WO2023090391A1 - 肺高血圧症の検査方法、肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物、及び肺高血圧症の予防又は治療薬 - Google Patents

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pulmonary
hypertension
mice
pah
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良和 中岡
理 竹内
愛 夜久
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国立研究開発法人国立循環器病研究センター
国立大学法人京都大学
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present disclosure relates to methods and test agents for testing the presence or absence of pulmonary hypertension, its severity, or its prognosis.
  • the present disclosure also relates to a pathological model animal of pulmonary arterial hypertension, a method of screening for a preventive or therapeutic agent for pulmonary arterial hypertension using the model animal, and a method of evaluating drug efficacy against pulmonary arterial hypertension.
  • the present disclosure relates to prophylactic or therapeutic agents for pulmonary hypertension.
  • Pulmonary hypertension is a group of progressive diseases with a poor prognosis that lead to cardiac and pulmonary dysfunction due to increased pressure in the pulmonary arteries.
  • Pulmonary Arterial Hypertension PAH
  • Group 1' pulmonary veno-occlusive disease (PVOD) and/or pulmonary capillary hemangiomatosis (PCH)
  • Group 1'' neonatal protraction
  • Group 2 Pulmonary hypertension associated with left heart disease
  • Group 3 Pulmonary hypertension associated with pulmonary disease and/or hypoxemia
  • Group 4 Chronic thromboembolic pulmonary hypertension ( chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH), group 5 pulmonary hypertension with unspecified multifactorial mechanisms.
  • CTEPH chronic thromboembolic pulmonary hypertension
  • PAH is a disease with a primary focus of inflammation in the peripheral pulmonary arteries (arterioles or arterioles), accompanied by pathological changes such as pulmonary artery muscleization, neointimal hyperplasia, and plexiform lesions.
  • PAH is further classified into idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH), hereditary pulmonary arterial hypertension (HPAH), drug- and toxicant-induced pulmonary arterial hypertension, and pulmonary arterial hypertension associated with various diseases. Subdivided into pulmonary hypertension (associated PAH).
  • PAH associated with various diseases includes connective tissue disease (CTD), human immunodeficiency virus (HIV) infection, portal hypertension, congenital heart disease, and schistosomiasis (Guidelines of the Japanese Circulation Society). : https://www.j-circ.or.jp/cms/wp-content/uploads/2020/02/JCS2017_fukuda_h.pdf).
  • Non-Patent Document 3 It is known that the pathogenesis of PAH is complex and possibly caused by a combination of various factors such as genetic background, epigenetic modifiers, pre-existing diseases and environmental factors (Non-Patent Document 3). ), and growth factors and cytokines are believed to contribute significantly to the pathogenesis of PAH.
  • Growth factors that may be involved in PAH include platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and bone morphogenetic proteins (BMPs).
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • BMPs bone morphogenetic proteins
  • circulating cytokines such as Il-6, Il-1 ⁇ and tumor necrosis factor (TNF) are elevated in PAH patients.
  • Animal studies have also demonstrated that cytokines contribute to the pathogenesis of PAH (Non-Patent Document 4).
  • these cytokines are regulated by factors such as aryl hydrocarbon receptors that are important
  • innate immune cells are the main producers of inflammatory cytokines in infectious diseases, and in fact, innate immune cells such as macrophages are also found to be important for PAH induction. Macrophage inflammatory responses are regulated by transcriptional and post-transcriptional mechanisms (Non-Patent Document 6), and epigenetic dysregulation and miRNAs have been found to be important pathogenesis of PAH. Post-transcriptional regulation of immune responses involves various RNA-binding proteins (RBPs) that regulate the translation and degradation of mRNAs involved in immune responses (Non-Patent Document 7). Little is known.
  • RBPs RNA-binding proteins
  • Regnase-1 (Regnase-1, a protein encoded by the ZC3H12A gene), on the other hand, is an RNA-binding protein that plays a pivotal role in post-transcriptional immunoregulation of innate and acquired immune cells (Non-patent literature). 8 and 9). Regnase-1 recognizes the stem-loop structure of the 3' untranslated region (3'UTR) and has RNase activity that degrades mRNAs involved in immune responses such as Il-6 and Il-1 ⁇ (non Patent document 10). Regnase-1-mediated mRNA degradation is initiated in a helicase UPF1-dependent manner after translation termination (Non-Patent Document 11).
  • Non-Patent Document 12 Regnase-1 regulates various immune cells
  • Non-Patent Document 13 mice deficient in Regnase-1 develop severe autoimmune inflammatory diseases.
  • mice lacking Regnase-1 in cardiomyocytes develop heart failure due to pressure overload due to coarctation of the transverse aorta
  • Non-Patent Document 13 mice lacking Regnase-1 in cardiomyocytes develop heart failure due to pressure overload due to coarctation of the transverse aorta
  • Regnase-1 is involved in diseases such as ulcerative colitis and pulmonary fibrosis (Non-Patent Documents 14-16).
  • the relationship between PH and Regnase-1 is unknown.
  • One of the purposes of the present disclosure is to identify markers that serve as indicators of the presence or absence of PH, the severity of PH, and the prognosis of PH, and use the markers to identify the presence or absence of PH and the severity of PH. , to provide a method for examining the prognosis of PH.
  • Another object of the present disclosure is to provide a model animal that spontaneously develops PAH, a method for screening a preventive or therapeutic agent for PAH using the model animal, and a method for evaluating efficacy of a test substance using the model animal. That is.
  • Still another object of the present disclosure is to provide a preventive or therapeutic agent for PH.
  • the present inventors compared the amount of Regnase-1 mRNA in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) between PH patients and healthy subjects by qPCR, and found that the Regnase-1 expression level was significantly higher in PH patients than in healthy subjects. The lower the expression level of Regnase-1 in PBMCs, the more severe PH. can be used as a PH marker.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PAH pathological model mice In addition, the preparation of conventional PAH pathological model animals required hypoxia and exposure to chemicals such as monocrotaline and Sugen5416. We found that PAH knockout mice spontaneously develop PAH without hypoxia or exposure to chemical substances, and can be used as PAH disease model mice. In addition, it was found that the PAH pathological model mouse can be used to screen preventive or therapeutic drugs for PAH and to evaluate the efficacy of test substances for PAH.
  • the present inventor administered morpholino oligos targeting the stem-loop-forming sequence of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA to PH pathological model mice, and investigated the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA. It was found that the pathology of PH was improved by destroying
  • Item 1-1 A method for examining the presence or absence of pulmonary hypertension, its severity, or its prognosis, A test method comprising the step of measuring the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1 in a sample isolated from a subject.
  • Item 1-2 The examination method according to Item 1-1, wherein the pulmonary hypertension is pulmonary arterial hypertension.
  • Item 1-3 The examination method according to Item 1-1 or 1-2, wherein the pulmonary hypertension is idiopathic pulmonary arterial hypertension, hereditary pulmonary arterial hypertension, or pulmonary arterial hypertension associated with collagen disease.
  • Item 1-4 The examination method according to Item 1-1 or 1-2, wherein the pulmonary hypertension is idiopathic pulmonary arterial hypertension.
  • Item 1-5 The examination method according to Item 1-1 or 1-2, wherein the pulmonary hypertension is hereditary pulmonary arterial hypertension.
  • Item 1-6 The examination method according to Item 1-1 or 1-2, wherein the pulmonary hypertension is pulmonary arterial hypertension associated with collagen disease.
  • a test kit for testing the presence or absence of pulmonary hypertension, its severity, or its prognosis A test kit comprising reagents for measuring the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1.
  • Item 1-8 A test kit for testing the presence or absence of pulmonary hypertension, its severity, or its prognosis, A test kit comprising reagents for measuring the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1.
  • Item 1-9. Reagents for measuring Regnase-1 gene expression levels or Regnase-1 levels for manufacturing test agents for testing the presence or absence of pulmonary hypertension, its severity, or its prognosis Use of.
  • Item 2-1. A pathological model animal of pulmonary arterial hypertension consisting of a non-human animal lacking Regnase-1 in immune cells.
  • a method of screening test substances for candidate substances that can be prophylactic or therapeutic drugs for pulmonary arterial hypertension comprising: A first step of providing a test substance to a non-human animal deficient in Regnase-1 in immune cells; a second step of examining the pathology of pulmonary arterial hypertension in the non-human animal to which the test substance was given; and A screening method comprising a third step of selecting the test substance as a candidate substance that can be a prophylactic or therapeutic drug for pulmonary arterial hypertension when the test substance is improved compared to non-human animals.
  • Item 2-4 A method of screening test substances for candidate substances that can be prophylactic or therapeutic drugs for pulmonary arterial hypertension
  • a method for evaluating the efficacy of a test substance for pulmonary arterial hypertension comprising: Step I of giving a test substance to a non-human animal deficient in Regnase-1 in immune cells, A method for evaluating drug efficacy, comprising a step II of examining the pathology of pulmonary arterial hypertension in the non-human animal given a test substance.
  • Item 3-1 A prophylactic or therapeutic agent for pulmonary hypertension, comprising a substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA.
  • the substance hybridizes to at least part of the base sequence of the region forming the stem portion of the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA, and inhibits complementary binding within the stem-loop structure.
  • the prophylactic or therapeutic agent for pulmonary hypertension according to item 3-1 which is Item 3-3.
  • Item 3-1 wherein the substance is at least one oligonucleic acid selected from the group consisting of (a-1), (a-2), (b-1), and (b-2) below Or the preventive or therapeutic agent for pulmonary hypertension according to 3-2.
  • the substance is selected from the group consisting of at least one oligonucleic acid selected from the group consisting of (a-1) and (a-2) and (b-1) and (b-2)
  • the preventive or therapeutic agent for pulmonary hypertension according to Item 3-3 which is in combination with at least one oligonucleic acid.
  • Item 3-5 The preventive or therapeutic agent for pulmonary hypertension according to any one of Items 3-1 to 3-4, wherein the pulmonary hypertension is pulmonary arterial hypertension.
  • Item 3-7 The preventive or therapeutic agent for pulmonary hypertension according to any one of Items 3-1 to 3-5, wherein the pulmonary hypertension is idiopathic pulmonary arterial hypertension.
  • Item 3-8 The preventive or therapeutic drug for pulmonary hypertension according to any one of Items 3-1 to 3-5, wherein the pulmonary hypertension is hereditary pulmonary arterial hypertension.
  • Item 3-9. The preventive or therapeutic agent for pulmonary hypertension according to any one of Items 3-1 to 3-5, wherein the pulmonary hypertension is pulmonary arterial hypertension associated with collagen disease. Item 3-10.
  • a method for preventing or treating pulmonary hypertension comprising the step of administering a substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA to a patient with pulmonary hypertension or a person who is likely to have recurrence of pulmonary hypertension.
  • Item 3-11 A substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA, used for the prevention or treatment of pulmonary hypertension.
  • Item 3-12. Use of a substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA for the production of a drug for the prevention or treatment of pulmonary hypertension.
  • the presence or absence of PH, the severity of PH, and the prognosis of PH can be tested by using Regnase-1 as a PH marker.
  • non-human animals in which Regnase-1 has been knocked out in immune cells can spontaneously develop PAH without hypoxic stress or exposure to chemical substances.
  • the candidate substance for prophylaxis or treatment of PAH can be obtained without a step of subjecting a non-human animal to hypoxia, exposure to chemical substances, or the like. Clinical usefulness as a drug can be judged.
  • the onset of PH is suppressed by destroying the stem-loop structure present in the 3'UTR of Regnase-1 mRNA to suppress the decrease in Regnase-1 expression level. and improve the pathology of PH.
  • WHO-FC WHO functional classification
  • mPAP mean pulmonary artery pressure
  • Cell fractions recovered from bronchoalveolar lavage fluid after 4 days of hypoxia in 8-week-old wild-type mice (C57BL/6) to induce hypoxia-induced PH It is the result of measuring the expression levels of IL-6 and Regnase-1 mRNA (n 6).
  • Monocrotaline (MCT) was administered to 6-week-old SD rats to induce PH pathology.
  • a Hematoxylin-Eosin-stained lung samples resected from CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice and control mice
  • b resected lung samples from CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl and control mice. histology immunostained for ⁇ -SMA and von Willebrand factor ( vWF ) ; Figures showing thickening coefficients
  • d Elastica van Gieson staining of pulmonary arteries of CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice corresponding to grades 1 to 4 in the Heath-Edwards classification
  • e pulmonary arteries of mice in d.
  • FIG. 1 Figures showing the occlusion rate
  • h is CD11c - Elastica van Gieson staining images of pulmonary veins of Cre + Zc3h12a fl/fl mice and control mice;
  • FIG. 4 shows the expression levels of Arg1, Retnla, and Il4R.
  • a EVG-stained lung histology of CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl Rag2 -/- mice; b, pulmonary artery occlusion rate of CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl Rag2 -/- mice.
  • c Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl Rag2 -/- mouse lung histology stained with EVG;
  • d CD11c- Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl Rag2 -/- mouse lung artery occlusion rate.
  • a Protocol for transcriptome analysis of pulmonary arteries and alveolar macrophages from CD11c-Cre + Zc3h12a fl/ fl mice; b, Highly enriched genes increased in pulmonary arteries from CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice.
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • h Ligand-target matrix representing the regulatory potential between Regnase-1-deficient alveolar macrophage ligands and target genes in the pulmonary artery.
  • Ligand-target matrix representing the regulatory potential between Regnase-1-deficient alveolar macrophage ligands and target genes in the pulmonary artery.
  • Figure showing the results of the luciferase reporter assay (n 3); b, protocol for treatment experiment of PAH model mice using anti-IL-6 receptor neutralizing antibody (MR16-1); c, MR16- RVSP of CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice treated with 1 or control antibody (IgG); d, CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice treated with MR16-1 or control antibody (IgG) Fig. showing the Fulton coefficient of; e, CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice administered with MR16-1 or control antibody (IgG).
  • a Protocol for PAH treatment experiment with Regnase-1 morpholino oligo (Reg1 MO); b, RVSP in hypoxic mice after administration of Reg1 MO or control oligo; c, Reg1 Figure showing Fulton's coefficient of hypoxic mice after administration of MO or control oligo; d, EVG-stained histology of resected lung samples from mice hypoxic after administration of Reg1 MO or control oligo; e, Media thickening index of lungs of hypoxic mice after administration of Reg1 MO or control oligos.
  • Pulmonary Hypertension is a group of progressive diseases with a poor prognosis resulting in impaired cardiac and pulmonary function due to elevated pulmonary artery pressure, classified according to the Nice Classification as group 1: Pulmonary Arterial Hypertension (PAH), Group 1': pulmonary veno-occlusive disease (PVOD) and/or pulmonary capillary hemangiomatosis (PCH), Group 1'' : neonatal persistent pulmonary hypertension, group 2: pulmonary hypertension associated with left heart disease, group 3: pulmonary hypertension associated with pulmonary disease and/or hypoxemia, group 4: chronic thromboembolic pulmonary Hypertension, Group 5: Classified as pulmonary hypertension with an unspecified multifactorial mechanism.
  • PAH Pulmonary Arterial Hypertension
  • PVOD pulmonary veno-occlusive disease
  • PCH pulmonary capillary hemangiomatosis
  • Group 1'' neonatal persistent pulmonary hypertension
  • group 2 pulmonary hypertension associated with left heart disease
  • Pulmonary arterial hypertension is further divided into idiopathic pulmonary arterial hypertension (idiopathic PAH; IPAH), hereditary pulmonary arterial hypertension (heritable PAH; HPAH), drug- and toxin-induced pulmonary arterial hypertension (PAH). , and pulmonary arterial hypertension (associated PAH) associated with various diseases.
  • PAH associated with various diseases includes connective tissue disease (CTD), human immunodeficiency virus (HIV) infection, portal hypertension, congenital heart disease, and schistosomiasis.
  • One embodiment of the present disclosure is a method for testing the presence or absence of PH, the severity of PH, or the prognosis of PH, wherein the expression level of the Regnase-1 gene or An inspection method including the step of measuring the amount of Regnase-1.
  • a "subject” is a human or non-human animal that is subject to determination of the presence or absence of PH, the severity of PH, or the prognosis of PH.
  • Non-human animals specifically include non-human mammals such as primates, rats, mice, gerbils, guinea pigs, hamsters, ferrets, rabbits, cows, horses, pigs, goats, dogs, and cats. Since the testing method of the present disclosure is suitable for testing on humans, the subject is preferably a human.
  • sample isolated from a subject is a biological sample isolated from the subject.
  • the sample is preferably the blood of the subject or a sample prepared from the blood.
  • the test method of the present disclosure enables highly accurate testing using the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1 in peripheral blood mononuclear cells as an index.
  • a sample containing peripheral blood mononuclear cells prepared or isolated peripheral blood mononuclear cells is preferred.
  • either the Regnase-1 gene expression level or the Regnase-1 level (Regnase-1 protein level) may be measured, or both of them may be measured.
  • the amount of Regnase-1 gene expression in a sample can be measured by, for example, Northern blotting, RT-PCR method, real-time RT-PCR method, RNA-Seq analysis, DNA microarray method (method using a DNA chip), dot blot method, It can be carried out using a known method such as RNase protection assay method.
  • the measured value of the Regnase-1 gene expression level may be the relative expression level of the Regnase-1 gene expression level to the gene expression level of one or more endogenous controls in the sample. Housekeeping genes can be used as endogenous controls.
  • the amount of Regnase-1 in a sample can be measured, for example, by immunoassay using an antibody that specifically recognizes and binds to Regnase-1.
  • Antibodies can be produced by known methods. Immunoassay methods include, for example, a method using a solid-phase carrier on which an antibody that specifically binds to Regnase-1 is immobilized, flow cytometry, Western blotting, and the like. Methods using a solid phase carrier include, for example, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an immobilized microtiter plate, an agglutination method (immunoprecipitation) using immobilized particles, and the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the amount of Regnase-1 can also be measured by a method using multiple reaction monitoring (MRM) by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS), which is a protein mass spectrometry technique that does not use antibodies, or the like. These detection methods can also be carried out by conventional methods.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • LC-MS/MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • the PH to be tested is any of Group 1, Group 1', Group 1'', Group 2, Group 3, Group 4, and Group 5 of the Nice Classification.
  • Preferred examples of PH to be tested include Group 1 (PAH).
  • PAH Group 1
  • a decrease in the expression level of the Regnase-1 gene and the amount of Regnase-1 is likely to reflect the pathology of idiopathic or hereditary PAH (I/HPAH) and collagen disease PAH (CTD-PAH), so the test of the present disclosure
  • Suitable PHs to test for in a preferred embodiment of the method include I/HPAH and CTD-PAH.
  • the lower the Regnase-1 gene expression level or the Regnase-1 amount the higher the possibility that the subject suffers from PH.
  • the severity of PH is tested by the test method of the present disclosure
  • the lower the Regnase-1 gene expression level or the Regnase-1 amount the more severe the severity of PH in the subject.
  • the prognosis of PH is examined by the test method of the present disclosure, the lower the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1, the worse the prognosis of PH in the subject.
  • Whether or not the Regnase-1 gene expression level or Regnase-1 level is low can be determined by comparing the Regnase-1 gene expression level or Regnase-1 level of a sample with a reference value according to the test method of the present disclosure.
  • the “reference value” is the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1 in a sample obtained from a subject whose PH morbidity, PH severity, PH prognosis, etc. are known.
  • the average value of the Regnase-1 gene expression level or the Regnase-1 amount of a plurality of healthy subject-derived samples is obtained in advance, and this is used as a reference value, If the Regnase-1 gene expression level or Regnase-1 level in the subject-derived sample is lower than the reference value, it can be determined that the subject may be suffering from PH.
  • the average value of the Regnase-1 gene expression level or the Regnase-1 amount of a plurality of PH patient-derived samples is obtained in advance, and this is used as a reference value. If the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1 is equal to or lower than the reference value, it can be determined that the subject may have PH.
  • PH patient-derived samples with known severity are divided by severity, and the expression level of the Regnase-1 gene or Regnase-1
  • the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1 in the subject-derived sample is close to which severity reference value, The severity of PH can be determined.
  • samples derived from PH patients with known prognosis are divided according to the presence or absence of events (heart failure, death, lung transplantation, etc.), and the expression level of the Regnase-1 gene for each event is Alternatively, the average value of the amount of Regnase-1 is obtained in advance, and this is used as a reference value, and by determining which reference value the Regnase-1 gene expression level or the Regnase-1 amount of the subject-derived sample is close to It can predict the prognosis of PH.
  • test kit of the present disclosure is a kit for testing the presence or absence of PH, the severity of PH, or the prognosis of PH, wherein the expression level of the Regnase-1 gene or the amount of Regnase-1 is measured.
  • a test kit containing reagents for The test kit of the present disclosure is a test kit used to carry out the test method, and the contents described in the "1.2-1. Test method" column are also used in the test kit of the present disclosure. be done.
  • Reagents for measuring the expression level of the Regnase-1 gene include, for example, a primer pair for amplifying a nucleic acid containing the Regnase-1 gene (e.g., mRNA, cDNA derived from mRNA), and a probe that hybridizes with the nucleic acid. etc.
  • examples of reagents for measuring the amount of Regnase-1 include antibodies that specifically bind to Regnase-1.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody may be an antibody fragment as long as it can specifically bind to Regnase-1.
  • Antibody fragments include, for example, Fab fragments, F(ab')2 fragments, single-chain antibodies (scFv), and the like.
  • the antibody may be provided in a state of being immobilized on a solid-phase carrier such as a microtiter plate or particles.
  • test kit of the present disclosure may further include a buffer solution for dilution or reaction containing components necessary for measurement, a washing solution, a coloring reagent, a reaction container, and the like.
  • PAH pathological model animal and method using the same 3-1.
  • PAH Pathological Model Animal Yet another embodiment of the present disclosure is a PAH pathological model animal comprising a non-human animal deficient in Regnase-1 in immune cells. The PAH pathological model animal of the present disclosure will be described in detail below.
  • Species of the PAH pathology model animal of the present disclosure are not particularly limited, but non-human mammals such as mice, rats, gerbils, guinea pigs, hamsters, ferrets, rabbits, cows, horses, pigs, goats, dogs, cats, monkeys, etc. animals.
  • non-human mammals such as mice, rats, gerbils, guinea pigs, hamsters, ferrets, rabbits, cows, horses, pigs, goats, dogs, cats, monkeys, etc. animals.
  • suitable examples include mice, rats, guinea pigs, and rabbits.
  • the types of immune cells that are deficient in Regnase-1 are not particularly limited, but for example, macrophages such as alveolar macrophages; dendritic cells; neutrophils, eosinophils, basophils granulocytes such as spheres; lymphocytes such as T cells and B cells;
  • a preferred embodiment of the PAH disease model animal of the present disclosure includes a non-human animal lacking Regnase-1 in at least alveolar macrophages. In non-human animals in which at least alveolar macrophages are deficient in Regnase-1, at least one or more of macrophages, lymphocytes, and granulocytes may be deficient in Regnase-1. .
  • PAH disease model animal of the present disclosure includes a non-human animal lacking Regnase-1 in at least alveolar macrophages and dendritic cells.
  • another embodiment of the PAH disease model animal of the present disclosure includes a non-human animal lacking Regnase-1 in at least alveolar macrophages and myeloid dendritic cells.
  • Non-human animals with immune cell-specific deletion of Regnase-1 can be generated using the conditional knockout method.
  • a conditional knockout method can be performed by a known method using the Cre/loxP system or the like.
  • the locus flanking the gene (ZC3H12A) region encoding Regnase-1 with the Cre recombinase target sequence loxP is An animal (flox animal) having the Cre recombinase is prepared and mated with an animal expressing Cre recombinase in alveolar macrophages.
  • CD11c-Cre mice are introduced with the DNA recombination enzyme Cre recombinase induced by the CD11c gene promoter, and can be crossed with flox animals to specifically delete the target gene in alveolar macrophages and dendritic cells. It has been known. Therefore, by mating CD11c-Cre mice with mice in which a flox site has been introduced into the Zc3h12a gene, mice that are specifically deficient in regnase-1 in alveolar macrophages and dendritic cells can be generated. .
  • LysM-Cre mice are transfected with the DNA recombination enzyme Cre recombinase driven by the ysozyme gene promoter, and by mating with flox animals, target genes are specifically transferred to myeloid cells, including alveolar macrophages. It is known that it can be lost. Therefore, by mating LysM-Cre mice with mice in which the flox site has been introduced into the Zc3h12a gene, mice that are specifically deficient in Regnase-1 in myeloid immune cells, including alveolar macrophages, can be generated. can be done.
  • PAH disease model animals required hypoxia and exposure to chemicals such as monocrotaline and Sugen5416. will spontaneously develop PAH and exhibit PAH pathology when reared in a normal rearing environment.
  • the breeding period until PAH spontaneously develops in the PAH pathological model animal of the present disclosure varies depending on the type and strain of the animal, the type of immune cells deficient in Regnase-1, etc., but usually 6 to 7 about a week.
  • the presence of PAH is confirmed by hemodynamic measurements, morphological analysis of lung tissue and heart tissue, etc., and right ventricular systolic pressure (RVSP) and Fulton coefficient (right / left ventricle + septum weight ratio), pulmonary vascular remodeling (stenosis or occlusion), etc.
  • RVSP right ventricular systolic pressure
  • Fulton coefficient right / left ventricle + septum weight ratio
  • pulmonary vascular remodeling stenosis or occlusion
  • the PAH pathological model animal of the present disclosure may be used as any PAH pathological model such as I/HPAH, CTD-PAH, CHD-PAH, portopulmonary hypertension (PoPH), drug-induced PAH, etc. Since the pathology of /HPAH and CTD-PAH is likely to be reflected, in one embodiment of the PAH pathology model animal of the present disclosure, it is preferably used as an I/HPAH pathology model or a CTD-PAH pathology model.
  • the PAH pathological model animal of the present disclosure can be used as a research sample for elucidating the pathology of PAH, etc., as well as for screening of preventive or therapeutic agents for PAH and efficacy evaluation of preventive or therapeutic agents for PAH, which will be described later.
  • test substance is a substance to be confirmed for the presence or absence of PAH preventive and/or therapeutic effects.
  • test substances include synthetic compounds, nucleic acids (e.g., antisense nucleic acids, cDNA, siRNA, etc.), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, culture products, mixtures thereof, and the like.
  • non-human animal lacking Regnase-1 in immune cells used in the first step is as described in the above "3-1. PAH pathological model animal".
  • the timing of giving the test substance to the non-human animal is not particularly limited, and may be before or after the non-human animal develops the pathology of PAH. It may be continued from before the onset of the pathology of PAH to after the onset.
  • the first step when the test substance is given to the non-human animal before the onset of PAH, it is possible to screen candidate substances that have the effect of delaying the onset of PAH or suppressing the onset of PAH.
  • a candidate substance that improves the pathology of PAH can be screened.
  • the number of times the test substance is given to the non-human animal is not particularly limited.
  • the test substance may be given only once, or the test substance may be given two or more times at regular intervals. good too.
  • the method of giving the test substance to the non-human animal is not particularly limited, and oral administration, intravascular (intraarterial or intravenous) injection, pulmonary administration (inhalation), continuous infusion, subcutaneous administration, Any of intramuscular administration, enteral administration, intraperitoneal administration, topical administration, and the like may be used.
  • the pathology of PAH in the non-human animal given the test substance is examined.
  • the timing of examining the pathology of PAH is not particularly limited, and may be set at the time when the effect of the test substance is sufficiently manifested. It may be set to about 14 days later, about 14 to 56 days later, or about 28 to 56 days later.
  • RVSP right ventricular systolic pressure
  • Fulton's coefficient right ventricular/left ventricular weight ratio
  • the test substance is used to prevent or treat PAH It is selected as a candidate substance that can become a drug.
  • the candidate substance selected in the third step can be a candidate for a prophylactic or therapeutic agent for any PAH such as I/HPAH, CTD-PAH, CHD-PAH, PoPH, and drug-induced PAH. Since animals tend to exhibit pathological conditions of I/HPAH and CTD-PAH, the candidate substance selected in the third step is suitable as a candidate drug for prevention or treatment of I/HPAH or CTD-PAH.
  • PAH such as I/HPAH, CTD-PAH, CHD-PAH, PoPH, and drug-induced PAH. Since animals tend to exhibit pathological conditions of I/HPAH and CTD-PAH, the candidate substance selected in the third step is suitable as a candidate drug for prevention or treatment of I/HPAH or CTD-PAH.
  • the candidate substance selected in the third step can be further subjected to safety evaluations and clinical trials to determine its clinical efficacy as a preventive or therapeutic agent for PAH.
  • a method for evaluating efficacy against PAH using a PAH pathological model animal is a method for evaluating the efficacy of a test substance against PAH, comprising the following steps I and II for efficacy evaluation: is the method: Step I of giving a test substance to a non-human animal deficient in Regnase-1 in immune cells, A second step of examining the pathology of PAH in the non-human animal to which the test substance was given.
  • PAH which is the target disease for drug efficacy evaluation
  • step I a test substance is given to a non-human animal deficient in Regnase-1 in its immune cells.
  • test substance is a substance whose efficacy (preventive and/or therapeutic effect) against PAH is to be evaluated.
  • the test substance may be a substance whose effectiveness as a preventive or therapeutic drug for PAH has been confirmed or suggested, or a substance whose preventive and/or therapeutic effect on PAH has not been confirmed.
  • Specific examples of test substances include synthetic compounds, nucleic acids (e.g., antisense nucleic acids, cDNA, siRNA, etc.), peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, culture products, mixtures thereof, and the like.
  • Non-human animals lacking Regnase-1 in immune cells used in Step I are as described in the above "3-1. PAH pathological model animals”.
  • Step I the timing, number of times, and method of giving the test substance to the non-human animal are described in Section 1 of “3-2. It is the same as for the process.
  • step II the pathology of PAH in the non-human animal to which the test substance is given is investigated.
  • step II the timing and method for examining the pathology of PAH are the same as in step 2 of the above "3-2. Screening method for preventive or therapeutic agents for PAH using PAH pathological model animals". .
  • the second step it is judged that the higher the degree of improvement of the PAH condition, the higher the efficacy of the test substance against PAH.
  • Prophylactic or therapeutic agent for PH Yet another embodiment of the present disclosure is a prophylactic or therapeutic agent for PH comprising a substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA.
  • the prophylactic or therapeutic agents for PH of the present disclosure are described in detail below.
  • the stem-loop structure-disrupting target Regnase-1 may be derived from the species to which the prophylactic or therapeutic agent for PH is administered.
  • a substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of human Regnase-1 mRNA may be used.
  • Representative amino acid sequences of Regnase-1 have been deposited under GenBank accession numbers NP_001310479.1 (human, SEQ ID NO:3) and NP_694799.1 (mouse, SEQ ID NO:4).
  • Regnase-1 mRNA 3'UTR is the 3' untranslated region in Regnase-1 mRNA.
  • Examples of the base sequence of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA include a base sequence containing at least the sequence represented by SEQ ID NO: 5 (human) or SEQ ID NO: 6 (mouse).
  • the 3'UTR of Regnase-1 mRNA contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (human) or SEQ ID NO: 2 (mouse).
  • a “stem-loop structure” is a single-stranded nucleic acid in which complementary sequences existing in two regions separated in the molecule are bound to form a stem portion, and the sequence narrowed between the two regions is a loop. It is the structure forming the part.
  • 3'UTR of human regnase-1 mRNA is the first stem-loop structure formed in the region corresponding to positions 231-245 of SEQ ID NO: 1 and/or the region corresponding to positions 424-442 of SEQ ID NO: 1 has a second stem-loop structure formed by
  • the 3'UTR of mouse regnase-1 mRNA is the first stem-loop structure formed in the region corresponding to positions 196 to 210 of SEQ ID NO: 2, and / or 378 to 392 of number 2. It has a second stem-loop structure formed in the corresponding region.
  • a “substance that destroys the stem-loop structure” is a substance that inhibits complementary binding within the stem-loop structure.
  • Substances that disrupt the stem-loop structure of the 3'UTR of mouse regnase-1 mRNA are described in WO2019/182055 and are publicly known.
  • the substance that disrupts the stem-loop structure may be any substance that inhibits complementary binding between at least one, at least two, or at least three pairs of nucleotides in the stem-loop structure. Examples thereof include oligonucleic acids that bind to base sequences that form stem-loop structures, and substances for modifying base sequences that form stem-loop structures by genome editing technology.
  • the substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA is It is an oligonucleic acid that hybridizes.
  • the oligonucleic acid contains at least a portion of the region forming the stem-loop structure in the 3'UTR of Regnase-1 mRNA, for example, at least 1, at least 2, or at least 3 nucleotides forming the stem portion of the stem-loop structure. can inhibit complementary binding within the stem-loop structure.
  • the oligonucleic acid comprises a sequence complementary to a sequence comprising at least 2 or 3, such as 3 consecutive nucleotides forming the stem portion of the stem-loop structure.
  • the contiguous nucleotides can be those that flank the loop portion of the stem-loop structure, for example, positions 233-235, 241-243, 426-428, and 438-440 in SEQ ID NO:1. can correspond to the rank
  • the oligonucleic acid itself preferably does not form a stem-loop structure, a hairpin structure, or a multimer such as a dimer.
  • the oligonucleic acid is, for example, a single-stranded nucleic acid consisting of 10-30, 15-27, 18-25 or 20-23 bases.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of human regnase-1 mRNA is at least one of the following oligonucleic acids (a-1) and (a-2).
  • a-1) 10 to 30 bases that hybridize to a continuous 10 to 30 base length sequence containing positions 233 to 235 of SEQ ID NO: 1 in the base sequence of positions 206 to 242 of SEQ ID NO: 1 long oligonucleotides.
  • the oligonucleic acid of (a-1) is at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, about An oligonucleic acid having a sequence identity of 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more.
  • the oligonucleic acid (a-1) has one or several, for example, two or three bases deleted, substituted, added, or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7. It is an oligonucleic acid consisting of an inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (a-1) is an oligonucleic acid consisting of the base sequence of SEQ ID NO:7 or an oligonucleic acid containing the base sequence of SEQ ID NO:7.
  • the identity of nucleotide sequences means the degree of similarity of sequences between bases, and two sequences aligned in an optimal state (a state in which the nucleotide match is maximized) over the region of the sequences to be compared Determined by comparing sequences.
  • a sequence identity number (%) is determined by determining the number of identical bases present in both sequences to determine the number of matching sites, then dividing this number of matching sites by the total number of bases in the sequence region being compared. , is calculated by multiplying the resulting number by 100.
  • Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence identity include various algorithms commonly available to those skilled in the art (eg, BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.). Sequence identity can be determined using sequence analysis software such as BLAST, FASTA, and the like.
  • the oligonucleic acid of (a-2) comprises SEQ ID NO: 8 (5'-CTTAAACTACAGAGATACAATGT-3') and at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, about 90% %, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more sequence identity.
  • the oligonucleic acid (a-2) has one or several, for example, two or three bases deleted, substituted, added or inserted in the nucleotide sequence of SEQ ID NO:8.
  • the oligonucleotide (a-2) is an oligonucleic acid consisting of the base sequence of SEQ ID NO:8 or an oligonucleic acid containing the base sequence of SEQ ID NO:8.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of human regnase-1 mRNA is at least one of the following oligonucleic acids (b-1) and (b-2) .
  • (b-2) 10 to 30 bases that hybridize to a continuous 10 to 30 base length sequence containing positions 438 to 440 of SEQ ID NO: 1 in the base sequence of positions 427 to 467 of SEQ ID NO: 1 long oligonucleotides.
  • the oligonucleic acid of (b-1) is at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, about An oligonucleic acid having a sequence identity of 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more.
  • the oligonucleic acid (b-1) has one or several, for example, two or three bases deleted, substituted, added, or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO:9. It is an oligonucleic acid consisting of an inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (b-1) is an oligonucleic acid consisting of the base sequence of SEQ ID NO:9 or an oligonucleic acid containing the base sequence of SEQ ID NO:9.
  • the oligonucleic acid of (b-2) is at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, about An oligonucleic acid having a sequence identity of 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more.
  • the oligonucleic acid (b-2) has one or several, for example, two or three bases deleted, substituted, added, or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10. It is an oligonucleic acid consisting of an inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (b-2) is an oligonucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:10 or an oligonucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:10.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of mouse regnase-1 mRNA is at least one of the following oligonucleic acids (a-1') and (a-2'): . (a-1') 10 to 30 that hybridizes to a sequence consisting of 10 to 30 consecutive bases containing positions 198 to 200 of SEQ ID NO: 2 in the base sequence of positions 171 to 207 of SEQ ID NO: 2 A base-length oligonucleic acid.
  • (a-2') 10 to 30 that hybridizes to a sequence consisting of 10 to 30 consecutive nucleotides containing positions 206 to 208 of SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence of positions 199 to 235 of SEQ ID NO: 2 A base-length oligonucleic acid.
  • the oligonucleic acid of (a-1') comprises SEQ ID NO: 11 (5'-aatgtgtatcaacagggtgatca-3') and at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, An oligonucleic acid having about 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more sequence identity.
  • the oligonucleic acid (a-1') has one or several, for example, two or three bases deleted, substituted, or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11. Or it is an oligonucleic acid consisting of the inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (a-1′) is an oligonucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:11 or an oligonucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:11.
  • the (a-2') oligonucleic acid is at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, about An oligonucleic acid having a sequence identity of 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more.
  • the oligonucleic acid (a-2') has one or several, for example, two or three bases deleted, substituted, added or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. It is an oligonucleic acid consisting of an inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (a-2') is an oligonucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:12 or an oligonucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:12.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of mouse regnase-1 mRNA is at least one of the following (b-1') and (b-2'): It is an oligonucleic acid.
  • (b-1') 10 to 30 that hybridizes to a sequence consisting of 10 to 30 consecutive nucleotides containing positions 381 to 383 of SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence of positions 354 to 388 of SEQ ID NO: 2 A base-length oligonucleic acid.
  • (b-2') 10 to 30 that hybridize to a sequence consisting of 10 to 30 consecutive nucleotides containing positions 387 to 389 of SEQ ID NO: 2 in the base sequence of positions 382 to 416 of SEQ ID NO: 2 A base-length oligonucleic acid.
  • the oligonucleic acid of (b-1') comprises SEQ ID NO: 13 (5'-atggtgcctaactagccggt-3') and at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, An oligonucleic acid having about 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more sequence identity.
  • the oligonucleic acid (b-1') has one or several, for example, two or three nucleotides deleted, substituted, or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13. Or it is an oligonucleic acid consisting of the inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (b-1′) is an oligonucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:13 or an oligonucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:13.
  • the oligonucleic acid of (b-2') is at least about 60%, about 70%, about 80%, about 85%, about An oligonucleic acid having a sequence identity of 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, or about 99% or more.
  • the oligonucleic acid (b-2') has one or several, for example, two or three nucleotides deleted, substituted, added, or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14. It is an oligonucleic acid consisting of an inserted base sequence.
  • the oligonucleic acid (b-2') is an oligonucleic acid consisting of the base sequence of SEQ ID NO:14 or an oligonucleic acid containing the base sequence of SEQ ID NO:14.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA may have one sequence alone, or two or more sequences. Arrays may be used in combination.
  • oligonucleic acids with two or more sequences a composition containing all oligonucleic acids may be used, or two or more compositions each containing one or more oligonucleic acids may be used in combination. good too.
  • two or more types of oligonucleic acids are contained in one composition, it is preferable that the oligonucleic acids do not form complementary bonds.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA includes (a-1) and (a -2) and one oligonucleic acid selected from the above (b-1) and (b-2) are used in combination.
  • the combination of the oligonucleic acids (a-1) and (b-1), the combination of the oligonucleic acids (a-1) and (b-2), the oligonucleic acids (a-2) and (b) A combination of oligonucleic acids of -1) or a combination of oligonucleic acids of (a-2) and (b-2) above can be mentioned.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA (a-1') and (a-2') in combination with one oligonucleic acid selected from (b-1') and (b-2').
  • the combination of (a-1′) and (b-1′) aoligonucleic acids, the combination of (a-1′) and (b-2′) oligonucleotides, the (a-2 ') and (b-1'), or a combination of the above (a-2') and (b-2') oligonucleic acids are examples of the above (a-2') and (b-2') oligonucleic acids.
  • the oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA may be composed of natural nucleotides or artificial nucleotides. , may be composed of one or more naturally occurring nucleotides and one or more artificial nucleotides. Naturally occurring nucleotides include, for example, deoxyribonucleotides or ribonucleotides. Artificial nucleotides may be selected that have structures different from those of natural nucleotides and that enhance nuclease resistance and binding affinity with target sequences. Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012).
  • Artificial nucleotides specifically include abasic nucleosides; arabinonucleosides, 2'-deoxyuridines, ⁇ -deoxyribonucleosides, ⁇ -L-deoxyribonucleosides, nucleosides having other sugar modifications; peptide nucleic acids ( PNA), phosphate-bound peptide nucleic acid (PHONA), cross-linked artificial nucleic acid (LNA), 2'-O,4'-C-ethylene cross-linked nucleic acid (ENA), constrained ethyl (cEt), morpholino nucleic acid, etc.
  • PNA peptide nucleic acids
  • PONA phosphate-bound peptide nucleic acid
  • LNA cross-linked artificial nucleic acid
  • ENA constrained ethyl
  • morpholino nucleic acid etc.
  • Artificial nucleotides having sugar modifications include, for example, substituted pentamethyl ribose, 2'-O-methyl ribose, 2'-O-methoxyethyl ribose, 2'-deoxy-2'-fluoro ribose, 3'-O-methyl ribose and the like. 1′,2′-deoxyribose; arabinose; substituted arabinose sugars; hexoses and those with alpha-anomeric sugar modifications.
  • artificial nucleotides having modified bases include pyrimidines such as 5-hydroxycytosine, 5-methylcytosine, 5-fluorouracil, and 4-thiouracil; purines such as 6-methyladenine and 6-thioguanosine; Those having a heterocyclic base and the like are included.
  • the artificial nucleotides in the oligonucleic acid may all be of the same type, or two or more different artificial nucleotides.
  • a preferred example of an oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA in the preventive or therapeutic agent for PH of the present disclosure is morpholino oligo.
  • a morpholino oligo is an oligonucleic acid having a structure in which the following structures are linked repeatedly.
  • B is adenine, cytosine, guanine or thymine, and the dashed line is the connecting point to the adjacent structure.
  • single-stranded DNA is another example of an oligonucleic acid capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA.
  • an oligonucleic acid When an oligonucleic acid is used as a substance capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA in the preventive or therapeutic agent for PH of the present disclosure, the oligonucleic acid enhances activity or cellular uptake 1 It may be combined with any of the above components or conjugates.
  • Such moieties include, but are not limited to, cholesterol moieties, cholic acid, thioethers (e.g. hexyl-S-tritylthiol), thiocholesterol, aliphatic chains (e.g. dodecanediol or undecyl residues), phospholipids (e.g.
  • a substance capable of disrupting the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA is used for the prophylaxis or treatment of PH.
  • a prophylactic agent for PH means preventing the onset or recurrence of PH, reducing the possibility of developing or recurring PH, or preventing PH or recurrence in a subject who is likely to develop or recur PH. Refers to drugs used for the purpose of delaying timing.
  • a therapeutic agent for PH means reducing or eliminating the cause of PH, delaying or stopping progression of PH, and/or alleviating symptoms of PH in a subject developing PH, refers to drugs used for the purpose of alleviating, improving or eliminating.
  • the type of PH to which the preventive or therapeutic agent for PH of the present disclosure is applicable is not particularly limited, and is Group 1, Group 1', Group 1'', Group 2, and Group 3 of the Nice Classification. , fourth group, and fifth group.
  • Suitable examples of PH to be applied include Group 1 (PAH) and PH.
  • a preferred embodiment of the PH preventive or therapeutic agent of the present disclosure can be targeted for the prevention or treatment of I/HPAH and PCTD-PAH.
  • Subject animals to which the PH prophylactic or therapeutic agent of the present disclosure is administered are not particularly limited. mammals, preferably humans.
  • the method of administering the prophylactic or therapeutic drug for PH is not particularly limited, and examples include oral administration, intravascular (intraarterial or intravenous) injection, transpulmonary administration (inhalation), continuous infusion, subcutaneous administration, intramuscular administration, Examples include internal administration, enteral administration, intraperitoneal administration, and topical administration.
  • transpulmonary administration is a suitable example of a method for administering a preventive or therapeutic agent for PH.
  • the dosage of the preventive or therapeutic drug for PH can be set appropriately according to the age, body weight, type and condition of PH, type of active ingredient to be used, etc.
  • the dose of the substance that disrupts the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA per day for adults is about 0.01 to 100 mg/kg or about 0.5 to 5 mg/kg. It can be set as appropriate.
  • the prophylactic or therapeutic drug for PH may be administered once or divided into several doses for one day only, or the prophylactic or therapeutic drug for PH may be administered continuously with an interval of one day or several days. good.
  • the prophylactic or therapeutic agents for PH of the present disclosure include transfection agents, stabilizers, excipients, antioxidants, buffers, preservatives, in addition to substances that disrupt the stem-loop structure of the 3'UTR of Regnase-1 mRNA.
  • Agents, surfactants, chelating agents, binders, sterilized water, physiological saline, etc. are blended to prepare and provide pharmaceutical compositions in desired dosage forms.
  • the pharmaceutical composition can be formulated by a conventional method according to its dosage form.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Regnase-1_f 5'-GAAGAGGAAAAGGAGGGCAG-3' (SEQ ID NO: 15)
  • Regnase-1_r 5'-CTCCAGGATGGCACAAACAC-3'
  • hGAPDH_f 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
  • hGAPDH_r 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3' (SEQ ID NO: 18)
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice lacking Regnase-1 in alveolar macrophages, dendritic cells (cDCs) and Regnase-1 were generated by mating Zc3h12a flox/flox mice with CD11c-Cre mice.
  • Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl mice lacking Regnase-1 in alveolar macrophages and neutrophils were also generated by mating Zc3h12a flox / flox mice with LysM-Cre mice.
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl Rag2 ⁇ / ⁇ mice lacking T cells and B cells were generated by mating CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice with Rag2 ⁇ / ⁇ mice.
  • Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl Rag2 ⁇ / ⁇ mice lacking T cells and B cells were generated by mating Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl mice with Rag2 ⁇ / ⁇ mice.
  • mice purchased from CLEA Japan. All mice were maintained in a pathogen-free environment at 24 ⁇ 1° C. with a 12 h light/dark cycle and fed standard mouse chow and water. All animal experiments were performed under the approval of the Kyoto University Animal Care and Use Committee (approval number: MedKyo21057) and the National Cardiovascular and Urinary Center.
  • 6-week-old female SD rats were subcutaneously administered 60 mg/kg of monocrotaline to induce the pathology of PH.
  • RVSP right ventricular systolic pressure
  • Fulton's coefficient right ventricle/left ventricle + septum weight ratio
  • MR16-1 a rat monoclonal IgG antibody against mouse IL-6 receptor
  • the one provided by Pharmaceutical Co., Ltd. was used.
  • 2 mg of MR16-1 or control antibody rat non-immune isotype IgG; MP Biomedicals, Solon, OH
  • Anakinra was used as IL-1 receptor inhibitor.
  • Anakinra was administered intraperitoneally to CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice at a dose of 20 mg/kg/day from 4 weeks of age.
  • the control group was allowed to freely ingest powdered food.
  • hemodynamic measurements were taken at 8 weeks of age, the animals were sacrificed, the heart and lungs were excised and organ weights were measured, followed by histological analysis.
  • control oligo consisting of the following base sequence.
  • 191-210MO 5'-cttaaatgacagagatacaatgt-3' (SEQ ID NO: 12)
  • 378-392MO 5'-cctcagagagcaggcacatg-3' (SEQ ID NO: 14)
  • Control oligo 5'-cctcttacctcagttacaatttata-3' (SEQ ID NO: 19)
  • Reg1 MO or control oligo was intratracheally administered to 8-week-old male C57BL/6 mice at a frequency of 25 ⁇ g/week (50 ⁇ L administration) once a week for a total of 3 times.
  • mice were placed in a hypoxic chamber with 10% oxygen and kept therein for 4 weeks.
  • hypoxic mice were measured for hemodynamics, then sacrificed, the heart and lungs were excised, organ weights were measured, and then tissue analysis was performed.
  • a polyethylene tube (SP-31) was inserted into the right external jugular vein and advanced to the right ventricle to measure the right ventricular pressure (RVP).
  • the arterial pressure (AP) was measured by inserting a heat-stretched, tapered polyethylene tube (PE50) into the right carotid artery.
  • AP and RVP signals were detected by a pressure transducer (MLT0670; AD Instruments), relayed by a pressure amplifier (ML117; AD Instruments), and continuously analyzed by a Power Lab system (AD Instruments Colorado Springs, CO). were sampled at and recorded on a computer using Chart software (AD Instruments).
  • Heart rate was calculated from the systolic peak of arterial pressure. Experiments were conducted only under the conditions where the mean arterial pressure was 50 mmHg or higher and the heart rate was between 350 and 600 beats/minute. A decrease in mean arterial pressure below 50 mmHg or heart rate below 350 beats/min was excluded from the measurements.
  • mice were euthanized by exsanguination from the inferior vena cava. After euthanasia, PBS was perfused through a right heart catheter, and the left atrium was exsanguinated by incision. The heart was removed, the atrium was removed, and the right ventricle (RV) was separated from the left ventricle (LV) and septum. Tissue weights were measured and the right ventricular/left ventricular weight ratio (RV/LV+septum ratio) was used as the Fulton's coefficient as the Merkmal of right ventricular hypertrophy.
  • the lung was collected for histological analysis.
  • the trachea was perfused with 4% paraformaldehyde (PFA) and fixed under the condition of stretching the airway.
  • PFA paraformaldehyde
  • the resected lung samples were fixed in 4% PFA at 4°C overnight, then replaced with PBS, embedded in paraffin, and sectioned at a thickness of 4 ⁇ m.
  • Morphological analysis of pulmonary vessels was performed with Elastica van Gieson staining and Hematoxylin-Eosin staining. Images of pulmonary vessels were taken with ScanScope CS (Leica) or NanoZoomer (Hamamatsu Photonics). Morphological analysis was performed using lung sections from randomly selected animals in each experimental group.
  • Pulmonary vascular remodeling measures the % wall thickness of pulmonary arteries in the lung parenchyma, small arteries at the level of terminal bronchioles, and arterioles at the level of pulmonary lobules. I considered.
  • the medial thickening factor was calculated by multiplying the distance between the internal elastic lamina and the external elastic lamina by 2, divided by the distance between the external elastic lamina (vascular diameter), and multiplying by 100. In vessels with only one layer of elastic lamina, the distance between the elastic lamina and the subendothelial basement membrane was measured. Medial thickening was analyzed only for blood vessels sectioned into roughly circular shapes. Pulmonary artery diameters were measured using an Aperio ImageScope (Leica). Medial thickening index was calculated in at least 15 pulmonary arterioles and pulmonary arterioles in one mouse.
  • the cell pellet was treated with ACK solution to remove red blood cells.
  • the treated samples were washed with RPMI medium containing 10% fetal bovine serum, centrifuged, and the collected cell pellets were subjected to flow cytometric analysis.
  • Antibodies were FITC-conjugated anti-mouse CD4 antibody (GK1.5, Biolegend), FITC-conjugated anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5, Biolegend), PE-conjugated anti-mouse SiglecF antibody (E50-2440, BD Pharmingen), PE-conjugated Gated anti-mouse B220 antibody (RA3-6B2, Biolegend), APC-conjugated anti-mouse CD11c antibody (N418, Biolegend), Alexa Fluor 700-conjugated anti-mouse Ly-6G antibody (1A8, Biolegend), Alexa Fluor 700-conjugated anti-mouse IA/IE antibody (M5/114.15.2, Biolegend), APC-Cy7 conjugated anti-mouse CD11b antibody (M1/70, Biolegend), APC-Cy7 conjugated anti-mouse SiglecF antibody (E50-2440, BD Pharmingen), PE -Cy
  • RT-qPCR Cells or tissues were lysed with TRIzol reagent (Invitrogen) and total RNA was extracted. Reverse transcription of total RNA was performed using ReverTra Ace qPCR RT Master Mix and gDNA remover (Toyobo) according to the manufacturer's instructions. cDNA fragments were amplified with SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) and fluorescence detected with the StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Mouse Actb mRNA levels were used for normalization.
  • RNA extraction mRNA isolation was performed according to the Chomczynski protocol with some modifications. After washing, RNA was resuspended in 10 ⁇ L purified water (RNase free) and DNase digested (Ambion, Austin, TX; 1 U, 30 min, 37° C.). The extraction was then repeated and finally the RNA was resuspended in 4 ⁇ L purified water.
  • RNA sequencing and bioinformatic analysis Macrophages isolated from the pulmonary arteries and alveoli of CD11c Cre/+ ;Zc3h12a fl/fl mice were lysed with TRizol reagent and total RNA was extracted as described above. After purification with RNA clean & Concentrator-5 (Zymo Research), RNA quality was checked using the 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano assay or RNA 6000 Pico assay (Agilent), and the RIN value (RNA integrity number) is >7.0.
  • a cDNA library was generated using the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (Illumina) according to the manufacturer's instructions and sequenced on a NextSeq500 (Illumina, 75 cycles).
  • Gene ontology (GO) enrichment analysis was performed using the PANTHER ( Protein AN alysis TH rough Evolutionary Relationships ) database with GO terms on biological processes of Mus musculus species.
  • the expression of Regnase-1 tended to be higher than in the group not treated with PH (Fig. 1j).
  • Table 2 shows the results of univariate and multivariate analyzes of the prognosis of PH (death, lung transplantation, hospitalization).
  • Regnase-1 expression became a prognostic factor, independent of other factors such as age, BNP, 6-minute walking distance, right atrial pressure, mean pulmonary artery pressure, and pulmonary vascular resistance. It became clear that there was
  • PAH model mouse (1) Regnase-1 expression levels in PH model mice Wild-type mice (C57BL/6) were placed in a hypoxic chamber containing 10% oxygen and fed for 4 days to induce hypoxic PH pathology. After 4 days of breeding, bronchoalveolar lavage was performed to collect bronchoalveolar lavage fluid. A cell fraction was taken from the obtained bronchoalveolar lavage fluid, and the expression levels of IL-6 and Regnase-1 were measured by RT-qPCR. As a result, mice in which PH pathology was induced by hypoxia showed significantly increased expression of IL-6 in cells recovered from bronchoalveoli compared with control mice housed in normoxia. However, the expression level of Regnase-1 was significantly decreased (Fig. 3).
  • pulmonary vascular remodeling in HCC was characterized by medial thickening and stromal infiltration of inflammatory cells (Fig. 6a-c).
  • histological changes corresponding to grades 3 and 4 in the Heath-Edwards classification such as concentric neointima and plexiform lesions were observed (Fig. 6d).
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice also had elevated right ventricular systolic pressure (RVSP) compared with control mice, which was consistent with the severity of pulmonary artery occlusion (Fig. 6e and f).
  • RVSP right ventricular systolic pressure
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice lack Regnase-1 in alveolar macrophages and cDCs, we confirmed the effects of Regnase-1 deficiency on these cells.
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice the number of CD103 + cDC1 and CD11b + cDC2 cells was increased, but alveolar macrophages were not (Fig. 7a).
  • cDCs of CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice the expression of co-stimulatory molecules CD40 and CD80 and the expression of cytokines such as Il1b and Il6 were not increased (Fig. 7b and c).
  • Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl mice deficient in Regnase-1 in lung macrophages and neutrophils Fig. 8
  • pathological changes corresponding to grades 1 to 4 in the Heath-Edwards classification were observed in the lungs of Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl mice (k and l in Figure 6) and were characteristic of PVOD (Fig. 6).
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice or Lysm Cre/+ Zc3h12a fl/fl mice showed significant attenuation even when Rag2 was deficient, but severe cerebral hyperplasia accompanied by medial thickening and vascular occlusion with aging. Pulmonary vascular remodeling was observed (Fig. 9a-d), indicating that in addition to adaptive immune cells, myeloid cells were also directly involved in pathogenesis. Furthermore, to confirm the effect of alveolar macrophages in PAH with Regnase-1 deficiency, we intratracheally administered clodronate-encapsulated liposomes to mice once a week to deplete alveolar macrophages (Fig. 9e).
  • RT-qPCR results confirmed that CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl Rag2 -/- mice were treated with liposomes encapsulating clodronic acid to deplete alveolar, but not interstitial, macrophages.
  • Fig. 9f As shown in Figure 9g-i, clodronic acid-encapsulated liposome treatment significantly improved medial thickening and occlusion rate in CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl Rag2 ⁇ / ⁇ mice. That is, the present results also confirmed that loss of Regnase-1 in alveolar macrophages can induce vascular remodeling and cause PAH.
  • Reg1 f/+ mice which are heterozygous for Regnase-1 in myeloid cells, did not spontaneously develop PH, but hypoxic exposure to CD11c-Cre + Zc3h12a fl/+ mice compared to control Zc3h12a fl/+ mice. , the Fulton coefficients were comparable, but the RVSP increased (j and k in Fig. 9). This result indicates that alveolar macrophage regnase-1 is involved in the prevention of PH induced by hypoxic conditions.
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • Fig. 10c Gene set enrichment analysis
  • KEGG pathway analysis revealed that genes in the cytokine-cytokine receptor signaling pathway were highly enriched in the pulmonary arteries of CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice (FIG. 10d).
  • transcriptomic changes in CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl and wild-type control mice were examined by RNA sequencing analysis (FIG. 10e).
  • highly ranked ligands included Il1a, Tnfsf10, Il6, Vegf, Pdgfb, Il33, Apoe, Anxa1 and Ccl5 (h,i in FIG. 10).
  • CD11c-Cre + Zc3h12a fl/fl mice have increased expression of potential ligands in alveolar macrophages compared to control mice (Fig. 11), suggesting that regase-1-deficient lung Said cytokines and angiogenic factors produced by alveolar macrophages were suggested to induce proliferation of vascular endothelial cells and smooth muscle cells.

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Abstract

本開示の目的は、高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査するための検査方法、肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物、及び高血圧症の予防又は治療薬を提供することである。　レグナーゼ-1をバイオマーカーとした高血圧症の検査方法、肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物からなるPAH病態モデル動物、及びレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を含む高血圧症の予防又は治療薬。

Description

肺高血圧症の検査方法、肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物、及び肺高血圧症の予防又は治療薬
　本開示は、肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査するための方法及び検査薬に関する。また、本開示は、肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物、及び当該モデル動物を使用した肺動脈性肺高血圧症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、並びに肺動脈性肺高血圧症に対する薬効評価方法に関する。更に、本開示は、肺高血圧症の予防又は治療薬に関する。
　肺高血圧症（Pulmonary Hypertension、PH）は、肺動脈の血圧が高くなることで、心臓と肺の機能障害をもたらす予後不良な進行性の疾患群であり、ニース分類によって、第1群：肺動脈性肺高血圧症（Pulmonary Arterial Hypertension、PAH）、第1'群：肺動脈閉鎖症（pulmonary veno-occlusive disease、PVOD）及び／又は肺毛細管腫症（pulmonary capillary hemangiomatosis、PCH）、第1''群：新生児遷延性肺高血圧症、第2群：左心性心疾患に伴う肺高血圧症、第3群：肺疾患及び／又は低酸素血症に伴う肺高血圧症、第4群：慢性血栓塞栓性肺高血圧症(chronic thromboembolic pulmonary hypertension、CTEPH)、第5群詳細不明な多因子のメカニズムに伴う肺高血圧症に分類されている。
　PHの中でも、PAHは肺動脈の筋性化、新生内膜増殖、叢状病変などの病理学的変化を伴う、末梢の肺動脈（小動脈または細小動脈）に炎症の主座を有する疾患である（非特許文献1及び2）。PAHは、更に特発性肺動脈性肺高血圧症(idiopathic PAH; IPAH)、遺伝性肺動脈性肺高血圧症(heritable PAH; HPAH)、薬剤・毒物誘発性肺動脈性肺高血圧症、及び各種疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症(associated PAH)に細分類される。各種疾患に伴うPAHの内訳として、膠原病(Connective tissue disease; CTD)、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染、門脈圧亢進症、先天性心疾患、住血吸虫症がある（日本循環器学会ガイドライン：https://www.j-circ.or.jp/cms/wp-content/uploads/2020/02/JCS2017_fukuda_h.pdf)。
　PAHの病因は複合的であり、おそらく遺伝的背景、エピジェネティックな修飾要因、既存疾患や環境要因のような、多様な要因が組み合わさって引き起こされることが知られているが（非特許文献3）、増殖因子やサイトカインがPAHの病因として大きく寄与していると考えられている。PAHに関与する可能性がある増殖因子としては、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、骨形成タンパク質(BMPs)等がある。また、Il-6、Il-1β、腫瘍壊死因子(TNF)等の循環炎症性サイトカインは、PAH患者において増大していることも知られている。また、動物試験によってサイトカインがPAHの病原に寄与していることも実証されている（非特許文献4）。更に、これらのサイトカインは、PAHの発症に重要なアリールハイドロカーボン受容体等の因子によって制御されていることも分かっている（非特許文献5）。
　自然免疫細胞が感染症における炎症性サイトカインの主な産生細胞であることは広く知られており、実際、マクロファージのような自然免疫細胞もPAHの誘導に重要であることが分かっている。マクロファージの炎症反応は、転写時及び転写後のメカニズムで調節されており（非特許文献6）、エピジェネティックな調節不全とmiRNAがPAHの重要な病因になっていることが分かっている。免疫反応の転写後調節には、免疫応答に関与するmRNAの翻訳と分解を制御する様々なRNA結合タンパク質(RBPs)が関与しているが（非特許文献7）、PAHにおけるRBPsの重要性は殆ど分かっていない。
　一方、レグナーゼ-1（Regnase-1、ZC3H12A遺伝子にコードされているタンパク質）は、自然免疫細胞と後天性免疫細胞の転写後免疫調節において極めて重要な役割を果たすRNA結合タンパク質である（非特許文献8及び9）。レグナーゼ-1は、3'非翻訳領域(3'UTR)のステムループ構造を認識し、Il-6やIl-1β等の免疫応答に関与するmRNAを分解するRNase活性を有している（非特許文献10）。レグナーゼ-1を介したmRNA分解は、翻訳終了後にヘリカーゼUPF1依存的に開始される（非特許文献11）。レグナーゼ-1は、様々な免疫細胞を制御しており（非特許文献12）、マウスにおいてレグナーゼ-1を欠損させると、重度の自己免疫性炎症性疾患を発症することが知られている。また、心筋細胞においてレグナーゼ-1が欠損しているマウスでは、横行大動脈縮窄による圧負荷により心不全が発症する（非特許文献13）。更に、レグナーゼ-1は、潰瘍性大腸炎、肺線維症等の疾患に関与していることも報告されている（非特許文献14～16）。しかしながら、PHとレグナーゼ-1との関連性については知られていない。
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　本開示の目的の１つは、PHの罹患の有無、PHの重症度、及びPHの予後予測の指標となるマーカーを特定し、当該マーカーを使用してPHの罹患の有無、PHの重症度、PHの予後を検査する方法を提供することである。
　更に、本開示の別の目的は、PAHを自然発症するモデル動物、当該モデル動物を使用したPAHの予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び当該モデル動物を使用した被験物質の薬効評価方法を提供することである。
　また、本開示の更に別の目的は、PHの予防又は治療薬を提供することである。
　本発明者は、ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)におけるレグナーゼ-1 mRNA量をPH患者と健常者でqPCRにて比較したところ、PH患者では健常者に比べてレグナーゼ-1発現量が有意に低下していること、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量が少ない程、PHが重症であること、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量が少ない程、PHの予後が悪いことを知得し、レグナーゼ-1をPHマーカーとして使用できることを見出した。
　また、従来のPAH病態モデル動物の作製には、低酸素負荷や、モノクロタリンやSugen5416等の化学物質曝露が必要であったところ、本発明者は、免疫細胞、特に肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1をノックアウトさせたマウスは、低酸素負荷や化学物質曝露等を加えずとも、PAHを自然発症し、PAH病態モデルマウスとして使用できることを見出した。また、当該PAH病態モデルマウスを使用して、PAHの予防又は治療薬のスクリーニングや、被験物質のPAHに対する薬効評価が可能になることを見出した。
　更に、本発明者は、PH病態モデルマウスに、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ形成配列を標的とするモルフォリノオリゴを投与して、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊することにより、PHの病態が改善されることを見出した。
　本開示は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本開示では、下記の態様の実施形態が例示される。
項1-1．　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査する方法であって、
　被験体から単離された試料中のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定する工程を含む、検査方法。
項1-2．　前記肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症である、項1-1に記載の検査方法。
項1-3．　前記肺高血圧症が、特発性肺動脈性肺高血圧症、遺伝性肺動脈性肺高血圧症、又は膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症である、項1-1又は1-2に記載の検査方法。
項1-4．前記肺高血圧症が、特発性肺動脈性肺高血圧症である、項1-1又は1-2に記載の検査方法。
項1-5．前記肺高血圧症が、遺伝性肺動脈性肺高血圧症である、項1-1又は1-2に記載の検査方法。
項1-6．前記肺高血圧症が、膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症である、項1-1又は1-2に記載の検査方法。
項1-7．　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査するための検査キットであって、
　レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬を含む、検査キット。
項1-8.　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後の検査に使用される、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬。
項1-9.　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査するための検査薬の製造のための、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬の使用。
項2-1．　免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物からなる、肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物。
項2-2．　前記免疫細胞が、少なくとも肺胞マクロファージを含む、請求項2-1に記載の肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物。
項2-3．　被験物質の中から、肺動脈性肺高血圧症の予防又は治療薬になり得る候補物質をスクリーニングする方法であって、
　被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える第１工程、
　被験物質を与えた前記非ヒト動物の肺動脈性肺高血圧症の病態を調べる第２工程、及び
　被験物質を与えた前記非ヒト動物の肺動脈性肺高血圧症の病態が、被験物質を与えていない前記非ヒト動物と比較して改善されている場合に、当該被験物質を肺動脈性肺高血圧症の予防又は治療薬になり得る候補物質として選択する第３工程
を含む、スクリーニング方法。
項2-4．　被験物質の肺動脈性肺高血圧症に対する薬効を評価する方法であって、
　被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える第I工程、
　被験物質を与えた前記非ヒト動物の肺動脈性肺高血圧症の病態を調べる第II工程
を含む、薬効評価方法。
項3-1．　レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を含む、肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-2．　前記物質が、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造のステム部分を形成している領域の塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズし、ステムループ構造内の相補的結合を阻害するオリゴ核酸である、項3-1に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-3．　前記物質が、以下の(a-1)、(a-2)、(b-1)、及び(b-2)よりなる群から選択される少なくとも1種のオリゴ核酸である、項3-1又は3-2に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
(a-1)配列番号1の第206～242位の塩基配列のうち、配列番号1の第233～235位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(a-2)配列番号1の第234～270位の塩基配列のうち、配列番号1の第241～243位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(b-1)配列番号1の第399～439位の塩基配列のうち、配列番号1の第426～428位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(b-2)配列番号1の第427～467位の塩基配列のうち、配列番号1の第438～440位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
項3-4．　前記物質が、前記(a-1)及び(a-2)よりなる群から選択される少なくとも1種のオリゴ核酸と、前記(b-1)及び(b-2)よりなる群から選択される少なくとも1種のオリゴ核酸との組み合わせである、項3-3に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-5．　前記肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症である、項3-1～3-4のいずれかに記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-6．　前記肺高血圧症が、特発性肺動脈性肺高血圧症、遺伝性肺動脈性肺高血圧症、又は膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症である、項3-1～3-5のいずれかに記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-7．　前記肺高血圧症が、特発性肺動脈性肺高血圧症である、項3-1～3-5のいずれかに記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-8．　前記肺高血圧症が、遺伝性肺動脈性肺高血圧症である、項3-1～3-5のいずれかに記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-9．　前記肺高血圧症が、膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症である、項3-1～3-5のいずれかに記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
項3-10．　肺高血圧症患者又は肺高血圧症を再発するおそれがある者に、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を投与する工程を含む、肺高血圧症の予防又は治療方法。
項3-11．　肺高血圧症の予防又は治療に使用される、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質。
項3-12．　肺高血圧症の予防又は治療薬の製造のための、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質の使用。
　本開示のPH検査方法によれば、レグナーゼ-1をPHマーカーとして使用することにより、PHの罹患の有無、PHの重症度、PHの予後を検査することができる。
　本開示のPAH病態モデル動物によれば、免疫細胞においてレグナーゼ-1をノックアウトさせた非ヒト動物は、低酸素負荷や化学物質曝露等を加えずとも、PAHを自然発症させることができる。
　本開示のPAHの予防又は治療薬になり得る候補物質をスクリーニングする方法によれば、非ヒト動物に低酸素負荷や化学物質曝露等を行う工程を経なくとも、候補物質のPAHの予防又は治療薬としての臨床的有用性を判断することができる。
　本開示のPAHに対する薬効を評価する方法によれば、非ヒト動物に低酸素負荷や化学物質曝露等を行う工程を経なくとも、候補物質のPAHに対する薬効を評価することができる。
　本開示のPHの予防又は治療薬によれば、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRに存在するステムループ構造を破壊して、レグナーゼ-1発現量の低下を抑制することにより、PHの発症を抑制したり、PHの病態を改善したりすることができる。
aは、PH患者（n=77）及び健康ボランティア(HV)（n=77）の末梢血単核球細胞（PBMC）におけるレグナーゼ-1発現量を示した図；ｂは、PH患者（n=77）をWHO機能分類（WHO-FC）に基づく重症度で軽症（クラス1と2）（n=32）及び中等症～重症（クラス3と4）（n=45）の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；cは、PH患者（n=17）を、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量が多い群（n=10）と少ない群（n=7）に分けて、死亡、肺移植、及び心不全をエンドポイントとした予後解析での無イベント率を示した図；dは、PH患者（n=77）のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と平均肺動脈圧(mPAP)との関係を示した図；eは、PH患者（n=50）を心臓MRI検査での右室駆出率（RVEF）が高値（30％以上）(n=37)と低値（30％未満）(n=13)の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；fは、PH患者（n=77）のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と血清脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)濃度との関係を示した図；gは、PH患者（n=77）のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と血清尿酸濃度との関係を示した図；h及びiは、PH患者（n=77）のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と血清C反応性タンパク(CRP)濃度との関係を示した図；jは、PH患者（n=77）をPHの治療を受けた患者(n=53)とPHの治療を受けていない患者(n=24)の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；kは、PHの治療を受けたPH患者(n=53)をmPAPが高値（45mmHG以上：n=15）及び低値（45mmHG未満：n=38）の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図である。 aは、PH患者（n=77）を各サブグループに分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；bは、CTD-PAH患者(n=22)をWHO-FCで軽度（クラス1と2）(n=9)及び重度（クラス3と4）(n=13)の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；cは、特発性PAH及び遺伝性PAH（I/HPAH）患者(n=33)をWHO-FCで軽症（クラス1と2）(n=20)及び中等症～重症（クラス3と4）(n=13)の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；dは、CTD-PAH患者(n=22)のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量とmPAPとの関係を示した図；eは、CTD-PAH患者(n=22)のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と6分間歩行距離(6MWD)との関係を示した図；fは、CTD-PAH患者(n=22)のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と血清尿酸濃度との関係を示した図；gは、CTD-PAH患者(n=22)を血清CRP濃度が高値（0.3mg/dl以上）(n=14)と低値（0.3mg/dl未満）(n=8)の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図；hは、I/HPAH患者(n=33)のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量とmPAPとの関係を示した図；iは、I/HPAH患者(n=33)のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と6分間歩行距離(6MWD)との関係を示した図；jは、I/HPAH患者(n=33)のPBMCにおけるレグナーゼ-1発現量と血清尿酸濃度との関係を示した図；kは、I/HPAH患者(n=33)を血清CRP濃度が高値（0.3mg/dl以上）(n=27)と低値（0.3mg/dl未満）(n=6)の2群に分けて、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量を示した図である。 8週齢の野生型マウス（C57BL/6）に対して4日間の低酸素負荷（Hypoxia）を行なって低酸素誘発性PHの病態誘導をした後に、気管支肺胞洗浄液から回収した細胞分画におけるIL-6及びレグナーゼ-1のmRNAの発現量を測定した結果である(n=6)。図3中、「Normoxia」は、正常酸素状態で飼育された対照マウスの結果である(n=6)。 6週齢のSDラットにモノクロタリン(MCT)を投与してPHの病態を誘発させ、MCT投与から4日後に、右心室収縮期圧（RVSP）、Fulton係数（RV/LV+S ratio）、肺組織におけるIL-6及びレグナーゼ-1のmRNA発現量を測定した結果である(n=8)。また、図4中、「Control」は、MCTを投与していない対象マウスの結果である（n=3)。 aはCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスより肺胞マクロファージ（AMΦ）及び樹状細胞(cDCs)を単離し、レグナーゼ-1発現量をQPCRにより確認した図；ｂはCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウス由来の肝臓、十二指腸、及び腎臓切片をHematoxylin-Eosin染色し観察した組織像である。 aは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスから切除した肺サンプルをHematoxylin-Eosin染色した組織像；ｂは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスから切除した肺サンプルに対してα-SMA及びフォンウィルブランド因子（vWF）の免疫染色した組織像；cは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=4)及びコントロールマウス(n=3)の肺の中膜肥厚係数を示した図；dは、Heath-Edwards分類におけるグレード1～4に対応する、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈のElastica van Gieson染色像；eは、dのマウスの肺動脈の閉塞率を示した図；fは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=9)及びコントロールマウス(n=8)の右心室収縮期圧（RVSP）を示した図；gは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(9週齢 n=10、3.5カ月齢 n=10)及びコントロールマウス(n=9)のFulton係数(RV/LV+S)を示した図；hは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスの肺静脈のElastica van Gieson染色像；iは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス(n=12)及びコントロールマウス(n=11)のRVSPを示した図；jは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス(13週齢 n=14、5カ月齢 n=4)及びコントロールマウス(n=12)のFulton係数を示した図；kは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスから切除した肺サンプルをHematoxylin-Eosin染色した組織像；lは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスから切除した肺サンプルをEVG染色した組織像；mは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスの肺動脈のElastica van Gieson染色像である。 aは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(cko)(n=4)及びコントロールマウス(n=4)の肺サンプルに含まれる肺胞マクロファージ（AMΦ）、CD11b+ cDC2、CD103+ cDC1、間質マクロファージ(IM)、好酸球、好中球、T細胞、及びB細胞の各細胞数を示した図：dは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスのCD11b+ cDC2及びCD103+ cDC1におけるCD40とCD80の発現量を示した図；bは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスのCD11b+ cDC2及びCD103+ cDC1におけるCD40とCD80の発現量を示した図；cは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(cko)(n=3)及びコントロールマウス(n=3)のcDCsにおけるIl1bとIl6の発現量を示した図；dは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(cko)(n=3)及びコントロールマウス(n=3)のマクロファージにおけるIl1bとIl6の発現量を示した図である。 aは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス(n=3)及びコントロールマウス(n=3)の肺サンプルから得られた肺胞マクロファージ(AM)と間質マクロファージ(IM)におけるレグナーゼ-1発現量を示した図；bは、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウス(n=3)及びコントロールマウス(n=3)の肺胞マクロファージ(AM)と間質マクロファージ(IM)におけるIl6、Il1b、Arg1、Retnla、及びIl4Rの発現量を示した図である。 aは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスの肺をEVG染色した組織像；bは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスの肺動脈の閉塞率を示した図；cは、LysmCre/+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスの肺をEVG染色した組織像；dは、CD11c- LysmCre/+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスの肺動脈の閉塞率を示した図；eは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスをクロドロン酸で処置した実験のプロトコール；fは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウス(CL; n=6，PBS; 4)及びコントロールマウス(CL; n=4，PBS; 7)に対して、クロドロン酸（CL）又はPBSを気管内投与し、肺胞マクロファージ(AM)と間質マクロファージ(IM)の各細胞数を示した図；gは、クロドロン酸（CL）又はPBSを気管内投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウス及びコントロールマウスの肺をEVG染色した組織像；hは、クロドロン酸（CL）又はPBSを気管内投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウス(n=7)及びコントロールマウス(n=4)の肺の中膜肥厚係数を示した図；iは、クロドロン酸（CL）又はPBSを気管内投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウス(n=7)及びコントロールマウス(n=4)の肺動脈の閉塞率を示した図；jは、低酸素負荷を行ったCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=9)及びコントロールマウス(n=7)、並びに常酸素下で飼育したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=6)及びコントロールマウス(n=5)のRVSPを示した図；kは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=9)及びコントロールマウス(n=7)、並びに常酸素下で飼育したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=6)及びコントロールマウス(n=5)のFulton係数を示した図である。 aは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈及び肺胞マクロファージのトランスクリプトーム解析のプロトコール；bは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈で増加した遺伝子が高度に濃縮されていた遺伝子群を示した図；cは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈で発現上昇した遺伝子の中で、細胞周期に関する遺伝子セットについて遺伝子セット濃縮解析(GSEA)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）の結果を示した図；dは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈でアップレギュレートされた遺伝子についてKEGG経路解析の結果を示した図；eは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスの肺胞マクロファージを使用したトランスクリプトーム解析結果のボルケーノプロットを示した図；fは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスの肺胞マクロファージにおける、血管新生サイトカイン発現量のヒートマップを示した図；gは、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びコントロールマウスの肺胞マクロファージにおける、M1及びM2マクロファージシグネクチャー遺伝子の発現量のヒートマップを示した図である。 hは、肺動脈でレグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージリガンドと標的遺伝子との間の調節ポテンシャルを表すリガンド-標的マトリックスである。 iは、肺動脈でレグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージリガンドと標的遺伝子との間の調節ポテンシャルを表すリガンド-標的マトリックスである。 CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス(n=3)及びコントロールマウス(n=3)の肺胞マクロファージにおけるIl1b、Il6、Il10、Arg1、Retnla、Ym1、Il4ra、Ir4f、Ccl24、Pdgfa、Pdgfb、Vegfa、Fgf2、Hgf、Igf1、Plau、及びThbs1の発現量を示した図である。 aは、遺伝子の3' UTRを含むルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3と、レグナーゼ-1(WT)、レグナーゼ-1変異体(D141N)、又は空（コントロール）の発現プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションすることにより行ったルシフェラーゼレポーターアッセイの結果(n=3)を示した図；bは、抗IL-6受容体中和抗体（MR16-1）を用いたPAHモデルマウスの治療実験のプロトコール；cは、MR16-1又はコントロール抗体(IgG)を投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスのRVSPを示した図；dは、MR16-1又はコントロール抗体(IgG)を投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスのFulton係数を示した図；eは、MR16-1又はコントロール抗体(IgG)を投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスから切除した肺サンプルをHematoxylin-Eosin染色した組織像；fは、PDGF受容体阻害剤（イマチニブ）及びIL-1受容体阻害剤（アナキンラ）を用いたPAHモデルマウスの治療実験のプロトコール；gは、イマチニブ又はアナキンラを投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスRVSPを示した図；hは、イマチニブ又はアナキンラを投与したCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスのFulton係数を示した図である。 aは、レグナーゼ-1モルフォリノオリゴ（Reg1 MO）を用いたPAH治療実験のプロトコール；bは、Reg1 MO又はコントロールオリゴを投与した後に低酸素負荷したマウスのRVSPを示した図；cは、Reg1 MO又はコントロールオリゴを投与した後に低酸素負荷したマウスのFulton係数を示した図；dは、Reg1 MO又はコントロールオリゴを投与した後に低酸素負荷したマウスから切除した肺サンプルをEVG染色した組織像；eは、Reg1 MO又はコントロールオリゴを投与した後に低酸素負荷したマウスの肺の中膜肥厚係数を示した図である。
１．用語
　本明細書で使用される用語は、特に具体的な定めのない限り、医学、薬学、分子生物学、微生物学、有機化学等の分野における当業者に一般に理解される通りの意味を有する。本明細書において定義された用語は、一般的に理解されるのと同じ意味を有していない場合、本明細書の記載内容が優先する。
　「肺高血圧症」（Pulmonary Hypertension、PH）とは、肺動脈の血圧が高くなることで、心臓と肺の機能障害をもたらす予後不良な進行性の疾患群であり、ニース分類によって、第1群：肺動脈性肺高血圧症（Pulmonary Arterial Hypertension、PAH）、第1'群：肺動脈閉鎖症（pulmonary veno-occlusive disease、PVOD）及び／又は肺毛細管腫症（pulmonary capillary hemangiomatosis、PCH）、第1''群：新生児遷延性肺高血圧症、第2群：左心性心疾患に伴う肺高血圧症、第3群：肺疾患及び／又は低酸素血症に伴う肺高血圧症、第4群：慢性血栓塞栓性肺高血圧症、第5群：詳細不明な多因子のメカニズムに伴う肺高血圧症に分類されている。
　肺動脈性肺高血圧症（PAH）は、更に、特発性肺動脈性肺高血圧症(idiopathic PAH; IPAH)、遺伝性肺動脈性肺高血圧症(heritable PAH; HPAH)、薬剤・毒物誘発性肺動脈性肺高血圧症、及び各種疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症(associated PAH)に細分類されている。各種疾患に伴うPAHの内訳としては、膠原病(Connective tissue disease; CTD), ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染, 門脈圧亢進症, 先天性心疾患, 住血吸虫症がある。
２．PHマーカーを利用した発明
２－１．検査方法
　本開示の一実施形態は、PHの罹患の有無、PHの重症度、又はPHの予後を検査する方法であって、被験体から単離された試料中のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定する工程を含む検査方法である。
　本開示において、「被験体」とは、PHの罹患の有無、PHの重症度、又はPHの予後の判定の対象となるヒト又は非ヒト動物である。非ヒト動物としては、具体的には、霊長類動物、ラット、マウス、スナネズミ、モルモット、ハムスター、フェレット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。本開示の検査方法は、ヒトを対象とした検査に好適であるので、被験体としては、好ましくはヒトである。
　「被験体から単離された試料」とは、前記被験体から単離された生体由来サンプルである。当該試料としては、被験体の血液又は血液から調製した試料であることが好ましい。特に、本開示の検査方法では、末梢血単核球細胞におけるレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を指標として高精度な検査が可能になるので、試料としては、末梢血液、末梢血液から調製した末梢血単核球細胞を含む試料、又は単離された末梢血単核球細胞が好ましい。
　本開示の検査方法では、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量（レグナーゼ-1タンパク質量）の一方のみを測定してもよく、またこれらの双方を測定してもよい。
　試料中のレグナーゼ-1遺伝子発現量の測定は、例えば、ノーザンブロッティング、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、RNA-Seq解析、DNAマイクロアレイ法（DNAチップを利用した方法）、ドットブロット法、RNaseプロテクションアッセイ法等の公知の方法を利用して行うことができる。また、レグナーゼ-1遺伝子発現量の測定値は、試料中における1以上の内在性コントロールの遺伝子発現量に対するレグナーゼ-1遺伝子発現量の相対発現量であってもよい。内在性コントロールとしては、ハウスキーピング遺伝子を利用することができる。
　試料中のレグナーゼ-1量の測定は、例えば、レグナーゼ-1を特異的に認識し結合する抗体を用いる免疫測定法により行うことができる。抗体は、公知の方法により作製することができる。免疫測定法としては、例えば、レグナーゼ-1に特異的に結合する抗体を固定した固相担体を用いる方法や、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング等が挙げられる。固相担体を用いる方法として、例えば、固定化マイクロタイタープレートを用いる酵素免疫測定法(ELISA)、固定化粒子を用いる凝集法（免疫沈降法）等が挙げられる。また、レグナーゼ-1量の測定は、抗体を用いないタンパク質質量分析技術である液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS/MS)による多重反応モニタリング(MRM)等を用いる方法により行うこともできる。これらの検出方法についても、常法によって実施することができる。
　本開示の検査方法において、検査対象となるPHは、ニース分類の第1群、第1'群、第1''群、第2群、第3群、第4群、及び第5群のいずれであってもよい。検査対象となるPHの好適な例として、第1群(PAH)が挙げられる。とりわけ、レグナーゼ-1遺伝子発現量及びレグナーゼ-1量の低下は、特発性又は遺伝性PAH(I/HPAH)及び膠原病性PAH(CTD-PAH)の病態を反映し易いため、本開示の検査方法の好適な一実施形態における好適な検査対象PHとして、I/HPAH及びCTD-PAHが挙げられる。
　本開示の検査方法によってPHの罹患の有無を検査する場合、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量が少ない程、被験体がPHに罹患している可能性が高いと判断される。また、本開示の検査方法によってPHの重症度を検査する場合、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量が少ない程、被験体のPHの重症度がより重篤であると判断される。また、本開示の検査方法によってPHの予後を検査する場合、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量が少ない程、被験体のPHの予後は悪いと判断される。
　本開示の検査方法によって、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量が少ないか否かは、試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を、参照値と比較して判断することができる。ここで、「参照値」とは、PHの罹患の有無、PHの重症度、PHの予後等が分かっている者から得られた試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量である。
　例えば、PHの罹患の有無を検査する場合であれば、複数の健常者由来試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量の平均値を予め求めておき、これを参照値として使用し、被験者由来試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量が当該参照値よりも低い場合には被験者はPHを罹患している可能性があると判断することができる。また、PHの罹患の有無を検査する場合、複数のPH患者由来試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量の平均値を予め求めておき、これを参照値として使用し、被験者由来試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量が当該参照値と同等程度以下である場合には被験者はPHを罹患している可能性があると判断することもできる。
　また、例えば、被験体のPHの重症度を検査する場合であれば、重症度が既知のPH患者由来試料を重症度毎に分けて、重症度毎にレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量の平均値を予め求めておき、これを参照値として使用し、被験者由来試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量がいずれの重症度の参照値に近いかを判定することにより、PHの重症度を判断することができる。
　また、例えば、PHの予後を検査する場合、予後が既知のPH患者由来試料をイベント（心不全、死亡、肺移植等）の有無に応じて分けて、イベントの有無毎にレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量の平均値を予め求めておき、これを参照値として使用し、被験者由来試料のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量がいずれの参照値に近いかを判定することによりPHの予後を予測することができる。
２－２．検査キット
　本開示の他の一実施形態は、PHの罹患の有無、PHの重症度、又はPHの予後を検査するためのキットであって、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬を含む検査キットである。本開示の検査キットは、前記検査方法を実施するために使用される検査キットであり、前記「1.２－１．検査方法」の欄に記載した内容は、本開示の検査キットにも援用される。
　レグナーゼ-1遺伝子発現量を測定するための試薬としては、例えば、レグナーゼ-1遺伝子を含む核酸（例えばmRNA、mRNAから誘導されるcDNA）を増幅するためのプライマー対、前記核酸とハイブリダイズするプローブ等が挙げられる。
　また、レグナーゼ-1量を測定するための試薬としては、例えば、レグナーゼ-1に特異的に結合する抗体等が挙げられる。当該抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体は、レグナーゼ-1に特異的に結合し得る限り、抗体断片であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Fab断片、F(ab’)2断片、単鎖抗体(scFv）等が挙げられる。また、当該抗体は、マイクロタイタープレート、粒子等の固相担体に固定化された状態で提供されてもよい。
　また、本開示の検査キットには、更に、測定に必要な成分を含む希釈用又は反応用の緩衝液、洗浄液、発色試薬、反応容器等を含んでいてもよい。
３．PAH病態モデル動物及びこれを使用した方法
３－１．PAH病態モデル動物
　本開示の更に他の一実施形態は、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物からなるPAH病態モデル動物である。以下、本開示のPAH病態モデル動物について詳述する。
　本開示のPAH病態モデル動物の種について、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、フェレット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、サル等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。これらの非ヒト哺乳動物の中でも、好適な一例としてマウス、ラット、モルモット、及びウサギが挙げられる。
　本開示のPAH病態モデル動物において、レグナーゼ-1を欠損させる免疫細胞の種類については、特に限定されないが、例えば、肺胞マクロファージ等のマクロファージ；樹状細胞；好中球、好酸球、好塩基球等の顆粒球；Ｔ細胞、Ｂ細胞等のリンパ球等が挙げられる。本開示のPAH病態モデル動物の好適な一実施形態として、少なくとも肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物が挙げられる。少なくとも肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物では、更にマクロファージ、リンパ球、及び顆粒球の中の少なくとも１つ以上においても、レグナーゼ-1が欠損していてもよいてもよい。本開示のPAH病態モデル動物の一実施形態として、少なくとも肺胞マクロファージと樹状細胞でレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物が挙げられる。また、本開示のPAH病態モデル動物の他の一実施形態として、少なくとも肺胞マクロファージと骨髄系樹状細胞でレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物が挙げられる。
　免疫細胞特異的にレグナーゼ-1を欠損させた非ヒト動物は、コンディショナルノックアウト法を使用して作製することができる。コンディショナルノックアウト法は、Cre/loxPシステム等を使用した公知の手法で実施できる。例えば、肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1を欠損している非ヒト動物を作製する場合であれば、レグナーゼ-1をコードしている遺伝子（ZC3H12A）領域をCreリコンビナーゼ標的配列loxPで挟んだ遺伝子座を持つ動物（flox動物）を作製し、これを肺胞マクロファージでCreリコンビナーゼを発現している動物と交配させればよい。
　例えば、CD11c-Creマウスは、CD11c遺伝子プロモーターによって誘導されるDNA組み換え酵素Creリコンビナーゼが導入されており、flox動物との交配によって肺胞マクロファージ及び樹状細胞に特異的に目的遺伝子を欠損させ得ることが知られている。従って、CD11c-Creマウスを、Zc3h12a遺伝子内にfloxサイトを導入したマウスと交配させることにより、肺胞マクロファージと樹状細胞でレグナーゼ-1が特異的に欠損しているマウスを作製することができる。
　また、例えば、LysM-Creマウスは、ysozyme遺伝子プロモーターによって誘導されるDNA組み換え酵素Creリコンビナーゼが導入されており、flox動物との交配によって肺胞マクロファージを含む骨髄球系細胞に特異的に目的遺伝子を欠損させ得ることが知られている。従ってLysM-Creマウスを、Zc3h12a遺伝子内にfloxサイトを導入したマウスと交配させることにより、肺胞マクロファージを含む骨髄球系免疫細胞でレグナーゼ-1が特異的に欠損しているマウスを作製することができる。
　従来のPAH病態モデル動物の作製では、低酸素負荷や、モノクロタリンやSugen5416等の化学物質曝露が必要であったが、免疫細胞、特に肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物は、通常の飼育環境で飼育すると、PAHを自然発症し、PAH病態を呈する。本開示のPAH病態モデル動物においてPAHを自然発症するまでの飼育期間については、動物物の種類や系統、レグナーゼ-1を欠損させている免疫細胞の種類等に応じて異なるが、通常6～7週間程度が挙げられる。PAHの病態を呈していることは、血行動態測定、肺組織及び心臓組織の形態学的解析等によって、右心室収縮期圧（RVSP）、右室肥大の度合いの指標であるFulton係数（右室/左室+中隔重量比）、肺血管リモデリング（狭窄や閉塞）等によって確認できる。
　本開示のPAH病態モデル動物は、I/HPAH、CTD-PAH、CHD-PAH、門脈肺高血圧症(PoPH)、薬物誘発性PAH等のいずれのPAH病態モデルとして使用してもよいが、I/HPAH及びCTD-PAHの病態を反映し易いため、本開示のPAH病態モデル動物の一実施形態では、I/HPAH病態モデル又はCTD-PAH病態モデルとして好適に使用される。
　本開示のPAH病態モデル動物は、後述するPAHの予防又は治療薬のスクリーニングやPAHの予防又は治療薬の薬効評価だけでなく、PAHの病態の解明等の研究試料として使用できる。
３－２．PAH病態モデル動物を使用したPAHの予防又は治療薬のスクリーニング方法
　本発明の更に他の一実施形態は、被験物質の中から、PAHの予防又は治療薬になり得る候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の第１工程～第３工程を含むスクリーニング方法である：
　被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える第１工程、
　被験物質を与えた前記非ヒト動物のPAHの病態を調べる第２工程、及び
　被験物質を与えた前記非ヒト動物のPAHの病態が、被験物質を与えていない前記非ヒト動物と比較して改善されている場合に、当該被験物質をPAHの予防又は治療薬になり得る候補物質候補物質として選択する第３工程。
［第１工程］
　第１工程では、被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える。
　本開示のスクリーニング方法において、被験物質とは、PAHの予防及び／又は治療効果の存否の確認対象となる物質である。被験物質としては、具体的には、合成化合物、核酸（例えば、アンチセンス核酸、cDNA、siRNA等）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、培養産物、これらの混合物等が挙げられる。
　第１工程で使用する「免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物」は、前記「３－１．PAH病態モデル動物」の欄に記載の通りである。
　第１工程において、被験物質を前記非ヒト動物に与えるタイミングとしては、特に制限されず、前記非ヒト動物がPAHの病態を発症する前又は後のいずれであってもよい。PAHの病態を発症する前から発症した後に継続してした後であってもよい。第１工程において、前記非ヒト動物がPAHの病態を発症する前に被験物質を与えた場合には、PAHの発症を遅延させる効果やPAHの発症を抑制する効果を有する候補物質をスクリーニングできる。また、第２工程において、前記非ヒト動物がPAHの病態を発症する前に被験物質を与えた場合には、PAHの病態を改善する候補物質をスクリーニングできる。
　また、第１工程において、被験物質を前記非ヒト動物に与える回数については特に限定されず、１回のみ被験物質を与えてもよく、また一定の間隔を空けて２回以上被験物質を与えてもよい。
　第１工程において、被験物質を前記非ヒト動物に与える方法については、特に限定されず、経口投与、血管内（動脈内又は静脈内）注射、経肺投与（吸入）、持続点滴、皮下投与、筋肉内投与、経腸投与、腹膜内投与、局所投与等のいずれであってもよい。
［第２工程］
　第２工程では、被験物質を与えた前記非ヒト動物のPAHの病態を調べる。第２工程において、PAHの病態を調べるタイミングについては、特に限定されず、被験物質の効果が十分に現れている時点に設定すればよいが、例えば、被験物質を最初に与えた時点から、例えば14日後程度、14～56日後程度、又は28～56日後程度に設定すればよい。
　第２工程において、PAHの病態を調べるには、血行動態測定、肺組織及び心臓組織の形態学的解析等によって、右室収縮期圧（RVSP）、右室/左室重量比（Fulton係数）、肺血管リモデリング等を確認すればよい。
［第３工程］
　第３工程では、被験物質を与えた前記非ヒト動物のPAHの病態が、被験物質を与えていない前記非ヒト動物と比較して改善されている場合に、当該被験物質をPAHの予防又は治療薬になり得る候補物質として選択する。
　第３工程において選択された候補物質は、I/HPAH、CTD-PAH、CHD-PAH、PoPH、薬物誘発性PAH等のいずれのPAHに対する予防又は治療薬の候補にもなり得るが、前記非ヒト動物はI/HPAH及びCTD-PAHの病態を反映し易いため、第３工程において選択された候補物質は、I/HPAH又はCTD-PAHの予防又は治療薬の候補として好適である。
　第３工程において選択された候補物質は、更に、安全性の評価や臨床試験等の試験に供して、PAHの予防又は治療薬としての臨床的有効性を判断することができる。
３－３．PAH病態モデル動物を使用したPAHに対する薬効評価方法
　本開示の更に他の一実施形態は、被験物質のPAHに対する薬効を評価する方法であって、以下の第I工程及び第II工程を含む薬効評価方法である：
　被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える第I工程、
　被験物質を与えた前記非ヒト動物のPAHの病態を調べる第II工程。
　本開示の薬効評価方法において、薬効の評価対象疾患であるPAHは、I/HPAH、CTD-PAH、CHD-PAH、PoPH、薬物誘発性PAH等のいずれであってもよいが、前記非ヒト動物はI/HPAH及びCTD-PAHの病態を反映し易いため、I/HPAH又はCTD-PAHの薬効評価に好適である。
［第I工程］
　第I工程では、被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える。
　本開示の薬効評価方法において、被験物質とは、PAHに対する薬効（予防及び／又は治療効果）の評価対象となる物質である。被験物質は、PAHの予防又は治療薬として有効性が確認又は示唆されている物質であってもよく、PAHの予防及び／又は治療効果が確認されていない物質であってもよい。被験物質としては、具体的には、合成化合物、核酸（例えば、アンチセンス核酸、cDNA、siRNA等）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、培養産物、これらの混合物等が挙げられる。
　第I工程で使用する「免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物」は、前記「３－１．PAH病態モデル動物」の欄に記載の通りである。
　第I工程において、被験物質を前記非ヒト動物に与えるタイミング、回数、及び方法等については、前記「３－２．PAH病態モデル動物を使用したPAHの予防又は治療薬のスクリーニング方法」の第１工程の場合と同様である。
［第II工程］
　第II工程では、被験物質を与えた前記非ヒト動物のPAHの病態を調べる。第II工程において、PAHの病態を調べるタイミングや方法等については、前記「３－２．PAH病態モデル動物を使用したPAHの予防又は治療薬のスクリーニング方法」の第２工程の場合と同様である。第II工程において、PAHの病態の改善度が高い程、被験物質のPAHに対する薬効が高いと判断される。
４．PHの予防又は治療薬
　本開示の更に他の一実施形態は、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を含むPHの予防又は治療薬である。以下、本開示のPHの予防又は治療薬について詳述する。
［レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質］
　レグナーゼ-1は、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRに存在する２つのステムループ構造を認識して、レグナーゼ-1 mRNAを分解していることが知られている（国際公開第2019/182055)。本開示のPHの予防又は治療薬では、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRに存在する２つのステムループ構造の少なくとも一方を破壊することにより、レグナーゼ-1発現量の低下を抑制することにより、PHの病態を改善することができる。
　本開示のPHの予防又は治療薬において、ステムループ構造を破壊対象となるレグナーゼ-1は、PHの予防又は治療薬が投与される種に由来するものであればよい。例えば、本開示のPHの予防又は治療薬をヒトに投与する場合には、ヒトレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を使用すればよい。レグナーゼ-1の代表的なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_001310479.1（ヒト、配列番号3）およびNP_694799.1（マウス、配列番号4）として登録されている。
　「レグナーゼ-1 mRNAの3'UTR」は、レグナーゼ-1 mRNAにおいて、3'側の翻訳されない領域である。レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRの塩基配列の例として、少なくとも配列番号5（ヒト）又は配列番号6（マウス）で示される配列を含む塩基配列が挙げられる。例えば、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRは、配列番号1（ヒト）又は配列番号2（マウス）で示される塩基配列を含む。
　「ステムループ構造」とは、一本鎖核酸において、分子内の離れた２つの領域に存在する相補的な配列が結合してステム部分を形成し、その２つの領域に狭まれた配列がループ部分を形成している構造である。ヒトレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRは、配列番号1の第231～245位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造、及び／又は、配列番号1の第424～442に相当する領域で形成される第２のステムループ構造を有する。また、マウスレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRは、配列番号2の第196～210位に相当する領域で形成される第１のステムループ構造、及び／又は、番号2の第378～392に相当する領域で形成される第２のステムループ構造を有する。
　「ステムループ構造を破壊する物質」とは、ステムループ構造内の相補的結合を阻害する物質である。マウスレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質については、国際公開第2019/182055に記載されており、公知である。ステムループ構造を破壊する物質としては、ステムループ構造内の少なくとも１対、少なくとも２対、又は少なくとも３対のヌクレオチド間の相補的結合を阻害する物質であればよい。例えば、ステムループ構造を形成する塩基配列に結合するオリゴ核酸、又はステムループ構造を形成する塩基配列をゲノム編集技術により改変するための物質が挙げられる。
　本開示のPHの予防又は治療薬の一実施形態において、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質は、ステムループ構造を形成している領域の塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするオリゴ核酸である。当該オリゴ核酸は、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRにおけるステムループ構造を形成する領域の少なくとも一部、例えば、ステムループ構造のステム部分を形成する少なくとも１個、少なくとも２個又は少なくとも３個のヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、ステムループ構造内の相補的結合を阻害し得る。例えば、当該オリゴ核酸は、ステムループ構造のステム部分を形成する少なくとも２個又は３個、例えば３個の連続するヌクレオチドを含む配列に相補的な配列を含む。当該連続するヌクレオチドは、ステムループ構造のループ部分に隣接するものであり得、例えば、配列番号１では、第233～235位、第241～243位、第426～428位、及び第438～440位に相当し得る。当該オリゴ核酸は、それ自体がステムループ構造、ヘアピン構造、または二量体などの多量体を形成しないものが好ましい。当該オリゴ核酸は、例えば10～30個、15～27個、18～25個又は20～23個の塩基からなる一本鎖核酸である。
　一実施形態では、ヒトレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸は、以下の(a-1)及び(a-2)の少なくとも1つのオリゴ核酸である。
(a-1)配列番号1の第206～242位の塩基配列のうち、配列番号1の第233～235位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(a-2)配列番号1の第234～270位の塩基配列のうち、配列番号1の第241～243位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
　また、一実施形態では、前記(a-1)のオリゴ核酸は、配列番号7（5'-AATGTGTATCAACAGGGTGATCG-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の一実施形態では、(a-1)のオリゴ核酸は、配列番号7の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、(a-1)のオリゴ核酸は、配列番号7の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号7の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　本開示において、塩基配列の同一性とは、塩基間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の配列の領域にわたって最適な状態（ヌクレオチドの一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズム等）が挙げられる。配列同一性は、例えばBLAST、FASTA等の配列解析ソフトウェアを用いて決定され得る。
　また、一実施形態では、(a-2)のオリゴ核酸は、配列番号8（5'-CTTAAACTACAGAGATACAATGT-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の実施形態では、(a-2)のオリゴ核酸は、配列番号8の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、ある実施態様では、(a-2)のオリゴヌクレオチドは、配列番号8の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号8の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　また、他の一実施形態では、ヒトレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸は、以下の(b-1)及び(b-2)の少なくとも１つのオリゴ核酸である。
(b-1)配列番号1の第399～439位の塩基配列のうち、配列番号1の第426～428位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(b-2)配列番号1の第427～467位の塩基配列のうち、配列番号1の第438～440位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
　また、一実施形態では、前記(b-1)のオリゴ核酸は、配列番号9（5'-ACGGTGCCCAACTAGCCAG-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の一実施形態では、(b-1)のオリゴ核酸は、配列番号9の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、(ｂ-1)のオリゴ核酸は、配列番号9の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号9の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　また、一実施形態では、前記(b-2)のオリゴ核酸は、配列番号10（5'-GGCCCTTGGAGGGCAGGCA-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の一実施形態では、(b-2)のオリゴ核酸は、配列番号10の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個の塩基が欠失、置換、付加または挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、(b-2)のオリゴ核酸は、配列番号10の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号10の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　一実施形態では、マウスレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸は、以下の(a-1')及び(a-2')の少なくとも１つのオリゴ核酸である。
(a-1')配列番号2の第171～207位の塩基配列のうち、配列番号2の第198～200位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(a-2')配列番号2の第199～235位の塩基配列のうち、配列番号2の第206～208位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
　また、一実施形態では、前記(a-1')のオリゴ核酸は、配列番号11（5'-aatgtgtatcaacagggtgatca-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の一実施形態では、(a-1')のオリゴ核酸は、配列番号11の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、(a-1')のオリゴ核酸は、配列番号11の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号11の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　また、一実施形態では、(a-2')のオリゴ核酸は、配列番号12（5'-cttaaatgacagagatacaatgt-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の実施形態では、(a-2')のオリゴ核酸は、配列番号12の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、ある実施態様では、(a-2')のオリゴ核酸は、配列番号12の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号12の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　また、他の一実施形態では、マウスレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸は、以下の(b-1')及び(b-2')の少なくとも１つのオリゴ核酸である。
(b-1')配列番号2の第354～388位の塩基配列のうち、配列番号2の第381～383位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
(b-2')配列番号2の第382～416位の塩基配列のうち、配列番号2の第387～389位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
　また、一実施形態では、前記(b-1')のオリゴ核酸は、配列番号13（5'-atggtgcctaactagccggt-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の一実施形態では、(b-1')のオリゴ核酸は、配列番号13の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個のヌクレオチドが欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、(b-1')のオリゴ核酸は、配列番号13の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号13の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　また、一実施形態では、(b-2')のオリゴ核酸は、配列番号14（5'-cctcagagagcaggcacatg-3'）と、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の配列同一性を有するオリゴ核酸である。また、別の実施形態では、(b-2')のオリゴ核酸は、配列番号14の塩基配列において、1個又は数個、例えば、2個若しくは3個のヌクレオチドが欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなるオリゴ核酸である。また、一実施形態では、ある実施態様では、(b-2')のオリゴ核酸は、配列番号14の塩基配列からなるオリゴ核酸、又は配列番号14の塩基配列を含むオリゴ核酸である。
　本開示のPHの予防又は治療薬において、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸は、１種の配列のものを単独で使用してもよく、2種以上の配列のものを組み合わせて使用してもよい。2種以上の配列のオリゴ核酸を使用する場合には、全てのオリゴ核酸を含む組成物としてもよく、また、各々1種またはそれ以上のオリゴ核酸を含む2種以上の組成物を併用してもよい。1つの組成物に2種類以上のオリゴ核酸が含まれる場合は、オリゴ核酸間で相補的結合を形成しないことが好ましい。
　本開示のPHの予防又は治療薬をヒトに使用する場合の一実施形態として、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸として、前記(a-1)及び(a-2)から選択される１種のオリゴ核酸と、前記(b-1)及び(b-2)から選択される１種のオリゴ核酸とを組み合わせて用いることが挙げられる。具体的には、前記(a-1)と(b-1)のオリゴ核酸の組合せ、前記(a-1)と(b-2)のオリゴ核酸の組合せ、前記(a-2)と(b-1)のオリゴ核酸の組合せ、又は前記(a-2)と(b-2)のオリゴ核酸の組合せが挙げられる。
　また、本開示のPHの予防又は治療薬をマウスに使用する場合の一実施形態として、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸として、前記(a-1')及び(a-2')から選択される１種のオリゴ核酸と、前記(b-1')及び(b-2')から選択される１種のオリゴ核酸とを組み合わせて用いることが挙げられる。具体的には、前記(a-1')と(b-1')のアオリゴ核酸の組合せ、前記(a-1')と(b-2')のオリゴ核酸の組合せ、前記(a-2')と(b-1')のオリゴ核酸の組合せ、又は前記(a-2')と(b-2')のオリゴ核酸の組合せが挙げられる。
　本開示のPHの予防又は治療薬において、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸は、天然のヌクレオチドで構成されてもよく、人工のヌクレオチドで構成されてもよく、１個又はそれ以上の天然のヌクレオチドと１個又はそれ以上の人工ヌクレオチドで構成されてもよい。天然のヌクレオチドとしては、例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドが挙げられる。人工ヌクレオチドは、天然のヌクレオチドと異なる構造を有し、ヌクレアーゼ耐性や標的配列との結合親和性を高めるものを選択すればよい。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012). Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chemistry & biology, 19(8), 937-954 に記載の人工ヌクレオチドを使用できる。人工ヌクレオチドとしては、具体的には、無塩基（abasic）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸(PNA）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸(PHONA)、架橋型人工核酸(LNA)、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸(ENA)、拘束エチル(cEt)、モルフォリノ核酸等が挙げられる。糖修飾を有する人工ヌクレオチドとしては、例えば、2'-O-メチルリボース、2'-O-メトキシエチルリボース、2'-デオキシ-2'-フルオロリボース、3'-O-メチルリボース等の置換五単糖；1',2'-デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ－アノマーの糖修飾を有するもの等が挙げられる。修飾された塩基を有する人工ヌクレオチドとしては、例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-メチルシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル等のピリミジン；6-メチルアデニン、6-チオグアノシン等のプリン；及び他の複素環塩基等を有するものが挙げられる。オリゴ核酸中の人工ヌクレオチドは、すべて同じ種類のものであってもよく、２種類以上の異なる人工ヌクレオチドであってもよい。
　本開示のPHの予防又は治療薬において、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸の好適な一例として、モルフォリノオリゴが挙げられる。モルフォリノオリゴは、下記の構造が繰り返し連結した構造を有するオリゴ核酸である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　前記式中、Ｂは、アデニン、シトシン、グアニンまたはチミンであり、破線は隣接する構造との結合点である。
　また、本開示のPHの予防又は治療薬において、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得るオリゴ核酸の他の例として一本鎖DNAが挙げられる。
　本開示のPHの予防又は治療薬においてレグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得る物質としてオリゴ核酸を使用する場合、当該オリゴ核酸は、活性又は細胞への取り込みを増強する１以上の成分又はコンジュゲートと結合していてもよい。そのような成分としては、以下に限定されないが、コレステロール成分、コール酸、チオエーテル（例えばヘキシル-S-トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート）、ポリアミン、ポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル成分、オクタデシルアミン、ヘキシルアミノ－カルボニル-tオキシコレステロールもしくはオクタグアニジンデンドリマー成分等が挙げられる。
［対象となるPH］
　本開示のPHの予防又は治療薬では、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊し得る物質をPHの予防又は治療のために使用する。本開示において、PHの予防薬とは、PHを発症又は再発する可能性がある対象において、PHの発症又は再発を防止する、PHを発症又は再発する可能性を低減する、又はPH又は再発の時期を遅延させる目的で使用される薬剤を指す。また、本開示において、PHの治療薬とは、PHを発症している対象において、PHの原因を軽減又は除去する、PHの進行を遅延又は停止させる、及び／又は、PHの症状を軽減、緩和、改善又は除去する目的で使用される薬剤を指す。
　本開示のPHの予防又は治療薬の適用対象となるPHのタイプについては、特に限定されず、ニース分類の第1群、第1'群、第1''群、第2群、第3群、第4群、及び第5群のいずれであってもよい。適用対象となるPHの好適な例として、第1群(PAH)及が挙げられる。本開示のPHの予防又は治療薬の好適な一実施形態では、I/HPAH、及びPCTD-PAHの予防又は治療の対象にすることができる。
［対象動物］
　本開示のPHの予防又は治療薬が投与される対象動物は、特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル等の哺乳動物であればよいが、好ましくはヒトである。
［用量・用法］
　本開示において、PHの予防又は治療薬の投与方法については、特に限定されず、例えば、内服、血管内（動脈内又は静脈内）注射、経肺投与（吸入）、持続点滴、皮下投与、筋肉内投与、経腸投与、腹膜内投与、局所投与等が挙げられる。本開示の一実施形態において、PHの予防又は治療薬の投与方法の好適な一例として、経肺投与が挙げられる。
　本開示において、PHの予防又は治療薬の投与量については、投与対象の年齢、体重、PHのタイプや病態、使用する有効成分の種類等に応じて、予防又は治療有効量を適宜設定すればよいが、例えば、成人1日当たりの、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質の投与量は、0.01～100 mg/kg程度又は0.5～5 mg/kg程度の範囲内で適宜設定すればよい。PHの予防又は治療薬は、1日当たり1回又は数回に分けて1日のみ投与してもよい、また、PHの予防又は治療薬は1日又は数日の間隔を空けて連用してもよい。
［製剤化］
　本開示のPHの予防又は治療薬は、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質に加えて、トランスフェクション剤、安定剤、賦形剤、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤、滅菌水、生理食塩水等を配合して、所望の剤型の医薬組成物に調製して提供される。また、医薬組成物は、その剤型に応じて、常法により製剤化できる。
　本開示は、前記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で示した文献等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
１．実験材料及び方法
（１）ヒト試料
　ヒト試料を用いた全ての実験は、国立循環器病研究センター治験審査委員会の承認の下に行われた。血液検体は、PH患者77名及び健常ボランティア(Healthy volunteers: HV)77名から得た。全ての患者及び健康ボランティアからは、生物学的研究への血液試料の使用について、書面で同意を得ている。
（２）末梢血単核球細胞（Peripheral blood mononuclear cells: PBMC）の単離
　ヒトのPBMCは、EDTA採血管を使用し、各々の末梢血試料よりLymphoprep Tube（Cosmo Bio Co.,Ltd）を用いて、指示書通りに分離した。
（３）PBMCにおけるレグナーゼ-1 mRNA量の測定
　ヒトPBMCをTRIzol(Invitrogen)を用いて溶解し、PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen)及びPureLink DNase (Invitrogen)を用いて全RNAを抽出した。全RNAに対して、PrimeScript RT reagent kit(TAKARA BIO)及びTB Green Premix Ex TaqTM II (TAKARA BIO)を用いてqRT-PCRを行った。製造元の指示書通りに逆転写させて、95℃30秒の条件の後、95℃5秒と60℃30秒と45サイクルでqPCRの反応を行った。蛍光データはLightCycler 96（Roche）を用いて回収して解析した。用いた遺伝子とそのプライマーは以下の通である。
レグナーゼ-1_f: 5'-GAAGAGGAAAAGGAGGGCAG-3'（配列番号15）
レグナーゼ-1_r: 5'-CTCCAGGATGGCACAAACAC-3'（配列番号16）
hGAPDH_f: 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'（配列番号17）
hGAPDH_r: 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'（配列番号18）
（４）実験動物
　全ての実験は8～14週齢のマウスを使用して行った。ZC3H12A遺伝子（レグナーゼ-1をコードする）遺伝子内にfloxサイトを導入したZc3h12aflox/floxマウス、CD11c遺伝子プロモーターによって誘導されるDNA組み換え酵素Creを導入したCD11c-Creマウス、lysozyme遺伝子プロモーターによって誘導されるDNA組み換え酵素Creを導入したLysM-Creマウス、Rag2をノックアウトしたRag2-/-マウス、及び骨髄細胞においてレグナーゼ-1ヘテロ接合を有するReg1 f/+マウスを準備した。
　更に、Zc3h12aflox/floxマウスとCD11c-Creマウスを交配させることにより肺胞マクロファージと、樹状細胞(cDCs)及びにおいてレグナーゼ-1を欠損しているCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスを作製した。また、Zc3h12aflox/floxマウスとLysM-Creマウスを交配させることにより、肺胞マクロファージと好中球においてレグナーゼ-1を欠損させたLysmCre/+Zc3h12afl/flマウスを作製した。
　また、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスとRag2-/-マウスを交配させることにより、T細胞及びB細胞を欠くCD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスを作製した。更に、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウスとRag2-/-マウスを交配させることにより、T細胞及びB細胞を欠くLysmCre/+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスを作製した。
　なお、記載のない実験はC57BL/6マウスを日本クレアから購入して行った。全てのマウスは明暗12時間/12時間サイクルで24±1℃にて、病原体非存在環境下で、標準的マウス飼料と水を与えて飼養した。全ての動物実験は、京都大学動物実験委員会（承認番号: MedKyo21057）及び国立循環器尿センターの承認の下で実施した。
（５）PHモデルマウスの作製及び解析
　8週齢の野生型C57BL/6マウスを10％酸素の低酸素チェンバーに入れ、その中で4日間飼養し、PHの病態を誘発させた。4日間の飼育後に、気管支肺胞洗浄を行って気管支肺胞洗浄液を回収した。得られた気管支肺胞洗浄液から細胞分画をとり、IL-6及びレグナーゼ-1の発現量をRT-qPCRにて測定した。
　また、6週齢の雌性SDラットにモノクロタリン60mg/kgを皮下投与してPHの病態を誘発させた。モノクロタリンの投与から4週間後に、右心室収縮期圧（RVSP）及びFulton係数（右室/左室+中隔重量比）を測定し、更に肺組織からRNAを抽出してIL-6及びレグナーゼ-1の発現量をRT-qPCRにて測定した。
（６）肺胞マクロファージにおけるレグナーゼ-1欠損マウスの解析
　9週齢のCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びZc3h12aflox/floxマウス、又は13週齢のLysmCre/+Zc3h12afl/flマウスおよびZc3h12aflox/floxマウスに対して、肺高血圧症病態解析のために血行動態測定を行った。血行動態測定の後に、それぞれのマウスをサクリファイスして心臓と肺を切除して臓器重量を測定し、次いで組織解析を行った。
（７）Reg1 f/+マウス及びCD11c-Cre + Zc3h12a fl/+ マウスに対する慢性低酸素負荷実験
　8週齢のReg1 f/+マウス又はCD11c-Cre+Zc3h12afl/+マウスに対し、4週間の低酸素負荷を行った。低酸素負荷する際には、10％酸素の低酸素チェンバー内で持続的に4週間飼養し、掃除の為に週1回5分程度開ける以外は、この条件を維持した。低酸素ガスは流量7L/分で低酸素チェンバーへと持続的に供給した。低酸素負荷後のマウスは血行動態の測定を行った後に、サクリファイスして心臓と肺を切除して臓器重量を測定し、次いで組織解析を行った。
（８）抗IL-6受容体中和抗体を用いたPAHモデルマウスの治療実験
　抗IL-6受容体中和抗体は、マウスIL-6受容体に対するラットモノクローナルIgG抗体であるMR16-1を中外製薬株式会社から供与されたものを使用した。MR16-1又はコントロール抗体（ラットnon-immune isotype IgG; MP Biomedicals, Solon, OH）2mgをCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスに対し4週齢から静脈注射で投与して、その後は1週間に1回の頻度で0.5mgのMR16-1又はコントロール抗体を腹腔内投与し、8週齢で血行動態測定を行った後に、サクリファイスして心臓と肺を切除して臓器重量を測定し、次いで組織解析を行った。
（９）PDGF受容体阻害剤を用いたPAHモデルマウスの治療実験
　PDGF受容体阻害剤としてイマチニブを使用した。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスに対し4週齢から50mg/kg/dayとなるようにイマチニブを混餌投与した。コントロール群には粉餌を自由摂取させた。8週齢で血行動態測定を行った後に、サクリファイスして心臓と肺を切除して臓器重量を測定し、次いで組織解析を行った。
（１０）IL-1受容体阻害剤を用いたPAHモデルマウスの治療実験
　IL-1受容体阻害剤としてアナキンラを使用した。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスに対し4週齢から20mg/kg/dayでアナキンラを腹腔内投与した。コントロール群は、粉餌を自由摂取させた。8週齢で血行動態測定を行った後に、サクリファイスして心臓と肺を切除して臓器重量を測定し、次いで組織解析を行った。
（１１）レグナーゼ-1の分解を抑制するモルフォリノオリゴ(MO)を用いたPAHモデルマウスの治療実験
　マウスレグナーゼ-1の分解を抑制するマウスレグナーゼ-1モルフォリノ修飾オリゴ核酸（Reg1 MO）として、以下の191-210MOと378-392MOを等モル量含むレグナーゼ-1モルフォリノオリゴ混合物を使用した。191-210MOは、配列番号2（マウスレグナーゼ-1 mRNAの3'UTR）の塩基配列の第201～223位に相補的な塩基配列を有している。また、378-392MOは、配列番号2の塩基配列の第384～403位に相補的な塩基配列を有している。また、コントロールとして、以下の塩基配列からなるモルフォリノオリゴ（コントロールオリゴ）を使用した。
191-210MO： 5'-cttaaatgacagagatacaatgt-3'（配列番号12）
378-392MO： 5'-cctcagagagcaggcacatg-3'（配列番号14）
コントロールオリゴ：5'-cctcttacctcagttacaatttata-3'（配列番号19）
　8週齢の雄C57BL/6マウスに対してReg1 MO又はコントロールオリゴを25μg/week（50μL投与）となるように1週間に1回の頻度で合計3回気管内投与した。最初の投与から1日後にマウスを10％酸素の低酸素チェンバーに入れ、その中で4週間飼養した。4週間後に、低酸素負荷マウスの血行動態測定を行った後に、サクリファイスして心臓と肺を切除して臓器重量を測定し、次いで組織解析を行った。
（１２）右心カテーテルによる血行動態測定
　マウスをイソフルラン（1.5～2％）で麻酔した。手技の間にマウスの体温を直腸温モニターと連動したサーモスタット制御のヒートパッドで37～38℃に維持した。気管切開してマウス用の人工呼吸器（VentElite; Harvard apparatus）で1回換気量200～300μL、160～180 breath/minで換気した。
　ポリエチレンチューブ（SP-31）を右外頸静脈に挿入して右室まで進めて右室圧（RVP）を測定した。熱で引き延ばし、先端を細くしたポリエチレンチューブ（PE50）を右頸動脈に挿入して動脈圧（AP）を測定した。AP及びRVPシグナルは圧トランスデューサー（MLT0670; ADインスツルメンツ）で検出して、圧アンプリファイアー（ML117; ADインスツルメンツ）でそのシグナルを中継して、持続的にPower Labシステム（ADインスツルメンツColorado Springs, CO）でサンプリングし、Chart software（ADインスツルメンツ）を用いたコンピューターで記録した。心拍数は動脈圧の収縮期のピークから算出した。平均動脈圧が50mmHg以上及び心拍数が350～600回/分の間にある条件のみを測定対象として実験を行った。平均動脈圧が50mmHg以下又は心拍数が350回/分以下に低下した場合は測定から除外した。
（１３）形態学的解析
　右心カテーテルでの血行動態測定の後、マウスを下大静脈からの放血で安楽死させた。安楽死後に右心カテーテルからPBSを灌流し、左心房を切開することにより脱血した。心臓を取り出して、心房を外した上で、右心室（RV）を左心室（LV）と中隔(septum)から分離した。組織重量を測定して、右室/左室重量比（RV/LV+septum比）をフルトン係数として右室肥大のメルクマールとして用いた。
　肺は組織学的な解析の為に回収した。気管は4％パラフォルムアルデヒド（PFA）で灌流し気道を伸展させる条件で固定した。切除した肺サンプルは4％PFAにて4℃で一晩固定した後にPBSで置換し、パラフィン包埋して4μm厚で切片化した。肺血管の形態解析にはElastica van Gieson染色及びHematoxylin-Eosin染色を行った。肺血管の画像はScanScope CS（Leica）又はNanoZoomer（Hamamatsu Photonics）で撮像した。各実験群でランダムに選んだ動物の肺切片を用いて形態解析を行った。肺血管リモデリングは肺実質にある肺動脈、終末細気管支レベルにある小動脈（small artery）、及び肺細葉レベルにある細小動脈(arteriole)について、中膜肥厚係数（％ wall thickness）を測定して検討した。中膜肥厚係数は、内弾性板と外弾性板の間の距離を2倍して、外弾性板間の距離（血管の直径）で除したものに100を乗じることにより算出した。一層の弾性板しかない血管では、弾性板と内皮下の基底膜との間の距離を計測した。中膜肥厚は大体円形の体裁をなす形に切片化された血管のみを対象として解析した。肺動脈の直径はAperio ImageScope（Leica）を用いて測定した。中膜肥厚係数は1匹のマウスにおいて少なくとも15の肺小動脈と肺細小動脈で計算した。
（１４）免疫組織化学的解析
　抗von Willebrand Factor (vWF)ポリクローナル抗体(bs-0586R; Bioss Inc)、抗α-平滑筋アクチン(α-SMA)抗体(sc-32251;Santa Cruz)を使用して、免疫染色を行った。組織内の内因性マウス免疫グロブリンに対する反応を排除するために、Histofine-MOUSESTAIN KIT (Nichirei)を、製造元の指示書の通りに使用した。
（１５）肺由来の単細胞懸濁液の調製
　マウスの肺サンプルをはさみで細切し、100 μg/ml DNaseＩ (Roche applied science)及び50 μg/ml Liberase TM (Roche applied science)を含むRPMI培地中で、37℃40分間消化した。次に、500 mM EDTA (Nacalai Tesque)を終濃度が10 mMとなるように添加して、37℃10分間インキュベートした。消化完了後、サンプルをGentleMACSTM Dissociator (Miltenyi biotec)に供し、40μmセルストレイナーで濾過した。濾過したサンプルを遠心分離して上清を除去した後に、細胞ペレットをACK溶液で処理し、赤血球を除去した。処理後のサンプルを10%牛胎児血清を含むRPMI培地で洗浄して遠心分離し、回収した細胞ペレットをフローサイトメトリー解析に供した。
（１６）フローサイトメトリー解析
　細胞をFixable Viability Dye eFluor 506 (eBiosciences)で染色して視細胞を除き、製造元マニュアルに従って抗マウスCD16/CD32抗体で処理した。Fcレセプターをブロッキングした後に、細胞を表面抗原染色抗体と共に氷上で20分間インキュベートした。抗体は、FITCコンジュゲート抗マウスCD4抗体(GK1.5, Biolegend)、FITCコンジュゲート抗マウスCD19抗体(clone 6D5, Biolegend)、PEコンジュゲート抗マウスSiglecF抗体(E50-2440, BD Pharmingen)、PEコンジュゲート抗マウスB220抗体(RA3-6B2, Biolegend)、APCコンジュゲート抗マウスCD11c抗体(N418, Biolegend)、Alexa Fluor 700コンジュゲート抗マウスLy-6G抗体(1A8, Biolegend)、Alexa Fluor 700コンジュゲート抗マウスI-A/I-E抗体(M5/114.15.2, Biolegend)、APC-Cy7コンジュゲート抗マウスCD11b抗体(M1/70, Biolegend)、APC-Cy7コンジュゲート抗マウスSiglecF抗体(E50-2440, BD Pharmingen)、PE-Cy7コンジュゲート抗マウスLy-6C抗体(HK1.4, Biolegend)、PE-Cy7コンジュゲート抗マウスCD11b抗体(M1/70, Biolegend)、PerCP-Cy5.5コンジュゲート抗マウスCD45.2抗体(clone 104, Biolegend)、及びBV421コンジュゲート抗マウスCD64抗体(X54-5/7.1, Biolegend)を使用した。データはLSRFotessa X-20 (BD Biosciences)を使用して取得し、ソーティングはFACSAria III (BD Biosciences)を用いて行った。FlowJo 10.5.3 software (FlowJo, LLC)を使用してデータ解析を行った。
（１７）RT-qPCR
　細胞又は組織をTRIzol reagent (Invitrogen)で溶解し、全RNAを抽出した。ReverTra Ace qPCR RT Master Mix及びgDNA remover (Toyobo)を使用して、製造元の指示書の通りに、全RNAの逆転写を行った。cDNAフラグメントをSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)で増幅し、StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)で蛍光を検出した。マウスActb mRNA量を正規化に使用した。
（１８）レーザーマイクロダイセクション
　肺組織の凍結切片をスライドガラスに載せ、トルイジンブルー染色した後に、切片を100%エタノールに浸漬させた。直径250～500μmの肺内動脈を選択し、Laser Microbeam System (Leica microsystems, Germany)を使用して肺内動脈を分離した。
（１９）mRNA抽出
　mRNAの分離は、幾つかの修正を加えたChomczynskiプロトコールに従って行った。洗浄後、RNAを10μL精製水（RNase free）に再懸濁し、DNase消化した (Ambion, Austin, TX; 1U, 30 min, 37℃)。その後、抽出を繰り返し、最終的にRNAを4μL精製水に再懸濁した。
（２０）RNAシーケンス及びバイオインフォマティクス解析
　CD11cCre/+;Zc3h12afl/flマウスの肺動脈及び肺胞からから分離したマクロファージをTRizol reagentで溶解し、前記のように全RNAを抽出した。RNA clean & Concentrator-5 (Zymo Research)で精製した後に、2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano assay若しくはRNA 6000 Pico assay (Agilent)を使用してRNAの品質をチェックし、シーケンス前の各サンプルのRIN値(RNA integrity number)が>7.0であることを確認した。NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (Illumina)を使用して製造者の指示書に従って、cDNAライブラリーを作製し、NextSeq500 (Illumina, 75 cycles)でシーケンスした。PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships) databaseを使用し、Mus musculusspeciesの生物学的プロセスに関するGO termsで遺伝子オントロジー(GO)エンリッチメント解析を行った。
（２１）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　所定遺伝子の3' UTRを含むルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3と共に、レグナーゼ-1(WT)、レグナーゼ-1変異体(D141N)、又は空（コントロール）の発現プラスミドを、HEK293細胞にトランスフェクトした。24時間培養後に、細胞を溶解し、Dual-Luciferase Reporter Assay system (Promega)を用いて溶解液のルシフェラーゼ活性を測定した。また、内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子も同時にトランスフェクトした。
（２２）統計解析
　全てのデータは、平均値±標準偏差で表現されている。多群間での有意差検定はone-way ANOVAで行い、Turkey-Kramerの方法で検定した。2群間の検定はStudent t検定で解析した。Ｐ値0.05未満を統計的有意とした。*はP<0.05、**はP<0.01、***はP<0.001、****はP<0.0001を示す。
２．実験結果
２－１．PHマーカー
（１）PH患者のPBMCにおけるレグナーゼ-1の発現量
　PHにおけるレグナーゼ-1の関与を検討するために、PBMC中のレグナーゼ-1 mRNA量を、PH患者と、年齢及び性別を一致させた健常人ボランティア(healthy volunteer; HV)との間で比較した。PH患者と健康ボランティアの年齢、性別、病型、レグナーゼ-1の発現量等の詳細を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　PH患者では、レグナーゼ-1の発現量が有意に低下していた（表1、図1のa）。レグナーゼ-1の発現量は、WHO機能分類（WHO-FC）で重度（クラス3と4）に分類されるPH患者だけでなく、軽度（クラス1と2）に分類されるPH患者でも、低かった（表1、図1のb）。PH患者をレグナーゼ-1の発現量に基づいて２つのグループに分けた場合、レグナーゼ-1の発現量が少ない患者(n=7)は、レグナーゼ-1の発現量が多い患者(n=10)に比べて、予後に死亡、心不全、肺移植等のイベントの発生率が高く、予後が著しく不良であった（図1のc）。このことは、レグナーゼ-1の発現量が、PH患者の予後の改善と正の相関関係があることを示している。また、PAH患者だけでなく、WHO機能分類の4群（CTEPH）、3群（その他）、ダウン症候群、及びキャッスルマン病でも、PBMCにおけるレグナーゼ-1の発現量が低下していた。
　更に、レグナーゼ-1の発現量は、平均肺動脈圧(mPAP)とは逆相関があることが分かった（図1のd）。レグナーゼ-1の発現量は右室駆出率の30％以上の群に比べて30％未満の群では有意に低下していた（図1のe）。更に、心不全の重症度バイオマーカーである脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、及びPH重症度のマーカーである尿酸(UA)の血清中の濃度も、PAH患者のPBMC中のレグナーゼ-1 mRNA量と逆相関しており（図1のf及びg）、レグナーゼ-1発現量がPAHの重症度と相関していることが分かった。また、レグナーゼ-1発現量は、炎症マーカーである血清C反応性タンパク(CRP)量は逆相関の関係にあることも確認できた（図1のh及びi）。
　更に、PH患者について、PHの治療を受けた患者(n=53)とPHの治療を受けていない患者(n=24)に分けて、PBMC中のレグナーゼ-1 mRNA量を分析したところ、PHの治療を受けた群では、PHの治療を受けていない群に比べて、レグナーゼ-1発現量が高い傾向が認められた（図1のj）。
　また、PH患者の内、PHの治療を受けた患者(n=53)について、mPAPが高値（45mmHg以上：n=15）及び低値（45mmHg未満：n=38）に分けて、PBMC中のレグナーゼ-1 mRNA量を分析したところ、mPAP低値の群では、mPAP高値の群に比べて、レグナーゼ-1発現量が有意に高くなっており（図1のj）、治療耐性があるPH患者群は、治療応答性があるPH患者群と比べてレグナーゼ-1発現量が有意に低いことが分かった。
（２）PHサブグループ毎のPBMCにおけるレグナーゼ-1の発現量
　PHの各サブグループでレグナーゼ-1発現量を確認したところ、膠原病性(CTD)-PAH、特発性又は遺伝性PAH(I/HPAH)、及び先天性心疾患(CHD)-PAHを含む各種PHにおいてレグナーゼ-1発現量が有意に低下していた（図2のa)。レグナーゼ-1発現量は、HVと比較して、WHO機能分類に関係なくCTD-PAH患者とI/HPAH患者で低かったが（図2のb及びc）、CTD-PAH患者ではレグナーゼ-1発現量とmPAPとの間に逆相関が認められ（図2のd）、I/HPAH患者ではレグナーゼ-1発現量とmPAPとの相関は認められなかった（図2のh）。同様に、レグナーゼ-1発現量はCTD-PAH患者における6分間歩行距離と相関していたが（図2のe）、I/HPAH患者では当該相関は認められなかった（図2のi）。一方、血清尿酸濃度については、CTD-PAHとI/HPAHの双方でレグナーゼ-1発現量と逆相関の関係があり（図2のf及びj）、血清CRP濃度が高い患者に着目しても、CTD-PAH患者とI/HPAH患者の双方でレグナーゼ-1発現量が少なかった（図2のg及びk）。
　これらの結果から、各種PH患者において、PBMCにおけるレグナーゼ-1発現量は、PHの罹患の有無の診断指標として使用でき、特にPAH（とりわけCTD-PAH）の重症度の診断指標として使用できることが明らかとなった。
　また、PHの予後（死亡、肺移植、入院）について、単変量解析及び多変量解析を行った結果を表2に示す。この結果、レグナーゼ-1の発現は、年齢、BNP、6分間歩行距離、右房圧、平均肺動脈圧、及び肺血管抵抗等の他の要因とは独立して、予後に関連する要因になっていることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２－２．PAHモデルマウス
（１）PHモデルマウスにおけるレグナーゼ-1の発現量
　野生型マウス（C57BL/6）を10％酸素の低酸素チェンバーに入れ、その中で4日間飼養し、低酸素性PH病態を誘導した。4日間の飼育後に、気管支肺胞洗浄を行って気管支肺胞洗浄液を回収した。得られた気管支肺胞洗浄液から細胞分画をとり、IL-6及びレグナーゼ-1の発現量をRT-qPCRにて測定した。その結果、低酸素負荷によりPHの病態を誘導したマウスでは、正常酸素状態で飼育された対照マウスに比べて、気管支肺胞から回収された細胞におけるIL-6の発現量が有意に増大していたが、レグナーゼ-1の発現量は有意に低下していた（図3）。
　また、SDラットにモノクロタリンを投与してPHの病態を誘発させた。モノクロタリンの投与から4週間後に、右心室収縮期圧（RVSP）及びFulton係数（右室/左室+中隔重量比）を測定し、更に肺組織からRNAを抽出してIL-6及びレグナーゼ-1の発現量をRT-qPCRにて測定した。モノクロタリンの投与から4週間後のマウスでは、モノクロタリンを投与していない対照マウスと比較して、右心室収縮期圧（RVSP）が上昇し、右室肥大の度合いの指標であるFulton係数（右室/左室+中隔重量比）も上昇しており、PHの病態が呈されていることが確認された（図4のa,b）。また、モノクロタリンを投与したマウスでは、対照マウスに比べて、肺組織におけるIL-6の発現量が有意に増大し、レグナーゼ-1の発現量は有意に低下していた（図4のc）。
　以上の結果から、２つの異なるPH動物モデルにおいて、レグナーゼ-1の発現量の有意な低下が認められたことから、レグナーゼ-1がPAHの診断指標になり得ることが支持された。
（２）肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1が欠損しているマウスの解析
　次に、レグナーゼ-1がPAHの病因に関与しているかを調べた。炎症性サイトカインを高産生する骨髄細胞におけるレグナーゼ-1の発現がPAHを調節している可能性がある。そこで、先ず、樹状細胞(cDCs)及び肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1を欠損しているCD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスを作製した（図5のa）。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスにおいて、免疫細胞は様々な臓器に浸潤していたが（図5のb）、組織学解析及び免疫組織化学的解析によって、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスにおける肺血管リモデリングは、中膜肥厚と炎症細胞の間質浸潤が特徴になっていることが確認された（図6のa～c）。更に、同心円状の新生内膜及び叢状病変等のHeath-Edwards分類におけるグレード3及び4に対応する組織学的変化が観察された（図6のd）。また、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスは、対照マウスと比較して右心室収縮期圧（RVSP）が上昇しており、これは肺動脈閉塞の重症度と一致していた（図6のe及びf）。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスでも、右室肥大の度合いの指標であるFulton係数（右室/左室+中隔重量比）の年齢依存的な増加が観察された（図6のg）。また、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスでは、肺静脈閉塞症(PVOD)の特徴である肺静脈の閉塞も観察された（図6のh)。これらの結果は、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスがCTD-PAHに関連する重度のPAHを自発的に発症することを示している。
　CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスでは、肺胞マクロファージとcDCsにおいてレグナーゼ-1が欠損しているため、レグナーゼ-1の欠損がこれらの細胞に与える影響を確認した。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスにおいて、CD103+ cDC1及びCD11b+ cDC2の細胞数は増加していたが、肺胞マクロファージは増加していなかった（図7のa）。しかし、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスのcDCsにおいて、共刺激分子CD40及びCD80の発現、並びにIl1b及びIl6等のサイトカインの発現は増大していなかった（図7のb及びc）。一方、レグナーゼ-1の欠損は、マクロファージにおけるサイトカイン遺伝子の大幅な上昇を生じさせていたことから（図7のd）、レグナーゼ-1が欠損した肺胞マクロファージが炎症性サイトカインを介してPAHを発症させていることが分かった。
　レグナーゼ-1欠損によるPAHの発症に関与する骨髄細胞の種類を調べるために、肺のマクロファージと好中球においてレグナーゼ-1を欠損させたLysmCre/+Zc3h12afl/flマウスを作製した（図8のa）。LysmCre/+Zc3h12afl/flマウスは、Fulton係数の増大及びRVSPの増加を特徴とする重度のPAHを自発的に発症した（図6のi及びj）。また、Heath-Edwards分類におけるグレード1～4に対応する病理学的変化が、LysmCre/+Zc3h12afl/flマウスの肺（図6のk及びl）で認められ、PVODの特徴（図6のm）の点でも観察された。これらの結果から、レグナーゼ-1がマクロファージ及び好中球で欠損し、DCsでは欠損していないマウスは、CTD-PAHに関連するPAHを発症することが示された。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及びLysmCre/+Zc3h12afl/flマウスは、双方とも肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1が欠損しているため、これらの結果から、肺胞マクロファージにおいてレグナーゼ-1を欠損させたマウスはPAHを自発的に発症することが確認された。
（３）肺胞マクロファージにおけるレグナーゼ-1欠損がPAHの進行に及ぼす影響の分析
　自然免疫細胞だけでなく、獲得免疫に関与するリンパ球もPAHの病因に関与すると考えられる。実際、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス又はLysmCre/+Zc3h12afl/flマウスの骨髄細胞におけるレグナーゼ-1欠損が、T細胞やB細胞等の獲得免疫の浸潤を生じさせている（図7のa）。獲得免疫細胞が肺動脈リモデリングに関与しているかを確認するために、これらのマウスを、T細胞及びB細胞を欠くRag2ノックアウトマウス（Rag2-/-マウス）と交配させた。その結果、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス又はLysmCre/+Zc3h12afl/flマウスでは、Rag2を欠損させても、かなり減弱はするが、加齢により中膜肥厚及び血管閉塞を伴う重度の肺血管リモデリングが観察され（図9のa～d）、獲得免疫細胞に加え、骨髄球系細胞も病因に直接関与していることが分かった。更に、レグナーゼ-1欠損を伴うPAHにおける肺胞マクロファージの作用を確認するために、1週間に1回マウスにクロドロン酸内包リポソームを気管内投与し、肺胞マクロファージを枯渇させた（図9のe）。RT-qPCRの結果から、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスにクロドロン酸内包リポソーム処理することにより、肺胞マクロファージは枯渇したが、間質マクロファージは枯渇しなかったことが確認された（図9のf）。図9のg～iに示すように、クロドロン酸内包リポソーム処理により、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flRag2-/-マウスにおいて有意に中膜肥厚及び閉塞率が改善された。即ち、本結果からも、肺胞マクロファージにおけるレグナーゼ-1欠損が、血管リモデリングを引き起こしてPAHを発症させ得ることが確認された。
（４）慢性低酸素負荷がレグナーゼ-1 floxヘテロ接合（Reg1 f/+）マウス及びCD11c-Cre + Zc3h12a fl/+ マウスに及ぼす影響
　従来、確立されているPHモデルマウスは、低酸素曝露又はSugen処置後に低酸素曝露によって誘発されている。骨髄細胞におけるレグナーゼ-1が、マウスの低酸素誘発性ＰＨの病因に関与しているかを確認するために、CD11c-Cre+Zc3h12afl/+マウスを使用した。骨髄細胞においてレグナーゼ-1ヘテロ接合を有するReg1 f/+マウスは、PHを自然発症しなかったが、CD11c-Cre+Zc3h12afl/+マウスに低酸素曝露すると、コントロールZc3h12afl/+マウスに比べて、Fulton係数は同等であったが、RVSPが増加した（図9のj及びk）。この結果は、肺胞マクロファージのレグナーゼ-1が低酸素条件で誘発されるPHの予防に関与していることを示している。
（５）レグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージと肺動脈とのリガンド－標的結合の分析
　レグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージが引き起こす肺動脈リモデリングのメカニズムを解明するために、先ず、レーザーマイクロダイセクションによって調製した肺動脈についてトランスクリプトーム分析を行った（図10のa）。遺伝子オントロジー(GO)解析によって、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈においてアップレギュレートされた遺伝子の中で、免疫応答に関与している遺伝子群が高度に濃縮されていることが判明した（図10のb）。また、遺伝子セット濃縮回析(GSEA)によって、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈でアップレギュレートされた遺伝子の中でも、細胞周期及び細胞増殖に関与する遺伝子セットが高度に濃縮されていることが判明した（図10のc）。更に、KEGG経路解析により、サイトカイン－サイトカイン受容体シグナル伝達経路における遺伝子は、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈において高度に濃縮されていることが判明した（図10のd）。次に、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウス及び野生型コントロールマウスのトランスクリプトミクス変化をRNAシーケンシング分析によって調べた（図10のe）。その結果、M1及びM2の双方へのマクロファージ活性化に関与する各種遺伝子（Il6, Nos2, Chil3, Arg1 及びMrc1）のアップレギュレーションが生じていることが分かった（図10のf）。更に、血管新生因子として作用し得る各種成長因子及びサイトカインが、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺胞マクロファージでアップレギュレートされていた（図10のg）。
　これらの結果から、少なくとも一部にはレグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージによって分泌される因子が動脈平滑筋細胞及び内皮細胞の増殖を抑制し、それによって血管リモデリングを誘導している可能性があると考えられる。そこで、リガンド-標的リンクを予測できるNicheNetで、肺胞マクロファージと肺動脈のトランスクリプトームデータを組み合わせることにより、肺胞マクロファージと肺動脈の間のトランスクリプトミクス変化の関連性を分析した。当該分析によって、レグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージと肺動脈の間で潜在的に機能するリガンド-標的ネットワークのセットを特定できた（図10のh,i）。特に、高いランク付けされたリガンドには、Il1a、Tnfsf10、Il6、Vegf、Pdgfb、Il33、Apoe、Anxa1、及びCcl5が含まれていた（図10のh,i）。実際に、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスは、コントロールマウスに比べて、肺胞マクロファージにおける潜在的なリガンドの発現量が増加しており（図11）、このことから、レグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージにより産生される前記サイトカイン及び血管新生因子は、血管内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖を誘導することが示唆された。
（６）肺胞マクロファージのレグナーゼ-1の機能分析
　次に、NicheNet法により同定されたサイトカイン／血管新生因子がレグナーゼ-1を介したmRNA分解によって直接的に調節されているかを分析した。レグナーゼ-1は標的mRNAの3'UTRを認識するので、血管新生因子Pdgf1、Egf、及びIgf1と共に、Il1a、Tnfsf10、Il6、Vegf、Pdgfa、Pdgfb、Il33、Apoe、Anxa1、又はCcl5を含むルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。HEK293Tにおける野生型レグナーゼ-1 (Reg1 WT)の過剰発現は、レグナーゼ-1の標的であることが確認されているIl6の3' UTR存在下だけでなく、Il1a、Tnfsf10、Pdgfa、Pdgfb及びIl33の3' UTR存在下でも、ルシフェラーゼ活性の有意な抑制が認められたが（図12のa）、Pdgfa、Apoe、Anxa1、Ccl5、Egf、又はIgf1の3' UTR存在下ではルシフェラーゼ活性の有意な抑制は認められなかった。ヌクレアーゼ活性が不活化されているレグナーゼ-1 (D141N)変異体では、試験した遺伝子はいずれもレポーター活性を阻害できなかったことから（図12のb）、レグナーゼ-1がこれらの標的mRNAを制御するRNaseとして機能していることが分かった。従って、本結果から、レグナーゼ-1が、肺胞マクロファージにおいて、Il6及びIl1bだけでなく、Il1a、Il33、Tnfsf10、及び血管新生因子（PdgfaやPdgfb等）を分解する作用があることが明らかとなった。
（７）抗IL-6受容体中和抗体の投与がPAHモデルマウスに与える影響
　肺胞マクロファージにおけるレグナーゼ-1欠損によるPAHの発症に関与する因子を調べた。IL-6はPAHを引き起こす炎症性サイトカインであり、レグナーゼ-1によって調製されているので、先ず、MR16-1又はコントロール抗体でマウスを処理し、PAHの発症におけるIL-6の役割を調べた（図12のb）。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスにおいて、1週間に1回の頻度で5週間、IL-6シグナル伝達を遮断すると、RVSPとFulton係数を有意に抑制でき（図12のc及びd）、レグナーゼ-1を介したIL-6の調節はPAHの発症に影響することが分かった。しかしながら、組織学的解析から、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスの肺動脈の閉塞が緩和されたが、MR16-1処置後に完全に治癒しないことが確認され（図12のe）、このことから、IL-6以外の因子も同時にPAHの病態形成に寄与していることが示唆された。
（８）PDGF受容体阻害剤及びIL-1受容体阻害剤の投与がPAHモデルマウスに与える影響
　肺胞マクロファージにおけるレグナーゼ-1欠損によるPAHの発症に関与するIL-6非依存性メカニズムを解明するために、mRNAがレグナーゼ-1によって直接調節されるIL-1及び血小板由来成長因子(PDGF)に着目した。IL-1を介した応答は、in vivoでもIL-1受容体阻害剤（アナキンラ）による治療で阻害され、PDGFシグナル伝達は、PDGF受容体(PDGFR)-α及び-βの双方を抑制するチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブによって阻害される。CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスにアナキンラの腹腔内投与を連日行ってもPVSPを減少できなかったが、イマチニブの経口投与を連日行うと、CD11c-Cre+Zc3h12afl/flマウスにおけるRVSPが有意に減少した（図12のf及びg）。但し、Fulton係数は、イマチニブによる治療に反応しても有意に変化しなかった（図12のh）。これらの結果は、PAHの病因にIL-6が決定的に寄与している可能性があるものの、IL-1ではなくPDGFが、レグナーゼ-1欠損肺胞マクロファージによるPAHの進行に関与していることを示している。
２－３．マウスレグナーゼ-1の分解を抑制するモルフォリノオリゴ（ＭＯ）を用いたPAHの病態抑制
　マウスレグナーゼ-1の分解を抑制するレグナーゼ-1モルフォリノオリゴ（Reg1 MO）を投与したマウスでは、コントロールオリゴを投与したマウスに比べて、低酸素負荷によるRVSP及びFulton係数の上昇が有意に抑制されていた（図13のb及びc）。また、Reg1 MOを投与したマウスでは、肺血管における中膜肥厚の程度も、コントロールオリゴを投与した場合に比べて有意な抑制が認められた（図13のd及びe）。以上の結果から、レグナーゼ－１ mRNAの３’UTRにおけるステムループ構造を破壊することにより、レグナーゼ－１ mRNAの分解を抑制でき、その結果、PAHの病態を抑制できることが明らかとなった。

Claims (19)

  1. 　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査する方法であって、
    　被験体から単離された試料中のレグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定する工程を含む、検査方法。
  2. 　前記肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症である、請求項１に記載の検査方法。
  3. 　前記肺高血圧症が、特発性肺動脈性肺高血圧症、遺伝性肺動脈性肺高血圧症、又は膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症である、請求項１又は２に記載の検査方法。
  4. 　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査するための検査キットであって、
    　レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬を含む、検査キット。
  5. 　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後の検査に使用される、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬。
  6. 　肺高血圧症の罹患の有無、その重症度、又はその予後を検査するための検査薬の製造のための、レグナーゼ-1遺伝子発現量又はレグナーゼ-1量を測定するための試薬の使用。
  7. 　免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物からなる、肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物。
  8. 　前記免疫細胞が、少なくとも肺胞マクロファージを含む、請求項７に記載の肺動脈性肺高血圧症の病態モデル動物。
  9. 　被験物質の中から、肺動脈性肺高血圧症の予防又は治療薬になり得る候補物質をスクリーニングする方法であって、
    　被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える第１工程、
    　被験物質を与えた前記非ヒト動物の肺動脈性肺高血圧症の病態を調べる第２工程、及び
    　被験物質を与えた前記非ヒト動物の肺動脈性肺高血圧症の病態が、被験物質を与えていない前記非ヒト動物と比較して改善されている場合に、当該被験物質を肺動脈性肺高血圧症の予防又は治療薬になり得る候補物質として選択する第３工程
    を含む、スクリーニング方法。
  10. 　被験物質の肺動脈性肺高血圧症に対する薬効を評価する方法であって、
    　被験物質を、免疫細胞においてレグナーゼ-1が欠損している非ヒト動物に与える第I工程、
    　被験物質を与えた前記非ヒト動物の肺動脈性肺高血圧症の病態を調べる第II工程
    を含む、薬効評価方法。
  11. 　レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を含む、肺高血圧症の予防又は治療薬。
  12. 　前記物質が、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造のステム部分を形成している領域の塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズし、ステムループ構造内の相補的結合を阻害するオリゴ核酸である、請求項１１に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
  13. 　前記物質が、以下の(a-1)、(a-2)、(b-1)、及び(b-2)よりなる群から選択される少なくとも1種のオリゴ核酸である、請求項１１又は１２に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
    (a-1)配列番号1の第206～242位の塩基配列のうち、配列番号1の第233～235位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
    (a-2)配列番号1の第234～270位の塩基配列のうち、配列番号1の第241～243位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
    (b-1)配列番号1の第399～439位の塩基配列のうち、配列番号1の第426～428位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
    (b-2)配列番号1の第427～467位の塩基配列のうち、配列番号1の第438～440位を含む連続する10～30塩基長からなる配列にハイブリダイズする、10～30塩基長のオリゴ核酸。
  14. 　前記物質が、前記(a-1)及び(a-2)よりなる群から選択される少なくとも1種のオリゴ核酸と、前記(b-1)及び(b-2)よりなる群から選択される少なくとも1種のオリゴ核酸との組み合わせである、請求項１３に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
  15. 　前記肺高血圧症が、肺動脈性肺高血圧症である、請求項１１又は１２に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
  16. 　前記肺高血圧症が、特発性肺動脈性肺高血圧症、遺伝性肺動脈性肺高血圧症、又は膠原病に伴う肺動脈性肺高血圧症である、請求項１１又は１２に記載の肺高血圧症の予防又は治療薬。
  17. 　肺高血圧症患者又は肺高血圧症を再発するおそれがある者に、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質を投与する工程を含む、肺高血圧症の予防又は治療方法。
  18. 　肺高血圧症の予防又は治療に使用される、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質。
  19. 　肺高血圧症の予防又は治療薬の製造のための、レグナーゼ-1 mRNAの3'UTRのステムループ構造を破壊する物質の使用。
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