 3.2 molar equivalents), and diisopropylethylamine (i-Pr 2 NEt, 4.0 molar equivalents) ) was added and the mixture was stirred at 22°C or 30°C for 24 hours. The mixture after the reaction was purified by GPC.
  • the yield of cyclic peptide 18 and cyclized dimer 19 contained in the residue was determined by HPLC-UV analysis (column: GLscience InertsilTM ODS-3 5 ⁇ m, 4.6 mm x 75 mm, solvent: methanol + 0.1% formic acid/H 2 O + 0 .1% formic acid (0-23 minutes: 0-70%, 23-23.5 minutes: 70-100%, 23.5-26 minutes: 100%, 26-26.5 minutes: 0%, 26.5 ⁇ 29 minutes: 0%), flow rate: 1.0 mL/min, detection wavelength: 254 nm, temperature: 40°C, retention time: 15.8 minutes (cyclic peptide 18; corresponding to Example 10) and 21.6 minutes (Cyclized dimer 19)).

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Abstract

一般式（２）：で表される環状アミド前駆体と一般式（３）：で表される縮合剤と一般式（４）：で表される３級アミン化合物（ただし、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリエチルアミンを除く）とを反応させて、安価で、反応後に生成する夾雑物が少ない縮合剤で短時間のうちに環化させることで、多様な環状アミドを製造できる。

Description

環状アミドの製造方法
　本発明は、環状アミドの製造方法に関する。
　β－ラクタム、γ－ラクタム等に代表される環状アミドは、上市医薬品に含まれる３５１種類の環構造の中で、それぞれ１５、４２番目に多く見られる構造である（例えば、非特許文献１参照）。また、環状アミドのなかでも、アミド結合を複数有する環状ペプチドは、非環状ペプチドよりも高い代謝安定性及び標的選択性を有することから、例えば、抗菌剤、免疫抑制剤及び抗腫瘍剤等の薬剤として有用であることが知られている。このことから、環状アミド及び環状ペプチドの簡便な合成方法が求められている。
　比較的単純な、官能基化されていない環状アミドの合成方法としては、直鎖状のアミノカルボン酸を安価なルイス酸で縮合させる方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、安価なルイス酸で縮合させる方法は、一般的に高温条件下で長時間の反応を要するため、環状ペプチドをはじめ、不安的な官能基によって官能基化された環状アミドの合成には適さない。このため、環状ペプチドを含む、広範な環状アミドに適用できる、優れた環状アミドの合成方法が求められている。
　一方で、環状ペプチドの合成方法として、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）等のホスホニウム系ペプチド縮合剤を用いると、頭－尾（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）環化反応において副反応を回避しつつ目的のペプチドが得られやすいことが知られている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、このようなホスホニウム系ペプチド縮合剤は、一般的な縮合剤の中でも高価であって、また、縮合剤に由来する夾雑物が多量に発生するという問題を抱えていることから、安価で高活性で、且つ反応後に残る夾雑物が少ない縮合剤を用いた環状ペプチドの合成方法も求められている。
　環状ペプチドの合成方法として、本発明者らは、安価で高活性なトリホスゲンを縮合剤として用いた場合に、従来の合成方法よりも高い収率で環状ペプチドを合成できることを報告している（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、非特許文献４の方法では、基質によっては十分な収率で環状ペプチドを得ることができない。このため、広範な種類のペプチドを環化できる、優れた環状ペプチドの合成方法とは言えない。
　また、環状ペプチドの合成方法として、トリホスゲンよりも安価である、クロロギ酸エチルを縮合剤として用いた報告例が存在する（例えば、非特許文献５及び６参照）。しかしながら、非特許文献５及び６では、特定のペプチドを環化できることが報告されているに過ぎず、また、いずれの環状ペプチドも十分に高い収率で得られていない。他にも、環状ペプチドの合成方法として、クロロギ酸イソブチルを縮合剤として用いた報告例が存在する（例えば、非特許文献７～９参照）。非特許文献８では、クロロギ酸エチルを用いた場合よりもある種の環状ペプチドを高い収率で合成できているものの、非特許文献９から、非特許文献８とほぼ同様の条件を他の基質に適用した場合に、収率が著しく低下することが明らかである。また、非特許文献５～９では、低温条件下で長時間かけて環化反応を行うことで、わずかでも収率を向上させる試みがなされているに過ぎず、短時間で効率よく環状ペプチドを合成できるものではない。
　このように、安価な縮合剤を用いて短時間のうちに環化させることで、環状ペプチドを含む、多様な環状アミドを得る方法はいまだ確立されていない。
J. Med. Chem. 2014, 57, 5845-5859. Tetrahedron Lett. 1988, 29, 3049-3052. Org．Process　Res．Dev., 2018, 22, 760-772. Chem. Eur. J. 2021, 27, 7525-7532. Liebigs Ann. Chem., 1968, 713, 201-208. Helv. Chim. Acta, 1952, 35, 2229-2235. Helv. Chim. Acta, 1987, 70, 1012-1016. Int. J. Peptide Protein Res. 1988, 32, 527-535. J. Med. Chem. 1999, 42, 1705-1713.
　本発明は、上記した従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、安価な縮合剤で短時間のうちに環化させることで、多様な環状アミドを製造する方法を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、上記した目的を達成すべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、特定の縮合剤及び特定の３級アミン化合物を選択することによって、末端にアミノ基及びカルボキシル基を有する多様な非環状化合物を、安価な縮合剤で短時間のうちに環化させて、多様な環状アミドを得ることができることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、さらに研究を重ね、本発明を完成した。即ち、本発明は、以下の構成を包含する。
　項１．一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中、Ｒは、置換されていてもよい２価の有機基を示す。Ｒは、隣接する窒素原子とともに環を形成していてもよい。ＲＡは、水素原子又は炭化水素基を示す。］
で表される環状アミドを製造する方法であって、
一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［式中、Ｒ及びＲＡは、前記に同じである。］
で表される環状アミド前駆体と
一般式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［式中、Ｘは、ハロゲン原子を示す。Ｙは、置換されていてもよいアルキル基を示す。］で表される縮合剤と
一般式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。或いは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち２つ以上が連結して１個以上のヘテロ原子又は置換基を有していてもよい環（ただし、ピリジン環を除く）を形成していてもよい。］
で表される３級アミン化合物（ただし、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリエチルアミンを除く）とを反応させる工程を含む、製造方法。
　項２．前記Ｒは、アミド結合及び／又は置換基を有していてもよい、２価の炭化水素基である、項１に記載の製造方法。
　項３．前記環状アミドは、一般式（１ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［式中、ＲＡは、前記に同じである。２個以上のＲＡは、同一であってもよく異なっていてもよい。ＲＣ、ＲＮ及びＲＰは、同一又は異なって、２価の有機基を示す。ＲＣ、ＲＮ及びＲＰはそれぞれ、隣接する窒素原子とともに環を形成していてもよい。ｎは０以上の整数を示す。ただし、ｎが２以上の整数である場合、ｎ個のＲＰは、同一でも異なっていてもよい。］
で表される環状ペプチドであって、
前記環状アミド前駆体は、一般式（２ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［式中、ＲＡ、ＲＣ、ＲＮ、ＲＰ及びｎは前記に同じである。］
で表される環状ペプチド前駆体である、項１又は２に記載の製造方法。
　項４．前記ＲＣ、ＲＮ及びＲＰは、同一又は異なって、置換基を有していてもよい２価の炭化水素基である、項３に記載の製造方法。
　項５．前記ｎは、２以上の整数である、項３又は４に記載の製造方法。
　項６．前記Ｘは、塩素原子である、項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
　項７．前記Ｙは、分岐鎖状アルキル基である、項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
　項８．前記Ｙは、イソプロピル基である、項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
　項９．前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち少なくとも１つは、メチル基である、項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
　項１０．前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち少なくとも２つは、メチル基である、項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
　項１１．前記反応工程は、非プロトン性極性溶媒を含む溶媒中で行う、項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
　項１２．前記反応工程の反応温度は、０～１００℃である、項１～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
　項１３．前記反応工程の反応時間は、１０分未満である、項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
　項１４．前記反応工程は、フロー法により行われる、項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
　項１５．前記反応工程は、マイクロフロー法により行われる、項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
　本発明によれば、環状アミド前駆体と、特定の縮合剤と、特定の３級アミン化合物とを反応させることにより、多様な環状アミドを短時間のうちに合成することができる。
マイクロフローリアクターの概略的な構成を示す模式図である。 実施例９－１で得られた配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１６（Versicotide D類縁体；Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ）と、そのエピマーである、実施例９－２で得られた配列番号７で表される環状ペプチド１７（Versicotide D類縁体エピマー）のクロマトグラムである（カラム：ＧＬｓｃｉｅｎｃｅ　ＩｎｅｒｔｓｉｌＴＭ　ＯＤＳ－３　５μｍ，４．６ｍｍ×７５ｍｍ，溶媒：メタノール＋０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸（０－１３分：０～１００％，１３～１６分：１００％，１６～１７分：０％，１７～２２分：０％），流量：１．０ｍＬ／分，検出波長：２５４ｎｍ，温度：４０℃）。
　本明細書において、「含有」は、「含む（comprise）」、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」のいずれも包含する概念である。
　また、本明細書において、「Ａ～Ｂ」との数値範囲の表記は、「Ａ以上且つＢ以下」を意味する。
　本発明の環状アミドの製造方法は、環状アミド前駆体と縮合剤と３級アミン化合物とを反応させる工程を含む。
　また、本発明の方法においては、縮合剤と３級アミン化合物が反応することにより、反応性の高い活性種が生じると考えられるため、迅速に環状アミド前駆体の末端のカルボキシル基（以下、本明細書において、「Ｃ末端」と称する。）を活性化することができ、また、続く、活性化されたＣ末端のカルボキシル基と、他方の末端のアミノ基（以下、本明細書において、「Ｎ末端」と称する。）との環化反応も迅速に進行することができると考えられる。この場合、中性に近い条件下で、短時間で反応させられることから、本発明の方法は、多様な基質に適用することができる。また、本発明の方法は、環化に伴うエピメリ化及び二量体化を回避することができる。
　また、本発明の方法では、特に縮合剤としてクロロギ酸イソプロピルを用いた場合には、安価に高収率で反応を進行させることも可能であり、反応後に生じる夾雑物も除きやすい。
　また、本発明の方法では、特に、３級アミン化合物として、１つ以上のメチル基が窒素原子に結合した化合物を用いた場合には、環状アミド前駆体のＣ末端を選択的に活性することができることから、高い収率で環状アミドを得ることができる。
　さらに、本発明の方法では、マイクロフロー法を用いた場合には、縮合剤及び塩基を適切に選択することによって、従来のペプチド合成方法では考えられないほど高い収率（＞９９％）で、定量的に環状ペプチドを得ることも可能である。
　１．環状アミド
　本発明の目的物である環状アミドは、一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、Ｒは、置換されていてもよい２価の有機基を示す。Ｒは、隣接する窒素原子とともに環を形成していてもよい。ＲＡは、水素原子又は炭化水素基を示す。］
で表される化合物である。
　一般式（１）において、Ｒで示される基は、置換されていてもよい２価の有機基である。
　Ｒで示される２価の有機基としては、アミド結合及び／又は置換基を有していてもよい、２価の炭化水素基が好ましく、炭化水素基としては、例えば、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基が挙げられる。
　Ｒで示されるアルキル基としては、特に制限はなく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等の炭素数１～１０（特に１～６）の直鎖状アルキル基の他、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数３～１０（特に３～６）の分岐鎖状アルキル基、及び、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の炭素数３～１０（特に５～８）の環状アルキル基も挙げられる。
　Ｒで示されるアリール基としては、特に制限はなく、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基（ｏ－ターフェニル基、ｍ－ターフェニル基、及びｐ－ターフェニル基のいずれも採用可能である。以下同様。）、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等の炭素数６～１８のアリール基（特に６～１４）が挙げられる。
　Ｒで示される炭化水素基が有するアミド結合は、水素原子が置換されていてもよい。
　Ｒで示される炭化水素基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アルキル基、上記アリール基、アルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。　
　Ｒで示される炭化水素基が有する置換基は、保護基を有していてもよい。上記保護基としては、公知の保護基をいずれも採用することができ、例えば、トリフェニルメチル基（Ｔｒｔ）等のアルキル型保護基；ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）等のシリル型保護基；ｐ－メトキシベンジル基（ＰＭＢ）、ｐ－メトキシフェニル基（ＰＭＰ）等のアリール型保護基；ホルミル基、アセチル基（Ａｃ）等のアミド型保護基；フタロイル基（Ｐｈｔｈ）等のフタルイミド型保護基；ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ－アミルオキシカルボニル基（Ａｏｃ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２－トリエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）等のカルバメート型保護基；３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、２－ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）、（２－トリメチルシリル）－エタンスルホニル基（ＳＥＳ）等のスルホンアミド型保護基等が挙げられる。本発明によれば、熱や酸に不安定な保護基でも採用できるとの利点を有する。
　保護基を有する場合の保護基の数は、特に制限されず、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
　一般式（１）において、ＲＡで示される基は、水素原子又は炭化水素基である。
　ＲＡで示される炭化水素基としては、アルキル基及びアリール基等が挙げられる。
　ＲＡで示されるアルキル基としては、特に制限はなく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等の炭素数１～１０（特に１～６）の直鎖状アルキル基の他、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数３～１０（特に３～６）の分岐鎖状アルキル基も挙げられる。
　ＲＡで示されるアリール基としては、特に制限はなく、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等の炭素数６～１８のアリール基（特に６～１４）が挙げられる。
　なかでも、本発明の目的物である環状アミドが環状ペプチドである場合、本発明の目的物である環状アミドは、一般式（１ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［式中、ＲＡは、前記に同じである。２個以上のＲＡは、同一であってもよく異なっていてもよい。ＲＣ、ＲＮ及びＲＰは同一又は異なって、２価の有機基を示す。ＲＣ、ＲＮ及びＲＰはそれぞれ、隣接する窒素原子とともに環を形成していてもよい。ｎは０以上の整数を示す。ただし、ｎが２以上の整数である場合、ｎ個のＲＰは、同一でも異なっていてもよい。］
で表される化合物である。
　一般式（１ａ）において、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される基は、同一又は異なって、２価の有機基である。
　ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される２価の有機基は、置換基を有していてもよい２価の炭化水素基であることが好ましく、炭化水素基としては、例えば、置換されていてもよいアルキル基又は置換されていてもよいアリール基が挙げられる。
　ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアルキル基としては、特に制限はなく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等の炭素数１～１０（特に１～６）の直鎖状アルキル基の他、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数３～１０（特に３～６）の分岐鎖状アルキル基、及び、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の炭素数３～１０（特に５～８）の環状アルキル基も挙げられる。
　ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアリール基としては、特に制限はなく、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等の炭素数６～１８のアリール基（特に６～１４）が挙げられる。
　ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される炭化水素基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アルキル基、上記アリール基、アルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
　ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される炭化水素基が有する置換基は、保護基を有していてもよい。上記保護基としては、公知の保護基をいずれも採用することができ、例えば、トリフェニルメチル基（Ｔｒｔ）等のアルキル型保護基；ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）等のシリル型保護基；ｐ－メトキシベンジル基（ＰＭＢ）、ｐ－メトキシフェニル基（ＰＭＰ）等のアリール型保護基；ホルミル基、アセチル基（Ａｃ）等のアミド型保護基；フタロイル基（Ｐｈｔｈ）等のフタルイミド型保護基；ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ－アミルオキシカルボニル基（Ａｏｃ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２－トリエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）等のカルバメート型保護基；３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、２－ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）、（２－トリメチルシリル）－エタンスルホニル基（ＳＥＳ）等のスルホンアミド型保護基等が挙げられる。本発明によれば、熱や酸に不安定な保護基でも採用できるとの利点を有する。
　保護基を有する場合の保護基の数は、特に制限されず、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
　本発明の目的物である環状アミドが環状ペプチドである場合、本発明の方法は、環状ペプチド前駆体として非環状ペプチドを用いて、環状ペプチドを合成しようとするものであり、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される基は、非環状ペプチドが有するＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される基に対応するものである。このことから、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示される基は、隣接するアミノ基、カルボキシル基とともにアミノ酸を構成するものであり、アミノ酸残基が好ましい。
　なお、本明細書において、アミノ酸残基とは、一分子内にアミノ基とカルボキシル基を有するアミノ酸からアミノ基とカルボキシル基を除いた２価の基を意味する。
　一般式（１ａ）において、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアミノ酸残基は、それぞれ後述する環状ペプチド前駆体のＣ末端アミノ酸残基、Ｎ末端アミノ酸残基、及び非末端アミノ酸残基に由来する。なお、環状ペプチドは、互いに対等なアミノ酸残基及びペプチド結合の繰り返し構造からなるため、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアミノ酸残基は互いに対等である。つまり、環状ペプチドにおいて、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアミノ酸残基をそれぞれ決定することは、本発明の方法によって環化されてできるペプチド結合の位置を決定することに等しい。このため、由来する環状ペプチド前駆体のＣ末端とＮ末端の反応性（つまり、環化しやすさ）を加味して、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアミノ酸残基を適宜選択することが好ましい。具体的には、上記環状ペプチドのアミノ酸残基のうちから、環状ペプチド前駆体のＣ末端アミノ酸残基としたときに活性化しやすいアミノ酸残基をＲＣとすることができ、活性化したＣ末端アミノ酸残基を攻撃して環化しやすいＮ末端アミノ酸残基をＲＮとすることができる。
　一般式（１ａ）において、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアミノ酸残基としては、天然アミノ酸残基及び合成アミノ酸残基のいずれも採用することができ、例えば、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（ＩＬＥ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、リジン（Ｌｙｓ）、５－ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（ＣｙＳＨ）、シスチン（Ｃｙｓｓ）、システイン酸（Ｃｙａ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、チロシン（Ｔｙｒ）、チロキシン（Ｔｈｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、β－アラニン、Ｎ－メチル－β－アラニン、サルコシン、γ－アミノ酪酸、カイニン酸、又はこれらの誘導体のアミノ酸残基等が挙げられる。これらのアミノ酸残基は、単独を採用することもでき、２種以上を組合せて採用することもできる。
　また、一般式（１ａ）において、ＲＣ、ＲＮ及びＲＰで示されるアミノ酸残基としては、保護される官能基の種類に応じて、保護基を有するアミノ酸残基を採用することができる。上記アミノ酸残基が、アミノ基又はカルボキシル基を側鎖に有するアミノ酸残基である場合には、副反応回避の観点から、保護基を有するアミノ酸残基が好ましい。一方で、上記アミノ酸残基が、アミノ基及びカルボキシル基以外の官能基を側鎖に有するアミノ酸残基のみからなる場合には、脱保護工程を削減し、原子効率を向上させ、廃棄物を削減する観点から、保護基を有していないアミノ酸残基が好ましい。本発明の方法によれば、上記アミノ酸残基が保護基を有していなくても、側鎖に由来する副反応が生じにくい。
　上記アミノ酸残基が有する保護基としては、公知の保護基をいずれも採用することができ、例えば、トリフェニルメチル基（Ｔｒｔ）等のアルキル型保護基；ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）等のシリル型保護基；ｐ－メトキシベンジル基（ＰＭＢ）、ｐ－メトキシフェニル基（ＰＭＰ）等のアリール型保護基；ホルミル基、アセチル基（Ａｃ）等のアミド型保護基；フタロイル基（Ｐｈｔｈ）等のフタルイミド型保護基；ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔ－アミルオキシカルボニル基（Ａｏｃ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２－トリエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）等のカルバメート型保護基；３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル基（Ｎｐｙｓ）、２－ニトロベンゼンスルホニル基（Ｎｓ）、（２－トリメチルシリル）－エタンスルホニル基（ＳＥＳ）等のスルホンアミド型保護基等が挙げられる。
　一般式（１ａ）において、ｎは１以上の整数であり、環状ペプチドの構造安定性、収率向上の観点から、ｎは２～１００が好ましく、３～４０がより好ましい。ｎが２以上の整数である場合、ｎ個のＲＰは、同一でも異なっていてもよい。本発明の方法によれば、通常は合成が困難であることが知られている、環状テトラペプチド及び環状ペンタペプチドを提供することができる。
　上記環状ペプチドは、高い代謝安定性及び高い細胞膜透過性を有しやすい。このため、例えば、抗菌剤、免疫抑制剤、抗腫瘍剤、脳機能改善剤、毛質改善剤、鎮痒剤等の薬剤、スキンケア用品、医薬部外品、健康補助食品、化粧品等の材料として用いることができる。
　以上から、上記環状アミドとしては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
等が挙げられる。
　また、上記環状ペプチドとしては、例えば、下記の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１１（Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１２（Ｌ－Ｔｒｐ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１３（Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１４（Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１５（Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１６（Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ）、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１７（Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ａｌａ）、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１８（Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ）等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　（２）環状アミド前駆体
　本発明で使用する環状アミド前駆体は、一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、Ｒ及びＲＡは、前記に同じである。］
で表される化合物である。
　一般式（２）において、ＲＡで示される基が水素原子ではなく、炭化水素基である場合には、通常、環化反応が進行しにくくなると考えられる。しかしながら、本発明の方法によれば、ＲＡで示される基が炭化水素基である場合にも環化反応を進行させやすいとの利点を有する。
　なかでも、本発明の目的物である環状アミドが環状ペプチドである場合、環状アミド前駆体は、一般式（２ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、ＲＡ、ＲＣ、ＲＮ、ＲＰ及びｎは前記に同じである。］
で表される環状ペプチド前駆体である。
　本発明で使用する上記環状アミド前駆体としては、これまでに環化が達成されている環状アミド前駆体を採用することもできるし、これまでに環化が達成されていない環状アミド前駆体を採用することもできる。本発明の方法によれば、これまでに環化が達成されている環状アミド前駆体を高い収率で環化することができるし、これまでに環化が達成されていない多様な環状アミド前駆体を環化することができる。このため、本発明の方法によれば、創薬スクリーニングのためのアミドライブラリー及びペプチドライブラリーを提供することが可能となる。
　以上から、上記環状アミド前駆体としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
等が挙げられる。
　また、上記環状ペプチド前駆体としては、例えば、下記の、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２１（Ｈ－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨ）、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２２（Ｈ－Ｌ－Ｔｒｐ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨ）、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２３（Ｈ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ）、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２４（Ｈ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ）、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２５（Ｈ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨ）、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２６（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ）、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２７（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ａｌａ－ＯＨ）、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２８（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ）等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（３）縮合剤
　本発明で使用できる縮合剤は、一般式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
［式中、Ｘは、ハロゲン原子を示す。Ｙは、置換されていてもよいアルキル基を示す。］で表される化合物である。
　一般式（３）において、Ｘで示される基は、ハロゲン原子である。
　Ｘで示されるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、収率、経済性、安全性等の観点から、塩素原子又は臭素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。
　一般式（３）において、Ｙで示されるアルキル基としては、特に制限はなく、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等の炭素数１～１０（特に１～６）の直鎖状アルキル基の他、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数３～１０（特に３～６）の分岐鎖状アルキル基も挙げられる。Ｙで示されるアルキル基としては、環状アミド前駆体及び３級アミン化合物との反応性の観点から、炭素数３～１０の分岐鎖状アルキル基が好ましく、炭素数３～６の分岐鎖状アルキル基がより好ましく、イソプロピル基がさらに好ましい。
　以上から、本発明で使用する縮合剤としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
等が挙げられる。
　これらの縮合剤は、単独で用いることもでき、２種以上を組合せて用いることもできる。
　縮合剤の使用量は、特に制限されず、広い範囲内から適宜選択することができる。夾雑物の生成抑制、収率向上等の観点から、環状アミド前駆体１モルに対して、０．１～１０モル程度が好ましく、０．２～５モル程度がより好ましく、０．５～３モル程度がさらに好ましい。
　（４）３級アミン化合物
　本発明で使用できる３級アミン化合物は、一般式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。或いは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち２つ以上が連結して１個以上のヘテロ原子又は置換基を有していてもよい環（ただし、ピリジン環を除く）を形成していてもよい。］
で表される化合物（ただし、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリエチルアミンを除く）である。ここで、「トリブチルアミンを除く」とは、トリ－ｎ－ブチルアミン、トリ－ｓ－ブチルアミン、トリ－ｔ－ブチルアミン、及びトリイソブチルアミンを除くことを意味する。
　一般式（４）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３で示されるアルキル基としては、特に制限はなく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等の炭素数１～１０（特に１～６）の直鎖状アルキル基の他、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等の炭素数３～１０（特に３～６）の分岐鎖状アルキル基も挙げられる。
　一般式（４）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３で示されるアリール基としては、特に制限はなく、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等の炭素数６～１８のアリール基（特に６～１４）が挙げられる。
　一般式（４）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３で示されるヘテロアリール基としては、特に制限はなく、単環ヘテロアリール基及び多環ヘテロアリール基のいずれも採用でき、例えば、ピロリジル基、ピロリル基、テトラヒドロチエニル基、チエニル基、オキソラニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３で示されるアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アルキル基、上記アリール基、アルコキシ基、アミノ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、１～６個が好ましく、１～３個がより好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち２つ以上が連結して、１個以上のヘテロ原子又は置換基を有していてもよい環（ただし、ピリジン環を除く）を形成していてもよい。上記環としては、特に制限はなく、例えば、アジリジン環、アジリン環、ジアジリジン環、ジアジリン環、アゼチジン環、アゼト環、ジアゼト環、ピロリジン環、ピロール環、イミダゾリジン環、イミダゾール環、ピぺリジン環、ピペラジン環、モルホリン環等が挙げられる。
　なかでも、収率向上の観点から、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち少なくとも１つはメチル基であることが好ましく、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち少なくとも２つはメチル基であることがより好ましい。
　以上から、本発明で使用する３級アミン化合物としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
等が挙げられる。
　なかでも、本発明で使用できる３級アミン化合物としては、収率向上の観点から、ジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ）、トリメチルアミン（Ｍｅ３Ｎ）、ジメチルエチルアミン（Ｍｅ２ＮＥｔ）、ジメチルｎ－ヘキシルアミン（Ｍｅ２Ｎｎ－Ｈｅｘ）、１－メチルピロリジンが好ましく、ジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ）、トリメチルアミン（Ｍｅ３Ｎ）、ジメチルエチルアミン（Ｍｅ２ＮＥｔ）、ジメチルｎ－ヘキシルアミン（Ｍｅ２Ｎｎ－Ｈｅｘ）がより好ましい。
　これらの３級アミン化合物は、単独で用いることもでき、２種以上を組合せて用いることもできる。
　３級アミン化合物の使用量は、特に制限されず、広い範囲内から適宜選択することができる。目的とする環状アミドの収率、経済性等の観点から、環状アミド前駆体１モルに対して、０．１～１０モル程度が好ましく、０．２～５モル程度がより好ましく、０．５～３モル程度がさらに好ましい。なお、３級アミン化合物の使用量が増えるとともに目的物である環状アミドの収率も向上する一方、３級アミン化合物を過剰に用いても、目的物である環状アミドの収率はほとんど向上しない。このため、経済性の観点も加味し、３級アミン化合物の使用量を適宜調整することが好ましい。
　５．反応溶媒
　本発明の反応工程は、特に制限されず、例えば、基質が溶解するいずれの有機溶媒、水又はこれらの混合溶媒中で行うことができるが、基質の溶解性の観点から、非プロトン性極性溶媒を含む溶媒中で行うことが好ましい。
　また、本発明の反応工程に用いられる非プロトン性極性溶媒としては、特に制限されるわけではないが、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン溶媒；１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルホルムアミド等のアミド溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド溶媒、アセトニトリル等のニトリル溶媒及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのうち、基質溶解性、低反応性、除去容易性、環境負荷の観点から、エーテル溶媒、ニトリル溶媒等が好ましく、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等がより好ましい。これらの溶媒は単独で用いることもでき、２種以上を組合せて用いることもできる。
　特に、有機溶媒のみには溶解しにくい環状アミド（前駆体）又は環状ペプチド（前駆体）を溶解するための溶媒としては、水及び非プロトン性極性溶媒の混合溶媒を採用することが好ましく、水及びアセトニトリル、水及び１，４－ジオキサン、水及びテトラヒドロフランの混合溶媒を採用することがより好ましい。上記混合溶媒の混合割合（水：非プロトン性極性溶媒）としては、体積比で１０：９０～９０：１０程度が好ましく、７５：２５～２５：７５程度がより好ましく、５０：５０がさらに好ましい。
　６．環状アミドの製造方法
　本発明の目的物である環状アミドは、上記環状アミド前駆体と、上記縮合剤と、上記３級アミン化合物とを反応させることにより、製造することができる。反応は特に制限はなく、全ての成分を同時に投入することもできるし、逐次的に投入することもできる。
　本発明の反応工程は、バッチ法及びフロー法のいずれによっても行うことができる。高い安全性やスケールアップの容易さ等の観点から、フロー法がより好ましく、反応温度や反応時間の精密な制御が可能等の観点からマイクロフロー法がさらに好ましい。
　なお、本明細書において、バッチ法とは、回分操作、具体的には、反応容器又は反応装置に、反応にあずかる物質を一度に仕込んで反応させ、平衡又は一定の反応率に達してから取り出すまでの一連の操作を意味する。本明細書において、フロー法とは、連続操作、具体的には、原料とその処理に必要な物質を装置内に一定の割合（流量）で連続的に送入し、且つ排出する操作を意味する。
　本明細書において、マイクロフロー法とは、マイクロフローリアクターを使用したフロー法（連続操作）を意味する。
　なかでも、本発明の反応工程は、マイクロフローリアクターを使用して実施することができる。マイクロフローリアクターは、例えば、反応に用いられる原料又は中間体を含む流体を輸送する流路と、当該流体を当該流路に送入するためのポンプと、当該流体を混合するための混合機と、を備える。
　マイクロフローリアクターの使用について、例えば、縮合剤と３級アミン化合物との反応をマイクロフローリアクターで行うのであってもよく、縮合剤と３級アミン化合物との反応により生成した高反応性活性種と、環状アミド前駆体との反応をマイクロフローリアクターで行うのであってもよい。縮合剤や上記高反応性活性種の安定性、反応効率の観点から、環状アミド前駆体及び３級アミン化合物とを含む流体と、当該流体以外の、縮合剤を含む流体とを、マイクロフローリアクターを使用して混合して反応させることが好ましい。
　なお、本発明の環状アミドの製造方法は、マイクロフローリアクターを使用して実施するものに限定されず、例えば、容積が小さく高速な攪拌速度が得られるバッチ容器を用いてもよい。バッチ容器の混合部の体積は、１～１００ｍＬであってもよく、５～５０ｍＬであってもよい。
　以下、上記マイクロフローリアクターの形態と、それを用いた本発明の環状アミドの製造方法を、図１を参照して説明する。ただし、本発明の製造方法は、図１の実施形態に限られないことは言うまでもない。
　図１は、マイクロフローリアクター１の概略的な構成を示す模式図である。マイクロフローリアクター１は、第１の液を収容するタンク１１と、第２の液を収容するタンク１２と、第３の液を収容するタンク１３とを備えることができる。
　一例として、第１の液は環状アミド前駆体を含み、第２の液は３級アミン化合物を含み、第３の液は縮合剤を含むことができる。他の一例として、第１の液は環状アミド前駆体及び３級アミン化合物を含み、第２の液は縮合剤を含み、第３の液は反応停止剤を含むことができる。マイクロフローリアクターの使用について、例えば、少なくとも第１の液と第２の液との混合物と、第３の液との混合をマイクロフローリアクターで行うのであってもよく、更には、第１の液と第２の液との混合をマイクロフローリアクターで行うのであってもよい。
　マイクロフローリアクター１は流体を輸送するための流路ｆ１，ｆ２，ｆ３，ｆ４及びｆ５を備えることができる。流路の内径は、例えば、０．１～１０ｍｍであってもよく、０．３～１ｍｍであってもよい。マイクロフローリアクター１は流体を混合するための混合機３１及び３２を備えることができる。混合機としては、特に制限されないが、例えば、流体が流入されることで流体の混合が達成される、Ｖ字ミキサー、Ｔ字ミキサー等を採用することができる。このような混合機内では、流路内で発生する巻込流によって、２液界面積を増大させ、２液以上の反応液を数ミリ秒で混合しやすい。混合機内部の流路の内径は、例えば、０．１～１０ｍｍであってもよく、０．２～１ｍｍであってもよい。
　上記流路の内径とは、流路の長さ方向と直角に交わる方向での流路断面における、流路内部分（流体が通る部分）の直径とすることができる。流路内部分の形状が真円形でない場合には、上記の流路の内径とは、上記流路内部分の形状を面積基準で真円換算したときの直径とすることができる。
　タンク１１，１２，１３及び１４、混合機３１及び３２、並びに流路ｆ１，ｆ２，ｆ３，ｆ４及びｆ５は、一例として、プラスチックやエラストマー等の樹脂や、ガラス材、金属、セラミックなどで形成され得る。 
　タンク１１はポンプ２１に接続し、ポンプ２１の作動により、タンク１１に収容された第１の液は、流路ｆ１内を移動して混合機３１に流入することができる。タンク１２はポンプ２２に接続し、ポンプ２２の作動により、タンク１２に収容された第２の液は、流路ｆ２内を移動して混合機３１に流入され得る。そして、第１の液及び第２の液は、混合機３１により混合されて第１の混合液となり、流路ｆ４へと送られ得る。一方、タンク１３はポンプ２３に接続し、ポンプ２３の作動により、タンク１３に収容された液は、流路ｆ３内を移動して混合機３２へと流入し、第１の混合液と混合されて第２の混合液となり、流路ｆ５へと送られ得る。第２の混合液は、タンク１４に貯留され得る。
　上記マイクロフローリアクター１によれば、反応溶液の体積あたりの熱交換を行う面積を大きくしやすい。加えて、流量や流路の長さによって反応時間を制御しやすい。このため、反応溶液の厳密な制御を可能としやすく、結果、所望しない副反応の進行を最小化しやすく、目的物の収率を向上させやすい。
　このように、本発明の環状アミドの製造方法は、液相法により実施できることから、スケールアップが容易である。
　マイクロフローリアクターを使用した反応終了後は、必要に応じて、通常の単離及び精製工程を経て、目的化合物である環状アミドを得ることができる。
　また、通常のペプチド合成では単離及び精製工程に煩雑な作業を要するところ、本発明によれば、反応後に生成する夾雑物が少なく、かつ除きやすい縮合剤を用いて、高い収率で環状ペプチドを得やすいため、これらの工程を省略又は簡略化することができ、そのまま結晶化や分析に供することができる。
　７．その他の条件
　本発明においては、上記成分以外にも、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜添加剤を使用することができる。上記添加剤としては、例えば、界面活性剤、ペプチドカップリング剤、クラウンエーテル、金属塩等が挙げられる。
　本発明の反応工程の反応温度は、環化効率の向上、エピメリ化の抑制、二量体化の抑制、反応時間の短縮等の観点から、０～１００℃が好ましく、２０～８０℃がより好ましく、４０～８０℃がさらに好ましい。反応時間は、環化反応が進行する時間とすることができ、環化収率向上、エピメリ化抑制等の観点から、１０秒～１２時間が好ましく、１０秒～６時間がより好ましく、１０秒～１時間がさらに好ましい。好適には、本発明の反応工程がマイクロフロー法により行われる場合に、反応時間を１０分未満とすることができ、より好ましくは５分未満とすることができ、さらに好ましくは１分未満とすることができる。
　８．反応メカニズム
　本発明の方法においては、３級アミン化合物と縮合剤とが反応して、アシルアンモニウムカチオン（以下のスキーム１における化合物５）が生成すると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　ここで、Makromol. Chem., Macromol. Symp. 1992, 54/55, 397-412.によれば、イオン性の求核剤（例えば、水酸化物イオン、フェノキシドアニオン）と、イオン性のアシルアンモニウムカチオンとの静電相互作用により下記の反応が促進されることが報告されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　上記の報告を基に、本発明においても同様の反応機構により反応が進行するものと考えられる。まず中性の３級アミン化合物が中性の化合物と反応し、高反応性活性種である、イオン性のアシルアンモニウムカチオンを生成する。このイオン性のアシルアンモニウムカチオンは、イオン性のカルボキシラートと反応しやすい。このように、本発明の方法によって環状アミド及び環状ペプチドの収率を向上させやすいのは、縮合剤と３級アミン化合物の反応により得られるアシルアンモニウムカチオンが、環状アミド前駆体のＣ末端を選択的に活性化し、また、続く環化反応も迅速に進行するためだと説明できる。本発明の方法では、中性に近い条件で、短時間で反応させられることから、多様な基質に適用することができる。さらに、本発明の方法では、反応工程が上記反応機構により進行することにより、環化に伴うエピメリ化及び二量体化を抑制することができ、好ましくは、環化に伴うエピメリ化及び二量体化を実質的に回避することができる。
　上記反応機構については、環状カルボナートの合成研究において、唯一Brunelleらが上述のイオン同士の相互作用の存在の可能性について言及しているに過ぎず、過去にそれ以外の報告はない。反応工程が上記の反応機構により進行することは、アミド化においては初めて得られた知見である。
　以下、実施例および比較例を示し、本発明の特徴とするところを一層明確にするが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　［実施例１］
　３級アミン化合物及び溶媒の検討（モデル基質）
　本発明の環状アミドの製造方法は、環状アミド前駆体の（ｉ）Ｃ末端の活性化と（ｉｉ）環化縮合の２段階で進行する。そこで、まず環状アミド前駆体のＣ末端の選択的な活性化を可能にする条件を探索するため、それぞれの末端モデルとして単純な構造のモデル基質を用いて検討した。Ｃ末端モデル基質である３－フェニルプロピオン酸のカリウム塩１（０．１００Ｍ、１．０モル当量）と、Ｎ末端モデル基質である２－フェニルエチルアミン２（０．１００Ｍ、１．０モル当量）、３級アミン化合物（０．１００Ｍ、１．０モル当量）を溶媒Ｘと水の混合溶媒に溶解させ、クロロギ酸イソプロピル（０．０５０Ｍ、１．０モル当量）を溶媒Ｙに溶解させた。３－フェニルプロピオン酸のカリウム塩１と２－フェニルエチルアミン２の混合溶媒溶液を流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎで、クロロギ酸イソプロピルの溶媒Ｙ溶液を流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎでＶ字ミキサーに注入し、６０℃で３０秒間反応させた（表１）。続いて、反応混合物と過剰量のヘキシルアミン７の溶媒Ｙ溶液（１．０００Ｍ、１０．００モル当量）をＴ字ミキサーに注入することで、反応を停止した。生成物の収率はＨＰＬＣ－ＵＶ解析で求めた。アミド３の生成は、所望のＣ末端の活性化が進行したことを示し、逆にカルバマート４の生成は、所望していないＮ末端との反応が進行したことを示している。なお、３－フェニルプロピオン酸のカリウム塩１とヘキシルアミン７との反応物は検出されなかった。
　アセトン、１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のいずれの溶媒を用いた場合もアミド３とカルバマート４の反応選択性（３／４）（以下、「Ｃ末端選択性」と称する。）は高かった（表１、実施例１－１～１－５）。以降の実施例では、広範な基質に対する溶解性の高さ、環状アミド前駆体の側鎖官能基との副反応のリスクの低さ、沸点が比較的低く除去しやすいこと、環境に対して負荷の小さいアセトニトリルを使用して塩基の検討を行うこととした（実施例１－９）。
　塩基を用いない場合、所望していないカルバマート４が７７％で得られ、所望のアミド３は全く得られなかった（比較例１－１９）。ピリジン、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの複素環アミンを用いた際も、所望のアミド３はほとんどもしくは全く得られなかった。一方で興味深いことに、メチル基を二つ以上含む三級アルキルアミンを用いると、Ｃ末端選択性が向上した（実施例１－６～１－９）。とりわけ、ジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ）を用いた際は、所望のアミド３の収率がカルバマート４の収率の約３倍高くなった。メチル基を１つ含む三級アルキルアミンを使用すると、Ｃ末端選択性が低下し（実施例１－１１～１－１４）、メチル基を１つも含まない、かさ高い三級アルキルアミンを使用するとほとんど所望のアミド３は得られなかった（比較例１－１７及び１－１８）。この結果から、塩基性ではなく、アルキルアミンのかさ高さによる求核性が反応のＣ末端選択性に大きな影響をおよぼしているものと推測した。実際に、ジエチルメチルアミン（Ｅｔ２ＮＭｅ）（ｐＫａＨ＝１０．３）とトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（ｐＫａＨ＝１０．８）では塩基性度はほぼ同等であるが、所望のアミド３の収率は大きく異なっている（それぞれ２１％、０％）。興味深いことに、ピリジン及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）は低いＣ末端選択性を示した（比較例１－１５及び１－１６）。現在のところ詳細な理由は不明であるが、ピリジンに関してはアシルピリジニウムカチオンの生成量が少なすぎること、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）に関しては、生じるカチオンが安定化されているために反応性が不十分であることが考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Ｎ－フェネチル－３－フェニルプロパミド（表１、アミド３）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ7.35-7.14 (m, 8H), 7.14-7.05 (m, 2H), 5.45 (brs, 1H), 3.46 (td, J = 6.8 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.72 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ172.1, 141.0, 139.0, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 126.6, 126.3, 40.7, 38.6, 35.8, 31.8 ppm; LCMS: calcd for [C17H19NO+H]+ 254.15, found 254.20。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
イソプロピルフェネチルカルバメート（表１、カルバメート４）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ7.35-7.10 (m, 5H), 4.98-4.83 (m, 1H), 4.65 (brs, 1H), 3.41 (dt, J = 7.2 Hz, 2H）, 2.80 (t, J = 6.8 Hz, 2H),1.20 (d, J = 6.4 Hz, 6H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ156.3, 139.0, 128.9, 128.7, 126.5, 68.0, 42.1, 36.3, 22.3 ppm; LCMS: calcd for [C40H43N3O6+H]+ 208.13 found 208.20。
　［実施例２］
　イオン相互作用の検討（モデル基質）
　実施例１において、最も高いＣ末端選択性でアミド３を与えたジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ）を用いて、上述のイオン性の求電子剤と求核剤の組み合わせによる反応性向上について調査することとした（表２)。すなわち、表１の塩基の検討と同じ濃度、当量、温度、時間条件で３－フェニルプロピオン酸のカリウム塩１と２－フェニルエチルアミン２およびクロロギ酸イソプロピルとの反応において、塩化リチウムを添加してＣ末端選択性の変化を観察することとした。もしもイオン同士の相互作用がＣ末端選択性の向上に重要であるならば、塩化リチウムの添加により、相互作用が阻害されて、Ｃ末端選択性が低下する可能性があると考えたためである。その結果、塩化リチウムの添加により、添加量依存的なＣ末端選択性の低下が観察された。このことから、求電子剤と求核剤の間のイオン相互作用がＣ末端選択性発現に重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられる。我々が知る限り、環状カルボナートの合成研究において、唯一Brunelleらが上述のイオン同士の相互作用の存在の可能性について言及しているが、それ以外に報告はなく、アミド化においては初めて得られた知見である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　［実施例３］
　基質適用範囲の検討（モデル基質）
　見出した反応条件の基質適用範囲を精査するため、より環状ペプチドのＣ、Ｎ末端構造に近いアミノ酸から誘導されたモデル基質５と６を用いて検討を行った。所望のＣ末端モデル５が活性化されるとＣ末成績体７及び８が得られ（Ｃ末成績体８は、Ｃ末端モデル５とＮ末端モデル６のアミド化が遅い反応において、反応停止剤のｎ－ヘキシルアミン（Ｈ２Ｎ－ｎ－Ｈｅｘ）と５が反応して生成する）、逆にＮ末端モデル６が活性化されると所望しないＮ末成績体９が得られる。Ｃ末成績体７及び８の合算収率とＮ末成績体９の収率との比からＣ末端選択性（７＋８）／９を算出した（表２）。グリシン（Ｇｌｙ）から誘導したＣ末端モデル５ａとＧｌｙ及びアラニン（Ａｌａ）から誘導したＮ末端モデル６ａ及び６ｃとの反応では中程度から高いＣ末端選択性が観察された（実施例３－１及び３－３）。５ａと、さらにかさ高いＮ－メチルアラニン（ＭｅＡｌａ）から誘導されたＮ末端モデル６ｄとの反応でも、予測通り、高いＣ末端選択性が観察され、多量のＣ末成績体７が得られた（実施例３－４）。一方で、５ａとサルコシン（Ｓａｒ）から誘導したＮ末端モデル６ｂとの反応ではＣ末端選択性が低下した（実施例３－２）。これはＳａｒの２級アミン部位の高い求核性に由来するものと考えられる。また、Ａｌａから誘導したＣ末端モデル５ｂとＧｌｙから誘導したＮ末端モデル６ａとの反応においても、予想外に高いＣ末端選択性が観察された（実施例３－５）。このことから、実際に環状ペプチド合成においてもＣ末端の選択的活性化が可能になる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
ベンジル（２－（（２－（ベンジルアミノ）－２－オキソエチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体７ａ）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.45-7.20 (m, 10H), 6.68 (brs, 1H), 6.47 (brs, 1H), 5.38 (brs, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.44 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.98 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.87 (d, J = 5.6 Hz, 2H) ppm; 13C NMR (100 MHz, DMSO): δ170.1, 169.3, 157.1, 139.8, 137.5,128.9, 128.8, 128.3, 128.3, 127.7, 127.3, 66.1, 44.2, 42.5, 31.2 ppm; LCMS: calcd for [C19H21N3O4+H]+ 356.10 found 356.25。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
ベンジル（２－（ヘキシルアミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体８ａ）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.38-7.31 (m, 5H), 5,96 (brs, 1H), 5.41 (brs, 1H), 5.13 (s, 2H), 3.83 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.24 (td, J = 6.4 Hz, 2H), 1.48 (brs, 2H), 1.28 (brs, 6H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ169.1, 156.8, 136.2, 128.6, 128.3, 128.1, 67.1, 44.6, 39.6, 31.5, 29.4, 26.6, 22.6, 14.1 ppm.; LCMS: calcd for [C16H24N2O3+H]+ 293.18, found 293.25。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
イソプロピル（２－（ベンジルアミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（表２、Ｎ末成績体９ａ）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.35-7.29 (m, 5H), 6.27 (brs, 1H), 5.14 (brs, 1H), 4.93-4.83 (m, 1H), 4.47 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.87 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 1.22 (d, J = 6.4 Hz, 6H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ169.3, 156.7, 138.0, 128.8, 127.8, 127.7, 69.1, 44.7, 43.6, 22.2 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C13H18N2O3+Na]+ 273.1210, found 273.1156。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
ベンジル（２－（（２－（ベンジルアミノ）－２－オキソエチル）（メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体７ｂ）：回転異性体を観測。下記は主異性体。
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.35-7.24 (m, 10H), 6.38 (brs, 1H), 5.65 (brs, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.43 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.06 (s, 4H), 3.10 (s, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3/CD3OD): δ169.8, 168.7, 157.0, 137.8, 136.1, 128.2, 128.1, 127.7, 127.5,127.1, 126.9, 66.6, 51.1, 42.8, 42.0, 35.2 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C20H23N3O4+Na]+ 392.1581, found 392.1579。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
イソプロピル（２－（ベンジルアミノ）－２－オキソエチル）（メチル）カルバメート（表２、Ｎ末成績体９ｂ）：回転異性体を観測。下記は主異性体。
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.38-7.18 (m, 5H), 6.47 (brs, 1H), 4.96-4.80 (m, 1H), 4.48 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.95 (s, 2H), 2.98 (s, 3H), 1.21 (brs, 6H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ169.2, 157.0, 138.1, 128.7, 128.5, 127.6, 69.6, 53.5, 43.3, 36.0, 22.1 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C14H20N2O3+Na]+ 287.1366 found 287.1338。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
ベンジル（Ｓ）－（２－（（１－（ベンジルアミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体７ｃ）
White solid; 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.34-7.22 (m, 10H), 5.03 (s, 2H), 4.44-4.37 (m, 3H), 3.79 (s 2H), 1.36 (d, J = 7.6 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, DMSO): δ172.0, 168.7, 156.5, 139.3, 137.0, 128.4, 128.3, 127.8, 127.7, 127.0, 126.7, 65.5, 48.1, 43.5, 41.8, 18.3 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C20H23N3O4+Na]+ 392.1581, found 392.1469。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
イソプロピル（Ｓ）－（１－（ベンジルアミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（表２、Ｎ末成績体９ｃ）：
White solid; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.38-7.18 (m, 5H), 6.43 (brs, 1H), 5.07 (brs, 1H), 4.95-4.78 (m, 1H), 4.45 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.30-4.10 (m, 1H), 1.40 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.8 Hz, 3H) , 1.21 (d, J = 5.6 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ172.5, 156.0, 138.1, 128.8, 127.7, 127.6, 68.9, 50.5, 43.6, 31.1, 22.2, 18.7 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C14H20N2O3+Na]+ 287.1366 found 287.1338。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
ベンジル（Ｓ）－（２－（（１－（ベンジルアミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体７ｄ）：回転異性体を観測。下記は主異性体。
White solid; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.40-7.15 (m, 10H), 6.54 (brs, 1H), 5.73 (brs, 1H), 5.20-5.05 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.46-4.28 (m, 2H), 4.10-3.85 (m, 2H), 2.87 (s, 3H), 1.34 (d, J = 7.2 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ170.4, 169.4, 156.3, 138.3, 136.3, 128.6, 128.5, 128.2, 128.0, 127.5, 127.4, 66.9, 52.3, 43.3, 42.9, 29.6, 13.7 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C21H25N3O4+Na]+ 406.1737, found 406.1737。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
イソプロピル（Ｓ）－（１－（ベンジルアミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）（メチル）カルバメート（表２、Ｎ末成績体９ｄ）：回転異性体を観測。下記は主異性体。Colorless oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.38-7.20 (m, 5H), 6.49 (brs, 1H), 4.95-4.86 (m, 1H), 4.77 (brs, 1H), 4.48 (dd, J = 5.6, 14.8 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 5.6, 14.8 Hz, 1H), 2.81 (s, 3H), 1.38 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21 (d, J= 6.0 Hz, 6H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ171.4, 156.7, 138.3, 128.5, 127.4, 126.4, 69.4, 53.8, 43.3, 29.3, 22.1, 13.8 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C15H22N2O3+Na]+ 301.1523, found 301.1522。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
ベンジル（Ｓ）－（１－（（２－（ベンジルアミノ）－２－オキソエチル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体７ｅ）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.40-7.17 (m, 10H), 7.02 (brs, 2H), 5.50 (d , J = 5.6 Hz 1H), 4.98 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 12.0, 1H), 4.50-4.30 (m, 2H), 4.25-4.10 (m, 1H), 3.98 (dd, J = 4.4, 16.0 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 4.4, 16.0 Hz, 1H), 1.33 (d, J = 6.8 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ173.3, 168.8, 156.4, 138.0, 136.1, 128.7, 128.7, 128.4, 128.2, 127.9, 127.6, 67.2, 51.1, 43.5, 43.3, 18.2 ppm; LCMS: calcd for [C20H23N3O4+H]+ 370.17 found 370.25。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
ベンジル（１－（ヘキシルアミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバメート（表２、Ｃ末成績体８ｂ）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.40-7.23 (m, 5H), 6.08 (brs, 1H), 5.37 (brs, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.27-4.10 (m, 1H), 3.22 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.55-1.35 (m, 2H), 1.40-1.30 (m, 3H),1.28 (brs, 6H), 0.95-0.80 (m, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ172.3, 156.1, 136.3, 128.6, 128.3, 128.0, 67.0, 50.6, 39.6, 31.5, 29.5, 26.6, 22.6, 18.9, 14.1 ppm; LCMS: calcd for [C17H26N2O3+Na]+ 307.19 found 307.30。
　［実施例４］
　環状ペプチドの合成（保護Stellarin G）
　環状ペプチド合成における反応条件を検討した（表４）。環状ペプチドのモデル基質として、中国の医薬品用ハーブとして知られる５残基の環状ペプチドであるStellarin Gを選択した。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２１（Ｈ－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨ・ＨＣｌ，０．０１０Ｍ，１．０モル当量）、水酸化カリウム（０．０２０Ｍ，２．０モル当量）、３級アミン化合物（１．０モル当量 ）のアセトニトリルと水の１：１混合溶媒（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル６(１．０モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）をＶ字ミキサーに流し込み、６０℃で３０秒間反応させた。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１１（保護Stellarin G；Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）の収率はＨＰＬＣ－ＵＶ解析で算出した。ジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ）１．０モル当量とした場合は６２％と、中程度の収率であったが、過剰量である２．０モル当量添加することで、９９％と高収率で得ることに成功した（表４、実施例４－１及び４－２）。さらに塩基の当量を増やした場合でも環状ペプチド１１を定量的に得ることに成功した（表４、実施例４－３）。
　Ｍｅ２ＮＢｎの塩基の効果について改めて確認するため、表１の検討でＣ末端選択性が発現しなかったジイソプロピルエチルアミン（ｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ）を用いて反応を検討したところ、予測通り、全く環状ペプチドは得られなかった（表４、比較例４－４）。
　マイクロフローリアクター内で、高収率で環状ペプチドを得ることが出来た条件（表４、実施例４－３）で同様の環状ペプチド１１及びその前駆体２１についてバッチ（攪拌速度：１０００ｒｐｍ）で検討したところ、ＨＰＬＣ－ＵＶ収率で９９％であった。
　以上から、本発明の方法における環化は、上述のモデル基質を用いた場合と同様の反応機構で進行していると考えられる。ジメチルベンジルアミンとクロロギ酸イソプロピルによる高反応性活性種は極めて反応性が高く、迅速に環状ペプチド前駆体のＣ末端を活性化することができ、続く反応も早いことから、環状ペプチド１１を高収率で得ることに成功したと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
保護Stellarin G：
White solid, 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.45-8.31 (m, 3H), 8.17 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 8.08 (brs, 1H ), 7.48-7.25 (m, 5H), 7.11 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 5.05 (s, 2H), 4.35 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 4.30-4.15 (m, 1H), 4.13-4.03 (m, 2H), 3.95-3.85 (m, 1H), 3.50-3.40 (m, 1H), 2.93 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H), 1.45-1.30 (m, 2H), 1.22 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 0.78 (d, J = 5.6 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, DMSO): δ172.4, 171.9, 171.6, 170.5, 168.9, 157.0, 137.2, 130.1, 129.5 128.4, 127.8, 127.6, 114.4, 69.1, 55.8, 53.9, 49.8, 48.4, 43.2, 36.0, 24.3, 22.9, 21.4, 17.3 ppm; HRMS (ESI):calcd for [C30H39N5O6+H]+ 588.2793, found 588.2792。
　［実施例５］
　環状ペプチドの合成（Stellarin G類縁体）
　異なる環状アミド及び環状ペプチドにも本発明が適用可能か検討するため、環状アミド及び環状ペプチドのモデル基質として、Stellarin G類縁体を選択した。具体的には、実施例４の保護Stellarin Gのチロシン（Ｔｙｒ）残基をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基に代え、且つ、アラニン（Ａｌａ）残基をトリプトファン（Ｔｒｐ）残基に代えて、次の通りに環状ペプチドを製造した。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２２（Ｈ－Ｌ－Ｔｒｐ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨ・ＴＦＡ，０．０１０Ｍ，１．０モル当量）、水酸化カリウム（０．０２０Ｍ，２．０モル当量）、及びジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ，０．０２０Ｍ，２．０モル当量)のアセトニトリルと水の１：１混合溶液（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル(０．０２０Ｍ，２．０モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）とをシリンジポンプによって６０℃でＶ字ミキサーに導入した。反応途中の混合物は、同じ温度で反応チューブ（内径０．８ｍｍ、長さ２３８８ｍｍ、体積１２００μＬ、反応時間１０秒）に導入され、６０秒かけて定常状態に達した後、反応後の混合物を室温で２４０秒間試験管に注いだ。２分間攪拌した後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）２ｍＬと混合し、有機層を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。そして、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）／ヘキサンで再結晶により精製した。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１２（Stellarin G類縁体；Ｌ－Ｔｒｐ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）の単離収率は、８６％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
Stellarin G類縁体：
White solid, mp: > 245 ℃ (decomposed and change to black solid); IR (neat): 3730, 3058, 2954, 1651, 1534, 740 cm-1; [α]25 D = -130.7 (c 0.12, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.62 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.25-7.00 (m, 8H), 4.61 (dd, J = 6.8 Hz, 1H), 4.30-4.20 (m, 2H), 4.13 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 10.8, 4.8 Hz, 1H), 3.37 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 15.2, 6.8 Hz, 1H), 3.07 (dd, J = 15.2, 8.0 Hz, 1H), 3.03 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 1.89-1.80 (m, 1H), 1.55-1.45 (m, 1H), 1.48 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 1.33-1.30 (m, 1H), 0.89 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H) ppm;13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 174.9, 174.2, 173.6, 172.1, 138.3, 138.1, 130.2, 129.5, 128.6, 127.7, 124.3, 122.5, 119.8, 119.4, 112.3, 110.9, 58.7, 56.5, 56.0, 50.6, 44.6, 40.9, 37.4, 28.2, 25.8, 23.5, 21.6, 17.3 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C31H38N6O5+Na]+ 597.2796, found 597.2796。
　［実施例６］
　環状ペプチドの合成（保護Dianthin I）
　次に、異なる環状アミド及び環状ペプチドにも本発明が適用可能か検討するため、環状アミド及び環状ペプチドのモデル基質として、抗癌剤として知られる５残基の環状ペプチドであるDianthin Iを選択した。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２３（Ｈ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ・ＴＦＡ，０．０１Ｍ，１．０モル当量）、水酸化カリウム（０．０２Ｍ，２．０モル当量）、及びジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ，０．０３Ｍ，３モル当量)のアセトニトリルと水の１：１混合溶液（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル(０．０１５Ｍ，３モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）とをシリンジポンプによって６０℃でＶ字ミキサーに導入した。反応途中の混合物は、同じ温度で反応チューブ（内径０．８ｍｍ、長さ２３８８ｍｍ、体積１２００μＬ、反応時間１０秒）に導入され、３０秒かけて定常状態に達した後、反応後の混合物を室温で１２０秒間試験管に注いだ。２分間攪拌した後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）２ｍＬと混合し、有機層を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。そして、ＧＰＣによって精製した。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１３（保護Dianthin I；Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）の単離収率は、７２％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
保護Dianthin I：
21.6 mg, 0.034 mmol, 72%.
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): (broad NMR signals were observed probably due to existence of conformational isomers) δ 7.99-7.80 (m, 1H), 7.70-7.55 (m, 1H), 7.40-7.00 (m, 17H), 4.85-4.60 (m, 2H), 4.48-4.23 (m, 3H), 4.20-4.00 (m, 1H), 3.80-3.75 (m, 1H), 3.65-3.45 (m, 3H), 3.41-3.21 (m, 4H), 3.09-2.95 (m, 2H), 1.89-1.20 (m, 4H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.4, 171.0, 170.4, 169.8, 169.7, 138.3, 137,4, 136.4, 129.5, 129.4, 128.7, 128.5,128.5, 128.0, 127.8, 127.2, 126.5, 73.2, 69.5, 61.5, 56.8, 53.2, 52.8, 47.0, 43.8, 39.7, 34.9, 31.6, 22.0 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C35H39N5O6+H]+ 648.2793, found 648.2796。
　［実施例７］
　環状ペプチドの合成（Dianthin I）
　無保護の環状アミド及び環状ペプチドにも本発明が適用可能か検討した。アミノ酸残基が有する保護基を取り除いた以外は、つまり、保護基であるベンジル基を水素原子に代えた以外は、実施例６と同様にして、環状ペプチドであるDianthin Iを製造した。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２４（Ｈ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ・ＴＦＡ，０．０１０Ｍ，１．０モル当量）、水酸化カリウム（０．０２０Ｍ，２．０モル当量）、及びジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ，０．０３０Ｍ，３．０モル当量)のアセトニトリルと水の１：１混合溶液（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル(０．０１５Ｍ，３．０モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）とをシリンジポンプによって８０℃でＶ字ミキサーに導入した。反応途中の混合物は、同じ温度で反応チューブ（内径０．８ｍｍ、長さ２３８８ｍｍ、体積１２００μＬ、反応時間１０秒）に導入され、３０秒かけて定常状態に達した後、反応後の混合物を室温で４８０秒間試験管に注いだ。反応後の混合物を１ＭのＨＣｌ水溶液５ｍＬと混合し、２分間攪拌した。混合溶液を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）５０ｍＬに注ぎ、有機層を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。そして、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）／ヘキサンで再結晶により精製した。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１４（Dianthin I；Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｓｅｒ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）の単離収率は、６２％であった。このように、本発明は、保護基を有しない環状アミド及び環状ペプチド前駆体にも適用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
Dianthin I（J. Nat. Prod. 2016, 79, 1769-1774.）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, pyridine-d5): δ 10.82 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.66 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.50-7.35 (m, 5H), 7.32-7.17 (m, 5H), 5.39 (dd, J = 14.4, 8.4 Hz 1H), 5.13-5.00 (m, 1H), 4.84 (dd, J = 16.0, 9.2 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.35-4.29 (m, 1H), 4.28-4.21 (m, 2H), 4.00-3.85 (m, 2H), 3.82-3.65 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 2H), 2.13-2.03 (m, 1H), 1.85-1.70 (m, 2H), 1.55-1.50 (m, 1H) ppm. 13C NMR (100 MHz, pyridine-d5): δ 175.5, 173.7, 171.2, 171.0, 170.7, 140.0, 138.2, 130.0, 129.9, 128.7, 128.5, 126.7, 126.4, 61.4, 61.3, 57.9, 57.5, 55.6, 48.6, 43.3, 39.8, 35.1, 32.0, 21.6 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C28H33N5O6+Na]+ 558.2323, found 558.2329。
　［実施例８］
　環状ペプチドの合成（保護Heterophyllin J）
　さらに、異なる環状アミド及び環状ペプチドにも本発明が適用可能か検討するため、環状アミド及び環状ペプチドのモデル基質として、利尿や斜頸の漢方薬として知られる５残基の環状ペプチドであるHeterophyllin Jを選択した。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２５（Ｈ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＯＨ・ＴＦＡ，０．０１０Ｍ，１．０モル当量）、水酸化カリウム（０．０２０Ｍ，２．０モル当量）、及びジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ，０．０２０Ｍ，２モル当量)のアセトニトリルと水の混合溶液（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル(０．０１０Ｍ，２モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）とをシリンジポンプによって６０℃でＶ字ミキサーに導入した。反応途中の混合物は、同じ温度で反応チューブ（内径０．８ｍｍ、長さ２３８８ｍｍ、体積１２００μＬ、反応時間１０秒）に導入され、３０秒かけて定常状態に達した後、反応後の混合物を室温で１５０秒間試験管に注いだ。２分間攪拌した後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）２ｍＬと混合し、有機層を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。そして、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）／ヘキサンで再結晶により精製した。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１５（保護Heterophyllin J；Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｖａｌ－Ｌ－Ｔｙｒ（ＯＢｎ）－Ｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）の単離収率は、７４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
保護Heterophyllin J：
20.5 mg, 0.035 mmol, 74%.
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.21 (d, J = 6.4 Hz, 1H ), 7.84 (brs, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H ), 7.45-7.28 (m, 5H), 7.12-7.05 (m, 3H), 6.84 (d, J = 8.4 Hz, 2H ), 4.96 (s, 2H), 4.55-4.48 (m, 1H),4.42-4.31 (m, 2H), 4.22 (dd, J = 5.2, 2.8 Hz, 1H), 4.111 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.65-3.45 (m, 2H), 3.20 (dd, J = 8.8, 8.4 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 7.6, 6.4 Hz, 1H), 2.31-2.22 (m, 1H), 2.20-2.03 (m, 2H), 2.02-1.93 (m, 2H), 1.33 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 2.8 Hz, 6H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.6, 172.4,172.4, 172.3, 168.7, 157.8, 137.2, 130.5, 129.1, 128.7, 128.0, 127.6, 114.9, 70.1, 62.6, 60.0, 57.9, 49.8, 47.1, 42.2, 36.4, 30.0, 29.8, 25.2, 19.5, 18.8, 16.1 ppm. HRMS (ESI): calcd for [C31H39N5O6+H]+ 600.2793, found 600.2796。
　本発明のＲＭＥ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｅｆｆｉｃｉａｎｃｙ）は、従来技術よりも高い。ＲＭＥとは、次の式で求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000057
　［実施例９］
　環状ペプチドの合成（Versicotide D類縁体及びそのエピマー）
　遊離アミノ基がメチル基で置換されている、環状アミド前駆体及び環状ペプチド前駆体にも本発明が適用可能か検討した。環状アミド及び環状ペプチドのモデル基質として、５残基の環状ペプチドであるVersicotide D類縁体を選択した。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２６（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ・ＴＦＡ，０．０１０Ｍ，１．０モル当量）、及びジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ，０．０２０Ｍ，２．０モル当量)のアセトニトリル溶液（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル(０．０１０Ｍ，２．０モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）とをシリンジポンプによって６０℃でＶ字ミキサーに導入した。反応途中の混合物は、同じ温度で反応チューブ（内径０．８ｍｍ、長さ２３８８ｍｍ、体積１２００μＬ、反応時間１０秒）に導入され、３０秒かけて定常状態に達した後、反応後の混合物を室温で１８０秒間試験管に注いだ。反応後の混合物を１ＭのＨＣｌ水溶液５ｍＬと混合し、２分間攪拌した。混合溶液を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）５０ｍＬに注ぎ、有機層を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。そして、ＧＰＣによって精製した。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１６（Versicotide D類縁体；Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ）の単離収率は、４１％であった（表５、実施例９－１）。
　従来、かさ高いアミノ基は求核性が低いことから、Ｎ末端にＮ－メチルアミノ酸を有する直鎖状ペプチドは環化反応に適さないと考えるのが技術常識であった。しかしながら、本発明の方法を用いることで、Ｎ末端にＮ－メチルアミノ酸を有する直鎖状ペプチドも環化することが可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
Versicotide D類縁体：
White solid, mp: 102-106℃; IR (neat): 3298, 2933, 1632, 1534, 1454, 1287, 1121, 701 cm-1; [α]26 D = -69.0 (c 0.13, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.40-7.12 (m, 10H), 5.85 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.98-4.85 (m, 2H), 4.52 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 3.75-3.65 (m, 1H), 3.66-3.46 (m, 1H), 3.40-3.33 (m, 1H), 3.27-3.15 (m, 1H), 3.12-3.05 (m, 1H), 3.01 (s, 3H), 2.95-2.85 (m, 1H), 2.66 (s, 3H), 1.78 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 1.29 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.19 (d, J = 6.0 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.1, 173.0, 172.7, 170.0, 169.8, 136.21, 136.15, 129.6, 129.3, 128.7, 127.7, 127.4, 67.5, 62.0, 54.3, 50.8, 47.0, 39.3, 38.8, 38.3, 37.2, 17.5, 16.4, 12.7 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C29H37N5O5+Na]+ 558.2687, found 558.2706。
　本発明がエピメリ化を抑制可能か検討した。環状アミド及び環状ペプチドのモデル基質として、実施例９－１で製造したVersicotide D類縁体のエピマーを選択した。具体的には、環状ペプチド前駆体２６のエピマーである環状ペプチド２７（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ａｌａ－ＯＨ・ＴＦＡ）を用いたこと以外は、実施例９－１と同様にして、環状ペプチド１７を製造した。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１７（Versicotide D類縁体エピマー；Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ａｌａ）の単離収率は、４７％であった（表５、実施例９－２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Versicotide D類縁体エピマー（Tetrahedron Lett. 2019, 60, 151281.）：
White solid, mp: 105-109 ℃; IR (neat): 3293, 2933, 1651, 1523, 1454, 1538, 1454, 1123, 700 cm-1; [α]25 D = -107.8 (c 0.13, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.78 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.42-7.16 (m, 10H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.98-4.85 (m, 2H), 4.70 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.67-4.58 (m, 1H), 3.38 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.22-3.12 (m, 4H), 3.10-2.93 (m, 3H), 2.75 (s, 3H), 1.59 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.30 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 6.4 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 174.3, 172.5, 172.0, 171.8, 170.4, 137.1, 136.9, 129.9, 129.3, 128.4, 128.3, 126.8, 126.7, 66.0, 54.2, 54.1, 51.9, 46.0, 38.8, 38.5, 37.7, 30.9, 16.5, 15.3, 14.7 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C29H37N5O5+Na]+ 558.2687, found 558.2702。
　実施例９－１及び実施例９－２（Versicotide D類縁体及びそのエピマー）のＤ体：Ｌ体比は、ＨＰＬＣ－ＵＶ分析（カラム：ＧＬｓｃｉｅｎｃｅ　ＩｎｅｒｔｓｉｌＴＭ　ＯＤＳ－３　５μｍ，４．６ｍｍ×７５ｍｍ，溶媒：メタノール＋０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸（０－１３分：０～１００％，１３～１６分：１００％，１６～１７分：０％，１７～２２分：０％），流量：１．０ｍＬ／分，検出波長：２５４ｎｍ，温度：４０℃）によって評価した。結果を表５及び図２に示す。環状ペプチド１６の保持時間は１１．８分（図２ａ）であり、エピマーである環状ペプチド１７の保持時間は１２．２分であった（図２ｂ）。図２に示す通り、実施例９－１では、環状ペプチド前駆体２６に対応する環状ペプチド１６（Ｌ体）だけが得られ、実施例９－２では、環状ペプチド前駆体２７に対応する環状ペプチド１７（Ｄ体）だけが得られた。このように、本発明は、環化の際にエピメリ化を実質的に抑制することが可能である。これにより、本発明では、対応する環状アミド前駆体及び環状ペプチド前駆体を選択することで、光学異性体を作り分けることが可能となる。本発明では、例えば、実質的にＤ－アミノ酸を含まない環状ペプチドを合成することができる。
　反応温度を２０℃に変更した以外は、実施例９－１と同様にして、環状ペプチド１６（Versicotide D類縁体）を製造した（実施例９－３）。本発明は、反応温度が比較的低温である場合でも環化可能であり、その際に検出可能なエピメリ化を伴わない（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
　［比較例９］
　従来技術による環状ペプチドの合成（Versicotide D類縁体及びそのエピマー）
　Posodaらは、Tetrahedron Lett. 2019, 60, 151281.において、上記Versicotide D類縁体を最初に全合成したことを報告している。本願出願人は、当該報告に従ってVersicotide D類縁体を合成することで、従来技術を用いた場合のエピメリ化について検討した。具体的には、環状ペプチド前駆体２６（Ｈ－Ｌ－Ａｌａ（ＮＭｅ）－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ（ＮＭｅ）－Ｌ－Ｐｈｅ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ・ＴＦＡ）が０．００５Ｍ（１．０モル当量）である希薄条件で、１－［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム－３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ，１．５モル当量）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，０．１モル当量）、及びジイソプロピルエチルアミン（ｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ，３モル当量）を用いて、脱水アセトニトリル中、２０℃で、バッチ法でマクロ環化を実施した（表５、比較例９－１）。反応後の混合物を５％ＨＣｌで洗浄し、その後、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。得られた環状ペプチドのＮＭＲスペクトルは、環状ペプチド前駆体２６のエピマーである環状ペプチド前駆体２７に対応するＤ体のVersicotide D類縁体（実施例９－２に相当。）のＮＭＲスペクトルと一致した。また、得られた環状ペプチドをＨＰＬＣ－ＵＶ分析により評価したところ、Ｄ体であるVersicotide D類縁体の結果と一致した。このように、Posodaらの方法では、環状ペプチド前駆体２６は、先ずエピメリ化し、その後に環化していることを解明した。これに対し、本発明の方法では、興味深いことに、より高い求核性を有する混合酸無水物を用いているにもかかわらず、不要なエピメリ化を回避することが可能である。
　また、反応温度を６０℃に設定したこと以外は、比較例９－１と同様にして、Posodaらの方法でVersicotide D類縁体を製造した（表５、比較例９－２）。また、溶媒をジクロロメタンに代えたこと以外は、比較例９－２と同様にして、Posodaらの方法でVersicotide D類縁体を製造した（表５、比較例９－３）。表５に示す通り、Posodaらの方法では、反応温度に依らず、目的物のＬ体よりも多量に、所望でないＤ体のVersicotide D類縁体が生成していることが確認された。このように、従来技術では、エピメリ化を回避することが不可能であった。
　［実施例１０］
　環状ペプチドの合成（Dihydrotentoxin）
　大きな歪みを有する４残基の環状ペプチドにも本発明が適用可能か検討した。また、本発明が二量体化を抑制可能か検討した。環状ペプチドのモデル基質として、４残基の環状ペプチドであるDihydrotentoxinを選択した。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド前駆体２８（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ・ＴＦＡ，０．０１０Ｍ，１．００モル当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ，０．０２０Ｍ，２．００モル当量）及びジメチルベンジルアミン（Ｍｅ２ＮＢｎ，０．０３０Ｍ，３．００モル当量)のアセトニトリル（流速２．４０ｍＬ／ｍｉｎ）と、クロロギ酸イソプロピル(０．０１５Ｍ，３．００モル当量)のアセトニトリル溶液（流速４．８０ｍＬ／ｍｉｎ）とをシリンジポンプによって６０℃でＶ字ミキサーに導入した。反応途中の混合物は、同じ温度で反応チューブ（内径０．８ｍｍ、長さ７１６４ｍｍ、体積３６００μＬ、反応時間３０秒）に導入され、３０秒かけて定常状態に達した後、反応後の混合物を室温で１２０秒間試験管に注いだ。反応後の混合物に１ＭＨＣｌ水溶液５ｍＬを添加し、２分間攪拌した後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）５０ｍＬと混合し、有機層を１ＭのＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、濾過し、室温で真空濃縮した。そして、ＧＰＣによって精製した。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド１８（Dihydrotentoxin；Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ）の単離収率は、５０％であった。このように、本発明は、大きな歪みを有する４残基の環状ペプチドにも適用することができる。
　環状ペプチド前駆体２８を１０モル当量用いた場合でも、同様のＲＭＥで環状ペプチド１８が得られた。いずれの濃度条件でも、製造された環状ペプチド１８からは、環状ペプチド前駆体２８のダイマー（二量体）は検出されなかった。このように、本発明は、環化に伴う二量体化を回避することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Dihydrotentoxin（Tetrahedron 2018, 74, 6173-6181）：
White solid, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.74 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.35-7.15 (m, 5H), 4.94 (dd, J = 10.0, 5.2 Hz ,1H), 4.61 (dd, J = 7.6, 3.6 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.70 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 3.50 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 3.10-2.95 (m,1H), 2.84 (s, 3H), 2.78 (s, 3H), 1.68 (m, 1H), 1.55 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.45-1.25 (m, 2H), 0.83 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.77 (d, J = 7.2 Hz, 3H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ 172.4, 172.0, 170.8, 170.2, 137.2, 129.1, 128.3, 127.2, 63.1, 57.4, 48.6, 44.6, 41.0, 34.4, 30.7, 30.2, 24.7, 22.7, 22.5, 15.7 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C22H32N4O4+Na]+ 439.2321, found 439.2324。
　［比較例１０］
　従来技術による環状ペプチドの合成（Dihydrotentoxin及びそのダイマー）
　Satoらは、Tetrahedron 2018, 74, 6173-6181.において、環化により上記Dihydrotentoxinを合成したことを報告している。本願出願人は、当該報告に従ってDihydrotentoxinを合成することで、従来技術を用いた場合の二量体化について検討した。具体的には、環状ペプチド前駆体２８（Ｈ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ，０．１ｍＭ，，１．０モル当量）のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）溶液又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に、クロロジイソピノカンフェイルボラン（ＤＩＰＣｌ，３．２モル当量）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ，３．２モル当量）、及びジイソプロピルエチルアミン（ｉ－Ｐｒ２ＮＥｔ，４．０モル当量）を添加し、混合物を２２℃又は３０℃で２４時間攪拌した。反応後の混合物をＧＰＣによって精製した。残留物に含まれる環状ペプチド１８及び環化ダイマー１９の収率は、ＨＰＬＣ－ＵＶ分析（カラム：ＧＬｓｃｉｅｎｃｅ　ＩｎｅｒｔｓｉｌＴＭ　ＯＤＳ－３　５μｍ，４．６ｍｍ×７５ｍｍ，溶媒：メタノール＋０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸（０－２３分：０～７０％，２３～２３．５分：７０～１００％，２３．５～２６分：１００％，２６～２６．５分：０％，２６．５～２９分：０％），流量：１．０ｍＬ／分，検出波長：２５４ｎｍ，温度：４０℃，保持時間：１５．８分（環状ペプチド１８；実施例１０に相当。）及び２１．６分（環化ダイマー１９））で算出した。結果を表６に示す（比較例１０－１～比較例１０－４）。表６に示す通り、Satoらの方法では、目的物である環化モノマー１８だけでなく、副生成物として、配列番号９で表される環化ダイマー１９（Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ－Ｌ－ＭｅＡｌａ－Ｌ－Ｌｅｕ－Ｌ－ＭｅＰｈｅ－Ｇｌｙ）も生成していることが確認された。このように、従来技術では、二量体化を回避することが不可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
Dihydrotentoxinダイマー：
White solid, mp 169-172 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.40-7.10 (m, 10H), 4.92-4.80 (m, 2H), 4.57 (dd, J = 10.0, 7.2 Hz ,2H), 4.50-4.32 (m, 2H), 3.60-3.40 (m, 4H), 3.60-3.45 (m, 4H), 3.23-3.17 (m, 2H), 3.14 (s, 6H), 3.11 (s, 6H), 1.90-1.80 (m, 2H), 1.52 (d, J = 6.8 Hz, 6H), 1.40-1.25 (m, 4H), 0.94 (d, J = 6.4 Hz, 6H), 0.89 (d, J = 6.4 Hz, 6H) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ 174.9, 172.7, 171.0, 170.1, 135.8, 128.9, 128.5, 127.0, 63.1, 60.4, 50.9, 40.5, 37.6, 37.3, 35.1, 31.6, 25.1, 23.1, 20.7, 13.1 ppm; HRMS (ESI): calcd for [C45H64N8O8+Na]+ 855.4739 found 855.4738。

Claims (15)

  1. 一般式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒは、置換されていてもよい２価の有機基を示す。Ｒは、隣接する窒素原子とともに環を形成していてもよい。ＲＡは、水素原子又は炭化水素基を示す。］
    で表される環状アミドを製造する方法であって、
    一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ及びＲＡは、前記に同じである。］
    で表される環状アミド前駆体と
    一般式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｘは、ハロゲン原子を示す。Ｙは、置換されていてもよいアルキル基を示す。］で表される縮合剤と
    一般式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。或いは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち２つ以上が連結して１個以上のヘテロ原子又は置換基を有していてもよい環（ただし、ピリジン環を除く）を形成していてもよい。］
    で表される３級アミン化合物（ただし、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン及びトリエチルアミンを除く）とを反応させる工程を含む、製造方法。
  2. 前記Ｒは、アミド結合及び／又は置換基を有していてもよい、２価の炭化水素基である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記環状アミドは、一般式（１ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、ＲＡは、前記に同じである。２個以上のＲＡは、同一であってもよく異なっていてもよい。ＲＣ、ＲＮ及びＲＰは、同一又は異なって、２価の有機基を示す。ＲＣ、ＲＮ及びＲＰはそれぞれ、隣接する窒素原子とともに環を形成していてもよい。ｎは０以上の整数を示す。ただし、ｎが２以上の整数である場合、ｎ個のＲＰは、同一でも異なっていてもよい。］
    で表される環状ペプチドであって、
    前記環状アミド前駆体は、一般式（２ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、ＲＡ、ＲＣ、ＲＮ、ＲＰ及びｎは前記に同じである。］
    で表される環状ペプチド前駆体である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 前記ＲＣ、ＲＮ及びＲＰは、同一又は異なって、置換基を有していてもよい２価の炭化水素基である、請求項３に記載の製造方法。
  5. 前記ｎは、２以上の整数である、請求項３又は４に記載の製造方法。
  6. 前記Ｘは、塩素原子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 前記Ｙは、分岐鎖状アルキル基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 前記Ｙは、イソプロピル基である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち少なくとも１つは、メチル基である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち少なくとも２つは、メチル基である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 前記反応工程は、非プロトン性極性溶媒を含む溶媒中で行う、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 前記反応工程の反応温度は、０～１００℃である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 前記反応工程の反応時間は、１０分未満である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 前記反応工程は、フロー法により行われる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 前記反応工程は、マイクロフロー法により行われる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。 
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Title
FUSE SHINICHIRO: "Innovation in peptide syntheses accelerated by micro-flow technologies", MEDCHEM NEWS, vol. 30, no. 4, 1 November 2020 (2020-11-01), pages 193 - 200, XP093089601, DOI: 10.14894/medchem.30.4_193 *

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