WO2023136510A1 - 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법 및 장치 - Google Patents

라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법 및 장치 Download PDF

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WO2023136510A1
WO2023136510A1 PCT/KR2022/021432 KR2022021432W WO2023136510A1 WO 2023136510 A1 WO2023136510 A1 WO 2023136510A1 KR 2022021432 W KR2022021432 W KR 2022021432W WO 2023136510 A1 WO2023136510 A1 WO 2023136510A1
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stem cells
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stem cell
raman spectroscopy
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김준기
주미연
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재단법인 아산사회복지재단
울산대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method and apparatus for sorting stem cells using Raman spectroscopy.
  • Stem cells have the ability to divide and differentiate into almost all types of cells in the body, so they are emerging as a new alternative when current treatments are not appropriate or there is no treatment method. However, it is difficult to analyze the division and differentiation process of each stem cell, and it is difficult to identify the lineage of all stem cells, so there is a possibility of stability problems when used in clinical practice.
  • stem cells Currently, methods used to confirm the differentiation characteristics of stem cells include chemical staining assay, quantitative polymerase chain reaction (qPCR), western blot analysis, and immunofluorescence staining. (immunofluorescene staining) and the like have been used.
  • hADMSCs human adipose-derived mesenchymal stem cells
  • differentiated cells are generally analyzed for phylogenetic identification, and then destruction/invasive processes such as cell fixation and lysis are used, which make it impossible to reuse the differentiated cells.
  • destruction/invasive processes such as cell fixation and lysis are used, which make it impossible to reuse the differentiated cells.
  • some of these existing methods have limited resolution and cannot perform single-cell level analysis.
  • An object to be solved by the present invention is to provide a method and apparatus for sorting stem cells using Raman spectroscopic analysis.
  • the problem to be solved by the present invention is to identify and quantify the differentiation direction and division state of stem cells in a non-destructive, non-invasive and non-labeled state, so that normal stem cells can be applied at an appropriate time. It is to provide a cell sorting method and apparatus.
  • a method of sorting stem cells using Raman spectroscopy for solving the above problems is a method of sorting stem cells using a Raman spectroscopy module and a sorting device, wherein a specimen containing the stem cells Preparing and pre-processing, comparing and analyzing Raman spectroscopy spectral images through Raman spectroscopy, comparing Raman spectroscopy results with Raman standard average values to evaluate the differentiation direction and state of the stem cells, the stem cells Classifying the differentiation and growth types of the stem cells, and quantifying the differentiation and growth types of the stem cells by including the Raman standard average value.
  • a stem cell removal step of selectively removing the stem cells included in the sample may be further included according to a comparison result between the Raman spectroscopic test result and the preset Raman reference average value according to the Raman spectroscopic test.
  • the step of comparatively analyzing the Raman spectroscopy spectrum image is the step of calculating a Raman signal and a Raman spectroscopy spectrum image according to the Raman signal by performing a Raman scattering test on the stem cells in the differentiation process, the Comparing the Raman signal and the Raman spectral spectrum image with the stem cell average Raman signal and the Raman average spectral spectrum image of the culture dish containing the stem cells, and the difference between the compared Raman signal and the Raman spectroscopy image Depending on the differentiation process, it may include a step of confirming whether or not there is an abnormal chemical change in the stem cells.
  • a program for performing the classification method of stem cells using Raman spectroscopy according to the present invention may be stored in a computer-readable recording medium coupled to a hardware computer in order to solve the above problems.
  • the apparatus for sorting stem cells using Raman spectroscopy for solving the above problems is to culture a stem cell sample in a culture dish capable of Raman spectroscopy, and conduct a Raman spectroscopy test for stem cells.
  • stem cell classification method using Raman spectroscopic analysis according to an embodiment of the present invention, toxic effects and abnormal reactions due to staining can be avoided by quantifying the differentiation direction and division state of stem cells in an unlabeled state. The original state of the cell and the state that changes in real time can be observed in real time.
  • stem cells grown and differentiated for a certain period of time can be used for experiments without exhaustion through quality check by checking the differentiation characteristics of stem cells with a non-destructive and non-invasive analysis method, and normal stem cells are applied at an appropriate time can support you to do it.
  • FIG. 1 is a flow chart for sequentially explaining a method of sorting stem cells using Raman spectroscopy according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view specifically showing various directions of differentiation of stem cells applied as specimens according to an embodiment.
  • FIG. 3 is an image diagram for explaining a comparative analysis method of a Raman spectroscopy spectrum image according to an exemplary embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a process of classifying and quantifying the differentiation direction and division state of stem cells using a machine learning algorithm according to an embodiment.
  • FIG. 5 is a configuration block diagram showing in detail an apparatus for sorting stem cells using Raman spectroscopy according to an embodiment of the present invention.
  • the identification code is used for convenience of description, and the identification code does not explain the order of each step, and each step may be performed in a different order from the specified order unless a specific order is clearly described in context. there is.
  • FIG. 1 is a flow chart for sequentially explaining a method of sorting stem cells using Raman spectroscopy according to an embodiment of the present invention.
  • the stem cell classification method includes preparing and pre-processing a specimen including stem cells (ST1), comparing and analyzing Raman spectroscopy spectral images (ST2), and averaging the Raman spectroscopy test result with the Raman standard. It includes a step of comparing the value (ST3), a step of selectively removing stem cells (ST4), and a step of classifying and quantifying the differentiation and growth types of stem cells (ST5, ST6).
  • the stem cells are cultured in a culture dish capable of Raman spectroscopy, and the culture dish sample is placed in at least one test position to prepare for a Raman spectroscopy test.
  • the culture dish in which the stem cells are distributed is put into a cell incubator to pre-treat the test dish.
  • Stem cells placed and distributed in a culture dish as samples include liver-derived stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, induced pluripotent stem cells, and mesenchymal stem cells, etc. this may apply.
  • liver-derived stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC
  • human adipose-derived mesenchymal stem cells of the fifth lineage may be cultured for at least two days and differentiated into osteoblasts and adipocytes.
  • human adipose-derived mesenchymal stem cells can be differentiated using StemPro Adipogenesis differentiation kit media (Gibco).
  • StemPro Adipogenesis differentiation kit media As another example, for osteogenic differentiation, human adipose-derived mesenchymal stem cells were supplemented with ascorbic acid (SigmaAldrich), glycerophosphate (Sigma-Aldrich), and dexamethasone (Sigma-Aldrich). It can also be treated with mesenchymal stem cell growth medium.
  • FIG. 2 is a view specifically showing various directions of differentiation of stem cells applied as specimens according to an embodiment.
  • stem cells have the property of dividing and differentiating into almost all types of cells in the body, and include nucleus, cytoplasm or endoplasmic reticulum, chloroplast, cytoplasm, lysosome, and cell clustering. (e.g., vesicle, plasma membrane) and the like. Accordingly, stem cells can be differentiated and classified into cells of various phenotypes according to body types through the growth and differentiation of each structural germ layer. In particular, mesenchymal stem cells can be differentiated into muscle cells, blood cells, nerve cells, cardiomyocytes, hepatocytes, fat cells, bone cells, etc. through a cell differentiation process. These mesenchymal stem cells exist in an undifferentiated state and are differentiated into cells of various types according to differentiation signals to form unique functions and shapes as differentiated cells.
  • mesenchymal stem cells exist in an undifferentiated state and are differentiated into cells of various types according to differentiation signals to form unique functions and shapes as differentiated cells.
  • a spectrum image of the stem cells is detected and compared with an image to be compared for analysis.
  • Raman signals may be obtained by performing a Raman scattering test on the stem cells in the differentiation process.
  • a Raman scattering method is an analysis method that provides molecular-specific information about biological and chemical specimens.
  • a change in intensity of a characteristic peak of a Raman marker is measured to quantify a target material (eg, nucleic acid, lipid, protein, etc.) of stem cells in the differentiation process.
  • a target material eg, nucleic acid, lipid, protein, etc.
  • a Raman signal may be obtained by measuring a portion where stem cells are distributed in a culture dish using a Raman scattering method.
  • a Raman spectroscopy device eg, 532 nm laser, 785 nm laser Raman Device
  • a spectrum image of the sampled wavelength range is extracted. can do.
  • the spectrometer Collected scattered light can be dispersed.
  • the dispersed light dispersed by the dispersion system may be detected by a Raman spectroscopy device in addition to a CCD camera (charge-coupled device camera), and the dispersed light may be converted into a spectrum.
  • the type of protein, lipid, RNA, DNA, etc. may be further detected according to the unique Raman spectrum distribution and coverage of organic and inorganic molecules.
  • confocal microscopy images are obtained through a confocal microscope to extract the number of stem cells, information on the size of each stem cell, etc. .
  • FIG. 3 is an image diagram for explaining a comparative analysis method of a Raman spectroscopy spectrum image according to an exemplary embodiment.
  • the number of stem cells detected through the confocal microscope image acquisition process, size information of each stem cell, etc. are recorded as Raman average data.
  • the reference information of the Raman average data can be compared with the reference information of
  • the average Raman data may be data formed and databased through data accumulation of conventionally differentiated stem cells.
  • the Raman signal extracted through the Raman spectroscopy test and the Raman spectroscopy spectrum image are included in the stem cell Compare the Raman average signal and the Raman average image of the culture dish with
  • the Raman signal extracted through the Raman spectroscopy test and the Raman spectroscopy spectrum image compared to the Raman average signal and the Raman average image, it is possible to determine whether or not there is an abnormal chemical change in the stem cells during the differentiation process.
  • osteoblasts and adipocytes In particular, in micro-Raman analysis to confirm stem cell differentiation, differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts and adipocytes is induced, and then the Raman spectrum of each cell type is analyzed as a single cell. Levels can be used to determine specific peaks for further analysis. In this case, since the color of phenol red can interfere with the Raman signal, a phenol red-free cell media can be used. Accordingly, both osteoblasts and adipocytes contain live cells in a culture medium, and each component can be irradiated using an immersion lens.
  • the Raman spectroscopy test result values compared to the Raman standard average values are extracted larger than the preset error range.
  • the stem cells of the target can be extracted.
  • the spectroscopic test result values may be detection values or measurement values of lipids, nucleic acids, and protein components that appear when Raman spectroscopy is measured.
  • the stem cells of the target whose Raman spectroscopy test result values are larger than a preset error range compared to the Raman reference average values are selectively removed by a laser device or the like.
  • stem cells that are significantly out of the error range compared to the Raman average reference value can be discarded by continuously comparing the Raman average, that is, the Raman reference average values against the Raman spectroscopy test result values.
  • the point of discarding the stem cells by comparing the morphological change according to the process of continuous differentiation and the test amount of the extracted component. That is, by detecting and comparing Raman reference average values with Raman spectroscopy test result values in real time or in a preset period of time, stem cells that greatly deviate from the error range compared to the Raman average reference value can be detected. Accordingly, discard time information for stem cells that fall out of the error range may be quantified.
  • the amount of change in the components of target substances eg, nucleic acids, lipids, proteins, etc.
  • target substances eg, nucleic acids, lipids, proteins, etc.
  • a change in the size (or volume) of differentiation for at least one component is detected through Raman spectral incremental analysis.
  • list information on the lineage and classification elements of stem cells may be set by extracting comparison target elements having similar comparison result values within a preset error range into a lineage and classification element list.
  • list information on the lineage and classification elements of stem cells may be set by extracting comparison target elements having similar comparison result values within a preset error range into a lineage and classification element list.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a process of classifying and quantifying the differentiation direction and division state of stem cells using a machine learning algorithm according to an embodiment.
  • the step of quantifying the differentiation and growth types of stem cells including the Raman reference mean value, list information on the lineage and classification elements of stem cells, size information of each stem cell, and each The amount of differentiation size change for at least one component included in the stem cell and the amount of change in the component of the target substances included in each stem cell are preset and machine learning factors (or input values) to the selected machine learning program (or machine learning program) to classify the differentiation direction and division state information of stem cells.
  • At least one machine learning program among preset machine learning programs may be selected to additionally input specimen-related information, a result of detecting a Raman signal, and a result of detecting a Raman spectrum as a learning factor.
  • Machine learning programs include PCA (Principal Component Analysis)-LDA (Linear Discriminant Analysis) model, NMF (Non-Negative Matrix Factorization)-LDA (Linear Discriminant Analysis) model, RFML (Random Forest Machine Learning) model, machine learning (eg For example, Convolutional Neural Networks (CNN) and the like may be concurrently applied.
  • PCA Principal Component Analysis
  • LDA Linear Discriminant Analysis
  • NMF Non-Negative Matrix Factorization
  • RFML Random Forest Machine Learning
  • machine learning eg For example, Convolutional Neural Networks (CNN) and the like may be concurrently applied.
  • CNN Convolutional Neural Networks
  • machine learning is performed through a preset machine learning program to reset and can be quantified.
  • the differentiation type of stem cells can be predicted by classifying and learning the average data, the average value of the Raman standard, and information on the differentiation direction and division state of the stem cells using a machine learning program.
  • the differentiation type of stem cells can be predicted by analyzing the Raman averaged information on the differentiation direction and division state of stem cells based on machine learning.
  • FIG. 5 is a configuration block diagram showing in detail an apparatus for sorting stem cells using Raman spectroscopy according to an embodiment of the present invention.
  • the apparatus for classifying stem cells using Raman spectroscopy shown in FIG. 5 includes an inspection module 100, a stem cell analysis module 200, and a data learning module 300.
  • the test module 100 detects Raman spectroscopy signals of the stem cells through a Raman spectroscopy test by arranging a stem cell sample in a culture dish.
  • the inspection module 100 includes a sample inspection and pre-processing unit 101, a Raman signal detection unit 103, and an image detection unit 105.
  • the sample inspection and preprocessing unit 101 arranges a sample made of stem cells in at least one culture dish to prepare for a Raman spectroscopic examination, and puts the at least one culture dish in which the stem cells are distributed and arranged into a cell incubator for pretreatment.
  • Stem cells cultured in a culture dish can be liver-derived stem cells such as hLD-SC, hUCM-MSC, and hiPSC, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, induced pluripotent stem cells, and mesenchymal stem cells. .
  • the Raman signal detector 103 obtains a Raman signal by performing a Raman scattering test on the stem cell samples. Then, the obtained Raman signal is stored in the database. In the Raman scattering test, a target material (eg, nucleic acid, lipid, protein, etc.) of stem cells in the differentiation process can be quantified by measuring a change in intensity of a characteristic peak of a Raman marker.
  • a target material eg, nucleic acid, lipid, protein, etc.
  • the image detector 105 samples a preset wavelength range between 500 cm ⁇ 1 and 3000 cm ⁇ 1 using a Raman spectroscopy device (eg, 532 nm laser, 785 nm laser Raman Device), and generates a spectral image of the sampled wavelength range. can be extracted.
  • a Raman spectroscopy device eg, 532 nm laser, 785 nm laser Raman Device
  • a spectral image When extracting a spectral image, light is irradiated on stem cells cultured on a culture dish to generate scattered light, and the scattered light is collected by a spectrometer through an immersion lens, and then collected by the spectrometer. Scattered light can be dispersed.
  • the dispersed light dispersed by the dispersion system may be detected by a Raman spectroscopy device in addition to a CCD camera (charge-coupled device camera), and the dispersed light may be converted into a spectrum.
  • CCD camera charge-coupled device camera
  • the stem cell analysis module 200 analyzes the Raman spectroscopy spectrum image, compares the Raman spectroscopy test result with the Raman standard average value to evaluate the direction and state of stem cell differentiation, and classifies the differentiation and growth types of stem cells according to the comparison result. do.
  • the stem cell analysis module 200 includes a component confirmation unit 202, a component comparison analysis unit 204, a stem cell discard unit 206, and a growth type confirmation unit 208.
  • the component checking unit 202 checks and stores the number of stem cells detected through confocal microscopy, size information of each stem cell, and spectroscopy result values through Raman spectroscopy.
  • the component identification unit 202 may detect changes in the components of preset target substances and differentiation size changes for at least one component included in each stem cell through Raman spectral incremental analysis of the stem cell samples.
  • list information on the lineage and classification elements of stem cells may be set by extracting comparison target elements having similar comparison result values within a preset error range into a lineage and classification element list.
  • the component comparison and analysis unit 204 compares the Raman spectroscopy test result with a Raman reference average value in order to evaluate the direction and state of stem cell differentiation. Accordingly, the component comparison and analysis unit 204 may extract the stem cells of the target in which the Raman spectroscopy test result values compared to the Raman reference average values are larger than a preset error range.
  • the stem cell discard unit 206 selectively removes the stem cells of the target whose Raman spectroscopy test result values are larger than a preset error range compared to the Raman reference average values with a laser device.
  • the stem cell discard unit 206 continuously compares the Raman average, that is, the Raman spectroscopy test result values against the Raman standard average values, and discards stem cells that deviate greatly from the error range compared to the Raman average standard value.
  • the stem cell discard unit 206 detects and compares Raman reference average values versus Raman spectroscopy test result values in real time or in units of a preset period of time to detect stem cells that are significantly out of the error range compared to the Raman average reference value. Accordingly, discard time information for stem cells that fall out of the error range can be quantified.
  • the growth type confirmation unit 208 checks the amount of change in the components of target substances and the amount of change in the differentiation size of stem cell components through Raman spectral incremental analysis of stem cell specimens, and lists information on lineage and classification elements for stem cells. set The growth type confirmation unit 208 compares the amount of change in the components of the target materials and the amount of change in the differentiation size of the stem cell components calculated through Raman spectroscopy compared to the amount of change in the components of the target materials and the amount of change in the differentiation size of the stem cell components. Elements to be compared with similar comparison result values within a set error range are extracted into a lineage and classification element list, and list information on lineage and classification elements for stem cells is set.
  • the data learning module 300 classifies and quantifies the differentiation direction and division state of stem cells using a machine learning algorithm.
  • the data learning module 300 includes a learning factor input unit 301, a machine learning processor 303, a machine learning program input unit 305, and a Raman reference data generator 307.
  • the learning factor input unit 301 includes list information on lineage and classification factors for stem cells, size information of each stem cell, amount of differentiation size change for at least one component included in each stem cell, and information included in each stem cell.
  • the amount of change in the components of the target substances is input as a machine learning factor (or input value) to a preset machine learning program (or machine learning program) to classify the differentiation direction and division state information of the stem cells.
  • At least one machine learning program among preset machine learning programs may be selected to additionally input specimen-related information, a result of detecting a Raman signal, and a result of detecting a Raman spectrum as a learning factor.
  • information on detected cells eg, culture time, type of culture medium used, type of stem cell growth factor and amount of growth factor input, etc.
  • the machine learning processing unit 303 performs machine learning through a preset machine learning program to reset and quantify information about the Raman average data, the Raman reference average value, and the differentiation direction and division state of stem cells.
  • the program input unit 305 performs machine learning by matching the learning factor and the detected human information.
  • Machine learning programs include PCA (Principal Component Analysis)-LDA (Linear Discriminant Analysis) model, NMF (Non-Negative Matrix Factorization)-LDA (Linear Discriminant Analysis) model, RFML (Random Forest Machine Learning) model, machine learning (eg For example, Convolutional Neural Networks (CNN) and the like may be selectively applied.
  • the Raman reference data generation unit 307 predicts the differentiation type of stem cells by analyzing Raman averaged information on the differentiation direction and division state of stem cells based on machine learning. Specifically, the Raman reference data generation unit 307 classifies and learns average data, Raman reference average values, and information on the differentiation direction and division state of stem cells with a machine learning program to predict the differentiation type of stem cells. In addition, the differentiation type of stem cells can be predicted by analyzing the Raman averaged information on the differentiation direction and division state of stem cells based on machine learning.
  • stem cells can be inspected and measured in an unlabeled state, thereby avoiding toxicity or adverse reactions caused by staining, and observing the state of cells as they are and changing in real time.
  • stem cells that have been grown and differentiated for a long time can be used for experiments without exhausting them through quality checks.
  • unlike the existing destructive confirmation method it may be possible to experiment on the stem cells whose condition has been confirmed.
  • the stem cell analysis module 200 and the data learning module 300 include a memory (not shown) for storing data for an algorithm or a program reproducing the algorithm for controlling the operation of components within the processor of each module, and a memory (or, a processor (not shown) that performs the above-described operation using data stored in a database).
  • a memory for storing data for an algorithm or a program reproducing the algorithm for controlling the operation of components within the processor of each module
  • a memory or, a processor (not shown) that performs the above-described operation using data stored in a database.
  • the memory and the processor may be implemented as separate chips.
  • the memory and the processor may be implemented as a single chip.
  • Each component refers to software and/or hardware components such as Field Programmable Gate Array (FPGA) and Application Specific Integrated Circuit (ASIC).
  • FPGA Field Programmable Gate Array
  • ASIC Application Specific Integrated Circuit
  • the disclosed embodiments may be implemented in the form of a recording medium storing instructions executable by the stem cell analysis module 200 and the data learning module 300 . Instructions may be stored in the form of program codes, and when executed by a processor, create program modules to perform operations of the disclosed embodiments.
  • the recording medium may be implemented as a stem cell analysis module 200, a data learning module 300, and a computer-readable recording medium.
  • the stem cell analysis module 200 and the data learning module 300 or computer-readable recording media include all types of recording media in which instructions readable by a computer are stored. For example, there may be read only memory (ROM), random access memory (RAM), magnetic tape, magnetic disk, flash memory, optical data storage device, and the like.
  • ROM read only memory
  • RAM random access memory
  • magnetic tape magnetic tape
  • magnetic disk magnetic disk
  • flash memory optical data storage device
  • stem cell classification method using Raman spectroscopic analysis according to the above-described embodiment of the present invention, toxic effects and abnormal reactions due to staining can be avoided by quantifying the differentiation direction and division state of stem cells in an unlabeled state, , the original state of stem cells and the state that changes in real time can be observed in real time.
  • stem cells grown and differentiated for a certain period of time can be used for experiments without exhaustion through quality check by checking the differentiation characteristics of stem cells with a non-destructive and non-invasive analysis method, and normal stem cells are applied at an appropriate time can support you to do it.

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Abstract

라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법 및 장치가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포의 분류 방법은 라만 분광 검사 모듈 및 분류 장치를 이용해서 줄기세포들을 분류하는 방법에 있어서, 줄기세포들을 포함한 검체를 준비하고 전처리하는 단계, 라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계, 줄기세포들의 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 단계, 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 단계, 및 라만 기준 평균 값을 포함하여 상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 정량화하는 단계를 포함한다.

Description

라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법 및 장치
본 발명은 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법 및 장치에 관한 것이다.
줄기세포는 신체의 거의 모든 유형의 세포로 분열 및 분화할 수 있는 특성을 가져 현재 치료가 적절치 않거나 치료 방법이 없는 경우 새로운 대안으로 떠오르고 있다. 다만, 줄기세포 하나하나의 분열 및 분화 과정을 분석하기 어렵고, 모든 줄기세포들의 계통 확인도 어려워 임상에서 사용될 경우 안정성에 문제가 생길 가능성이 있다.
현재 줄기세포의 분화 특성을 확인하기 위해 사용하고 있는 방법들로는 화학적 염색 분석법(chemical staining assay), 정량적 중합 효소 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR), 웨스턴 블랏 분석법(western blot analysis), 면역 형광 염색법(immunofluorescene staining) 등이 이용되고 있다.
하지만, 종래 기술에 따른 줄기세포의 분화 특성 확인 방법들은 세포 파괴적 및 침습적(destructive and invasive)인 방법으로, 세포 고정 요건에 의한 화학적 염색 및 용해 등을 통해 일부 만을 분석하는 것이다.
실제로, 인간 지방질-유래 중간엽 줄기세포(hADMSC, The human adipose-derived mesenchymal stem cells)의 분화는 일반적으로 3주에서 2개월 정도의 긴 시간이 걸리며, 많은 비용이 소비된다. 그러나 분화된 세포는 계통 확인을 위해서 일반적으로 분석 후, 상기 분화된 세포의 재사용이 불가능한 세포 고정 및 용해와 같은 파괴/침습적 공정이 사용된다. 더욱이 기존의 이러한 방법들 중에서 일부는 분해능에 한계가 있으므로 단일 세포 수준의 분석을 수행할 수 없었다.
따라서, 비파괴적이고 줄기세포에 영향을 주지 않는 범위내에서 줄기세포의 분화를 특정 유형으로 정확하게 확인하고 분류할 수 있는 분석 방법들의 개발이 필요하며, 궁극적으로 줄기세포를 재생 치료에 효율적으로 사용하기 위한 진보성 있는 기술들이 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 비파괴적, 비침습적, 비표지 상태로 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태 등을 확인하고 정량화하여, 적절한 치료 시기에 정상적인 줄기세포들을 적용시킬 수 있도록 지원 가능한 줄기세포의 분류 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 면에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법은 라만 분광 검사 모듈 및 분류 장치를 이용해서 줄기세포들을 분류하는 방법에 있어서, 상기 줄기세포들을 포함한 검체를 준비하고 전처리하는 단계, 라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계, 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 단계, 상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 단계, 및 상기 라만 기준 평균 값을 포함하여 상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 정량화하는 단계를 포함한다.
상기 라만 분광 검사에 따른 라만 분광 검사 결과와 미리 설정된 상기 라만 기준 평균 값의 비교 결과에 따라, 상기 검체에 포함된 줄기세포들을 선택적으로 제거하는 줄기세포 제거 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계는 분화 과정의 줄기세포들에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 라만 시그널, 및 상기 라만 시그널에 따른 라만 분광 스펙트럼 이미지를 산출하는 단계, 상기 라만 시그널, 및 라만 분광 스펙트럼 이미지를 해당 줄기세포가 포함되어 있는 배양접시의 줄기세포 라만 평균 시그널, 및 라만 평균 분광 스펙트럼 이미지와 비교하는 단계, 및 비교된 상기 라만 시그널, 및 상기 라만 분광 스펙트럼 이미지 차이에 따라 상기 분화 과정의 줄기세포들에 대한 화학적 변화 이상 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위해 하드웨어인 컴퓨터와 결합되어 컴퓨터 판독 가능한 기록매체에는, 본 발명에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법을 수행하기 위한 프로그램이 저장될 수 있다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 면에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 장치는 줄기세포 검체를 라만 분광이 가능한 배양 접시에 배양하여 라만 분광 검사를 통해 줄기세포들에 대한 라만 분광 시그널들과 라만 분광 스펙트럼 이미지들을 검출하는 검사 모듈, 상기 라만 분광 스펙트럼 이미지들을 분석하고 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하며, 비교 결과에 따라 상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 줄기세포 분석 모듈, 및 머신 러닝 알고리즘을 이용하여 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 분열 상태를 분류하고 정량화하는 데이터 학습 모듈을 포함할 수 있다.
본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 실시예에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법으로는 비표지 상태로 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태 등을 정량화하여, 염색에 의한 독성 영향과 이상 반응을 피할 수 있으며, 줄기세포의 원래 상태와 실시간으로 변하는 상태들을 실시간으로 관측할 수 있다.
또한, 비파괴적, 비침습적인 분석 방법으로 줄기세포의 분화 특성을 확인하여 소정 기간 동안 성장 및 분화시킨 줄기세포를 퀄리티 체크로 소진하지 않고 실험에 사용할 수 있으며, 적절한 치료 시기에 정상적인 줄기세포들을 적용시킬 수 있도록 지원할 수 있다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급된 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법을 순서대로 설명하기 위한 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 검체로 적용되는 줄기세포들의 다양한 분화 방향을 구체적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 라만 분광 스펙트럼 이미지의 비교 분석 방법을 설명하기 위한 이미지 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 머신 러닝 알고리즘을 이용하여 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태를 분류하고 정량화하는 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 장치를 구체적으로 나타낸 구성 블록도이다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다. 본 명세서가 실시예들의 모든 요소들을 설명하는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적인 내용 또는 실시예들 간에 중복되는 내용은 생략한다. 명세서에서 사용되는 '부, 모듈, 부재, 블록'이라는 용어는 소프트웨어 또는 하드웨어로 구현될 수 있으며, 실시예들에 따라 복수의 '부, 모듈, 부재, 블록'이 하나의 구성요소로 구현되거나, 하나의 '부, 모듈, 부재, 블록'이 복수의 구성요소들을 포함하는 것도 가능하다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
제1, 제2 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 전술된 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 예외가 있지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다.
이하 첨부된 도면들을 참고하여 본 발명의 작용 원리 및 실시예들에 대해 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법을 순서대로 설명하기 위한 순서도이다.
도 1에 도시된 일 실시예에 따른 줄기세포의 분류 방법으로는 줄기세포들의 분화 방향 및 분열 특성 등을 실시간으로 확인하고, 특정 줄기세포들은 선택적으로 제거할 수 있으며, 줄기세포들의 분화 유형과 분열 상태를 정량화할 수 있다. 이를 위해, 일 실시예에 따른 줄기세포의 분류 방법은 줄기세포를 포함한 검체를 준비하고 전처리하는 단계(ST1), 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계(ST2), 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 단계(ST3), 줄기세포들을 선택적으로 제거하는 단계(ST4), 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하고, 정량화하는 단계(ST5,ST6)를 포함한다.
구체적으로, 검체 준비 및 전처리 단계(ST1)에서는 라만 분광이 가능한 배양접시에 줄기세포들을 배양하고, 배양 접시 검체를 적어도 하나의 검사 위치에 배치하여 라만 분광 검사를 준비한다. 그리고, 줄기세포들이 분포된 배양접시를 셀 인큐베이터에 넣어 검사 접시를 전처리한다.
검체로서 배양 접시에 배치 및 분포되는 줄기세포는 hLD-SC, hUCM-MSC, hiPSC 등의 간 유래 줄기세포, 탯줄 유래 간엽 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 및 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells) 등이 적용될 수 있다. 이하에서는 중간엽 줄기세포를 배양 접시에 배치 및 분포되는 대상 검체로 적용한 예를 설명하기로 하며, 실시예에 따른 줄기세포 검체는 중간엽 줄기세포만으로 한정되지 않는다.
일 예로, 줄기세포 분화 및 염색 분석(Differentiation and Staining Analysis)을 위해서는 제5 계통의 인간 지방질-유래 중간엽 줄기세포를 수 적어도 2일간 배양해서 골아 세포 및 지방 세포로 분화시켜 이용할 수 있다.
한편, 지방 세포 분화를 위해서는 인간 지방질-유래 중간엽 줄기세포는 StemPro 지방 세포형성 분화 키트 미디어(the StemPro Adipogenesis differentiation kit media)(Gibco)를 사용하여 분화시킬 수 있다. 다른 일 예로, 골 형성 분화를 위해서는 인간 지방질-유래 중간엽 줄기세포를 아스코르브 산(ascorbic acid, SigmaAldrich), 글리세로 포스페이트(glycerophosphate, Sigma-Aldrich), 및 덱사메타손(dexamethasone, Sigma-Aldrich)이 보충된 중간엽 줄기세포 성장 배지로 처리할 수도 있다.
도 2는 일 실시예에 따른 검체로 적용되는 줄기세포들의 다양한 분화 방향을 구체적으로 나타낸 도면이다.
도 2로 도시된 바와 같이, 줄기세포는 신체의 거의 모든 유형의 세포로 분열 및 분화할 수 있는 특성을 가지며, 핵(nucleus), 세포 소기관(cytoplasm) 또는 소포체, 엽록체, 세포질, 리소좀, 세포 클러스터링(예를 들어, vesicle, plasma membrane) 등을 포함하는 구조를 이룬다. 이에, 줄기세포들은 각 구조적인 배엽 성장 및 분화를 통해 신체 유형에 따라 다양한 형질의 세포로 분화 및 분류될 수 있다. 특히, 중간엽 줄기세포는 세포 분화 과정을 거쳐 근육 세포, 혈액 세포, 신경 세포, 심근 세포, 간세포, 지방세포, 뼈 세포 등으로 분화할 수 있다. 이러한 중간엽 줄기세포는 미분화 상태로 존재하다가 분화 신호에 따라 다양한 형태의 세포로 분화되어 분화된 세포로서 고유한 기능과 형태를 구성한다.
줄기세포들을 분화시키는 과정에서 줄기세포의 분화 과정 및 분화 상태를 확인하기 위해, 줄기세포들의 스펙트럼 이미지를 검출하고 비교 대상 이미지와 비교 분석한다. 이를 위해, 라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계(ST2)에서는 분화 과정의 줄기세포들에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 라만 시그널을 획득할 수 있다.
일 실시예에 따른 라만 산란 방식은 생물학적 및 화학적 검체들에 대한 분자 특이적 정보를 제공하는 분석법이다. 라만 산란 방식의 검사로는 라만 표지자의 특징적인 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 분화 과정의 줄기세포들에 대한 표적 물질(예를 들어, 핵산, 지질, 단백질 등)을 정량화한다.
라만 분광 검사시에는 배양접시 내에 줄기세포들이 분포된 부분을 라만 산란 방식으로 측정하여 라만 시그널을 획득할 수 있다. 라만 시그널 획득시에는 라만 분광 장비(예를 들어, 532nm laser, 785nm laser Raman Device)를 이용하여 500cm-1 ~ 3000cm-1 사이의 미리 설정된 파장 범위를 샘플링하고, 샘플링된 파장 범위의 스펙트럼 이미지를 추출할 수 있다.
한편, 스펙트럼 이미지 추출시에는 배양 접시 상에 배양된 줄기세포에 광을 조사하여 산란광(scattered light)을 발생시키고, 산란광을 침지렌즈(immersion lens)를 통해 분광계(spectrometer)로 수집한 후, 분광계로 수집한 산란광을 분산시킬 수 있다. 그리고, 분산계로 분산시킨 분산광을 CCD 카메라(chargecoupled device camera) 외에도 라만 분광 장비로 감지하여 분산광을 스펙트럼으로 변환시킬 수 있다.
특히, 라만 시그널의 스펙트럼 분포를 컴퓨터의 미리 설정된 프로그램을 통해 분석하면, 유기 및 무기 분자의 고유 라만 스펙트럼 분포 및 포함 범위에 따라 단백질의 종류, 지질, RNA, DNA 등을 더 검출할 수도 있다.
이와 더불어, 라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계(ST2)에서는 공초점 현미경을 통한 공초점 현미경 이미지를 획득하여 줄기세포들의 개수, 각 줄기세포의 크기 정보 등을 추출할 수 있다.
도 3은 일 실시예에 따른 라만 분광 스펙트럼 이미지의 비교 분석 방법을 설명하기 위한 이미지 도면이다.
도 3을 참조하면, 라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계(ST2)에서는 공초점 현미경 이미지 획득 과정을 통해 검출된 줄기세포들의 개수, 각 줄기세포의 크기 정보 등을 라만 평균 데이터의 기준 정보들과 비교할 수 있다. 그리고, 라만 평균 데이터의 기준 정보 대비 줄기세포들의 개수, 각 줄기세포별 굴절률, 각 줄기세포의 크기 차이를 산출하여 분화 과정의 줄기세포들에 대한 물리적 변화 및 이상 여부를 확인할 수 있다. 여기서, 라만 평균 데이터는 기존에 정상적으로 분화된 줄기세포의 데이터 축적을 통해 형성 및 데이터베이스화된 데이터일 수 있다.
또한, 도 3으로 도시된 바와 같이, 라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계(ST2)에서는 라만 분광 검사를 통해 추출된 라만 시그널, 및 라만 분광 스펙트럼 이미지를 해당 줄기세포가 포함되어 있는 배양접시의 라만 평균 시그널 및 라만 평균 이미지와 비교한다. 그리고, 라만 평균 시그널 및 라만 평균 이미지 대비 라만 분광 검사를 통해 추출된 라만 시그널, 및 라만 분광 스펙트럼 이미지 차이를 분석하여 분화 과정의 줄기세포들에 대한 화학적 변화 이상 여부를 확인할 수 있다.
특히, 줄기세포 분화 확인을 위한 마이크로 라만 분석(Micro-Raman analysis)시에는 인간 지방질-유래 중간엽 줄기세포에 대해 골아 세포 및 지방 세포로 분화를 유도한 다음, 각 세포 유형의 라만 스펙트럼을 단일 세포 수준에서 얻음으로써 다음 분석을 위한 특정 피크를 결정할 수 있다. 이 경우, 페놀 레드의 색이 라만 신호를 방해할 수 있기 때문에 페놀 레드 프리 세포 배지(Phenol red-free cell media)를 사용할 수 있다. 이에 따라 조골세포 및 지방 세포 모두 살아있는 세포를 배지에 담고 침지 렌즈(immersion lens)를 사용하여 각 성분들의 조사가 가능해진다.
줄기세포 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 단계(ST3)에서는 정상적으로 분화된 줄기세포의 데이터 축적을 통해 형성된 라만 평균 데이터로에서 미리 설정된 기준 평균 값들을 산출한다.
또한, 라만 평균 데이터의 라만 기준 평균 값들과 공초점 현미경 측정 및 라만 분광 검사를 통해 측정된 라만 분광 검사 결과 값들을 비교하여, 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들이 미리 설정된 오차 범위보다 크게 추출된 대상의 줄기세포들을 추출할 수 있다. 여기서, 분광 검사 결과 값으로는 라만 분광 측정 시 나타나는 지질, 핵산, 및 단백질 성분들의 검출 값 또는 측정 값일 수 있다.
줄기세포들을 선택적으로 제거하는 단계(ST4)에서는 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들이 미리 설정된 오차 범위보다 크게 추출된 대상의 줄기세포들이 레이저 장비 등에 의해 선택적으로 제거되도록 한다.
줄기세포들을 선택적으로 제거하는 단계(ST4)에서는 지속적으로 라만 평균 즉, 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들을 비교하여 라만 평균 기준 값 대비 오차 범위에서 크게 벗어나는 줄기세포를 폐기할 수 있다.
이와 더불어, 연속적으로 계속 분화되는 과정에 따른 형태 변화와 추출 성분 검사량을 비교하여 줄기세포의 폐기 시점을 찾아낼 수도 있다. 즉, 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들 실시간으로 또는 미리 설정된 기간 단위로 검출하고 비교하여, 라만 평균 기준 값 대비 오차 범위에서 크게 벗어나는 줄기세포들을 검출할 수 있다. 이에, 오차 범위에서 벗어나는 줄기세포들에 대한 폐기 시점 정보를 정량화할 수도 있다.
줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 단계(ST5)에서는 폐기되지 않은 줄기세포들에 대해 미리 설정된 표적 물질들(예를 들어, 핵산, 지질, 단백질 등)의 성분 변화량, 및 각 줄기세포에 포함된 적어도 한 구성 요소(예를 들어, 요소핵, 세포 소기관, 소포체, 세포질, 리소좀, 세포 클러스터링)에 대한 분화 크기(또는, 부피) 변화량을 라만 스펙트럼 증가량 분성을 통해 검출한다.
이때, 미리 설정된 오차 범위 내로 유사한 비교 결과 값이 나온 비교 대상 요소들을 계통 및 분류 요소 목록으로 추출하여, 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보를 설정할 수 있다. 또한, 산출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량 대비 라만 분광 검사를 통해 산출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량을 비교할 수 있다. 이때, 미리 설정된 오차 범위 내로 유사한 비교 결과 값이 나온 비교 대상 요소들을 계통 및 분류 요소 목록으로 추출하여, 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보를 설정할 수 있다.
도 4는 일 실시예에 따른 머신 러닝 알고리즘을 이용하여 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태를 분류하고 정량화하는 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 4를 참조하면, 라만 기준 평균 값을 포함하여 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 정량화하는 단계(ST6)에서는 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보, 각 줄기세포의 크기 정보, 각 줄기세포에 포함된 적어도 한 구성 요소에 대한 분화 크기 변화량, 각 줄기세포에 포함된 표적 물질들의 성분 변화량을 미리 설정 및 선택된 머신 러닝 프로그램(또는 기계 학습 프로그램)에 기계 학습 인자(또는, 입력 값)으로 입력하여 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태 정보를 분류한다.
학습 인자들의 입력시, 미리 설정된 머신 러닝 프로그램들 중 적어도 하나의 머신 러닝 프로그램을 선택해서 검체 관련 정보를 비롯한 라만 시그널 검출 결과 및 라만 스펙트럼 검출 결과를 학습 인자로 추가 입력할 수 있다.
머신러닝 프로그램으로는 PCA(Principal component analysis)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, NMF(Non-Negative Matrix Factorization)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, RFML(Random Forest Machine Learning) 모델, 머신 러닝(예를 들어, CNN(Convolutional Neural Networks)) 등이 동반적으로 적용될 수 있다. 학습 인자 입력시에는 결과적인 분류 정보들을 명확히 구분하기 위해 검출 세포 정보(예를 들어, 배양시간, 사용 배양액 종류, 투입된 줄기세포 성장인자 종류 및 성장인자 투입량 등)을 각각 추가로 입력할 수 있다.
줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 정량화하는 단계(ST6)에서는 미리 설정된 머신 러닝 프로그램을 통한 기계 학습을 수행하여 라만 평균 데이터, 라만 기준 평균 값, 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 재설정 및 정량화할 수 있다.
이에 따라, 평균 데이터, 라만 기준 평균 값, 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 머신 러닝 프로그램으로 분류 및 학습시켜 줄기세포의 분화 유형을 예측할 수 있다. 또한 라만 평균된 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 머신 러닝 기반으로 분석하여 줄기세포의 분화 유형을 예측할 수 있다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 장치를 구체적으로 나타낸 구성 블록도이다.
도 5에 도시된 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 장치는 검사 모듈(100), 줄기세포 분석 모듈(200), 및 데이터 학습 모듈(300)을 포함한다.
검사 모듈(100)은 줄기세포 검체를 배양 접시에 배치하여 라만 분광 검사를 통해 줄기세포들에 대한 라만 분광 시그널들을 검출한다. 이를 위해, 검사 모듈(100)은 검체 검사 및 전처리부(101), 라만 시그널 검출부(103), 및 이미지 검출부(105)를 포함한다.
검체 검사 및 전처리부(101)는 줄기세포들로 이루어진 검체를 적어도 하나의 배양 접시에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하고, 줄기세포들이 분포 및 배치된 적어도 하나의 배양 접시를 셀 인큐베이터에 넣어 전처리한다. 배양 접시에서 배양된 줄기세포는 hLD-SC, hUCM-MSC, hiPSC 등의 간 유래 줄기세포, 탯줄 유래 간엽 줄기세포, 유도만능 줄기세포, 및 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells) 등이 적용될 수 있다.
라만 시그널 검출부(103)는 줄기세포 검체들에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 라만 시그널을 획득한다. 그리고 획득한 라만 시그널을 데이터 베이스에 저장한다. 라만 산란 방식의 검사로는 라만 표지자의 특징적인 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 분화 과정의 줄기세포들에 대한 표적 물질(예를 들어, 핵산, 지질, 단백질 등)을 정량화할 수 있다.
이미지 검출부(105)는 라만 분광 장비(예를 들어, 532nm laser, 785nm laser Raman Device)를 이용하여 500cm-1 ~ 3000cm-1 사이의 미리 설정된 파장 범위를 샘플링하고, 샘플링된 파장 범위의 스펙트럼 이미지를 추출할 수 있다.
스펙트럼 이미지 추출시에는 배양 접시 상에 배양된 줄기세포에 광을 조사하여 산란광(scattered light)을 발생시키고, 산란광을 침지렌즈(immersion lens)를 통해 분광계(spectrometer)로 수집한 후, 분광계로 수집한 산란광을 분산시킬 수 있다. 그리고, 분산계로 분산시킨 분산광을 CCD 카메라(chargecoupled device camera) 외에도 라만 분광 장비로 감지하여 분산광을 스펙트럼으로 변환시킬 수 있다.
줄기세포 분석 모듈(200)은 라만 분광 스펙트럼 이미지를 분석하고 줄기세포 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하며, 비교 결과에 따라 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류한다.
이를 위해, 줄기세포 분석 모듈(200)은 구성 성분 확인부(202), 성분 비교 분석부(204), 줄기세포 폐기부(206), 및 성장 유형 확인부(208)를 포함한다.
구성 성분 확인부(202)는 공초점 현미경 측정을 통해 검출된 줄기세포들의 개수, 각 줄기세포의 크기 정보, 및 라만 분광 검사를 통한 분광 검사 결과 값들을 확인 및 저장한다. 구성 성분 확인부(202)는 줄기세포 검체들에 대한 라만 스펙트럼 증가량 분석을 통해 미리 설정된 표적 물질들의 성분 변화량, 및 각 줄기세포에 포함된 적어도 한 구성 요소에 대한 분화 크기 변화량을 검출할 수 있다. 또한, 검출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량 대비 라만 분광 검사를 통해 산출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량을 비교할 수 있다. 이때, 미리 설정된 오차 범위 내로 유사한 비교 결과 값이 나온 비교 대상 요소들을 계통 및 분류 요소 목록으로 추출하여, 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보를 설정할 수 있다.
성분 비교 분석부(204)는 줄기세포 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교한다. 이에, 성분 비교 분석부(204)는 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들이 미리 설정된 오차 범위보다 크게 추출된 대상의 줄기세포들을 추출할 수 있다.
줄기세포 폐기부(206)는 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들이 미리 설정된 오차 범위보다 크게 추출된 대상의 줄기세포들을 레이저 장비로 선택적으로 제거한다. 줄기세포 폐기부(206)는 지속적으로 라만 평균 즉, 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들을 비교하여 라만 평균 기준 값 대비 오차 범위에서 크게 벗어나는 줄기세포를 폐기할 수 있다.
줄기세포 폐기부(206)는 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들 실시간으로 또는 미리 설정된 기간 단위로 검출하고 비교하여, 라만 평균 기준 값 대비 오차 범위에서 크게 벗어나는 줄기세포들을 검출할 수 있다. 이에, 오차 범위에서 벗어나는 줄기세포들에 대한 폐기 시점 정보를 정량화할 수 있다.
성장 유형 확인부(208)는 줄기세포 검체들에 대한 라만 스펙트럼 증가량 분석을 통해 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량을 확인하여 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보를 설정한다. 성장 유형 확인부(208)는 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량 대비 라만 분광 검사를 통해 산출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량을 비교한다 그리고, 미리 설정된 오차 범위 내로 유사한 비교 결과 값이 나온 비교 대상 요소들을 계통 및 분류 요소 목록으로 추출하여, 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보를 설정한다.
데이터 학습 모듈(300)은 머신 러닝 알고리즘을 이용하여 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태를 분류하고 정량화한다. 이를 위해, 데이터 학습 모듈(300)은 학습 인자 입력부(301), 기계학습 처리부(303), 기계학습 프로그램 입력부(305), 및 라만 기준 데이터 생성부(307)를 포함한다.
학습 인자 입력부(301)는 줄기세포에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보, 각 줄기세포의 크기 정보, 각 줄기세포에 포함된 적어도 한 구성 요소에 대한 분화 크기 변화량, 각 줄기세포에 포함된 표적 물질들의 성분 변화량을 미리 설정된 머신 러닝 프로그램(또는 기계 학습 프로그램)에 기계 학습 인자(또는, 입력 값)으로 입력하여 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태 정보를 분류한다.
학습 인자들의 입력시, 미리 설정된 머신 러닝 프로그램들 중 적어도 하나의 머신 러닝 프로그램을 선택해서 검체 관련 정보를 비롯한 라만 시그널 검출 결과 및 라만 스펙트럼 검출 결과를 학습 인자로 추가 입력할 수 있다. 학습 인자 입력시에는 결과적인 분류 정보들을 명확히 구분하기 위해 검출 세포 정보(예를 들어, 배양시간, 사용 배양액 종류, 투입된 줄기세포 성장인자 종류 및 성장인자 투입량 등)을 각각 추가 입력할 수 있다.
기계학습 처리부(303)는 미리 설정된 머신 러닝 프로그램을 통한 기계 학습을 수행하여 라만 평균 데이터, 라만 기준 평균 값, 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 재설정 및 정량화한다. 이때, 프로그램 입력부(305)는 학습 인자, 및 검출 인적 정보들을 매칭시켜서 기계 학습을 수행한다. 머신러닝 프로그램으로는 PCA(Principal component analysis)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, NMF(Non-Negative Matrix Factorization)-LDA(Linear Discriminant Analysis)모델, RFML(Random Forest Machine Learning) 모델, 머신 러닝(예를 들어, CNN(Convolutional Neural Networks)) 등이 선택적으로 적용될 수 있다.
라만 기준 데이터 생성부(307)는 라만 평균된 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 머신 러닝 기반으로 분석하여 줄기세포의 분화 유형을 예측한다. 구체적으로, 라만 기준 데이터 생성부(307)는 평균 데이터, 라만 기준 평균 값, 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 머신 러닝 프로그램으로 분류 및 학습시켜 줄기세포의 분화 유형을 예측할 수 있다. 또한 라만 평균된 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 머신 러닝 기반으로 분석하여 줄기세포의 분화 유형을 예측할 수 있다.
이와 같이, 본 발명으로는 비표지 상태로 줄기세포를 검사 및 측정할 수 있어 염색에 의한 독성이나 이상반응을 피할 수 있고, 세포 그대로의 상태와 실시간으로 변하는 상태 또한 관측이 가능한다. 또한, 비파괴적 분석 방법이기 때문에 오랜 시간동안 성장 및 분화시킨 줄기세포를 퀄리티 체크로 소진하지 않고 실험에 사용할 수 있게 된다. 그리고, 기존의 파괴적인 확인 방법과는 다르게 상태를 확인한 줄기세포에 대해 실험이 가능할 수 있다.
줄기세포 분석 모듈(200), 및 데이터 학습 모듈(300)은 각 모듈의 프로세서 내 구성요소들의 동작을 제어하기 위한 알고리즘 또는 알고리즘을 재현한 프로그램에 대한 데이터를 저장하는 메모리(미도시), 및 메모리(또는, 데이터 베이스)에 저장된 데이터를 이용하여 전술한 동작을 수행하는 프로세서(미도시)를 포함할 수 있다. 이때, 메모리와 프로세서는 각각 별개의 칩으로 구현될 수 있다. 또는, 메모리와 프로세서는 단일 칩으로 구현될 수도 있다.
각각의 구성요소는 소프트웨어 및/또는 Field Programmable Gate Array(FPGA) 및 주문형 반도체(ASIC, Application Specific Integrated Circuit)와 같은 하드웨어 구성요소를 의미한다.
한편, 개시된 실시예들은 줄기세포 분석 모듈(200), 및 데이터 학습 모듈(300)에 의해 실행 가능한 명령어를 저장하는 기록매체의 형태로 구현될 수 있다. 명령어는 프로그램 코드의 형태로 저장될 수 있으며, 프로세서에 의해 실행되었을 때, 프로그램 모듈을 생성하여 개시된 실시예들의 동작을 수행할 수 있다. 기록매체는 줄기세포 분석 모듈(200), 및 데이터 학습 모듈(300), 및 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체로 구현될 수 있다.
줄기세포 분석 모듈(200), 및 데이터 학습 모듈(300)이나 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체로는 컴퓨터에 의하여 해독될 수 있는 명령어가 저장된 모든 종류의 기록 매체를 포함한다. 예를 들어, ROM(Read Only Memory), RAM(Random Access Memory), 자기 테이프, 자기 디스크, 플래쉬 메모리, 광 데이터 저장장치 등이 있을 수 있다.
전술한 본 발명의 실시예에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법으로는 비표지 상태로 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태 등을 정량화하여, 염색에 의한 독성 영향과 이상 반응을 피할 수 있으며, 줄기세포의 원래 상태와 실시간으로 변하는 상태들을 실시간으로 관측할 수 있다. 또한, 비파괴적, 비침습적인 분석 방법으로 줄기세포의 분화 특성을 확인하여 소정 기간 동안 성장 및 분화시킨 줄기세포를 퀄리티 체크로 소진하지 않고 실험에 사용할 수 있으며, 적절한 치료 시기에 정상적인 줄기세포들을 적용시킬 수 있도록 지원할 수 있다.
이상에서와 같이 첨부된 도면을 참조하여 개시된 실시예들을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고도, 개시된 실시예들과 다른 형태로 본 발명이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 개시된 실시예들은 예시적인 것이며, 한정적으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (14)

  1. 라만 분광 검사 모듈 및 분류 장치를 이용해서 줄기세포들을 분류하는 방법에 있어서,
    상기 줄기세포들이 배양된 배양 접시를 준비하고 전처리하는 단계;
    라만 분광 검사를 통해 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계;
    상기 줄기세포들의 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 단계;
    상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 단계; 및
    상기 라만 기준 평균 값을 포함하여 상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 정량화하는 단계를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 라만 분광 검사에 따른 라만 분광 검사 결과와 미리 설정된 상기 라만 기준 평균 값의 비교 결과에 따라, 상기 검체에 포함된 줄기세포들을 선택적으로 제거하는 줄기세포 제거 단계를 더 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계는,
    분화 과정의 줄기세포들에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 라만 시그널, 및 상기 라만 시그널에 따른 라만 분광 스펙트럼 이미지를 산출하는 단계;
    상기 라만 시그널, 및 라만 분광 스펙트럼 이미지를 라만 평균 시그널 및 평균 이미지와 비교하는 단계; 및
    비교된 상기 라만 시그널, 및 상기 라만 분광 스펙트럼 이미지 차이에 따라 상기 분화 과정의 줄기세포들에 대한 화학적 변화 이상 여부를 확인하는 단계를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 라만 분광 스펙트럼 이미지를 비교 분석하는 단계는,
    공초점 현미경 측정을 통해 상기 분화 과정 줄기세포들의 개수 및 각 줄기세포의 크기 정보를 추출하는 단계; 및
    상기 공초점 현미경 측정을 통해 추출된 줄기세포들의 개수 및 상기 각 줄기세포의 크기 정보를 라만 평균 데이터의 기준 정보들과 비교하여 분화 과정의 줄기세포들에 대한 물리적 변화 및 이상 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 단계는,
    상기 라만 기준 평균 값들을 산출하는 단계;
    상기 라만 기준 평균 값들과 상기 공초점 현미경 측정 및 상기 라만 분광 검사를 통해 측정된 라만 분광 검사 결과 값들을 비교하는 단계; 및
    상기 라만 기준 평균 값들 대비 상기 라만 분광 검사 결과 값들이 미리 설정된 오차 범위보다 크게 검출된 대상의 줄기세포들을 추출하는 단계를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  6. 제4 항에 있어서,
    상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 단계는,
    상기 줄기세포들이 포함된 검체들에 대한 라만 스펙트럼 증가량 분석을 통해 미리 설정된 표적 물질들의 성분 변화량, 및 상기 줄기세포들에 포함된 적어도 한 구성 요소에 대한 분화 크기 변화량을 검출하는 단계;
    상기 라만 스펙트럼 증가량 분석을 통해 산출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량 대비 상기 공초점 현미경 측정 및 상기 라만 분광 검사를 통해 산출된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량을 비교하는 단계; 및
    미리 설정된 오차 범위 내로 유사한 비교 결과 값이 나온 비교 대상 요소들을 계통 및 분류 요소 목록으로 추출하여 상기 줄기세포들에 대한 계통 및 분류 요소들에 한 목록 정보를 설정하는 단계를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 라만 기준 평균 값을 포함하여 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 정량화하는 단계는,
    상기 줄기세포들에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보, 상기 각 줄기세포의 크기 정보, 상기 각 줄기세포에 포함된 적어도 한 구성 요소에 대한 분화 크기 변화량, 각 줄기세포에 포함된 표적 물질들의 성분 변화량을 미리 설정 및 선택된 머신 러닝 프로그램에 기계 학습 인자으로 입력하여 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 분열 상태 정보를 분류하는 단계; 및
    상기 머신 러닝 프로그램을 통한 기계 학습을 수행하여 상기 라만 평균 데이터, 상기 라만 기준 평균 값, 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 정량화하는 단계를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법.
  8. 하드웨어인 컴퓨터와 결합되어, 제1 항에 따른 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포의 분류 방법을 수행하기 위한 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능한 기록매체.
  9. 줄기세포 검체를 배양 접시에 배치하여 라만 분광 검사를 통해 줄기세포들에 대한 라만 분광 시그널들과 라만 분광 스펙트럼 이미지들을 검출하는 검사 모듈;
    상기 라만 분광 스펙트럼 이미지들을 분석하고 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하며, 비교 결과에 따라 상기 줄기세포들의 분화 및 성장 유형을 분류하는 줄기세포 분석 모듈; 및
    머신 러닝 알고리즘을 이용하여 상기 줄기세포들의 분화 방향 및 분열 상태를 분류하고 정량화하는 데이터 학습 모듈을 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포 분류 장치.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 검사 모듈은,
    상기 줄기세포들로 이루어진 검체를 적어도 하나의 배양 접시에 배치하여 라만 분광 검사를 준비하고 상기 줄기세포들이 분포된 배치된 적어도 하나의 배양 접시를 전처리하는 검체 검사 및 전처리부;
    상기 줄기세포들로 이루어진 검체들에 대해 라만 산란(Raman scattering) 방식의 검사를 수행해서 라만 시그널을 획득하는 라만 시그널 검출부; 및
    라만 분광 장비를 이용하여 미리 설정된 파장 범위를 샘플링하고, 샘플링된 파장 범위의 상기 라만 분광 스펙트럼 이미지를 추출하는 이미지 검출부를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포 분류 장치.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 줄기세포 분석 모듈은,
    공초점 현미경 측정을 통해 검출된 줄기세포들의 개수, 상기 각 줄기세포의 크기 정보, 및 상기 라만 분광 검사를 통한 분광 검사 결과 값들을 확인하는 구성 성분 확인부;
    상기 줄기세포들의 분화 방향 및 상태 평가를 위해 라만 분광 검사 결과를 라만 기준 평균 값과 비교하는 성분 비교 분석부; 및
    상기 줄기세포들에 대한 미리 설정된 표적 물질들의 성분 변화량 및 줄기세포 구성 요소들의 분화 크기 변화량을 확인하여 상기 줄기세포들에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보를 설정하는 성장 유형 확인부를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포 분류 장치.
  12. 제10 항에 있어서,
    상기 줄기세포 분석 모듈은,
    상기 라만 기준 평균 값들 대비 라만 분광 검사 결과 값들이 미리 설정된 오차 범위보다 크게 추출된 대상의 줄기세포들을 레이저 장비로 선택적으로 제거하는 줄기세포 폐기부를 더 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포 분류 장치.
  13. 제12 항에 있어서,
    상기 줄기세포 폐기부는,
    상기 라만 기준 평균 값들 대비 상기 라만 분광 검사 결과 값들 실시간으로 또는 미리 설정된 기간 단위로 검출하고 비교하여, 상기 라만 평균 기준 값 대비 미리 설정된 오차 범위를 벗어나는 줄기세포들을 검출하고 저장함으로써, 오차 범위에서 벗어나는 줄기세포들에 대한 폐기 시점 정보를 정량화하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포 분류 장치.
  14. 제10 항에 있어서,
    상기 데이터 학습 모듈은,
    상기 줄기세포들에 대한 계통 및 분류 요소들에 대한 목록 정보, 각 줄기세포의 크기 정보, 각 줄기세포에 포함된 적어도 한 구성 요소에 대한 분화 크기 변화량, 각 줄기세포에 포함된 표적 물질들의 성분 변화량을 미리 설정 및 선택된 머신 러닝 프로그램에 기계 학습 인자로 입력하는 학습 인자 입력부;
    상기 머신 러닝 프로그램을 통한 기계 학습을 수행하여 라만 평균 데이터, 라만 기준 평균 값, 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 재설정 및 정량화하는 기계학습 처리부; 및
    라만 평균된 줄기세포의 분화 방향 및 분열 상태에 대한 정보들을 머신 러닝 기반으로 분석하여 줄기세포의 분화 유형을 예측하는 라만 기준 데이터 생성부를 포함하는 라만 분광 분석을 이용한 줄기세포 분류 장치.
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