WO2023128556A1 - 신규한 메토트렉세이트 결합체와 이의 용도 - Google Patents

신규한 메토트렉세이트 결합체와 이의 용도 Download PDF

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WO2023128556A1
WO2023128556A1 PCT/KR2022/021386 KR2022021386W WO2023128556A1 WO 2023128556 A1 WO2023128556 A1 WO 2023128556A1 KR 2022021386 W KR2022021386 W KR 2022021386W WO 2023128556 A1 WO2023128556 A1 WO 2023128556A1
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WO
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sialyllactose
methotrexate
conjugate
brain
linker
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PCT/KR2022/021386
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박은정
이상미
박단비
김리라
김대희
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주식회사 진켐
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Publication date
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    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to methotrexate conjugates capable of penetrating the blood-brain barrier.
  • the Blood-Brain Barrier is a cell composed of tight junctions with high electrical resistance of 0.1 ⁇ m or more between pericytes and astrocytes and vascular endothelial cells in contact. It is a barrier.
  • the BBB is a selectively permeable barrier that separates circulating blood from brain extracellular fluid in the central nervous system (CNS) and serves as a gateway to control the entry and exit of substances.
  • the BBB blocks the delivery of bacteria, pathogens and potentially dangerous substances in the blood that can be transported through the blood to the brain, but also blocks the delivery of therapeutic drugs to the brain, making most central nervous system drugs ineffective. In order to compensate for this, since these drugs are administered in high doses, they sometimes cause serious side effects in the surrounding organs. Therefore, there is a need for an efficient drug delivery system capable of penetrating the BBB so that the drug can sufficiently exert a therapeutic effect while preventing negative systemic effects.
  • the Swiss pharmaceutical company Roche has developed an antibody-based 'brain shuttle', but antibody-based drug delivery systems are not suitable for application to various types of drugs.
  • Antibodies are high-molecular substances that are much larger in size than low-molecular substances such as small-molecular compounds and peptides, so attaching one drug to one antibody reduces drug delivery efficiency.
  • research on various drug delivery systems using small molecule compounds, peptides, and aptamers having molecular weights smaller than antibodies has been conducted.
  • methotrexate (hereinafter referred to as MTX) is a folate analogue that inhibits DNA synthesis, repair and cell replication and has anti-inflammatory and immunomodulatory activities.
  • MTX is a drug that is used as a treatment for a wide range of diseases, including malignant tumors and autoimmune diseases, as it shows superior efficacy even at relatively low doses compared to its price and is proven to be safe when used in appropriate doses.
  • the permeability to various selective biomembranes, including the BBB is remarkably low, so that a high dose must be administered for the treatment of target diseases in the central nervous system.
  • MTX When administered in high doses, MTX can cause serious side effects such as shock, hypersensitivity, bone marrow suppression, and liver/kidney/digestive tract/blood/skin disorders depending on the duration of administration, age, and condition of the patient.
  • a technology to increase its BBB penetration is required.
  • the inventors of the present invention confirmed that sialyllactose having a small molecular weight can pass through the BBB, and that a conjugate in which sialyllactose is linked to methotrexate can pass through the BBB as well as methotrexate that has passed through the BBB.
  • the present invention was completed by confirming that it can exert medicinal effects on central nervous system diseases.
  • An object to be solved by the present invention is to provide a methotrexate conjugate capable of passing through the blood-brain barrier by linking sialyllactose and methotrexate.
  • one embodiment of the present invention provides a methotrexate conjugate linked to sialyllactose.
  • the sialyllactose may be 2,3-sialyllactose or 2,6-sialyllactose.
  • methotrexate and sialyllactose may be connected through a covalent bond or a linker.
  • the sialyllactose may be characterized in that it is linked to methotrexate through the hydroxy group position of the glucose moiety.
  • the methotrexate may be characterized in that it is linked to sialyllactose through a carboxyl group position.
  • the conjugate has a structure of Formula I or Formula II below,
  • L in Formulas I and II may be a covalent bond or a linker.
  • linker comprises one or more alkyl, alkenyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, polyethylene glycol, natural or unnatural amino acids, or combinations thereof;
  • the linker is -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -S-S- , -C(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)-O-, ⁇ NH-O-, ⁇ NH-NH- and ⁇ NH-N(CH3)-;
  • it may be characterized in that it is connected to the sialyllactose and the methotrexate through any one selected from the group consisting of amide and ester.
  • the conjugate may be characterized in that the ability to penetrate the blood-brain barrier is improved compared to methotrexate.
  • Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating neoplastic or inflammatory diseases comprising the above-described conjugate.
  • the neoplastic disease or inflammatory disease may be characterized in that it includes or is likely to include a lesion in the brain or spinal cord.
  • composition may be characterized in that it is for oral, transdermal, dermal, intraperitoneal, rectal, intravenous, arterial, bone marrow, intramuscular, subcutaneous, intrauterine intradural or intracerebroventricular, cardiac, nasal, enteral, topical or sublingual administration. there is.
  • the methotrexate conjugate linked to sialyllactose enables MTX with low BBB passage efficiency to be effectively delivered to the brain to produce a drug effect, so that the conjugate can be used in various central nervous systems without toxicity problems caused by high-dose MTX administration. It can be used for the treatment of diseases.
  • FIG. 2 is a result of digitizing the fluorescence signal intensity of the brain part in FIG. 1 and a result of measuring the fluorescence signal intensity by extracting the brain in the experiment of FIG. 1 .
  • FIG. 6 is a result of digitizing the fluorescence signal intensity of the brain part in FIG. 5 and a result of measuring the fluorescence signal intensity by extracting the brain in the experiment of FIG. 5 .
  • a “linker” in the present specification is a moiety connecting two parts of a compound, and generally includes one or more direct covalent bonds, atoms, units, or chains of atoms.
  • atoms are oxygen (-O-) and sulfur (-S-), units are NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2 and SO2NH, etc.
  • chains of atoms are substituted or unsubstituted Unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, arylalkyl, arylalkenyl, arylalkynyl ), heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heteroarylalkynyl, heterocyclylalkyl, heterocyclylalkenyl, heterocyclylalkynyl, Aryl, heteroaryl, heterocyclyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, alkylaryl
  • One aspect of the present invention provides a methotrexate conjugate linked to sialyllactose.
  • Sialyllactose is one of the most abundant human milk oligosaccharides (HMOs) in colostrum of breast milk, and is a form in which sialic acid is attached to lactose (milk sugar).
  • HMOs human milk oligosaccharides
  • Rillactose may be characterized in that it is 2,3-sialyllactose, 2,6-sialyllactose or a salt thereof.
  • the sialyllactose may be extracted from breast milk, chemically synthesized, or synthesized using an enzymatic reaction.
  • mass production is possible and it can be synthesized using an environmentally friendly and safe enzymatic reaction without using a toxic catalyst or organic solvent.
  • the salt of sialyllactose may be, for example, a sodium salt, but is not limited thereto.
  • methotrexate (MTX) and sialyllactose (SL) may be connected through a covalent bond or a linker.
  • the SL and MTX may be directly connected to each other.
  • the functional group of SL and the functional group of MTX can be directly covalently bonded, and the direct covalent bonding does not inhibit the ability of SL to penetrate the blood-brain barrier and the physiological activity of MTX, or the covalent bond is broken after penetrating the blood-brain barrier to form SL.
  • the covalent bond is broken after penetrating the blood-brain barrier to form SL.
  • a linker Preferably, a hydroxyl group (-OH) of the lactose portion of SL may be combined with a functional group that does not affect the physiological activity of MTX.
  • the SL and MTX may be connected by a linker.
  • the linker can bind to the functional group of SL and the functional group of MTX, respectively, without inhibiting the blood-brain barrier penetration ability of SL and the physiological activity of MTX.
  • the linker binds to a hydroxyl group of the lactose portion of SL and to a functional group that does not affect the physiological activity of MTX.
  • the linker may be a cleavable linker that promotes release after delivery of the target physiologically active substance to the brain.
  • pH sensitive linkers peptidase-sensitive linkers and photoslabile linkers can be used.
  • a peptidase-sensitive linker that is easily cleavable by intracellular peptidase may be used.
  • it may be selected from those that are susceptible to cleavage by peptidases such as cathepsins B, C and D, which are peptidases that are preferentially expressed in tumor tissue.
  • the sialyllactose may be characterized in that it is connected to methotrexate through a hydroxyl group (-OH) of the lactose portion, preferably through a hydroxyl group position of the glucose portion.
  • the methotrexate may be characterized in that it is linked to sialyllactose through a carboxyl group (-COOH) position.
  • the conjugate has a structure of Formula I or Formula II below,
  • L in Formulas I and II may be a covalent bond or a linker.
  • the linker comprises one or more alkyl, alkenyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, polyethylene glycol, natural or unnatural amino acids, or combinations thereof, wherein the linker is —C(O)O— , -OC(O)-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -O-, -NH-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -OC (O)NH-, -NHC(O)-O-, ⁇ NH-O-, ⁇ NH-NH- and ⁇ NH-N(CH3)-; Alternatively, it may be characterized in that it is connected to the sialyllactose and the methotrexate through any one selected from the group consisting of amide and ester.
  • the conjugate may be characterized in that the ability to penetrate the blood-brain barrier is improved compared to methotrexate. As confirmed in Examples to be described later, the conjugate according to one embodiment of the present invention can penetrate the blood-brain barrier 2 times or more, preferably 3 times or more, and more preferably 5 times or more than methotrexate.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating neoplastic or inflammatory diseases comprising the above-described conjugate.
  • neoplasm refers to the abnormal proliferation of cells, is generally referred to as a tumor, and may be benign or malignant.
  • the neoplastic disease may be, for example, breast cancer, lung cancer, multiple myeloma, melanoma, glioma, lymphoma, leukemia, etc., but is not limited thereto.
  • the inflammatory disease includes a wide range of diseases characterized by inflammation, such as allergy, asthma, autoimmune disease, chronic digestive disorder (coeliac disease), glomerulonephritis (glomerulonephritis), hepatitis (hepatitis), ischemia reperfusion injury (reperfusion injury) , transplant rejection, etc., but is not limited thereto.
  • the autoimmune disease refers to a disease in which the immune system attacks self-antigens and causes an immune response, such as rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, systemic lupus erythematosus, and multiple sclerosis.
  • sclerosis type 1 diabetes mellitus, Guillain-Barre syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, psoriasis, and the like, but is not limited thereto.
  • the neoplastic disease or inflammatory disease may be characterized as involving or likely to include a lesion in the brain or spinal cord. This includes both the case where a lesion exists in the brain or spinal cord, or a case in which a lesion occurs in the brain or spinal cord due to metastasis from outside the central nervous system, or a case in which a lesion may occur.
  • it may be a malignant tumor that has occurred in the brain or spinal cord, and may be a case where a malignant tumor that has developed in another part has metastasized or has a possibility of metastasizing to the brain or spinal cord.
  • the pharmaceutical composition may further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • pharmaceutically acceptable means that it exhibits non-toxic properties to cells or humans exposed to the composition.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination or in combination with conventionally known agents for the treatment of neoplastic or inflammatory diseases.
  • administration refers to introducing a predetermined substance into a subject by an appropriate method
  • subject refers to all target animals such as rats, mice, and livestock including humans for treatment. As a specific example, it may be mammals including humans.
  • composition may be characterized in that it is for oral, transdermal, dermal, intraperitoneal, rectal, intravenous, arterial, bone marrow, intramuscular, subcutaneous, intrauterine intradural or intracerebroventricular, cardiac, nasal, enteral, topical or sublingual administration. there is.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it is preferable to select an injection method for external skin application or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection, It is not limited to this. From the viewpoint of selecting a more effective absorption route, the composition may be preferably characterized in that it is for oral administration. As can be seen in Examples to be described later, the MTX conjugate according to one embodiment of the present invention can be effectively delivered to the brain even when administered orally to produce medicinal effects.
  • the pharmaceutical composition When formulating the pharmaceutical composition, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc. Alternatively, it is prepared by mixing lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used as a base for the suppository.
  • sialyllactose as a blood-brain barrier penetrating transporter, brain penetration experiments of sialic acid, lactose, and sialyllactose were conducted.
  • Cy5.5 (Genechem, Cat no. GCCD0064), a fluorescent substance, was attached to lactose, 2,3-sialyllactose (GCB100) and 2,6-sialyllactose (GCB200), and each substance was mixed with 10% DMSO. After dissolving in , a sample was prepared by dilution (the final concentration of DMSO was around 2% of the total volume). Each sample was injected into the vein of a BALB/c nude mouse at 1 ⁇ mol/kg, and then the brains of the nude mice were examined at different times (1, 2, 4, 6, 8, 24 hours) using Perkin Elmer's IVIS spectrum CT.
  • Cy5.5 (Genechem, Cat no. GCCD0064), a fluorescent material, was attached to sialic acid, 2,3-sialyllactose (GCB100) and 2,6-sialyllactose (GCB200), and each material was 10 Samples were prepared by dissolving in % DMSO and then diluting (the final concentration of DMSO was around 2% of the total volume).
  • Cy5.5 (control) was found to hardly penetrate the blood-brain barrier, and even when sialic acid was attached, the brain penetration was at a similar level, whereas Cy5.5 with sialylactose attached to the brain It was well delivered, and in particular, the effect of 2,6-sialyllactose was found to be higher than that of 2,3-sialyllactose.
  • Cy5.5 which has a low brain permeability, passes through the blood-brain barrier better.
  • Cy5.5 attached with sialylaltose has a significantly higher brain permeability. was able to confirm
  • GCB016 (2,3-sialyllactose-methotrexate conjugate) and GCB017 (2,6-sialyllactose-methotrexate conjugate).
  • the structures of the obtained GCB016 (2,3-sialyllactose-methotrexate conjugate) and GCB017 (2,6-sialyllactose-methotrexate conjugate) are shown in FIG. 4 .
  • Cy5.5 was attached to methotrexate and used as a control material, and Cy5.5 was attached to GCB017 to conduct blood-brain barrier permeation experiments.
  • the fluorescence distributions of methotrexate and GCB017 with Cy5.5 attached over time were as shown in FIG. 5, and the fluorescence intensity in the brain was measured as shown in FIG. 6A.
  • the brain was extracted after 24 hours, and the result of measuring the fluorescence distribution image and fluorescence intensity of the brain was as shown in FIG. 6B.
  • FIGS. 5 and 6 compared to methotrexate-Cy5.5, which showed almost no fluorescence signal in the brain, when methotrexate-Cy5.5 linked to sialyllactose was administered, a fluorescence signal was clearly observed. That is, it was confirmed that methotrexate, which was hardly delivered to the brain, could be delivered to the brain by linking with sialyllactose.
  • GCB017 was administered to examine the tissue distribution and dissociation of sialyllactose-bound methotrexate, and the levels of GCB017 and its dissociates (linker-6'SL (L-6'SL) and linker) were administered in the brain and pancreas over time. I checked the existence.
  • GCB017 was dissolved in 10% DMSO and then diluted to prepare a sample (the final concentration of DMSO was around 2% of the total volume), and the sample was administered intravenously (IV) at a concentration of 80 mg/kg or orally administered at the same concentration.
  • methotrexate which is hardly delivered to the brain, can be delivered across the blood-brain barrier as a conjugate with sialyllactose and then dissociated from the brain.
  • a brain cancer model was constructed in the mouse brain and anticancer efficacy was evaluated.
  • a brain cancer model was constructed by transplanting U-87MG, a brain cancer cell line expressing luciferase.
  • each subject was injected with isoflurane to induce anesthesia, fixed on a stereotaxic arm, and a 25 ⁇ l Hamilton (Hamilton ) After transferring the cell line to a syringe, the cell line was transplanted into an area 1 mm anterior, 2 mm lateral, and 3 mm deep based on bregma at a rate of 1 ⁇ l/min.
  • the syringe After transplantation of the cell line, to prevent regurgitation and ensure good absorption, the syringe was kept for about 10 minutes, the syringe was separated, the incision was sutured, disinfected, and after confirming that the anesthesia was broken, it was raised normally.
  • methotrexate and GCB017 were intravenously administered twice a week for 4 weeks, and the size of the brain tumor was confirmed through optical imaging (FIG. 7).
  • the negative control group Vehicle
  • the tumor enlarged significantly on day 20
  • the increase over time was confirmed on day 24 and 27, and the positive control group administered with methotrexate also showed 20 It is confirmed that the size of the tumor gradually increases from day to day.

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Abstract

본 발명은 혈뇌장벽 투과가 가능한 시알릴락토스를 메토트렉세이트에 연결시킨 메토트렉세이트 결합체를 제공한다. 상기 결합체는 경구투여로도 혈뇌장벽을 투과할 수 있어 메토트렉세이트에 의해 치료될 수 있는 다양한 종류의 중추신경계 질환에 적용될 수 있다. 또한, 낮은 혈뇌장벽 투과율을 보완하기 위해 고용량이 투여됨에 따라 독성 문제를 가지던 메토트렉세이트를 낮은 용량으로 투여할 수 있도록 한다.

Description

신규한 메토트렉세이트 결합체와 이의 용도
본 발명은 혈뇌장벽을 투과할 수 있는 메토트렉세이트 결합체에 관한 것이다.
혈뇌장벽(Blood-Brain Barrier, 이하 BBB)은 관련된 혈관주위세포(pericytes) 및 성상세포(astrocytes)와 접하는 혈관내피세포 간의 0.1 Ω·m 이상의 높은 전기적 저항성을 갖는 밀착연접(tight junction)으로 구성된 세포 장벽이다. BBB는 중추신경계(central nervous system; CNS)에서 뇌 세포 외액(brain extracellular fluid)으로부터 순환하는 혈액을 분리하는 선택적인 투과성을 갖는 장벽으로서, 물질의 출입을 조절하는 관문 역할을 한다.
BBB는 혈액을 통해 운반될 수 있는 박테리아, 병원체 및 혈액 내 잠재적 위험물질이 뇌로 전달되는 것을 차단하지만, 치료를 위한 약물도 뇌로 전달되는 것을 차단하여 대부분의 중추신경계 약물이 낮은 효율을 나타내도록 하며, 이를 보상하기 위하여 이들 약물을 고용량으로 투여하게 되므로 주변 장기에 심각한 부작용을 유발하기도 한다. 따라서, 부정적인 전신 효과를 방지하면서 약물이 충분히 치료 효과를 낼 수 있도록 BBB를 투과할 수 있는 효율적인 약물 전달 시스템이 필요한 상황이다.
이러한 측면에서, 스위스의 제약회사인 로슈사는 항체 기반의 '뇌 셔틀(brain shuttle)'을 개발한 바 있으나, 항체 기반의 약물 전달 시스템은 다양한 종류의 약물에 적용하기에는 적합하지 않다. 항체는 고분자 물질로 저분자 물질인 소분자 화합물, 펩타이드 등에 비해 크기가 월등히 크기 때문에 항체 한 개에 약물 한 개를 붙인다면 오히려 약물 전달 효율이 떨어진다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 분자량이 항체보다 작은 소분자 화합물, 펩타이드 및 압타머 등을 이용한 다양한 약물 전달 시스템 연구가 진행되고 있다.
한편, 메토트렉세이트(methotrexate, 이하 MTX)는 DNA 합성, 복구 및 세포 복제를 저해하며 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 이중 작용을 하는 엽산(folate) 유사체이다. MTX는 가격에 비해 상대적으로 저용량으로도 월등한 효능을 나타내며, 적절한 용량으로 사용될 경우 안전하다는 것이 입증되어 악성 종양 및 자가면역 질환을 포함하는 광범위한 질병의 치료제로 이용되는 약물이다. 다만, BBB를 포함한 각종 선택적 생체 막에 대한 투과능이 현저히 떨어져 중추신경계 내 타겟질환의 치료를 위해서는 높은 용량을 투여할 수밖에 없다. MTX는 고용량으로 투여 시에 투여 지속기간, 연령 및 환자의 상태에 따라 쇼크, 과민증, 골수 억제, 간/신장/소화관/혈액/피부 장애 등의 심각한 부작용을 일으킬 수 있으므로, 중추신경계 질환의 치료에 MTX를 이용하기 위해서는 이의 BBB 투과를 높일 기술이 필요한 실정이다.
본 발명의 발명자들은 분자량이 작은 시알릴락토스가 BBB를 통과할 수 있음을 확인하고, 이러한 시알릴락토스를 메토트렉세이트와 연결한 결합체(conjugate)가 BBB를 통과할 수 있을 뿐만 아니라 이렇게 BBB를 통과한 메토트렉세이트가 중추신경계 질환에 약효를 낼 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 시알릴락토스와 메토트렉세이트를 연결하여 혈뇌장벽을 통과할 수 있는 메토트렉세이트 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예에서는 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트(methotrexate) 결합체(conjugate)를 제공한다.
여기서, 상기 시알릴락토스는 2,3-시알릴락토스 또는 2,6-시알릴락토스인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 메토트렉세이트와 시알릴락토스는 공유결합 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 시알릴락토스는 글루코스 부분의 하이드록시기 위치를 통해 메토트렉세이트와 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 메토트렉세이트는 카복실기 위치를 통해 시알릴락토스와 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합체는 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 포함하는 것이고,
화학식 I:
Figure PCTKR2022021386-appb-img-000001
화학식 II:
Figure PCTKR2022021386-appb-img-000002
상기 화학식 I 및 II의 L은 공유결합 또는 링커인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 링커는 하나 이상의 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌 글라이콜, 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 그 조합을 포함하고,
상기 링커는 ―C(O)O―, ―OC(O)―, ―NHC(O)―, ―C(O)NH―, ―O―, ―NH―, ―S―, ―S―S―, ―C(O)―, ―OC(O)NH―, ―NHC(O)―O―, 〓NH―O―, 〓NH―NH― and 〓NH―N(CH3)-; 또는 아마이드, 에스테르로 구성된 군에서 각각 선택된 어느 하나를 통해 상기 시알릴락토스 및 상기 메토트렉세이트와 각각 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합체는 혈뇌장벽 투과능이 메토트렉세이트에 비해 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는 전술한 결합체를 포함하는 신생물성 또는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 신생물성 질환 또는 염증성 질환은 뇌 또는 척수에 병변(lesion)을 포함하거나 포함할 가능성이 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물은 경구, 경피, 피부, 복강, 직장, 정맥, 동맥, 골수, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular), 심장, 비강, 장관, 국소 또는 설하 투여용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트 결합체는 BBB 통과 효율이 낮은 MTX가 뇌로 효과적으로 전달되어 약효를 낼 수 있도록 하므로, 상기 결합체는 MTX의 고용량 투여로 인한 독성 문제없이 다양한 중추신경계 내 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 락토스 및 시알릴락토스가 연결된 Cy5.5의 뇌 투과를 비교한 실험 결과이다.
도 2는 도 1에서 뇌 부분의 형광신호강도를 수치화한 결과 및 도 1의 실험에서 뇌를 적출하여 형광신호강도를 측정한 결과이다.
도 3은 시알산 및 시알릴락토스가 연결된 Cy5.5의 뇌 투과를 비교한 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 시알릴락토스가 연결된 메토트렉세이트의 구조식이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 시알릴락토스가 연결된 메토트렉세이트의 뇌 투과를 동물에서 확인한 실험 결과이다.
도 6은 도 5에서 뇌 부분의 형광신호강도를 수치화한 결과 및 도 5의 실험에서 뇌를 적출하여 형광신호강도를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 시알릴락토스가 연결된 메토트렉세이트를 뇌암 동물 모델에 투여시 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 “링커”는 화합물의 두 부분을 연결하는 모이어티(moiety)로, 일반적으로 직접적인 공유결합, 원자, 단위 또는 원자들의 사슬을 하나 이상 포함한다. 예컨대 원자는 산소(-O-) 및 황(-S-) 등, 단위는 NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2 및 SO2NH 등, 원자들의 사슬은 치환(substituted) 또는 비치환된(unsubstituted) 알킬(alkyl), 치환 또는 비치환된 알케닐(alkenyl), 치환 또는 비치환된 알키닐(alkynyl), 아릴알킬(arylalkyl), 아릴알케닐(arylalkenyl), 아릴알키닐(arylalkynyl), 헤테로아릴알킬(heteroarylalkyl), 헤테로아릴알케닐(heteroarylalkenyl), 헤테로아릴알키닐(heteroarylalkynyl), 헤테로사이클릴알킬 (heterocyclylalkyl), 헤테로사이클릴알케닐 (heterocyclylalkenyl), 헤테로사이클릴알키닐 (heterocyclylalkynyl), 아릴(aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 헤테로사이클릴(heterocyclyl), 사이클로알킬(cycloalkyl), 사이클로알케닐(cycloalkenyl), 알킬아릴알킬(alkylarylalkyl), 알킬아릴알케닐(alkylarylalkenyl), 알킬아릴알키닐 (alkylarylalkynyl), 알케닐아릴알킬(alkenylarylalkyl), 알케닐아릴알케닐 (alkenylarylalkenyl), 알케닐아릴알키닐(alkenylarylalkynyl), 알키닐아릴알킬 (alkynylarylalkyl), 알키닐아릴알케닐(alkynylarylalkenyl), 알키닐아릴알키닐 (alkynylarylalkynyl), 알킬헤테로아릴알킬(alkylheteroarylalkyl), 알킬헤테로아릴알케닐 (alkylheteroarylalkenyl), 알킬헤테로아릴알키닐(alkylheteroarylalkynyl), 알케닐헤테로아릴알킬 (alkenylheteroarylalkyl), 알케닐헤테로아릴알케닐 (alkenylheteroarylalkenyl), 알케닐헤테로아릴알키닐(alkenylheteroarylalkynyl), 알키닐헤테로아릴알킬(alkynylheteroarylalkyl), 알키닐헤테로아릴알케닐 (alkynylheteroarylalkenyl), 알키닐헤테로아릴알키닐(alkynylheteroarylalkynyl), 알킬헤테로사이클릴알킬(alkylheterocyclylalkyl), 알킬헤테로사이클릴알케닐 (alkylheterocyclylalkenyl), 알킬헤테로사이클릴알키닐(alkylhererocyclylalkynyl), 알케닐헤테로사이클릴알킬(alkenylheterocyclylalkyl), 알케닐헤테로사이클릴알케닐 (alkenylheterocyclylalkenyl), 알케닐헤테로사이클릴알키닐(alkenylheterocyclylalkynyl), 알키닐헤테로사이클릴알킬(alkynylheterocyclylalkyl), 알키닐헤테로사이클릴알케닐 (alkynylheterocyclylalkenyl), 알키닐헤테로사이클릴알키닐(alkynylheterocyclylalkynyl), 알킬아릴(alkylaryl), 알케닐아릴(alkenylaryl), 알키닐아릴(alkynylaryl), 알킬헤테로아릴 (alkylheteroaryl), 알케닐헤테로아릴(alkenylheteroaryl) 및 알키닐헤테로아릴 (alkynylhereroaryl) 기(하나 이상의 메틸렌(methylene) 중간 또는 말단이 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭 기로 연결/치환된 것; R8은 수소, 아실(acyl), 알리파틱(aliphatic) 또는 치환된 알리파틱 기인 것) 등에서 선택된 것일 수 있다. 링커는 바람직하게 1-24 원자로 되어 있을 수 있고, 더욱 바람직하게 4-24 원자로 구성될 수 있다.
본 발명의 일측면은 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트(methotrexate) 결합체(conjugate)를 제공한다.
시알릴락토스(sialyllactose, 이하 SL)는 모유의 초유에 가장 많이 함유된 모유올리고당(HMO)의 한 종류로 락토스(유당)에 시알산이 붙어 있는 형태이다. 시알릴락토스는 시알산이 락토스와 결합하는 위치에 따라, 하기 구조식 1로 표현되는 2,3-시알릴락토스와 하기 구조식 2로 표현되는 2,6-시알릴락토스 두 종류가 있으며, 상기 접합체의 시알릴락토스는 2,3-시알릴락토스, 2,6-시알릴락토스 또는 그 염인 것을 특징으로 할 수 있다.
[구조식 1]
Figure PCTKR2022021386-appb-img-000003
[구조식 2]
Figure PCTKR2022021386-appb-img-000004
상기 시알릴락토스는 모유에서 추출하거나, 화학적으로 합성하거나, 또는 효소반응을 이용하여 합성할 수 있다. 바람직하게는 대량생산이 가능하고 독성이 있는 촉매나 유기 용매를 사용하지 않아 환경 친화적이고 안전한 효소반응을 이용하여 합성할 수 있다.
상기 시알릴락토스의 염은 예컨대 소듐염일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 메토트렉세이트(MTX)와 시알릴락토스(SL)는 공유결합 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 SL과 MTX는 서로 직접 연결될 수 있다. 예컨대, SL의 작용기와 MTX의 작용기가 직접 공유결합될 수 있고, 직접 공유결합으로 인해 SL의 혈뇌장벽 투과능과 MTX의 생리활성을 저해하지 않거나, 혈뇌장벽을 투과한 뒤에 공유결합이 분해되어 SL과 MTX가 분리되는 경우에는 링커 없이 직접 공유결합될 수 있다. 바람직하게는 SL의 락토스 부분 하이드록시기(hydroxyl group, -OH)와 MTX의 생리활성에 영향을 미치지 않는 작용기가 결합할 수 있다.
또한, 상기 SL과 MTX는 링커로 연결될 수 있다. 예컨대, 상기 링커는 SL의 혈뇌장벽 투과능과 MTX의 생리활성을 저해하지 않으면서, SL의 작용기와 MTX의 작용기에 각각 결합할 수 있다. 바람직하게는 상기 링커가 SL의 락토스 부분 하이드록시기와 결합하고, MTX의 생리활성에 영향을 미치지 않는 작용기와 각각 결합할 수 있다.
상기 링커는 뇌로 전달 대상 생리 활성 물질을 전달한 후에 방출을 촉진하는 분리가능한 링커(cleavable linker)일 수 있다. 예를 들면, pH 민감성 링커, 펩티다아제-민감성 링커 및 광불안정 링커를 사용할 수 있다. 바람직하게는 세포내에 존재하는 펩티다아제에 의해 쉽게 분리가능한 펩티다아제-민감성 링커를 사용할 수 있다. 예컨대, 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 펩티다아제인 카뎁신 B, C 및 D와 같은 펩티다아제에 의해 절단되기 쉬운 것들 중에서 선택할 수 있다.
상기 시알릴락토스는 락토스 부분의 하이드록시기(hydroxyl group, -OH), 바람직하게 글루코스 부분의 하이드록시기 위치를 통해 메토트렉세이트와 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 메토트렉세이트는 카복실기(carboxyl group, -COOH) 위치를 통해 시알릴락토스와 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합체는 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 포함하는 것이고,
화학식 I:
Figure PCTKR2022021386-appb-img-000005
화학식 II:
Figure PCTKR2022021386-appb-img-000006
상기 화학식 I 및 II의 L은 공유결합 또는 링커인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 링커는 하나 이상의 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌 글라이콜, 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 그 조합을 포함하고, 상기 링커는 ―C(O)O―, ―OC(O)―, ―NHC(O)―, ―C(O)NH―, ―O―, ―NH―, ―S―, ―S―S―, ―C(O)―, ―OC(O)NH―, ―NHC(O)―O―, 〓NH―O―, 〓NH―NH― and 〓NH―N(CH3)-; 또는 아마이드, 에스테르로 구성된 군에서 각각 선택된 어느 하나를 통해 상기 시알릴락토스 및 상기 메토트렉세이트와 각각 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 결합체는 혈뇌장벽 투과능이 메토트렉세이트에 비해 향상된 것을 특징으로 할 수 있다. 후술할 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 상기 결합체는 메토트렉세이트에 비해 2배 이상, 바람직하게 3배 이상, 더욱 바람직하게 5배 이상 혈뇌장벽을 투과할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은 전술한 결합체를 포함하는 신생물성 또는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
여기서, 신생물성 질환(neoplasm)은 세포의 이상 증식을 말하며, 일반적으로 종양으로 불리고, 양성 또는 악성일 수 있다. 상기 신생물성 질환은 예컨대 유방암, 폐암, 다발성 골수종, 흑색종, 신경교종, 림프종, 백혈병 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 염증성 질환은 염증을 특징으로 하는 광범위한 질환을 포함하며, 예컨대 알러지, 천식, 자가면역질환, 만성소화장애(coeliac disease), 사구체신염(glomerulonephritis), 간염(hepatitis), 허혈재관류 손상(reperfusion injury), 이식거부(transplant rejection) 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 자가면역질환은 면역계가 자가항원을 공격하여 면역반응을 일으켜 나타나는 질환을 말하며, 예컨대 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 낭창(systemic lupus erythematosus), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 1형당뇨(Type 1 diabetes mellitus), 길랭 바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 건선(psoriasis) 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 신생물성 질환 또는 염증성 질환은 뇌 또는 척수에 병변(lesion)을 포함하거나 포함할 가능성이 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 뇌 또는 척수에 병변이 존재하거나, 중추신경계 밖으로부터 전이되어 뇌 또는 척수에 병변이 생긴 경우 및 생길 가능성이 있는 경우를 모두 포함한다. 예컨대 뇌 또는 척수에 발생한 악성종양일 수 있으며, 다른 부위에 발생한 악성 종양이 뇌 또는 척수로 전이되거나 전이될 가능성이 있는 경우일 수 있다.
상기 약학 조성물은 추가로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
나아가 상기 약학 조성물은 종래에 알려져 있는 상기 신생물성 또는 염증성 질환 치료용 제제와 혼합하거나 병행하여 투여될 수 있다.
상기 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 치료를 목적하는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 대상 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 조성물은 경구, 경피, 피부, 복강, 직장, 정맥, 동맥, 골수, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular), 심장, 비강, 장관, 국소 또는 설하 투여용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 효과적인 흡수경로를 선택한다는 관점에서 바람직하게 상기 조성물은 경구투여용인 것을 특징으로 할 수 있다. 후술할 실시예에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 일실시예에 따른 MTX 결합체는 경구투여시에도 효과적으로 뇌로 전달되어 약효를 낼 수 있다.
상기 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예1. 시알릴락토스의 혈뇌장벽 투과 실험>
시알릴락토스의 혈뇌장벽 투과 전달체로 활용 가능성을 검증하기 위하여 시알산, 락토스 및 시알릴락토스의 뇌 투과 실험을 진행하였다.
우선, 락토스, 2,3-시알릴락토스(GCB100) 및 2,6-시알릴락토스(GCB200)에 형광물질인 Cy5.5(Genechem, Cat no. GCCD0064)를 부착시키고, 각 물질을 10% DMSO에 용해한 후 희석하여 시료를 준비하였다(최종 DMSO의 농도는 전체 볼륨의 2% 내외). 각각의 시료를 1 μmol/kg 로 BALB/c 누드마우스의 정맥에 투여한 뒤에 Perkin Elmer사 IVIS spectrum CT를 이용하여 시간별(1, 2, 4, 6, 8, 24시간)로 누드마우스의 뇌의 형광신호를 확인하고, 투여 24시간 후에 누드마우스를 생리식염수 관류하고 뇌를 적출하여 뇌에 존재하는 형광을 측정하였다(도 1 및 2). 그 결과, Cy5.5(control)는 혈뇌장벽을 거의 투과하지 않는 것으로 나타났으며, 락토스에 비해 서로 다른 시알릴락토스가 부착된 Cy5.5 모두 뇌에 잘 전달되는 것으로 나타났다.
다음으로, 시알산, 2,3-시알릴락토스(GCB100) 및 2,6-시알릴락토스(GCB200)에 형광물질인 Cy5.5(Genechem, Cat no. GCCD0064)를 부착시키고, 각 물질을 10% DMSO에 용해한 후 희석하여 시료를 준비하였다(최종 DMSO의 농도는 전체 볼륨의 2% 내외). 각각의 시료를 1 μmol/kg 로 BALB/c 누드마우스의 정맥에 투여한 뒤에 Perkin Elmer사 IVIS spectrum CT를 이용하여 시간별(10분, 30분, 1, 2, 4, 6, 8, 24시간)로 누드마우스의 뇌의 형광신호를 측정하고, 투여 24시간 후에 누드마우스를 생리식염수 관류하고 뇌를 적출하여 뇌에 존재하는 형광을 측정하였다. 그 결과 도 3과 같이 Cy5.5(control)는 혈뇌장벽을 거의 투과하지 않는 것으로 나타났으며, 시알산을 부착해도 뇌 투과가 유사한 수준이었는데 비해, 시알릴락토스가 부착된 Cy5.5는 뇌에 잘 전달되었고, 특히 2,6-시알릴락토스의 효과가 2,3-시알릴락토스에 비해 높은 것으로 나타났다.
종합해보면, 시알릴랄토스를 부착시키면 뇌 투과율이 낮은 Cy5.5의 혈액-뇌장벽 통과가 더 잘 되며, 특히 시알산이나 락토스에 비해서 시알릴랄토스를 부착한 Cy5.5가 뇌의 투과율이 월등히 높음을 확인할 수 있었다.
<실시예2. 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트 결합체의 제조>
메토트렉사이트 1 g에 피리딘 10 ml과 트리에틸아민 0.337 ml을 넣고 교반 한 뒤 4-디메틸아미노피리딘 0.027 g과 4-니트로페닐 클로로포름산염 0.887 g을 천천히 첨가하여 4시간 동안 교반하였다. 반응 후 농축하여 1 g의 반응물을 얻었다. 상기 반응물 1 g에 디메틸포름아마이드 15 ml와 트리에틸아민 2.42 ml를 넣고 교반한 후 Aminohexyl-2,3-시알릴락토스와 Aminohexyl-2,6-시알릴락토스를 각각 0.63 g씩 넣고 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응 후에 농축하여 실리카 겔로 정제하여 GCB016(2,3-시알릴락토스-메토트렉세이트 결합체)와 GCB017(2,6-시알릴락토스-메토트렉세이트 결합체)를 얻었다. 수득된 GCB016(2,3-시알릴락토스-메토트렉세이트 결합체)와 GCB017(2,6-시알릴락토스-메토트렉세이트 결합체)의 구조는 도 4와 같다.
<실시예3. 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트의 혈액-뇌 장벽 투과 실험>
Cy5.5를 메토트렉세이트와 부착시켜 대조물질로 사용하였고, Cy5.5를 GCB017에 부착하여 혈액-뇌 장벽 투과 실험을 진행하였다.
Cy5.5를 부착한 메토트렉세이트와 GCB017의 시간별 체내 형광분포는 도 5와 같았고, 뇌에서의 형광세기를 측정한 결과 도 6A와 같았다. 그리고 뇌를 24시간 뒤에 적출하고 적출된 뇌의 형광분포 이미지와 형광세기를 측정한 결과 도 6B와 같았다. 도 5 및 6에서 확인할 수 있듯 뇌에서는 거의 형광신호가 나타나지 않은 메토트렉세이트-Cy5.5에 비해 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트-Cy5.5를 투여한 경우 뚜렷하게 형광신호가 나타났다. 즉, 뇌로 거의 전달되지 않던 메토트렉세이트가 시알릴락토스와의 연결에 의해 뇌로 전달될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예4. 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트 결합체의 뇌조직 투과 및 물질 해리 확인 실험>
시알릴락토스를 결합시킨 메토트렉세이트의 조직 내 분포 및 해리 여부를 확인하기 위해 GCB017을 투여하고 시간 별로 뇌 및 췌장에서 GCB017 및 그 해리물(linker-6'SL (L-6'SL) 및 linker)의 존재를 확인해보았다. 상세하게, GCB017을 10% DMSO에 용해한 후 희석하여 시료를 준비하고(최종 DMSO의 농도는 전체 볼륨의 2% 내외), 시료를 80 mg/kg 농도로 정맥투여(IV) 또는 동일 농도로 경구투여(PO)한 후, 시간별(0, 0.5, 2, 4시간)에 마취, 심장 채혈 후 생리식염수 관류하고 뇌 및 췌장을 적출하였다. 적출된 각 조직을 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 1:5 비율로 균질화(homogenize)하고 20분간 3,000 rpm, 4 ℃에서 원심분리하여 상층액을 얻고, 이를 질량분석(SCIEX사 Triple Quad 3500 LC-MS/MS system)한 결과를 표 1에 나타내었다.
(ng/ml) 뇌
GCB017 L-6'SL linker
Vehicle G1 101 N/D N/D N/D
102 N/D N/D N/D
GCB017
(80 mg/kg, IV)		 0.5h G2 201 557.75 N/D N/D
202 246.04 N/D N/D
203 82.46 N/D N/D
2h G3 301 52.73 N/D N/D
302 66.80 N/D N/D
303 41.10 N/D N/D
4h G4 401 39.94 N/D N/D
402 57.44 N/D N/D
403 161.80 N/D N/D
GCB017
(80 mg/kg, PO)		 0.5h G5 501 34.78 N/D N/D
502 169.99 N/D N/D
2h G6 601 N/D N/D N/D
602 N/D N/D N/D
4h G7 701 30.34 N/D N/D
702 N/D N/D N/D
그 결과, GCB017을 정맥 투여하는 경우뿐만 아니라 경구 투여시에도 뇌 조직 내에서 해당 물질 및 그 해리물이 검출되었다. 이를 통해, 뇌로 거의 전달되지 않는 메토트렉세이트가 시알릴락토스와의 결합체로서 혈뇌장벽 너머로 전달될 수 있으며, 이후 뇌에서 해리됨을 확인할 수 있다.
<실시예5. 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트 결합체의 뇌암 동물 모델 내 항암 효과 평가>
GCB017이 뇌로 통과하여 메토트렉세이트의 항암효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여 마우스 뇌에 뇌암 모델을 제작하여 항암 효능평가를 수행하였다. 뇌암 모델은 luciferase를 발현하는 뇌암 세포주인 U-87MG를 이식하여 제작하였다. 뇌 이식을 위해 각 개체는 isoflurane으로 주사 마취를 유도하고 stereotaxic arm에 고정하고, 머리 피부를 세로로 1 cm 정도 절개하여 마이크로 드릴로 주입 부위를 노출시켜 31 게이지의 주사침을 연결한 25 μl 해밀턴(Hamilton) 주사기에 세포주를 옮겨 담은 후 브레그마(bregma) 기준으로 전방 1mm, 측방 2mm, 깊이 3 mm 부위에 세포주를 1 μl/min 속도로 이식하였다. 세포주 이식 후 역류를 방지하고 흡수가 잘 되게 하고자 10분 정도 그대로 유지하고 주사기를 분리하였고, 절개 부위를 봉합한 뒤 소독한 뒤 마취가 깨는 것을 확인하고 정상 사육하였다. 모델 제작 1주 후부터 메토트렉세이트와 GCB017을 주 2회 4주간 총 8회 정맥으로 투여한 뒤에 광학영상촬영을 통해 뇌 종양의 사이즈를 확인하였다(도 7). 그 결과, 음성대조군(Vehicle)의 경우 20일에 종양이 커지는 것이 두드러지게 나타나며 24, 27일로 시간이 경과함에 따라 증대 양상이 확인되었고, 메토트렉세이트를 투여한 양성대조군 역시 22 μmol/kg 투여 시에도 20일부터 점차적으로 종양의 크기가 커짐이 확인된다. 반면 음성대조군 및 양성대조군 투여 시와 비교하였을 때 GCB017을 22 μmol/kg 투여한 실험군의 경우, 종양의 형성이 크게 지연되고 종양의 크기도 작게 제어된다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 실시예 3-4의 결과와 종합해보면, 이는 본 발명에 따른 시알릴락토스와 연결된 메토트렉세이트 결합체가 메토트렉세이트보다 개선된 BBB 투과능을 가져 종양의 형성 및 성장을 저해하기 때문인 것으로 판단할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 시알릴락토스(sialyllactose)와 연결된 메토트렉세이트(methotrexate) 결합체(conjugate).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시알릴락토스는 2,3-시알릴락토스 또는 2,6-시알릴락토스인 것을 특징으로 하는 결합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 메토트렉세이트와 시알릴락토스는 공유결합 또는 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 결합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 시알릴락토스는 글루코스 부분의 하이드록시기 위치를 통해 메토트렉세이트와 연결된 것을 특징으로 하는 결합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 메토트렉세이트는 카복실기 위치를 통해 시알릴락토스와 연결된 것을 특징으로 하는 결합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결합체는 하기 화학식 I 또는 화학식 II의 구조를 포함하는 것이고,
    화학식 I:
    Figure PCTKR2022021386-appb-img-000007
    화학식 II:
    Figure PCTKR2022021386-appb-img-000008
    상기 화학식 I 및 II의 L은 공유결합 또는 링커인 것을 특징으로 하는 결합체.
  7. 제3항 및 제6항에 있어서,
    상기 링커는 하나 이상의 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 폴리에틸렌 글라이콜, 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 그 조합을 포함하고,
    상기 링커는 ―C(O)O―, ―OC(O)―, ―NHC(O)―, ―C(O)NH―, ―O―, ―NH―, ―S―, ―S―S―, ―C(O)―, ―OC(O)NH―, ―NHC(O)―O―, 〓NH―O―, 〓NH―NH― and 〓NH―N(CH3)-; 또는 아마이드, 에스테르로 구성된 군에서 각각 선택된 어느 하나를 통해 상기 시알릴락토스 및 상기 메토트렉세이트와 각각 연결된 것을 특징으로 하는 결합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 결합체는 혈뇌장벽 투과능이 메토트렉세이트에 비해 향상된 것을 특징으로 하는 결합체.
  9. 제1항의 결합체를 포함하는 신생물성 또는 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 신생물성 질환 또는 염증성 질환은 뇌 또는 척수에 병변(lesion)을 포함하거나 포함할 가능성이 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 경구, 경피, 피부, 복강, 직장, 정맥, 동맥, 골수, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular), 심장, 비강, 장관, 국소 또는 설하 투여용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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