WO2023085441A1

WO2023085441A1 - マクロポーラス構造体

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Publication number: WO2023085441A1
Application number: PCT/JP2022/042460
Authority: WO
Inventors: 昌治竹内; みどり根岸; 文智小沢; 淳澤山
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2023-05-19
Anticipated expiration: 2024-05-10
Also published as: JPWO2023085441A1

Abstract

多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを含む混合物、及び当該混合物からブロック共重合体が除去された構造体、並びに、多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを混合して相分離を起こさせ、当該相分離後の混合物から前記ブロック共重合体を除去する工程を含む、マクロポーラス構造体の製造方法。

Description

マクロポーラス構造体

　本発明は、多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを含む混合物、及びマクロポーラス構造体に関する。

　近年、外部環境（温度、ｐＨ、光、電場など）に応答して構造及び性質が変化する機能性高分子が注目されており、この高分子を用いて種々のインテリジェント材料を開発する試みが行われている。その中でも、不連続な体積変化（体積相転移現象）を起こすゲルとして、温度応答性高分子であるＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＮＩＰＡＭ：ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））が知られている（非特許文献１：Ａ．Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｍ．Ｋｒｏｇｅｒ，Ｆ．Ｍ．Ｗｉｎｎｉｋ，Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　２０１５，５４，１５３４２−１５３６７）。

　ＰＮＩＰＡＭは、側鎖に親水基及び疎水基をともに有しており、直鎖ポリマーのときは３２℃に下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ：ｌｏｗｅｒ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を持つとともに（非特許文献１）、水中では体積相転移温度（ＶＰＴＴ：ｖｏｌｕｍｅ　ｐｈａｓｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を示す。ＰＮＩＰＡＭは、水溶液温度がＶＰＴＴ以下ではゲルは膨潤しているのに対し、ＶＰＴＴ以上ではゲルは収縮するという性質を持つ。このため、ＰＮＩＰＡＭは、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）、アクチュエータ、固定化酵素、バイオセンサーなど様々な分野への応用が期待されている。

　他方、アルギン酸ゲルは、生体適合性が高く、ゲル化条件がマイルドであり、そしてゲル化速度が速いという特徴を有しており、食料品や移植用グラフトの材料等に幅広く使用されている。しかし、アルギン酸ゲルではゲルの孔径のサイズを大きく変えることが困難であり、分泌物、細菌、ウイルスなどの透過及び放出が妨げられたり、細胞体構造体がゲル内を通過できないなど、課題が残されている。

Ａ．Ｈａｌｐｅｒｉｎ，Ｍ．Ｋｒｏｇｅｒ，Ｆ．Ｍ．Ｗｉｎｎｉｋ，Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　２０１５，５４，１５３４２−１５３６７）

　上記事情により、ゲルの孔径を制御し、貫通型のマクロポーラス構造体を開発することが求められていた。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを含む混合物により、上記課題を解決し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを含む混合物。
［２］多糖類が、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン及びプルラン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１］に記載の混合物。
［３］下限臨界溶液温度を有する高分子が、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）及びポリビニルアルキルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１］に記載の混合物。
［４］親水性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセトアミド、ポリアミン、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、及びポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）からなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１］に記載の混合物。
［５］多糖類とブロック共重合体との混合比（多糖類：ブロック共重合体）が、６：４~８：２である、［１］に記載の混合物。
［６］ファイバー状に形成してなる、［１］に記載の混合物。
［７］［１］に記載の混合物と生体関連物質とを含む、生体関連物質含有混合物。
［８］生体関連物質が、細胞、抗体又は核酸である［７］に記載の混合物。
［９］［１］に記載の混合物、又は［７］に記載の生体関連物質含有混合物からブロック共重合体が除去された構造体。
［１０］生体関連物質が、細胞、抗体又は核酸である［９］に記載の構造体。
［１１］多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを混合して相分離を起こさせ、当該相分離後の混合物から前記ブロック共重合体を除去する工程を含む、マクロポーラス構造体の製造方法。
［１２］相分離を起こさせる前に細胞を混合する工程をさらに含む、［１１］に記載の方法。
［１３］多糖類が、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン及びプルラン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１１］に記載の方法。
［１４］下限臨界溶液温度を有する高分子が、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）及びポリビニルアルキルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１１］に記載の方法。
［１５］親水性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセトアミド、ポリアミン、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、及びポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）からなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１１］に記載の方法。
［１６］多糖類とブロック共重合体との混合比（多糖類：ブロック共重合体）を７：３~８：２で混合する、［１１］に記載の方法。
［１７］混合物をファイバー状に形成する、［１１］に記載の方法。
［１８］細胞が、アンジオテンシン変換酵素２を発現する細胞である［１０］に記載の構造体。
［１９］［１８］に記載の構造体を含む、ウイルス捕捉材。
［２０］細胞が神経幹細胞である［１０］に記載の構造体。
［２１］［２０］に記載の構造体を含む、神経再生医療材。

　本発明のマクロポーラス構造体は、孔径が制御されており、かつ貫通型であるため、従来のアルギン酸ゲルでは透過できなかったサイズの構造体を透過及び／又は放出することが可能となった。

本発明のマクロポーラス構造体の製造工程の概念図である。４分岐型ポリエチレングリコールとＰＮＩＰＡＭとのブロック共重合体を合成する合成法の模式図である。ファイバー状の細胞含有マクロポーラス構造体を製造するための二重同軸層流装置を示す図である。アルギン酸：ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ＝６．５：３．５におけるマクロポーラスアルギン酸ゲルの形態の時間経過を示す図である。アルギン酸：ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ＝７：３におけるマクロポーラスアルギン酸ゲルの形態の時間経過を示す図である。アルギン酸：ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ＝７．５：２．５におけるマクロポーラスアルギン酸ゲルの形態の時間経過を示す図である。アルギン酸：ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ＝８：２におけるマクロポーラスアルギン酸ゲルの形態の時間経過を示す図である。マクロポーラスアルギン酸ゲルの孔径のまとめを示す図である。３７℃におけるマクロポーラスアルギン酸ゲルファイバーを示す図である。４℃におけるマクロポーラスアルギン酸ゲルファイバーを示す図である。マウス神経幹細胞ファイバーの製造法の模式図である。マウス神経幹細胞ファイバーの培養を示す図である。培養３日後のマウス神経幹細胞ファイバーを示す図である。ＥＧＦＰを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを感染させたＶＥＲＯ細胞を共焦点顕微鏡により観察した図である。　左：感染していないマクロポーラス細胞ファイバ　右：感染してＥＧＦＰが発現したマクロポーラス細胞ファイバＥＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを感染させたＶＥＲＯ細胞を共焦点顕微鏡により観察した図である。　左：感染していないマクロポーラス細胞ファイバ　右：感染してＥＧＦＰが発現したマクロポーラス細胞ファイバ高濃度のレンチウイルスを感染させた細胞を示す図である。神経幹細胞の分化誘導後のマクロポーラスアルギン酸ゲルファイバを共焦点顕微鏡により観察した。神経幹細胞の分化誘導後のマクロポーラスアルギン酸ゲルファイバを共焦点顕微鏡により観察した。２０日間培養した細胞ファイバを免疫染色し、共焦点顕微鏡により観察した。

１．概要
　本発明は、（ｉ）多糖類、及び（ｉｉ）下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体を含む混合物に関する。本発明においては、上記多糖類とブロック共重合体とを混合することによりその混合物において相分離を起こさせ、その後ブロック共重合体を除去することにより、マクロポーラス構造を有する構造体を得ることができる。

　図１は、ブロック共重合体と多糖類との混合物からマクロポーラス構造体を形成させるための概念図である。図１において、相分離を起こさせるには、混合をＬＣＳＴ未満で行う場合とＬＣＳＴ以上で行う態様がある（図１ａ）。例えば、ＬＣＳＴ未満では、ＬＣＳＴを有する高分子が親水性となってブロック共重合体は水に溶解する。その状態で多糖類と混合すると、自発的に相分離構造が形成される（図１ｂ）。またＬＣＳＴ以上では、ＬＣＳＴを有する高分子が疎水性になるため水中では析出して白濁する。すなわち、ブロック共重合体がエマルジョンを形成した相分離構造となる。

　相分離構造を形成した後にブロック共重合体を除去すれば、多糖類により形成されたマクロポーラス構造体を得ることができる（図１ｃ）。本発明においては、上記相分離構造を形成した段階で多糖類をゲル化すると、流動性が抑制されたゲル状のマクロポーラス構造体が得られる点で好ましい。

２．下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体
２．１．ＬＣＳＴを有する高分子
　本発明において、ＬＣＳＴを有する高分子は特に限定されるものではなく、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）及びポリビニルアルキルエーテルなどが挙げられ、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。ＬＣＳＴを有する高分子の例を以下に示す。

（１）ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）
　ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）は、次式Ｉ：

（Ｒ^１０は、水素原子、又は炭素数１~４（Ｃ_１−４）のアルキル基（「Ｃ_１−４アルキル基」という。以下同様に表示する。）を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
で示される。

　ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）の一例として、ポリ（Ｎ−メチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）などが挙げられる。

（２）ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）
　ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）は、次式ＩＩ：

（Ｒ^２０は、水素原子、又はＣ_１−４アルキル基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
で示される。
　ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）の一例として、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルイソプロピルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）などが挙げられる。

（３）ポリビニルアルキルエーテル
　ポリビニルアルキルエーテルは、次式ＩＩＩ：

（Ｒ^３０は、水素原子、又はＣ_１−４アルキル基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
で示される。
　ポリビニルアルキルエーテルの一例として、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテルなどが挙げられる。

（４）分子設計
　上記高分子において、末端のアルキル基を種々変換することで、相転移温度を制御し、あるいは相分離構造の安定性を制御することができる。例えばＰＮＩＰＡＭは、側鎖に親水基及び疎水基をともに有しており、直鎖ポリマーのときは３２℃に下限臨界溶液温度を持つとともに水中では体積相転移温度（ＶＰＴＴ）を示す。ＰＮＩＰＡＭは、水溶液温度がＶＰＴＴ以下ではゲルは膨潤しているのに対し、ＶＰＴＴ以上ではゲルは収縮するという性質を持つことから、本発明のマクロポーラス構造体の製造に際し、この性質を利用することができる。

　末端のアルキル基に官能基を付与することで、親水性高分子と連結することが可能となる。官能基としては、マレイミド、チオール、アルキン、アジド、アミン、活性カルボン酸などを含む。例えば、後述のように親水性高分子にチオール基（ＳＨ基）を付加しておくと、マレイミド基はＳＨ基と反応し、安定なチオエーテル基を形成する。

２．２．親水性高分子
　本発明において、親水性高分子は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセトアミド、ポリアミン、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などを、単独で又は２種以上を組み合わせて使用される。

　本発明の好ましい態様において、親水性高分子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
　ＰＥＧは、直鎖型でも多分岐型でもよく、多分岐型の分岐数は特に限定されるものではなく、２分岐型、３分岐型、４分岐型、５分岐型、６分岐型、７分岐型、８分岐型などを含む。また、ＰＥＧはスターポリマーやデンドリマーとすることもできる。ＰＥＧには両端に又は一端に官能基を付加しておくことが好ましい。官能基としては、チオール、アクリレート、アミン、ビオチン、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミジルカルボキシメチルエステル、スクシンイミジルグルタレートエステル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　多分岐型ＰＥＧは、例えば、次式ＩＶ：

で示される構造を表す。

　式ＩＶにおいて、Ｒ^１は、次式：

（Ｘは官能基を表す。）で示される。ｎは、目的に応じて任意に設定することができ、例えばｎは２５~１０００である。
　Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して、水素原子、又は次式：

（Ｘは官能基を表す。）で示される。

　Ｘは官能基を表し、その種類は前記と同様、例えばチオール、アクリレート、アミン、ビオチン、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミジルカルボキシメチルエステル、スクシンイミジルグルタレートエステル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、官能基はそれぞれの分岐鎖において独立しており、同一であっても異なってもよい。また、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４におけるｎも、それぞれの分岐鎖において独立しており、同一数であっても異なる数であってもよい。

　ＰＥＧが２分岐型から８分岐型の場合、ｍは、１~４の整数を表す。
　ｍが１であり、かつＲ^３及びＲ^４がいずれも水素原子のときは、ＰＥＧは２分岐型となり、ｍが１であり、Ｒ^３及びＲ^４のいずれか一方が水素原子のときは、ＰＥＧは３分岐型となり、ｍが１であり、かつＲ^２、Ｒ^３及びＲ^４がいずれも水素原子でないときは、ＰＥＧは４分岐型となる。さらに、例えばｍが４であってＲ^２及びＲ^３がいずれも水素原子ではなくＲ^４が水素原子であるときは、ＰＥＧは８分岐型となる。
　本発明において使用する多分岐型ＰＥＧは４分岐型又は８分岐型であることが好ましい。

　４分岐型及び８分岐型のＰＥＧの一例を以下に示す。

　８分岐型：

　本発明において、上記多分岐型ＰＥＧは、公知方法により得ることができるが、また市販品（日油）として購入することも可能である。

　スターポリマーは、中心より３本以上のポリマーが放射状に分岐した高分子であり、分岐点が一箇所に集中している。スターポリマーの合成法は当分野において周知であり、例えばコアを開始点としてモノマーを連鎖的に重合させる方法、アーム部分を先に合成して、アームの末端とコアの官能基部分を結合させる方法、リビング的な連鎖重合により直鎖状高分子を合成し、架橋剤を用いてコア部位を架橋させる方法などが採用される。

　デンドリマーは、中心から規則的に分枝した構造を持つ樹状高分子である。デンドリマーの合成法には、コアとなる分子にジェネレーションごとに分子を結合させ枝分かれさせていくダイバージェント法、及び予め枝の部分を合成して最後にコア分子と反応させるコンバージェント法の２つがある。市販の多官能性ＰＥＧ（Ｍｅｒｃｋ社）を使用することもできる。

　さらに、直鎖型では、ＰＥＧの一端又は両端に官能基を付加して、ＬＣＳＴを有する高分子を連結させることができ、分岐型では、分岐したＰＥＧの末端に官能基を付加して、ＬＣＳＴを有する高分子を連結させることができる。
　官能基としては、例えばチオール、アクリレート、アミン、ビオチン、アルデヒド、マレイミド、スクシンイミジルカルボキシメチルエステル、スクシンイミジルグルタレートエステル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

２．３．ブロック共重合体
　本発明において、ＬＣＳＴを有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体は、それぞれの高分子に官能基を付加しておいて、官能基同士を反応させることにより、合成することができる。
　例えば、マレイミド基はチオール基（ＳＨ基）と反応して安定なチオエーテル基を形成するため、親水性高分子にＳＨ基、ＬＣＳＴを有する高分子にマレイミド基を付加して両者を反応させればよい。図２は、親水性高分子としてＳＨ基を付加した４分岐型のＰＥＧと、ＬＣＳＴを有する高分子としてＰＮＩＰＡＭとのブロック共重合体を合成する合成例の模式図である。

　なお、本発明においては、ブロック共重合体を蛍光物質で標識しておいてもよい。蛍光物質は、特に限定されるものではなく、例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ等の化学合成物質、あるいはフィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等の蛍光タンパク質などが挙げられる。これらの蛍光物質は、市販品として入手可能である。蛍光物質でブロック共重合体を標識することにより、その後のステップにおいて、混合物から相分離構造が形成されたか否か、あるいはブロック共重合体を除去できたか否かの確認をすることができる。

３．多糖類
　本発明において使用される多糖類は、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン及びプルランが例示され、１種を単独で、又は２種以上を適宜組み合わせて使用できる。また本発明においては、これらの多糖類の塩も含む。
　塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩などを含む。

　本発明の一態様において、使用される多糖類は、好ましくはアルギン酸である。アルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよい。好ましく用いられるアルギン酸類は、カジカ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される生体内吸収性の多糖類であり、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー画分、Ｌ−グルロン酸のホモポリマー画分、及びＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸がランダムに配列した画分が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸は、市販品として入手することもできる（持田製薬）。

４．マクロポーラス構造体の製造
　本発明の一態様においては、多糖類と、ＬＣＳＴを有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを混合して相分離を起こさせ、当該相分離後の混合物から前記ブロック共重合体を除去する工程を含む、マクロポーラス構造体の製造方法が提供される。

　前記の通り、ＬＣＳＴを有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体は、ＬＣＳＴ未満では当該高分子が水に溶解する。その状態で多糖類（アルギン酸等）と混合することにより、自発的に相分離構造を形成する。ＬＣＳＴ未満に下げるとブロック共重合体は水に溶解するため、単に水中で攪拌、震盪又は静置することにより、ブロック共重合体を除去することができる。

　ここで、本発明において多糖類とブロック共重合体との混合比（多糖類：ブロック共重合体）は、本発明において多糖類とブロック共重合体との混合比（多糖類：ブロック共重合体）は、９：１から１：９の間で様々な比をとることができ、一つの態様では例えば６：４~８：２であり、別の態様では例えば７：３~８：２である。
　本発明においては、多糖類をゲル化して流動性を落とすことにより、マクロポーラス構造を保持することができる。この場合は、ＬＣＳＴ未満でブロック共重合体と多糖類とを混合し、混合物をＬＣＳＴ以上に上げて構造をゲル化により固定化した後、再度ＬＣＳＴ未満に下げればよい。ゲル化は、例えば多糖類をカルシウムイオン含有溶液（例えば塩化カルシウム水溶液）で処理すること、具体的にはブロック共重合体と多糖類との混合物に塩化カルシウム水溶液を混合することにより、行うことができる。

　他方、ＬＣＳＴを有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体において、ＬＣＳＴ以上では当該高分子が水に不溶となり、エマルジョンを形成する。その状態で多糖類（アルギン酸等）と混合することによっても相分離構造を形成する。その後多糖類をゲル化した後にＬＣＳＴ未満に下げるとブロック共重合体は水に溶解するため、単に水中で攪拌、震盪又は静置することにより、ブロック共重合体を除去することができる。

　さらに、本発明においては、混合物に細胞を含有させることができる。この場合、混合物の相分離を起こさせる前に含有させておく。そして、多糖類を必要によりゲル化した後、混合物をＬＣＳＴ以下に設定して水中で攪拌等を行うことでブロック共重合体を除去する。これにより、細胞含有のマクロポーラス構造体を得ることができる。

　細胞を含有するマクロポーラス構造体は、ウイルスや細菌の捕獲用ツール、抗体産生ハイブリドーマを導入した抗体製造ツール等に利用される。ゲルは所定の大きさの孔径を有するため、半透膜としての利用が可能である。その場合は、透析や血液浄化に使用することができる。

　マクロポーラス構造体に細胞等の生体関連物質を導入する場合は、４℃~３７℃の温度範囲に調節することが必要であるが、細胞以外他の物質を導入することも可能である。例えば酵母を導入する場合は、０℃から最大１００℃程度までの温度範囲内で行うことができる。この場合は、ＬＣＳＴを有する高分子において、置換基の種類を適宜変えて高温のＬＣＳＴを有する高分子を使用すればよい。

　細胞としては特に限定されるものではなく、万能性を有するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、幹細胞（造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞）、各種組織における細胞（例えば骨格筋細胞、心筋細胞、神経系細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、膵細胞、皮膚細胞、血液細胞、間質細胞等）などが挙げられる。

　これらの細胞の具体例として、以下の細胞を例示することができる。
　内分泌細胞：神経分泌細胞、下垂体細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、膵島細胞、胃腸内分泌細胞、心筋細胞、肝細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、副腎細胞、性腺細胞等
　外分泌細胞：消化管上皮細胞、生理活性物質を放出する細胞（アルブミンを放出する肝細胞、酵素を放出する酵素産生細胞等）
　神経系細胞：神経幹細胞、中枢神経細胞、末梢神経細胞、グリア細胞等
　骨格筋系細胞：骨細胞、軟骨細胞等
　血液細胞：造血幹細胞、白血球、赤血球、血小板等
　間質細胞：繊維芽細胞、血管細胞等

　また、血液に含まれる特定物質（例えばウイルスやサイトカイン）と親和性を有する膜タンパク質を発現した親和性細胞を用いることができる。
　さらに、細胞の他にも、タンパク質、ペプチド、抗体（抗体断片を含む）、脂質、糖類、核酸類などの生体関連物質を混合物に導入することが可能であり、生体関連物質の種類に限定はない。

５．ファイバー状構造体
　本発明においては、上記マクロポーラス構造体の製造法を応用して、ファイバー状の構造体を製造する方法を提供する。
　ファイバー状構造体を製造するには、二重の同軸マイクロ流体装置（ＷＯ２０１１／０４６１０５号）を用いる方法を採用することができる。同軸マイクロ流体装置は、２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出する構成となっている。

　同軸マイクロ流体装置装置の一例を図３に示す。図３ａにおいて、同軸マイクロ流体装置１０は、細胞懸濁液射出用チューブ１０１、多糖類とブロック共重合体との混合物射出用チューブ１０２、カルシウムイオン含有水溶液射出用チューブ１０３を備える。なお、多糖類とブロック共重合体との混合物を、単に「混合物」ともいう。細胞懸濁液射出用チューブ１０１の上部は、細胞懸濁液を注入するための注入口１１１が設けられ、上部から細胞懸濁液１２１が注入される。細胞懸濁液射出用チューブ１０１及び混合物射出用チューブ１０２は下部がテーパ状の先細り形状に形成されており、細胞懸濁液射出用チューブ１０１と混合物射出用チューブ１０２との間には混合物射出用の開口部１１２が設けられる。また、混合物射出用チューブ１０２とカルシウムイオン含有水溶液射出用チューブ１０３との間にはカルシウムイオン含有水溶液射出用の開口部１１３が設けられる。

　細胞懸濁液１２１は、細胞懸濁液射出用チューブ１０１の下部の射出口から混合物射出用チューブ１０２に向けて射出され、ファイバーのコア部を構成する。開口部１１２から混合物射出用チューブ１０２に向けて混合物１２２を射出すると、ファイバーのコア部を細胞懸濁液が占め、混合物が細胞周囲を覆ってシェル部を形成し、同軸のコア・シェル状の流体を形成する。その流体をカルシウムイオン含有水溶液射出用チューブ１０３に向けて射出するとともに、開口部１１３からカルシウムイオン含有水溶液（例えばＣａＣｌ_２含有水溶液）を射出すると、流体のシェル部がゲル化される。その結果、コア部が細胞で占められ、シェル部がゲル化されたファイバー１２３を得ることができる。ゲル化されたファイバー１２３の一部拡大図を図３ｂに示す。この段階では、ファイバー１２３のシェル部にはブロック共重合体が含まれるため、これをＬＣＳＴ以下の温度に調節することで、ブロック共重合体は水溶性となり、ファイバーを水中で攪拌することにより当該ブロック共重合体を除去することができる。これにより、コア部が細胞、シェル部がマクロポーラス状（多孔質）となったファイバー状のマクロポーラス構造体（以下、単に「マクロポーラス構造体」という）１３０を得ることができる（図３ｃ）。

　細胞懸濁液及び混合物のそれぞれの射出速度は限定されるものではないが、孔径が５０μｍ~２ｍｍ程度のサイズの同軸マイクロ流体装置を有する場合は、射出口における速度は例えば１０~５００μＬ／分である。また、カルシウムイオン含有水溶液への導入速度も特に限定されるものではなく、例えば１~１０ｍＬ／分である。

　マクロポーラス構造体１３０において、コア及びシェルの孔径は任意であり、目的に応じて適宜調節することができる。例えば、マクロポーラス構造体１３０のシェル部の外径は１０μｍ~２ｍｍ、２００μｍ~２ｍｍ、５０μｍ~１ｍｍ程度とすることができる。マクロポーラス構造体１３０の長さは特に限定されず、数ｍｍ~数ｍ程度とすることができる。その断面形状としては、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等が挙げられる。

　上記のようにして得られたマクロポーラス構造体は、孔径を自由に変えることができるため細胞が通り易く、細胞との親和性が高い。従って、本発明の構造体に含まれる細胞は多孔質の中に入り込んで細胞が凝集し、スフェロイド等の細胞構造体が形成される。

　マクロポーラス構造体１３０を培養液中で培養することにより、マクロポーラス構造体１３０に内包された細胞を増殖させることができる。マクロポーラス構造体１３０は、培養液を適切に交換することにより、数か月培養することもできる。

　また、マクロポーラス構造体１３０に含まれる細胞の種類によっては、分化誘導培地に置換して培養することにより、細胞が分化してマクロポーラス構造体１３０の外側に分化後の細胞又は組織の一部が形成される。
　このようにして細胞が内包されたマクロポーラス構造体１３０は、細胞の種類によって、各種再生医療材として使用することができる。例えば、マクロポーラス構造体１３０中に神経幹細胞を未分化の状態で内包させた後、所定期間培養し、その後細胞増殖因子のＦＧＦやＥＧＦを除去した分化誘導培地に置換して培養すると、未分化の神経幹細胞は神経細胞に分化し、マクロポーラス構造体１３０の外に組織の一部が伸長する。このようにして形成されたマクロポーラス構造体１３０は、神経再生医療材として使用することができる。

　あるいは、マクロポーラス構造体１３０に、ウイルスを捕捉する細胞等を内包すると、当該マクロポーラス構造体１３０はウイルスに感染した生体関連物質（例えばウイルス感染血液）を浄化するのに有用である。
　例えば、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）は、その表面のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）が細胞表面のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）をレセプターとして結合して感染する。そこで、レンチウイルスベクターを用いた遺伝子導入による各種ＡＣＥ２発現細胞（ＶｅｒｏＥ６細胞、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｈｅｌａ／ＡＣＥ２細胞）を作製し、この細胞をマクロポーラス構造体１３０に内包させる。

　これにより、マクロポーラス構造体１３０に内包された細胞はＡＣＥ２を発現するため、ＡＣＥ２発現細胞を内包したマクロポーラス構造体１３０は、ウイルス捕捉材として、ウイルスに感染した血液の浄化等に使用することができる。
　なお、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の細胞感染機構を模倣することができるＳタンパク質を表面に有するビーズ（Ｓタンパク質ビーズ）を作製すると、当該ビーズは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の細胞感染モデルとして使用することができる。

　さらに、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子導入ウイルスとして知られているため、ＡＡＶに目的遺伝子を導入し、当該ＡＡＶを感染させた細胞をマクロポーラス構造体１３０に注入することで、遺伝子治療用マクロポーラス構造体１３０ができる。

　実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］

・材料
　アルギン酸ナトリウム（Ｐｒｏｎｏｖａ　ＵＰ　ＭＶＧ　ａｌｇｉｎａｔｅ，Ｎｏｖａ　Ｍａｔｒｉｘ）、ｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＰＴＥ−５０ＳＨ，ＰＴＥ−１００ＳＨ，ＰＴＥ−２００ＳＨ，油化産業株式会社）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ^ＴＭ　４８８　Ｃ５　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（Ａ１０２５４，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）マレイミド末端（７３１０４８，７２８６３２，Ｍｅｒｃｋ）は市販品を購入して実験に使用した。

・ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（１００００−５５００）の合成法
　ｔｅｔｒａ−ＰＥＧの４官能基末端にＰＮＩＰＡＭをｔｈｉｏ−ｅｎｅ反応によって導入して、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを合成した。合成法としては、分子量１００００のｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（２ｇ，２００μｍｏｌ，）と分子量５５００のＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（４．４ｇ，８００μｍｏｌ）を４℃に冷やしたＰＢＳ　６４ｍＬに溶解させ、４℃下で終夜撹拌し、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液を調製した。さらに、蛍光顕微鏡での観察を可能にするためにＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭの４官能基末端のうちの一つをＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８−ＭＡを導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８も合成した。合成法としては、ｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（１５．２６ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬとＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８−ＭＡ（１ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬを混合し、４℃下で１時間で撹拌する。その後、４℃に冷却しＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（２５．８１ｍｇ）／ＰＢＳ　２２０μＬを添加し、４℃下で終夜撹拌しＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８溶液を調製した。

・ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（１００００−２０００）の合成法
　ｔｅｔｒａ−ＰＥＧの４官能基末端にＰＮＩＰＡＭをｔｈｉｏ−ｅｎｅ反応によって導入して、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを合成した。合成法としては、分子量２００００のｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（５００ｍｇ，５０μｍｏｌ）と分子量２０００のＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（４００ｍｇ，２００μｍｏｌ）を４℃に冷やしたＰＢＳ　１６ｍＬに溶解させ、４℃下で終夜撹拌し、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液を調製した。さらに、蛍光顕微鏡での観察を可能にするためにＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭの４官能基末端のうちの一つをＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８−ＭＡを導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８も合成した。合成法としては、ｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（１５．２６ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬとＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８−ＭＡ（１ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬを混合し、４℃下で１時間で撹拌する。その後、４℃に冷却しＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（９．３８ｍｇ）／ＰＢＳ　２２０μＬを添加し、４℃下で終夜撹拌しＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８溶液を調製した。

・ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（２００００−５５００）の合成法
　ｔｅｔｒａ−ＰＥＧの４官能基末端にＰＮＩＰＡＭをｔｈｉｏ−ｅｎｅ反応によって導入して、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを合成した。合成法としては、分子量２００００のｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（５００ｍｇ，２５μｍｏｌ）と分子量５５００のＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（５５０ｍｇ，１００μｍｏｌ）を４℃に冷やしたＰＢＳ　１６ｍＬに溶解させ、４℃下で終夜撹拌し、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液を調製した。さらに、蛍光顕微鏡での観察を可能にするためにＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭの４官能基末端のうちの一つをＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８−ＭＡを導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８も合成した。合成法としては、ｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（１５．２６ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬとＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８−ＭＡ（０．５ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬを混合し、４℃下で１時間で撹拌する。その後、４℃に冷却しＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（１２．９０ｍｇ）／ＰＢＳ　２２０μＬを添加し、４℃下で終夜撹拌しＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８溶液を調製した。

・ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（２００００−２０００）の合成法
　ｔｅｔｒａ−ＰＥＧの４官能基末端にＰＮＩＰＡＭをｔｈｉｏ−ｅｎｅ反応によって導入して、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを合成した。合成法としては、分子量２００００のｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（５００ｍｇ，２５μｍｏｌ）と分子量２０００のＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（２００ｍｇ，１００μｍｏｌ）を４℃に冷やしたＰＢＳ　１６ｍＬに溶解させ、４℃下で終夜撹拌し、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液を調製した。さらに、蛍光顕微鏡での観察を可能にするためにＰＥＧ−ｂ−ＰＮＴＰＡＭの４官能基末端のうちの一つをＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８−ＭＡを導入したＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８も合成した。合成法としては、ｔｅｔｒａ　ＰＥＧ−ＳＨ（１５．２６ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬとＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８−ＭＡ（０．５ｍｇ）／ＰＢＳ　１００μＬを混合し、４℃下で１時間で撹拌する。その後、４℃に冷却しＰＮＩＰＡＭ−ＭＡ（４．６９ｍｇ）／ＰＢＳ　２２０μＬを添加し、４℃下で終夜撹拌しＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８溶液を調製した。

・結果
　ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液２．４ｍｌとＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ−Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８溶液０．１μｌを混合し、蛍光ブロックコポリマー溶液を調製した。アルギン酸ナトリウムは生理食塩水に溶解させ、１．８％のアルギン酸ナトリウム溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム溶液と蛍光ブロックコポリマー溶液を６．５：３．５（図４）、７：３（図５）、７．５：２．５（図６）、８：２（図７）の割合で混合し、厚さ１００μｍのセルに移し、４℃下で０、１、２、３、４、５時間後の共焦点顕微鏡観察を実施した（緑色：蛍光ブロックコポリマー、黒色：アルギン酸ナトリウム）。７．５：２．５、８：２ではいずれも、相分離した網目構造が観察され、ｚスタック画像より相分離構造は貫通構造であることが分かった。また、アルギン酸ナトリウム溶液の割合が増えるほど、網目構造が小さくなることも確認された。
　アルギン酸ナトリウムとブロックコポリマーとのとの組み合わせ及び及び共焦点顕微鏡観察像のまとめを図８に示す。

・Ａｌｇｉｎａｔｅ＋ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ（マクロポーラスアルギン酸ゲル）（合成法又は取得法）
　マクロポーラスアルギン酸ゲルの調製方法としては、４℃に冷却した１．８％　アルギン酸ナトリウム溶液と１０％　ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液を混合し、１日静置し相分離させた。混合溶液を３７℃の恒温槽内に移し、１時間静置する。温度が下がらないように気をつけながら、混合溶液を３７℃の塩化カルシウム溶液中に滴下し、白濁したアルギン酸をゲルを作製した。その後、４℃に冷却し撹拌する事で、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを除去し、マクロポーラスのアルギン酸ゲルを作製した。

・Ａｌｇｉｎａｔｅ／ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ　ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ　ｆｉｂｅｒの製造法、測定法、特徴
　内包したい細胞懸濁液、蛍光ビーズなどを含む温度３７℃のコア部分を流速２５μＬ／ｍｉｎ、多糖類とブロック共重合体との混合物を含む温度３７℃のシェル部分を流速７５μＬ／ｍｉｎ、カルシウムイオンを含有する水溶液を温度３７℃のシース部分を流速３６００μＬ／ｍｉｎで送液することで、多糖類とブロック共重合体との混合物をシェルとするファイバー構造を作製した。その後、４℃に冷却し撹拌する事で、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを除去し、マクロポーラスのアルギン酸ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ　ｆｉｂｅｒを作製した。直径１００ｎｍの蛍光ビーズを内包した際は、４℃に冷却前にはファイバー内に蛍光が確認されたが、４℃に冷却撹拌した後は完全に抜けていることが確認された（図９、１０）。

・ｍＮＳＣｓの細胞凝集体の作製方法
　ＩＣＲマウスの中脳（胎生日数：１３．５日）から取得した神経幹細胞（ｍＮＳＣｓ）を、２ｍＭのＬ−グルタミン（２５０３０−０８１，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ４３３３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（ＡＦ−１００−１８Ｂ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ　ｍＬ／Ｌ　ｈＥＧＦ（ＡＦ−１００−１５，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｂ−２７^ＴＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ），ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ（１２５８７０１０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（１０８８８−０２２，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）増殖培地で培養した。ｍＮＳＣｓは、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（１２５６３−０１１、Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２−３回継代してから使用した。ｍＮＳＣｓ細胞凝集体は、細胞培養用１０ｃｍ　ｄｉｓｈで培養し、回収した。

・ｍＮＳＣｓファイバーの製造法、培養法、測定法、特徴
　ｍＮＳＣｓファイバーの製造法の概要を図１１に示す。
　４℃に冷却した１．８％　アルギン酸ナトリウム溶液と１０％　ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭ溶液を７：３の割合で混合し１０時間層分離した後、ｍＮＳＣｓ細胞凝集体と混合し、１ｍｌのガラスキャプラリーから３７℃の１００ｍＭ塩化カルシウム溶液中に１００μＬ／ｍｉｎの速度で注入した。その後、得られたｍＮＳＣｓゲルファイバーを、４℃に冷却したＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ内で撹拌する事で、ＰＥＧ−ｂ−ＰＮＩＰＡＭを除去し、ｍＮＳＣｓマクロポーラスアルギン酸ゲルファイバーを作製した。

　作製した細胞ファイバーはＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔで培養し、分化誘導時には、２ｍＭのＬ−グルタミン（２５０３０−０８１，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｐ４３３３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂ−２７^ＴＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ），ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ（１７５０４０４４，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（１０８８８−０２２，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分化誘導培地で培養した。ｍＮＳＣｓ細胞凝集体は分化誘導前はファイバー内で増殖するだけであるが、分化誘導かける事によって遊走性の高い一部の細胞がファイバー内を外側に向かって動き、一度シェルの外に出ると凝集体の内部の細胞が追随し、細胞外に大きな細胞凝集体を形成する事がわかった（図１２、１３）。

［実施例２］
　ファイバーへのウイルス感染
（１）ＡＡＶウイルスの感染
　ＥＧＦＰを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ）ベクターを用いて、マクロポーラス細胞ファイバ内のＶＥＲＯ細胞への共焦点顕微鏡を用いて調べた。

　具体的には、１０ｃｍ細胞培養ディッシュ中で、ＶＥＲＯ細胞（１．０×１０^８　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で作成したマクロポーラス細胞ファイバを７日間培養した後、培地を除去し、４．２９　ｘ　１０^１１　ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのＣＭＶ−ＥＧＦＰのＡＡＶウイルス溶液を１００μＬ添加し、３０分間３７℃で静置したのち、培地を１０ｍＬ添加し３７℃で４８時間インキュベーター内に静置した。その後、ＰＢＳで洗浄し培地を１０ｍＬ添加し、３７℃で４８時間インキュベーター内に静置した。ガラスボトムディッシュに移して、共焦点顕微鏡で観察した。

　結果を図１４に示す。
　青色の蛍光はＤＡＰＩでの核染色、緑色の蛍光はＡＡＶに感染した細胞を示している。ｃｏｎｔｒｏｌはＡＡＶウイルスを添加していないマクロポーラス構造体の共焦点顕微鏡での観察像になる。
　図１４より、ＡＡＶを添加していない、ｃｏｎｔｒｏｌは緑色の蛍光をほとんど示していないが、ＡＡＶを添加したマクロポーラス構造体では、ほとんどの細胞が緑色の蛍光を示していることから、マクロポーラス構造体をＡＡＶが膜を透過し、ＶＥＲＯ細胞が感染していることが示された。

（２）レンチウイルスの感染
＜材料と方法＞
　ＥＧＦＰを発現するＬｅｎｔｉベクターをもちいて、マクロポーラス細胞ファイバ内のＶＥＲＯ細胞への感染を共焦点顕微鏡を用いて調べた。

　具体的には、１０ｃｍ細胞培養ディッシュ中で、ＶＥＲＯ細胞（１．０×１０^８　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で作成したマクロポーラス細胞ファイバを５日間培養した。培養後、培地を除去し、１．４０　ｘ　１０^９　ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのＣＭＶ−ＥＧＦＰのレンチウイルス溶液を１００μＬ添加した。３０分間３７℃で静置したのち、培地を１０ｍＬ添加し３７℃で４８時間インキュベーター内に静置した。

　その後、ＰＢＳで洗浄し培地を１０ｍＬ添加し、３７℃で４８時間インキュベーター内に静置した。ガラスボトムディッシュに移して、共焦点顕微鏡で観察した。
　結果を図１５に示す。
　青色の蛍光はＤＡＰＩでの核染色、緑色の蛍光はレンチウイルスに感染した細胞を示している。ｃｏｎｔｒｏｌはレンチウイルスを添加していないマクロポーラス構造体の共焦点顕微鏡での観察像になる。

　図１５より、レンチウイルスを添加していない、ｃｏｎｔｒｏｌは緑色の蛍光をほとんど観察されなかったが、レンチウイルスを添加したマクロポーラス構造体では、ほとんどの細胞が緑色の蛍光を示していることから、マクロポーラス構造体をレンチウイルスが膜を透過し、ＶＥＲＯ細胞が感染していることが観察された。

　また、より高濃度のレンチウイルスに感染すると、細胞凝集体の細胞がバラバラになる（図１６、左）。しかし、マクロポーラス細胞ファイバでは、アルギン酸のシェルが細胞を被覆しているため、ファイバーの外に細胞が出るリスクを軽減できる（図１６、中及び右）。感染タイターが１０^７トランスダクションユニット（ＴＵ）の場合は感染がすすんでも、細胞がそこまでバラバラになっていないが、１０^８ＴＵの場合は感染により、マクロポーラス構造体内で凝集していた細胞がバラバラになっており、コア部分全体に拡がって観察された。

［実施例３］
　マウスの神経幹細胞（２．０×１０^８　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を内包したマクロポーラスな細胞ファイバを、２ｍＭ　Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ　ｈＥＧＦ、Ｂ２７　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地で５~１０日間培養した。培養後、ｂＦＧＦ、ｈＥＧＦを除去した分化誘導培地に置換することで分化誘導をかけた。

　カルシウム指示薬のＦｌｏｕ−８　ＡＭで処理したところ、マクロポーラスなハイドロゲル部分の貫通孔を軸索が外側に伸びていることが確認できた（図１７）。また、マクロポーラスハイドロゲルファイバの表面部分を観察すると、軸索が、ファイバーの向きと並行して、ファイバーの外側を走っている事が確認できた（図１８）。

　分化誘導培地に置換後、７~１０日培養した細胞ファイバを、神経細胞のマーカーであるＴｕｊ１抗体を用いて免疫染色を行った。
　その結果、一般的なアルギン酸ハイドロゲルファイバではほとんど抗体が透過しないのに対して、マクロポーラスファイバでは抗体が透過し、マクロポーラスなハイドロゲル部分に内包された組織も免疫染色されることが確認できた（図１９）。マクロポーラスファイバ作製後、２０日以上の長期培養サンプルについても抗体のような分子量の大きなタンパク質も透過可能であり、組織と反応性を有していた。

１０：同軸マイクロ流体装置
１０１：細胞懸濁液射出用チューブ
１０２：多糖類とブロック共重合体との混合物射出用チューブ
１０３：カルシウムイオン含有水溶液射出用チューブ
１１１：注入口
１１２：混合物射出用の開口部
１１３：カルシウムイオン含有水溶液射出用の開口部
１２１：細胞懸濁液
１２２：混合物
１２３：ファイバー
１３０：マクロポーラス構造体

Claims

多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを含む混合物。
多糖類が、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン及びプルラン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の混合物。
下限臨界溶液温度を有する高分子が、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）及びポリビニルアルキルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の混合物。
親水性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセトアミド、ポリアミン、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、及びポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の混合物。
多糖類とブロック共重合体との混合比（多糖類：ブロック共重合体）が、６：４~８：２である、請求項１に記載の混合物。
ファイバー状に形成してなる、請求項１に記載の混合物。
請求項１に記載の混合物と生体関連物質とを含む、生体関連物質含有混合物。
請求項１に記載の混合物、又は請求項７に記載の生体関連物質含有混合物からブロック共重合体が除去された構造体。
多糖類と、下限臨界溶液温度を有する高分子と親水性高分子とのブロック共重合体とを混合して相分離を起こさせ、当該相分離後の混合物から前記ブロック共重合体を除去する工程を含む、マクロポーラス構造体の製造方法。
相分離を起こさせる前に細胞を混合する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
多糖類が、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キサンタンガム、ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン及びプルラン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項９に記載の方法。
下限臨界溶液温度を有する高分子が、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）及びポリビニルアルキルエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項９に記載の方法。
親水性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセトアミド、ポリアミン、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、及びポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項９に記載の方法。
多糖類とブロック共重合体との混合比（多糖類：ブロック共重合体）を７：３~８：２で混合する、請求項９に記載の方法。
混合物をファイバー状に形成する、請求項９に記載の方法。