WO2023127707A1 - 微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定するための方法、装置及びピペットカートリッジ - Google Patents

Abstract

本開示では、微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法であって、微量血液を提供すること；微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得すること；第一血液部分中の非血球成分に関連する第一要素を測定すること；第二血液部分を溶血させること；及び溶血後の前記第二血液部分中の血球成分に関連する第二要素を測定することを備える方法が提供される。

Description

微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定するための方法、装置及びピペットカートリッジ

　本開示は、微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法に関するものである。

　血液中の血球成分及び血清又は血漿成分はそれぞれ有用なバイオマーカを含んでいる。したがって、対象被検者の同一全血サンプルから、両方の成分に関する複数の測定を行うことは有用である。

　例えば、糖尿病関連の検査として、血中グルコース、ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミン（ＧＡ）などが測定される。一般的に、ＨｂＡ１ｃは、血球成分を溶血させたサンプルを用いて、比色法などによって測定される。一方、血中グルコース及びグリコアルブミンは、血球分離後の血清又は血漿を用いて、同様に比色法などによって測定される。血清又は血漿を用いたグルコース及びグリコアルブミンの測定では、溶血サンプルに含まれる赤色素タンパク質であるヘモグロビンの吸収波長が光学測定に影響を及ぼす。そのため、ＨｂＡ１ｃなど血球成分に含まれる物質の測定と、血中グルコース、グリコアルブミンなどの血清成分に含まれる物質の測定とを同時に行うためには、安定して血球と血清・血漿が分離できる程度の全血サンプルの用意が必要であった。例えば、静脈血を採取できれば、所定の量の全血サンプルを準備することは可能である。

　しかし近年、より迅速、簡易、そしてより低い侵襲度の血液検査が求められているものの、より少量の血液、例えば、指頭血などの毛細管血を用いた血球成分と血清・血漿成分に含まれる複数のバイオマーカの同時検査は、安定した血球成分と血清・血漿成分の分離が困難なため、実現できなかった。

　本開示の一実施形態は、少量の血液を用いて複数のバイオマーカを測定する技術を提供する。本開示の一実施形態によれば、微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法であって、微量血液の第一血液部分中の非血球成分に関連する第一要素を測定すること；微量血液の第二血液部分を溶血させること；及び溶血後の前記第二血液部分中の血球成分に関連する第二要素を測定することを備える方法が提供される。

一実施形態に係る微量血液内の要素を測定する方法のフローチャートである。 一実施形態に係る微量血液内の要素を測定する方法のフローチャートである。 一実施形態に係る微量血液内の要素を測定するための装置のブロック図である。 一実施形態に係る、微量血液内の要素を測定するためのピペットカートリッジの構成とその操作手順を説明するための正面図である。 一実施形態に係る、微量血液内の要素を測定するためのピペットカートリッジの構成とその操作手順を説明するための正面図である。 一実施形態に係る、微量血液内の要素を測定するためのピペットカートリッジの構成とその操作手順を説明するための正面図である。 実施例１で得られたフィルタ血清と静脈血清との間でのＧＡ％における相関を示すグラフである。 実施例１で得られた溶血サンプルと静脈血サンプルとの間でのＨｂＡ１ｃ％における相関を示すグラフである。 実施例２で得られた溶血サンプルと静脈血サンプルとの間でのＨｂＡ１ｃ％における相関を示すグラフである。 実施例３で得られたフィルタ血清と静脈血清との間でのグルコース濃度における相関を示すグラフである。 実施例４で得られたフィルタ血清と静脈血清との間での１，５ーＡＧ濃度における相関を示すグラフである。 実施例５で得られたフィルタ血清と静脈血清との間でのＧＡ％における相関を示すグラフである。

＜１．測定方法＞
　本開示の一実施形態は、少量の血液を用いて複数のバイオマーカを測定する技術を提供する。本開示の一実施形態によれば、微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法であって、
　微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得すること；
前記第一血液部分中の非血球成分に関連する第一要素を測定すること；
　前記第二血液部分を溶血させること；及び
　前記溶血後の前記第二血液部分中の血球成分に関連する第二要素を測定することを備える、
方法が提供される。

　微量血液を用いてこれらを測定することで、例えば非限定的に、ポイントオブケアとして、又は個別のクリニック、家庭などで少量の血液を用いて複数のバイオマーカを検査すること、簡易に健康管理を行うことなどが可能になる。

　本明細書で用いる「微量血液」は、一般に、その容量の血液に対して、遠心分離を含む処理を行って所望の検査又は測定を行うことが、実質的に不可能又は医療的若しくは産業的に実質的な意味をもたない程度の量をさす。

　微量血液は、０．５μＬ，０．６μＬ，０．７μＬ，０．８μＬ，０．９μＬ，１μＬ，２μＬ，３μＬ，４μＬ，５μＬ，６μＬ，７μＬ，８μＬ，９μＬ，１０μＬ，１０μＬ，２０μＬ，３０μＬ，４０μＬ，５０μＬ、又はそれより少ない量の血液である。

　いくつかの実施形態では、微量血液は毛細管血であってもよく、又はそれ由来であってもよい。いくつかの態様では、微量血液は、指頭血であってもよい。本明細書で用いる「指頭血」は、一般に、ランセットなどのデバイスを用いて体表面に形成された、毛細管血のドロップレットをさす。これを、毛細管を用いて収集することができる。毛細管血は、耳たぶ、上腕、腹部、足の裏（例えば新生児）において同様に形成され、収集されてもよい。

　いくつかの実施形態では、微量血液は静脈血又は動脈血であってもよく、それら由来であってもよい。一般に、静脈血又は動脈血は、比較的大量に収集することができる。しかし、少量しか収集できない場合もある。

　いくつかの実施形態では、微量血液を希釈してもよい。いくつかの実施形態では、方法は、微量血液を希釈することを備えていてもよい。原液としての微量血液は、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍に希釈されてもよい。本明細書で用いる「微量血液の希釈液」又はそれに類似する用語は、矛盾がない限り、「微量血液」と同義に用いる場合がある。

　微量血液を希釈することは、所定の希釈溶液を微量血液に添加し又は混合してもよい。いくつかの実施形態では、希釈溶液は、溶血を実質的に生じさせない。希釈溶液は、生理食塩水であってもよい。いくつかの実施形態では、希釈溶液は、等張液であることが好ましい。希釈溶液は、グッドバッファ（例えばＨＥＰＥＳ）などの緩衝液であってもよい。

　いくつかの実施形態では、微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得してもよい。微量血液を、第一血液部分と第二血液部分とに分けてもよい。微量血液を２つの部分に分けてもよい。多少の残余があってもよい。

　いくつかの実施形態では、溶血は、溶血剤を用いて行ってもよい。本明細書で使用される「溶血剤」という用語は、血液中の赤血球を溶解することができる任意の物質をさす。溶血剤は低張液であってもよい。溶血剤は、例えば非限定的に、純水であってもよく、溶液であってもよい。

　いくつかの実施形態では、溶血剤は、シアンイオンを含んでいてもよい（シアン又はシアン化合物の溶液）。溶血剤中のシアンイオンは、溶出したヘモグロビンに結合し、生成したシアンメトヘモグロビンの量を吸光度法で測定することによって、ヘモグロビンの濃度を求めることができる。

　いくつかの実施形態では、溶血剤は、界面活性剤を含んでいてもよい。溶血剤中の界面活性剤は、溶出したヘモグロビンの立体構造を変化させ、その吸光度測定により、ヘモグロビンの濃度を求めることができる。

　いくつかの実施形態では、溶血剤は、任意の対象物質を染色する染色液を含んでいてもよい。溶血剤中の染色液は、溶解した細胞由来成分又は溶解した細胞以外の細胞由来成分（例えばタンパク質、抗体、抗原、低分子などの対象物質）に結合し、その濃度を光学測定より求めることができる。

　図１に、一実施形態に係る測定方法のフローチャートＳ１００を示す。
　微量血液が提供される（Ｓ１０１）。
　この微量血液を第一血液部分と第二血液部分とに分ける。あるいは、微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取り出してもよい（Ｓ１０２）。
　第一血液部分を用いて、非血球成分の一つ又は複数の要素を測定する（Ｓ１１１）。
　一方、第二血液部分を溶血させる（Ｓ１２１）。
　溶血された第二血液部分を用いて、血球成分の一つ又は複数の要素を測定する（Ｓ１２２）。

＜容量的な分離＞
　微量血液を第一血液部分と第二血液部分とに分ける工程（Ｓ１０２）は、微量血液を容量的に分注してもよい。いくつかの実施形態では、微量血液から、ピペッティング、ピペット操作、又は自動分注装置によって、第一血液部分と第二血液部分とを分注してもよい。微量血液の一部を、第二血液部分（又は第一血液部分）として分注し、それ以外の部分を、第一血液部分（又は第二血液部分）として用いてもよい。

　いくつかの実施形態では、微量血液に血清分離フィルタを通過させることを備えていてもよい。血清分離フィルタを通過した部分を、第一血液部分と定義してもよい。血清分離フィルタに残った又は捕捉された部分を、第二血液部分と定義してもよい。フィルタに捕捉された第二血液部分は、血球成分を含んでいてもよい。

＜フィルタを用いた分離＞
　図２に、血清分離フィルタを用いる一実施形態に係る測定方法のフローチャートＳ２００を示す。
　微量血液が提供される（Ｓ２０１）。
　この微量血液に血清分離フィルタを通過させる（Ｓ２０２）。血清分離フィルタは血球成分を捕捉する。血清分離フィルタを通過した部分は、血球成分を実質的に含んでおらず、すなわち実質的に非血球成分から構成されている。血清分離フィルタには液体成分が残るためここに非血球成分が残存していてもよい。このように、血清分離フィルタを用いて、血球成分を含まない血液部分（非血球成分、第一血球成分）を、血球成分（第二血球成分）から分離し、両方の成分を回収することができる。
　フィルタを通過した非血球成分（「第一血液部分」「フィルタ処理血清サンプル」と例示的に呼ぶ。）を用いて、非血球成分の要素を測定する（Ｓ２１１）。
　一方、溶血剤を血清分離フィルタに導入する（Ｓ２２１）。血清分離フィルタに捕捉された血球成分は、溶血剤と接触することにより、溶血する。
　溶血された血球成分の部分（第二血液部分）を用いて、血球成分の一つ又は複数の要素を測定する（Ｓ２２２）。

　いくつかの実施形態では、第二血液部分を捕捉している血清分離フィルタに、溶血剤を導入してもよい。いくつかの実施形態では、血清分離フィルタに捕捉された第二血液部分に溶血剤を接触させてもよい。これにより、第二血液部分を溶血させてもよい。

　本明細書で用いる「血清分離」は、「血液分離」、「血漿分離」、「血球分離」、「血漿又は血清分離」と交換可能に用いられる。本明細書で用いる「フィルタ」は一般に、「メンブレン」「膜」又はそれらの積層体と交換可能に用いられる。例えば、「血清分離フィルタ」は、「血球分離メンブレン」とは、特に指定がない限り、同じ意味を有する。血球分離フィルタは、血球成分を捕捉し、血清などの非血球成分をその外部に排出することがきる材料又は部材である。血球分離フィルタは、少なくとも赤血球を捕捉する能力を有していてもよい。血清分離フィルタは、細胞成分（赤血球、白血球、血小板）を捕捉する能力を有していてもよい。

　第一血液部分と第二血液部分とを容量的に分ける場合にも、溶血に、血清分離フィルタを用いてもよい。いくつかの実施形態では、ピペッティングで取得した第二血液部分に血清分離フィルタを通過させてもよい。さらに、第二血液部分を捕捉している前記血清分離フィルタに溶血剤を導入してもよい。いくつかの実施形態では、血清分離フィルタに捕捉された第二血液部分に溶血剤を接触させてもよい。これにより、第二血液部分を溶血させてもよい。

＜測定対象＞
　測定対象は、血球成分に関連する要素と、非血球成分に関連する要素とを含む。各測定対象は、現在知られている又は将来見つかった物質を含む。本開示で示す各要素又は物質は、例示であり、これらに限定して解釈されるべきではない。

　本開示の方法は、測定対象の濃度又は関連する値を求めることを更に備えていてもよい。例えば、サンプル又は溶液中の、アルブミン濃度、グリコアルブミン濃度、ＨｂＡ１ｃ濃度、ヘモグロビン濃度、グルコース濃度、１，５－ＡＧ濃度を求めてもよい。例えば、総アルブミン（ＡＬＢ）濃度と糖化アルブミン（ＧＡ）濃度とから比率（ＧＡ値、ＧＡ％）を求めてよい。例えば、総ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度と糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度とから比率（ＨｂＡ１ｃ値、ＨｂＡ１ｃ％）を求めてよい。

　非血球成分に関連して測定される要素（第一要素）は、ＧＡ、グルコース、及び１，５－ＡＧからなる群から選択されてもよい。非血球成分に関連して測定される要素（第一要素）は、例えば非限定的に以下を含み、それらから選択されてもよい：
　総蛋白（ＴＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（γ－ＧＴ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ＣＫ－ＭＢ活性、アミラーゼ（ＡＭＹ）、膵リパーゼ（ＬＩＰ）、尿酸（ＵＡ）、総コレステロール（Ｔ－ＣＨＯ）、中性脂肪（ＴＧ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）などの生化学検査関連物質；
　ビタミン関連物質；
　カルシウム、カリウム、マグネシウムなどの電解質・血液ガス関連物質；
　総ビリルビンなどの生体色素関連物質；
　毒物・産業医学的代謝物質；
　抗菌薬、抗てんかん薬、免疫抑制薬、循環器用薬、精神神経用薬、その他薬物；
　フィブリノーゲン（ＦＩＢ）、Ｄダイマーなどの凝固・線溶検査関連物質、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチゾール、副腎髄質ホルモン、性腺ホルモン、インスリンなどのホルモン及び結合タンパク質；
　ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ末端フラグメント（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）などの内分泌学的関連物質；
　前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの腫瘍マーカ関連物質；
　ＣＲＰなどの炎症関連物質；
　肝炎ウイルス（Ｂ型、Ｃ型）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、その他各種ウイルス；
　カンジダ抗体などの感染症関連物質；
　自己免疫検査関連物質；
　免疫血液学的検査関連物質；
　各種免疫グロブリン；
　各種サイトカイン；
　アレルギー検査関連物質；
　各種アミノ酸； 
　自己抗体検査関連物質；及び
　インスリン、ケトン体、３－ヒドロキシ酪酸、乳酸、酸化型アルブミン、還元型アルブミンなど。

　血球成分に関連して測定される要素（第二要素）は、ＨｂＡ１ｃであってもよい。第二要素は、例えば非限定的に、赤血球由来の各種タンパク質、抗原、抗体、低分子などであってもよい。血球成分に関連して測定される要素（第二要素）は、例えば非限定的に、ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤血球クレアチン，グルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）などであってもよい。

＜２．測定システム＞
　本開示は、本明細書に開示する測定方法を実施するための装置、デバイス、又はシステムを提供する。いくつかの実施形態では、流路デバイスが提供される。いくつかの実施形態では、自動分析装置に用いられるピペットカートリッジが提供される。本開示の装置などは、これらに限定されず、他のものであってもよい。

＜実施形態１：流路デバイス＞
　図３に、ＧＡ％とＨｂＡ１ｃ％との両方を測定することができる装置又はデバイス１００のブロックを示す。このような装置は、据え置き型装置、デスクトップ型装置、ハンドヘルド型装置、流路デバイスなどであってもよい。

　デバイス１００は、希釈液タンク１０２、フィルタ部１０４、第一血液部分測定部１１０、及び第二血液部分測定部１２０を備えている。デバイス１００は、フィルタ部１０４の後に流路を第一血液部分測定部１１０と第二血液部分測定部１２０との間で流路を切り替える弁１０５を備えている。

　図３に示すデバイス１００は、溶血剤を収容する溶血剤タンク１０３を備えている。図３では、溶血剤タンク１０３は、希釈液タンク１０２の上流側に配置されているが、他の位置に配置されていてもよい。

　図３に示すデバイス１００は、更に廃液タンク１３０を備え、第一血液部分測定部１１０と第二血液部分測定部１２０とから排出される液体を収集する。これにより安全に廃液処理を行うことができる。

　第一血液部分測定部１１０は、ＧＡ％を測定するように構成されている。第一血液部分測定部１１０は、総アルブミンの量を測定する総ＡＬＢ測定部１１１とＧＡ測定部１１２とを備えている。これらは流体的に直列に配置されてもよく、並列に配置されていてもよい。

　第二血液部分測定部１２０は、ＨｂＡ１ｃ％を測定するように構成されている。第二血液部分測定部１２０は、総ヘモグロビンの量を測定する総Ｈｂ測定部１２１とＨｂＡ１ｃ測定部１２２とを備えている。これらは流体的に直列に配置されてもよく、並列に配置されていてもよい。

　サンプル溶液である血液は、サンプル溶液デバイス１０１から、希釈液タンク１０２に導入され、フィルタ部１０４を通過する。弁１０５は、フィルタ処理が行われた第一血液部分（非血球成分）を第一血液部分測定部１１０にガイドする。非血球成分の内の総アルブミン量とＧＡ量が、総ＡＬＢ測定部１１１とＧＡ測定部１１２とでそれぞれ測定される。測定されたＧＡ量と総アルブミン量の除からＧＡ％を求める。

　次にデバイス１００は、溶血剤タンク１０３から溶血剤をフィルタ部１０４に導入する。フィルタ部１０４に捕捉された血球成分は溶血する。この段階で、弁１０５は、フィルタ部１０４で溶血された第二血液部分（血球成分）を第二血液部分測定部１２０にガイドする。血球成分の内の総ヘモグロビン量とＨｂＡ１ｃ量が、総Ｈｂ測定部１２１とＨｂＡ１ｃ測定部１２２とでそれぞれ測定される。測定されたＨｂＡ１ｃ量と総Ｈｂ量の除からＨｂＡ１ｃ％を求める。

　デバイス１００は、これらの送液を行う又は制御することができる送液システムを備えていてもよい。

＜実施形態２：自動分注装置＞
　図４Ａに、一実施形態に係るピペットカートリッジ２００を示す。ピペットカートリッジ２００は、ウェルａからｊとＧＡセンサｓとを有し、ＧＡ値とＨｂＡ１ｃ値との両方を測定することができる。

　ウェルａ及びｂは、当初空である。ウェルｂには、血清分離フィルタ（以降単にフィルタと呼ぶ。）１１が、取り外し可能に載置されている。ウェルｃからウェルｈは、それぞれ、（ｃ）希釈液、（ｄ）溶血剤として精製水、（ｅ）ＢＣＰ溶液、（ｆ）プロテアーゼ溶液、（ｇ）Ｈｂ用の変性剤とＨｂＡ１ｃ測定のための発色剤、プロテアーゼの混合溶液、及び（ｈ）酸化酵素（ＦＰＯＸ）とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含むＨｂＡ１ｃ測定試薬を収容している。ウェルｉ及びｊは、（ｉ）アルブミンの光学測定用ウェル及び（ｊ）ＨｂＡ１ｃの光学測定用ウェルである。ウェルｉ及びｊのそれぞれに、測定用の光学系が設置されていて、入射光と出力光の強度の差を吸光度として計測することができる。

　ＧＡセンサｓは、過酸化水素電極を備え、その電極上にはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）膜が形成されている。ペプチド断片がＦＡＯＤと反応し、過酸化水素が発生する。過酸化水素電極は、発生した過酸化水素を測定することができる。

　以下、図４Ｂから図４Ｉを用いて、測定手順を説明する。ただし、ピペットカートリッジの構成、用いる溶液及び試薬の種類、数および量、測定方法及び手順などは、例示であり、本発明はこれに限定して解釈されるべきでなく、他の実施形態、態様であってもよい。

　まず、採取又は提供された全血試料を、ウェルｃに添加し、希釈液と混合する。（図４Ｂ）

　血液希釈液を、フィルタ１１を通し、フィルタを通過した非血球成分（血漿又は血清）がウェルｂ内で回収される。この際、血球成分はフィルタ１１によって捕捉される。（図４Ｃ）

　フィルタ１１を、ウェルｂから取り外しウェルａに載置する。溶血剤を、ウェルｄから取り、ウェルａに載置されたフィルタ１１に添加する。これにより、フィルタ１１に捕捉された赤血球が溶血し、溶血成分は、ウェルａ内に回収される。（図４Ｄ）

　非血球成分の一部を、ウェルｂから取り、ＡＬＢ光学測定用のウェルｉに入れる。ウェルｅのＢＣＰ溶液をウェルｉに入れ、非血球成分と混合させる。ＢＣＰはアルブミンと結合する。このＢＣＰに対して光学測定を行うことで、試料のアルブミン濃度を求める。（図４Ｅ）

　非血球成分の残りを、ウェルｂから取り、ウェルｆに入れ、プロテアーゼ溶液と混合させる。これにより、プロテアーゼによってアルブミンは分解される。この際、通常ウェルｆ内の溶液を熱すると、この消化反応が促進される。これにより、アルブミンのペプチド断片が生成される。（図４Ｆ）

　アルブミンのペプチド断片を含む溶液を、ウェルｆから取り、センサｓに導入する。ペプチド断片とＦＡＯＤ膜との反応により過酸化水素が生じる。この過酸化水素と電極との酸化還元反応が電気信号に変換される。センサｓはこの電気信号を出力する。これにより、試料内のＧＡ濃度を求めることができる。（図４Ｇ）

　溶血成分を、ウェルａから取り、光学測定ウェルｊに入れる。Ｈｂ用の変性剤とＡ１ｃ測定のための発色剤、プロテアーゼとの混合溶液を、ウェルｇから取り、光学測定ウェルｊに入れ、溶血成分と混合させる。これにより、変性剤が、溶血成分内のヘモグロビンを変性させる。変性したヘモグロビンの吸光度を測定することによって、試料内の総ヘモグロビン濃度を求めることができる。同時に、プロテアーゼが変性ヘモグロビンを分解し、糖化ジペプチドが生成される。（図４Ｈ）

　ＨｂＡ１ｃ測定試薬を、ウェルｈから取り、光学測定ウェルｊに入れる。糖化ジペプチドと酸化酵素との反応で過酸化水素が発生する。その過酸化水素によって、ＰＯＤ存在下で発色剤からメチレンブルーが生成される。この発色吸光度を測定することによって、試料内の糖化ヘモグロビン濃度を求めることができる。（図４Ｉ）

　いくつかの実施形態では、センサｓの代わりに光学ウェルを設け、発色試薬などの光学試薬を用いて、ＧＡ濃度を光学的に測定してもよい。

＜３．実施例＞

＜実施例１：フィルタ処理を介したＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）の測定＞
　測定サンプルとして、１１人の健常者から指頭血を採取した。ランセット（ニプロＬＳランセット、ニプロ株式会社）を用いて指頭に血液ドロップレットを形成させ、マイクロピペットを用いて、ここから１０μＬの血液を採取した。採取した血液に４０μＬの希釈用緩衝液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を混合し、５０μＬの希釈液を準備した。

　この希釈液に血液分離フィルタを通過させ、指頭血フィルタ処理血清サンプルを回収した。その後、血液分離フィルタに溶血液として８０μＬの超純水を添加した。このとき、血液分離フィルタを通過した溶血液は、赤色を示した。これにより溶血が確認された。この指頭血フィルタ処理溶血サンプルを回収した。

　ＧＡ（％）は、２μＬのフィルタ処理血清サンプルを用いて、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（株式会社島津製作所）を用いて測定した。一方、ＨｂＡ１ｃ（％）は、糖尿病検査項目自動分析装置ＤＭ－ＪＡＣＫ　Ｅｘ＋（ミナリスメディカル株式会社）と酵素法を測定原理とするＨｂＡ１ｃ測定試薬（メタボリードＨｂＡ１ｃ、ミナリスメディカル株式会社）とを用いて測定した。

　比較例として、同じ１１人の健常者から採取した静脈血を遠心処理した。この静脈血遠心処理サンプルの血清成分を用いて、指頭血と同様の方法で、ＧＡ（％）を測定した。また、同じ静脈血遠心処理サンプルの血球層を用いて、指頭血と同様の方法で、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定した。

　図５Ａに、指頭血フィルタ処理血清サンプルでのＧＡ（％）と静脈血遠心分離血清サンプルでのＧＡ（％）との間の関係を示す。両者は非常に強い正の相関関係を有していた（ｙ＝０．９９２ｘ－０．２３８、相関係数Ｒ＝１．０００）。この結果は、フィルタ処理によって得られた微量血血清を用いて、静脈血を用いた場合と同様のＧＡ（％）測定が可能であることを示唆している。

　次に、図５Ｂに、指頭血フィルタ処理溶血サンプルのＨｂＡ１ｃ（％）と静脈血サンプルのＨｂＡ１ｃ（％）との間の関係を示す。両者は非常に強い正の相関関係を有していた（ｙ＝０．９５５ｘ＋０．０３４、相関係数Ｒ＝０．９２２）。この結果は、静脈血を用いた場合と同様に、フィルタ処理後の血液分離フィルタに残る微量血血球成分由来の溶血サンプルを用いて、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定することが可能であることを示唆している。

　したがって、同じ微量血液から、静脈血を用いた場合と同様に、血液中のＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）との両方を求めることができることが明らかとなった。

＜実施例２：フィルタ処理を介さないＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）との測定＞
　測定サンプルとして、１２人の健常者から指頭血を採取した。実施例１と同様に、指頭血を採取し、希釈液を準備した。

　このうち、２６μＬの希釈液を取り、血液分離フィルタを通過させ、指頭血フィルタ処理血清サンプルを回収した。フィルタ処理に用いなかった２４μＬの希釈液に対し、１２０μＬの溶血液（超純水）を添加し混合した。このとき、混合溶血液は、赤色を示した。これにより溶血が確認された。この指頭血未フィルタ処理溶血サンプルを回収した。

　ＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）とは、いずれも実施例１と同様に測定した。

　比較例として、同じ１２人の健常者から採取した静脈血を遠心処理した。この遠心処理静脈血を用いて、同様の方法で、ＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）とを測定した。

　指頭血フィルタ処理血清サンプルでのＧＡ（％）と静脈血遠心分離血清サンプルでのＧＡ（％）との間の関係は、図５Ａと同様の非常に強い正の相関関係を有していた（不図示）。

　次に、図６に、指頭血未フィルタ処理溶血サンプルのＨｂＡ１ｃ（％）と遠心分離静脈血サンプルのＨｂＡ１ｃ（％）との間の関係を示す。両者は非常に強い正の相関関係を有していた（ｙ＝０．８３０ｘ＋０．８２４、Ｒ＝０．９１６）。この結果は、フィルタ処理をしていない、微量血血球成分由来の溶血サンプルを用いた時においても、フィルタ処理後の血液分離フィルタに残る微量血血球成分由来の溶血サンプルを用いた場合と同様に、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定することが可能であることを示唆している。

＜実施例３：フィルタ処理血清サンプルを用いたその他のバイオマーカの測定―１＞
　フィルタ処理血清サンプルを用いた、血中グルコースの測定を検証した。

　実施例１と同様に、測定サンプルとして、１０人の健常者から指頭血を採取し、希釈液を準備した。その後、実施例１と同様に、指頭血フィルタ処理血清サンプルを回収した。

　血中グルコースは、５μＬのフィルタ処理血清サンプルを用いて、糖尿病検査項目自動分析装置ＤＭ－ＪＡＣＫ　Ｅｘ＋（ミナリスメディカル株式会社）と酵素法を測定原理とするグルコース試薬（デタミナーＬ　ＧＬＵ　ＨＫ、ミナリスメディカル株式会社）とを用いて測定した。

　比較例として、同じ１０人の健常者から指頭血と同じタイミングで採取した静脈血を遠心処理した後、血清を回収した。同様の方法で、血中グルコースを測定した。

　図７に、指頭血フィルタ処理血清サンプルでの血中グルコース濃度と静脈血遠心分離血清サンプルでの血中グルコース濃度との間の関係を示す。両者は非常に強い正の相関関係を有していた（ｙ＝０．１７５ｘ－０．５５０、相関係数Ｒ＝０．９８１）。

　したがって、微量血液から、ＧＡ（％）だけでなく、血中グルコースなどの種々のバイオマーカの値を求めることが可能であることが明らかとなった。

＜実施例４：フィルタ処理血清サンプルを用いたその他のバイオマーカの測定―２＞
　フィルタ処理血清サンプルを用いて、１，５－ＡＧの測定を検証した。

　実施例１と同様に、測定サンプルとして、７人の健常者から指頭血を採取し、希釈液を準備した。その後、実施例１と同様に、指頭血フィルタ処理血清サンプルを回収した。

　１，５－ＡＧは、８μＬのフィルタ処理血清サンプルを用いて、糖尿病検査項目自動分析装置ＤＭ－ＪＡＣＫ　Ｅｘ＋（ミナリスメディカル株式会社）と酵素法を測定原理とする１，５－ＡＧ測定試薬（デタミナーＬ　１，５－ＡＧ、ミナリスメディカル株式会社）とを用いて測定した。

　比較例として、同じ７人の健常者から指頭血と同じタイミングで採取した静脈血を遠心処理した後、血清を回収した。同様の方法で、１，５－ＡＧを測定した。

　図８に、指頭血フィルタ処理血清サンプルでの１，５－ＡＧ濃度と静脈血遠心分離血清サンプルでの１，５－ＡＧ濃度を比較した結果を示す。両者は非常に強い正の相関関係を有していた（ｙ＝０．１１７ｘ－０．９２７、相関係数Ｒ＝０．９４７）。

　したがって、微量血液から、ＧＡ（％）だけでなく、１，５－ＡＧなどの種々のバイオマーカの値を求めることが可能であることが明らかとなった。

＜実施例５：ＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）の測定；異なるＧＡ（％）測定方法の検証＞
　実施例１と同様に、測定サンプルとして、７人の健常者から指頭血を採取し、希釈液を準備した。その後、実施例１と同様に、指頭血フィルタ処理血清サンプルを回収した。

　ＧＡ（％）は、糖尿病検査項目自動分析装置ＤＭ－ＪＡＣＫ　Ｅｘ＋（ミナリスメディカル株式会社）と酵素法を測定原理とするＧＡ（％）測定試薬（ルシカＧＡ－Ｌ、旭化成ファーマ株式会社）を用いて測定した。

　比較例として、同じ７人の健常者から採取した静脈血を遠心処理し、血清を回収した。この血清サンプル（静脈血遠心分離血清サンプル）を用いて、同様の方法で、ＧＡ（％）を測定した。

　図９に、酵素法を用いて測定した、指頭血フィルタ処理血清サンプルのＧＡ（％）と静脈血由来血清サンプルのＧＡ（％）との間の関係を示す。両者は非常に強い正の相関関係を有していた（ｙ＝１．００７ｘ＋０．１１９、相関係数Ｒ＝０．９７８）。

　この結果は、酵素法による測定においても、指頭血フィルタ処理血清サンプルを用いた測定が可能であることを示唆しており、両サンプルを取得することにより、ＧＡ（％）とＨｂＡ１ｃ（％）との両方を同時に測定することが可能であることを示唆している。

　本開示は、以下の実施形態を含む：
Ａ００１
　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法であって、
　微量血液を提供すること；
　前記微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得すること；
　前記第一血液部分中の非血球成分に関連する第一要素を測定すること；
　前記第二血液部分を溶血させること；及び
　前記溶血後の前記第二血液部分中の血球成分に関連する第二要素を測定することを備える、
方法。
Ａ００２
　Ａ００１に記載の方法であって、
　前記微量血液を提供することは、微量血液を希釈することを含む、
方法。
Ａ００１ｂ
　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法であって、
　微量血液を希釈すること（微量血液の希釈液を提供すること）；
　前記微量血液の希釈液から、第一血液部分（第一希釈液部分）と第二血液部分（第二希釈液部分）とを取得すること；
　前記第一血液部分（第一希釈液部分）中の非血球成分に関連する第一要素を測定すること；
　前記第二血液部分（第二希釈液部分）を溶血させること；及び
　前記溶血後の前記第二血液部分（第二希釈液部分）中の血球成分に関連する第二要素を測定することを備える、
方法。
Ａ０１１
　Ａ００１又はＡ００２に記載の方法であって、
　前記微量血液は５０μＬ以下である、
方法。
Ａ０１２
　Ａ００１又はＡ００２に記載の方法であって、
　前記微量血液は１０μＬ以下である、
方法。
Ａ０１３
　Ａ００１又はＡ００２に記載の方法であって、
　前記微量血液は５μＬ以下である、
方法。
Ａ０２１
　Ａ００１からＡ０１２のいずれか一項に記載の方法であって、
　前記微量血液は毛細管血である、
方法。
Ａ０２２
　Ａ００１からＡ０２１のいずれか一項に記載の方法であって、
　前記微量血液は指頭血である、
方法。
Ａ０３１
　Ａ００１からＡ０２２のいずれか一項に記載の方法であって、
　前記微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得することは、前記微量血液に血清分離フィルタを通過させることを含み、
　前記第一血液部分は、前記血清分離フィルタを通過した部分であり、
　前記第二血液部分は、前記血清分離フィルタに残った又は捕捉された部分である、
方法。
Ａ０３２
　Ａ０３１に記載の方法であって、
　前記第二血液部分を溶血させることは、前記第二血液部分を捕捉している前記血清分離フィルタに溶血剤を導入すること、又は前記血清分離フィルタに捕捉されている前記第二血液部分を溶血剤と接触させることを含む、
方法。
Ａ０４１
　Ａ００１からＡ０２２のいずれか一項に記載の方法であって、
　前記微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得することは、
　前記微量血液の一部を、前記第二血液部分として分注すること；及び
　それ以外の部分を、前記第一血液部分として用いることを含む、
方法。
Ａ０４２
　Ａ００４１に記載の方法であって、
　前記第二血液部分を溶血させることは、前記第二血液部分に血清分離フィルタを通過させ、前記第二血液部分を捕捉している前記血清分離フィルタに溶血剤を導入することを含む、
方法。
Ａ０５１
　Ａ００１からＡ０４２のいずれか一項に記載の方法であって、
　前記非血球成分に関連する前記第一要素は、ＧＡ、グルコース、及び１，５－ＡＧからなる群から選択される物質（に関する値）である、
方法。
Ａ０６１
　Ａ００１からＡ０５１のいずれか一項に記載の方法であって、
　前記血球成分に関連する前記第二要素は、ＨｂＡ１ｃ（に関する値）である、
方法。
Ｂ００１
　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する装置又はデバイスであって、
　血液導入部；
　導入された血液から血球成分を分離する能力を有するフィルタ；
　前記フィルタを通過した非血球成分の要素を測定する第一血液部分測定部：
　前記フィルタに捕捉された血球成分を溶血させるための溶血剤を収容する溶液剤タンク；
　前記フィルタで溶血したことにより得られた血球成分の要素を測定する第二血液部分測定部；及び
　送液システムを備える、
装置又はデバイス。
Ｂ０１１
　Ｂ００１に記載の装置又はデバイスであって、
　前記第一血液部分測定部及び／又は第二血液部分測定部から排出される液体を収容する廃液タンクを更に備える、
装置又はデバイス。
Ｂ０２１
　Ｂ００１又はＢ０１１に記載の装置又はデバイスであって、
　前記第一血液部分測定部は、ＧＡ％、グルコース値、及び１，５－ＡＧ値の少なくとも一つを求めるように構成され、
　前記第二血液部分測定部は、ＨｂＡ１ｃ％を求めるように構成された、
装置又はデバイス。
Ｂ０２２
　Ｂ００１からＢ０２１のいずれか一項に記載の装置又はデバイスであって、
　前記第一血液部分測定部は、ＧＡ％を求めるように構成され、総アルブミン測定部及びＧＡ測定部を備える、
装置又はデバイス。
Ｂ１０１
　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定するために自動分注装置に用いられるピペットカートリッジであって、
　（ａ）フィルタが載置されるように構成され、第一血球成分（非血球成分）を受け入れるウェル；
　（ｂ）フィルタが載置されるように構成され、第二血球成分（血球成分）を受け入れるウェル；
　（ｃ）希釈液を収容している希釈液ウェル；
　（ｄ）溶血剤を収容している溶血剤収容ウェル、もしくは溶血剤ウェル；
　（ｅ／ｆ）第一血球成分の要素の測定用試薬を収容している第一試薬ウェル；
　（ｇ／ｈ）第二血球成分の要素の測定用試薬を収容している第二試薬ウェル；
　（ｉ）第一血球成分の要素を測定するための光学測定用ウェル；及び
　（ｊ）第二血球成分の要素を測定するための光学測定用ウェルを備える、
ピペットカートリッジ。
Ｂ１１１
　Ｂ１０１に記載のピペットカートリッジであって、
　前記非血球成分の要素は、ＧＡ、グルコース、及び１，５－ＡＧからなる群から選ばれる物質であって、
　前記血球成分の要素は、ＨｂＡ１ｃである、
ピペットカートリッジ。
Ｂ１２１
　Ｂ１１１に記載のピペットカートリッジであって、
　前記非血球成分の要素は、ＧＡである、
ピペットカートリッジ。
Ｂ１２２
　Ｂ１２１に記載のピペットカートリッジであって、
　第一血球成分の要素の測定用試薬を収容している前記第一試薬ウェルは、
　（ｅ）ＢＣＰ溶液を収容しているＢＣＰ溶液ウェル；及び
　（ｆ）プロテアーゼ溶液を収容しているプロテアーゼ溶液ウェルを備え、
　第二血球成分の要素の測定用試薬を収容している第二試薬ウェル；
　（ｇ）Ｈｂ用の変性剤とＨｂＡ１ｃ測定のための発色剤との混合溶液を収容する第一ＨｂＡ１ｃ試薬ウェル；及び
　（ｈ）プロテアーゼと酸化酵素（ＦＰＯＸ）とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を収容する第二ＨｂＡ１ｃ試薬ウェルを備える、
ピペットカートリッジ。
Ｂ１３１
　Ｂ１０１からＢ１２２のいずれか一項に記載のピペットカートリッジであって、
　（ｓ）電気化学センサを更に備える、
ピペットカートリッジ。
Ｂ１３２
　Ｂ１３１に記載のピペットカートリッジであって、
　（ｓ）前記電気化学センサは、過酸化水素電極とその上に配置されたＦＡＯＤ膜とを備える、
ピペットカートリッジ。

　以上、本開示の幾つかの実施形態及び実施例について説明したが、これらの実施形態及び実施例は、本開示を例示的に説明するものである。例えば、上記各実施形態は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必要に応じて寸法、構成、材質、回路を追加変更してもよい。なお、上記に挙げた本開示の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた実施形態も本開示の範囲に含まれる。特許請求の範囲は、本開示の技術的思想から逸脱することのない範囲で、実施形態に対する多数の変形形態を包括するものである。したがって、本明細書に開示された実施形態及び実施例は、例示のために示されたものであり、本開示の範囲を限定するものと考えるべきではない。

 

Claims (22)

1. 　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する方法であって、
   　微量血液を提供すること；
   　前記微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得すること；
   　前記第一血液部分中の非血球成分に関連する第一要素を測定すること；
   　前記第二血液部分を溶血させること；及び
   　前記溶血後の前記第二血液部分中の血球成分に関連する第二要素を測定することを備える、
   方法。
2. 　請求項１に記載の方法であって、
   　前記微量血液を提供することは、微量血液を希釈することを含む、
   方法。
3. 　請求項１又は２に記載の方法であって、
   　前記微量血液は１０μＬ以下である、
   方法。
4. 　請求項１又は２に記載の方法であって、
   　前記微量血液は５μＬ以下である、
   方法。
5. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の方法であって、
   　前記微量血液は毛細管血である、
   方法。
6. 　請求項１から４のいずれか一項に記載の方法であって、
   　前記微量血液は指頭血である、
   方法。
7. 　請求項１から６のいずれか一項に記載の方法であって、
   　前記微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得することは、前記微量血液に血清分離フィルタを通過させることを含み、
   　前記第一血液部分は、前記血清分離フィルタを通過した部分であり、
   　前記第二血液部分は、前記血清分離フィルタに残った又は捕捉された部分である、
   方法。
8. 　請求項７に記載の方法であって、
   　前記第二血液部分を溶血させることは、前記第二血液部分を捕捉している前記血清血漿分離フィルタに溶血剤を導入すること、又は前記血清分離フィルタに捕捉されている前記第二血液部分を溶血剤と接触させることを含む、
   方法。
9. 　請求項１から６のいずれか一項に記載の方法であって、
   　前記微量血液から、第一血液部分と第二血液部分とを取得することは、
   　前記微量血液の一部を、前記第二血液部分として分注すること；及び
   　それ以外の部分を、前記第一血液部分として用いることを含む、
   方法。
10. 　請求項９に記載の方法であって、
    　前記第二血液部分を溶血させることは、前記第二血液部分に血清分離フィルタを通過させ、前記第二血液部分を捕捉している前記血清分離フィルタに溶血剤を導入することを含む、
    方法。
11. 　請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
    　前記非血球成分に関連する前記第一要素は、ＧＡ、グルコース、及び１，５－ＡＧからなる群から選択される物質である、
    方法。
12. 　請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法であって、
    　前記血球成分に関連する前記第二要素は、ＨｂＡ１ｃである、
    方法。
13. 　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定する装置であって、
    　血液導入部；
    　導入された血液から血球成分を分離する能力を有するフィルタ；
    　前記フィルタを通過した非血球成分の要素を測定する第一血液部分測定部；
    　前記フィルタに捕捉された血球成分を溶血させるための溶血剤を収容する溶液剤タンク；
    　前記フィルタで溶血したことにより得られた血球成分の要素を測定する第二血液部分測定部；及び
    　送液システムを備える、
    装置。
14. 　請求項１３に記載の装置であって、
    　前記第一血液部分測定部及び／又は第二血液部分測定部から排出される液体を収容する廃液タンクを更に備える、
    装置。
15. 　請求項１３又は１４に記載の装置であって、
    　前記第一血液部分測定部は、ＧＡ％、グルコース濃度、及び１，５－ＡＧ濃度の少なくとも一つを求めるように構成され、
    　前記第二血液部分測定部は、ＨｂＡ１ｃ％を求めるように構成された、
    装置。
16. 　請求項１３から１５のいずれか一項に記載の装置又はデバイスであって、
    　前記第一血液部分測定部は、ＧＡ％を求めるように構成され、総アルブミン測定部及びＧＡ測定部を備える、
    装置。
17. 　微量血液内の血球成分の要素と非血球成分の要素とを測定するために自動分注装置に用いられるピペットカートリッジであって、
    　（ａ）フィルタが載置されるように構成され、第一血球成分（非血球成分）を受け入れるウェル；
    　（ｂ）フィルタが載置されるように構成され、第二血球成分（血球成分）を受け入れるウェル；
    　（ｃ）希釈液を収容している希釈液ウェル；
    　（ｄ）溶血剤を収容している溶血剤収容ウェル、もしくは溶血剤ウェル；
    　（ｅ／ｆ）第一血球成分の要素の測定用試薬を収容している第一試薬ウェル；
    　（ｇ／ｈ）第二血球成分の要素の測定用試薬を収容している第二試薬ウェル；
    　（ｉ）第一血球成分の要素を測定するための光学測定用ウェル；及び
    　（ｊ）第二血球成分の要素を測定するための光学測定用ウェルを備える、
    ピペットカートリッジ。
18. 　請求項１７に記載のピペットカートリッジであって、
    　前記非血球成分の要素は、ＧＡ、グルコース、及び１，５－ＡＧからなる群から選ばれる物質であって
    　前記血球成分の要素は、ＨｂＡ１ｃである、
    ピペットカートリッジ。
19. 　請求項１８に記載のピペットカートリッジであって、
    　前記非血球成分の要素は、ＧＡである、
    ピペットカートリッジ。
20. 　請求項１９に記載のピペットカートリッジであって、
    　第一血球成分の要素の測定用試薬を収容している前記第一試薬ウェルは、
    　（ｅ）ＢＣＰ溶液を収容しているＢＣＰ溶液ウェル；及び
    　（ｆ）プロテアーゼ溶液を収容しているプロテアーゼ溶液ウェルを備え、
    　第二血球成分の要素の測定用試薬を収容している第二試薬ウェル；
    　（ｇ）Ｈｂ用の変性剤とＨｂＡ１ｃ測定のための発色剤との混合溶液を収容する第一ＨｂＡ１ｃ試薬ウェル；及び
    　（ｈ）プロテアーゼと酸化酵素（ＦＰＯＸ）とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を収容する第二ＨｂＡ１ｃ試薬ウェルを備える、
    ピペットカートリッジ。
21. 　請求項１７から２０のいずれか一項に記載のピペットカートリッジであって、
    　（ｓ）電気化学センサを更に備える、
    ピペットカートリッジ。
22. 　請求項２１に記載のピペットカートリッジであって、
    　（ｓ）前記電気化学センサは、過酸化水素電極とその上に配置されたＦＡＯＤ膜とを備える、
    ピペットカートリッジ。
    
     

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