WO2023164940A1

WO2023164940A1 - 氮杂吩噻嗪类化合物及其在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用

Info

Publication number: WO2023164940A1
Application number: PCT/CN2022/079365
Authority: WO
Inventors: 王玉东; 孙笑; 毛斐; 伍慧雯; 刘小虎; 李丽娟; 李剑; 李晓康; 朱进
Original assignee: 中国福利会国际和平妇幼保健院; 华东理工大学
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2023-09-07

Abstract

本发明公开了一种氮杂吩噻嗪类衍生物及其在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用，其结构如式I所示，各取代基的定义如说明书和权利要求书所述。本发明的氮杂吩噻嗪类衍生物对子宫内膜癌Ishikawa和KLE细胞的增殖、克隆形成、侵袭能力具有抑制作用，并能诱导细胞凋亡。因此，本发明提供的氮杂吩噻嗪类衍生物有望被用于制备治疗和/或预防I型和II型子宫内膜癌药物。

Description

氮杂吩噻嗪类化合物及其在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物治疗学技术领域，具体涉及一类新合成氮杂吩噻嗪类化合物在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。

背景技术

子宫内膜癌(endometrialcancer，EC)是发生于子宫内层(子宫内膜)的一种恶性疾病，是发达国家中最常见的妇科恶性肿瘤之一。随着人口出生率的下降和肥胖患者的增加，其发病率和死亡率逐年上升。根据美国癌症协会(American Cancer Society，ACS)报道,2021年美国预计新增EC病例66570例，新增EC死亡病例12940例。有数据表明，75％的子宫内膜癌患者可以在早期诊断，其5年生存率可达65％～92％。但对于晚期和复发患者，以及临床侵袭性强的组织学类型(如高级别子宫内膜样癌，浆液性癌)患者，临床预后往往都比较差。近几年，随着生活节奏的加快，EC患者呈年轻化的趋势。

EC根据受体类型分为Ⅰ型和Ⅱ型。其中Ⅰ型，又称雌激素依赖型，合并肥胖、高血糖、高血脂等代谢疾病，多伴有内膜不典型增生，典型组织学类型有子宫内膜样腺癌。Ⅱ型，又称非雌激素依赖型，与高雌激素无关，无内分泌代谢紊乱，伴有萎缩性内膜，低分化、侵袭性强，典型组织学类型有浆液性癌、透明细胞癌。EC患者的标准治疗方法为手术治疗辅助放疗和化疗，但目前对有生育需求的年轻EC患者来说，能够保留生育功能的保守治疗更为必要。因此，本领域有必要研发对EC患者安全有效的保守治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种氮杂吩噻嗪类化合物。

本发明的另一个目的是提供一种所述氮杂吩噻嗪类化合物在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种式I所示化合物在制备治疗或预防子宫内膜癌的药物中的应用，

其中，n为1、2、3、4、5、6、7或8；

X、Y各自独立地选自N、O、S；

R ¹、R ²各自独立地选自H、羟基、卤素、C ₁-C ₆烷基、C ₁-C ₆卤代烷基、C ₁-C ₆烷氧基、硝基、亚硝基、氨基、苯基、甲酰基；

R ³为取代或未取代的氨基、或取代或未取代的4-12元杂环基，

其中，所述杂环基含有选自下组的1、2、3或4个杂原子：N、O、S；

所述取代各自独立地是指具有一个或多个选自下组的取代基：C ₁-C ₆直链或支链烷基、C ₃-C ₈环烷基、氧代(＝O)、羟基、C ₁-C ₆羟烷基、酰基、磺酰基、或C ₃-C ₆炔基取代的-(C1-C4亚烷基)-二氮环丙烯。

在另一优选例中，所述的X为S。

在另一优选例中，所述的Y为N。

在另一优选例中，所述的n为2、3、4或5。

在另一优选例中，所述的R ¹、R ²各自独立地选自H、羟基、F、Cl、Br、甲基、乙基、正丙基、异丙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基。

在另一优选例中，所述的R ³为取代或未取代的氨基、取代或未取代的哌嗪基、取代或未取代的吡咯烷基、取代或未取代的哌啶基、或取代或未取代的四氢异喹啉基。

在另一优选例中，所述的取代是指具有1或2个选自下组的取代基：C ₁-C ₃直链或支链烷基、C ₃-C ₅环烷基、氧代(＝O)、羟基、羟甲基、羟乙基、酰基、或C ₃-C ₆炔基取代的-(C1-C4亚烷基)-二氮环丙烯。

在另一优选例中，所述的R ³为氨基、NH(C ₁-C ₃烷基)、N(C ₁-C ₃烷基)(C ₁-C ₃烷基)、C ₃-C ₅环烷基取代的氨基、C ₁-C ₃烷基取代的哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基、羟基取代的哌啶基、C ₁-C ₃羟烷基取代的哌啶基、酰胺基、磺酰胺基、或取代的四氢异喹啉基。

在另一优选例中，所述的化合物为选自下组：

在另一优选例中，所述子宫内膜癌包括I型和II型子宫内膜癌。

在另一优选例中，所述子宫内膜癌包括孕激素敏感型子宫内膜癌、或孕激素耐受型子宫内膜癌。

在另一优选例中，所述子宫内膜癌为孕激素受体阴性和孕激素耐药的子宫内膜癌。

在另一优选例中，所述药物还用于以下一种或多种用途：

(a)抑制子宫内膜癌细胞增殖；

(b)抑制子宫内膜癌细胞克隆；

(c)抑制子宫内膜癌细胞迁移；

(d)诱导子宫内膜癌细胞凋亡；

(e)上述(a)至(d)的任意组合。

在另一优选例中，所述的治疗子宫内膜癌的药物是以本发明第一方面所述的化合物作为唯一成分的药物。

在另一优选例中，所述药物为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂。

在另一优选例中，所述药物为口服剂型、经皮剂型、静脉或肌肉注射剂型。

在本发明的第二方面，提供了一种化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自下组：

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(A1)式I化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，作为第一活性组分；

(A2)其他抗子宫内膜癌药物，作为第二活性组分；

(B)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述抗子宫内膜癌药物为孕激素、或拓扑异构酶抑制剂。

在另一优选例中，所述孕激素为醋酸甲地孕酮、酸酸甲羟孕酮或己酸孕酮中的一种或两种以上的组合。

在另一优选例中，所述的拓扑异构酶抑制剂为拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan，CPT-11)、勒托替康(lurtotecan)或羟基喜树碱中的一种或两种以上的组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述第一活性组分的重量含量为0.1-99％。

在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂。

在另一优选例中，所述药物组合物为口服剂型、经皮剂型、静脉或肌肉注射剂型。

在本发明的第四方面，提供了一种体外抑制子宫内膜癌细胞的方法，包括步骤：

(i)在如式I所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐、或本发明第三方面所述的药物组合物存在的条件下，培养子宫内膜癌细胞，从而抑制所述的子宫内膜癌细胞。

在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。

在另一优选例中，所述的抑制选自下组：

(a)抑制子宫内膜癌细胞增殖；

(b)抑制子宫内膜癌细胞克隆；

(c)抑制子宫内膜癌细胞迁移；

(d)诱导子宫内膜癌细胞凋亡；

(e)上述(a)至(d)的任意组合。

在另一优选例中，所述子宫内膜癌细胞为ISK和/或KLE细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种治疗子宫内膜癌的方法，包括步骤：给有需要的对象施用如式I所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐、或本发明第三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述对象为子宫内膜癌患者。

在另一优选例中，所述治疗方法进一步包括给有需要的对象施用其他抗子宫内膜癌药物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了优选化合物X-10和CPZ对Ishikawa和KLE细胞克隆形成的影响示意图。(A)ISK和KLE细胞结晶紫染色；(B)ISK细胞结晶紫染色定量；(C)KLE细胞结晶紫染色定量；数据为平均值±SD，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 vs Ctrl,One-way ANOVA.

图2显示了优选化合物X-10和CPZ对Ishikawa和KLE细胞迁移能力的影响示意图。(A)ISK和KLE细胞结晶紫染色；(B)KLE细胞结晶紫染色；(C)KLE细胞结晶紫染色定量；数据为平均值±SD，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001 vs Ctrl,One-way ANOVA.

图3显示了优选化合物X-10和CPZ对Ishikawa和KLE细胞侵袭能力的影响示意图。(A)ISK和KLE细胞结晶紫染色；(B)KLE细胞结晶紫染色；(C)KLE细胞结晶紫染色定量；数据为平均值±SD，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001 vs Ctrl,One-way ANOVA.

图4显示了优选化合物X-10对Ishikawa和KLE细胞凋亡的影响示意图。(A)化合物X-10对ISK和KLE细胞凋亡的影响；(B)ISK细胞凋亡比例定量；(C)KLE细胞凋亡比例定量；数据为平均值±SD,*p<0.0 vs Ctrl,One-way ANOVA.

图5显示了化合物X-10对小鼠皮下ISK和KLE细胞移植瘤的生长抑制作用。(A)ISK皮下荷瘤小鼠给药14天后肿瘤重量；(B)ISK皮下荷瘤小鼠给药14天后肿瘤体积；(C)给药过程中ISK皮下荷瘤小鼠肿瘤体积的变化；(D)KLE皮下荷瘤小鼠给药14天后肿瘤重量；(E)KLE皮下荷瘤小鼠给药14天后肿瘤体积；(F)KLE皮下荷瘤小鼠体重随给药时间的变化曲线；数据为平均值±SEM，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001 vs Vehicle,one-way ANOVA.

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，发现了一类具有抗子宫内膜癌活性的氮杂吩噻嗪衍生物，其对EC细胞具有显著增殖抑制作用，能够抑制EC细胞的克隆形成和迁移，诱导EC细胞凋亡，以及体内抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。在此基础上，完成了本发明。

本发明通过实验发现，新合成氮杂吩噻嗪类化合物对于子宫内膜癌细胞Ishikawa(ISK)、KLE、HEC-1-A、AN3CA细胞具有增殖抑制作用，能够影响子宫内膜癌细胞Ishikawa和KLE细胞的克隆、迁移、侵袭和凋亡。

术语

在本发明中采用的术语具有以下含义。

除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

在本发明中，术语“C ₁-C ₆”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子，“C ₁-C ₈”是指具有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子，依此类推。“5-7元”是指具有5、6或7个环原子，依此类推。

“烷基”是指直链或支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。

术语“烷氧基”表示-O-(C _1-6烷基)基团。例如术语“C ₁-C ₆烷氧基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷氧基，非限制性地包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和丁氧基等。

术语“烯基”表示包含至少一个双键的直链或支链烃基部分，例如术语“C ₂-C ₆烯基”是指具有2至6个碳原子的含有一个双键的直链或支链烯基，非限制性地包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、异丁烯基、戊烯基和己烯基等。

术语“炔基”是指含有一个三键的直链或支链炔基，非限制性地包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、戊炔基和己炔基等。

“环烷基”是指表示饱和的环状烃基部分，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。

在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“杂环(基)”意指由2至14个碳原子以及1至6个选自氮、磷、氧和硫的杂原子组成的稳定的3元至20元非芳香族环状基团。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，其可包括稠合环体系、桥环体系或螺环体系；其杂环基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化；且杂环基可为部分或完全饱和。杂环基可以经由碳原子或者杂原子并通过1个或多个单键与分子其余部分连接。本文所用的“稠杂环基”是指包含稠环的杂环基，其中一个或多个环可以是下文所定义的芳基或杂芳基，条件是与分子其余部分的连接点为非芳香族环原子。杂环基的实例包括但不限于：吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基、硫代吗啉基、2-氮杂双环[2.2.2]辛烷基、2,7-二氮杂-螺[3.5]壬烷-7-基、2-氧杂-6-氮杂-螺[3.3]庚烷-6-基、2,5-二氮杂-双环[2.2.1]庚烷-2-基、氮杂环丁烷基、吡喃基、四氢吡喃基、噻喃基、四氢呋喃基、噁嗪基、二氧环戊基、四氢异喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、喹嗪基、噻唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、二氢吲哚基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、吡咯烷基、吡唑烷基、邻苯二甲酰亚氨基等。

在本申请中，作为基团或是其它基团的一部分，术语“芳基”意指具有6至18个碳原子(优选具有6至10个碳原子，即C6-C10芳基)的共轭烃环体系基团。就本发明的目的而言，芳基可以为单环、双环、三环或更多环的环体系，还可以与上文所定义的碳环基或杂环基稠合，条件是芳基经由芳香环上的原子通过1个或多个单键与分子的其余部分连接。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基、芴基、2,3-二氢-1H-异吲哚基、2-苯并噁唑啉酮、2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等。

“卤素”是F、Cl、Br或I。

本发明还包括上述化合物药学上可接受的盐。本发明氮杂吩噻嗪类衍生物的药用盐是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过已知的成盐方法制备。

子宫内膜癌

如本文所用，术语“子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)”是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，又称子宫体癌，是女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一。子宫内膜癌好发于围绝经期及绝经后女性，根据其发病机制和生物学行为特点，可分为I型子宫内膜癌(雌激素依赖型)与II型子宫内膜癌(非雌激素依赖型)。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物包括：

(1)本发明第一方面所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，作为第一活性组分；和

(2)药学上可接受的载体。

需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、注射剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。

本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。

本发明的药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、鼻、皮肤、肺或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。

本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。

典型地，本发明活性成分或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂 (包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括O/W型、W/O型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明活性成分可以被制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明活性成分被制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；润湿剂可以是水、乙醇、异丙醇等；黏合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明活性成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明的胶囊剂。

为将本发明活性成分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、PH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；PH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其他添加剂。

本发明的两种活性成分或组合物可一起服用或先后服用，或进一步地与其他治疗药物或对症药物合并使用。

当本发明的活性成分与其他治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的主要优点包括：

1)本发明提供了一类新合成氮杂吩噻嗪类化合物，其对子宫内膜癌Ishikawa和KLE细胞的增殖、克隆形成、侵袭能力具有抑制作用，并能诱导细胞凋亡。

2)本发明提供了一种新合成氮杂吩噻嗪类化合物在制备治疗Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌的药物中的应用。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。

本发明化合物的制备方法可包括以下步骤：

实施例1 5-氯-2-((3-硝基吡啶-2-基)硫代)苯胺的制备

向干净的500mL反应瓶中依次加入乙腈200mL，20.0g 2-氨基-4-氯苯硫酚，冰浴下慢慢加入14.1g叔丁醇钾，搅拌30min，慢慢加入19.8g 2-氯-3-硝基吡啶，加毕移到室温，反应2h，TLC板监测反应完全，过滤，保留滤饼，滤液减压蒸除溶剂，剩余残渣用乙醇溶解，过滤，合并滤饼，放入红外干燥箱，约50℃干燥过夜，得到棕黄色固体为I-1。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.55(dd,J＝3.9,1.9Hz,1H),8.51(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),7.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.21(dd,J＝8.2,4.0Hz,1H),7.02(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.96(d,J＝2.0Hz,1H).

实施例2 N-(5-氯-2-((3-硝基吡啶-2-基)硫代)苯基)乙酰胺的制备

向干净的250mL反应瓶中依次加入醋酸酐100mL，10.0g I-1，2.0mL吡啶，室温反应过夜，TLC板监测反应完全，过滤，保留滤饼，滤液加入500mL水析出产物，过滤，合并滤饼，放入红外干燥箱，约90℃干燥过夜，得到黄色固体为II-1。

实施例3 1-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)乙烷-1-酮的制备

向干净的250mL反应瓶中依次加入丙酮100mL，10.0g II-1，5.2g KOH，升温至60℃左右，反应2h，TLC板监测反应完全，将反应体系降至室温，减压蒸除溶剂，剩余残渣柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)，得到黄色固体III-1。

实施例4 8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

向干净的250mL反应瓶中依次加入2g III-1，60mL乙醇，2mL浓盐酸，升温至80℃左右，反应过夜，TLC板监测反应完全，将反应体系降至室温，减压蒸除溶剂，加氨水过滤得淡黄色固体IV-1。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ9.34(s,1H),7.83(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),7.30(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),6.86(d,J＝2.2Hz,1H),6.82(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),6.76(dd,J＝7.5,4.9Hz,1H).

实施例5 2-((3-硝基吡啶-2-基)硫代)苯胺的制备

具体实施步骤同实施例1，不同之处在于将其中的2-氨基-4-氯苯硫酚换成2-氨基-苯硫酚，得到棕黄色固体I-2。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ8.61–8.58(m,2H),7.41–7.38(m,1H),7.27(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.20–7.15(m,1H),6.75(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),6.59(td,J＝7.6,1.6Hz,1H),5.35(s,2H).

实施例6 N-(2-((3-硝基吡啶-2-基)硫代)苯基)乙酰胺的制备

具体实施步骤同实施例2，不同之处在于I-1替换为I-2，得棕黄色固体II-2。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ9.14(s,1H),8.65(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),8.55(dd,J＝4.4,1.6Hz,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.51(td,J＝7.6,1.2Hz,,1H),7.45–7.42(m,1H),7.23(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),1.88(s,3H).

实施例7 1-(10H苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)乙烷-1-酮的制备

具体实施步骤同实施例3，不同之处在于用II-2代替II-1，得棕黄色固体III-2。

实施例8 (1S,3S)-1-(4-甲氧基苯基)-N-(2-氯乙酰基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(中间体III-4)的制备

具体实施步骤同实施例4，不同之处在于用III-2代替III-1，得到黄色固体 IV-2。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ9.12(s,1H),7.75(dd,J＝5.2,1.6Hz,1H),7.22(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.95–6.91(m,1H),6.87(dd,J＝7.6,0.8Hz,1H),6.77–6.70(m,2H),6.68(dd,J＝7.2,4.8Hz,1H).

实施例9 10-(4-溴丁基)-8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

向干净的100mL反应瓶中依次加入DMF 50mL，10.0g中间体IV-1，20.1g 1,4-二溴丁烷，5.1g氢氧化钾，室温反应1h，TLC板监测反应完全，加入150mL的水淬灭反应，乙酸乙酯萃取多次至水相没有产物点，合并有机相，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，剩余残渣柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝100：1，v/v)，得到灰黄色固体V-1

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.01(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.26(dd,J＝7.6,2.0Hz,1H),6.95(d,J＝8.0Hz,1H),6.90(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.83(d,J＝2.0Hz,1H),6.79–6.76(m,1H),4.11(t,J＝6.4Hz,2H),3.61(t,J＝6.4Hz,2H),1.97–1.91(m,4H).

实施例10 10-(5-溴戊基)-8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例9，不同之处在于将原料1,4-二溴丁烷替换为1,5-二溴戊烷，得灰黄色固体V-2。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.01(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.24(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),6.93–6.85(m,3H),6.77(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),4.08(t,J＝7.6Hz,2H),2.34(t,J＝7.2Hz,2H),1.86–1.78(m,2H),1.65–1.58(m,4H).

实施例11 10-(6-溴戊基)-8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例9，不同之处在于将原料1,4-二溴丁烷替换为1,6-二溴己烷，得灰黄色固体V-3。

实施例12 10-(5-溴戊基)-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例10，不同之处在于将原料中间体IV-1替换为中间体IV-2。

实施例13 4-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)-N，N-二甲基丁烷-1-胺的制备

向干净的50mL单口圆底烧瓶中依次加入20mL乙腈，100mg的中间体V-1、1mL三乙胺，含192mg二甲胺的醇溶液，加热至40-50℃，反应过夜，加入水约50mL淬灭反应，乙酸乙酯萃取多次至水相无产物点，合并有机相，水洗1次，饱和氯化钠洗1次，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1，v/v)，得到黄色油状物X-01。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.02(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.27(s,1H),6.97(d,J＝8.0Hz,1H),6.92(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.82–6.79(m,2H),4.12(t,J＝7.2Hz,2H), 2.93(t,J＝7.2Hz,2H),2.68(s,6H),1.97–1.86(m,4H).HRMS(EI)m/z calcd C ₁₇H ₂₀ClN ₃S(M+)333.1066,found 333.1065.

实施例14 5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)-N,N-二甲基戊-1-胺的制备

具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将中间体V-1换成V-2。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.20(d,J＝5.2Hz,1H),7.70(d,J＝7.2Hz,1H),7.16(d,J＝8.0Hz,2H),7.07–7.03(m,2H),4.42(t,J＝5.6Hz,2H),3.10(brs,2H),2.84(d,J＝4.0Hz,6H),2.03-1.95(m,4H),1.71–1.62(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₁₈H ₂₂ClN ₃S(M+)347.1223,found 347.1225.

实施例15 6-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)-N,N-二甲基己-1-胺的制备

具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将中间体V-1换成V-3。

¹H NMR(600MHz,MeOD)δ8.03(dd,J＝3.6,0.8Hz,1H),7.62(d,J＝4.8Hz,1H),7.12–7.09(m,2H),7.06–7.03(m,2H),4.16(t,J＝4.4Hz,2H),3.10(t,J＝5.2Hz,2H),2.85(s,6H),1.85–1.80(m,2H),1.74–1.69(m,2H),1.56–1.51(m,2H),1.46–1.41(m,2H).

实施例16 (6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(4-氟苯甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物 I _C-4)的制备

具体实施步骤同实施例13，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成甲胺的醇溶液,中间体V-1换成V-4。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ8.05(d,J＝3.2Hz,1H),7.49(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.24(t,J＝7.6Hz,1H),7.13(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.06(d,J＝8.4Hz,1H),6.99–6.91(m,2H),4.06(brs,2H),3.02–2.97(m,2H),2.69(d,J＝5.2Hz,6H),1.77–1.67(m,4H),1.45–1.38(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₁₈H ₂₃N ₃S(M+)313.1613,found313.1611.

实施例17 5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)-N-甲基戊-1-胺的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成甲胺的醇溶液。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.01(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.24(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.94(d,J＝8.0Hz,1H),6.88(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.80(d,J＝2.0Hz,1H),6.78(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.05(t,J＝7.2Hz,2H),2.64(t,J＝7.2Hz,2H),2.44(s,3H),1.85–1.77(m,2H),1.63–1.56(m,2H),1.51–1.45(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₁₇H ₂₀ClN ₃S(M+)333.1066,found 333.1061

实施例18 5(-8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)-N-丙基戊基-1-胺的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成正丙胺。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ8.59(s,1H),8.07(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.49(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.15(d,J＝7.6Hz,1H),7.03–7.01(m,2H),6.94(dd,J＝7.2,4.8Hz,1H),4.08(t,J＝7.2Hz,2H),2.87–2.78(m,4H),1.74–1.55(m,6H),1.46–1.39(m,2H),0.92(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(EI)m/z calcd C ₁₉H ₂₄ClN ₃S(M+)361.1379,found361.1380.

实施例19 5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)-N-异丙基戊烷-1-胺的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成异丙胺。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.00(dd,J＝4.9,1.7Hz,1H),7.23(dd,J＝7.5,1.7Hz,1H),6.93(d,J＝8.2Hz,1H),6.87(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.80–6.71(m,2H),4.02(t,J＝7.3Hz,2H),3.03–2.93(m,1H),2.72(t,J＝7.8Hz,2H),1.84–1.66(m,4H),1.48(p,J＝7.8Hz,2H),1.21(d,J＝6.4Hz,6H).

实施例20 5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)戊基)-N-环丙胺的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成环丙胺。

¹H NMR(600MHz,CDCl ₃)δ8.00(dd,J＝3.2,1.2Hz,1H),7.23(dd,J＝5.2,1.2Hz,1H),6.93(d,J＝5.2Hz,1H),6.87(dd,J＝5.6,1.2Hz,1H),6.79(d,J＝1.2Hz,1H),6.76(dd,J＝4.8,2.4Hz,1H),4.04(t,J＝4.8Hz,2H),2.79(t,J＝5.2Hz,2H),2.21–2.17(m,1H),1.83–1.78(m,2H),1.68–1.63(m,2H),1.50–1.45(m,2H),0.56–0.49(m,4H).HRMS(EI)m/z calcd C ₁₉H ₂₂ClN ₃S(M+)359.1223,found 359.1221.

实施例21 (6S,12aS)-6-(4-甲氧基苯基)-2-(2-(1-(3-吡啶甲基)哌啶-4-基)乙基)-2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(化合物I _C-9)的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成二乙胺。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.01(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.27(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.96(d,J＝8.4Hz,1H),6.90(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),6.81–6.77(m,2H),4.09(t,J＝7.2Hz,2H),3.12–3.05(m,4H),3.00–2.95(m,2H),1.89–1.82(m,4H),1.55–1.47(m,2H),1.39(t,J＝7.2Hz,6H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₀H ₂₆ClN ₃S(M+)375.1536,found375.1537

实施例22 8-氯-10(-5(-4-甲基哌嗪-1-基)戊基)-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成N-甲基哌嗪。

¹H NMR(600MHz,CDCl ₃)δ8.00(dd,J＝3.2,0.8Hz,1H),7.24(dd,J＝5.2,1.2Hz,1H),6.94(d,J＝5.6Hz,1H),6.88(dd,J＝5.6,1.6Hz,1H),6.79(d,J＝1.2Hz,1H),6.77(dd,J＝5.2,3.2Hz,1H),4.05(t,J＝5.2,2H),2.56(s,8H),2.42(t,J＝5.2,2H),2.34(s,3H),1.83–1.78(m,2H),1.61–1.56(m,2H),1.48–1.43(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₁H ₂₇ClN ₄S(M+)402.1645,found 402.1641.

实施例23 4-(5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)戊基)吗啉的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成吗啉环。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.05(d,J＝4.8Hz,1H),7.36(d,J＝7.2Hz,1H),7.00–6.94(m,2H),6.89–6.84(m 2H),4.33(t,J＝11.6Hz,2H),4.16(t,J＝7.2Hz,2H),3.98(dd,J＝13.2,3.2Hz,2H),3.44(d,J＝11.6Hz,2H),2.99(d,J＝6.0Hz,2H),2.88–2.80(m 2H),2.01(s,2H),1.91–1.86(m,2H),1.59–1.53(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₀H ₂₄ClN ₃OS(M+)389.1329,found 389.1328.

实施例24 8-氯-10-(5-(吡咯烷-1-基)戊基)-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成四氢吡咯。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ8.06(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.47(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),7.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.01–6.99(m,2H),6.93(dd,J＝7.2,4.8Hz,1H),4.07(t,J＝7.2Hz,2H),2.64–2.57(m,6H),1.76–1.65(m,6H),1.57–1.50(m,2H),1.44–1.36(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₀H ₂₄ClN ₃S(M+)373.1379,found 373.1377.

实施例25 8-氯-10-(5-(哌啶-1-基)戊基)-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成哌啶。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ8.07(dd,J＝5.2,2.0Hz,1H),7.49(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),7.05–7.00(m,2H),6.94(dd,J＝7.6,5.2Hz,1H),4.09(t,J＝7.2Hz,2H),3.37(d,J＝12.0Hz,2H),2.98–2.93(m,2H),2.83–2.74(m,2H),1.81–1.67(m,10H),1.44–1.38(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₁H ₂₆ClN ₃S(M+)387.1536,found 387.1534.

实施例26 (1-(5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)戊基)哌啶-4-基)甲醇的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成羟甲基哌啶。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ10.2(s,1H),8.07(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.49(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.14(d,J＝8.0Hz,1H),7.05–7.00(m,2H),6.94(dd,J＝7.2,4.8Hz,1H),4.08(t,J＝6.8Hz,2H),3.43-3.37(m,2H),3.25(d,J＝6.0Hz,2H),2.98–2.93(m,2H),2.85–2.77(m,2H),1.81–1.67(m,6H),1.58–1.36(m,5H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₂H ₂₈ClN ₃S(M+)417.1642,found 417.1643.

实施例27 1-(5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)戊基)哌啶-4-醇的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成4-哌啶醇。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.00(dd,J＝5.0,1.7Hz,1H),7.24(dd,J＝7.5,1.7Hz,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),6.88(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.82–6.72(m,2H),4.04(t,J＝7.3Hz,2H),3.87(dq,J＝8.7,4.1Hz,1H),3.80(s,1H),2.86(s,2H),2.47(s,2H),2.07–1.98(m,2H),1.84–1.79(m,2H),1.69(d,J＝3.9Hz,4H),1.46(q,J＝8.0Hz,2H),1.27(d,J＝12.2Hz,2H).

实施例28 N-(2-(3-丁炔基)-3H-双吖丙啶-3-基)-乙基)-N-(5-(8-氯-10H-苯并[b]吡啶[2,3-e][1,4]噻嗪-10-基)戊基)乙酰胺

合成路线：

合成方法：

将制备的1g中间体IV-1和2.52g 2-(5-溴戊基)异吲哚啉-1,3-二酮溶于12mL DMF中，加入717mg KOH,80℃反应过夜，TLC板监测反应完全，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到黄色油状中间体X-16-1,无需进一步纯化。

上述制备的2g中间体X-16-1溶解于60mL乙醇中，加入1mL水合肼溶液，80℃回流反应4h,TLC板监测反应完全,减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化得到棕黄色油状中间体X-16-2。

称量制备的300mg中间体X-16-2溶于乙腈中，0℃条件下缓慢滴加乙酰氯，滴加完后移到常温反应30min,TLC板监测反应完全,减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化得到黄色油状中间体X-16-3。

称量制备的100mg中间体X-16-3溶于DMF中,加入114mg K ₂CO ₃和82mg光交联基团，60℃反应过夜，TLC板监测反应几乎完全，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析分离纯化得到无色油状物X-16。

¹H NMR(400MHz,CDCl ₃)δ8.01(dd,J＝5.0,1.7Hz,1H),7.29–7.27(m,1H),6.99–6.88(m,2H),6.83–6.76(m,2H),4.07(q,J＝9.1,8.2Hz,2H),3.30–3.06(m,4H),2.05(d,J＝5.9Hz,3H),2.03–2.00(m,2H),1.98(t,J＝2.6Hz,1H),1.85–1.79(m,2H),1.69–1.63(m,2H),1.63–1.53(m,4H),1.46–1.38(m,2H).

实施例29 8-氯-10-(5-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)戊基)-10H-苯并[b]吡啶并[2,3-e][1,4]噻嗪的制备

具体实施步骤同实施例14，不同之处在于将原料二甲胺醇溶液替换成四氢异喹啉，硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1，v/v)，得到黄色油状物X-17。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.24(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.16–7.10(m,3H),7.03–7.00(m,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.80(d,J＝2.0Hz,1H),6.78(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),4.08(t,J＝7.2Hz,2H),3.78(s,2H),2.97–2.89(m,4H),2.67(t,J＝7.2Hz,2H),1.88–1.81(m,2H),1.80–1.72(m,2H),1.55–1.47(m,2H).HRMS(EI)m/z calcd C ₂₅H ₂₆ClN ₃S(M+)435.1536,found 435.1534.

实施例30氮杂吩噻嗪类化合物对子宫内膜癌细胞ISK和KLE的增殖抑制作用

1.实验材料和方法

子宫内膜癌细胞ISK和KLE购自于美国组织培养库ATCC；磷酸盐缓冲液(PBS)、DME/F12培养基购自于Hyclone公司；血清(FBS)购自于Gibco公司；胰酶、CCK8购自于碧云天生物科技有限公司；氮杂吩噻嗪类化合物均来源于实验室合成；盐酸氯丙嗪(CPZ)来源于实验室老药库。具体实验方法如下：

1)取对数生长期的细胞，倒去培养皿内的培养液，加入PBS 2mL清洗细胞2次。

2)加入胰酶1mL，室温消化2min。

3)加入含10％FBS的培养液2mL中和胰酶，轻轻吹打成单细胞混悬液，吹打力度以不起气泡为宜。

4)将单细胞混悬液吸至15mL离心管中，1000rpm低速离心3min，倒去上清液。

5)加入含10％FBS细胞培养液2mL，吹打悬浮细胞至单细胞悬液。

6)吸取10μL细胞混悬液至细胞计数板，进行细胞计数，调单细胞悬液浓度为70000个/mL。

7)将单细胞悬液加入96孔板中，每孔加100μL(约7000个细胞)，每组设3个复孔，将96孔板放在培养箱培养24h(37℃，5％CO ₂)，使细胞贴壁。

8)设对照组和不同浓度化合物和CPZ给药组，对照组中加入200μL DME/F12培养基，给药组中加入200μL含不同浓度化合物和CPZ的DME/F12培养基，在培养箱分别培养24、48、72h后，吸除培养基，每孔(包括空白孔)加入100μL含10％CCK-8的无血清培养液，在培养箱继续培养1h，酶标仪检测450nm处吸光值，计算抑制率和IC ₅₀值。抑制率计算公式：细胞抑制率％＝[1-(给药组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100％，IC ₅₀值通过Graphpad Prism软件拟合。

2.实验结果

表1为化合物和CPZ对Ishikawa细胞24h的增殖抑制作用IC ₅₀值。从表1中可以看出新合成氮杂吩噻嗪类化合物对ISK细胞均具有增殖抑制作用且化合物X-10的增殖抑制作用明显优于氯丙嗪。表2为优选化合物和CPZ对KLE细胞24h的增殖抑制作用IC ₅₀值。从表2中可以看出优选氮杂吩噻嗪类化合物对KLE细胞也具有增殖抑制作用，综合表1和表2，化合物X-10对ISK细胞和KLE细胞均具有较好的增殖抑制作用且明显优于氯丙嗪。

表1.氯丙嗪和氮杂吩噻嗪类化合物对ISK细胞增殖抑制活性数据

表2.氯丙嗪和优选氮杂吩噻嗪类化合物对KLE细胞增殖抑制活性数据

实施例31 X-10对ISK和KLE细胞克隆形成的影响

31.1实验材料和方法

结晶紫购自于碧云天生物科技有限公司；甲醇为实验室常用试剂，商业购买，未经任何处理。其余实验材料来源同实施例1。具体实验方法如下：

1)取对数生长期的细胞，用胰酶消化下来制备单细胞混悬液，梯度稀释，以每孔约100个细胞的密度接种至6孔板，过夜待其贴壁。

2)设6组实验组，分别为对照组；CPZ 5μM组；CPZ 10μM组；X-10 2.5μM组；X-10 5μM组；X-10 10μM组。给药组用含不同浓度药物的DME/F12培养基3mL培养3天，之后换成无药的培养基继续培养7天后染色计数。对照组用无药DME/F12的培养基1mL培养10天(每两天换液)后染色计数。

3)将待染细胞置于冰上，并用预冷PBS于4℃清洗细胞两次，每次3min。

4)用预冷的甲醇，于-20℃固定细胞10min。

5)吸除甲醇，加入足量的0.5％结晶紫染液覆盖(约1mL)，孵育10min。

6)移除结晶紫染液，清水清洗已染细胞至染液被洗脱完毕。

7)计数，拍照。

31.2实验结果

如图1所示，图1为优选化合物X-10和CPZ对Ishikawa和KLE细胞克隆形成的影响示意图。图中双阴组即为对照组，照片中的每一个黑点表示一个细胞群落。可见在ISK细胞中，与同浓度CPZ组相比，新合成化合物X-10组的细胞群落明显减少，尤其是X-10 10μM组，只有少数细胞群落存在(p<0.001)。在KLE细胞中，与同浓度CPZ组相比，X-10 10μM组的细胞群落并没有减少，但X-10 5μM组的细胞群落显著减少(X-10 5μM组:p<0.001)。柱状图表示各组细胞群落的数目，数据显著性差异采用t-test法分析(Graphpad Prism软件)，*给药组与与同浓度CPZ组比较，**p<0.01，***p<0.001。

本实施例证明了新合成化合物X-10对Ishikawa和KLE细胞的克隆形成均具有抑制作用，且抑制作用强于盐酸氯丙嗪CPZ。

实施例32 X-10对ISK和KLE细胞迁移能力的影响

32.1实验材料和方法

Transwell小室购自于Costar公司；多聚甲醛为实验室常用试剂，商业购买，未经任何处理，其余实验材料来源同实施例1，具体实验方法如下：

1)取对数生长期的EC细胞，用胰蛋白酶消化下来，使用不含血清的DMEM/F12培养基制备成单细胞混悬液，以每孔约10万个细胞的密度接种至Transwell小室上方。小室下方加入600μL含20％FBS的DMEM/F12培养基，注意避免气泡产生。

2)设6组实验组，分别为对照组；CPZ 5μM组；CPZ 10μM组；X-10 2.5μM组；X-10 5μM组；X-10 10μM组，每组设3个复孔。给药组的上室加入含不同药物的无血清DMEM/F12培养基150μL，对照组上室加入无药物无血清的DMEM/F12培养基150μL。置于37℃，5％CO ₂的培养箱培养24h。

3)随后用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加入约800μL预冷PBS的24孔板中，清洗2次，每次5min。

4)取出小室，移到预先加入约800μL多聚甲醛溶液的24孔板中，室温固定30min。

5)取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μL结晶紫染液的24孔板中，室温染色30min。

6)轻轻用清水冲洗数次，用湿棉棒小心擦去上室膜表面上的细胞。

7)200倍显微镜下随机取5个视野拍照，Image J软件手动计数，统计各个视野下的细胞数。

32.2实验结果

结果如图2所示，图中Ctrl为对照组，照片中的每一个点表示一个穿过小室的细胞。结果表明，在KLE细胞中，与Ctrl组相比，给药组穿过小室的细胞数量减少，且随着化合物X-10浓度的增加而明显减少，尤其是高剂量组，只有少量细胞穿过，说明化合物X-10具有抑制KLE细胞迁移的能力，并且能够浓度依赖性地抑制子宫内膜癌细胞的迁移。柱状图纵坐标表示各组穿过小室细胞数目，数据显著性差异采用One-way ANOVA法分析(Graphpad Prism8.0软件)。

本实施例证明了新合成化合物X-10具有抑制KLE细胞迁移的能力，且抑制作用强于盐酸氯丙嗪CPZ。

实施例33 X-10对ISK和KLE细胞侵袭能力的影响

33.1实验材料和方法

多聚甲醛为实验室常用试剂，商业购买，未经任何处理；Transwell小室购自于Costar公司；基质胶购自于其余BD公司；实验材料来源同实施例1，具体实验方法如下：

1)基质胶1:6稀释，每个小室铺基质胶50μL，在37℃放置90min。

2)取无血清ISK/KLE细胞混悬液150μL(约18万个细胞)加入Transwell小室上室。细胞混悬液使用的培养基为不含血清的DME/F12培养基。

3)下室加入800μL含20％FBS的DME/F12培养基，注意避免气泡产生。

4)设6组实验组，分别为对照组；CPZ 5μM组；CPZ 10μM组；X-10 2.5μM组；X-10 5μM组；X-10 10μM组。给药组的上室加入含不同药物的无血清DME/F12培养基150μL。对照组上室加入无药物无血清的DME/F12培养基150μL。在培养箱培养48h(37℃，5％CO ₂)。

5)用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加入约800μL预冷PBS的24孔板中，清洗2次，每次5min。

6)取出小室，移到预先加入约800μL多聚甲醛溶液的24孔板中，室温固定30min。

7)取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约800μL 0.5％结晶紫染液的24孔板中，室温染色30min。

8)取出小室，轻轻用清水冲洗数次，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。200倍显微镜下随机取3个视野观察细胞，记数。

33.2实验结果

如图3所示，图3为新合成化合物X-10和CPZ对Ishikawa和KLE细胞侵袭能力的影响示意图。图中双阴组即为对照组，照片中的每一个黑点表示一个透过小室的细胞。可以发现，在Ishikawa和KLE细胞中，与同浓度CPZ组相比，新合成化合物X-10组透过小室的细胞数量显著减少(ISK：X-10 5μM Vs CPZ 5μM p<0.001；其余各组p<0.0001)。柱状图表示各组透过小室细胞数目，数据显著性差异采用t-test法分析(Graphpad Prism软件)，*给药组与同浓度CPZ组比较，***p<0.001；****p<0.0001。

本实施例证明了新合成化合物X-10具有抑制Ishikawa和KLE细胞侵袭的能力，且抑制作用强于盐酸氯丙嗪CPZ。

实施例34 X-10对Ishikawa和KLE细胞凋亡的影响

34.1实验材料和方法

本实施例采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒完成，试剂盒购自于碧云天生物科技有限公司，其中Annexin V-FITC结合液、Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)均为试剂盒中试剂。其余实验材料来源同实施例1。具体实验方法如下：

1)将ISK/KLE细胞传入6孔板，每孔约300,000个细胞，过夜待其贴壁。

2)设6组实验组，分别为对照组；CPZ 5μM组；CPZ 10μM组；X-10 2.5μM组；X-10 5μM组；X-10 10μM组。给药组加入含X-10的DME/F12培养基3mL，对照组加入无药DME/F12培养基3mL。在培养箱培养72h(37℃，5％CO2)。

3)把细胞培养液吸出至10mL离心管内，PBS清洗贴壁细胞一次，加入300μL胰酶消化细胞2min。吸除胰酶，加入步骤1中收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。

4)取5-10万重悬的细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

5)加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。

6)加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀。

7)室温避光孵育20min，立即用流式细胞仪检测。

34.2实验结果

图4为X-10对Ishikawa和KLE细胞凋亡的影响示意图。图中双阴组即为对照组，在凋亡示意图中的第一象限为晚凋细胞，第四象限为早凋细胞，其中第一象限和第四象限的百分比之和即为凋亡比例。与同浓度CPZ组相比，10μM X-10能够诱导ISK和KLE细胞凋亡，凋亡比例分别为18.31％和21.33％。柱状图表示各组细胞凋亡比例，数据显著性差异采用t-test法分析(GraphpadPrism软件)，*给药组与对照组比较，*p<0.05。

本实施例证明新合成化合物X-10可以诱导Ishikawa和KLE细胞凋亡，且诱导凋亡作用强于盐酸氯丙嗪CPZ。

实施例35 X-10对小鼠移植瘤生长的影响

本实施例通过裸鼠体内皮下成瘤实验测试了化合物X-10对子宫内膜癌细胞(ISK和KLE)移植瘤生长的影响。研究结果表明，化合物X-10能够显著抑制小鼠皮下ISK和KLE细胞移植瘤的生长。

35.1实验材料和方法

实验动物选择5-6周龄的SPF级的雌性BALB/C裸鼠，购自上海斯莱克动物实验有限公司；顺铂(DDP)来源于实验室老药库。化合物配制方法是称取一定量的化合物，溶于溶剂中稀释成所需浓度。化合物给药前现配现用。具体实验方法如下：

1)首先在5-6周龄的裸鼠右侧腋下皮下植入ISK或KLE细胞，每只小鼠约植入500万个细胞。

2)待肿瘤长至800-1000mm ³后处死小鼠，再将肿瘤组织切成大小均匀的肿瘤组织块，通过手术移植到新的5-6周龄裸鼠右侧腋下皮下。

3)待新长出的肿瘤体积达到平均300-400mm ³时，将小鼠随机分6组：对照组、溶剂组、阳性药DDP 2mg/kg、X-10 2mg/kg给药组、X-10 5mg/kg给药组、氯丙嗪5mg/kg组。

4)按不同的药物浓度腹腔注射0.1mL，每天称量小鼠体重，每2日用游标卡尺测量肿瘤长L(mm)和宽W(mm)。

5)每天给药，连续给药2周后，处死小鼠，剥离肿瘤，拍照。

6)解剖当天用游标卡尺测量肿瘤长L(mm)和宽W(mm)，并称量肿瘤重量。肿瘤体积计算公式V(mm ³)＝0.5×L(mm)×W(mm) ²。

35.2实验结果

实验结果如图5所示，图中Vehicle为对照组。其中A、B图为小鼠体重随给药时间的变化曲线，横坐标为给药天数，纵坐标为小鼠体重，从图中可以看到，X-10给药组体重平稳，顺铂DDP组体重有明显下降。C-F图可以看出给药结束后，与对照组相比，化合物X-10给药组的肿瘤生长均受到抑制，X-10 2mg/kg和X10 5mg/kg均能显著抑制小鼠肿瘤的生长，且与阳性药顺铂组效果相当甚至略优于顺铂。数据显著性差异采用One-way ANOVA法分析(Graphpad Prism8.0软件)。本实验证明化合物X-10能够抑制小鼠皮下ISK和KLE细胞移植瘤的生长且对体重没有影响，其药效与阳性药顺铂相当，毒性小于顺铂。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围。

Claims

一种式I所示化合物在制备治疗或预防子宫内膜癌的药物中的用途，

其中，n为1、2、3、4、5、6、7或8；

X、Y各自独立地选自N、O、S；

R ¹、R ²各自独立地选自H、羟基、卤素、C ₁-C ₆烷基、C ₁-C ₆卤代烷基、C ₁-C ₆烷氧基、硝基、亚硝基、氨基、苯基、甲酰基；

R ³为取代或未取代的氨基、或取代或未取代的4-12元杂环基，

其中，所述杂环基含有选自下组的1、2、3或4个杂原子：N、O、S，

所述取代各自独立地是指具有一个或多个选自下组的取代基：C ₁-C ₆直链或支链烷基、C ₃-C ₈环烷基、氧代(＝O)、羟基、C ₁-C ₆羟烷基、酰基、磺酰基、或C ₃-C ₆炔基取代的-(C ₁-C ₄亚烷基)-二氮环丙烯。
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物选自下组：
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述子宫内膜癌包括I型和II型子宫内膜癌。
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还用于以下一种或多种用途：

(a)抑制子宫内膜癌细胞增殖；

(b)抑制子宫内膜癌细胞克隆；

(c)抑制子宫内膜癌细胞迁移；

(d)诱导子宫内膜癌细胞凋亡；

(e)上述(a)至(d)的任意组合。
一种化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自下组：
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：

(A1)式I化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐，作为第一活性组分；

(A2)其他抗子宫内膜癌药物，作为第二活性组分；

(B)药学上可接受的载体或赋形剂。
如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述抗子宫内膜癌药物为孕激素、或拓扑异构酶抑制剂。
如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的拓扑异构酶抑制剂为拓扑替康、伊立替康、勒托替康或羟基喜树碱中的一种或两种以上的组合。
如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中，所述第一活性组分的重量含量为0.1-99％。
一种体外抑制子宫内膜癌细胞的方法，包括步骤：

(i)在如权利要求1所述的化合物或其立体异构体，或其药学上可接受的盐、或如权利要求6所述的药物组合物存在的条件下，培养子宫内膜癌细胞，从而抑制所述的子宫内膜癌细胞。