WO2023101359A1 - Pip4k2c 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

Pip4k2c 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물 Download PDF

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정다운
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating cancer by discovering PIP4K2C as a novel cancer treatment target and using the same.
  • Cancer is one of the diseases that account for the largest share of the causes of death of modern people. It is a disease caused by changes in normal cells due to mutations in genes caused by various causes. refers to malignant tumors. Cancer is characterized by "uncontrolled cell growth", and by this abnormal cell growth, a cell mass called a tumor is formed and penetrates into surrounding tissues and, in severe cases, may metastasize to other organs of the body. . Cancer is an intractable chronic disease that in many cases cannot be fundamentally cured even when treated with surgery, radiation, and drug therapy, causing pain to patients and ultimately leading to death. In particular, in recent years, the incidence of cancer in the world is increasing by more than 5% every year due to the increase in the elderly population and environmental degradation. It is estimated that 10,000 people will die of cancer.
  • Rhabdomyosarcoma is an undifferentiated tumor that occurs in the muscles of the body and can appear throughout the body. It mainly occurs in children and adolescents and accounts for about 60 to 70% of all soft tissue sarcomas. Symptoms depend on the location of the tumor, and the exact cause is unknown. Rhabdomyosarcoma is histologically divided into embryonal and alveolar. Among them, the alveolar type accounts for 20 to 25% of rhabdomyosarcomas, and has a poor prognosis because it has a gene fusion of PAX3/7-FOXO1.
  • rhabdomyosarcoma Treatment of rhabdomyosarcoma involves various methods such as surgery, radiation, and chemotherapy, and customized treatment is performed depending on the location of the tumor or whether the gene is translocated.
  • the 5-year survival rate for relapsed or metastasized rhabdomyosarcoma is very low at 20 to 30%, it is necessary to develop new, more effective therapies.
  • the present invention was completed in order to solve the above problems.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop an effective new therapeutic agent for cancer, which is difficult to fundamentally treat and has a high recurrence rate.
  • the PIP4K2C gene was discovered as a new target for cancer treatment for the first time and the expression of PIP4K2C was suppressed, breast, lung, pancreatic, colorectal, and rhabdomyosarcoma cell lines were efficiently killed, and various PIP4K2C inhibitors became the fundamental treatment composition for cancer. was found to be useful.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition effective for treatment by presenting a new target for cancer treatment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a PIP4K2C inhibitor as an active ingredient.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop an effective new therapeutic agent for cancer, which is difficult to fundamentally treat and has a high recurrence rate.
  • the PIP4K2C gene was discovered as a new target for cancer treatment for the first time and the expression of PIP4K2C was suppressed, breast, lung, pancreatic, colorectal, and rhabdomyosarcoma cell lines were efficiently killed, and various PIP4K2C inhibitors became the fundamental treatment composition for cancer. was found to be useful.
  • cancer refers to or refers to a physiological condition typically characterized by unregulated cell growth in mammals.
  • Cancer to be prevented, improved, or treated in the present invention may be a solid tumor formed by the abnormal growth of cells in a solid organ, and depending on the site of the solid organ, gastric cancer, liver cancer, It may be glioblastoma, ovarian cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, rhabdomyosarcoma, pancreatic cancer, melanoma or lung cancer, but is not limited thereto.
  • rhabdomyosarcoma refers to a tumor that occurs in rhabdomyosarcoma as a very aggressive form of cancer that occurs in mesenchymal cells that have not differentiated into myocytes of skeletal muscle.
  • embryonic rhabdomyosarcoma refers to the most common soft tissue sarcoma occurring in children as a rare histological form of connective tissue in which mesenchymal-derived malignant cells are similar to the primitive developing skeletal muscle of a fetus. do. Genetic rhabdomyosarcoma is also known as fusion-negative rhabdomyosarcoma (FN-RMS).
  • alveolar Rhabdomyosarcoma refers to a subtype of rhabdomyosarcoma soft tissue cancer, derived from mesenchymal cells and related to skeletal muscle cells.
  • Alveolar rhabdomyosarcoma tumors resemble the alveolar tissue of the lungs, and although the location of the tumor varies from patient to patient, it is commonly found in the head and neck region, urinary organs, trunk, and extremities in men and women.
  • Pediatric and juvenile alveolar rhabdomyosarcoma accounts for approximately 1% of all malignancies, has an incidence per million, and occurs sporadically in most cases without a genetic predisposition.
  • pleomorphic Rhabdomyosarcoma refers to a rare soft tissue sarcoma characterized by almost exclusively developing adults, consisting of unusual polygonal, round, spindle cells with evidence of skeletal muscle differentiation. Patients usually have rapidly growing, painful masses located in the deep soft tissue of the extremities, but also have other anatomical regions, and the prognosis is generally poor.
  • botryoid Rhabdomyosarcoma appears as a multivesicular or bract-like lesion under the mucous membrane, does not penetrate the epithelium, and has a ductal appearance. It is almost always found in mucosal organs, including the vagina, bladder, and nasopharynx, and often appears as round, grape-like lumps in affected organs in infants under one year of age. Histologically, the cells of the botryoid variant are defined by a dense tumor layer beneath the epithelium.
  • prevention refers to suppressing the occurrence of a disease or condition in a subject who has not been diagnosed with the disease or disease, but is likely to suffer from the disease or disease.
  • the term “treatment” refers to (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of the disease, condition or symptom; or (c) eliminating the disease, disorder or condition.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is administered to a subject, the expression level or activity of PIP4K2C is reduced, thereby inhibiting, eliminating, or alleviating tumor progression. Therefore, the composition of the present invention may be a composition for treating these diseases by itself, or may be administered together with other anti-cancer pharmacological components to be applied as a therapeutic adjuvant for cancer. Accordingly, in the present specification, the term “treatment” or “therapeutic agent” includes the meaning of “therapeutic aid” or “therapeutic agent”.
  • administration refers to directly administering a therapeutically effective amount of the composition of the present invention to a subject so that the same amount is formed in the body of the subject.
  • the term "therapeutically effective amount” means the content of the composition contained in a sufficient level to provide a therapeutic or preventive effect of the pharmacological component in the composition to the subject to whom the pharmaceutical composition of the present invention is to be administered. It is meant to include “a prophylactically effective amount”.
  • the cancer is ovarian cancer, rhabdomyosarcoma, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract Cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulva Carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymph
  • the PIP4K2C inhibitor is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to PIP4K2C, an aptamer that specifically binds to PIP4K2C, a nucleic acid molecule that inhibits the expression of a nucleotide encoding PIP4K2C, Or a composition comprising a low molecular weight compound that inhibits the expression of PIP4K2C.
  • the PIP4K2C inhibitor is composed of Dutasteride, Aprepitant, Ivacaftor, Adapalene and pharmaceutically acceptable salts thereof. It is at least one low molecular weight compound selected from the group.
  • the present invention provides a screening method for a composition for preventing or treating rhabdomyosarcoma comprising the following steps.
  • the test substance is determined as a composition for preventing or treating rhabdomyosarcoma.
  • biological sample is any sample containing cells expressing PIP4K2C obtained from mammals, including humans, and includes, but is not limited to, tissues, organs, cells, or cell cultures.
  • the biological sample is whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, leukocyte buffy coat, plasma, serum ), sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva ), peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells (cell), tissue, tissue-derived cells, cell extract (cell extract) and cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid) characterized in that selected from the group consisting of, a method, but is not limited thereto.
  • test substance used while referring to the screening method of the present invention refers to an unknown substance used in screening to test whether it affects the activity or expression level of PIP4K2C by being added to a sample containing cells expressing PIP4K2C.
  • the test substance includes, but is not limited to, compounds, nucleotides, peptides and natural extracts.
  • the step of measuring the expression level or activity of PIP4K2C in the biological sample treated with the test substance may be performed by various methods for measuring the expression level and activity known in the art. As a result of the measurement, when the expression level or activity of PIP4K2C is reduced, the test substance may be determined as a composition for preventing or treating cancer.
  • the term "decrease in activity or expression level” means a decrease in the expression level of PIP4K2C measured in the group administered with the test substance or a unique function or expression level in vivo compared to PIP4K2C measured in the control group.
  • a decrease in activity includes a decrease in ultimate activity due to a decrease in stability as well as a simple decrease in function. Specifically, it may refer to a state in which the activity or expression level is reduced by 20% or more, more specifically, a state reduced by 40% or more, and more specifically, a state decreased by 60% or more, compared to the control group.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer comprising, as an active ingredient, an agent for measuring the expression level of a PIP4K2C protein or a gene encoding the same.
  • the term “high expression” refers to a case where the expression level of PIP4K2C protein or PIP4K2C gene is significantly higher than that of a normal individual, specifically, when the expression level is 30% or more of the normal individual, more specifically, 50% It means the case of more than 70% or more, most specifically.
  • the term "individual” refers to an individual to whom a sample for measuring the expression level of a PIP4K2C protein or a gene encoding the same is provided and ultimately analyzed for cancer occurrence.
  • Subjects include, without limitation, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cows, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons or rhesus monkeys, specifically humans. Since the composition of the present invention provides information for predicting the genetic risk of future cancer diagnosis as well as current cancer status, the subject of the present invention may be a cancer patient or a healthy subject who has not yet developed cancer. .
  • the agent for measuring the expression level of the PIP4K2C protein is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the PIP4K2C protein, an aptamer that specifically binds to PIP4K2C, or expression of PIP4K2C. It is a composition characterized in that it is a low molecular weight compound that inhibits.
  • the PIP4K2C protein of the present invention can be detected according to an immunoassay method using an antigen-antibody reaction, and can be used to analyze whether an individual has cancer.
  • an immunoassay can be performed according to various immunoassay or immunostaining protocols previously developed.
  • antibodies labeled with radioactive isotopes may be used.
  • the antibody specifically recognizing the PIP4K2C protein is a polyclonal or monoclonal antibody, specifically a monoclonal antibody.
  • Antibodies of the present invention can be produced by methods commonly practiced in the art, such as fusion methods, recombinant DNA methods, or phage antibody library methods.
  • Cancer can be predicted by analyzing the strength of the final signal by the above-described immunoassay process. That is, when the signal for the PIP4K2C protein in the sample of the subject is stronger than that of the normal sample, it is determined to be cancer.
  • antigen binding fragment refers to a part of a polypeptide capable of binding to an antigen among the entire immunoglobulin structure, for example, F(ab')2, Fab', Fab, Fv and scFvs, but are not limited thereto.
  • binding means the same as “specifically recognizing”, and specifically interacts with an antigen and an antibody (or a fragment thereof) through an immunological reaction. means to do
  • an aptamer that specifically binds to the PIP4K2C protein may be used instead of an antibody.
  • the term “aptamer” refers to a single-stranded nucleic acid (RNA or DNA) molecule or peptide molecule that binds to a specific target substance with high affinity and specificity.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the PIP4K2C protein is a primer or probe that specifically binds to the nucleic acid molecule of the gene.
  • nucleic acid molecule has the meaning of comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are basic structural units in nucleic acid molecules, are not only natural nucleotides, but also sugar or base sites that are modified. Also included are analogs.
  • primer refers to conditions in which synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, that is, the presence of nucleotides and a polymerizing agent such as DNA polymerase, synthesis under conditions of suitable temperature and pH. refers to an oligonucleotide that serves as the starting point of Specifically, the primer is a single chain deoxyribonucleotide.
  • Primers used in the present invention may include naturally occurring dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides, and may also include ribonucleotides.
  • the primer of the present invention may be an extension primer that anneals to a target nucleic acid to form a sequence complementary to the target nucleic acid by a template-dependent nucleic acid polymerase, which is extended to a position where the immobilized probe is annealed, so that the probe becomes occupies the annealed area.
  • the extension primer used in the present invention includes a hybrid nucleotide sequence complementary to a specific nucleotide sequence of a target nucleic acid, for example, the PIP4K2C gene.
  • the term "complementary" means that a primer or probe is sufficiently complementary to selectively hybridize to a target nucleic acid sequence under predetermined annealing or hybridization conditions, substantially complementary and perfectly complementary. ), and specifically means completely complementary cases.
  • substantially complementary sequence means not only sequences that are completely identical, but also sequences that are partially inconsistent with the sequence to be compared, within the range of annealing to a specific sequence and acting as a primer.
  • the primer must be long enough to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerization agent.
  • the suitable length of a primer depends on a number of factors, such as temperature, pH and the source of the primer, but is typically 15 to 30 nucleotides. Shorter primer molecules generally require lower temperatures to form a sufficiently stable hybrid complex with the template.
  • the design of such primers can be easily performed by those skilled in the art by referring to the target nucleotide sequence, and can be performed using, for example, a primer design program (eg, PRIMER 3 program).
  • the term "probe” refers to a linear oligomer having a natural or modified monomer or linkage including deoxyribonucleotide and ribonucleotide capable of hybridizing to a specific nucleotide sequence. Specifically, the probe is single-stranded for maximum efficiency in hybridization, more specifically a deoxyribonucleotide.
  • a sequence perfectly complementary to a specific nucleotide sequence of the PIP4K2C gene may be used, but a sequence substantially complementary within a range that does not interfere with specific hybridization is used It could be. In general, since the stability of a duplex formed by hybridization tends to be determined by the matching of the terminal sequence, it is preferable to use a probe complementary to the 3'-end or 5'-end of the target sequence. do.
  • diagnosis composition refers to an integrated mixture or device including a means for measuring the expression level of PIP4K2C protein or PIP4K2C gene in order to determine whether or not a subject has cancer or predict the possibility of developing cancer. It can also be expressed as a “diagnostic kit”.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a PIP4K2C inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention discovers PIP4K2C as a new treatment target for intractable cancer, which is difficult to fundamentally treat and has a high recurrence rate, as well as by selecting a drug that inhibits PIP4K2C among known anticancer agents, an efficient and fundamental treatment composition for cancer.
  • Figure 4 shows the results of confirming the anticancer effect of Ivacaftor on colon cancer, pancreatic cancer, lung cancer and breast cancer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of confirming the anticancer effect of adapalene on colon cancer, pancreatic cancer, lung cancer and breast cancer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the results of confirming the anticancer effect of dutasteride on colon cancer, pancreatic cancer and lung cancer, according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention is to develop an effective new therapeutic agent for intractable cancer, which is difficult to treat fundamentally and has a high recurrence rate.
  • the present invention is for effective cancer treatment by using the expression level of a specific gene in a biological sample to be tested.
  • RPMI1640 penicillin and streptomycin used for cell culture were purchased from GIBCO, and fetal bovine serum (FBS) was purchased from Invitrogen.
  • FBS fetal bovine serum
  • MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide
  • DMSO was purchased from Sigma-Aldrich. Purchased.
  • the FDA approved drug library was purchased from Selleckchem.
  • Example 1-2 cell culture
  • SJCRH30 human alveolar rhabdomyosarcoma cells were purchased from ATCC. Cells were cultured in RPMI1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin and streptomycin. CCD-18Co human colon fibroblasts were purchased from Korea Cell Line Bank. Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin and streptomycin, and all cells were cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin and streptomycin 1% penicillin and streptomycin
  • Cell proliferation was evaluated by MTT assay.
  • SJCRH30 and CCD-18Co were inoculated three times in a 96-well plate at a cell density of 2 x 10 4 per well.
  • the FDA-approved drug was diluted in a medium without fetal bovine serum (FBS) and treated.
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium was changed to MTT solution (0.5 mg/mL) and the plate was incubated at 37°C and 5% CO 2 conditions. After 60 minutes of incubation, the supernatant was removed and 50 ⁇ L of DMSO was added.
  • the optical density in each well was measured at 570 nm using a microplate reader (VersaMax, Molecular Devices, USA).
  • MTT assay was performed to evaluate the effect of FDA-approved drugs on the proliferation of rhabdomyosarcoma cells (SJCRH30).
  • Rhabdomyosarcoma cells were treated with 18 drugs at concentrations of 5 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively, and observed after 24 hours.
  • MTT assay was performed to evaluate the toxicity of Ivacaftor to normal cells, which showed the highest cell proliferation reducing effect.
  • Rhabdomyosarcoma cells (SJCRH30) and colon fibroblasts (CCD-18Co) were treated with Ivacaftor at concentrations of 0.625 ⁇ M, 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 10 ⁇ M and compared.
  • MTT assay was performed to compare IC 50 (half maximal inhibitory concentration) for rhabdomyosarcoma cells (SJCRH30) of pazopanib HCl and Ivacaftor used for soft tissue sarcoma patients did Pazopanib hydrochloride (pazopanib HCl) and Ivacaftor (0.625 ⁇ M, 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 40 ⁇ M, 60 ⁇ M concentrations of 0.625 ⁇ M, 40 ⁇ M, 60 ⁇ M was observed after treatment for 24 hours.
  • IC 50 of pazopanib hydrochloride and ivacapto were 40.870 ⁇ M and 5.111 ⁇ M, respectively, confirming that ivacapto was more effective against rhabdomyosarcoma cells (SJCRH30) (FIG. 3).
  • Ivacaftor and Adapalene were treated with colon cancer cells (HCT-116), pancreatic cancer cells (PANC-1), lung cancer cells (A549), and breast cancer cells (MDA-MB-231), In the case of Dutasteride, colon cancer cells (HCT-116), pancreatic cancer cells (PANC-1), and lung cancer cells (A549) were treated to perform MTT analysis.
  • the three drugs were observed after 24 hours of treatment at concentrations of 0.625 ⁇ M, 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 10 ⁇ M.
  • Ivacaftor showed a significant decrease in cell proliferation in pancreatic cancer cells (PANC-1), lung cancer cells (A549), and breast cancer cells (MDA-MB-231) (FIG. 4).
  • Adapalene showed a significant decrease in cell proliferation in colon cancer cells (HCT-116), pancreatic cancer cells (PANC-1), lung cancer cells (A549), and breast cancer cells (MDA-MB-231) (Fig. 5).
  • Dutasteride showed a reduction in cell proliferation in colon cancer cells (HCT-116), pancreatic cancer cells (PANC-1), and lung cancer cells (A549) (FIG. 6).
  • the present invention is to develop an effective new therapeutic agent for intractable cancer, which is difficult to treat fundamentally and has a high recurrence rate.
  • the present invention is for effective cancer treatment by using the expression level of a specific gene in a biological sample to be tested.
  • PIP4K2C inhibitors are a fundamental treatment composition for cancer Therefore, it is expected to be used very effectively in the treatment of cancer patients.

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Abstract

본 발명은 PIP4K2C의 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 근본적인 치료가 어렵고 재발률이 높은 암에 대한 신규한 치료 타깃으로서 PIP4K2C를 발굴함은 물론 공지된 항암제 중 PIP4K2C를 억제하는 약물을 선별함으로써, 암에 대한 효율적이고 근원적인 치료 조성물을 제공한다.

Description

PIP4K2C 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물
본 발명은 신규한 암 치료 타겟으로서 PIP4K2C를 발굴하고, 이를 이용하여 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 현대인의 사망원인에서 가장 큰 비중을 차지하고 있는 질환 중 하나로서 여러가지 원인에 의하여 발생된 유전자의 돌연변이로 인하여 정상세포가 변화하여 발생된 질병으로서, 정상적인 세포의 분화, 증식, 성장 형태 등을 따르지 않는 종양 중 악성인 것을 지칭한다. 암이란, "제어되지 않은 세포성장"으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포 성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투되고, 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 약물 요법 등으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 특히, 최근에는 노년 인구의 증가, 환경 악화 등으로 인하여 세계 암 발생률은 매년 5% 이상 증가되고 있는 추세이며, WHO 보고서에 따르면 향후 25년 내 암 발생 인구는 3천 만명으로 증가되고, 이중 2천 만명의 인구는 암으로 사망할 것으로 추정되고 있다.
횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)은 우리 몸의 근육에서 발생하는 미분화 종양으로 전신에 걸쳐 나타날 수 있다. 주로 소아 청소년기에서 발생하며 전체 연부조직육종의 60 내지 70 %가량을 차지한다. 증상은 종양이 생긴 위치에 따라 다르며 정확한 발병원인은 알려져 있지 않다. 횡문근육종은 조직학적으로 크게 배아형(embryonal)과 포상형(alveolar)로 나뉜다. 이 중 포상형(alveolar)은 횡문근육종의 20 내지 25%를 차지하며, PAX3/7-FOXO1의 유전자 융합을 갖고 있어 예후가 좋지 않다.
횡문근육종의 치료는 수술, 방사선, 항암 화학 요법과 같은 다양한 방법이 병행되며, 종양의 위치나 유전자의 전위여부 등에 따라 맞춤 치료가 이루어진다. 하지만 재발되거나 전이된 횡문근육종에 대한 5년 생존율은 20 내지 30 %로서 매우 낮기 때문에 보다 효과적인 신규 치료제 개발이 필요한 상황이다. 이에, 상기와 같은 문제를 해결하기 위해서 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 근본적인 치료가 어렵고 재발률이 높은 암에 대한 효과적인 신규 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암 치료를 위해 신규 타깃으로 PIP4K2C 유전자를 최초로 발굴하고, PIP4K2C의 발현을 억제할 경우 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암 및 횡문근육종 세포주가 효율적으로 사멸됨으로써 다양한 PIP4K2C 억제제가 암의 근원적 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 발견하였다.
따라서 본 발명의 목적은 암 치료를 위한 신규 타깃을 제시하여 치료에 효과적인 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 PIP4K2C 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 근본적인 치료가 어렵고 재발률이 높은 암에 대한 효과적인 신규 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암 치료를 위해 신규 타깃으로 PIP4K2C 유전자를 최초로 발굴하고, PIP4K2C의 발현을 억제할 경우 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암 및 횡문근육종 세포주가 효율적으로 사멸됨으로써 다양한 PIP4K2C 억제제가 암의 근원적 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 발견하였다.
본 발명에서, "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 횡문근육종, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “횡문근육종(Rhabdomyosarcoma)”은 골격근의 근세포로 분화되지 못한 중간엽 세포에서 발생하는 매우 공격적인 형태의 암으로 횡문근육세포에서 발생하는 종양을 의미한다. 발생성 횡문근육종, 폐포 횡문근육종, 평형 횡문근육종, 스핀들 세포/종양성 횡문근육종 등 4가지 아형이 있으며, 18세 이하에서 발병하는 경우가 대부분이기 때문에 일반적으로 유년기의 질병으로 간주된다.
본 발명에 따르면, “배아형횡문근육종(embryonal Rhabdomyosarcoma)”은 중간엽에서 유래된 악성 세포가 태아의 원시 발달 골격근과 유사한 결합 조직의 희귀한 조직학적 형태로써 어린이에게 발생하는 가장 흔한 연조직 육종을 의미한다. 발생성 횡문근육종은 또한 융합 음성 횡문근육종(FN-RMS)으로도 알려져 있다.
본 발명에 따르면, “폐포형횡문근육종(alveolar Rhabdomyosarcoma)”은 횡문근육종 연조직암 계열의 아형을 의미하며, 중간엽 세포에서 유래하며 골격근 세포와 관련이 있다. 폐포형횡문근육종 종양은 폐의 폐포 조직과 유사하고, 종양의 위치는 환자마다 다르지만 일반적으로 머리와 목 부위, 남성과 여성의 요로니탈 기관, 몸통, 사지에서 발견된다. 소아 및 청소년 폐포형횡문근육종은 모든 악성 종양의 약 1%를 차지하며, 백만 명 당 발병률을 가지며, 대부분의 경우 유전적 소인이 없이 산발적으로 발생한다.
본 발명에 따르면, “다형태횡문근육종(pleomorphic Rhabdomyosarcoma)”은 골격근 분화의 증거가 있는 기괴한 다각형, 원형, 스핀들 세포로 구성된 거의 성인에게만 발생하는 특징을 가진 희귀한 연조직 육종을 의미한다. 환자들은 보통 사지의 깊은 연조직에 위치한 빠르게 성장하고 고통스러운 덩어리를 가지고 있지만, 다른 해부학적 영역도 가지고 있으며 예후는 일반적으로 좋지 않다.
본 발명에 따르면, “포도형횡문근육종(botryoid Rhabdomyosarcoma)”은 점막 아래에 다포체 또는 포엽과 같은 병변으로 나타나고, 상피에 침투하지 않으며, 관내 외관을 가지고 있는 특성을 가진다. 질, 방광, 비인두 등을 포함한 점막선 장기에서 거의 항상 발견되며, 1세 미만의 유아에게 영향을 받은 장기에 둥글고 포도 같은 덩어리로 나타나는 경우가 많다. 조직학적으로, 보트리이드 변종의 세포는 상피 아래의 밀집된 종양층에 의해 정의된다.
본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 PIP4K2C의 발현량 또는 활성이 감소하여 종양의 진행을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 항암 약리성분과 함께 투여되어 암에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어 “치료” 또는 “치료제”는 “치료 보조” 또는 “치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “투여” 또는 “투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어 “치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에 “예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 암은 난소암, 횡문근육종, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 PIP4K2C 억제제는 PIP4K2C에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PIP4K2C에 특이적으로 결합하는 앱타머, PIP4K2C를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 핵산 분자, 또는 PIP4K2C의 발현을 억제하는 저분자 화합물을를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 PIP4K2C 억제제는 두타스테리드(Dutasteride), 아프레피턴트(Aprepitant), 이바카프토(Ivacaftor), 아다팔렌(Adapalene) 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저분자 화합물이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 횡문근육종의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) PIP4K2C를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 PIP4K2C의 활성 또는 발현량을 측정하거나 또는 상기 PIP4K2C를 발현하는 세포의 생존률(viability) 또는 증식률(proliferation)를 측정하는 단계,
상기 PIP4K2C의 활성 또는 발현량이 감소하거나, 또는 상기 PIP4K2C를 발현하는 세포의 생존률 또는 증식률이 감소한 경우, 상기 시험물질은 횡문근육종의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
본 발명에서 용어 “생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, PIP4K2C를 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 조직, 조직 유래 세포, 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 PIP4K2C을 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 PIP4K2C의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 PIP4K2C의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, PIP4K2C의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 암의 예방 또는 치료용 조성물로 판정될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “활성 또는 발현량의 감소”는 대조군 내 측정된 PIP4K2C보다 시험물질을 투여한 군에서 측정된 PIP4K2C의 발현량 또는 생체 내 고유한 기능 또는 발현량이 감소하는 것을 의미한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소뿐 아니라 안정성(stability)의 감소에 기인한 궁극적인 활성의 감소를 포함한다. 구체적으로는 대조군에 비하여 활성 또는 발현량이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 PIP4K2C 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, PIP4K2C 단백질과 횡문근육종과의 상관관계를 가진다는 사실을 최초로 발견하였다. 이에, 개체 내 PIP4K2C 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자가 고발현될 경우 상기 개체는 횡문근육종을 가지는 것으로 판단한다.
본 명세서에서 용어 “고발현”은 PIP4K2C 단백질 또는 PIP4K2C 유전자의 발현량이 정상 개체에 비하여 유의하게 높은 경우를 의미하며, 구체적으로는 그 발현량이 정상 개체의 30% 이상인 경우를, 보다 구체적으로는 50% 이상인 경우를, 가장 구체적으로는 70% 이상인 경우를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “개체”는 PIP4K2C 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 암 발병 여부의 분석 대상이 되는 개체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하며, 구체적으로는 인간이다. 본 발명의 조성물은 현재 암 여부뿐 아니라 향후 암 진단될 유전적 위험성을 예측하기 위한 정보도 제공하기 때문에, 본 발명의 개체는 암 환자일 수도 있고 아직 발병하지 않은 정상개체(healthy subject)일 수도 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 PIP4K2C 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 PIP4K2C 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PIP4K2C에 특이적으로 결합하는 앱타머, 또는 PIP4K2C의 발현을 억제하는 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는, 조성물이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 PIP4K2C 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 개체의 암 발병 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 PIP4K2C 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 구체적으로는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법 또는 파아지 항체 라이브러리 방법에 의해 제조될 수 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 암을 예측할 수 있다. 즉, 개체의 시료에서 PIP4K2C 단백질에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 판단된다.
본 발명에 따르면, “항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.
본 발명은 항체 대신 PIP4K2C 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 PIP4K2C 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.
본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.
본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 PIP4K2C 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15 내지 30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 PIP4K2C 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 용어 “진단용 조성물”은 대상체의 암의 발병 여부를 판단하거나 발병 가능성을 예측하기 위해 PIP4K2C 단백질 또는 PIP4K2C 유전자의 발현량 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에 “진단용 키트”로 표현될 수도 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 PIP4K2C의 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 근본적인 치료가 어렵고 재발률이 높은 난치성 암에 대한 신규한 치료 타깃으로서 PIP4K2C를 발굴함은 물론 공지된 항암제 중 PIP4K2C를 억제하는 약물을 선별함으로써, 암에 대한 효율적이고 근원적인 치료 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, SJCRH30에 24시간 FDA 승인 약물 처리 후의 MTT분석 결과를 나타낸 것이다 (*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른, SJCRH30와 CCD-18Co에 24시간 이바카프토(Ivacaftor) 처리 후의 MTT분석 결과를 나타낸 것이다 (*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른, SJCRH30에 24시간 파조파닙염산염 (pazopanib HCl)과 이바카프토(Ivacaftor) 처리 후의 MTT분석 결과를 나타낸 것이다 (*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 이바카프토(Ivacaftor)의 대장암, 췌장암, 폐암 및 유방암에 대한 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 아다팔렌(Adapalene)의 대장암, 췌장암, 폐암 및 유방암에 대한 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 두타스테리드(Dutasteride)의 대장암, 췌장암 및 폐암에 대한 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 종래의 근본적인 치료가 어렵고 재발률이 높은 난치성 암에 대한 효과적인 신규 치료제를 개발을 위한 것이다. 본 발명은 시험하고자 하는 생물학적 시료에 특정 유전자의 발현량을 이용하여 효과적인 암의 치료를 위한 것이다. 암 치료를 위해 신규 타깃으로 PIP4K2C 유전자를 최초로 발굴하고, PIP4K2C의 발현을 억제할 경우 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암 및 횡문근육종 세포주가 효율적으로 사멸됨을 발견함으로써, 다양한 PIP4K2C 억제제가 암의 근원적 치료 조성물로 횡문근육종 환자에게 최적의 치료조성물을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
이하에서는 본 발명의 알고리즘에 대한 구체적인 실시예를 상세하게 설명한다. 인포지노머(InfoGenomeR) 알고리즘을 사용하여 횡문근육종세포주(SJCRH30) 샘플의 전장 유전체(whole-genome sequencing) 데이터에서 유전변이를 찾고, 전사체(RNA sequencing) 데이터에서 발현량이 높은 유전자를 찾는다. 이후, 횡문근육종세포주 샘플에서 후보 유전자를 발굴하기 위하여 유전 변이가 존재하면서 유전자 발현량과 정수형 복제수(Integer copy number)가 높은 유전자 중 하나인 PIP4K2C를 횡문근육종 치료를 위한 신규 타깃으로 선택하였다. 마지막으로, DeepAffinity 알고리즘을 통해 FDA 승인 약물 라이브러리에서 PIP4K2C 유전자와 반응성이 높은 약물 후보군을 발굴하였다.
[실시예 1] 재료 및 실험방법
실시예 1-1. 시약
세포배양에 사용된 RPMI1640, 페니실린 및 스트렙토마이신은 GIBCO에서 구입하였고, 소태아혈청 (FBS)은 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였다. 세포증식평가를 위한 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)는 골드 바이오테크놀로지(Gold Biotechnology)에서 구입하였으며, DMSO는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. FDA 승인 약물 라이브러리는 셀렉켐(Selleckchem)에서 구입하였다.
실시예 1-2. 세포 배양
SJCRH30 인간 포상형 횡문근육종 세포(alveolar rhabdomyosarcoma)는 ATCC에서 구입하였다. 세포는 10% 소태아혈청 (FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640에서 배양되었다. CCD-18Co 인간 대장 섬유아세포(Human colon fibroblast)는 한국세포주은행에서 구입하였다. 세포는 10% 소태아혈청 (FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양되었으며, 모든 세포는 37℃, 5% CO2조건의 인큐베이터에서 배양되었다
실시예 1-3. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 어세이
세포 증식은 MTT분석을 통해 평가하였다. SJCRH30과 CCD-18Co는 웰(well)당 2 x 104 세포 밀도로 96웰 플레이트에 3회 접종하였다. 24 시간 후 FDA 승인 약물을 소태아혈청(FBS)이 없는 배지에 희석하여 처리해주었다. 24시간 인큐베이션 후, 배지를 MTT 용액(0.5mg/mL)으로 변경하고 플레이트를 37℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이션하였다. 60분 인큐베이션 후, 상층액을 제거한 뒤 50μL의 DMSO를 첨가하였다. 각 웰에서의 광학 밀도는 마이크로 플레이트 리더(VersaMax, Molecular Devices, USA)를 사용하여 570nm에서 측정되었다.
실시예 1-4. 데이터 분석
Student’s t-test는 도1의 통계적 유의성을 결정하기 위해 사용되었다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 오차 막대는 표준 편차이다.
[실시예 2] FDA 승인 약물들의 횡문근육종에 대한 항암효과 확인
FDA 승인 약물이 횡문근육종세포(SJCRH30) 증식에 미치는 영향을 평가하기 위해 MTT분석을 수행하였다. 18종의 약물을 각 5μM, 10μM 농도로 횡문근육종 세포에 처리하여 24시간 후 관찰하였다. 두타스테리드(Dutasteride), 아프레피턴트(Aprepitant), 이바카프토(Ivacaftor), 아다팔렌(Adapalene)을 처리한 세포에서 유의미한 세포증식 감소와 세포 사멸 효과(10μM)가 확인되었다(도 1).
[실시예 3] 이바카프토의 횡문근육종에 대한 선택적인 작용 확인
가장 높은 세포증식 감소 효과를 보여준 이바카프토(Ivacaftor)의 정상세포에 대한 독성을 평가하기 위해 MTT분석을 수행하였다. 횡문근육종세포 (SJCRH30)와 대장섬유아세포(CCD-18Co)에 0.625μM, 1.25μM, 2.5μM, 5μM, 10μM 농도의 이바카프토(Ivacaftor)를 처리하여 비교하였다. 횡문근육종세포(SJCRH30)에 처리한 경우 1.25μM, 2.5 μM, 5μM, 10μM에서 유의미한 세포수의 감소를 보여주었으며, 대장섬유아세포(CCD-18Co)에 처리한 경우 모든 농도에서 유의미한 세포수의 감소가 없었다. 이로 이바카프토(Ivacaftor)는 정상세포에서 독성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다 (도 2).
[실시예 4] 파조파닙염산염(pazopanib HCl)과 이바카프토(Ivacaftor)의 IC50 비교
연조직육종(soft tissue sarcoma)환자에게 쓰이는 파조파닙염산염(pazopanib HCl)과 이바카프토(Ivacaftor)의 횡문근육종세포(SJCRH30)에 대한 IC50(half maximal inhibitory concentration)를 비교하기위해 MTT분석을 시행하였다. 파조파닙염산염(pazopanib HCl)과 이바카프토(Ivacaftor)를 0.625μM, 1.25μM, 2.5μM, 5μM, 10μM, 20μM ,40μM, 60μM 농도로 24시간 처리 후 관찰하였다. 파조파닙염산염과 이바카프토의 IC50는 각각 40.870μM 과 5.111μM로 횡문근육종 세포(SJCRH30)에 대해 이바카프토의 효력이 더 큰 것으로 확인되었다 (도 3).
[실시예 5] 타 암종에 대한 항암효과 확인
횡문근육종세포(SJCRH30)에서 유의미한 세포증식 감소가 확인된 약물 중 이바카프토(Ivacaftor), 아다팔렌(Adapalene), 및 두타스테리드(Dutasteride)의 다른 암종에 대한 항암효과를 확인하였다. 이바카프토(Ivacaftor), 및 아다팔렌(Adapalene)은 대장암세포(HCT-116), 췌장암세포(PANC-1), 폐암세포(A549), 및 유방암세포 (MDA-MB-231)에 처리하였고, 두타스테리드(Dutasteride)의 경우 대장암세포 (HCT-116), 췌장암세포(PANC-1), 및 폐암세포(A549)에 처리하여 MTT분석을 수행하였다. 3종의 약물은 0.625μM, 1.25μM, 2.5μM, 5μM, 및 10μM 농도로 24시간 처리 후 관찰하였다.
이바카프토(Ivacaftor)는 췌장암세포(PANC-1), 폐암세포(A549), 및 유방암세포(MDA-MB-231)에서 유의미한 세포증식 감소를 보여주었다(도 4). 아다팔렌(Adapalene)의 경우 대장암세포(HCT-116), 췌장암세포(PANC-1), 폐암세포(A549), 및 유방암세포 (MDA-MB-231)에서 모두 유의미한 세포증식 감소를 보여주었다(도 5). 또한, 두타스테리드(Dutasteride)의 경우 대장암세포(HCT-116), 췌장암세포(PANC-1), 및 폐암세포(A549)에서 세포증식 감소를 보여주었다(도 6).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 종래의 근본적인 치료가 어렵고 재발률이 높은 난치성 암에 대한 효과적인 신규 치료제를 개발을 위한 것이다. 현재 암은 효과적인 표적치료제나 항암제가 없고, 연구가 미비하여 새로운 치료제 개발 필요성이 요구되고 있다. 본 발명은 시험하고자 하는 생물학적 시료에 특정 유전자의 발현량을 이용하여 효과적인 암의 치료를 위한 것이다. 암 치료를 위해 신규 타깃으로 PIP4K2C 유전자를 최초로 발굴하고, PIP4K2C의 발현을 억제할 경우 유방암, 폐암, 췌장암, 대장암 및 횡문근육종 세포주가 효율적으로 사멸됨을 발견함으로써, 다양한 PIP4K2C 억제제가 암의 근원적 치료 조성물로 암 환자 치료에 매우 효과적으로 이용될 것으로 기대된다.

Claims (13)

  1. PIP4K2C 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 난소암, 횡문근육종, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 PIP4K2C 억제제는 PIP4K2C에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PIP4K2C에 특이적으로 결합하는 앱타머, PIP4K2C를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 핵산 분자, 또는 PIP4K2C의 발현을 억제하는 저분자 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 PIP4K2C 억제제는 두타스테리드(Dutasteride), 아프레피턴트(Aprepitant), 이바카프토(Ivacaftor), 아다팔렌(Adapalene) 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 저분자 화합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 다음의 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법:
    (a) PIP4K2C를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 PIP4K2C의 활성 또는 발현량을 측정하거나 또는 상기 PIP4K2C를 발현하는 세포의 생존률(viability) 또는 증식률(proliferation)를 측정하는 단계,
    상기 PIP4K2C의 활성 또는 발현량이 감소하거나, 또는 상기 PIP4K2C를 발현하는 세포의 생존률 또는 증식률이 감소한 경우, 상기 시험물질은 암의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 조직, 조직 유래 세포, 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. PIP4K2C 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 PIP4K2C 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 PIP4K2C 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PIP4K2C에 특이적으로 결합하는 앱타머, 또는 PIP4K2C의 발현을 억제하는 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 PIP4K2C 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 개체에게 PIP4K2C 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  11. PIP4K2C 억제제의 암의 예방 또는 치료 용도.
  12. PIP4K2C 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 진단 방법.
  13. PIP4K2C 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제의 암 예방 또는 진단 용도.
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