WO2023140613A1 - 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판 - Google Patents

락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루코스 및 락테이트와 반응하는 동일한 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))과 반응촉매(horseradish peroxidase: HRP)를 사용하여, 글루코스와 락테이트 두 분석에 대한 프로토콜을 설정이 용이하고, 글루코스와 락테이트를 측정하기 위한 분석 절차를 단순화할 수 있으며, 글루코스 농도와 락테이트 농도를 동시에 측정함에 따라 글루코스 농도와 락테이트 농도 측정이 간편하고, 측정된 글루코스 농도와 락테이트 농도로 종래보다 더욱 정밀한 비만도, 배아 활성도를 측정할 수 있는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판을 제공한다.

Description

락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판
본 발명은 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단일의 유입채널을 통해 유입된 샘플(배양액 또는 혈장, 혈청)을 동일한 기질을 갖는 제1반응물 및 제2반응물과 각각 반응시켜, 글루코스 및 락테이트 농도를 동시에 측정하는 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판에 관한 것이다.
일반적으로 글루코스(포도당)와 락테이트(젖산)는 우리의 신진대사 활동에 필수적인 생체 화합물인데, 글루코스와 락테이트의 측정은 궁극적으로 개인의 건강을 관리하기 위해 다양한 질병의 예후와 발달을 파악하는데 도움이 될 수 있다.
일례로, 글루코스는 체내 에너지 생산을 위한 주요 대사기질로 간주되는데, 혈액 내 농도로 당뇨병, 고혈압 및 지방간의 바이오마커로 사용되어 왔다.
혈당(혈중 글루코스)과 비교하여 혈중 락테이트는 덜 주목받아 왔는데, 혈중 락테이트는 피루브산 대사결함, 패혈증, 저산소증 및 수막염 등과 같은 질병 상태의 진단을 판단하도록 도울 수 있다.
글루코스와 락테이트는 모두 대사 주기에 기여하는 주요요인이지만, 현재까지 다양한 질병 상황에서 측정되지 않았고, 소수의 연구자들이 글루코스와 락테이트의 결합 효과를 연구하였다.
*이에 신장 및 간 기능 부전, 인슐린 저항성, 갑상선과 같은 장기간의 유전적 병력이 있는 소수의 경우에만 글루코스와 락테이트가 상당히 상승하는 것으로 보고되었다.
현재 글루코스가 락테이트보다 선호도가 높지만, 일부 연구에서는 락테이트가 비만 및 제2형 당뇨병을 모니터링하기 위해 글루코스와 동등하게 중요한 요인으로 여겨져야 한다.
그러므로 글루코스와 락테이트를 함께 측정하는 것은 비만 및 당뇨병과 같은 단일 배아의 질과 건강 상태를 평가하는데 중요하다.
그러나 단일 기질을 사용하는 프로토콜은 여러 효소와 동시에 상호 작용하면서 단일 기질이 안정되기 어렵기 때문에 이러한 대사 산물의 측정에 어려움이 있었다.
따라서 상기한 요구로 글루코스와 락테이트를 함께 측정하는 장치를 개발하기 위해 여러 시도가 있었으나, 글루코스와 락테이트를 동시에 측정할 수 있는 측정장치는 전무한 실정이다.
종래에는 글루코스와 락테이트를 측정하기 위해 별도의 측정 프로토콜로 측정되었는데, 글루코스는 전혈을 이용하여 전기화학적 검출방식을 사용하였고, 락테이트는 혈장을 이용하여 분광광도법을 사용하여, 각각 개별로 측정해야 하는 문제점이 있었다.
본 발명은 글루코스 및 락테이트와 반응하는 동일한 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))와 반응촉매(겨자무 과산화효소 horseradish peroxidase: HRP)를 사용하여, 글루코스와 락테이트 두 분석에 대한 프로토콜의 설정이 용이하고, 글루코스와 락테이트를 측정하기 위한 분석 절차를 단순화할 수 있으며, 글루코스 농도와 락테이트 농도를 동시에 측정함에 따라 글루코스 농도와 락테이트 농도 측정이 간편하며, 측정된 글루코스 농도와 락테이트 농도로 종래보다 더욱 정밀한 비만도, 배아 활성도를 측정할 수 있는 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명에 따른 락테이트 형광 측정방법은 a)락테이트를 측정할 샘플을 준비하는 단계; b)락테이트와 반응하여 형광 산화물을 생성하는 락테이트 반응물을 준비하는 단계; c)상기 준비된 샘플을 락테이트 반응물과 반응시키는 단계; 및 d)상기 샘플에 포함된 락테이트와, 상기 락테이트 반응물과의 반응으로 생성된 형광 산화물을 기반으로, 상기 샘플의 락테이트 농도를 측정하는 단계;를 포함한다.
이때 본 발명에 따른 상기 락테이트 반응물은 반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 락테이트 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산칼륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것이 바람직하다.
여기서 본 발명에 따른 상기 인산칼륨수용액은 HPLC 등급의 물과, 일염기성 인산칼륨과, 이염기성 인산칼륨을 혼합하여 50mM의 농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판은 샘플을 인입하는 단일의 유입채널과 상기 유입채널과 연통하면서 둘로 분기되는 분기채널을 형성한 베이스; 상기 베이스의 일측에 구비되면서, 상기 분기채널 중 어느 한 측의 분기채널과 연통하며, 샘플 중 글루코스와 반응하여 형광물질을 생성하는 제1반응물을 수용한 제1반응챔버; 및 상기 제1반응챔버와 인접하면서 상기 분기채널 중 다른 측의 분기채널과 연통하고, 샘플 중 락테이트와 반응하여 형광물질을 생성하는 제2반응물을 수용한 제2반응챔버;를 포함한다.
이때 본 발명에 따른 상기 제1반응물은 샘플 중 글루코스와 반응하는 것으로, 반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 글루코스 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산나트륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것이 바람직하다.
그리고 본 발명에 따른 상기 제2반응물은 샘플 중 락테이트와 반응하는 것으로, 반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 락테이트 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산칼륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것이 바람직하다.
여기서 본 발명에 따른 상기 인산칼륨수용액은 HPLC 등급의 물과, 일염기성 인산칼륨과 이염기성 인산칼륨을 혼합하여 50mM의 농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판은 최초 배양액의 글루코스 농도 및 락테이트 농도와, 배아 배양 후 글루코스 농도(소모) 및 락테이트 농도(생산)의 비교로, 배아의 활성도를 분석할수 있다.
본 발명에 따른 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판에 의해 나타나는 효과는 다음과 같다.
글루코스 및 락테이트와 반응하는 동일한 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))과 반응촉매(겨자무 과산화효소 horseradish peroxidase: HRP)를 사용하여, 글루코스와 락테이트 두 분석에 대한 프로토콜을 설정이 용이하고, 글루코스와 락테이트를 측정하기 위한 분석 절차를 단순화할 수 있는 효과를 가진다.
단일의 샘플(배양액, 혈장, 혈청 등)로 글루코스 농도와 락테이트 농도를 동시에 측정함에 따라 글루코스 농도와 락테이트 농도 측정이 간편해지고, 글루코스 농도와 락테이트 농도로 종래보다 더욱 정밀한 비만도를 측정할 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 락테이트 형광 측정방법을 단계적으로 보인 블록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판을 분해한 상태를 보인 분해사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판을 보인 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석을 위한 전체 실험 설정을 간략하게 보인 예시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 반응물 최적화를 위한 락테이트 분석을 보인 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석 역학을 보인 그래프이다.
도 7은 배아 상태에 따른 배양액의 글루코스와 락테이트 형광분석을 보인 그래프이다.
도 8은 혈장 및 혈청을 이용한 글루코스와 락테이트 형광분석을 보인 그래프이다.
본 발명은 샘플을 인입하는 단일의 유입채널과 상기 유입채널과 연통하면서 둘로 분기되는 분기채널을 형성한 베이스와, 상기 베이스의 일측에 구비되면서, 상기 분기채널 중 어느 한 측의 분기채널과 연통하며, 샘플 중 글루코스와 반응하여 형광물질을 생성하는 제1반응물을 수용한 제1반응챔버 및 상기 제1반응챔버와 인접하면서 상기 분기채널 중 다른 측의 분기채널과 연통하고, 샘플 중 락테이트와 반응하여 형광물질을 생성하는 제2반응물을 수용한 제2반응챔버를 포함하는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판을 이용하여, a)락테이트를 측정할 샘플을 준비하는 단계와, b)락테이트와 반응하여 형광 산화물을 생성하는 락테이트 반응물을 준비하는 단계와, c)상기 준비된 샘플을 락테이트 반응물과 반응시키는 단계, 및 d)상기 샘플에 포함된 락테이트와, 상기 락테이트 반응물과의 반응으로 생성된 형광 산화물을 기반으로, 상기 샘플의 락테이트 농도를 측정하는 단계를 포함하는 락테이트 형광 측정방법을 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들은 대체할 수 있는 균등한 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 단일의 유입채널을 통해 유입된 샘플(배양액 도는 혈장)을 동일한 기질을 갖는 제1반응물 및 제2반응물과 각각 반응시켜, 글루코스 및 락테이트 농도를 동시에 측정하는 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판에 관한 것으로, 도면을 참조하여 살펴보면 다음과, 같다.
도 1을 참조한 본 발명의 일 실시 예에 따른 락테이트 형광 측정방법은 a)락테이트를 측정할 샘플을 준비하는 단계; b)락테이트와 반응하여 형광 산화물을 생성하는 락테이트 반응물을 준비하는 단계; c)상기 준비된 샘플을 락테이트 반응물과 반응시키는 단계; d)상기 샘플에 포함된 락테이트와, 상기 락테이트 반응물과의 반응으로 생성된 형광 산화물을 기반으로, 상기 샘플의 락테이트 농도를 측정하는 단계;를 포함한다.
먼저 a)단계로, 락테이트를 측정할 샘플을 준비한다.
이때 준비되는 샘플은, 배아를 배양시킨 배양액, 동물 또는 인간의 혈장/ 혈청 일 수 있다.
다음은 b)단계로, 락테이트와 반응하여 형광 산화물을 생성하는 락테이트 반응물을 준비한다.
이때 상기 락테이트 반응물은 반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 락테이트 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산칼륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것이 바람직하고, 상기 인산칼륨수용액은 HPLC 등급의 물과, 일염기성 인산칼륨과, 이염기성 인산칼륨을 혼합하여 50mM의 농도를 갖는 것이 바람직하다.
다음은 c)단계로, 상기 준비된 샘플을 락테이트 반응물과 반응시킨다.
이때 상기 락테이트 반응물은 형광분석기판의 내부에 형성된 챔버에 수용된 후, 상기 챔버에 샘플을 주입하여 반응시킨다.
다음은 d)단계로, 상기 샘플에 포함된 락테이트와, 상기 락테이트 반응물과의 반응으로 생성된 형광 산화물을 기반으로, 상기 샘플의 락테이트 농도를 측정한다.
도 2 및 도 3을 참조한 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판은 상기 락테이트 형광 측정방법을 이용한 것으로, 베이스(100), 제1반응챔버(130), 제2반응챔버(140)를 포함하는데, 상기 베이스(100)는 판 상의 기판으로 하판(101)과 상판(102)으로 분할되어 구비될 수 있다.
상기 베이스(100)의 하판(101)은 상기 유입채널(110), 분기채널(120)과, 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)를 형성하고, 상기 상판(102)은 상기 하판(101)의 면적과 동일한 형태로, 상기 하판(101)을 상면에 접합되어, 상기 유입채널(110), 분기채널(120)과, 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)를 밀폐한다.
이때 상기 유입채널(110)은 상기 베이스(100)의 길이를 따라 형성되어, 상기 베이스(100)의 일측단에 형성된 유입구(111)를 통해 샘플을 유입하여 상기 베이스(100)의 길이를 따라 일측에서 타측으로 유동하도록 안내한다.
여기서 샘플은 수정란의 배양액 또는 동물 및 사람의 혈장으로 이루어진다.
그리고 상기 베이스(100)에 구비되는 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)는 상기 베이스(100) 중 상기 유입채널(110)의 유입구(111)와 대향진 위치상에 형성되는 것이 바람직하다.
상기 제1반응챔버(130)은 상기 분기채널(120) 중 어느 한 측의 분기채널(120)과 연통하며, 샘플 중 글루코스와 반응하여 형광물질을 생성하는 제1반응물(200)을 수용한다.
이때 상기 제1반응물(200)은 반응촉매와, 기질과, 글루코스 산화효소와, 완충액을 혼합한 혼합물로, 상기 반응촉매는 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)로 0.2U/ml가 혼합되고, 상기 기질은 앰플렉스 레드(Amplex Red)로 100μM로 혼합되며, 글루코스 산화효소는 2U/ml가 혼합되고, 상기 완충액(버퍼)은 해당 용량의 인산나트륨수용액이 혼합된다.
여기서 인산나트륨수용액은 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))의 자발적 산화를 최소화하고 형광 분석 중 기포 형성을 피하기 위해 HPLC 등급의 물을 사용하여 50mM의 인산나트륨수용액으로 제조하여 이용하는 것이 바람직하다.
따라서 샘플에 포함된 글루코스는 글루코스 산화효소와 반응하여 D-글루코노락톤(D-gluconolactone)와 과산화수소(H₂O₂)를 생성하고, 상기 과산화수소는 반응효소의 존재하에 기질과 화학양론적 반응하여, 레조루핀(resorufin)으로 알려진 분홍색/빨간색의 형광 산화물 생성한다.
또한, 상기 제2반응챔버(140)는 상기 제1반응챔버(130)와 인접하면서 상기 분기채널(120) 중 다른 측의 분기채널(120)과 연통하고, 샘플 중 락테이트와 반응하여 형광물질을 생성하는 제2반응물(300)을 수용한다.
이때 상기 제2반응물(300)은 반응촉매와, 기질과, 락테이트 산화효소와, 인산칼륨용액을 혼합한 혼합물로, 상기 반응촉매는 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)로 0.2U/ml가 혼합되고, 상기 기질은 앰플렉스 레드(Amplex Red)로 100μM로 혼합되며, 락테이트 산화효소는 2U/ml가 혼합되고, 상기 완충액(버퍼)은 해당 용량의 인산칼륨수용액이 혼합된다.
여기서 상기 인산칼륨수용액은 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))의 자발적 산화를 최소화하고 형광 분석 중 기포 형성을 피하기 위해 HPLC 등급의 물을 사용하여 일염기성 인산칼륨과 이염기성 인산칼륨을 혼합하여 50mM의 인산칼륨수용액으로 제조하여 이용하는 것이 바람직하다.
따라서 샘플에 포함된 락테이트는 락테이트 산화효소와 반응하여 피루브산(Pyruvate)과 과산화수소(H₂O₂)를 생성하고, 상기 과산화수소는 반응효소의 존재하에 기질과 화학양론적 반응하여 레조루핀(resorufin)으로 알려진 분홍색/빨간색의 형광 산화물 생성한다.
그러므로 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판은 단일의 유입채널(110)을 통해 유입된 샘플(배양액 또는 혈장)은 분기채널(200)에 의해 분기되어, 상기 분기채널(200)과 각각 연결된 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)로 유입됨에 따라 상기 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)에 각각 수용된 동일한 기질을 갖는 제1반응물(200) 및 제2반응물(300)과 각각 반응하여, 형광 물질을 생성하고, 생성된 그 형광 물질의 분석으로 글루코스 및 락테이트 농도를 동시에 측정할 수 있다.
또한, 상기 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)로 샘플의 유입이 원활하도록, 상기 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)에는 외부와 연통하는 연통을 형성하거나, 상기 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140) 각각에 진공압을 제공하는 진공펌프와 연결될 수 있다.
도 4 내지 도 8을 참조한 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판을 이용한 글루코스와 락테이트 동시 측정 실험을 살펴보면 다음과 같다.
먼저 글루코스와 락테이트 동시 측정을 위해 샘플로 배아를 배양한 배양액 및 혈장, 혈청을 준비한다.
이때 배아는 마우스의 배아로, 근친 교배 균주 ICR마우스를 사용하여 글루코스와 락테이트 동시 측정으로 단일 배아의 대사 활성을 측정하고, 근친 교배 수컷 마우스에서 대사 산물(혈장)을 분석한다.
여기서, 두 마우스 계통은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 명암 주기(21-23°C)로 통제된 환경에 수용되었다.
그리고 암컷 ICR마우스(6-9주)를 과배란 시켜, 암컷은 hCG주사와 같은 날 동일한 수컷 마우스 계통과 교배되었는데, 질 마개가 있는 과배란 암컷은 교배 후 18시간 후에 희생시켜, 배아를 채취하고, 채취된 배아(상실배와 초기 배반포)는 시험관 내에서 10% 혈청 대체 보충제와 함께 상업적으로 구입한 배지로 배양하였다.
배아(상실배와 배반포)는 37℃에서 5%의 CO₂가습 환경에서 24시간 동안 배양액을 방울로 60㎕가량 공급하여 배양되었고, 대조군의 배양액은 비특이적 대사산물 분해를 확인하기 위해 배아가 있는 배양액에 인접하여 배양되었으며, 배반포의 형태학적 상태를 기록하여 배양 초기에 기록된 상태와 비교하였다.
그리고 개별 배아의 측정은 배양액과 대조군의 기질 수준의 차이를 분석하여 수행되었는데, 개별 배아의 해당 활성은 1몰의 글루코스에서 2몰의 락테이트이 형성된다는 가정하에 계산되어, 결과는 pmol/embryo/h로 표시되었다.
마우스의 혈장은 수컷 근친교배 마우스(6주)를 두 그룹의 마우스로 나누어, 한 그룹에는 보통급식(ND-10% 지방)을 공급하고, 다른 그룹에는 고지방급식(HFD-60%)을 제공하여 비만을 유도했다.
혈액 샘플은 7-8주령 보통급식 마우스 및 최대 20주령 고지방급식 DIO마우스(비만 마우스)의 15-16시간 밤새 금식한 마우스로부터 수집되었고, 혈액 샘플을 수집한 직후 원심분리하여 혈장을 분리하였으며, 분리된 혈장을 메타인산(MPA)과 탄산칼륨을 사용하여 단백질을 제거하여 글루코스와 락테이트를 각각 측정하였다.
이때 혈장 시료에 대한 형광 분석을 위해 글루코스 및 락테이트 분석을 위한 마우스 혈장 샘플을 100-300배 희석하는 것이 바람직하다.
그리고 인간 혈청은 정상인과 당뇨병이 있는 환자의 혈청을 헤파린 처리된 튜브에 수집했고, 샘플을 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하며, 분석을 수행하기 전에 혈장을 500배 희석하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 준비된 샘플들을 각각 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판의 유입채널(110)로 유입시키면, 샘플이 유입채널(110)을 따라 분기채널(120)로 유입되고, 분기채널(120)로 유입된 샘플은 분기채널(120)에서 분기되어 각각 제1반응챔버(130) 및 제2반응챔버(140)로 유입되어, 각각 반응챔버(130, 140)에 수용된 반응물(200, 300)과 반응하게 된다.
이때 샘플에 포함된 글루코스는 글루코스 산화효소와 반응하여 D-글루코노락톤(D-gluconolactone)와 과산화수소(H₂O₂)를 생성하고, 상기 과산화수소는 반응효소의 존재하에 기질과 화학양론적 반응하여, 레조루핀(resorufin)으로 알려진 분홍색/빨간색의 형광 산화물 생성한다.
그리고 샘플에 포함된 락테이트는 락테이트 산화효소와 반응하여 피루브산(Pyruvate)과 과산화수소(H₂O₂)를 생성하고, 상기 과산화수소는 반응효소의 존재하에 기질과 화학양론적 반응하여 레조루핀(resorufin)으로 알려진 분홍색/빨간색의 형광 산화물 생성한다.
이때 상기 생성된 레조루핀은 약 571nm의 형광 여기 최대값과 585nm의 최대 방출을 가진다.
도 4는 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석을 위한 전체 실험 설정을 간략하게 보인 예시도이다.
여기서, 도 4(a)는 배아 수집을 위한 마우스의 준비 과정을 보인 것이고, 도 4(b)는 혈장 샘플에서 글루코스 및 락테이트 측정을 위한 정상 마우스 및 DIO(비만) 마우스 두 가지 유형의 마우스 준비하는 과정을 보인 것이며, 도 4(c)는 인간 혈액 및 혈장 수집하는 과정을 보인 것이고, 도 4(d)는 글루코스 및 락테이트 분석 원리를 표현한 것이다.
상기 제1반응물(200) 및 제2반응물(300)에 포함된 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red) 시약은 반응촉매와 과산화수소(H₂O₂)를 생성하는 효소에 대한 다양한 형광 및 발색 분석을 수행하기 위한 가장 안정적이고 민감한 형광 기질이다.
효소적 락테이트 분석법의 개발은 락테이트 산화효소(LOX) 및 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)에 의한 L-락테이트(L-lactate)의 피루브산으로의 산화를 기반으로 했고, 기질의 선택은 D-글루코노락톤을 생산하기 위해 글루코스 산화효소(GOX) & 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)에 의해 촉매된 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)를 사용하여 이전에 확립된 글루코스 분석을 기반으로 했다.
종래에는 글루코스와 락테이트를 각각 개별적으로 측정하였는데, 이때 글루코스는 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)를 이용한 글루코스 어세이(assay) 프로토콜을 이용하였고, 락테이트는 LDH(lactate dehydrogenase)를 이용한 락테이트 어세이(assay) 프로토콜을 이용하였으나, 단일 기질을 사용하여 글루코스와 락테이트를 동시에 측정하기 위한 프로토콜은 존재하지 않는다.
따라서 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판은 동일한 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))과 반응 촉매(겨자무 과산화효소(HRP))를 사용하여 두 분석 모두에 대한 프로토콜을 설정하여 분석 절차를 단순화하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 반응물 최적화를 위한 락테이트 분석을 보인 그래프이다.
여기서, 도 5(a)는 완충액(버퍼)인 인산나트륨수용액을 사용한 글루코스 분석과 비교하여, 인산나트륨 및 인산칼륨 수용액을 사용한 락테이트 분석에 대한 신호의 안정화를 보인 것이고, 도 5(b) ~ 도 5(e)는 완충액(버퍼)인 인산칼륨 수용액을 사용한 락테이트 분석에 대한 각 성분의 효과를 보인 것으로, 도 5(b)는 pH, 도 5(c)는 반응촉매(겨자무 과산화효소(HRP)), 도 5(d)는 락테이트 산화효소, 도 5(e)는 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red), 도 5(f)는 완전한 반응물, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)를 뺀 반응물, 겨자무 과산화효소(HRP)를 뺀 반응물, 락테이트 산화효소(LOX) 뺀 반응물 및 락테이트 뺀 반응물에 대한 락테이트 반응을 보인 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이 락테이트 분석에 글루코스 분석과 동일한 조건을 적용한 경우, 형광 신호는 글루코스와 달리 불안정하거나 변동되었는데, 이를 해소하기 위해 Na+의 이온을 가진 완충액(버퍼)인 인산나트륨수용액을 K+의 이온을 가진 인산칼륨수용액으로 교체하여 형광 신호를 안정화했다.
효소의 활성과 수용액에서의 안정성은 완충액에 따라 달라지며, 다른 단백질은 Na+ 또는 K+와 같은 특정 이온과 다른 안정성을 가질 수 있다.
도 5(a)에 나타난 바와 같이, 락테이트 분석에서 인산나트륨수용액에 비해 인산칼륨수용액의 K+ 이온으로 신호 변동이 감소하였다.
따라서 락테이트 분석에서는 완충액(버퍼)으로 인산칼륨수용액으로 수행되었지만, 글루코스 분석에서는 완충액(버퍼)으로 인산나트륨수용액을 사용하였다.
도 5(b)~(e)참조하면 인산칼륨수용액을 사용한 락테이트 분석에 대한 각 성분(pH, 겨자무 과산화효소(HRP), 락테이트 산화효소(LOX) 및 앰플렉스 레드(Amplex Red)) 효과를 추가로 평가했는데, 가장 높은 신호는 분해능과 선택성 등의 측면에서 더 많은 이점이 있기 때문에 가장 높은 값을 보인 각 구성 요소에 대해 최적의 조건을 선택했고, 여기에서 반응물의 최적 조건은 pH 7.3, 겨자무 과산화효소(HRP) 0.2U/ml, 락테이트 산화효소(LOX) 2U/ml 및 앰플렉스 레드(Amplex Red) 100μM이다. 모든 평가는 50μM의 락테이트를 사용했다.
완전한 반응혼합물은 가장 높은 수준의 형광을 보인 반면, 촉매로 작용하는 겨자무 과산화효소(HRP)를 제거 시에는 낮은 신호 강도를 나타냈고, 반응의 핵심인자인 기질(앰플렉스 레드(Amplex Red))와, 락테이트 산화효소(LOX)에 락테이트를 생략하면 도 5(f)에 나타낸 바와 같이 신호가 나타나지 않았다.
이러한 결과는 다른 구성요소가 주로 락테이트에 반응했음을 종합적으로 보여주었으며, 이는 분석 프로토콜이 락테이트에 특이적임을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석 역학을 보인 그래프로, 도 6(a) 및 도 6(b)는 5분 간격으로 30분 동안 글루코스(a) 및 락테이트(b) 농도에 대한 형광신호의 증가를 보인 것이고, 도 6(c) 및 도 6(d)는 5분 간격으로 글루코스(c) 및 락테이트(d) 농도를 증가시켜 형광 신호의 증가를 보인 것이며, 도 6(e)는 글루코스(R2=0.71) 및 락테이트(R2=0.77) 농도의 넓은 범위(~ 최대 500μM)의 형광 신호를 보인 것이고, 도 6(f)는 회귀 계수(R2)가 0.94인 전형적인 글루코스 표준 곡선 및 회귀 계수(R2)가 0.98인 락테이트 표준 곡선을 보인 것이다.
도 6(a) 및 (b)에서는 시간이 경과함에 따라 글루코스의 형광 신호는 지속적으로 증가하였고, 락테이트의 형광 신호는 5분에 최대값에 도달한 후 점차 감소하였다.
도 6(c) 및 (d)는 각각 글루코스 및 락테이트 농도의 관점에서 시간 증분을 갖는 도 6(a) 및 (b)의 리플롯이다.
도 6(e)와 같이 글루코스(R²=0.71) 및 락테이트(R²=0.77) 농도의 넓은 범위(최대 500μM)에서 형광 신호를 분석하여 분석 감도를 평가했다.
모든 기질과 과산화수소(H₂O₂)가 이미 사용되었기 때문에 형광 신호는 쌍곡선 방식으로 증가하고 100μM 농도 이상의 곡선에서 정체된 상태를 나타냈으나, 도 6(f)와 같이 농도의 형광 신호는 글루코스와 락테이트의 경우 1μM에서 100μM 범위였으며 회귀계수(R²)가 글루코스 분석의 경우, 각각 0.94, 락테이트의 경우, 0.98로 분석의 선형성을 보여주었다.
따라서 최대 100μM 범위의 선형성을 통해 글루코스 소비 및 락테이트 생산 측정을 기반으로 단일 마우스 배아의 해당 활성을 측정할 수 있다.
배아의 활성도를 측정하기 위해 3개의 다른 초기 형태적 단계(상실배 n=20, 초기 배반포 n=20 및 확장된 배반포 n=18)를 가진 총 58개의 배아를 24시간 동안 배양했다.
일반적으로 배아는 접합자(수정란으로 추정), 2세포, 4세포, 8세포, 상실배, 초기 배반포, 확장 배반포, 부화 및 부화기의 순서로 발달하는데, 각 배아의 발달 능력이 다르기 때문에 도착 단계가 시작 단계와 일치하지 않을 수 있다.
모든 배양된 배아는 확장, 부화 및 부화 배반포의 세 가지 다른 단계 중 하나에 있었는데, 각 분석의 효능과 발달 단계/속도와 배아 능력(대사 및 해당 활동으로 표시) 간의 상관관계를 찾기 위해 24시간 동안 각 개별 배아의 글루코스 소비량과, 락테이트 생산을 조사하였다.
그 결과는 각 단일 배아의 글루코스 소비율이 발달 후기 단계에서 증가함을 보여주었다.
도 7(a)에서 볼 수 있듯이 상실배아의 글루코스 소모율은 5.36±0.92 pmol/embryo/h였으며, 소모율은 초기(6.88±0.89 pmol/embryo/h)와 확장된 배반포(8.01±0.87pmol/embryo/h), 1.53pmol/embryo/h(p<0.4), 및 2.65pmol/embryo/h(p<0.04)로, 배아의 락테이트 생산율은 배아 발달과 함께 감소했다.
상실배, 초기 배반포 및 확장된 배반포에서의 락테이트 생산율은 각각 8.84±0.88 pmol/embryo/h, 8.31±1.05 pmol/embryo/h 및 5.62±0.75 pmol/embryo/h였다.
상실배와 초기 배반포의 락테이트 생산 수준에는 유의한 차이가 없었다.
그러나 상실배 및 확장된 배반포(p<0.009) 및 초기 및 확장된 배반포(p<0.04)의 락테이트 생산에서는 유의한 차이가 관찰되었고, 글루코스 소비와 락테이트 생산을 기준으로 측정한 배아의 해당 활성은 상실배에서 배반포 확장으로 점차 감소했다.
동일한 조건에서 배양한 초기 배반포는 상실배보다 해당 활성이 적었다(169.76±3 8.53% VS 76.55±16.58%)(p<0.03).
유사하게, 확장된 배반포(44.02±8.36%)의 해당 활성은 상실배 단계 배아(p<0.004) 및 초기 배반포(76.55±16.58%)보다 낮았다(p<0.09).
상기한 결과에 따르면 배아의 후기 단계는 글루코스와 같은 더 많은 에너지 자원이 필요하고, 세포수가 증가함에 따라 다음 단계로 이동하기 위해 더 많은 대사 활동이 있는 것으로 보인다.
따라서 배아의 더 나은 발달을 위해 pH를 유지하기 위해 락테이트 수준을 유지하는 것이 필요하고, 또한 배아의 해당 활성은 소모된 글루코스와 배아의 여러 단계에서 생성된 락테이트를 기반으로 계산되었다.
해당 작용 활성이 낮은 배반포는 해당 작용 수준이 높은 배반포보다 생존 가능성이 더 높은 것으로 가정되고, 가장 높은 해당 수준은 상실배 단계에 있었고, 가장 낮은 것은 확장된 배반포에서 관찰되었다.
그러므로 상실배 단계의 배아는 초기, 확장된, 부화하는 배반포보다 더 높은 해당 활성을 나타낸다.
또한, 추가 희석 절차가 필요하지만 대사 건강 상태를 결정하기 위해 정상 및 DIO마우스 모델의 혈장 샘플과 인간 혈청 샘플에 에서 글루코스 및 락테이트 농도를 측정했다.
도 8은 혈장 및 혈청을 이용한 글루코스와 락테이트 형광분석을 보인 그래프로, 도 8(a)는 6주에서 20주 사이에 60kcal% 지방을 먹인 수컷 DIO 쥐와 10kcal% 식단을 먹인 정상 쥐의 평균 체중 값(일주일에 두 번 같은 날에 측정된 10마리 마우스의 평균 및 표준 편차)을 나타낸다. 도 8(b)는 ND 및 DIO 마우스 혈장에서 측정된 글루코스 및 락테이트 수준(***p<0.001)을 보인 것이고, 도 8(c)는 ICR 균주 마우스의 글루코스 및 락테이트 수준을 보인 것이며, 도 8(d)는 정상, 당뇨병 전증 및 당뇨병 환자의 인간 혈청 샘플에서 글루코스 및 락테이트 수준 (*p<0.05, **p<0.01)을 보인 것이다.
혈장 샘플은 초기 체중이 19.18±0.6g인 6주령 마우스에 고지방급식(HFD) 또는 보통급식(ND) 식이를 도입했는데, 체중의 변화는 20주령까지 기록되었다. 고지방급식(HFD)을 먹인 쥐는 보통급식(ND)을 먹인 쥐보다 체중이 더 늘었다.
고지방급식(HFD)을 도입한 1주일 후, 마우스 무게는 1.32±1.10g만큼 유의하게 증가했고, 보통급식(ND)을 식이한 마우스 그룹에서 체중 증가가 0.91±0.6g 증가하여 고지방급식(HFD)을 먹인 마우스에서 더 높고 빠른 체중 증가를 하였다.
보통급식(ND) 마우스의 평균 체중 증가는 0.59±0.64g이었는데, 그러나 고지방급식(HFD)을 먹인 마우스의 경우 1.04±1.10g이었다. 금식 후 마우스의 체중 감소는 < 2g이었는데, 마우스 체중 기록은 도 8(a)에 나와 있다.
아래의 [표 1]은 상용 키트를 사용하여 측정된 락테이트 농도와 현재 프로토콜 간의 비교를 보인 것이다.
마우스 상용 키트의 락테이트 수치(평균 ±SD) 현재 프로토콜의 락테이트 수치(평균±SD) 차이% 몸무게(g)
보통급식1 1.986 ± 0.016 1.793 ± 0.062 9.65 27.71
보통급식2 5.613 ± 1.827 5.304 ± 0.011 5.497 29.59
보통급식3 2.840 ± 0.104 2.583 ± 0.011 9.033 30.67
고지방급식1 9.072 ± 0.478 8.963 ± 0.030 1.2 46.46
고지방급식2 9.152 ± 0.287 8.291 ± 0.412 9.405 50.73
고지방급식3 10.164 ± 0.546 9.896 ± 0.060 2.627 51.29
단식 DIO수컷 마우스(n=10)의 글루코스 수준은 보통급식(ND)를 섭취한 마우스(n=10)보다 더 높았고, 고지방급식(HFD)을 먹인 마우스의 혈장 글루코스는 보통급식(ND)을 먹인 마우스에 비해 2.15mmol/l 증가(p<0.001) 했으며, 보통급식(ND)을 먹인 마우스의 평균 글루코스 농도는 4.49±0.16mmol/l이었고, DIO 마우스에서는 6.64±0.18mmol/l이었다.마찬가지로, 고지방급식(HFD)를 먹인 마우스의 락테이트 수준은 보통급식(ND)을 먹인 마우스보다 3.80mmol/l(6.42±0.28mmol/l 대 2.61±0.11mmol/l) 증가(p<0.001) 했다. 따라서 마우스에게 먹인 식단의 유형은 혈당과 락테이트 수치에 영향을 미쳤고, 마우스 균주는 식이 비만에 좋은 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
HFD로 유도된 비만 마우스 그룹은 ND를 먹인 마우스에 비해 글루코스 수준이 증가한 것으로 나타났고, 측정된 포도당 수준은 14-16시간 동안 밤새 금식한 ND 섭취 마우스에 의해 측정된 것과 유사하였다.
다른 연구에서는 측정한 동일한 비절식 마우스 계통보다 금식 마우스의 수준이 더 낮았고, 6시간의 단식 후 동일한 계통의 마우스에서 혈장 글루코스 측정값은 우리 연구(5.61mmol/l)보다 약간 더 높았다.
따라서 공복 상태의 마우스는 공복 시간이 증가함에 따라 혈장 혈당이 감소하는 것으로 나타났고, 글루코스과 락테이트 수치는 도 8(b)에 나와 있다.
마우스의 혈당 수치는 성별에 따라 다른데, 암컷 마우스는 일반적으로 수컷 마우스보다 혈장 글루코스이 더 낮고, 금식 시간과 시기에 따라 다르다.
본 실험에 따른 글루코스와 락테이트는 다른 쥐 균주인 ICR에서도 측정되었는데, 도 8(c)에 나타낸 바와 같이 글루코스와 락테이트 농도가 균주마다 다르기 때문에 글루코스와 락테이트 농도는 모두 ICR 균주 마우스에서 더 높았다.
그리고 4마리의 ND-fed ICR 마우스와, 4마리의 ND-fed C57BL/6J 마우스에 대해 비교가 이루어졌으며, 각각은 거의 동일한 체중과 동일한 금식 시간을 가졌는데, 평균 글루코스 농도는 ICR 마우스의 경우 4.84±0.17mmol/l, C57BL/6J 마우스의 경우 2.85±0.19mmol/l이였다.
그러나 ICR의 경우 3.78±0.10mmol/l, C57BL/6J 마우스의 경우 2.02±1.16mmol/l로 두 마우스의 락테이트 수준에서 1.75mmol/l의 차이(p < 0.03)로 나타났다.
인간 혈청 샘플은 환자의 개인 및 신체 건강 정보 없이 병원에서 제공한 20개의 인간 혈청 샘플을 분석했다.
결과는 전체 글루코스 농도가 3.64mmol/l~14.19mmol/l의 범위로 평균값이 7.99±0.84mmol/l인 반면 전체 락테이트 농도의 범위는 0.53mmol/l~11.88mmol/l이며, 평균값은 5.00 ± 0.68mmol/l이다.
측정된 글루코스 농도를 기반으로 우리는 20개의 샘플을 정상, 당뇨병 전단계 및 당뇨병 이상 세 그룹으로 추가 분류했다.
공복 혈당 농도가 99mg/dl(5.5mmol/l) 미만이면 정상으로 간주되는 반면, 100mg/dl에서 125mg/dl(5.6-6.9mmol/l) 사이의 글루코스 농도는 당뇨병 전단계로 간주했으며, 당뇨병 환자 그룹의 공복 혈당 농도는 > 126mg/dl(> 7.0mmol/l)이다.
샘플 중 5명은 4.73±0.29mmol/l 글루코스 농도와, 3.53±1.19mmol/l 락테이트 농도로 정상그룹에 있었고, 다른 7개 샘플은 글루코스 농도가 6.49±0.13 mmol/l이고, 락테이트 농도가 3.79±1.07 mmol/l인 당뇨병 전단계그룹에 있었으며, 유사하게 당뇨병그룹의 8명은 11.34±1.36mmol/l의 글루코스 농도와 6.21±1.17mmol/l의 락테이트 농도를 보였다.
정상 그룹과 당뇨병 전단계 그룹 사이의 락테이트 농도는 유의한 차이가 없었지만, 글루코스와 락테이트 농도는 정상에서 당뇨병으로 상태가 악화됨에 따라 증가했다.
도 8(d)에 나타난 바와 같이, 글루코스 농도는 정상 그룹에 비해 당뇨병 전단계 그룹에서 증가하였다(p<0.05).
마찬가지로, 당뇨병 그룹은 당뇨병 전단계 그룹(p<0.05) 및 정상 그룹(p<0.05)보다 글루코스 및 락테이트 농도가 더 높았다.
종래에는 두 유형의 당뇨병 환자 모두에서 공복 혈장 락테이트가 증가하는 것으로 나타났는데, 글루코스와 마찬가지로 락테이트 또한, 노인의 비만과 관련이 있고, 비만이 있는 비당뇨병 환자와 비교할 때 더 높은 락테이트 수치가 나타났으며, 락테이트 생산은 조절되지 않는 당뇨병 환자에서도 더 높다.
입원 당시 환자에서 매우 높은 글루코스(>11.1mmol/l)와 매우 높은 락테이트(>4mmol/l)의 조합이 가장 높은 사망률(39.15%)을 나타냈다.
다음으로 높은 글루코스(7.8-11.1mmol/l)와 매우 높은 락테이트(34.04%)의 조합이다.
신장 질환 및 심장 문제와 같은 다른 건강 상태가 있는 당뇨병 환자는 높은 락테이트 농도의 발병률이 높다고 하는데, 글루코스 농도가 정상인 정상 그룹의 락테이트 농도는 정상 락테이트 범위인 0.5mmol/l~2.2mmol/l 보다 비교적 높았으며, 이는 당뇨병을 나타내지 않지만 다른 건강 문제를 나타낼 수 있다.
따라서 본 발명은 글루코스와 락테이트의 동시 측정을 위해 동일한 기질을 사용하는 형광 분석기판은 배아의 배양액, 마우스 혈장 및 인간 혈청 샘플에서 글루코스와 락테이트를 모두 측정하는데 성공적으로 사용되었고, 배양액을 사용한 배아의 대사 산물 및 해당 작용의 측정은 이식을 위한 생존 가능한 배아를 선택하는데 사용할 수 있으며, 이는 다태 임신의 기회를 최소화하면서 성공적인 수태 및 출산으로 이어질 수 있다.
마우스 혈장 및 인간 혈청 샘플에서 측정된 글루코스와 락테이트는 대사 건강 상태를 결정하고, 미래에 발생할 수 있는 추가 합병증을 분석하는데 도움이 될 수 있고, 글루코스와 락테이트에 따른 대사 산물의 측정은 중환자의 결과를 예측하는 데에도 사용할 수 있다.

Claims (8)

  1. a)락테이트를 측정할 샘플을 준비하는 단계;
    b)락테이트와 반응하여 형광 산화물을 생성하는 락테이트 반응물을 준비하는 단계;
    c)상기 준비된 샘플을 락테이트 반응물과 반응시키는 단계; 및
    d)상기 샘플에 포함된 락테이트와, 상기 락테이트 반응물과의 반응으로 생성된 형광 산화물을 기반으로, 상기 샘플의 락테이트 농도를 측정하는 단계;를 포함하는 락테이트 형광 측정방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 락테이트 반응물은
    반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 락테이트 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산칼륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 하는 락테이트 형광 측정방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 인산칼륨수용액은
    HPLC 등급의 물과, 일염기성 인산칼륨과, 이염기성 인산칼륨을 혼합하여 50mM의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 락테이트 형광 측정방법.
  4. 샘플을 인입하는 단일의 유입채널과 상기 유입채널과 연통하면서 둘로 분기되는 분기채널을 형성한 베이스;
    상기 베이스의 일측에 구비되면서, 상기 분기채널 중 어느 한 측의 분기채널과 연통하며, 샘플 중 글루코스와 반응하여 형광물질을 생성하는 제1반응물을 수용한 제1반응챔버; 및
    상기 제1반응챔버와 인접하면서 상기 분기채널 중 다른 측의 분기채널과 연통하고, 샘플 중 락테이트와 반응하여 형광물질을 생성하는 제2반응물을 수용한 제2반응챔버;를 포함하는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1반응물은
    샘플 중 글루코스와 반응하는 것으로, 반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 글루코스 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산나트륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 하는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 제2반응물은
    샘플 중 락테이트와 반응하는 것으로, 반응촉매인 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP)와, 기질인 앰플렉스 레드(Amplex Red)와, 락테이트 산화효소와, 완충액(버퍼)인 인산칼륨수용액을 서로 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 하는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 인산칼륨수용액은
    HPLC 등급의 물과, 일염기성 인산칼륨과 이염기성 인산칼륨을 혼합하여 50mM의 농도를 갖는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판.
  8. 청구항 4에 있어서,
    최초 배양액의 글루코스 농도 및 락테이트 농도와, 배아 배양 후 글루코스 농도(소모) 및 락테이트 농도(생산)의 비교로, 배아의 활성도를 분석하는 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판.
PCT/KR2023/000862 2022-01-19 2023-01-18 락테이트 형광 측정방법 및 글루코스와 락테이트 동시 측정 형광분석기판 WO2023140613A1 (ko)

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