WO2023121254A1 - 인터류킨-2 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

인터류킨-2 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2023121254A1
WO2023121254A1 PCT/KR2022/020885 KR2022020885W WO2023121254A1 WO 2023121254 A1 WO2023121254 A1 WO 2023121254A1 KR 2022020885 W KR2022020885 W KR 2022020885W WO 2023121254 A1 WO2023121254 A1 WO 2023121254A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
amino acid
fusion protein
chain
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/020885
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
류성언
김소희
김명빈
강지안
박흥록
배동구
이광현
박수봉
최은주
윤소라
김수윤
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
주식회사 지뉴브
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 산학협력단, 주식회사 지뉴브 filed Critical 한양대학교 산학협력단
Publication of WO2023121254A1 publication Critical patent/WO2023121254A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons

Definitions

  • interleukin-2 IL-2
  • IL-2 interleukin-2
  • target anticancer drugs that inhibit signals involved in cancer development
  • anti-CTLA4 and anti-CTLA4 -Immune Checkpoint Inhibitors ICIs
  • PD-(L)1 PD-(L)1
  • ORR objective response rate
  • CR complete response rate
  • An object of the present invention is to provide an IL-2 fusion protein capable of inhibiting the proliferation of regulatory T cells (Treg) and selectively activating only effector T cells (Teff).
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the IL-2 fusion protein.
  • FIG. 7 is an SDS-PAGE result (reduced) of the IL-2/IL-2Ra Fc fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • 21 shows the results of an experiment for confirming the binding ability of Fc-IL-2R ⁇ mutant protein and Hetero Fc-IL-2 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Interleukin-2 is a cytokine that promotes the proliferation of T cells.
  • IL-2R ⁇ and IL-2R ⁇ are present on the surface of effector T cells (Teff) that enhance immunity
  • IL-2R ⁇ and IL-2R ⁇ are present on the surface of effector T cells (Teff) that suppress immunity. Since -2R ⁇ and IL-2R ⁇ exist and have a much higher affinity for IL-2, when IL-2 is administered to the human body, there is a problem that it acts in a direction of suppression rather than enhancement of immunity.
  • a fusion protein capable of strongly binding to effector T cells can be provided by linking the IL-2 protein and the IL-2Ra protein to the Fc region of an antibody, and the structure of each protein can be redesigned or mutations introduced to fusion proteins. It can improve the binding stability of proteins.
  • the IL-2/IL-2R ⁇ Fc fusion protein of the present invention is a structure in which an IL-2-derived protein and an IL-2R ⁇ -derived protein are linked to an Fc region, or a structure in which an IL-2-derived protein and an IL-2R ⁇ -derived protein are linked to an Fc region, or an IL-2-derived protein and IL-2R ⁇ -derived proteins may be linked to each chain of the Fc region.
  • each of the IL-2-derived protein and the IL-2R ⁇ -derived protein may be linked to each other through an amino acid linker or may not be covalently linked to each other.
  • IL-2 may contain a mutation in the amino acid sequence for structural stabilization of the IL-2/IL-2Ra complex.
  • a mutation for example, cysteine at position 125 of IL-2 may be changed to serine (C125S).
  • C125S serine
  • the N-terminal and C-terminal positions of IL-2 may be reversed to shorten the linker length.
  • IL-2R ⁇ protein or "IL-2R ⁇ -derived protein” refers to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a functional fragment thereof, an extracellular domain of IL-2R ⁇ protein, a Sushi domain, or a variant thereof. It is used in a meaning encompassing, but is not limited thereto.
  • “functional fragment” of the IL-2Ra protein means a part of the full-length IL-2Ra protein that retains the ability to bind to IL-2.
  • the IL-2-derived protein, the IL-2Ra-derived protein, or a complex protein linked to one or more of them may be linked to the N-terminus and/or C-terminus of the Fc region to form an Fc fusion protein.
  • the IL-2R ⁇ protein is formed between any two helix structures of helices A, B, C, and D of the IL-2 protein. may be linked.
  • the Fc region may refer to a region extending from residue 221 of a human IgG1 heavy chain to the C-terminus, or a region further including a hinge in the region.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region follows the EU numbering that defines the numbering of residues in human immunoglobulin heavy chains in the Kabat literature.
  • the chain including the amino acid substitution at K360 among the first Fc chain and the second Fc chain further comprises an amino acid substitution at Q347, or the amino acid substitution at Q347 among the first Fc chain and the second Fc chain
  • the comprising chain further comprises an amino acid substitution at K360, or the chain comprising an amino acid substitution at K360 among the first Fc chain and the second Fc chain further comprises an amino acid substitution at Q347, and the amino acid substitution at Q347
  • a chain containing substitutions may further contain an amino acid substitution at K360.
  • the heterodimeric Fc region comprises amino acid substitutions of T366W and Q347R in the first Fc chain, and the second amino acid substitutions of one or more of T366S, L368A and Y407V and amino acid substitutions of K360E in the Fc chain (“WRE mutations”).
  • the heterodimeric Fc region comprises amino acid substitutions of T366W, K360R and Q347R in the first Fc chain, amino acid substitutions of one or more of T366S, L368A and Y407V and amino acid substitutions of K360E and Q347E in the second Fc chain (“WRREE mutations”).
  • the heterodimeric Fc region comprises amino acid substitutions of T366W, K360E and Q347E in the first Fc chain, amino acid substitutions of one or more of T366S, L368A and Y407V and amino acid substitutions of K360R and Q347R in the second Fc chain (“WEERR mutations”).
  • the C125S mutation may be included in the IL-2 protein for structural stabilization of the protein.
  • the IL-2R ⁇ protein may include mutations that can improve protein solubility and production yield, such as the A114D mutation, in a region not involved in the interaction of the fusion protein with IL-2R ⁇ and IL-2R ⁇ .
  • the IL-2R ⁇ protein may contain mutations in one or more of F121A and V122A. That is, the IL-2R ⁇ protein may contain one or more mutations among A114D, F121A and V122A.
  • the fusion protein of the present invention may also introduce a mutation to increase affinity between IL-2 and IL-2Ra.
  • Increasing the affinity between IL-2 and IL-2R ⁇ within the structure of the fusion protein stabilizes the structure of the fusion protein and further lowers the possibility that IL-2 introduced into the fusion protein binds to IL-2R ⁇ expressing cells in the body.
  • it provides an advantage of improving manufacturing yield by promoting the formation of heterodimer Fc. For example, as shown in Tables 1 and 2 below, ionic binding or hydrophobic interaction between IL-2 and IL-2Ra by introducing mutations at sites where IL-2 and IL-2Ra residues interact with each other. affinity can be improved.
  • the interaction between IL-2 and IL-2R ⁇ , binding force, etc. may be increased, or the solubility and yield of the protein may be increased. It is preferable because it can improve the etc.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
  • a suitable dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be 0.001 to 100 mg/kg.
  • the synthesized DNA was amplified by chain enzyme polymerization (PCR) and cloned to contain human IgG1 Fc and histidine tags at the C-terminus using restriction enzyme and T4 DNA ligase.
  • PCR chain enzyme polymerization
  • the IL-2/IL-2Ra complex and Fc have a form linked by a (GS) 3 -linker.
  • the synthesized IL-2 DNA (Bioneer) was amplified through chain enzyme polymerization, the amplified DNA was cloned into the C-terminal portion of FcK using restriction enzyme and T4 DNA ligase. At this time, the C-terminal part of FcK and the new N-terminal part (Ser75) of IL-2 have a (GGGGS) 2 -linker linkage.
  • S39K mutant IL-2R ⁇ -Fc, L45R mutant IL-2R ⁇ -Fc, H120L mutant IL-2R ⁇ -Fc, and S39K+L45R+H120L mutant IL-2R ⁇ -Fc sequences designed in this Preparation Example are as follows.
  • affinity chromatography was performed using a Ni-NTA (Qiagen) column.
  • the protein prepared in Preparation Example 1-1 (b) was diluted to a level of 0.4 mg/ml in a reaction solution having a composition of 0.1M HEPES pH 7.5 and 150 mM NaCl, and then mixed with a diluted fluorescent dye solution. 20 ⁇ l of the mixed solution was dispensed into MicroAmp Optical 8-Tube Strip (Thermo Fisher Scientific) products. For real-time fluorescence measurement, the protein was reacted at 25 to 95 °C at a ramp rate of 1 °C/min using an Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). After the reaction was completed, the melting point was calculated from the inflection point of the melting curve obtained from the software of the device.
  • a disulfide-bridged knob-into-hole (KiHs-s) was used as the heterodimer Fc to which IL-2 and IL-2R ⁇ were linked, respectively.
  • a linker with an appropriate length was designed through structure-based modeling as shown in FIG.
  • wild-type homodimer Fc was coupled to the IL-2R ⁇ portion into which the mutation was introduced, and the IL-2 portion was designed to bind to only one chain of the heterodimer Fc.
  • An expression vector was constructed by fusing wild-type IL-2R ⁇ (Nos. 1 to 165 of SEQ ID NO: 2) to the C-terminus of Fc based on pcDNA3.1 (Invitrogen). As shown in Table 8, the gene sequence (SEQ ID NO: 15) was synthesized and inserted into pcDNA3.1 vector using BamH I and EcoR I restriction enzymes.
  • IL-2Ra mutants were prepared using the plasmid containing the Fc-IL-2Ra gene prepared above and a site-directed mutagenesis method.
  • the heterodimer Fc part used the WRE variant described in International Application No. PCT/KR2022/017565 of the present applicant.
  • the T366W/Q347R mutation was introduced into the first chain of human IgG1 Fc (Hetero FcA), and the K360E/T366S/L368A/Y407V mutation was introduced into the second chain (Hetero FcB).
  • Hetero FcA human IgG1 Fc
  • Hetero FcB the K360E/T366S/L368A/Y407V mutation was introduced into the second chain
  • a heterodimeric Fc-IL-2 protein was prepared in which IL-2 (C125S) was attached to the C-terminus of Hetero FcA.
  • the transfected cells were cultured in a carbon dioxide incubator to a cell viability of 75%, and then separated into a cell culture medium containing the recombinant protein and cells by centrifugation.
  • the column was washed sequentially with PBS (5 CV) and 50 mM NaOAc pH 5.2 (5 CV), and proteins were eluted using Elution buffer (0.1 M Glycine pH 3.0). The pH was changed to neutral by adding 1 M TrisHCl pH 8.5 buffer to a final concentration of 100 mM to the eluted protein. Then, the protein was concentrated to 0.5 mL using an Amicon tube (MWCO: 50 K).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 인터류킨-2(IL-2) 융합단백질, 특히 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은 항체의 Fc 영역에 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질이 연결된 형태를 가지며, 이로써 IL-2가 효과 T세포에 선택적으로 강하게 결합하도록 조절하여 면역 증진 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시 형태에 따라 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질에 돌연변이를 도입하는 경우, 융합단백질의 결합력 및 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 IL-2의 면역 증진 활성을 통해 효과를 기대할 수 있는 면역 질환 또는 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

인터류킨-2 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물
본 발명은 인터류킨-2(interleukin-2, IL-2) 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효과 T세포에 강하게 결합하여 면역을 효과적으로 증진시킬 수 있는 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
신세포암(renal cell carcinoma; RCC) 및 흑색종(melanoma)은 미국에서 흔한 암종으로서, 외과적 수술이 가능한 초기에는 예후가 좋은 편이지만, 수술이 불가능한 전이성 신세포암(mRCC) 및 전이성 흑색종(mM)의 경우 생존율이 매우 낮은 것으로 알려져 있다.
이러한 전이성 신세포암 및 전이성 흑색종과 관련하여, 1990년대에 인터류킨-2(IL-2)가 미국 FDA의 승인을 받았으며 이후 암발생에 관여하는 시그널을 억제하는 표적항암제들과 anti-CTLA4 및 anti-PD-(L)1와 같은 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitors; ICIs)가 치료제로 승인되었다.
인터류킨-2는 T세포의 증식과 활성화에 관여하는 필수 사이토카인(cytokine)으로, 이러한 작용을 통해 항암 효과를 나타낸다. 그러나 암 치료를 위한 IL-2 제제의 경우 고용량으로 인한 독성이 나타나 사용에 제한이 있다. 구체적으로, 현재 승인된 IL-2 (Proleukin®, aldesleukin)의 경우 치료 옵션이 없는 전이성 흑색종과 전이성 신세포암 환자에게서 높은 반응율(약 7 내지 9%의 CR)을 나타냈으나, 모세혈관 누출 증후군(capillary leak syndrome; CLS) 같은 부작용의 우려가 있어 투여대상 환자와 투여 가능한 양이 제한적이다.
임상에서는 면역관문억제제의 병용투여에 의해 객관적반응율(objective response rate; ORR) 및 완전관해율(complete response; CR)이 향상되는 것으로 보고되었으며, 이에 따라 병용투여에 따른 부작용을 줄이면서 이러한 ORR 및 CR의 개선 효과를 더욱 향상시킬 수 있는 새로운 병용투여 치료제에 대한 개발이 요구되고 있다.
최근 면역항암제가 표준 항암요법으로 자리 잡으면서 차세대 IL-2 약물을 둘러싼 경쟁이 다시 치열해지고 있으나, 개발된 차세대 IL-2 약물은 임상에서 효능이 미미하거나 병용요법에서의 반응율이 낮은 것으로 보고되었다. 예를 들어, IL-2에 페길화(pegylation)를 하여 분해속도를 늦추고 T세포 및 NK세포에 보다 편향적으로 작용하도록 하여 항암효과를 유도하는 시도가 있었지만, 페길화에 따라 T세포 및 NK세포에 대한 약물 활성이 높지 않고 면역반응을 억제하는 조절 T세포의 증식을 막기 위한 IL-2Rβγ 수용체 선택성 향상에 한계가 있다는 문제가 있다.
이와 같이, IL-2의 고유기능인 T세포 활성화는 면역항암제 개발로 매우 매력적인 타겟이지만, 부작용이 없는 항암효과 유도를 위해서는 조절 T세포(Treg)의 증식을 억제하고 효과 T세포(Teff)만을 활성화시키는 세포 선별성을 강화할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
[선행기술문헌]
Huang JJ, Hsieh JJ. The Therapeutic Landscape of Renal Cell Carcinoma: From the Dark Age to the Golden Age. Semin Nephrol. 2020 Jan;40(1):28-41
본 발명의 목적은 조절 T세포(Treg)의 증식을 억제하고 효과 T세포(Teff)만을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 IL-2 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IL-2/IL-2Rα와 항체 Fc 영역의 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 IL-2 융합단백질은 IL-2 단백질, 인터류킨-2 수용체 서브유니트 알파(IL-2Rα) 단백질 및 Fc 영역을 포함하고, 여기서 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질은 각각 상기 Fc 영역에 연결되어 있거나, 또는 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질이 서로 연결된 복합체가 상기 Fc 영역에 연결된 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질은 상기 Fc 영역이 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬을 포함하며, 상기 IL-2 단백질이 제1 Fc 사슬에 연결되어 있고, 상기 IL-2Rα 단백질이 제2 Fc 사슬에 연결될 수 있다. 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질은 서로 간에 공유결합으로 연결되어 있지 않은 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질은 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질 중 하나 이상이 항체의 Fc 영역에 연결되고, 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질 중 항체의 Fc 영역에 연결되지 않은 단백질은 상기 항체의 Fc 영역에 연결된 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질이 서로 연결된 복합체는 상기 IL-2Rα 단백질이 상기 IL-2 단백질의 나선구조(helix) A, B, C 및 D 중 어느 두 나선구조들 사이에 결합된 구조를 취할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질 중 하나 이상은 링커를 통해 Fc 영역에 연결될 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질 중 하나 이상은 각각 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 단백질은 야생형 IL-2의 아미노산 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, IL-2 단백질의 나선구조 중 하나 이상의 아미노산 서열, IL-2 단백질의 순환 치환체(circular permutation), 이들의 변이체, 또는 IL-2 작용제를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 번호를 기준으로 T37K 및 C125S 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2Rα 단백질은 야생형 IL-2Rα의 아미노산 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2Rα 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, IL-2Rα 단백질의 세포외 도메인, 스시(Sushi) 도메인, 또는 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2Rα 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 L2, M25, N27, S39, L42, L45, N57, I118, H120 및 K153 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2Rα 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 L2D, L2E, L2Q, M25L, M25I, N27A, N27T, N27I, N27Y, S39K, L42F, L42I, L42A, L42V, L45R, N57E, I118R, H120A, H120D, H120K, H120Y, H120L, H120W, H120R 및 K153G 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2Rα 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 A114D, F121A 및 V122A 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역은 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중 어느 한 사슬이 T366에서의 아미노산 치환을 포함하고, 다른 한 사슬이 T366, L368 및 Y407 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 번호는 KABAT 문헌의 EU 넘버링을 기준으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중, 어느 한 사슬이 K360에서의 아미노산 치환을 더 포함하고, 다른 한 사슬이 Q347에서의 아미노산 치환을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 융합단백질은 Fc 영역의 하나 이상의 사슬에 연결된 하나 이상의 결합 도메인 단백질 또는 약물을 더 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 융합단백질은 이중특이적 항체, 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체의 형태일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 IL-2 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 IL-2 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 제조방법은 IL-2 융합단백질을 코딩하는 1종 이상의 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 발현 벡터를 숙주 세포에서 발현시키고 단백질을 수득하여 융합단백질을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 IL-2 융합단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 암 예방 또는 치료용일 수 있으며, 구체적으로 전이성 흑색종 또는 신세포암종의 예방 또는 치료용일 수 있다.
본 발명의 IL-2 융합단백질은 항체의 Fc 영역에 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질이 연결된 형태를 가지며, 이로써 IL-2가 효과 T세포에 선택적으로 강하게 결합하도록 조절하여 면역 증진 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명을 이용하면 IL-2 투여 시 IL-2가 조절 T세포에 결합하여 면역이 억제되는 문제를 극복하고, IL-2를 이용한 효과적인 면역촉진제를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시 형태에 따라 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질을 재설계하고 돌연변이를 도입하는 경우, 융합단백질의 결합력 및 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 IL-2 융합단백질은 IL-2의 면역 증진 활성을 통해 효과를 기대할 수 있는 면역 질환 또는 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질과 수용체의 결합을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 구조에서 IL-2 및 IL-2Rα 단백질의 삼차구조를 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질의 서열 개략도(a) 및 단백질 3차 구조(b)를 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 서열 개략도(a) 및 단백질 3차 구조(b)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 대한 SDS-PAGE 결과(환원)이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질에서 FcK-IL-2(1열), FcH-IL-2Rα(2열) 및 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질(3열)에 대한 SDS-PAGE 결과(비환원)이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 IL-2-Fc와 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질의 ELISA 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 IL-2-Fc 융합단백질과 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 ELISA 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 대해 ELISA를 수행하고 야생형(WT)과 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 대해 ELISA를 수행하고 야생형(WT)과 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질에서 각 단백질(비환원)에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα의 일차 도함수 용해곡선을 IL-2-Fc와 비교하여 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 구조기반 모델링을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 이종이량체 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 이종이량체 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질의 EC50 확인 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 이종이량체 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 대해, IL-2Rαβγ subunit을 발현하는 CTLL2 세포와 IL-2Rβγ subunit만 발현하는 HH 세포에 대한 결합력을 IL-2와 비교하여 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-2Rα 돌연변이의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 20a 및 20b는 각각 본 발명의 제조예 4에서 제조되어 사용된 동종이량체 Fc-IL-2Rα(a) 및 이종이량체 Fc-IL-2(b)를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 Fc-IL-2Rα 돌연변이 단백질과 Hetero Fc-IL-2 단백질의 결합능 확인 실험 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 IL-2 융합단백질, 구체적으로 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 관한 것이다.
인터류킨-2(Interleukin-2, IL-2)는 T세포의 증식을 촉진하는 역할을 하는 사이토카인이다. 그런데 면역을 증진시키는 효과 T세포(effector T cell, Teff)의 표면에는 IL-2Rβ와 IL-2Rγ가 존재하는 반면, 면역을 억제하는 조절 T세포(regulatory T cell, Treg)에는 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ가 존재하여 IL-2에 대한 친화력이 훨씬 높기 때문에, 인체에 IL-2를 투여하면 면역을 증진시키기 보다는 억제하는 방향으로 작용하는 문제가 발생한다.
이를 고려하여, 본 발명에서는 효과 T세포에서 발현되는 IL-2Rβγ에 우선적으로 결합할 수 있도록 IL-2와 IL-2Rα가 미리 결합된 형태를 고안하였다.
본 발명에 따른 IL-2 융합단백질은 IL-2 단백질, 인터류킨-2 수용체 서브유니트 알파(IL-2Rα) 단백질 및 Fc 영역을 포함하고, 여기서 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질은 각각 상기 Fc 영역에 연결되어 있거나, 또는 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질이 서로 연결된 복합체가 상기 Fc 영역에 연결된 구조를 가질 수 있다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은 IL-2Rα가 IL-2를 선점하고 있는 복합체 구조로 구성되어 있기 때문에, IL-2가 조절 T세포에 결합하는 것을 억제하고 효과 T세포에만 선택적으로 결합한다. 따라서, 조절 T세포 증식에 의한 면역 체계 저하를 방지하고, 효과 T세포 증식에 의한 면역 체계 활성화를 특이적으로 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 IL-2/IL-2Rα의 구조적 안정성과 체내 반감기를 증가시키기 위해 항체의 Fc 부위에 연결하였다. 항체의 Fc 영역에 연결시, 도 2와 같이 N-말단 및 C-말단에 모두 결합이 가능한 형태로 제조하여 활용성을 높일 수 있다.
본 발명에서는 항체의 Fc 영역에 IL-2 단백질과 IL-2Rα 단백질을 연결함으로써 효과 T세포에 강하게 결합할 수 있는 융합단백질을 제공할 수 있으며, 각 단백질의 구조를 재설계하거나 돌연변이를 도입하여 융합단백질의 결합 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명을 설명함에 있어서, "단백질"은 적어도 2개의 공유결합으로 부착된 아미노산으로서 올리고펩타이드 및 폴리펩티드를 포함하는 개념으로 해석되며, "융합 단백질"이란 적어도 2개의 단백질이 공유결합된 형태 또는 이를 포함하는 복합체를 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서, "IL-2 단백질" 또는 "IL-2Rα 단백질"은 각각 "IL-2 유래 단백질" 또는 "IL-2Rα 유래 단백질"의 의미를 가지며, 본 명세서에 있어서"A 유래 단백질"이란 모체가 되는 A 단백질의 전부 또는 일부, 이들의 기능적 단편, 유사체 및 돌연변이를 포함하는 개념으로 해석된다. 또한, "돌연변이"는 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 의미로 해석될 수 있다. 아미노산 잔기의 치환은 모체가 되는 야생형 단백질에 존재하는 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 번호 및 치환된 아미노산 잔기의 순서로 표현할 수 있다.
본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은, IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질이 연결된 형태의 단백질(즉, 복합체)이 Fc 영역에 연결된 구조, 또는 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질이 Fc 영역의 각 사슬에 각각 연결된 구조일 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 상기 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질 각각은 아미노산 링커를 통해 서로 연결되거나, 서로 간에 공유결합으로 연결되어 있지 않을 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 유래 단백질에서 기준이 되는 IL-2 단백질의 아미노산 서열은 프로세싱되지 않은 야생형 인간 IL-2(Uniprot P60568-1)의 21번 내지 153번에 해당하는 아래 서열번호 1로 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에서 IL-2 유래 단백질이란 서열번호 1의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질을 의미할 수 있다. 본 발명을 설명함에 있어서, IL-2의 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1의 아미노산 순서를 기준으로 표기한다.
[IL-2 단백질] (서열번호 1)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 IL-2 유래 단백질은 IL-2 나선구조(helix)를 구성하는 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명의 예시적인 실시 형태에서, 상기 IL-2 유래 단백질로 IL-2 helix A, B 서브유닛(서열번호 1의 1 내지 73번(Ala1~Ala73) 또는 4 내지 74번(Ser4~Gln74)), IL-2 helix C, D 서브유닛(서열번호 1의 75 내지 133번(Ser75~Thr133)) 등을 이용하여 융합단백질을 설계할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "IL-2 단백질" 또는 "IL-2 유래 단백질"은 서열번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, IL-2 단백질의 나선구조 중 하나 이상의 아미노산 서열, IL-2 단백질의 순환 치환체(circular permutation), 이들의 변이체, 또는 IL-2 작용제를 포괄하는 의미로 사용되며, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 IL-2 변이체 또는 작용제는 IL-2Rα에의 상호작용 또는 친화도를 높이는 것이면 모두 사용가능하고 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 IL-2는 IL-2/IL-2Rα 복합체의 구조적 안정화를 위하여 아미노산 서열에 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이로는 예를 들어 IL-2의 125번 위치의 cysteine을 serine으로 바꾼 것일 수 있다(C125S). 또한, 링커의 길이를 단축하기 위해 IL-2의 N-말단과 C-말단 위치를 바꿀 수도 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2Rα 유래 단백질에서 기준이 되는 IL-2Rα 단백질의 아미노산 서열은 프로세싱되지 않은 야생형 인간 IL-2Rα(Uniprot P01589-1)의 22번 내지 272번 서열에 해당하는 아래 서열번호 2로 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에서 IL-2Rα 유래 단백질이란 서열번호 2의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질을 의미할 수 있다. 본 발명을 설명함에 있어서 IL-2Rα의 아미노산 잔기 번호는 서열번호 2의 아미노산 순서를 기준으로 표기한다.
[IL-2Rα 단백질] (서열번호 2)
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI
본 발명에서, 용어 "IL-2Rα 단백질" 또는 "IL-2Rα 유래 단백질"은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, IL-2Rα 단백질의 세포외 도메인, 스시(Sushi) 도메인, 또는 이들의 변이체를 포괄하는 의미로 사용되며, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, IL-2Rα 단백질의 "기능적 단편"이란 IL-2에의 결합 능력을 보유하는 전장 IL-2Rα 단백질의 일부분을 의미한다.
본 발명의 예시적인 실시 형태에서, 상기 IL-2Rα 유래 단백질로 IL-2Rα 23 내지 122번(Gly23~Val122), 1 내지 217번(Glu1~Glu217) 또는 1 내지 165번(Glu1~Gly165)을 이용하여 융합단백질을 설계할 수 있다.
본 발명에서, 상기 IL-2 유래 단백질, IL-2Rα 유래 단백질, 또는 이들 중 하나 이상이 연결된 복합 단백질이 Fc 영역의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결되어 Fc 융합단백질을 형성할 수 있다. 상기 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질이 연결된 복합체의 경우, 상기 IL-2Rα 단백질이 상기 IL-2 단백질의 나선구조(helix) A, B, C 및 D 중 어느 두 나선구조들 사이에 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fc 영역"은 항체의 중쇄불변영역 중 CH2 및 CH3 도메인(또는, CH2, CH3 및 CH4 도메인)을 포함하는 C-말단 영역을 의미하며, 야생형(wild-type, WT) Fc 영역 및 그의 변이체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 발명의 일 실시 형태에서, Fc 영역은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 면역글로불린의 Fc 영역을 사용할 수 있으며, 이 때 IgG는 어느 한 아형에 제한되지 않고 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4와 같은 IgG를 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1 중쇄의 221번 잔기로부터 C-말단에 이르는 영역, 또는 상기 영역에 힌지를 더 포함하는 영역을 의미할 수 있다. 본 발명을 설명함에 있어서, Fc 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 Kabat 문헌에서 인간 면역글로불린 중쇄 내의 잔기 번호를 정의하는 EU 넘버링에 따른다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역은 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)일 수 있다. 용어 "동종이량체"는 서로 동일한 단량체(monomer)에 의해 형성되는 이량체(dimer)를 의미하며, "이종이량체"는 서로 다른 두 개의 단량체에 의해 형성되는 이량체를 의미한다.
본 발명에서, Fc 영역의 각 사슬은 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬로 구분될 수 있다. 또 다르게는, Fc 영역의 각 사슬은 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드로 구분될 수 있다. 상기 제1 Fc 사슬(또는 제1 폴리펩티드) 및 제2 Fc 사슬(또는 제2 폴리펩티드)은 3차 구조를 형성할 수 있으며, 이들은 이황화 결합과 같은 공유 결합이나, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 결합, 소수성 상호작용과 같은 비공유 상호작용에 의해 서로 상호작용할 수 있다.
Fc 영역이 동종이량체인 경우, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. Fc 영역이 이종이량체인 경우, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬은 서로 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 Fc 영역의 각 사슬은 IgG1의 중쇄 221 내지 447번 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 상기 IgG1의 중쇄 221 내지 447번 서열은 아래와 같다.
[IgG1 HC 221-447] (서열번호 3)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질의 복합체(IL-2/IL-2Rα 복합체)가 Fc 영역에 연결된 형태를 가질 수 있다. 상기 융합단백질은 상기 IL-2/IL-2Rα 복합체가 Fc 사슬 한쪽 또는 양쪽에 IL-2만 결합된 형태(즉, IL-2Rα는 Fc에 결합되지 않은 상태로 IL-2에 대해 링커의 부재 또는 존재 하에 결합되어 있는 형태)를 취하거나, 또는 그 반대로 Fc 사슬 한쪽 또는 양쪽에 IL-2Rα만 결합된 형태(즉, IL-2는 Fc에 결합되지 않은 상태로 IL-2Rα에 대해 링커의 부재 또는 존재 하에 결합되어 있는 형태)를 취할 수 있다. 이 경우, IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질 각각은 직접 또는 아미노산 링커를 통해 서로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질이 Fc 영역의 각 사슬에 각각 연결된 구조를 가질 수 있다. 이 경우, IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질은 서로 간에 링커로 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 및 IL-2Rα 유래 단백질은 서로 간에 공유결합으로 연결되어 있지 않다.
상기 실시 형태에 있어서, Fc 영역에는 이종이량체를 형성할 수 있는 돌연변이(예를 들어, 놉-인투-홀(knob-into-hole))가 도입될 수 있다. 이 때, 놉 변형된 Fc 사슬(FcK; T366W)에 IL-2 유래 단백질이 연결되고, 홀 변형된 Fc 사슬(FcH; T366S, L368A, Y407V)에 IL-2Rα 유래 단백질이 연결되거나, 또는 반대로 IL-2 유래 단백질이 홀 변형된 사슬에, IL-2Rα 유래 단백질이 놉 변형된 사슬에 연결될 수 있다.
본 발명에서, 놉 변형된 Fc 사슬의 C 말단에 IL-2 유래 단백질이 연결되고, 홀 변형된 Fc 사슬의 C 말단에 IL-2Rα 유래 단백질이 연결되는 실시 형태의 경우, FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα로 지칭할 수 있다. 반대로, 놉 변형된 Fc 사슬의 C 말단에 IL-2Rα 유래 단백질이 연결되고, 홀 변형된 Fc 사슬의 C 말단에 IL-2 유래 단백질이 연결되는 실시 형태의 경우, FcK-IL-2Rα:FcH-IL-2로 지칭할 수 있다.
도 3은 상기 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, 도 4는 상기 구조에서 IL-2 및 IL-2Rα 단백질의 삼차구조를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 이종이량체성 Fc 영역을 형성하기 위한 Fc 돌연변이에는 당해 기술분야에 잘 알려진 이종이량체 형성 기술, 예를 들어 위에 기재한 바와 같은 놉-인투-홀(KiH) 변이(WO 96/27011 또는 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621] 참조), 또는 놉-인투-홀 다이설파이드(KiHss) 변이(문헌[Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681] 참조) 등을 포함할 수 있으나, 이들로 특별히 제한되지 않는다.
예를 들어서, 상기 Fc 영역에서 어느 한 사슬이 T366에서의 아미노산 치환을 포함하고, 다른 한 사슬이 제2 Fc 사슬이 T366, L368 및 Y407 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 이종이량체성 Fc 영역은 또한 본 출원인의 PCT 국제출원 제PCT/KR2022/017565호(본원에 그 전체가 참고로 인용됨)에 기재된 바와 같은 Fc 돌연변이 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 이종이량체성 Fc 영역은, 제1 Fc 사슬이 T366에서의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 Fc 사슬이 T366, L368 및 Y407 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중 어느 한 사슬은 K360에서의 아미노산 치환을 더 포함하고, 다른 한 사슬은 Q347에서의 아미노산 치환을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중 K360에서의 아미노산 치환을 포함하는 사슬이 Q347에서의 아미노산 치환을 더 포함하거나, 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중 Q347에서의 아미노산 치환을 포함하는 사슬이 K360에서의 아미노산 치환을 더 포함하거나, 또는 상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중 K360에서의 아미노산 치환을 포함하는 사슬이 Q347에서의 아미노산 치환을 더 포함하고, Q347에서의 아미노산 치환을 포함하는 사슬이 K360에서의 아미노산 치환을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질이 이종이량체성 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기 이종이량체성 Fc 영역은 제1 Fc 사슬에서 T366W 및 K360E의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 Fc 사슬에서 T366S, L368A 및 Y407V 중 하나 이상의 아미노산 치환 및 Q347R의 아미노산 치환("WER 변이")을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질이 이종이량체성 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기 이종이량체성 Fc 영역은 제1 Fc 사슬에서 T366W 및 Q347R의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 Fc 사슬에서 T366S, L368A 및 Y407V 중 하나 이상의 아미노산 치환 및 K360E의 아미노산 치환("WRE 변이")을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질이 이종이량체성 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기 이종이량체성 Fc 영역은 제1 Fc 사슬에서 T366W, K360R 및 Q347R의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 Fc 사슬에서 T366S, L368A 및 Y407V 중 하나 이상의 아미노산 치환 및 K360E 및 Q347E의 아미노산 치환("WRREE 변이")을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질이 이종이량체성 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기 이종이량체성 Fc 영역은 제1 Fc 사슬에서 T366W, K360E 및 Q347E의 아미노산 치환을 포함하고, 제2 Fc 사슬에서 T366S, L368A 및 Y407V 중 하나 이상의 아미노산 치환 및 K360R 및 Q347R의 아미노산 치환("WEERR 변이")을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질은 돌연변이를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 단백질의 구조적 안정화를 위하여 IL-2 단백질에 C125S 돌연변이가 포함될 수 있다.
또한, IL-2Rα 단백질은 융합단백질과 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ의 상호작용에 관여하지 않는 부위에 단백질 용해도 및 생산수율을 향상시킬 수 있는 돌연변이, 예를 들어 A114D 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, IL-2Rα 단백질은 F121A 및 V122A 중 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수도 있다. 즉, IL-2Rα 단백질은 A114D, F121A 및 V122A 중 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 IL-2 단백질은 T37K 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 IL-2 단백질이 T37K 돌연변이를 포함하고, 상기 IL-2Rα 단백질이 S39K 돌연변이 또는 L45R 돌연변이를 포함할 수 있으며, 이로써 IL-2와 IL-2Rα 단백질의 상호작용이 크게 증대될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 링커의 길이와 방향성을 고려하여 IL-2에 circular permutation을 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 circular permutation은 4개의 알파 나선구조 번들(Helix A, B, C, D)로 이루어진 IL-2(서열번호 1)를 기준으로 기존의 N 말단부(Ser4)와 C 말단부(Thr133)을 GG-링커로 연결하고 새로운 N 말단부(Ser75)와 C 말단부(Gln74)를 형성하도록 설계할 수 있다. 상기 실시 형태에서, 상기 circular permutation과 함께 단백질의 안정성, 친화력 등을 향상시키기 위한 다른 돌연변이, 예를 들어 C125S 돌연변이가 함께 도입될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명의 융합단백질은 또한 IL-2와 IL-2Rα의 친화력을 증가시키기 위한 돌연변이를 도입할 수 있다. 융합단백질의 구조 내에서 IL-2와 IL-2Rα 사이의 친화력을 증가시키면 융합단백질의 구조가 안정화되고, 융합단백질에 도입된 IL-2가 체내의 IL-2Rα 발현 세포에 결합할 가능성을 더욱 낮출 수 있을 뿐 아니라, 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하여 제조 수율을 향상시키는 이점을 제공한다. 예를 들어, 아래 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 IL-2와 IL-2Rα 잔기 사이에서 서로 상호작용을 하는 부위에 돌연변이를 도입함으로써 IL-2와 IL-2Rα 사이의 이온 결합 또는 소수성 상호작용을 통해 친화력을 향상시킬 수 있다. 표 1 및 2에서, IL-2 및 IL-2Rα 잔기 번호는 서열번호 1 및 2의 아미노산 번호 기준(IL-2 및 IL-2 수용체의 복합체 결정구조(2ERJ)에 기초함) 및 각 단백질의 야생형 아미노산 번호 기준(Uniprot P60568-1 및 P01589-1)으로 각각 나타내었다.
Figure PCTKR2022020885-appb-img-000001
Figure PCTKR2022020885-appb-img-000002
본 발명의 IL-2Rα 유래 단백질에서, IL-2Rα의 세포외 도메인은 L2, M25, N27, S39, L42, L45, N57, I118, H120 및 K153 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시 형태에서, IL-2Rα의 세포외 도메인은 L2D, L2E, L2Q, M25L, M25I, N27A, N27T, N27I, N27Y, S39K, L42F, L42I, L42A, L42V, L45R, N57E, I118R, H120A, H120D, H120K, H120Y, H120L, H120W, H120R 및 K153G 중 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
예를 들어, IL-2Rα 세포외 도메인은, L42I, L42F, L2E, L2D, N27I, H120R, H120D, H120K, N27A 및 N57E 중에서 선택되는 하나의 치환을 포함하거나; (1) N27T 및 H120Y, (2) M25L 및 H120Y, (3) N27I 및 L42I, (4) N27Y 및 H120A, (5) H120K 및 L42I, (6) N27I 및 H120K, (7) N27A 및 H120K, (8) N27A 및 H120W, 또는 (9) L42I 및 N57E와 같은 2개의 치환을 포함하거나; 또는 M25L, N27T 및 H120Y와 같은 3개의 치환을 포함할 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 IL-2Rα 돌연변이는 L2E 및 L42I 중 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 IL-2Rα 돌연변이는 하기의 돌연변이 조합 중에서 선택된 아미노산 치환을 포함할 수 있다:
(a) M25L, N27Y, L42I 및 H120W의 돌연변이(M01);
(b) M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E 및 H120W의 돌연변이(M02);
(c) M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E, H120W 및 K153G의 돌연변이(M03);
(d) M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E, I118R, H120W 및 K153G의 돌연변이(M04);
(e) L2Q, M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E, I118R 및 H120W의 돌연변이(M05);
(f) M25I, N27Y, L42A, I118R, H120W 및 K153G의 돌연변이(M06);
(g) L2Q, M25I, N27Y, L42A, I118R 및 H120W의 돌연변이(M07);
(h) L2Q, M25I, N27Y, L42V, I118R, H120W 및 K153G의 돌연변이(M08);
(i) M25I, N27Y, L42I, I118R, H120W 및 K153G의 돌연변이(M09);
(j) L2Q, M25I, N27Y, L42I, I118R 및 H120W의 돌연변이(M10); 및
(k) L2Q, M25I, N27Y, L42I, N57E, I118R, H120W 및 K153G의 돌연변이(M11).
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 IL-2Rα 유래 단백질은 S39K, L45R 및 H120L 중 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합단백질에서, 상술한 돌연변이들이 도입된 IL-2 유래 단백질 및 IL-2Rα 유래 단백질을 이용하는 경우 IL-2와 IL-2Rα의 상호작용, 결합력 등을 증대시키거나, 단백질의 용해도, 수율 등을 향상시킬 수 있으므로 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태에서, IL-2 유래 단백질과 IL-2Rα 유래 단백질은 Fc 사슬에 아미노산 링커를 통해 또는 직접 연결될 수 있다. 이 때, 사용가능한 링커는 예를 들어, (GGGX)n, (GGGGX)n, (GX)n (X = A 또는 S, n = 1, 2, 3 또는 4), SGGGSGGGSGGGSGG, GGGSGGGSGGGSGG 등일 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 본 발명의 융합단백질의 구조적 안정성을 높일 수 있도록 길이를 조절할 수 있다. 예를 들어, IL-2는 링커 GGGSGGGSGGGSGG를 통해, IL-2Rα는 링커 GGGSGGGSGGGS를 통해 Fc 사슬에 각각 연결될 수 있다.
본 발명의 융합단백질에는 다른 폴리펩티드 및/또는 단백질이 연결될 수 있고, 이중특이적 또는 다중특이적 융합단백질, 구체적으로 이중특이적 또는 다중특이적 항체 형태로 응용될 수 있으며, 이들에 약물이 접합된 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC) 형태로 사용되는 것도 가능하다.
본 발명의 융합단백질은 효과 T세포(Teff)에 강하게 결합하면서 조절 T세포(Treg)에는 결합하지 않는 성질을 나타낼 수 있다. 이로써, 효과 T세포에 결합하여 면역을 효과적으로 증진시킬 수 있고, 다양한 종류의 암 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 융합단백질은, 해당 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에서 발현시켜 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 융합단백질의 제조방법은, 상기 융합단백질을 코딩하는 1종 이상의 발현 벡터를 준비하는 단계; 및 상기 발현 벡터를 숙주 세포에서 발현시켜 단백질을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 의미로 해석된다. 본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 IL-2 유래 단백질, IL-2Rα 유래 단백질 및 Fc 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적하는 단백질 구조에 따라 변경하여 생성될 수 있으며, 각 사슬의 신호 펩타이드, 힌지, 링커, 히스티딘 태그 등을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
또한, 융합단백질이 다른 단백질(예를 들어, 항원 결합 영역, 치료용 단백질 등의 결합 도메인 단백질)을 포함하는 경우, 이를 포함하는 전체 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여 제조할 수 있다.
발현 벡터는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 것으로, 역할 및 숙주 세포에 따라 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱되는 신호 서열, 복제 기점, 마커 유전자, 전사조절인자들이 결합하는 프로모터, DNA의 전사를 증가시키기 위한 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 서열 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
구체적으로, 본 발명의 융합단백질 생산을 위하여 융합단백질의 각 사슬을 코딩하는 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드를 얻은 후 이를 이용하여 발현 벡터를 구축할 수 있다. 또한, 융합단백질의 구조에 따라 1개 또는 2개의 발현 벡터, 또는 그 이상의 발현 벡터를 사용할 수 있다.
발현 벡터가 제작되면, 숙주 세포에서 이를 발현시켜 목적하는 단백질을 얻을 수 있다. 구체적으로, 숙주 세포에 발현 벡터를 트랜스펙션(transfection, 형질주입)한 후 배양시켜, 단백질을 발현할 수 있다.
상기 숙주 세포는 당해 기술 분야에 공지되어 있는 상용 기법을 이용하여, 본 발명에 사용하기에 적합한 것을 실험적으로 결정하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 세포(BHK), 원숭이 신장 세포(COS), 대장균 세포 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서, 발현 벡터는 개별적인 숙주 세포에 각각 주입하여 발현시킬 수 있고, 또는 동일한 숙주 세포에 주입하여 동시발현 시키는 것도 가능하다.
배양이 완료되면, 세포로부터 단백질을 단리(isolation)할 수 있다. 구체적으로, 배양된 세포를 원심분리하여, 목적 단백질을 함유하는 세포 배양액을 얻을 수 있다. 이후, 배양액에서 단백질을 분리하고 정제하는 과정을 수행할 수 있다. 상기 분리에는 친화도 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 이용할 수 있으며, 정제를 위하여 추가의 크로마토그래피, SDS-PAGE 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서, 각각 발현으로 얻은 단백질로 이량체(dimer)를 형성하는 경우, 단리된 단백질을 혼합하는 공정을 수행할 수 있다.
본 발명의 융합단백질 및 이를 이용한 이중특이적 항체, 다중특이적 항체 및 항체-약물 접합체는 약학 조성물에 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 예방 또는 치료의 대상이 되는 질환은 IL-2의 면역 증진 활성을 통해 효과를 기대할 수 있는 면역 질환 또는 암일 수 있다. 예를 들어, 암은 대장암, 직장암, 난소암, 췌장암, 폐암, 비소세포암, 간암, 유방암, 신장암, 신세포암, 전립선암, 위암, 혈액암, 피부암, 흑색종, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종, 두경부암, 뇌암, 골암 등일 수 있다. 예를 들어, 대상 질환은 전이성 흑색종(멜라노마, melanoma), 신세포암종(renal cell carcinoma) 등의 암일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 융합단백질 외에 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제 등의 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질과 함께 인터페론, 항-S 단백질 단일클론 항체, 항-S 단백질 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라제 저해제, siRNA 제제 또는 치료백신을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 인간을 포함하는 포유동물에게 투여함으로써 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 이때, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001 내지 100㎎/㎏일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 융합단백질, 또는 이를 이용한 이중특이적 항체, 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다. 대상 질병은 IL-2의 면역 증진 활성을 통해 효과를 기대할 수 있는 면역 질환 또는 암, 예를 들어 전이성 흑색종, 신세포암종 등의 암일 수 있다.
본 발명의 융합단백질 또는 약학 조성물은 이를 필요로 하는 개체(subject), 즉 해당 질병을 갖고 있거나, 해당 질병이 발생할 위험이 있는 개체에 투여될 수 있다. 상기 개체는 동물일 수 있고, 통상적으로 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
하기 제조예의 각 아미노산 서열에서, 이탤릭체로 표시된 아미노산 서열은 신호서열을 나타내며, 밑줄로 표시된 아미노산 서열은 링커 서열을 나타내고, 볼드 표시된 아미노산은 돌연변이 잔기를 나타낸다.
제조예 1: IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질 제작
1-1. 융합단백질 설계 및 폴리뉴클레오티드 제작
인간 IL-2 서열(Uniprot P60568-1 유래; 서열번호 1), IL-2Rα 서열(Uniprot P01589-1 유래; 서열번호 2), 및 IgG1의 221 내지 447 서열(서열번호 3)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 기준으로, 융합단백질의 아미노산 서열을 코딩하도록 DNA를 설계하고 합성하였다. 발현 벡터는 pcDNA 3.1 / Myc His-A (Invitrogen)을 기반으로 하여 제작되었으며, 인간 IgG1 Fc (잔기 221~447)은 EU 넘버링을 따른다. 인간 IgG1 Fc 말단부(K447) 이후에 도입된 TG 아미노산 서열은 벡터 클로닝시 제한효소 부위로 인한 것이다.
(a) IL-2/IL-2Rα 폴리펩타이드 복합체가 Fc 영역에 연결된 형태의 융합단백질 (IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질)
도 5a의 서열 개략도 및 도 5b의 단백질 3차 구조에 나타낸 바와 같이, IL-2의 helix A 및 B (서열번호 1의 Ala1~Ala73), IL-2Rα 서열(서열번호 2의 Gly23~Val122), 및 IL-2의 helix C 및 D (서열번호 1의 Ser75~Thr133)가 링커로 연결된 형태의 융합단백질을 코딩하도록 DNA를 설계하고 합성하였다.
이 때, IL-2가 C125S 돌연변이를 포함하고, IL-2Rα가 A114D, F121A 및 V122A 돌연변이를 포함하도록 설계하였다. IL-2Rα의 Ala114는 IL-2/IL-2Rα Fc 상호작용과 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ 상호작용에 관여하지 않는 부위의 IL-2Rα 표면 잔기로, 상기 돌연변이를 도입함으로써 단백질 용해도 및 생산수율을 향상시킬 수 있다.
연쇄효소중합반응(PCR)을 통해 합성된 DNA를 증폭하고, 제한효소와 T4 DNA 결합효소를 이용하여 C 말단부에 인간 IgG1 Fc 및 히스티딘 태그를 포함하도록 클로닝하였다. 이 때, IL-2/IL-2Rα 복합체와 Fc는 (GS)3-링커로 연결된 형태를 갖는다.
본 제조예에서 설계된 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질의 아미노산 서열은 아래와 같다.
[IL-2/IL-2Rα Fc 서열] (서열번호 4)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAGGGGSGGGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEDTERIYHAA GGGSGGGASKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGSGSGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGHHHHHH
(b) IL-2 및 IL-2Rα가 Fc 사슬에 각각 결합된 형태의 융합단백질 (FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질)
도 6a의 서열 개략도 및 도 6b의 단백질 3차 구조에 나타낸 바와 같이, Fc 영역에 놉-인투-홀(knob-into-hole) 돌연변이를 도입하고, Fc-knob에 IL-2 유래 서열, Fc-hole에 IL-2Rα 유래 서열을 연결하여 이종이량체 형태를 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 설계하였다.
구체적으로, Fc-knob 돌연변이(FcK; T366W)의 C 말단에 IL-2의 helix C 및 D (Ser75~Thr133 잔기)와 helix A 및 B (Ser4~Gln74 잔기)가 링커로 연결된 아미노산 서열을 설계하였다.
이 때, 링커의 길이와 방향성을 고려하여 IL-2에 circular permutation을 적용하였다. IL-2의 기존의 N 말단부(Ser4)와 C 말단부(Thr133)를 GG-링커로 연결하고, 새로운 N 말단부(Ser75)와 C 말단부(Gln74)를 형성하도록 설계하였다. 이와 같이, circular permutation이 적용되어 IL-2의 helix가 C-D-A-B 순으로 연결된 형태를 갖도록 설계하였다. 상기 IL-2에는 또한, C125S 돌연변이를 도입하였다.
합성된 IL-2 DNA (Bioneer)를 연쇄효소중합반응을 통해 증폭시킨 후, 증폭된 DNA를 제한효소와 T4 DNA 결합효소를 이용하여 FcK의 C 말단부에 클로닝하였다. 이 때 FcK의 C 말단부와 IL-2의 새로운 N 말단부(Ser75)는 (GGGGS)2-링커로 연결된 형태를 갖는다.
Fc-hole 돌연변이(FcH; T366S, L368A 및 Y407V)에 IL-2Rα의 Glu1~Glu217 서열이 링커로 연결된 아미노산 서열을 코딩하도록 DNA를 설계하고 합성하였다. FcH-IL-2Rα는 FcH의 C 말단부에 IL-2Rα의 N 말단부(Glu1)가 (GGGGS)2-링커로 연결되도록 고안되었다.
IL-2Rα의 1~217 잔기의 DNA를 연쇄효소중합반응을 통해 증폭시킨 후, 증폭된 DNA를 제한효소와 T4 DNA 결합효소를 이용하여 FcH의 C 말단부에 클로닝하였다. FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 정제 용이성을 고려하여, FcH-IL-2Rα의 C 말단부에만 히스티딘 태그를 포함한 형태를 갖도록 설계하였다.
본 제조예에 따른 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질에서, FcK-IL-2 및 FcH-IL-2Rα 서열은 각각 아래와 같다.
[FcK-IL-2] (서열번호 5)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGGGGGSGGGGSSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ
[FcH-IL-2Rα] (서열번호 6)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEGGHHHHHH
(c) 돌연변이가 도입된 IL-2Rα-Fc 융합단백질 설계
IL-2 와 IL-2Rα의 친화도를 시험하기 위하여, IL-2Rα에 S39K, L45R 및/또는 H120L 돌연변이를 도입하고 Fc 사슬과 연결된 IL-2Rα-Fc 융합단백질을 설계하였다.
본 제조예에서 설계된 S39K 변이 IL-2Rα-Fc, L45R 변이 IL-2Rα-Fc, H120L 변이 IL-2Rα-Fc, 및 S39K+L45R+H120L 변이 IL-2Rα-Fc 서열은 아래와 같다.
[IL-2Rα(S39K)-Fc] (서열번호 7)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKKGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEGSGSGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGHHHHHH
[IL-2Rα(L45R)-Fc] (서열번호 8)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMRCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEGSGSGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGHHHHHH
[IL-2Rα(H120L)-Fc] (서열번호 9)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYLFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEGSGSGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGHHHHHH
[IL-2Rα(S39K+L45R+H120L)-Fc] (서열번호 10)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKKGSLYMRCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYLFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEGSGSGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGHHHHHH
또한, IL-2 부위에도 돌연변이를 도입한 IL-2 Fc 융합단백질을 설계하여 IL-2와 IL-2Rα 사이의 상호작용이 더욱 강화되도록 하였다. IL-2 변이체(서열번호 1 기준 T37K)를 도출하고, 이를 IL-2Rα (S39K) 또는 IL-2Rα (L45R)와 쌍을 이루게 하여 실험하였다. 일례로, 아래 서열을 갖는 IL-2Rα (S39K) + IL-2 (T37K) 변이를 포함하는 이종이량체 Fc를 제작할 수 있다.
[FcH-IL-2Rα(S39K)] (서열번호 11)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKKGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEGGHHHHHH
[FcK-IL-2(T37K)] (서열번호 12)
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKTGGGGGSGGGGSSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLTGGSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLKRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQ
1-2. 단백질 발현
설계된 단백질을 발현하는 벡터를 ExpiCHOTM 세포에 트랜스펙션하여 일시적으로 단백질을 발현하였다.
트랜스펙션 시, 세포 농도는 6 x 106 세포/mL 정도로 희석하였으며, OptiPROTM SFM를 이용하여 DNA의 최종 농도가 0.8μg/ml 가 되도록 발현 벡터를 혼합하였다. 이 과정에서, ExpiCHOTM Expression Medium, ExpiFectamineTM 트랜스펙션 키트(Gibco), OptiPROTM SFM를 제조사 지침에 따라 사용하였다.
이후 80% 이상의 습도와 8% 이산화탄소가 유지되는 인큐베이터에서 세포들을 배양하였다. 이 때, FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질 배양액의 경우, 하베스트(harvest)하기 하루 전 글루타티온(glutathione)을 처리하였다. 배양된 세포들을 원심분리하여, 재조합 단백질을 포함한 상층액과 분리시켰다.
1-3. 단백질 정제
각각의 재조합 단백질을 포함하는 배양액에서 목표 단백질들을 분리하기 위해 Ni-NTA (Qiagen) 컬럼을 이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography)를 실시하였다.
구체적으로, Ni-NTA 컬럼에 50mM Tris-HCl pH 7.5, 200mM NaCl 조성의 완충용액을 채웠다. 컬럼에 배양액을 0.45μm 필터로 여과하여 로딩한 후, 50mM Tris-HCl pH 7.5, 1M NaCl 조성의 완충용액과 50mM Tris-HCl pH 7.5, 500mM NaCl, 30mM imidazole, 5% glycerol 조성의 완충용액을 순차적으로 로딩하여 불순물을 세척하였다.
이후, 재조합 단백질을 50mM Tris-HCl pH 7.5, 500mM NaCl, 500mM imidazole 조성의 완충용액으로 용출하였다. 최종 용출된 용액을 HitrapTM Desalting (GE healthcare) 컬럼에 도입하여, 20mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl 조성의 완충용액으로 교체하였다.
도 7은 제조예 1-1(a)의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질에 대한 SDS-PAGE 결과(환원)이며, 도 8은 제조예 1-1(b)의 FcK-IL-2(1열), FcH-IL-2Rα(2열) 및 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질(3열)에 대한 SDS-PAGE 결과(비환원)이다.
실험예 1: 효소면역흡착 (ELISA)
IL-2 단백질(JWCreaGene)과 IL-2Rα, β, γ 단백질(Sino Biological)을 0.1M sodium carbohydrate pH 9.5 조성의 완충용액에 0.05~10μg/ml의 농도로 희석하여 96 웰 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후 5%(w/v) 탈지분유를 이용하여 플레이트를 블로킹 처리하였다.
코팅된 각 웰에 야생형 IL-2-Fc, 야생형 IL-2Rα-Fc, 제조예 1-1(a)의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질, 제조예 1-1(b)의 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질, 및 제조예 1-1(c)의 돌연변이가 도입된 IL-2Rα-Fc을 각각 5%(w/v) 탈지분유에 다양한 농도로 희석하여 첨가 후 상온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 버린 뒤, 인간 Fc에 결합하는 HRP 결합 2차 항체(GW Vitek)를 5%(w/v) 탈지분유에 희석하여 첨가 후 상온에서 2~3시간 반응시켰다. 각 과정이 끝날 때마다 웰은 인산완충액으로 3차례 세척하였다. 각 웰에 tetramethylbenzidine (고마바이오텍) 용액을 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.18M 황산 용액을 가하여 반응을 정지시켰다. EMax micro plate reader (Molecular Devices)를 사용하여 450nm에서 반응을 마친 용액의 흡광도를 측정하였다. 단백질 농도(nM)의 log 값에 따른 흡광도 그래프를 도 9 및 10에 나타내었다.
도 9는 IL-2-Fc와 제조예 1-1(a)의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질의 ELISA 결과를 비교하여 나타낸 것으로, 각각 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ에 대한 친화력을 나타낸다. 상기 결과를 참고하면, 본 발명의 제조예에 따른 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질이 야생형 IL-2-Fc 융합단백질에 비해 IL-2Rβ 및 IL-2Rγ에 대한 친화도가 높고, IL-2Rα에 대한 친화도는 낮은 것을 확인할 수 있다.
도 10은 IL-2-Fc 융합단백질과 제조예 1-1(b)의 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 ELISA 결과를 비교한 것으로, IL-2Rα에 대한 친화력을 나타낸다. 도 9와 마찬가지로, 도 10에서도 본 발명에 따른 융합단백질이 IL-2-Fc 융합단백질에 비해 IL-2Rα에 대한 친화도가 낮은 것을 확인할 수 있다.
아래 표 3 및 도 11은 야생형(WT) IL-2Rα-Fc 융합단백질과 제조예 1-1(c)의 돌연변이가 도입된 IL-2Rα-Fc 융합단백질의 ELISA 결과를 비교한 것으로, IL-2 단백질에 대한 친화력을 나타낸다. 실험 결과, IL-2Rα의 야생형과 S39K, L45R 또는 H120L 돌연변이체에 대해 IL-2에 대한 친화력을 비교하였을 때, 돌연변이를 포함하는 경우 야생형에 비하여 IL-2에 대한 친화력이 약 2배가량 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, IL-2Rα에 S39K, L45R 및 H120L 돌연변이를 모두 함께 도입하면 EC50 측면에서 더욱 향상된 결과를 얻을 수 있었다.
돌연변이 IL-2/IL-2Rα 상호작용 EC50 차이
IL-2Rα(S39K) 약 2.5배
IL-2Rα(L45R) 약 1.8배
IL-2Rα(H120L) 약 2.5배
IL-2Rα(S39K+L45R+H120L) 약 4.6배
또한, IL-2Rα의 돌연변이와 아울러 IL-2 부위에 IL-2Rα 상호작용에 관여하는 잔기의 돌연변이인 T37K 돌연변이를 도입하고 ELISA를 통해 친화도를 비교하였다. 구체적으로, IL-2-Fc 야생형과 IL-2(T37K)-Fc 돌연변이형 단백질을 0.1M sodium carbohydrate pH 9.5 조성의 완충용액에서 20μg/ml의 농도로 희석하여 96 웰 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후 플레이트는 5% (w/v) 탈지분유를 이용하여 블로킹처리를 하였다. 코팅된 각 웰에 야생형과 S39K 또는 L45R 돌연변이를 포함하는 IL-2Rα-Fc-myc 단백질을 각각 5% (w/v) 탈지분유에 다양한 농도로 희석하여 첨가 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 버린 뒤, myc에 결합하는 c-Myc 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 5% (w/v) 탈지분유에 희석하여 첨가 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 용액을 버린 뒤, 결합한 c-Myc 항체에 결합하는 HRP가 컨쥬게이션된 단백질(Santa Cruz Biotechnology)를 5% (w/v) 탈지분유에 희석하여 첨가 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 과정이 끝날 때마다 웰은 인산완충액으로 3차례 세척하였다. 각 웰에 tetramethylbenzidine (고마바이오텍) 용액을 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 0.2M 황산 용액을 가하여 반응을 정지시켰다. EMax micro plate reader (Molecular Devices) 기기를 사용하여 450nm에서 반응을 마친 용액의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 아래 표 4 및 도 12에서 확인 가능한 바와 같이 EC50 차이가 매우 크게 향상된 결과를 얻을 수 있었다.
돌연변이 IL-2/IL-2Rα 상호작용 EC50 차이
IL-2Rα(L45R) + IL-2 (T37K) 약 12배
IL-2Rα(S39K) + IL-2 (T37K) 약 110배
실험예 2: 웨스턴 블랏 (Western blot)
웨스턴 블랏 분석을 위해 단백질 샘플(0.3-0.5μg)을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤(SDS-PAGE)로 분리하였다. 젤 전기영동 후, Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell(Bio-Rad)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 해당 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 5%(w/v) 탈지분유로 블로킹 후, 각 태그에 결합하는 항체와 함께 4℃에서 밤새 반응시켰다. 각 항체는 인간 Fc에 결합하는 HRP 결합 항체(1:5000, GW Vitek), 히스티딘 태그에 결합하는 마우스 모노클로날 항체(5C3)(1:5,000, Abbkine) 및 마우스 모노클로날 항로돕신 항체(1D4)(1 :150, Santa Cruz Biotechnologies)를 사용하였다.
Tween-20 함유 트리스 완충액으로 5분간 4회 세척한 후, 인간 Fc 항체에 결합하는 HRP 결합 항체로 반응시킨 멤브레인을 제외하고 상온에서 마우스 Fc에 결합하는 HRP 결합 항체(1:5,000, GW Vitek)로 멤브레인을 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 멤브레인을 4회 세척하고 ClarityTM Western ECL substrate(Bio-Rad)로 반응시킨 다음 ChemiDocTM XRS+ System(Bio-Rad)으로 이미징하였다.
제조예 1-1(b)에서 제조한 각 단백질(비환원)에 대한 웨스턴 블랏 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서, (a)는 항인간 Fc 항체를 이용한 결과, (b)는 항로돕신 항체를 이용한 결과, (c)는 항히스티딘 태그 항체를 이용한 결과를 나타내며, 1, 2, 3, 4 및 5열은 각각 FcK-IL-2, FcH-IL-2Rα, FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα, FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 배양액의 상층액, 및 FcK-IL-2의 C 말단부에 C9 태그를 포함한 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα에 대한 결과를 나타낸다.
실험예 3: 열변성 분석 (Thermal shift assay)
단백질의 안정도 측정을 위한 열변성 분석을 Protein Thermal ShiftTM Dye Kit (Thermo Fisher Scientific) 제품을 이용하여 수행하였다.
제조예 1-1(b)에서 제조한 단백질을 0.1M HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl 조성의 반응 용액에 0.4mg/ml 수준이 되도록 희석한 후 형광 염색약 희석액과 혼합하였다. 혼합된 용액은 MicroAmp Optical 8-Tube Strip (Thermo Fisher Scientific) 제품에 20㎕씩 분주하였다. 실시간 형광 측정을 위해 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) 기기를 사용하여 단백질을 1℃/분 램프속도로 25~95℃에서 반응시켰다. 반응을 마친 후 해당 기기의 소프트웨어에서 획득한 융해곡선의 변곡점으로부터 융점을 계산하였다.
열변성 분석을 통하여 얻은 제조예 1-1(b)의 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα의 일차 도함수 용해곡선을 IL-2-Fc와 비교하여 도 14 및 표 5에 나타내었다. 열변성 분석 결과에 따르면, IL-2-Fc 융합단백질에 비하여 FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 융합단백질의 열적 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
단백질 Tm (℃)
FcK-IL-2:FcH-IL-2Rα 54.7 ± 0.8
IL-2-Fc 70.0 ± 0.7
제조예 2: IL-2/IL-2Rα 복합체의 IL-2Rβγ 결합특이성 확인을 위한 POC (Proof of Concept) 단백질 제작
IL-2 서열(Uniprot P60568-1 유래; 서열번호 1 기준), IL-2Rα 서열(Uniprot P01589-1 유래; 서열번호 2 기준), 및 IgG1의 221 내지 446 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 기준으로, 융합단백질의 아미노산 서열을 코딩하도록 DNA를 설계하고 합성하였다.
2-1. 구조 기반 모델링을 통한 링커 디자인
IL-2와 IL-2Rα가 각각 연결될 이종이량체 Fc로는 이황화 가교가 형성된 놉-인투-홀(KiHs-s)을 사용하였다. 야생형 IL-2와 IL-2Rα의 결합이 가장 안정적으로 유지될 수 있도록, 도 15와 같은 구조기반 모델링을 통해 적절한 길이의 링커를 디자인하였다.
2-2. POC 융합단백질 발현 벡터의 제작
Fc(KiHs-s)의 놉 사슬과 홀 사슬의 C-말단에 상기 디자인된 링커로 IL-2와 IL-2Rα를 각각 연결한 유전자를 포유동물 세포 발현 벡터에 삽입하였다.
발현 벡터는 pcDNA3.1(Invitrogen)을 바탕으로 Fc의 C-말단에 IL-2 또는 IL-2Rα가 발현되도록 제작되었다. 발현 벡터가 코딩하는 FcKs-(GGGS)3GG-IL-2 서열 및 FcHs-(GGGS)3-IL-2Rα 서열은 각각 아래와 같다.
[FcKs-(GGGS)3GG-IL-2] (서열번호 13)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGSGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
[FcHs-(GGGS)3-IL-2Rα] (서열번호 14)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGSGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
2-3. POC 단백질의 발현 및 정제
상기 제작된 발현 벡터를 1:1의 비율로 ExpiCHO cells에 도입하여 Day 6까지 배양 후, protein A affinity column chromatography를 이용하여 단백질을 95% 이상의 순도로 정제하였다.
도 16은 정제된 POC 단백질에 대한 실험 결과로서, 상기 POC 단백질(이종이량체 IL-2/IL-2Rα Fc 복합체)가 reducing gel (7.5% SDS-PAGE)과 non-reducing gel (6.5% SDS-PAGE)에서 확인된다.
실험예 4: 단백질의 수용체 선택성 확인
4-1. αβγ 수용체 결합력 확인
상기 제조예 2에서 제작한 이종이량체 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질(POC 단백질)의 수용체 선택성을 확인하기 위해서 HEK-Blue-IL-2 reporter assay system (Promega사)을 이용하여 농도-흡광도 그래프를 얻어 EC50 값을 확인하고 그 결과를 도 17에 나타내었다.
실험 결과, 본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은 비교물질인 알데스류킨(aldesleukin)에 비해 약 40배 이상 약화된 EC50 값을 나타내었으며, 이로써 본 발명의 융합단백질은 IL-2와 비교하여 IL-2Rαβγ 수용체에 대한 결합력이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다.
4-2. βγ 수용체 결합력 확인
상기 제조예 2에서 제작한 POC 단백질의 수용체 선택성을 추가적으로 확인하기 위해, IL-2Rαβγ subunit을 발현하는 CTLL2 세포와 IL-2Rβγ subunit만 발현하는 HH 세포에 대한 결합력을 IL-2와 비교하고 그 결과를 도 18에 나타내었다.
실험 결과를 참조하면, 본 발명의 IL-2/IL-2Rα Fc 융합단백질은 CTLL2 세포 표면에 대한 결합력이 IL-2 대비 약 18배 감소된 반면, HH 세포 표면에 대한 결합력은 IL-2와 거의 차이가 나타나지 않았다.
이에 따라, 본 발명의 융합단백질은 IL-2Rα에의 결합이 방지되는 기전(이른바 "No-IL-2Rα 결합" 기전)이 잘 작동하면서, IL-2Rβγ에의 결합력은 IL-2와 동등한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
제조예 3: 융합단백질 구조에서 IL-2와 IL-2Rα 사이의 결합력 강화를 위한 돌연변이 제작
IL-2와 IL-2Rα의 결합력을 강화하기 위한 총 6종의 IL-2Rα 돌연변이를 디자인하여 발현 정제하였다.
상기 IL-2Rα 돌연변이는 아래 표 6과 같이 설계하였다. 각 발현 벡터를 ExpiCHO cells에 트랜스펙션한 후, 세포배양 상층액에서 Ni-NTA resin을 이용하여 정제하였다. 14% reducing SDS-PAGE에 로딩하고 쿠마시 염색(Coomassie staining)한 결과를 도 19에 나타내었다.
IL-2Rα 돌연변이 돌연변이 설명
A-1 L2E
A-2 L2D
B-3 L42F
B-4 L42I
C-5 H120R
C-6 H120D
실험예 5: IL-2Rα 돌연변이의 친화도 측정
제조예 3의 IL-2Rα 돌연변이에 대하여, 단백질간 상호작용을 실시간 관찰하는 SPR (surface plasmon resonance) 장비 Biacore 8K를 이용하여 친화도를 측정하였다.
실험 결과, IL-2Rα Mutant A-1 및 B-4의 경우 야생형(wild type) IL-2Rα에 비해 친화도(KD) 또는 Koff 값(kd)이 향상된 결과가 나타났다. 구체적으로, 아래 표 7에 나타낸 바와 같이 IL-2Rα Mutant A-1 (L2E)의 경우 Koff 값이 크게 향상되었고, IL-2Rα Mutant B-4 (L42I)의 경우 친화도 값에 상당한 향상을 보였다. 이에 따라, IL-2Rα의 친화도를 향상시킬 수 있는 돌연변이를 확인할 수 있었다.
Group 리간드 Steady state affinity KD (M) Binding ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
1 Wild type 2.83E-8 1.95E+7 2.16E-1 1.11E-8
2 Mutant A-1 1.31E-7 3.57E+4 2.64E-3 7.40E-8
3 Mutant B-4 1.98E-8 1.08E+7 4.70E-2 4.36E-9
제조예 4: 융합단백질 구조에서 IL-2와 IL-2Rα 사이의 결합력 강화를 위한 추가 IL-2Rα 변이체 제작
Fc 부분에 의한 영향을 배제하기 위해 돌연변이가 도입되는 IL-2Rα 부분에는 야생형 동종이량체 Fc를 결합시키고, IL-2 부분은 이종이량체 Fc의 한쪽 사슬에만 결합되도록 제작하여 실험하였다.
도 20a 및 20b는 제작된 각 융합단백질의 모식도를 도시한 것으로, 각각 동종이량체 Fc-IL-2Rα(a) 및 이종이량체 Fc-IL-2(b)를 나타낸다.
4-1. DNA 준비
(a) 돌연변이가 도입된 동종이량체 Fc-IL-2Rα 설계 및 DNA 서열 제작
발현 벡터는 pcDNA3.1 (Invitrogen)을 기반으로, Fc의 C-말단에 야생형 IL-2Rα (서열번호 2의 1번 내지 165번)를 융합시켜 제작하였다. 표 8과 같이 유전자 서열(서열번호 15)을 합성 후 BamH I과 EcoR I 제한 효소를 이용하여 pcDNA3.1 벡터에 삽입하였다.
종류 DNA 서열
Kozak + 시그널 펩티드 서열 GCCACCATGAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTTCTGTTCTCCAGCGCCTACAGC
IgG1의 중쇄 일부 (221번 내지 446번) GATAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCAAGCGTTTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTCGATGTGTCTCACGAGGACCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTCGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCAGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTTTACACACTGCCTCCATCTCGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAATCCCTGAGCCTGTCTCCTGGC
링커 ggtggtggtggtagtggtggtggtggtagtggcggaggcggctc
IL-2Rα WT gagctgtgtgatgatgatcctcctgagatccctcacgccacctttaaggctatggcttataaggagggcacaatgctgaattgtgagtgtaagagaggctttagaagaatcaagtctggctctctgtatatgctgtgtacaggaaattcttctcattcttcttgggataaccagtgtcagtgtacatcttctgctacaagaaacacaaccaagcaggtgacacctcagcctgaggagcagaaggaaagaaagacaacagagatgcagtctccaatgcagcctgtggatcaggccagcctgcctggccactgtagagagcctcctccttgggagaatgaggctacagagagaatctatcattttgtggtgggacagatggtgtattaccagtgtgtgcagggctatagggctctgcatagaggacctgctgagtctgtgtgtaagatgacccacggcaagacaagatggacacagcctcagCTGATCTGTACCGGC
[Fc-IL-2Rα DNA 서열] (서열번호 15)
GCCACCATGAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTTCTGTTCTCCAGCGCCTACAGCgataagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccaagcgttttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtcgatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtcgacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgccagctcctatcgagaaaaccatctccaaggctaagggccagcctcgcgaacctcaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagtccaatggccagcctgagaacaactacaagaccacacctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaaatccctgagcctgtctcctggcggtggtggtggtagtggtggtggtggtagtggcggaggcggctcgagctgtgtgatgatgatcctcctgagatccctcacgccacctttaaggctatggcttataaggagggcacaatgctgaattgtgagtgtaagagaggctttagaagaatcaagtctggctctctgtatatgctgtgtacaggaaattcttctcattcttcttgggataaccagtgtcagtgtacatcttctgctacaagaaacacaaccaagcaggtgacacctcagcctgaggagcagaaggaaagaaagacaacagagatgcagtctccaatgcagcctgtggatcaggccagcctgcctggccactgtagagagcctcctccttgggagaatgaggctacagagagaatctatcattttgtggtgggacagatggtgtattaccagtgtgtgcagggctatagggctctgcatagaggacctgctgagtctgtgtgtaagatgacccacggcaagacaagatggacacagcctcagCTGATCTGTACCGGC
상기 벡터를 이용하여 발현되는 재조합 단백질 Fc-IL-2Rα의 서열은 아래와 같다.
[Fc-IL-2Rα] (서열번호 16)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
상기 제작된 Fc-IL-2Rα 유전자가 들어있는 플라스미드와 site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 IL-2Rα 돌연변이를 제작하였다.
NEBaseChanger (https://nebasechanger.neb.com/) 웹사이트에서 돌연변이에 사용할 프라이머를 설계한 후 2X Q5 High Fidelity 2X master mix (NEB)와 KLD Enzyme Mi (NEB)를 이용하여 돌연변이를 제작하였다. 돌연변이를 시행한 아미노산 서열은 표 9와 같으며, 각 돌연변이 위치는 서열번호 2를 기준으로 한다.
Fc-IL-2Rα 2 25 27 39 42 45 57 118 120 153
WT L M N S L L N I H K
M01 L L Y S I L N I W K
M02 L L Y K I R E I W K
M03 L L Y K I R E I W G
M04 L L Y K I R E R W G
M05 Q L Y K I R E R W K
M06 L I Y S A L N R W G
M07 Q I Y S A L N R W K
M08 Q I Y S V L N R W G
M09 L I Y S I L N R W G
M10 Q I Y S I L N R W K
M11 Q I Y S I L E R W G
(b) 이종이량체 Fc-IL-2 (Hetero FcA-IL-2 : Hetero FcB) 설계 및 DNA 서열 제작
이종이량체 Fc 부분은 본 출원인의 국제출원 제PCT/KR2022/017565호에 기재된 WRE 변이체를 사용하였다. 구체적으로, 인간 IgG1 Fc의 제1 사슬에 T366W/Q347R 돌연변이를 도입하고(Hetero FcA), 제2 사슬에 K360E/T366S/L368A/Y407V 돌연변이를 도입하였다(Hetero FcB). 이를 바탕으로, Hetero FcA의 C-말단에 IL-2 (C125S)가 부착된 형태의 이종이량체 Fc-IL-2 단백질을 제작하였다.
발현 벡터는 pcDNA3.1 (Invitrogen)을 기반으로 제작하였으며, 표 10과 같이 구성하여 Hetero FcA-IL-2 및 Hetero FcB 각각에 대한 유전자 서열(서열번호 17 및 18)을 합성 후 pGBC1.0 vector에 2개의 유전자를 모두 삽입하였다.
종류 DNA 서열
Kozak + 시그널 펩티드 서열 GCCACCATGAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTTCTGTTCTCCAGCGCCTACAGC
Hetero FcA gataagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccaagcgttttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtcgatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtcgacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgccagctcctatcgagaaaaccatctccaaggctaagggccagcctcgcgaacctcgggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgtggtgcctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagtccaatggccagcctgagaacaactacaagaccacacctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaaatccctgagcctgtctcctggc
링커 ggaggtggatctggtggaggatctggaggaggttctggtgga
IL-2 C125S gcccctacttctagctctactaagaaaacgcagctccagcttgaacacctcctgttggatctgcagatgatcctgaacggcatcaacaactacaagaaccctaagctgaccagaatgctgacctttaagttttacatgcctaagaaggccacagagctgaagcacctgcagtgtctggaggaggagctgaagcctctggaggaggtgctgaacctggcccagtctaagaactttcacctgagacctagagatctgatctctaacatcaacgtgatcgtgttggagctgaagggctctgagaccaccttcatgtgtgagtacgccgatgagacagccacaatcgtggagtttctgaacagatggatcaccttctcccagtctatcatctctacgctgacctga
Hetero FcB gataagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccaagcgttttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtcgatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtcgacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgccagctcctatcgagaaaaccatctccaaggctaagggccagcctcgcgaacctcaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccgagaatcaggtgtccctgtcctgcgccgtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagtccaatggccagcctgagaacaactacaagaccacacctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctggtgagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaaatccctgagcctgtctcctggc
[설계된 Hetero FcA-IL-2 DNA 서열] (서열번호 17)
GCCACCATGAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTTCTGTTCTCCAGCGCCTACAGCgataagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccaagcgttttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtcgatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtcgacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgccagctcctatcgagaaaaccatctccaaggctaagggccagcctcgcgaacctcgggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgtggtgcctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagtccaatggccagcctgagaacaactacaagaccacacctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaaatccctgagcctgtctcctggcggaggtggatctggtggaggatctggaggaggttctggtggagcccctacttctagctctactaagaaaacgcagctccagcttgaacacctcctgttggatctgcagatgatcctgaacggcatcaacaactacaagaaccctaagctgaccagaatgctgacctttaagttttacatgcctaagaaggccacagagctgaagcacctgcagtgtctggaggaggagctgaagcctctggaggaggtgctgaacctggcccagtctaagaactttcacctgagacctagagatctgatctctaacatcaacgtgatcgtgttggagctgaagggctctgagaccaccttcatgtgtgagtacgccgatgagacagccacaatcgtggagtttctgaacagatggatcaccttctcccagtctatcatctctacgctgacctga
[설계된 Hetero FcB DNA 서열] (서열번호 18)
GCCACCATGAAGTGGGTCACCTTCATCTCCCTGCTGTTTCTGTTCTCCAGCGCCTACAGCgataagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccaagcgttttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtcgatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtcgacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgccagctcctatcgagaaaaccatctccaaggctaagggccagcctcgcgaacctcaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccgagaatcaggtgtccctgtcctgcgccgtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagtccaatggccagcctgagaacaactacaagaccacacctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctggtgagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaaatccctgagcctgtctcctggc
상기 벡터를 이용하여 발현되는 재조합 단백질의 서열은 아래와 같다.
[Hetero FcA-IL-2] (서열번호 19)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGSGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
[Hetero FcB] (서열번호 20)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTENQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4-2. 단백질 발현
ExpiCHOTM 세포에 각 발현 벡터를 트랜스펙션하여 일시적으로 각 단백질을 발현하였다. 트랜스펙션은 초기 세포 밀도 6 x 106 cells/mL 및 발현 벡터 농도 0.8μgDNA/mL 조건에서 진행되었으며, 이 과정에서 ExpiCHOTM Expression Medium, OptiPROTM SFM 및 ExpiFectamineTM 트랜스펙션 키트(Gibco)를 제조사 지침에 따라 사용하였다.
트랜스펙션 과정을 거친 세포들을 이산화탄소 인큐베이터에서 세포생존률 75%까지 배양한 후, 원심분리를 통해 재조합 단백질을 함유하는 세포 배양액과 세포로 분리하였다.
4-3. 단백질 정제
재조합 단백질을 포함하는 배양액에서 목표 단백질들을 분리하기 위해 FPLC를 이용하여 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography)와 사이즈 분리 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 시행하였다.
먼저 AKTA avant25 FPLC에 HiTrap MabselectXtra (CV = 5 mL) 컬럼을 연결한 뒤 PBS (3 mM Na2HPO4 1.1 mM KH2PO4 0.16 M NaCl pH 7.2)를 이용하여 평형시켰다. 원심분리를 통해 획득된 배양액을 0.22μm 여과 필터로 여과하여 투입하였다.
배양액이 컬럼을 다 통과한 뒤, 컬럼을 PBS (5 CV), 50 mM NaOAc pH 5.2 (5 CV) 로 순차적으로 세척 후, Elution buffer (0.1 M Glycine pH 3.0)를 이용하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질에 최종농도가 100 mM 이 되도록 1 M TrisHCl pH 8.5 버퍼를 첨가하여 pH를 중성으로 변경하였다. 이후 Amicon tube (MWCO : 50 K)를 이용하여 단백질을 0.5 mL 로 농축하였다.
분리 크로마토그래피를 시행하기 위해 AKTA avant25 FPLC에 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg을 연결한 뒤, PBS (3 mM Na2HPO4 1.1 mM KH2PO4 0.16 M NaCl pH 7.2)를 이용하여 평형시켰다. 농축된 단백질을 투입하여 정제하고 PBS로 버퍼 교체하였다.
실험예 6: Fc-IL-2Rα 돌연변이 단백질과 Hetero Fc-IL-2 단백질의 결합능 확인
동종이량체 Fc-IL-2Rα 단백질 야생형과 동종이량체 Fc-IL-2Rα 단백질 돌연변이 각각을 1.5 nM이 되도록 ELISA coating buffer (Abcam)에 희석한 뒤, 96 well immunoplate에 코팅하였다(4℃, O/N).
다음 날 반응액을 제거한 후 1 X TBST를 이용하여 3번 세척하였다. 이후 1X Blocking buffer (Abcam)을 이용하여 단백질이 코팅되지 않은 바닥면을 Blocking 시켰다(RT, 1 hr). 이후 비오틴화(biotinylation) 시킨 Hetero Fc-IL-2 (Hetero FcA-IL-2(C125S) : Hetero FcB)를 0.2μM 부터 5배씩 희석한 농도별로 넣고 반응시켰다(RT, 1 hr). 반응액을 제거하고 1 X TBST를 이용하여 3번 세척하였다.
HRP-conjugated anti-SA antibody를 이용하여 반응시키고(RT, 30 min, Dark), 이후 반응액을 제거한 다음 1 X TBST를 이용하여 5번 세척하였다. TMB Solution (Abcam)을 이용하여 반응시키고(RT, 2 min), Microplate reader로 OD450을 측정하였다. 상기 흡광도 측정 결과를 도 21 및 아래 표 11에 나타내었다.
Fc-IL-2Rα EC50 [nM] WT 대비 Fold
WT 36.02 1.00
M01 3.679 9.79
M02 9.214 3.91
M03 7.69 4.68
M04 7.635 4.72
M05 8.801 4.09
M06 1.487 24.22
M07 2.008 17.94
M08 2.444 14.74
M09 2.616 13.77
M10 5.342 6.74
M11 2.482 14.51
실험 결과에 따르면, 모든 IL-2Rα 돌연변이가 야생형보다 Hetero Fc-IL-2와 친화도가 높은 것으로 확인되었으며, 특히 상기 M06 돌연변이의 경우 친화도가 가장 높은 결과를 나타냈다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 인터류킨(IL-2) 단백질, 인터류킨-2 수용체 서브유니트 알파(IL-2Rα) 단백질 및 Fc 영역을 포함하고, 여기서
    상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질은 각각 상기 Fc 영역에 연결되어 있거나, 또는
    상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질이 서로 연결된 복합체가 상기 Fc 영역에 연결되어 있는 것인, IL-2 융합단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 Fc 영역이 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬을 포함하며, 상기 IL-2 단백질이 제1 Fc 사슬에 연결되어 있고, 상기 IL-2Rα 단백질이 제2 Fc 사슬에 연결되어 있으며, 상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질은 서로 간에 공유결합으로 연결되어 있지 않은 것인, IL-2 융합단백질.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질 및 IL-2Rα 단백질 중 하나 이상이 링커를 통해 Fc 영역에 연결되어 있는 것인, IL-2 융합단백질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 복합체는 상기 IL-2Rα 단백질이 상기 IL-2 단백질의 나선구조(helix) A, B, C 및 D 중 어느 두 나선구조들 사이에 결합되어 있는 것인, IL-2 융합단백질.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질이 서열번호 1과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, IL-2 단백질의 나선구조 중 하나 이상의 아미노산 서열, IL-2 단백질의 순환 치환체(circular permutation), 또는 이들의 변이체를 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열 번호를 기준으로 T37K 및 C125S 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2Rα 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편, IL-2Rα 단백질의 세포외 도메인, 스시(Sushi) 도메인, 또는 이들의 변이체를 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2Rα 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 L2, M25, N27, S39, L42, L45, N57, I118, H120 및 K153 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2Rα 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 L2D, L2E, L2Q, M25L, M25I, N27A, N27T, N27I, N27Y, S39K, L42F, L42I, L42A, L42V, L45R, N57E, I118R, H120A, H120D, H120K, H120Y, H120L, H120W, H120R 및 K153G 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2Rα 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 S39K, L45R 및 H120L 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 이 때 상기 IL-2 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열 번호를 기준으로 T37K 및 C125S 중 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함할 수 있는 것인, IL-2 융합단백질.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2Rα 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 아래의 조합 중에서 선택된 아미노산 치환을 포함하는 것인, IL-2 융합단백질:
    (a) M25L, N27Y, L42I 및 H120W의 아미노산 치환(M01);
    (b) M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E 및 H120W의 아미노산 치환(M02);
    (c) M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E, H120W 및 K153G의 아미노산 치환(M03);
    (d) M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E, I118R, H120W 및 K153G의 아미노산 치환(M04);
    (e) L2Q, M25L, N27Y, S39K, L42I, L45R, N57E, I118R 및 H120W의 아미노산 치환(M05);
    (f) M25I, N27Y, L42A, I118R, H120W 및 K153G의 아미노산 치환(M06);
    (g) L2Q, M25I, N27Y, L42A, I118R 및 H120W의 아미노산 치환(M07);
    (h) L2Q, M25I, N27Y, L42V, I118R, H120W 및 K153G의 아미노산 치환(M08);
    (i) M25I, N27Y, L42I, I118R, H120W 및 K153G의 아미노산 치환(M09);
    (j) L2Q, M25I, N27Y, L42I, I118R 및 H120W의 아미노산 치환(M10); 및
    (k) L2Q, M25I, N27Y, L42I, N57E, I118R, H120W 및 K153G의 아미노산 치환(M11).
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2Rα 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열 번호를 기준으로 A114D, F121A 및 V122A 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 Fc 영역이 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬을 포함하는 이종이량체이며,
    상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중 어느 한 사슬이 T366에서의 아미노산 치환을 포함하고,
    다른 한 사슬이 T366, L368 및 Y407 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하며,
    여기서 상기 아미노산 번호는 KABAT 문헌의 EU 넘버링을 기준으로 하는 것인, IL-2 융합단백질.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 제1 Fc 사슬 및 제2 Fc 사슬 중,
    어느 한 사슬이 K360에서의 아미노산 치환을 더 포함하고,
    다른 한 사슬이 Q347에서의 아미노산 치환을 더 포함하며,
    여기서 상기 아미노산 번호는 KABAT 문헌의 EU 넘버링을 기준으로 하는 것인, IL-2 융합단백질.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합단백질이 Fc 영역의 하나 이상의 사슬에 연결된 하나 이상의 결합 도메인 단백질 또는 약물을 더 포함하는 것인, IL-2 융합단백질.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 IL-2 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제 16 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  18. 제 16 항의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 IL-2 융합단백질을 코딩하는 1종 이상의 발현 벡터를 준비하는 단계; 및
    상기 발현 벡터를 숙주 세포에서 발현시키고 단백질을 수득하여 융합단백질을 형성하는 단계
    를 포함하는, IL-2 융합단백질 제조방법.
  20. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 IL-2 융합단백질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2022/020885 2021-12-20 2022-12-20 인터류킨-2 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 WO2023121254A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0182903 2021-12-20
KR20210182903 2021-12-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023121254A1 true WO2023121254A1 (ko) 2023-06-29

Family

ID=86903402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/020885 WO2023121254A1 (ko) 2021-12-20 2022-12-20 인터류킨-2 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023121254A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020041865A1 (en) * 2000-01-20 2002-04-11 Richard Austin Methods for treating tumors
WO2010020766A2 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 Asterion Limited Interleukin fusion polypeptides
US20130089516A1 (en) * 2010-04-02 2013-04-11 University Of Rochester Protease activated cytokines
WO2021011353A1 (en) * 2019-07-12 2021-01-21 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020041865A1 (en) * 2000-01-20 2002-04-11 Richard Austin Methods for treating tumors
WO2010020766A2 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 Asterion Limited Interleukin fusion polypeptides
US20130089516A1 (en) * 2010-04-02 2013-04-11 University Of Rochester Protease activated cytokines
WO2021011353A1 (en) * 2019-07-12 2021-01-21 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VAZQUEZ-LOMBARDI RODRIGO ET AL: "Potent antitumour activity of interleukin-2-Fc fusion proteins requires Fc-mediated depletion of regulatory T-cells", NATURE COMMUNICATIONS, NATURE PUBLISHING GROUP, UK, vol. 8, 12 May 2017 (2017-05-12), UK, XP002773463, ISSN: 2041-1723, DOI: 10.1038/ncomms15373 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020197230A1 (ko) 인간 히알루로니다제 ph20의 변이체와 약물을 포함하는 피하투여용 약학 조성물
AU2016346870B2 (en) Dual function proteins and pharmaceutical composition comprising same
WO2014084607A1 (ko) 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도
WO2018030806A1 (ko) 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
WO2010123290A2 (ko) 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법
WO2020218829A1 (ko) 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
WO2017052329A1 (en) Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
WO2015152618A1 (ko) 면역글로불린 fc 단편 결합을 이용한 단백질 및 펩타이드의 용해도를 개선시키는 방법
WO2017065484A1 (ko) 효모접합을 이용한 항체 ch3 도메인 이종이중체 돌연변이쌍 제조방법 및 이에 의하여 제조된 ch3 돌연변이체 쌍
EP3262075A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2019066586A1 (ko) 글루카곤 유사 펩타이드-2(glp-2) 유도체의 지속형 결합체
WO2017116207A1 (ko) Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
WO2016199964A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
WO2023121254A1 (ko) 인터류킨-2 융합단백질, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물
WO2012137993A1 (en) Antibodies against angiopoietins 1 and 2, and their use
WO2022035201A1 (ko) Il-12 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2019132579A2 (ko) 세포질 침투 항체에 융합된 rna 분해효소를 포함하는 면역독소
WO2021071319A1 (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
WO2021101349A1 (ko) Ror1 및 b7-h3에 결합하는 항체, 이를 포함하는 항체-약물 접합체 및 그 용도
WO2020138868A1 (ko) 타입 1 인터페론 중화 fc-융합 단백질 및 이의 용도
WO2020204305A1 (ko) 항-메소텔린 항체, 항-cd3 항체 또는 항-egfr 항체를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체 및 이의 용도
WO2023224429A1 (ko) Light 단백질 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2023153880A1 (ko) Il-12 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
WO2024029876A1 (ko) 변형된 융합 단백질 및 이의 용도
WO2024107006A1 (en) Dual function proteins and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22911887

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1