WO2023089206A1

WO2023089206A1 - Recubrimiento multicapa, método para recubrir un implante e implante

Info

Publication number: WO2023089206A1
Application number: PCT/ES2021/070830
Authority: WO
Inventors: Jon ANDRADE DEL OLMO; Jose Maria ALONSO CARNICERO; Raul Perez Gonzalez; Manuel MUÑOZ MORENTIN
Original assignee: I+Med S.Coop.
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2023-05-25

Abstract

Un recubrimiento multicapa para recubrir una superficie de un implante (20), comprendiendo el recubrimiento multicapa capas (13) de polielectrolito, en donde las capas de polielectrolito (13) son capas intercaladas de una capa que comprende ácido hialurónico y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano y/o sus derivados y teniendo el recubrimiento multicapa una superficie (11) externa con un ángulo de contacto de entre 10º y 50º. Un método para recubrir un implante con un recubrimiento multicapa, siendo el método un método de recubrimiento capa a capa, que comprende una primera etapa de activar una superficie del implante a recubrir mediante grupos hidroxilo, carboxilato, aldehído, epóxido, isotiocianato, de amina, haluro o tiol superficiales, una segunda etapa de generar el recubrimiento multicapa depositando capas (13) de polielectrolito intercaladas de una capa que comprende ácido hialurónico y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano y/o sus derivados sobre la superficie activada a recubrir, y una tercera etapa de secar el recubrimiento multicapa, teniendo el recubrimiento multicapa resultante una superficie (11) externa con un ángulo de contacto de entre 10º y 50º.

Description

DESCRIPCIÓN

“Recubrimiento multicapa, método para recubrir un implante e implante”

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere a un recubrimiento multicapa de polielectrolitos para implantes y a métodos para su preparación.

ESTADO ANTERIOR DE LA TÉCNICA

Las reacciones de rechazo de implantes de uso permanente o al menos de duración moderada en un cuerpo humano o animal debidas a infecciones provocadas por el crecimiento de microorganismos sobre el implante son un gran problema. El rechazo desencadena una reducción de la funcionalidad del implante y el éxito de curación en el tratamiento. Los implantes metálicos tienen habitualmente superficies rugosas. Otra clase de implantes, por ejemplo, tornillos dentales, también tienen surcos que son necesarios para la funcionalidad del implante, pero fomentan la adhesión y proliferación de microorganismos en tales surcos y superficies rugosas.

Se conoce la aplicación de recubrimientos de polímeros biocompatibles al implante para minimizar los rechazos. US2006165962A1 describe un sistema de recubrimiento para implantes que tiene un cuerpo principal metálico que comprende una capa de polisacárido de quitosano y ácido hialurónico para la compatibilidad tisular del implante.

EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención es proporcionar un recubrimiento multicapa para implantes, un implante, y un método para recubrir un implante, tal como se definen en las reivindicaciones.

Un aspecto de la invención se refiere a un recubrimiento multicapa para recubrir una superficie de un implante, dicho recubrimiento comprendiendo capas de polielectrolito, en el que las capas de polielectrolito son capas intercaladas de una capa que comprende ácido hialurónico y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano y/o sus derivados y teniendo el recubrimiento multicapa una superficie externa con un ángulo de contacto de entre 10° y 50°.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un implante recubierto total o parcialmente con el recubrimiento multicapa de la invención.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para recubrir un implante con un recubrimiento multicapa, siendo el método un método de recubrimiento capa a capa, que comprende las siguientes etapas: una primera etapa de activar una superficie del implante a recubrir exponiendo grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato, de amina, haluro o tiol superficiales; una segunda etapa de generar el recubrimiento multicapa depositando capas intercaladas de polielectrolito de una capa que comprende ácido hialurónico y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano y/o sus derivados sobre la superficie activada que va a recubrirse, y una tercera etapa de secar el recubrimiento multicapa, teniendo el recubrimiento multicapa resultante una superficie externa con un ángulo de contacto de entre 10^o y 50°.

El método de la invención es simple, fácil de aplicar y se obtiene un recubrimiento uniforme sobre el implante. En el implante recubierto, cuando se aumenta el número de capas, disminuye la rugosidad de superficie debido a una mejor uniformidad en el recubrimiento del implante, obteniéndose además un recubrimiento hidrófilo.

Con el recubrimiento hidrófilo multicapa de la invención, se reduce la adherencia de los microorganismos a la superficie del recubrimiento y, por tanto, al implante, mejorando la estabilidad del recubrimiento. De ese modo, aumenta el efecto antibacteriano del quitosano o ácido hialurónico porque debido a la propiedad antiincrustante y antibacteriana del recubrimiento multicapa de la invención, se adhieren menos microorganismos, dando lugar a una menor o ausencia de crecimiento o proliferación de microorganismos no deseados sobre la superficie del implante. En este sentido, los estudios realizados por los inventores han demostrado la capacidad de este recubrimiento multicapa biocompatible para poder esterilizarse, tener buena estabilidad, poderse cargar con principios activos con una liberación sostenida de los principios activos y mantener la morfología principal de la superficie del implante de un modo homogéneo.

Estas y otras ventajas y características de la invención resultarán evidentes a la vista de los dibujos y de la descripción detallada de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra una representación gráfica de un elemento de implante con el recubrimiento multicapa según una realización de la invención.

La figura 2 muestra una representación gráfica de un ángulo de contacto según la sección A de la figura 1.

La figura 3 muestra una imagen de microscopía SEM comparativa de implantes recubiertos mediante un método de recubrimiento por inmersión según diferentes realizaciones de la invención.

La figura 4 muestra una imagen de microscopía SEM comparativa de implantes recubiertos mediante un método de recubrimiento por pulverización según diferentes realizaciones de la invención.

La figura 5 muestra el valor de ángulo de contacto del recubrimiento multicapa de varias realizaciones de la invención.

La figura 6 muestra una imagen de microscopía SEM de implantes recubiertos según diferentes realizaciones de la invención.

La figura 7 muestra una ratio en peso de recubrimiento restante a lo largo del tiempo de dos realizaciones de la invención.

La figura 8 muestra una curva de liberación de principios activos a lo largo del tiempo de un implante recubierto según diferentes realizaciones de la invención.

La figura 9 muestra un esquema general de un método para recubrir un implante con un recubrimiento multicapa según una realización de la invención.

EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La figura 1 muestra el recubrimiento multicapa para el recubrimiento de superficie de un implante 20 de la invención, comprendiendo el recubrimiento multicapa capas de polielectrolito en el que las capas de polielectrolito son capas intercaladas de una capa que comprende ácido hialurónico (HA) o sus derivados y una capa que comprende quitosano (CHI) o sus derivados, y teniendo el recubrimiento multicapa una superficie 11 externa con un ángulo de contacto de entre 10° y 50°, preferiblemente entre 25° y 35°. El recubrimiento multicapa de la invención convierte superficies hidrófobas nativas en superficies hidrófilas, adquiriendo una propiedad antibacteriana y antiincrustante. Además, considerando que las bacterias tienen paredes celulares cargadas negativamente, éstas se repelen por la aparición de fuerzas de repulsión electrostáticas por la superficie hidrófila del recubrimiento multicapa cargada negativamente.

En el contexto de la invención, tal como se muestra en la figura 2, el ángulo de contacto es el ángulo medido de manera convencional a través del líquido 14 en el que una interfase líquido- vapor se encuentra con una superficie sólida. Cuantifica la mojabilidad de una superficie sólida por un líquido mediante la ecuación de Young. La descripción teórica surge de la consideración de un equilibrio termodinámico entre las tres fases: fase líquida (L), sólida (S), y de gas o vapor (G). Si la energía interfacial sólido-gas se indica mediante YSG, la energía interfacial sólido-líquido mediante YSL y la energía interfacial líquido-gas mediante Y G, entonces el ángulo de contacto (0)c se determina a partir de estas cantidades mediante la ecuación de Young:

En los ejemplos aportados más adelante, se usó un instrumento Dataphysics OCA 15EC para las mediciones del ángulo de contacto, y de ese modo, analizar y cuantificar el contorno de gotas de agua. En el contexto de la invención, por el término “derivados de ácido hialurónico” se entendende que incluye todos los productos de reacción alterados estructuralmente que se obtienen cuando el ácido hialurónico experimenta modificaciones químicas en los grupos funcionales activos de su estructura (-OH, -COOH, -NH-) a través de las siguientes reacciones: carbodiimidación (preferiblemente, amidación mediada por carbodiimida), esterificación, carboximetilación, alquilación, acilación, tiolación, fosforilación, amidación, coordinación de metales, acoplamiento químico, reticulación química, copolimerización de injerto, base de Schiff, sulfonilación, alcanoilación, sulfatación y sulfonación. Además, se entiende que el término “ácido hialurónico y derivados de ácido hialurónico” incluye todas las sales polielectrolíticas de los mismos, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio y magnesio.

En el contexto de la invención, por el término “derivados de quitosano” se entiende que incluye todos los productos de reacción alterados estructuralmente que se obtienen cuando el quitosano experimenta modificaciones químicas en los grupos funcionales activos de su estructura (-OH, -NH2 y -NH-) a través de las siguientes reacciones: carbodiimidación (preferiblemente, amidación mediada por carbodiimida), esterificación, carboximetilación, alquilación, acilación, tiolación, fosforilación, amidación, coordinación de metales, acoplamiento químico, reticulación química, copolimerización de injerto, base de Schiff, sulfonilación, alcanoilación, sulfatación y sulfonación.

Con respecto al número de capas, en una realización particular, el número de capas es de al menos 6. En otra realización, el número de capas es igual a o menor de 30, preferiblemente, siendo de entre 6 y 30, más preferiblemente siendo de entre 20 y 30. Con este número de capas, además de lograr el ángulo de contacto, se mantiene la forma o apariencia externa del implante recubierto.

En una realización preferida, el ácido hialurónico y/o sus derivados tienen un peso molecular promedio de entre 0,01 y 2,70 MDa, preferiblemente, entre 2,00 y 2,20 MDa.

Con respecto al quitosano y/o sus derivados, en una realización preferida, tienen un peso molecular promedio de entre 0,10 y 1 ,00 MDa, preferiblemente, entre 0,30 y 0,40 MDa, y un grado de desacetilación mayor del 70%.

En el contexto de la invención, se define el grado de desacetilación (DD, %) como la fracción molar de GlcN (d-glucosamina) en los copolímeros (quitosano) que se componen de GIcNAc (glucosamina /V-acetilada) y GlcN (d-glucosamina). El grado de desacetilación puede medirse mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (¹H-RMN) en agua deuterada según la fórmula

donde DD es el grado de desacetilación, 151-11 ,90 es la intensidad de la señal a 1 ,90 ppm y I5H3,9O-3,OO es la intensidad de la señal entre 3,90 y 3 ppm. En una realización preferida, el grado de desacetilación es mayor del 70%, siendo preferiblemente de entre el 75 y el 85%.

En una realización preferida, el recubrimiento multicapa comprende una primera capa 12 de una monocapa autoensamblada unida a la superficie del implante, tal como se ¡lustra en la figura 1. Esta monocapa autoensamblada aumenta la adherencia de HA y CHI y mejora o aumenta la estabilidad del recubrimiento multicapa durante su almacenamiento y uso. En una realización preferida, la monocapa autoensamblada se selecciona del grupo que consiste en una monocapa basada en grupos de anclaje de silano, fosfonato, fosfato, catecol, carboxilato, de amina, alqueno, alquino, 2-hidrox¡-1 -carboxilato, ácido hidroxámico y yoduro de alquilo, preferiblemente, una monocapa de silano. Estas monocapas tienen grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato o de amina, haluro o tiol superficiales expuestos que se hacen reaccionar con la capa de polielectrolito.

Con respecto al grosor del recubrimiento multicapa, en una realización preferida, el grosor es de entre 10 y 1500 nm, preferiblemente entre 470 nm y 1200 nm. Con este intervalo de grosor, el recubrimiento mantiene la forma del implante, muy útil por ejemplo en implantes dentales, en los que algunos componentes del implante dental, tales como el pilar y el poste del implante tienen surcos para el acoplamiento y es importante mantener la forma de tales surcos.

En una realización preferida, las capas de polielectrolito se cargan con al menos un principio activo, en el que el principio activo se selecciona del grupo de antibióticos, analgésicos, antiinflamatohos, péptidos antibactehanos, antipiréticos, factores de crecimiento, antidepresivos, antihipertensivos, antidiabéticos, antiepilépticos, antivirales y anticancerígenos. Esto es muy útil cuando es necesaria una administración con liberación sostenida de un principio activo en el lugar en el que se implanta el implante. El recubrimiento multicapa puede liberar el contenido de principio activo en el plazo del periodo crítico de 24- 48 horas para la adhesión y proliferación bacterianas, pero todavía seguir actuando como depósito de bactericida para una acción a más largo plazo. A medida que se degradan las capas expuestas, el principio activo se libera de las capas más interiores, tanto por difusión del principio activo a través de las capas como por la degradación de las capas más externas del recubrimiento multicapa.

En una realización preferida, las capas de polielectrolito se cargan con más de un principio activo, cargándose preferiblemente la capa que comprende ácido hialurónico (HA) o sus derivados con un principio activo y cargándose la capa que comprende quitosano (CHI) o sus derivados, con otro principio activo. En una realización preferida, la capa que comprende ácido hialurónico (HA) o sus derivados se carga mediante un principio activo seleccionado de antibióticos, analgésicos, antiinflamatorios, péptidos antibacterianos, antipiréticos, factores de crecimiento, antidepresivos, antihipertensores, principios activos antidiabéticos, antiepilépticos, antivirales y anticancerígenos, cargándose preferiblemente mediante ácido acetilsalicílico, cefuroxima, amoxicilina, tetraciclina o dexketoprofeno o cualquier combinación de cualquiera de ellos. En una realización preferida, la capa que comprende quitosano (CHI) o sus derivados se carga mediante un principio activo seleccionados de antibióticos, analgésicos, antiinflamatorios, péptidos antibacterianos, antipiréticos, factores de crecimiento, antidepresivos, antihipertensores, principios activos antidiabéticos, antiepilépticos, antivirales y anticancerígenos, siendo preferiblemente ácido acetilsalicílico, cefuroxima, amoxicilina, tetraciclina o dexketoprofeno o cualquier combinación de cualquiera de ellos. En una realización preferida, ambos tipos de capas intercaladas se cargan, cargándose la capa que comprende ácido hialurónico (HA) o sus derivados con ácido acetilsalicílico, cefuroxima, y/o dexketoprofeno y cargándose la capa que comprende quitosano (CHI) o sus derivados con amoxicilina y/o tetraciclina.

Con respecto al uso, en una realización preferida el recubrimiento multicapa es para su uso en la prevención de complicaciones médicas como consecuencia del proceso de implantación tales como infecciones tisulares, inflamaciones tisulares y/o una integración deficiente del implante en el cuerpo humano.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un implante que está recubierto total o parcialmente con el recubrimiento multicapa de la invención.

Estos implantes pueden ser implantes dentales, implantes cocleares, implantes ortopédicos, implantes cardiacos, implantes cosméticos, implantes cigomáticos, implantes oculares, implantes de mama, implantes nasales, endoprótesis (stents), catéteres o válvulas, preferiblemente, implantes dentales.

En una realización preferida, el implante es un implante metálico que comprende metales seleccionados del grupo que consiste en metal de magnesio, aleación de magnesio, metal de hierro, aleación de hierro, metal ferroso, aleación ferrosa, tántalo, cobalto, aleaciones de cobalto, zirconio, aleaciones de zirconio, acero inoxidable, aleaciones de NiTi , NiTiNOL, oro, plata, platino, titanio, óxido de titanio y aleaciones de titanio, preferiblemente comprendiendo titanio o aleaciones de titanio.

En otra realización, el implante es un implante polimérico que comprende polímeros seleccionados del grupo que consiste en politetrafluoroetileno (PTFE), politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), caucho de silicona, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), copoli(ácido láctico-glicólico) (PLGA), polietileno (PE), polietileno de peso molecular ultra-alto (IIHMWPE), poliéster-uretano-urea (PEUII), silicona (polisiloxano), polidimetilsiloxano (PDMS), y nanotubos de carbono (NTC).

En otra realización, el implante es un implante cerámico y comprende materiales seleccionados de hidroxiapatita, óxido de zirconio (zircona) y vidrios bioactivos o una combinación de estos materiales.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para recubrir un implante con un recubrimiento multicapa, siendo el método un método de recubrimiento capa a capa, que comprende las siguientes etapas: una primera etapa de activación de una superficie del implante a recubrir mediante la exposición de grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato, de amina, haluro o tiol superficiales. una segunda etapa de generación del recubrimiento multicapa depositando capas intercaladas de polielectrolito de una capa que comprende ácido hialurónico (HA) y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano (CHI) y/o sus derivados sobre la superficie activada que va a recubrirse, una tercera etapa de secado del recubrimiento multicapa; teniendo el recubrimiento multicapa resultante una superficie externa con un ángulo de contacto de entre 10^o y 50°.

Por tanto, el recubrimiento multicapa de la invención también puede fabricarse según el método de la invención. Para impedir repeticiones innecesarias, se considera que las características descritas para el recubrimiento multicapa de la invención, tales como el número de capas, grosores de capa, tipo de principios activos, combinaciones de materiales también se describen para las realizaciones respectivas del método de la invención.

En el contexto de la invención, “mediante la exposición de grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato, de amina, haluro o tiol superficiales” significa que debido a la activación, la superficie del implante expone tales grupos que van a reaccionar con las capas de polielectrolito que van a depositarse.

Cuando la activación de la superficie del implante es exponiendo grupos de amina o haluro, la primera capa intercalada de polielectrolito que va a depositarse es la capa que comprende ácido hialurónico (HA) y/o sus derivados.

Cuando la activación de la superficie del implante es mediante grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato o tiol, la primera capa intercalada de polielectrolito que va a depositarse es la capa que comprende quitosano (CHI) y/o sus derivados.

Algunos ejemplos no limitativos del método de activación de la superficie del implante, conocidos por el experto en la técnica, son procedimientos de plasma de gas, electroquímica, procedimientos ácidos en húmedo basados en tratamientos con disolución piraña (HCI:H2C>2, H2SO4/H2O2), procedimientos básicos en húmedo basados en tratamientos con disolución piraña (NH4OH:H2Ü2), y otros procedimientos básicos en húmedo (NaOH, KOH).

En una realización, la activación de la superficie se realiza mediante procedimientos ácidos en húmedo basados en tratamientos con disolución piraña (HCI:H2C>2, H2SO4/H2O2). Con los procedimientos ácidos en húmedo, se crean más grupos activos. En otra realización, la activación de la superficie se realiza mediante plasma de gas, siendo el procedimiento de activación preferido para implantes poliméricos. En una realización preferida, la primera etapa comprende una etapa de generación o depósito de una primera capa de monocapa autoensamblada sobre la superficie del implante, preferiblemente, sobre la superficie del implante activada previamente, dicha activación siendo mediante la exposición de grupos hidroxilo superficiales, exponiendo además tal monocapa autoensamblada grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato o de amina, haluro o tiol superficiales, preferiblemente grupos de amina, sobre los que se depositan las capas intercaladas de polielectrolito en la segunda etapa. La activación y exposición de grupos superficiales de la monocapa autoensamblada se lleva a cabo mediante reacciones químicas y físicas que conoce el experto en la técnica.

El método de la invención se lleva a cabo preferiblemente mediante pulverización o ¡inmersión, más preferiblemente mediante pulverización, de una disolución polielectrolítica de ácido hialurónico y/o sus derivados o quitosano y/o sus derivados para generar cada capa de polielectrolito, alternando las disoluciones polielectrolíticas hasta que se deposita el diferente número de capas. En una realización preferida, la concentración de polielectrolito en la disolución es de entre el 0,1 y el 0,2% (p/p) a un pH de entre 4 y 6, preferiblemente 5. El disolvente se selecciona del grupo que consiste en ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido tartárico, ácido mélico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido fosfórico y agua, preferiblemente ácido acético.

Cuando la segunda etapa es mediante pulverización, se prefiere pulverizar los implantes con un ángulo de pulverización de entre 70° y 110°, preferiblemente 90°, siendo el ángulo de pulverización el ángulo formado por la dirección de pulverización y la superficie del material que va a recubrirse, y siendo la duración de la etapa de pulverización sobre el área que va a recubrirse preferiblemente de entre 3 y 5 segundos. La ventaja de esta duración es que es suficiente para garantizar el recubrimiento de la superficie.

En una realización preferida, la segunda etapa comprende una etapa de retirada del polielectrolito no adherido entre cada deposición de las capas intercaladas de polielectrolito. Esto aumenta la uniformidad del recubrimiento. En una realización preferida, la etapa de retirada es mediante pulverización del disolvente sobre la última capa depositada o inmersión de la pieza en disolvente.

En una realización, la etapa de activación es mediante grupos hidroxilo y la primera capa de polielectrolito en la segunda etapa es quitosano y/o sus derivados. En otra realización, la etapa de activación es mediante grupos de amina y la primera capa de polielectrolito en la segunda etapa es ácido hialurónico y/o sus derivados.

En una realización preferida, las capas de polielectrolito se cargan con un principio activo. En una realización preferida, se logra esta carga disolviendo el principio activo en la disolución polielectrolítica en la segunda etapa, preferiblemente en una concentración de entre el 0,1- 0,2% con respecto al volumen total de la disolución.

Con respecto a la tercera etapa de secar el recubrimiento multicapa, puede realizarse el secado mediante métodos convencionales que conoce el experto en la técnica. En una realización preferida, el secado es mediante secado a vacío, secado con calor, secado por aire o la combinación de la totalidad o parte de estos.

Dependiendo del uso del implante recubierto, el implante debe esterilizarse. En una realización preferida, el método comprende una cuarta etapa de esterilización. Los inventores han demostrado que la etapa de esterilización no afecta a la integridad y adherencia del revestimiento multicapa al implante. La esterilización puede realizarse mediante métodos convencionales que conoce el experto en la técnica, por ejemplo, mediante rayos gamma, rayos beta y esterilización con vapor de agua. En una realización preferida, la esterilización es mediante esterilización con vapor de agua.

Se describen algunos ejemplos ilustrativos que muestran claramente las características y ventajas de la invención a continuación. Sin embargo, no debe interpretarse que estos ejemplos limitan el objeto de la invención definido en las reivindicaciones.

Ejemplos

Materiales usados para llevar a cabo los ejemplos a continuación:

Tornillos (tornillos EVO_Aurea NP085 de 3,5 x 8,5 mm de tamaño, compuestos por titanio (Ti) y presentan una capa gruesa de óxido de Ti sobre la superficie. Se cortaron chapas de titanio (muestras de Ti) grado 5 (TieAUV, 250 mm de longitud x 250 mm de anchura x 0,8 mm de grosor) en secciones de 1 x 1 cm² mediante limpiadores por ultrasonidos Fisherbrand 11201 serie Advanced de TESOLVIT S. L. (115 V, 37 kHz, 100% de potencia), se usaron acetona (LabKem, al 99,6%) y agua ultrapura (filtro Millipak de 0,22 ,m) para limpiar la superficie de muestras de TieAUV. Se usaron ácido sulfúrico (H2SO4, LabKem, al 96%) y peróxido de hidrógeno (H2O2, LabKem, al 30%) para activar la superficie de TieAUV mediante procedimientos químicos en húmedo. Se creó la monocapa de silano usando (3- aminopropil)trietoxisilano (APTES, Sigma-Aldrich, al 98%) y etanol (EtOH, LabKem, al 99,5%). Se llevó a cabo la construcción multicapa usando biopolímeros de ácido hialurónico (HA, Contipro, 2,109 ± 0,102 MDa, PDI= 1 ,003 ± 0,004) y quitosano (CHI, Sigma-Aldrich, grado de desacetilación >75%, 0,310-0,375 MDa). Se emplearon ácido acético (CH3COOH, Fischer Chemicals, al 99,8%) e hidróxido de sodio (NaOH, Panreac, al 98%) para preparar disolución tampón de acético/acetato. También se preparó solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH =7,4) con reactivos de Fischer Chemicals como es el caso de hidrogeno-ortofosfato de disodio dodecahidratado (Na2HPO4' 12H2O, al 99%), dihidrogeno-ortofosfato de sodio dihidratado (NaH2PO4'2H2O, al 99%), cloruro de sodio (NaCI, 99%) y filtros de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF, 0,22 .m). Se realizaron estudios de carga y liberación desde el sistema multicapa usando el antibiótico sal de sodio de cefuroxima (CFX, Sigma-Aldrich), y el agente antiinflamatorio ácido acetilsalicílico (AAS, Acros Organics, al 99%).

Ejemplo 1: Recubrimiento de un implante de titanio con el recubrimiento multicapa

Se aplicó la técnica capa a capa (técnica LbL, layer-by-layer) para recubrir los tornillos con ácido hialurónico (HA) y quitosano (CHI) a través de dos métodos de recubrimiento: recubrimiento por inmersión y recubrimiento por pulverización. Se aplicaron ambas técnicas para recubrir tornillos EVO con 6, 10 y 20 capas alternas de biopolímeros de HA y CHI.

En la figura 9 se resume brevemente el proceso de recubrimiento de la superficie de muestras de TieAUV para la construcción del recubrimiento multicapa con HA y CHI.

Etapa 0: se limpian previamente muestras de Ti en jabón desinfectante, agua ultrapura y acetona

Etapa A: activación de la superficie: creación de grupos -OH.

Etapa B: anclaje de la monocapa de silano terminado en grupos amino

Etapa C: recubrimiento por pulverización o inmersión de disolución de ácido hialurónico (HA). Etapa D: recubrimiento por pulverización o inmersión de disolución tampón.

Etapa E: recubrimiento por pulverización o inmersión de disolución de quitosano (CHI). Etapa F: recubrimiento por pulverización o inmersión de disolución tampón.

Etapa G: pulverización de disolución de ácido hialurónico (HA).

Repitiendo n veces la etapa C a la etapa G hasta que se depositen los números deseados de capas. La etapa de secado no se incluye en la figura.

A continuación, por “capas HA/CHI” se entiende número de capas totales del recubrimiento multicapa generadas por las capas intercaladas de HA y de CHI.

Para un método de recubrimiento por inmersión, se sumergieron tornillos dentales en disolución de HA durante 5 min, seguido por aclarado con disolución tampón de acético/acetato. Después de eso, se sumergieron entonces los implantes dentales con la primera capa de HA adsorbido, en una disolución de CHI durante 5 min y seguido por el mismo proceso de aclarado. Se realizó el ciclo de polielectrol ito alterno (ácido hialurónico y quitosano) hasta que se obtuvo el número deseado de capas. Finalmente, se secaron los implantes dentales recubiertos por inmersión en un sistema de vacío durante 24 h a temperatura ambiente. La figura 3 muestra que el recubrimiento generado mediante inmersión se distribuye por la superficie de los tornillos a medida que aumenta el número de multicapas depositadas. El análisis mediante SEM presenta una gran diferencia en contraste entre las regiones recubiertas (áreas más oscuras) y las regiones sin recubrir o menos recubiertas (áreas más claras). La primera fila desde arriba corresponde a una muestra no recubierta. La segunda fila corresponde a un tornillo recubierto con 6 capas HA/CHI. La tercera fila corresponde a un tornillo recubierto con 10 capas HA/CHI y la cuarta fila corresponde a un tornillo recubierto con 20 capas HA/CHI.

El ensamblaje LBL usando el método de recubrimiento por pulverización proporcionó una superficie más homogénea. Específicamente, se pulverizaron tornillos con disolución de HA durante 3 segundos, seguido por pulverización con disolución tampón de acético/acetato de 1 segundo para retirar el exceso de HA no adherido a la superficie. Luego, se pulverizaron posteriormente los tornillos con una capa de HA adsorbido con una disolución de CHI durante 3 segundos y seguido por el mismo proceso con disolución tampón de acético/acetato para retirar el exceso de CHI no adherido. Se llevó a cabo el ciclo de pulverización de polielectrolito alterno hasta que se obtuvo diferente número de capas. Una vez pulverizados el número deseado de capas sobre tornillos, se secaron en un sistema de vacío durante 24 h a temperatura ambiente. El análisis mediante SEM (figura 4) muestra menos diferencia en contraste entre las regiones recubiertas (áreas más oscuras) y las regiones menos recubiertas (áreas más claras) del tornillo. A medida que aumenta el número de multicapas depositadas sobre la superficie del tornillo, mejora la calidad del recubrimiento, ya que hay menos diferencia en el contraste de imagen entre las diferentes áreas del tornillo que es típica de una superficie recubierta de manera homogénea. La primera fila desde arriba corresponde a una muestra no recubierta. La segunda fila corresponde a un tornillo recubierto con 6 capas HA/CHI. La tercera fila corresponde a un tornillo recubierto con 10 capas HA/CHI, y la cuarta capa corresponde a un tornillo recubierto con 20 capas HA/CHI. El recubrimiento generado mediante pulverización (figura 4) se distribuye de manera más homogénea que el recubrimiento producido mediante inmersión. Se configuró el sistema de pulverización con las siguientes características: se ajustó la presión de aire comprimido a 0,05-0,1 MPa y se ajustó el regulador de presión a 30-40 cm por encima de los tornillos. Se pulverizan disoluciones de HA y CHI desde el regulador de presión en perpendicular sobre los tornillos con un ángulo de pulverización de 70°-110°. Para ambos procedimientos de recubrimiento por inmersión y de recubrimiento por pulverización las concentraciones de las disoluciones empleadas fueron del 0,2% (p/p) de HA y el 0,2% (p/p) de CHI (ambos a pH 5) disueltas previamente en ácido acético al 0,5% (v/v). Se preparó la disolución tampón de acético/acetato (pH 5) mezclando disoluciones de ácido acético 0,50 M y de NaOH 0,32 M. Se investigó el efecto que tiene el proceso de esterilización sobre el recubrimiento LBL depositado sobre HA/CHI LBL mediante recubrimiento por pulverización mediante microscopía SEM (figura 6: tornillos cubiertos con 20 capas HA/CHI 20 y 30 capas HA/CHI 30, esterilizados con vapor de agua S y no esterilizados SN), puesto que puede dañar significativamente el recubrimiento. En este caso, se usó el método de esterilización por vapor (121 °C, 15 min).

Ejemplo 2: composición química de la superficie (muestras de Ti planas)

Se recubrieron muestras de Ti mediante la deposición de 0,10, 20 y 30 HA/CHI tal como describe el método de pulverización en el ejemplo 1 , con y sin una monocapa (monocapa de silano).

Se determinó la composición química de las diferentes superficies recubiertas mediante espectroscopia fotoelectrónica por rayos X (XPS). En primer lugar, se analizó la composición de superficie en el intervalo de energía de 0-800 eV antes y después de tratamiento de hidroxilación y con 3-aminopropil)thetoxisilano (APTES). Tal como se muestra en la tabla 1 , los elementos principales cuantificados en todas las muestras fueron Ti, C, O, N, Al y V. Se observó un claro aumento del pico que aparece a 400 eV, correspondiente a nitrógeno, cuando se compararon superficies vírgenes y tratadas con amino, como resultado de la inserción de los grupos NH2, demostraron una funcionalización con amino de la superficie satisfactoria.

Tabla 1

Se confirmó la incorporación de las multicapas puesto que las señales del sustrato de metal de Ti metal (Ti, Al, V), y de la monocapa (Si) disminuyeron hasta desaparecer mientras aumentaba C claramente. En muestras recubiertas mediante LBL, el contenido de N crece a medida que aumenta el número de capas depositadas, lo que corrobora la mayor cantidad e HA y CHI adherida a la superficie de los tornillos, siendo Ti-HA/CHI 20 y 30 multicapas con monocapas los tornillos con la mayor cantidad de HA y CHI en su superficie. Además, los datos de XPS indican que la monocapa de anclaje aumenta la adherencia de HA y CHI puesto que se mide un mayor contenido de N en estos casos.

Ejemplo 3: topografía de rugosidad de la superficie

Se observó el diferente efecto topográfico mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) y técnicas de interferometría cuando se llevaron a cabo modificaciones de superficie con 20 y 30 capas HA/CHI mediante el método de pulverización descrito en el ejemplo 1.

La siguiente tabla muestra los valores de Rms y Ra de Ti prístino y recubierto medidos mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) e interferometría.

Tabla 2

Ejemplo 4: Mojabilidad de superficie (muestras de Ti planas)

Se midió la mojabilidad de muestras de Ti sin modificar y recubiertas según el método de pulverización descrito en el ejemplo 1 , tal como se observa en la figura 5. La modificación de superficie dio como resultado un aumento de hidrofilicidad que pudo cuantificarse mediante las mediciones del ángulo de contacto. Concretamente, el ángulo de contacto (0) de las muestras de Ti originales (Z) disminuye bruscamente cuando se limpian (C) o activan (A) debido a la eliminación de contaminantes y polutantes de la superficie de las muestras, y la presencia de restos de TÍO2 y Ti-OH. Sin embargo, la funcionalización con amino mediante la monocapa de silano (SAM) induce un aumento del ángulo de contacto, debido a la introducción de la combinación de cortas cadenas de alquilo y grupos -NH2.

Tras la adsorción alterna de HA (capas impares) y CHI (capas pares) el ángulo de contacto del recubrimiento vahó periódicamente entre capa de HA y capa de CHI. De hecho, cuando se depositaron pocas capas (por debajo de 10), la diferencia entre los ángulos de contacto de capas de HA y CHI alcanzó 25-40°. Sin embargo, a medida que aumenta el número de capas, disminuye la diferencia del ángulo de contacto entre capas terminadas de HA y CHI debido al efecto de interpenetración de ambas capas, hasta que fue casi igual para las superficies de 29 y 30 capas.

Ejemplo 5: grosor del recubrimiento de superficies de Ti recubiertas (muestra de Ti planas)

Se realizaron muestras recubiertas según el método de pulverización descrito en el ejemplo 1 , sin principios activos cargados mediante haz de iones focalizados (FIB, focused ion beam) y luego, se midió el grosor mediante microscopía SEM.

Pudo medirse el grosor del recubrimiento multicapa de 20 y 30 capas HA/CHI, que era de aproximadamente 470 nm y 1200 nm, respectivamente.

Ejemplo 6: Estabilidad del sistema multicapa de HA/CHI

Se estudió la estabilidad multicapa mediante la inmersión de muestras recubiertas con Ti con 20 y 30 capas HA/CHI, en PBS a 37°C durante los primeros días después de la implantación, que es el tiempo crucial para la adhesión y proliferación bacterianas (24-48 horas). Se monitorizó la degradación del recubrimiento de HA/CHI mediante la razón de pérdida de peso (figura 7: el eje vertical corresponde a la razón en peso de recubrimiento restante en % (RCWR, %); el eje horizontal corresponde al tiempo en días (T); 20 corresponde a un recubrimiento multicapa de 20 capas HA/CHI; 30 corresponde a un recubrimiento multicapa de 30 capas HA/CHI). se recubrieron las muestras según el método de pulverización descrito en el ejemplo 1. En ambos casos, pudo medirse una rápida pérdida de masa inicial en las primeras 24 h, que puede corresponder probablemente a las capas exteriores no adheridas físicamente. Después de eso, la velocidad de degradación disminuye hasta el noveno día y finalmente, después del duodécimo día, la pérdida de peso permanece casi estable. Finalmente, después de 19 días en disolución PBS a 37°C, un peso de recubrimiento del 10% permanece todavía unido a la superficie de Ti, demostrando la estabilidad de la multicapa durante el periodo crítico para la formación de biopelícula (24-48 h) y el periodo posterior.

Ejemplo 7 carga y liberación de fármacos desde el sistema multicapa de HA/CHI Se recubrieron piezas de Ti con el recubrimiento multicapa de HA/CHI pulverizando una disolución de HA con cefuroxima (CFX) y ácido acetilsalicí lico (AAS) disueltos previamente (al 0,1 % de concentración). El procedimiento para obtener el recubrimiento multicapa sobre tornillos con fármacos cargados fue el mismo que en el ejemplo 1.

Las piezas recubiertas se introdujeron en 75 mi de disolución PBS, con agitación suave a 37°C y se midió la liberación de fármaco durante varias horas mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). La liberación de CFX y AAS en PBS puede producirse mediante la difusión de los fármacos a través de las capas o mediante la degradación de la superficie. Tal como puede observarse en la figura 8, la liberación del fármaco se produce especialmente en las primeras 24-48 horas. En conjunto, estos resultados muestran que las multicapas preparadas pueden liberar contenido de CFX y AAS en el plazo del periodo crítico de 24-48 horas para la adhesión y proliferación bacterianas, pero todavía sigue actuando como depósito de bactericida para una acción a más largo plazo (6 días).

En la figura 8: el eje vertical corresponde a la cantidad de fármaco liberado (RDQ, released drug quantity)', el eje horizontal corresponde al tiempo en horas (T); 20 CFX corresponde a un recubrimiento multicapa de 20 capas HA/CHI cargado con CFX; 30 CFX corresponde a un recubrimiento multicapa de 30 capas HA/CHI cargado con CFX; 20 AS corresponde a un recubrimiento multicapa de 20 capas HA/CHI cargado con AAS que se hidroliza a ácido salicílico (AS); 30 AS corresponde a un recubrimiento multicapa de 30 capas HA/CHI cargado con AAS que se hidroliza a ácido salicílico (AS). 20 AAS corresponde a un recubrimiento multicapa de 20 capas HA/CHI cargado con AAS; 30 AAS corresponde a un recubrimiento multicapa de 30 capas HA/CHI cargado con AAS.

Se realizaron mediciones de XPS para corroborar las propiedades de liberación de fármaco y también, la degradación del sistema multicapa (tabla 3). De hecho, en el sexto día de la prueba de estabilidad, la ausencia de S2_P y la disminución de Ni_s corroboran por una parte, la liberación total de CFX y AAS del sistema multicapa. Por otra parte, también se confirma la estabilidad del recubrimiento, a pesar de empezar a detectar S¡2_P, porque no se detectan aún otros elementos del sustrato de Ti como Ti, Al y V. También se detectan Ni_s y altas cantidades de Cis. Esto último confirma la presencia de recubrimiento de polisacárido de HA y CHI. Después de 19 días de la prueba de estabilidad, la presencia de grandes cantidades de C y N, la ausencia de Ti, Al y V, incluso habiendo detectado Si, sigue demostrando la estabilidad del recubrimiento de HA/CHI mencionado anteriormente. Tabla 3. Composiciones atómicas de superficie (%) de tornillos de Ti prístino y modificados de manera superficial con fármacos cargados después de 6 y 19 días de estabilidad en PBS.

Ejemplo 8: estudios antibacterianos

Se determinó cuantitativamente la actividad antibacteriana de muestras recubiertas según el método descrito en el ejemplo 1 , algunas con sustancias activas (Ti-HA/CHI con fármacos) y otras sin sustancias activas (Ti-HA/CHI sin fármacos), y se observó cualitativamente según la norma ISO 22196:2011 - “Medición de actividad antibacteriana en superficies plásticas y otras superficies no porosas”. 24 h fue el tiempo seleccionado puesto que es bien conocido que es el periodo más crítico para adquirir infecciones bacterianas peligrosas y dañinas. Tabla 4: resultados cuantitativos de actividad antibacteriana (UFC, reducción bacteriana y log de reducción (R)) de muestras de control de TieAUV, Ti-HA/CHI sin fármacos, y T¡- HA/CHI con fármacos frente a cepas de bacterias de Staphylococcus aureus y Escherichia coli a las 24 h.

Se indica un valor “< 200” cuando hay ausencia de UFC debido al intervalo de confianza del método.

Tal como se establece mediante la norma ISO 22196:2011 , se considera que un material tiene una actividad antibacteriana eficaz cuando Iog10 de reducción o valores de actividad antibacteriana (R) son mayores de 2. Teniendo esto en cuenta, tal como puede observarse en la tabla 4 anterior, puede decirse que el recubrimiento de HA/CHI sobre TieAUV presenta un comportamiento antibacteriano frente a cepas de bacterias gram-positivas y gram- negativas con valores de actividad antibacteriana mayores de 2 (R= 2,86 para S. aureus y R= 2,71 para E. coli). Luego, después de la carga de los fármacos CFX y AAS entre capas de HA y CHI, aunque no mejoró la actividad antibacteriana frente a S. aureus (R= 2,08), el número de bacterias viables (UFC) incluso disminuye más significativamente y de manera eficaz frente a E. coli con un mayor valor de actividad antibacteriana (R= 3,89).

Claims

REIVINDICACIONES Recubrimiento multicapa para recubrir una superficie de un implante (20), comprendiendo el recubrimiento multicapa capas (13) de polielectrolito, caracterizado porque las capas de polielectrolito son capas intercaladas de una capa que comprende ácido hialurónico y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano y/o sus derivados y teniendo el recubrimiento multicapa una superficie (11) externa con un ángulo de contacto de entre 10° y 50°. Recubrimiento multicapa según la reivindicación 1 , en el que el ángulo de contacto es de entre 25° y 35°. Recubrimiento multicapa según la reivindicación 1 o 2, en el que el número de capas es de al menos 6. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número de capas es igual a o menor de 30. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido hialurónico y/o sus derivados tienen un peso molecular promedio de entre 0,01 y 2,70 MDa, preferiblemente, entre 2,00 y 2,20 MDa. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el quitosano y/o sus derivados tienen un peso molecular promedio de entre 0,10 y 1 ,00 MDa, preferiblemente, entre 0,30 y 0,40 MDa, y un grado de desacetilación mayor del 70%, preferiblemente entre el 75% y el 85%. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el recubrimiento multicapa comprende una primera capa (12) de monocapa autoensamblada unida a la superficie del implante. Recubrimiento multicapa según la reivindicación 7, en el que la monocapa autoensamblada se selecciona del grupo que consiste en una monocapa basada en grupos de anclaje de silano, fosfonato, fosfato, catecol, carboxilato, de amina, alqueno, alquino, 2-hidroxi-1-carboxilato, ácido hidroxámico y yoduro de alquilo, preferiblemente, una monocapa de silano. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grosor del recubrimiento multicapa es de entre 10 nm y 5000 nm, preferiblemente entre 470 nm y 1200 nm. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se incorpora sobre una superficie activada del implante mediante grupos hidroxilo. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se incorpora sobre una superficie activada del implante mediante grupos amino. Recubrimiento multicapa según las reivindicaciones anteriores, en el que las capas de polielectrolito se cargan con al menos un principio activo. Recubrimiento multicapa según la reivindicación 12, en el que el principio activo se selecciona del grupo de antibióticos, analgésicos, antiinflamatorios, péptidos antibacterianos, antipiréticos, factores de crecimiento, antidepresivos, antihipertensivos, antidiabéticos, antiepilépticos, antivirales y anticancerígenos. Recubrimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en la prevención de complicaciones médicas como consecuencia del proceso de implantación, tales como infecciones tisulares, inflamaciones tisulares y/o una integración deficiente del implante en el cuerpo humano. Implante recubierto total o parcialmente con un revestimiento multicapa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores. Implante según la reivindicación 15, en el que el implante es un implante metálico y comprende metales seleccionados del grupo que consiste en metal de magnesio, aleación de magnesio, metal de hierro, aleación de hierro, metal ferroso, aleación ferrosa, tántalo, cobalto, aleaciones de cobalto, zirconio, aleaciones de zirconio, acero inoxidable, aleaciones de NiTi, NiTiNOL, oro, plata, platino, titanio, óxido de titanio y aleaciones de titanio, preferiblemente que comprende titanio o aleaciones de titanio. Implante según la reivindicación 15, en el que el implante es un implante polimérico y comprende polímeros seleccionados del grupo que consiste en politetrafluoroetileno (PTFE), politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), caucho de silicona, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), copoli(ácido láctico-glicólico) (PLGA), polietileno (PE), polietileno de peso molecular ultra-alto (IIHMWPE), poliéster-uretano-urea (PEUII), silicona (polisiloxano), polidimetilsiloxano (PDMS) y nanotubos de carbono (NTC). Implante según la reivindicación 15, en el que el implante es un implante cerámico y comprende materiales seleccionados de hidroxiapatita, óxido de zirconio y vidrios bioactivos. Método para recubrir un implante con un recubrimiento multicapa, siendo el método un método de recubrimiento capa a capa, que comprende las siguientes etapas: una primera etapa de activación de una superficie del implante a recubrir mediante la exposición de grupos hidroxicarboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato, de amina, haluro o tiol superficiales, una segunda etapa de generación del recubrimiento multicapa (13) depositando capas intercaladas de pol ¡electrolito de una capa que comprende ácido hialurónico y/o sus derivados y una capa que comprende quitosano y/o sus derivados sobre la superficie activada a recubrir, y una tercera etapa de secado del recubrimiento multicapa, teniendo el recubrimiento multicapa resultante una superficie (11) externa con un ángulo de contacto de entre 10° y 50°. Método según la reivindicación 19, en el que la primera etapa comprende una etapa de generar una primera capa de monocapa autoensamblada sobre la superficie del implante, exponiendo tal monocapa autoensamblada grupos hidroxilo, carboxilato, aldehido, epóxido, isotiocianato o de amina, haluro o tiol superficiales, preferiblemente grupos de amina, sobre los que se depositan las capas intercaladas de polielectrolito en la segunda etapa. Método según la reivindicación 19 o 20, en el que el número de capas intercaladas es de entre 6 y 30. 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , en el que la segunda etapa comprende una etapa de retirada del polielectrolito no adherido entre cada deposición de la capa intercalada de polielectrolito.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que la segunda etapa se lleva a cabo mediante pulverización o inmersión de una disolución polielectrolítica de ácido hialurónico y/o sus derivados o quitosano y/o sus derivados para generar cada capa de polielectrolito.

24. Método según la reivindicación 23, en el que la segunda etapa se lleva a cabo mediante pulverización, con un ángulo de pulverización de entre 70° y 110°, preferiblemente 90°.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que las capas de polielectrolito se cargan con al menos un principio activo.

26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25, en el que la activación es mediante grupos hidroxilo y la primera capa intercalada de polielectrolito en la segunda etapa es CHI.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, en el que la activación es mediante grupos de amina y la primera capa intercalada de polielectrolito en la segunda etapa es HA.

28. Método según la reivindicación 27, en el que la activación es mediante una primera capa de monocapa autoensamblada sobre la superficie del implante, tal monocapa autoensamblada es una monocapa de silano y expone grupos de amina.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, en el que la tercera etapa de secar es mediante secado a vacío, secado con calor, secado por aire o la combinación de cualquiera de los mismos.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29, en el que el método comprende una cuarta etapa de esterilización, preferiblemente, esterilización con vapor de agua.