WO2023062895A1 - 酵素安定化剤の製造方法、酵素安定化剤、酵素の安定化方法、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、及び酵素安定化剤の製造装置 - Google Patents

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enzyme
lignin derivative
liquid
hydrophilic
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夏季 前川
修 若村
竜彦 山田
史帆 ▲高▼橋
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日鉄エンジニアリング株式会社
国立研究開発法人森林研究・整備機構
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    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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    • C13B50/00—Sugar products, e.g. powdered, lump or liquid sugar; Working-up of sugar
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an enzyme stabilizer, an enzyme stabilizer, a method for stabilizing an enzyme, a method for saccharifying lignocellulosic biomass, and an apparatus for producing an enzyme stabilizer.
  • Non-edible biomass includes cellulose, which is the most abundant on earth, and most of it exists as lignocellulose, which is a complex with aromatic polymers such as lignin and hemicellulose.
  • the pretreatment of enzymatic saccharification is a process that allows enzymes to effectively act on cellulose, etc. in biomass, and physical or chemical treatments are carried out.
  • a physical treatment there is a method of grinding with a ball mill or the like.
  • chemical treatment there is a method of obtaining cellulose by removing lignin with a chemical agent, such as the chemical process of paper pulping. In either method, cellulose and hemicellulose are converted to ethanol and effectively used.
  • lignin is one of the three main components of biomass and the second most accumulated organic compound on earth. It is separated in the chemical pulping process and bioethanol pretreatment process, and is a by-product in paper pulp production and bioethanol production, but there are few effective ways to use it other than as a heat source, and effective ways to use it are being sought.
  • lignin has been studied as a raw material for functional materials by synthesizing it with other chemical substances and derivatizing it.
  • its properties as an enzyme stabilizer have also been recognized (see, for example, Patent Document 1, etc.).
  • a method for producing a lignin-derived enzyme stabilizer there is an acid solvolysis method using biomass and a hydrophilic compound such as polyethylene glycol as raw materials (see, for example, Patent Document 2, etc.).
  • a hydrophilic compound such as polyethylene glycol as raw materials
  • two types of lignin derivatives, a hydrophobic fraction and a hydrophilic fraction, are produced, and the hydrophilic fraction is suitable as an enzyme stabilizer (see, for example, Patent Document 3, etc.).
  • the hydrophilic fraction obtained by the method described in Patent Document 3 contains a large amount of unreacted hydrophilic compounds, and recovering and reusing these unreacted hydrophilic compounds is not profitable for business. This is an issue to ensure.
  • the hydrophilic fraction also contains fermentation inhibitors such as acetic acid and furfural. Therefore, when the hydrophilic fraction is used as an enzyme stabilizer in the production of ethanol from lignocellulosic biomass, these fermentation inhibitors may be brought into the fermentation system and the yield may decrease. Further, attempts have been made to purify the hydrophilic lignin derivative by dehydrating and concentrating the hydrophilic fraction, and to circulate and reuse the concentrated and purified unreacted hydrophilic compound. However, since the fermentation inhibitors in the hydrophilic fraction also circulate, the fermentation inhibitors are likely to be concentrated, which may require frequent blowing, and there is concern that the reuse rate of hydrophilic compounds will decrease. be done.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an enzyme stabilizer in which business profitability is ensured and fermentation inhibitors are removed, a method and apparatus for producing the same, and the enzyme stabilizer.
  • a method for stabilizing an enzyme using an agent and a method for saccharifying lignocellulosic biomass are provided.
  • the inventors have found that by treating the hydrophilic fraction obtained by the acid solvolysis method with a synthetic adsorbent having specific properties, the unreacted hydrophilic It is possible to efficiently recover hydrophilic compounds, to ensure business profitability by reusing the recovered hydrophilic compounds, and to remove fermentation inhibitors by distilling the solution after treatment with a synthetic adsorbent.
  • the present inventors have found that an enzyme stabilizer containing a hydrophilic lignin derivative with improved purity can be obtained, and have completed the present invention.
  • a method for producing an enzyme stabilizer containing a hydrophilic lignin derivative comprising the following steps. Step (1) of adding a first acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol to react; Step (2) of adding alkali to the reaction solution obtained in step (1) to neutralize; Step (3) of solid-liquid separation of the neutralized alkaline solution obtained in step (2) to obtain a liquid fraction; Step (4) of adding a second acid to the liquid fraction obtained in step (3); Step (5) of solid-liquid separation of the acidic liquid obtained in the step (4) to obtain a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative; The liquid fraction obtained in the step (5) is brought into contact with a synthetic adsorbent having a water content of 55% by mass or more, a pore diameter of 350 ⁇ or less, and a specific gravity of 1.15 or less, Step (6) of adsorbing a hydrophilic lignin derivative to the synthetic adsorb
  • ⁇ 2> Between the steps (6) and (7), Further comprising a step (6A) of washing the synthetic adsorbent by contacting water with the synthetic adsorbent to which the hydrophilic lignin derivative is adsorbed, and recovering the cleaning liquid,
  • the method for producing an enzyme stabilizer according to ⁇ 1> wherein in the step (7), the solution after contact with the synthetic adsorbent and the washing liquid are distilled.
  • ⁇ 4> The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the step (6) and the step (8) are performed at a temperature of 20°C or higher and 40°C or lower. .
  • ⁇ 5> The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the organic eluent is ethanol.
  • ⁇ 6> The method for producing an enzyme stabilizer according to ⁇ 5>, wherein the concentration of ethanol is 90% by mass or more.
  • ⁇ 7> The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the steps (6) and (8) are performed by a column treatment method.
  • ⁇ 8> The method for producing an enzyme stabilizer according to ⁇ 7>, wherein the flow direction of the column is downward flow.
  • ⁇ 9> The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the lignocellulosic biomass is a herbaceous biomass or a processed product thereof.
  • ⁇ 10> The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the polyalkylene glycol is polyethylene glycol.
  • the reaction system of the substrate and the enzyme is obtained by the method for producing an enzyme stabilizer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, and the content of acetic acid in the enzyme stabilizer is 1.
  • a method for stabilizing an enzyme comprising adding an enzyme stabilizer having a furfural content of 39 g/L or less and a furfural content of 0.20 g/L or less.
  • a method for saccharifying lignocellulosic biomass which comprises adding an enzyme stabilizer having a furfural content of 0.20 g/L or less and performing an enzymatic saccharification reaction of lignocellulosic biomass.
  • a first reaction tank having an alkali supply means and configured to react the lignocellulosic biomass and the polyalkylene glycol with the first acid; a first solid-liquid separator; a second reaction vessel configured to react a liquid fraction obtained by solid-liquid separation using the first solid-liquid separation device with a second acid; a second solid-liquid separator; a column filled with a synthetic adsorbent having a water content of 63% by mass or more, a pore size of 250 ⁇ or less, and a specific gravity of 1.09 or less; a first distillation apparatus configured to separate a hydrophilic lignin derivative and an organic eluent and purify the hydrophilic lignin derivative; a second distillation device configured to separate water and the polyalkylene glycol; a pipe configured to supply the water separated by the second distillation device to the first solid-liquid separation device; a pipe configured to supply the polyalkylene glycol separated by the second distillation apparatus to the first reaction vessel; a pipe configured to
  • the enzyme stabilizer of the above aspect and the production method and production apparatus thereof, the enzyme stabilizer can be obtained from which the business profitability is ensured and from which fermentation inhibitors have been removed.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram schematically showing an example of an apparatus for producing an enzyme stabilizer of the present embodiment
  • FIG. 1 is a graph showing the recovery rate of polyethylene glycol (PEG) and the recovery rate of hydrophilic lignin derivatives in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the recovery rate of PEG and the recovery rate of hydrophilic lignin derivatives in Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the recovery rate of PEG and the recovery rate of hydrophilic lignin derivatives in Example 4.
  • PEG polyethylene glycol
  • Enzyme stabilization means that in the reaction between a substrate and an enzyme, the presence of an enzyme stabilizer prevents deactivation of the enzyme and stabilizes the enzyme activity. Specifically, for example, under enzymatic saccharification reaction conditions, the residual enzyme activity is 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, compared to the case where no enzyme stabilizer is used. It means that it is maintained. As the enzymatic saccharification reaction conditions, 15 g of dry weight of bagasse pretreated with dilute sulfuric acid and an enzyme (any added weight) are used to convert the hydrophilic lignin derivative contained in the enzyme stabilizer in the present embodiment into dilute sulfuric acid.
  • enzyme refers to a polymer compound centering on proteins that catalyze chemical reactions, and particularly refers to saccharifying enzymes. Saccharifying enzymes include cellulase that degrades cellulose, hemicellulase that degrades hemicellulose, glucoxidase ( ⁇ -glucoxidase), and amylase that degrades starch. Any cellulase may be used as long as it decomposes cellulose into monosaccharides or oligosaccharides such as glucose.
  • Examples include endoglucanase (EG), cellobiohydrolase (CBH), and ⁇ -glucosidase ( ⁇ -glucosidase; BGL), and from the viewpoint of enzymatic activity, an enzyme mixture having each of these activities is preferable.
  • the hemicellulase may be one that decomposes hemicellulose into monosaccharides such as xylose or oligosaccharides. Enzyme mixtures having each of these activities are preferred from the viewpoint of enzymatic activity.
  • saccharifying enzymes such as cellulase and hemicellulase
  • Tricoderma genus Acremonium genus, Aspergillus genus, Bacillus genus, Pseudomonas cellulase derived from saccharifying enzyme-producing fungi such as filamentous fungi, basidiomycetes, bacteria, etc.
  • saccharifying enzymes such as hemicellulase can be used.
  • the saccharifying enzyme to which the enzyme stabilizer is applied in the present embodiment is preferably cellulase.
  • hydrophilic lignin derivative refers to a coniferyl alcohol skeleton constituting the hydrophilic lignin derivative having a polyalkylene glycol group at any of the ⁇ -position carbons, and having a lignocellulose Among lignin derivatives obtained by adding sulfuric acid to system biomass and polyalkylene glycol having a hydroxyl group at the end, it means a lignin derivative that does not precipitate when the pH is adjusted to 2 or more and 3 or less with sulfuric acid.
  • the hydrophilic lignin derivative those having a weight average molecular weight of 1000 or more and 3200 or less are preferable. When the weight-average molecular weight is at least the above lower limit, the hydrophilicity tends to be more sufficient. Functions can be exhibited more effectively.
  • hydrophobic lignin derivative refers to a coniferyl alcohol skeleton constituting the hydrophobic lignin derivative having a polyalkylene glycol group at any of the ⁇ -position carbons, and having a lignocellulose Of the lignin derivatives obtained by adding sulfuric acid to system biomass and polyalkylene glycol, it means a lignin derivative that precipitates when the pH is adjusted to 2 or more and 3 or less with sulfuric acid.
  • the hydrophobic lignin derivative one having a molecular weight of 4,000 or more and 20,000 or less is preferable.
  • the lignocellulosic biomass may be of any type as long as it is at least one selected from the group consisting of wood biomass, herbaceous biomass, processed products thereof, and waste products thereof. Among them, herbaceous biomass and processed products thereof are preferable as the lignocellulose-based biomass used as a raw material in the method for producing an enzyme stabilizer of the present embodiment.
  • Herbaceous biomass has a shorter cultivation period than wood-based biomass and has a large amount of agricultural residue, so it is possible to stably obtain a large amount of raw materials.
  • the liquid fraction obtained in step (5) described later contains more hydrophilic lignin derivatives and other soluble components than when wood biomass is used as a raw material. Therefore, as in the conventional method, when the dehydrated and concentrated polyalkylene glycol is circulated from the obtained liquid fraction and reused in step (1), the hydrophilic lignin derivative and other soluble components also circulates, the hydrophilic lignin derivative and other soluble components tend to be concentrated. As a result, frequent blowing may be required, and there is concern that the recycling rate of polyalkylene glycol will decrease.
  • the lignocellulosic biomass be finely pulverized (for example, wood flour, etc.).
  • Wood-based biomass includes, for example, cedar, cypress, larch, pine, rice pine, rice cedar, rice hemlock, poplar, white birch, willow, eucalyptus, sawtooth oak, konara oak, oak, seaweed, beech, acacia, bamboo, sasa, and oil palm. , sago palm and the like.
  • Japanese cedar is preferable as a wood plant from the viewpoint of stability of properties.
  • the bark, branches, fruit clusters, fruit shells, etc. of these can also be used.
  • processed materials such as plywood, fiberboard and laminated lumber using these materials can also be used.
  • members dismantled after being used in buildings can also be used.
  • processed products of lignocellulose biomass such as paper and used paper can also be used.
  • Herbaceous biomass includes, for example, rice, wheat, sugar cane, reeds, pampas grass, and corn.
  • Fermentation residues and distillation residues discharged from bioethanol production facilities can be preferably used as herbaceous biomass processed products.
  • a method for producing an enzyme stabilizer containing a hydrophilic lignin derivative of the present embodiment includes the following steps. Step (1) of adding a first acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol to react; Step (2) of adding alkali to the reaction solution obtained in step (1) to neutralize; Step (3) of solid-liquid separation of the neutralized alkaline solution obtained in step (2) to obtain a liquid fraction; Step (4) of adding a second acid to the liquid fraction obtained in step (3); Step (5) of solid-liquid separation of the acidic liquid obtained in the step (4) to obtain a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative; The liquid fraction obtained in the step (5) is brought into contact with a synthetic adsorbent having a water content of 55% by mass or more, a pore diameter of 350 ⁇ or less, and a specific gravity of 1.15 or less, Step (6) of ad
  • the liquid fraction containing the lignin derivative obtained by the acid solvolysis method shown in steps (1) to (3) above was used as it was as an enzyme stabilizer.
  • the inventors further added an acid to the liquid fraction obtained in step (3) to convert the lignin derivative into a hydrophobic fraction (solid fraction). and the hydrophilic fraction (liquid fraction), and that the hydrophilic lignin derivative contained in the hydrophilic fraction (liquid fraction) is suitable as an enzyme stabilizer has been reported in Patent Document 3 etc. so far reported.
  • the polyalkylene glycol used in the acid solvolysis method also serves as a solvent, and a certain amount does not contribute to the reaction and remains in the reaction solution as an unreacted portion.
  • the obtained hydrophilic fraction contains 60% by mass of unreacted polyalkylene glycol relative to the mass of the raw material polyalkylene glycol charged.
  • the cost of polyalkylene glycol accounts for more than half of the manufacturing cost of hydrophilic lignin derivatives, and the recovery and reuse of polyalkylene glycol have been important for securing business profitability.
  • the hydrophilic fraction (liquid fraction) contains fermentation inhibitors such as acetic acid and furfural.
  • fermentation inhibitors such as acetic acid and furfural.
  • a synthetic adsorbent having the above properties is used to adsorb a hydrophilic lignin derivative from the liquid fraction to the synthetic adsorbent, while Since polyalkylene glycols do not adsorb, they can be separated. Furthermore, in the above step (7), by distilling (preferably vacuum distillation) the aqueous solution containing the separated polyalkylene glycol, water and highly pure polyalkylene glycol can be separated and purified. The separated and purified polyalkylene glycol can be reused in the acid solvolysis reaction in step (1) above, and the business profitability, which has been the problem described above, can be ensured. In addition, the water separated in the step (7) can be reused as washing water in the step (3) and the like in the production method of the present embodiment, which contributes to cost reduction.
  • the organic eluent and the hydrophilic lignin derivative with high purity can be separated and purified.
  • the separated and purified hydrophilic lignin derivative has fermentation inhibitors removed as shown in the examples described later, and when used as an enzyme stabilizer, it does not inhibit fermentation in the fermentation process, which is the post-saccharification process. The occurrence of
  • Step (1) a first acid is added to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol for reaction.
  • the polyalkylene glycol is not particularly limited as long as it is polymerized alkylene glycol, but preferably has a terminal hydroxyl group. Examples thereof include polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc., and polyethylene glycol is preferred.
  • the molecular weight of the polyalkylene glycol is not particularly limited as long as it can be used in the production method of the present embodiment.
  • polyalkylene glycols may be commercially available or may be prepared by methods known in the art.
  • a lignin derivative can be obtained in a liquid fraction from lignin in the lignocellulosic biomass by adding a first acid to the lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol and reacting them.
  • the liquid fraction containing the lignin derivative thus obtained contains the hydrophilic lignin derivative and the hydrophobic lignin derivative.
  • the first acid used in step (1) is not particularly limited as long as it can produce a lignin derivative from lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol. Hydrochloric acid, sulfuric acid, etc. are used, and sulfuric acid is preferably used.
  • the amount to be added is usually 0.1 parts by weight or more and 3.0 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of polyalkylene glycol.
  • the amount of polyalkylene glycol to be reacted with lignocellulosic biomass depends on the type of lignin and polyalkylene glycol in the lignocellulosic biomass used and the desired amount. It can be determined depending on the performance of the enzyme stabilizer. For example, the amount of polyalkylene glycol to be added is calculated based on the amount of hydroxyl groups in lignin present in the lignocellulosic biomass to be used and the amount of hydroxyl groups in the polyalkylene glycol to be added. Polyalkylene glycol reacts with the hydroxyl groups attached to the ⁇ carbon atoms of lignin.
  • the amount of polyalkylene glycol is usually 5 parts by weight or more and 100 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or more and 60 parts by weight or less, and 20 parts by weight or more, relative to 10 dry parts by weight of lignocellulose biomass. 50 parts by weight or less is more preferable.
  • reaction temperature is not particularly limited, it is usually 100°C or higher and 200°C or lower, preferably 120°C or higher and 160°C or lower.
  • reaction time is not particularly limited, it is usually 30 minutes or more and 180 minutes or less, preferably 60 minutes or more and 120 minutes or less.
  • step (2) alkali is added to the reaction solution obtained in step (1) to neutralize it.
  • alkali The alkali used in step (2) is not particularly limited as long as it can neutralize the reaction solution obtained in step (1).
  • Examples include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, Examples include magnesium hydroxide and lithium hydroxide.
  • the pH of the reaction solution after adding the alkali is preferably 6 or more and 12 or less, more preferably 6 or more and 10 or less.
  • step (3) the neutralized alkaline solution obtained in step (2) is subjected to solid-liquid separation to obtain a liquid fraction.
  • the method for removing the solid content from the neutralized alkaline solution is not particularly limited as long as the solid content can be removed from the neutralized alkaline solution, but examples include centrifugal separation, screw press, filter press, and permeable membrane.
  • the liquid fraction obtained by removing the solid content in step (3) contains hydrophilic and hydrophobic lignin derivatives, and the hydrophilic lignin derivative can be used as an enzyme stabilizer in this embodiment.
  • step (4) a second acid is added to the liquid fraction obtained in step (3).
  • the second acid used in step (4) is not particularly limited as long as it can acidify the liquid fraction, but an acid capable of adjusting the pH to 1 or more and 4 or less is preferable, and sulfuric acid is particularly preferable.
  • the amount of the second acid added is usually 0.01 parts by weight or more and 3.0 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of the liquid fraction obtained in step (3).
  • step (5) the acidic liquid obtained in step (4) is subjected to solid-liquid separation to obtain a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative.
  • the solid-liquid separation method is not particularly limited as long as it can separate the solid matter generated by adding the second acid, but centrifugation is preferred. Centrifugation is usually carried out at 2000 ⁇ g or more and 20000 ⁇ g or less, preferably 5000 ⁇ g or more and 15000 ⁇ g or less.
  • step (6) the liquid fraction obtained in step (5) is brought into contact with a synthetic adsorbent to adsorb the hydrophilic lignin derivative on the synthetic adsorbent.
  • the synthetic adsorbent has a water content of 55% by mass or more, a pore diameter of 350 ⁇ or less, and a specific gravity of 1.15 or less.
  • the water content of the synthetic adsorbent is 55% by mass or more, preferably 57% by mass or more, more preferably 60% by mass or more, and even more preferably 63% by mass or more. Hydrophilic lignin derivatives can be adsorbed more efficiently because the water content of the synthetic adsorbent is at least the above lower limit.
  • the upper limit of the water content is not particularly limited, but can be, for example, 100% by mass, 90% by mass, 80% by mass, or 75% by mass.
  • the water content of the synthetic adsorbent is the ratio of the weight of water to the wet weight of the synthetic adsorbent expressed as a percentage, and can be measured, for example, by the loss-on-drying method.
  • the pore diameter of the synthetic adsorbent is 350 ⁇ or less, preferably 330 ⁇ or less, more preferably 300 ⁇ or less, and even more preferably 250 ⁇ or less.
  • a hydrophilic lignin derivative can be adsorbed more efficiently because the pore size of the synthetic adsorbent is equal to or less than the above upper limit.
  • the lower limit of the pore size is not particularly limited, but can be, for example, 50 ⁇ , 70 ⁇ , or 100 ⁇ .
  • the pore size of the synthetic adsorbent can be measured, for example, by a gas adsorption method.
  • the specific gravity of the synthetic adsorbent is 1.15 or less, preferably 1.12 or less, more preferably 1.10 or less, and even more preferably 1.09 or less.
  • a hydrophilic lignin derivative can be adsorbed more efficiently because the specific gravity of the synthetic adsorbent is equal to or less than the above upper limit.
  • the lower limit of the specific gravity is not particularly limited, but can be, for example, 1.02, 1.03, 1.04, and 1.05.
  • the specific gravity of the synthetic adsorbent can be measured, for example, by the pycnometer method.
  • the surface area of the synthetic adsorbent is preferably 800 m 2 /g or less, more preferably 700 m 2 /g or less, even more preferably 600 m 2 /g or less, and 570 m 2 /g or less. is particularly preferred.
  • a hydrophilic lignin derivative can be adsorbed more efficiently because the surface area of the synthetic adsorbent is equal to or less than the above upper limit.
  • the lower limit of the surface area is not particularly limited, but can be, for example, 300 m 2 /g, 350 m 2 /g, 400 m 2 /g, or 430 m 2 /g.
  • the surface area of synthetic adsorbents can be measured, for example, by the gas adsorption BET method.
  • Types of synthetic adsorbents include, for example, aromatic synthetic adsorbents, methacrylic acid synthetic adsorbents, and polystyrene synthetic adsorbents.
  • the methacrylic acid-based synthetic adsorbent and the polystyrene-based synthetic adsorbent may have a crosslinked structure with a crosslinker such as divinylbenzene (DVB).
  • Methacrylic acid-based synthetic adsorbents also include methacrylic acid ester-based synthetic adsorbents.
  • the synthetic adsorbent used in the step (6) is excellent in adsorption efficiency of the hydrophilic lignin derivative and desorption efficiency in the subsequent step (8) due to the functional group characteristics and steric structure of the hydrophilic lignin derivative. Therefore, a methacrylic acid-based synthetic adsorbent is preferable.
  • Examples of commercially available synthetic adsorbents having the above-described characteristics include, for example, Mitsubishi Chemical's product name "Diaion HP2MGL” (methacrylic acid ester-based synthetic adsorbent, water content of 55% by mass or more and 65% by mass or less, pore size of 240 ⁇ , Specific gravity 1.09, surface area 570 m 2 /g), trade name “PuroSorb TM PAD610” manufactured by Purolite (methacrylic acid-DVB crosslinked synthetic adsorbent, moisture content 60% by mass or more and 66% by mass or less, pore diameter 300 ⁇ , specific gravity 1.00 12, surface area 490 m 2 /g), "PuroSorb TM PAD 900” (polystyrene-DVB crosslinked synthetic adsorbent, moisture content 67% by mass or more and 73% by mass or less, pore size 220 ⁇ , specific gravity 1.02, surface area 850 m 2 /g), " PuroSorb
  • step (6) in addition to the hydrophilic lignin derivative, some contaminants such as fermentation inhibitors are adsorbed to the synthetic adsorbent. As a result, a part of impurities such as fermentation inhibitors can be removed from the system in the production method of the present embodiment.
  • step (8) which will be described later, the hydrophilic lignin derivative and some of the impurities such as fermentation inhibitors are desorbed and eluted by the organic eluent. Alternatively, it can be removed from the hydrophilic lignin derivative by side cutting or the like.
  • Step (6A)> In the manufacturing method of this embodiment, between steps (6) and (7), it is preferable to further include a step (6A) of washing the synthetic adsorbent by contacting the synthetic adsorbent on which the hydrophilic lignin derivative is adsorbed with water, and recovering the cleaning liquid.
  • the production method of the present embodiment further includes a step (6A), so that the synthetic adsorbent and the hydrophilic lignin derivative remain in the system in which the synthetic adsorbent and the hydrophilic lignin derivative are contacted in step (6).
  • Polyalkylene glycol can be recovered more effectively. That is, since the recovered washing liquid contains a large amount of polyalkylene glycol, in the subsequent step (7), it is mixed with the solution after contact with the synthetic adsorbent in step (6), if necessary. , preferably subjected to distillation.
  • step (7) the solution after contact with the synthetic adsorbent in step (6) (also referred to as flow-through in the case of a column method) is recovered, and then water and polyalkylene glycol are respectively separated from the solution by distillation. To separate.
  • the distillation method in step (7) is not particularly limited as long as it is a method capable of separating water and polyalkylene glycol, and examples thereof include atmospheric distillation and vacuum distillation. Among them, the vacuum distillation method is preferable because the boiling point of water separated by evaporation is relatively low.
  • the separated water is reused as washing water for the solid-liquid separator used in step (3) or step (5).
  • the separated water can also be reused as washing water used in step (6A).
  • the separated polyalkylene glycol is reused in step (1).
  • the production method of the present embodiment can achieve recovery and reuse of polyalkylene glycol, which has accounted for more than half of the production cost so far, and can ensure business profitability.
  • step (8) the organic eluate is brought into contact with the synthetic adsorbent to desorb the hydrophilic lignin derivative adsorbed to the synthetic adsorbent in step (6), and the eluate is recovered.
  • the organic eluent used in step (8) is not particularly limited as long as it can elute the hydrophilic lignin derivative and has a higher affinity with the hydrophilic lignin derivative than the synthetic adsorbent.
  • examples of such an organic eluent include alcohols such as methanol, ethanol, and isopropyl alcohol, acetone, benzene, and mixtures of these with acids or alkalis.
  • the enzyme stabilizer obtained by the production method of the present embodiment is inexpensive and easily available, and is especially put into the saccharification process during bioethanol production, so it adversely affects the saccharification process and the subsequent fermentation process. Ethanol is particularly preferred because it is relatively safe and does not affect Moreover, ethanol has a relatively low boiling point of 79° C. under atmospheric pressure, and can be recovered in the subsequent step (9) while suppressing energy consumption.
  • the organic eluent may be used in the form of a mixed solution with water, but since the desorption efficiency of the hydrophilic lignin derivative is more excellent, it is preferable that the concentration of the organic eluent is higher. is preferably 90% by mass or more, more preferably 95% by mass or more, even more preferably 99% by mass or more, and 99.5% by mass of the total mass of the solution. It is particularly preferable that it is above.
  • Step (6), step (6A), and step (8) are not particularly limited as long as they are under the optimum temperature of the synthetic adsorbent, but are preferably carried out at a temperature of 20°C or higher and 40°C or lower, and 23°C. It is more preferable to carry out at a temperature of 27° C. or higher.
  • Step (6), step (6A), and step (8) may be a batch processing method or a column processing method. is preferably
  • the direction of liquid flow through the column may be either upward flow or downward flow, but downward flow is preferable because the equipment power is smaller and the recovery rate of polyalkylene glycol is further improved. .
  • step (9) the hydrophilic lignin derivative and the organic eluate are separated from the eluate obtained in step (8) by distillation to purify the hydrophilic lignin derivative.
  • the distillation method in step (7) is not particularly limited as long as it is a method capable of separating the hydrophilic lignin derivative and the organic eluent.
  • Examples thereof include atmospheric distillation and vacuum distillation.
  • the vacuum distillation method is preferable because the boiling point of the organic eluent to be evaporated and separated, particularly ethanol, is relatively low.
  • the eluate obtained in step (8) also contains some contaminants such as fermentation inhibitors, but most of them are volatilized by distillation in step (9) or extracted by side cutting, removed.
  • the purified hydrophilic lignin derivative may be completely dried by a conventionally used drying method such as a freeze dryer.
  • step (10) the organic eluent separated in step (9) is reused in step (8). Manufacturing costs can be reduced by reusing the separated organic eluent in step (8).
  • the enzyme stabilizer of the present embodiment is obtained by the method for producing an enzyme stabilizer described above.
  • the enzyme stabilizer of the present embodiment has reduced fermentation inhibitors (eg, acetic acid, furfural, etc.). Specifically, the content of acetic acid in the enzyme stabilizer is 1.39 g. /L or less, and the content of furfural is 0.20 g/L or less.
  • the enzyme stabilizer obtained by the method for producing the enzyme stabilizer described above it may be used in the form of an aqueous solution, or it may be dried and pulverized before use.
  • Any additive may be added to the enzyme stabilizer of the present embodiment as long as it does not impair its performance.
  • additives include pH adjusters, antioxidants, water-soluble or water-insoluble carriers, dispersants, water-soluble inorganic or organic acid salts of metals, and the like.
  • pH adjusters examples include citric acid, sodium citrate, and potassium citrate. These may be used alone or in combination of two or more.
  • antioxidants examples include butylhydroxytoluene, distyrenated cresol, sodium sulfite and sodium hydrogensulfite. These may be used alone or in combination of two or more.
  • water-soluble or water-insoluble carriers examples include water, alcohols (ethanol, isopropyl alcohol, etc.), diols (e.g., ethylene glycol, 1,2-propanediol, 1,6-hexanediol), other polyols (e.g., , polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc.), ethers (e.g., dipropylene glycol monomethyl ether, etc.), ketones (e.g., cyclohexanone, etc.), esters (e.g., dimethyl succinate, dimethyl adipate, etc.), nitrogen-containing compounds ( Water-soluble carriers such as N-methyl-2-pyrrolidone, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, etc.; aliphatic and aromatic hydrocarbon solvents (eg, pentane, hexane, heptane, xylene, toluene, dodecyl) benzene, mineral
  • Dispersants include, for example, acrylate homopolymers, acrylate copolymers, mixtures thereof, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • inorganic or organic acid salts of water-soluble metals include alkali metal salts such as sodium and potassium, alkaline earth metal salts such as magnesium, and alkanolamine salts such as mono-, di-, and triethanolamine salts. . These may be used alone or in combination of two or more.
  • the solid fraction remaining after the solid-liquid separation in step (5) contains a hydrophobic lignin derivative. If necessary, the solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative may be completely dried by a conventionally used drying method such as a freeze dryer.
  • the concentration of the hydrophobic lignin derivative in the solid fraction can be calculated by the following formula.
  • the hydrophobic lignin derivative contained in the solid fraction can be used, for example, as a functional raw material for heat-resistant films, cement dispersants, thermosetting resins, and the like.
  • the method for stabilizing an enzyme of this embodiment includes adding an enzyme stabilizer obtained by the method for producing an enzyme stabilizer described above to a reaction system between a substrate and an enzyme.
  • the hydrophilic lignin derivative used in the enzyme stabilization method of the present embodiment is basically the same as the hydrophilic lignin derivative used in the enzyme stabilizer obtained by the method for producing the enzyme stabilizer described above. It has a configuration and operational effects. Therefore, description of the same content as the method for producing the enzyme stabilizer described above will be omitted as appropriate.
  • saccharifying enzymes are preferable, and cellulase is particularly preferable.
  • Cellulose is preferred as the substrate for the enzymatic reaction, and lignocellulosic biomass is particularly preferred.
  • the amount of the enzyme stabilizer used in the enzyme stabilization method of the present embodiment is arbitrary, but for example, the amount of hydrophilic lignin contained in the enzyme stabilizer is
  • the weight of the derivative is preferably 0.1% by weight or more and 3.0% by weight or less, more preferably 0.2% by weight or more and 1.0% by weight or less, and further preferably 0.3% by weight or more and 0.7% by weight or less. preferable.
  • the concentration of the hydrophilic lignin derivative added to the reaction solution can be calculated by the following formula.
  • the lignocellulosic biomass saccharification method of the present embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as the "saccharification method of the present embodiment") is obtained by adding an enzyme stabilizer obtained by the above-described method for producing an enzyme stabilizer. and enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass.
  • the enzyme stabilizer used in the saccharification method of the present embodiment can prevent enzyme deactivation and stabilize enzyme activity. Therefore, according to the saccharification method of the present embodiment, it is possible to reuse the used enzyme or reduce the amount of enzyme used.
  • the “enzymatic saccharification method of lignocellulosic biomass” may be any method as long as it enzymatically saccharifies lignocellulosic biomass. It may be a saccharification method (method for producing ethanol) described in the publication (reference document 1). The contents of reference 1 are incorporated herein by reference.
  • the saccharification method of this embodiment includes, for example, the following steps.
  • (b) and Step (c) of adding yeast to the obtained sugar solution and fermenting it to produce ethanol.
  • the saccharification efficiency can be examined by calculating the C6 saccharification rate.
  • the C6 saccharification rate indicates the ratio of the amount of glucose produced through saccharification from cellulose (in terms of glucose) in the pretreated biomass.
  • xylose C5 sugar
  • the enzymatic saccharification efficiency should be examined by the C6 saccharification rate.
  • the enzyme stabilizer used in the saccharification method of the present embodiment has the same configuration and effects as the enzyme stabilizer specifically described in the method for producing the enzyme stabilizer described above. Therefore, description of the same content as the method for producing the enzyme stabilizer described above will be omitted as appropriate.
  • the amount of the enzyme stabilizer used in the saccharification method of the present embodiment is arbitrary, but for example, the weight of the hydrophilic lignin derivative contained in the enzyme stabilizer is enzymatically saccharified. Based on the weight, it is preferably 0.1% by weight or more and 3.0% by weight or less, more preferably 0.2% by weight or more and 1.0% by weight or less, and further 0.3% by weight or more and 0.7% by weight or less. preferable. When the addition amount is within the above numerical range, the adsorption of the enzyme to the biomass component can be further suppressed, and the activity of the enzyme can be further improved.
  • the weight of the hydrophilic lignin derivative can be calculated by the method described in the enzyme stabilization method described above.
  • Any enzyme having cellulase, hemicellulase, or ⁇ -glucoxidase activity can be used as the saccharification enzyme used in the saccharification method of the present embodiment.
  • these saccharifying enzyme-producing bacteria include aerobic Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Irpex, and Acremonium.
  • the amount of saccharification enzyme used in the saccharification reaction is adjusted so that 5 units or more and 50 units or less of cellulase activity are included per 1 g of cellulose of the lignocellulosic biomass that serves as the raw material substrate.
  • the saccharified liquid obtained by the saccharification method of this embodiment can be used as a raw material for ethanol fermentation, lactic acid fermentation, amino acid fermentation, butanol fermentation, isobutanol fermentation, and the like. Below, the case where it uses for ethanol fermentation is demonstrated.
  • the saccharified liquid obtained above is fermented. Since the optimum temperature for the saccharification reaction differs from the optimum temperature for fermentation, the saccharification reaction is performed at a temperature suitable for the saccharification reaction, preferably 40° C. or higher and 60° C. or lower.
  • the pH of the reaction solution is also adjusted under conditions suitable for the saccharification reaction, preferably 4 or more and 7 or less.
  • the saccharification reaction solution is taken out and supplied to the fermenter.
  • the ethanol-fermenting bacteria in the fermenter may or may not be immobilized, but are preferably immobilized. Fermentation conditions are carried out under conditions suitable for ethanol fermentation.
  • the pH is preferably 4 or more and 8 or less, and the temperature is preferably 20°C or more and 40°C or less. Ethanol produced during ethanol fermentation can also be separated and recovered.
  • the saccharified liquid can be fermented and ethanol can be produced.
  • ethanol-fermenting bacteria include Saccharomyces, Zymomonas, and Pichia. Genetically modified ones can also be used if alcoholic fermentation is possible.
  • These ethanol-fermenting bacteria are desirably pre-cultured in a liquid medium before ethanol fermentation to increase the amount of bacteria. The greater the amount of ethanol-fermenting bacteria input, the higher the fermentation efficiency, and it is preferable to secure an amount of bacteria that can completely convert the sugar produced by the saccharification reaction into ethanol at the same time.
  • the saccharification reaction and ethanol fermentation can be performed simultaneously by adding ethanol-fermenting bacteria together with the above saccharifying enzyme. Simultaneous saccharification and fermentation may be performed in the same reactor for saccharification reaction and fermentation, or may be performed in separate reactors for saccharification reaction and fermentation.
  • the pH and temperature of the reaction solution should be such that both the saccharification reaction and fermentation can work.
  • priority is given to the fermentation conditions of the ethanol-fermenting bacteria, and the pH is preferably 4 or more and 7 or less, and the temperature is preferably 20°C or more and 40°C or less.
  • the simultaneous saccharification and fermentation under anaerobic conditions, it is possible to suppress the growth of saccharifying enzyme-producing bacteria, which are aerobic bacteria, and to suppress the consumption of sugar accompanying the growth of saccharifying enzyme-producing bacteria.
  • stirring the simultaneous saccharification and fermentation facilitates the progress of the saccharification reaction, resulting in better ethanol productivity.
  • Simultaneous saccharification and fermentation can also be performed while separating and recovering the produced ethanol. This method can simplify the manufacturing process because all saccharification reactions and ethanol fermentation can be performed in one reactor.
  • the saccharification reaction is performed at a temperature suitable for the saccharification reaction, preferably at 40°C or higher and 60°C or lower.
  • the pH of the reaction solution is the same as the fermentation conditions, preferably 4 or more and 6 or less.
  • the saccharification reaction solution is continuously taken out and supplied to the fermenter.
  • the ethanol-fermenting bacteria in the fermenter may or may not be immobilized, but are preferably immobilized. Fermentation conditions are preferably pH 4 or higher and 7 or lower and temperature 20° C. or higher and 35° C. or lower.
  • the ethanol fermentation liquid is returned to the saccharification reaction tank again, and saccharification reaction and fermentation are performed simultaneously. At that time, the produced ethanol can also be separated and recovered.
  • the lignocellulose-based biomass in the reactor is decomposed and reduced, so it is desirable to aseptically charge the lignocellulose-based biomass into the reactor as needed to continue the reaction.
  • ethanol In fermentation, ethanol accumulates in the reactor, and fermentation is suppressed when the ethanol concentration rises. Therefore, fermentation may be performed while separating and recovering ethanol from the fermentation broth. In that case, a pervaporation membrane may be used, or an evaporation device may be used. At that time, it is preferable to operate at 50° C. or less at which the fermenting microorganisms are not deactivated. However, if the fermentation broth after recovering ethanol is not returned to the reactor, this is not the case, and the temperature suitable for recovering ethanol can be used. In addition, since fermenting microorganisms remain in the liquid after ethanol recovery, it is desirable to aseptically return the liquid to the reactor for reuse. Enzymes and fermenting microorganisms may be added aseptically as needed.
  • insoluble residue accumulates in the reactor and suppresses stirring efficiency, so it may be removed using a centrifuge or the like.
  • cellulose may be mixed with the raw material lignocellulose biomass, or may be decomposed by adding a culture solution of saccharifying enzyme-producing bacteria.
  • the recovered ethanol can be distilled with a distillation device.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram schematically showing an example of an apparatus for producing an enzyme stabilizer according to this embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram schematically showing an example of an apparatus for producing an enzyme stabilizer according to this embodiment.
  • each configuration of the apparatus for producing an enzyme stabilizer according to this embodiment will be described with reference to FIG.
  • the enzyme stabilizer manufacturing apparatus 100 of the present embodiment includes a first reaction tank 1, a first solid-liquid separation device 2, a second reaction tank 3, a second solid-liquid separation device 4, A column 5, a first distillation device 6, a second distillation device 7, and a pipe 14c configured to supply water separated by the second distillation device 7 to the first solid-liquid separation device 2. and a pipe 14d configured to supply the polyalkylene glycol separated by the second distillation device 7 to the first reaction vessel 1, and the organic eluent separated by the first distillation device 6 to the column 5 a pipe 13c configured to supply to the
  • the first reaction tank has alkali supply means 1a.
  • an enzyme stabilizer from which fermentation inhibitors have been removed can be obtained while securing business profitability.
  • the first reaction vessel 1 is configured to react the lignocellulosic biomass and the polyalkylene glycol with the first acid.
  • the lignocellulosic biomass, polyethylene glycol, and first acid are the same as those described for the enzyme stabilizer above.
  • the amount of polyalkylene glycol to be added is not particularly limited, and is usually 5 parts by weight or more and 100 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or more and 60 parts by weight or less, with respect to 10 parts by dry weight of lignocellulose biomass. It is more preferable that the amount is not less than 50 parts by weight and not more than 50 parts by weight.
  • the amount of the first acid to be added is, for example, 0.1 parts by weight or more and 0.3 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of the polyalkylene glycol.
  • the first reaction tank 1 is not particularly limited as long as it is acid-resistant.
  • the first reaction tank 1 may have a stirring mechanism such as a stirring blade.
  • the temperature of the reaction liquid in the first reaction tank 1 is not particularly limited, and is usually 100° C. or higher and 200° C. or lower, preferably 120° C. or higher and 160° C. or lower.
  • the first reaction tank 1 may be equipped with a temperature control device or a thermometer 1b.
  • the first reaction tank 1 has alkali supply means 1a. Furthermore, as shown in FIG. 1, a lignocellulose-based biomass supply means 1c, a polyalkylene glycol supply means 1d, a first acid supply means 1e, and the like may be provided.
  • the first reaction tank 1 may have a pH meter.
  • a pH meter may be used in order to measure the pH of the reaction solution after alkali supply and appropriately adjust the amount of alkali supply.
  • the alkali supply means 1a is arranged in the first reaction tank 1 and configured to supply the alkali to the first reaction tank 1 .
  • the reaction liquid can be neutralized and the lignin derivative can be extracted to the liquid side after the production reaction of the lignin derivative is completed in the first reaction tank 1 .
  • the alkali is the same as those exemplified in the method for producing the enzyme stabilizer described above.
  • the pH of the reaction solution after alkali supply is preferably pH 6 or more and 12 or less, more preferably pH 6 or more and 10 or less.
  • the alkali supply means 1a may have a pump, a valve, etc. for adjusting the supply amount of alkali.
  • the first solid-liquid separator 2 is configured to remove a solid fraction from the reaction liquid. By passing the reaction liquid through the first solid-liquid separator 2, a liquid fraction containing the lignin derivative can be obtained.
  • the first solid-liquid separator 2 is not particularly limited as long as the solid fraction can be removed from the neutralized alkaline solution, but examples include centrifugal separation, screw press, filter press, and the like.
  • the second reaction tank 3 is configured to react the liquid fraction obtained by solid-liquid separation using the first solid-liquid separation device 2 with the second acid.
  • the second reaction tank 3 may have a second acid supply means 3a.
  • the second acid supply means 3a may have a pump, valve, etc. for adjusting the supply amount of the second acid.
  • the amount of the second acid to be added is, for example, 0.01 parts by weight or more and 3.0 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of the liquid fraction.
  • the second reaction tank 3 is not particularly limited as long as it is acid-resistant.
  • the second reaction vessel 3 may have a stirring mechanism such as a stirring blade.
  • the second solid-liquid separator 4 is configured to solid-liquid separate the reaction liquid (acidic liquid) obtained in the second reaction tank 3 to remove solid matter. By passing the acidic liquid through the second solid-liquid separator 4, a liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative can be obtained.
  • the second solid-liquid separation device 4 is not particularly limited as long as it is a device that can separate the solid matter generated by adding acid, but examples thereof include a centrifugal separator.
  • the column 5 is filled with a synthetic adsorbent having a water content of 63% by mass or more, a pore size of 250 ⁇ or less, and a specific gravity of 1.09 or less.
  • the organic eluent used for elution of the synthetic adsorbent and hydrophilic lignin derivative is the same as those exemplified in the method for producing the enzyme stabilizer described above.
  • the size and material of the column 5 are not particularly limited as long as they are acid-resistant.
  • the temperature in the column 5 is not particularly limited as long as it is under the optimum temperature of the synthetic adsorbent, but is preferably 20°C or higher and 40°C or lower, more preferably 23°C or higher and 27°C or lower.
  • the adsorption efficiency and desorption efficiency of the hydrophilic lignin derivative to the synthetic adsorbent can be further improved.
  • the column 5 may be equipped with a temperature control device such as a column oven or a thermometer.
  • the first distillation device 6 is configured to separate the hydrophilic lignin derivative and the organic eluent and to purify the hydrophilic lignin derivative.
  • the first distillation device 6 is not particularly limited as long as it can evaporate the organic eluent while leaving the hydrophilic lignin derivative in the solution. It may have a structure in which a shelf (tray) is provided, or may have a structure in which a filling material is filled.
  • the steam rising from the bottom of the tower causes the volatile components introduced and the top of the tower to flow down.
  • the incoming internal reflux liquid is heated to generate vapor containing a large amount of the low boiling point organic solvent.
  • Vapor from the bottom of the column is condensed with a large amount of high-boiling-point water. That is, heat exchange and mass exchange take place on each shelf (tray), with low boiling point components becoming richer toward the top of the column and higher boiling point components becoming richer toward the bottom of the column.
  • the overhead fraction rich in low boiling point components from the top of the tower is taken out of the apparatus through a pipe and condensed in a condenser or the like.
  • the condensed overhead fraction is returned to the first distillation apparatus by a reflux pump or the like through a pipe and a constant amount through a regulator and a control valve for adjusting the reflux amount.
  • the reflux pump, regulator and control valve may be collectively referred to as a reflux amount adjusting mechanism.
  • the remaining overhead fraction is withdrawn at a constant flow rate through a regulator and control valve (not shown) that regulate the flow rate of the remaining overhead fraction as a regenerated organic eluent that is recycled to column 5. .
  • the regulators and control valves that regulate the flow of the remaining overhead fraction may be collectively referred to as a regenerated organic eluent flow regulation mechanism (not shown).
  • the extraction flow rate can be changed according to the usage amount of the regenerated organic eluent used in the column 5 by the regenerated organic eluent flow rate control mechanism.
  • the regenerated organic eluent referred to here may be a mixed solution of the organic eluent and water, or may be a solution consisting only of the organic eluent, but the desorption efficiency of the hydrophilic lignin derivative can be further improved. Therefore, it is preferable to use a solution consisting only of an organic eluent.
  • heating steam is supplied to the reboiler (reboiler) at a constant flow rate by a regulator and a control valve that adjust the flow rate of the reboiler heating steam. It will be supplied to one distillation device 6 .
  • This regulator and control valve may be collectively referred to as a reboiler heating rate control mechanism. Steam containing a large amount of water generated from the reboiler by this heat source is generated in a constant amount, and is brought into contact with the reflux liquid from above in the column on each tray, and the distillation operation is performed while heat and substance are exchanged. The amount of generated steam is adjusted by the reboiler heating amount based on the reboiler heating steam amount of the heat source.
  • the second distillation device 7 is arranged to separate water and polyalkylene glycol.
  • the second distillation device 7 is not particularly limited as long as it can evaporate water while leaving the polyalkylene glycol in the solution. ) may be provided, or a structure filled with a filler may be used.
  • the piping arranged in the apparatus for producing an enzyme stabilizer of the present embodiment is not particularly limited as long as it is made of a material having acid resistance or heat resistance depending on the location where it is arranged.
  • the enzyme stabilizer production apparatus of the present embodiment is not limited to the production apparatus 100 shown in FIG. A part of the configuration may be changed or deleted, or another configuration may be added to what has been described so far.
  • the production apparatus 100 may further include a tank 13d configured to store the organic eluent evaporated and recovered in the first distillation apparatus 6.
  • the tank 13d By providing the tank 13d, the organic eluent can be stored until it is passed through the column 5 at a desired timing.
  • the concentration of the organic eluent to be passed can be kept constant.
  • the manufacturing apparatus 100 may further include a tank 14a configured to store the water evaporated and recovered by the second evaporator 7. By providing the tank 14a, water can be stored until the first solid-liquid separation device 2 is washed at a desired timing.
  • the manufacturing apparatus 100 may further include a tank configured to store the flow-through obtained by passing the liquid fraction through the column 5 and the washing liquid obtained by passing the washing water through the column 5 in the middle of the pipe 13b. good.
  • a tank configured to store the flow-through obtained by passing the liquid fraction through the column 5 and the washing liquid obtained by passing the washing water through the column 5 in the middle of the pipe 13b. good.
  • the manufacturing apparatus 100 includes a pipe configured to supply water from the tank 14a to the second solid-liquid separation device 4, and a pipe configured to supply water from the tank 14a to the column 5. You may also prepare. By providing these pipes, water can be reused as washing water in each manufacturing process.
  • a method for manufacturing an enzyme stabilizer using the enzyme stabilizer manufacturing apparatus 100 shown in FIG. 1 will be described below.
  • lignocellulose-based biomass, polyalkylene glycol, and a first acid are added to the first reaction tank 1 by means of the lignocellulose-based biomass supply means 1c, the polyalkylene glycol supply means 1d, and the first acid supply means 1e.
  • the kind, addition amount, reaction temperature and reaction time of each material are as described in the method for producing the enzyme stabilizer described above. The above materials are reacted to produce a lignin derivative.
  • alkali is added from the alkali supply means 1a to the reaction liquid containing the lignin derivative after the reaction to neutralize the reaction liquid, and the lignin derivative is extracted to the liquid side.
  • the type and amount of alkali to be added are as described in the method for producing the enzyme stabilizer described above.
  • the neutralized and extracted reaction liquid is sent to the first solid-liquid separator 2 through the pipe 9a while adjusting the amount of liquid sent by the pump 9b.
  • a solid fraction is removed from the sent reaction liquid to obtain a liquid fraction.
  • the solid content is discharged through pipe 10a.
  • the obtained liquid fraction is sent to the second reaction tank 3 via the pipe 10b, and the second acid is added by the second acid supply means 3a.
  • the reaction liquid (acidic liquid) is sent to the second solid-liquid separation device 4 via a pipe 11, where solids containing unreacted lignin and hydrophobic lignin derivatives are separated as a solid fraction via a pipe 12a. Ejected.
  • the obtained liquid fraction contains unreacted polyalkylene glycol in addition to the hydrophilic lignin derivative. Therefore, the liquid fraction is sent to column 5 via pipe 12b. By passing the liquid fraction through the column 5, the hydrophilic lignin derivative is adsorbed on the synthetic adsorbent during the liquid fraction. On the other hand, the flow-through that has passed through the column 5 is sent to the second distillation device 7 via the pipe 13b.
  • the synthetic adsorbent in the column is washed, and the polyalkylene glycol remaining in the column 5 is recovered more efficiently. be able to.
  • the washing liquid passed through the column 5 is sent to the second distillation device 7 via the pipe 13b, like the flow-through described above.
  • an organic eluent is passed through the column 5 to elute the hydrophilic lignin derivative adsorbed to the synthetic adsorbent.
  • the obtained eluate is sent to the first distillation device 6 through the pipe 13a, and the organic eluent is discharged from the top of the column by evaporation.
  • hydrophilic lignin derivatives are concentrated in the solution remaining at the bottom of the tower.
  • the concentrated and purified hydrophilic lignin derivative can be used as it is as an enzyme stabilizer in the saccharification step of bioethanol production.
  • hydrophilic lignin derivative is of high purity from which contaminants such as fermentation inhibitors have been removed, it is possible to prevent enzyme deactivation, stabilize enzyme activity, and improve saccharification efficiency and subsequent fermentation. Efficiency can be improved.
  • the flow-through and washing liquid are sent to the second distillation apparatus 7 via the pipe 13b, and water is discharged from the top of the tower by evaporation.
  • the discharged water is condensed and cooled by a condenser 8, sent to a tank 14a through a pipe 14b, and stored.
  • the water stored in the tank 14a is sent to the first solid-liquid separator 2 through the pipe 14c at desired timing and used as washing water.
  • polyalkylene glycol is concentrated in the solution remaining at the bottom of the column.
  • the concentrated and purified polyalkylene glycol is sent to the polyalkylene glycol supply means 1d through the pipe 14d and stored.
  • the polyalkylene glycol stored in the polyalkylene glycol supply means 1d is added to the first reaction tank 1 at a desired timing and used for the acid solvolysis reaction.
  • the production method of the present embodiment can achieve recovery and reuse of polyalkylene glycol, which has accounted for more than half of the production cost so far, and can ensure business profitability.
  • Example 1 (Study of synthetic adsorbent 1) 1. Preparation of hydrophilic lignin derivative 746.26 g of polyethylene glycol 400 (PEG400, manufactured by Lion Corporation) and 3.74 g of 95 mass% sulfuric acid were added to 250 g of bagasse dry weight, heated to 150 ° C., and stirred for 90 minutes to react. . After completion of the reaction, 1500 mL of 0.2N aqueous sodium hydroxide solution was added for neutralization, and the lignin derivative was extracted. The resulting reaction solution was centrifuged (3000 ⁇ g, 15 minutes) to remove solids. 3N sulfuric acid was added to the resulting supernatant until pH2. A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative was obtained by centrifuging the precipitate precipitated by sulfuric acid at 13000 ⁇ g for 15 minutes.
  • PEG400 polyethylene glycol 400
  • Step (6) When liquid fraction is passed through (* Collect flow-through after passing through) Liquid fraction: 80 mL Incubator temperature: 40°C Liquid feeding speed: 3.35 mL/min Space velocity (S.V.): 5 L/h/L of filled resin
  • Step (8) When passing the organic eluent (* Collect the eluate after passing) Organic eluent: 160 mL of 80 wt% ethanol Incubator temperature: 40°C Liquid feeding rate: 2.01 mL/min Space velocity (S.V.): 3 L/h/L of filled resin
  • the flow-through after passing the liquid fraction was analyzed by HPLC, and the concentrations of PEG400 contained in the liquid fraction before passing the liquid and in the flow-through were measured. Analysis conditions by HPLC are as shown below.
  • HPLC Shimadzu high-performance liquid chromatograph system (detector RID)
  • the eluate after passage of the organic eluent was analyzed by a non-reducing method, and the concentration of the hydrophilic lignin derivative contained in the liquid fraction before passage and in the eluate was measured. Specifically, an arbitrary volume of a sample was adjusted to 10 mL with a mixture of 2-propanol and 0.2 M sodium hydroxide (volume ratio 1:1). From there, 2 mL was weighed out, 120 ⁇ L of acetic acid was added, and the mixed solution of 2-propanol and distilled water (volume ratio 1:1) was added to a constant volume of 25 mL. Absorbance was measured at 280 nm, and the lignin concentration was determined by the following formula.
  • the PEG recovery rate is 40% by mass.
  • the recovery rate of the hydrophilic lignin derivative was 60% by mass or more, which was good.
  • the PEG recovery rate was more than 55% by mass, and the recovery rate of the hydrophilic lignin derivative was 80% by mass or more, which was particularly favorable.
  • Example 2 (Study of synthetic adsorbent 2) 1. Preparation of hydrophilic lignin derivative (1) Preparation of hydrophilic lignin derivative (derived from Napia) To 250 g of dry weight of Napier, 746.26 g of polyethylene glycol 400 (PEG400, manufactured by Lion Corporation) and 3.74 g of 95% by mass sulfuric acid were added, and 150 °C and stirred for 90 minutes to react. After completion of the reaction, 1500 mL of 0.2N aqueous sodium hydroxide solution was added for neutralization, and the lignin derivative was extracted. The resulting reaction solution was centrifuged (3000 ⁇ g, 15 minutes) to remove solids. 3N sulfuric acid was added to the resulting supernatant until pH2. A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative was obtained by centrifuging the precipitate precipitated by sulfuric acid at 13000 ⁇ g for 15 minutes.
  • PEG400 polyethylene glycol 400
  • hydrophilic lignin derivative (derived from bagasse fermentation residue) 746.26 g and 95 g of polyethylene glycol 600 (PEG600, manufactured by Lion Corporation) were added to 250 g of dry weight of fermentation residue discharged after fermentation by subjecting bagasse to bioethanol production. 3.74 g of mass % sulfuric acid was added, heated to 150° C., and stirred for 90 minutes to react. After completion of the reaction, 1500 mL of 0.2N aqueous sodium hydroxide solution was added for neutralization, and the lignin derivative was extracted. The resulting reaction solution was centrifuged (3000 ⁇ g, 15 minutes) to remove solids. 3N sulfuric acid was added to the resulting supernatant until pH2. A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative was obtained by centrifuging the precipitate precipitated by sulfuric acid at 13000 ⁇ g for 15 minutes.
  • PEG600 polyethylene glycol 600
  • Step (6) When liquid fraction is passed through (* Collect flow-through after passing through) Liquid fraction: 80 mL Incubator temperature: 40°C Liquid feeding rate: 2.01 mL/min Space velocity (S.V.): 3 L/h/L of filled resin
  • Step (8) When passing the organic eluent (* Collect the eluate after passing) Organic eluent: 160 mL of 80 wt% ethanol Incubator temperature: 40°C Liquid feeding rate: 2.01 mL/min Space velocity (S.V.): 3 L/h/L of filled resin
  • the flow-through after passing through the liquid fraction was analyzed by HPLC, and the content of PEG400 or PEG600 contained in the liquid fraction before passing through, in the washing solution, and in the flow-through was measured. Analysis conditions by HPLC are as shown below.
  • HPLC Shimadzu high-performance liquid chromatograph system (detector RID)
  • the eluate after passing the organic eluent was analyzed by a non-reducing method, and the concentrations of the hydrophilic lignin derivatives contained in the liquid fraction before passing and the eluate were measured. Specifically, the same method as the method shown in Example 1 was used for the measurement. Then, the recovery rate (% by mass) of the hydrophilic lignin derivative was calculated using the formula shown below. The results are shown in FIG. 3 (upper: derived from Napier, lower: derived from bagasse fermentation residue).
  • the PEG recovery rate is 90% by mass or more, and the recovery rate of the hydrophilic lignin derivative is 75% even when any synthetic adsorbent is used. It was more than mass % and was favorable.
  • the hydrophilic lignin derivative derived from bagasse
  • the PEG recovery rate is 90% by mass or more, and the recovery rate of the hydrophilic lignin derivative is 80% by mass. % or more, which was good.
  • the PEG recovery rate and the recovery rate of the hydrophilic lignin derivative are either also tended to be particularly good.
  • Example 3 (Simple distillation test using eluate) Of the synthetic adsorbents shown in Example 2, a simple distillation test was performed on 120 mL of the eluate obtained using PAD950.
  • the simple distillation conditions are as follows.
  • lignin was analyzed by the non-reducing method shown in Example 1, and other components were analyzed by HPLC under the conditions shown in Example 1. Table 2 shows the results.
  • Example 4 (Examination of various conditions for column treatment) 1. Preparation of hydrophilic lignin derivative 746.26 g of polyethylene glycol 400 (PEG400, manufactured by Lion Corporation) and 3.74 g of 95 mass% sulfuric acid were added to 250 g of bagasse dry weight, heated to 150 ° C., and stirred for 90 minutes to react. . After completion of the reaction, 1500 mL of 0.2N aqueous sodium hydroxide solution was added for neutralization, and the lignin derivative was extracted. The resulting reaction solution was centrifuged (3000 ⁇ g, 15 minutes) to remove solids. 3N sulfuric acid was added to the resulting supernatant until pH2. A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative was obtained by centrifuging the precipitate precipitated by sulfuric acid at 13000 ⁇ g for 15 minutes.
  • PEG400 polyethylene glycol 400
  • the flow-through after passing the liquid fraction was analyzed by HPLC, and the content of PEG400 contained in the liquid fraction before passing, in the washing liquid, and in the flow-through was measured.
  • the same method as the method described in Example 2 above was used for the analysis conditions by HPLC and the method for calculating the PEG recovery rate. The results are shown in FIG. 4 (right).
  • the eluate after passage of the organic eluent was analyzed by a non-reducing method, and the concentration of the hydrophilic lignin derivative contained in the liquid fraction before passage and in the eluate was measured.
  • the method described in Example 1 was used for the details of the analysis by the non-reducing method.
  • the calculation method of the recovery rate (% by mass) of the hydrophilic lignin derivative used the same method as the method described in Example 2 above. The results are shown in FIG. 4 (left).
  • the PEG recovery rate was 80% by mass or more, and the hydrophilic lignin derivative recovery rate was 75% by mass or more, which was favorable.
  • the PEG recovery rate is 90 mass. %, and the recovery rate of the hydrophilic lignin derivative was 90% by mass or more, which was particularly good.
  • the enzyme stabilizer and its production method and production apparatus of the present embodiment business profitability is ensured, and an enzyme stabilizer from which fermentation inhibitors have been removed can be obtained.
  • 1 first reaction tank, 1a: alkali supply means, 1b: thermometer, 1c: lignocellulosic biomass supply means, 1d: polyalkylene glycol supply means, 1e: first acid supply means, 2: first Solid-liquid separation device, 3: second reaction vessel, 3a: second acid supply means, 4: second solid-liquid separation device, 5: column, 6: first distillation device, 7: second distillation Apparatus, 8: condenser (condenser), 9a, 10a, 10b, 11, 12a, 12b, 13a, 13b, 13c, 14b, 14d, 14c: piping, 9b: pump, 13d, 14a: tank, 100: enzyme stabilization manufacturing equipment for chemical agent

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Abstract

酵素安定化剤の製造方法は、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールを用いて酸加溶媒分解法を行い、リグニン誘導体を得る工程（１）～（３）；工程（３）で得られた液分画に第二の酸を添加する工程（４）；酸性液を固液分離して、液分画を得る工程（５）；液画分中の親水性リグニン誘導体を、特定の性質を有する合成吸着剤に吸着させる工程（６）；工程（６）後の溶液から蒸留により水及びポリアルキレングリコールをそれぞれ分離し、再利用する工程（７）；有機溶離液を合成吸着剤に接触させて、親水性リグニン誘導体を脱着させて、溶出液を回収する工程（８）；溶出液から蒸留により親水性リグニン誘導体を精製する工程（９）；及び、分離された有機溶離液を工程（８）に再利用する工程（１０）；を含む。

Description

酵素安定化剤の製造方法、酵素安定化剤、酵素の安定化方法、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、及び酵素安定化剤の製造装置
　本発明は、酵素安定化剤の製造方法、酵素安定化剤、酵素の安定化方法、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、及び酵素安定化剤の製造装置に関する。
　本願は、２０２１年１０月１５日に、日本に出願された特願２０２１－１６９５０３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く用いられている。しかしながら、これらの原料はもともと食料又は飼料として用いられており、長期的に工業用利用資源として活用することは、食料又は飼料用途との競合を引き起こし、原料価格の高騰を招く危険性がある。
　従って、非食用バイオマスをエネルギー資源として活用する技術開発が進められている。非食用バイオマスとしては、地球上に最も多く存在するセルロースが挙げられるが、その大部分は芳香族ポリマーのリグニンやヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロースとして存在する。
　このリグノセルロース系バイオマスを利用する場合、濃硫酸でバイオマス中のセルロースを単糖に分解した後に発酵させる手法が古くから検討されてきた。しかし、この手法は濃硫酸を取り扱うための装置の耐酸性や硫酸の効率的な回収技術の確立や管理が難しく、普及は進んでいない。
　一方、硫酸等の酸を使わず、セルラーゼ等の酵素を使ってバイオマスの多糖成分を単糖化（糖化）し、酵母等によりエタノール発酵する方法（酵素糖化及び発酵法）が検討されている。しかしながら、この手法を木材等のリグノセルロース系バイオマスに応用する場合、酵素糖化処理の前に何らかの処理（前処理）が必要とされている。
　酵素糖化の前処理は、バイオマス中のセルロース等に酵素が効果的に作用できる状態にする工程であり、物理的又は化学的な処理が行われる。物理的処理としてはボールミル等で摩砕する手法等がある。化学的な処理としては紙パルプ化の化学工程のように、化学薬剤でリグニンを除去してセルロースを得る手法等がある。いずれの方法においても、セルロースとヘミセルロースはエタノール転換し、有効利用される。
　一方、リグニンはバイオマスの３大主成分の一つであり、地上で２番目に蓄積されている有機化合物である。化学パルプ化工程やバイオエタノール前処理工程で分離され、紙パルプ生産やバイオエタノール生産で副産されるが、熱源以外の有効な利用法に乏しく、その有効利用法が模索されている。近年では、リグニンに関して、他の化学物質と合成処理し誘導体化する等して、機能性材料原料とする研究が進められている。また、酵素安定化剤としての特性も認められている（例えば、特許文献１等参照）。
　リグニン由来の酵素安定化剤の製造方法として、バイオマスと、ポリエチレングリコール等の親水性化合物を原料とした酸加溶媒分解法がある（例えば、特許文献２等参照）。当該方法において、疎水性分画及び親水性分画の２種類のリグニン誘導体が製造され、酵素安定化剤としては親水性分画が適している（例えば、特許文献３等参照）。
国際公開第２０１１／１１１６６４号 特開２０１７－１９７５１７号公報 特開２０２０－１４５９９１号公報
　特許文献３に記載の方法で得られた親水性分画には、未反応の親水性化合物が多量に含まれており、この未反応の親水性化合物を回収再利用することが事業採算性を確保するための課題である。また、上記親水性分画には、酢酸やフルフラール等の発酵阻害物質が含まれる。そのため、親水性分画をリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する際の酵素安定剤として使用する場合に、これらの発酵阻害物質が発酵系に持ち込まれ、収率が低下する虞がある。さらに、上記親水性分画を脱水濃縮することで、親水性リグニン誘導体を精製し、濃縮精製された未反応の親水性化合物を循環させて再利用することも試みられている。しかしながら、親水性分画中の発酵阻害物質も循環するため、該発酵阻害物質が濃縮されやすく、頻繁なブローが必要となる可能性があり、親水性化合物の再利用率が低下することが懸念される。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、事業採算性が確保され、且つ、発酵阻害物質が除去された酵素安定化剤、その製造方法及び製造装置、並びに、前記酵素安定化剤を用いた酵素の安定化方法、及びリグノセルロース系バイオマスの糖化方法を提供する。
　発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、酸加溶媒分解法で得られた親水性分画を特定の性質を有する合成吸着剤で処理することで、未反応の親水性化合物を効率的に回収でき、回収された親水性化合物を再利用することで事業採算性を確保でき、且つ、合成吸着剤による処理後の溶液を蒸留することで、発酵阻害物質が除去されて純度が向上した親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
〈１〉　以下の工程を含む、親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤の製造方法。
　リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させる工程（１）；
　前記工程（１）で得られた反応液にアルカリを添加して中和する工程（２）；
　前記工程（２）で得られたアルカリ中和液を固液分離して、液分画を得る工程（３）；
　前記工程（３）で得られた液分画に第二の酸を添加する工程（４）；
　前記工程（４）で得られた酸性液を固液分離して、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得る工程（５）；
　前記工程（５）で得られた液画分を、含水率が５５質量％以上であり、孔径が３５０Å以下であり、且つ、比重が１．１５以下である合成吸着剤に接触させて、前記親水性リグニン誘導体を前記合成吸着剤に吸着させる工程（６）；
　前記工程（６）で前記合成吸着剤と接触させた後の溶液を回収した後、前記溶液から蒸留により水及びポリアルキレングリコールをそれぞれ分離し、前記水を前記工程（３）又は前記工程（５）に用いられる固液分離装置の洗浄水として再利用し、前記ポリアルキレングリコールを前記工程（１）に再利用する工程（７）；
　有機溶離液を前記合成吸着剤に接触させて、前記工程（６）で前記合成吸着剤に吸着した前記親水性リグニン誘導体を脱着させて、溶出液を回収する工程（８）；
　前記工程（８）で得られた溶出液から蒸留により前記親水性リグニン誘導体及び前記有機溶離液をそれぞれ分離し、前記親水性リグニン誘導体を精製する工程（９）；及び、
　前記工程（９）で分離された前記有機溶離液を前記工程（８）に再利用する工程（１０）。
〈２〉　前記工程（６）及び前記工程（７）の間に、
　前記親水性リグニン誘導体が吸着している前記合成吸着剤に水を接触させて、前記合成吸着剤を洗浄し、洗浄液を回収する工程（６Ａ）を更に含み、
　前記工程（７）において、前記合成吸着剤と接触させた後の溶液及び前記洗浄液を蒸留する、〈１〉に記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈３〉　前記合成吸着剤がメタクリル酸系合成吸着剤である、〈１〉又は〈２〉に記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈４〉　前記工程（６）及び前記工程（８）を、２０℃以上４０℃以下の温度下で行う、〈１〉～〈３〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈５〉　前記有機溶離液がエタノールである、〈１〉～〈４〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈６〉　前記エタノールの濃度が９０質量％以上である、〈５〉に記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈７〉　前記工程（６）及び前記工程（８）を、カラム処理法で行う、〈１〉～〈６〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈８〉　カラムの通液方向が下降流である、〈７〉に記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈９〉　前記リグノセルロース系バイオマスが草本系バイオマス及びその処理物である、〈１〉～〈８〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈１０〉　前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、〈１〉～〈９〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法。
〈１１〉　〈１〉～〈１０〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法により得られ、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である、酵素安定化剤。
〈１２〉　基質と酵素の反応系に、〈１〉～〈１０〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法により得られ、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である酵素安定化剤を添加することを含む、酵素の安定化方法。
〈１３〉　〈１〉～〈１０〉のいずれか一つに記載の酵素安定化剤の製造方法により得られ、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である酵素安定化剤を添加して、リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化反応を行うことを含む、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
〈１４〉　アルカリ供給手段を有し、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を反応させるように構成された第一の反応槽と、
　第一の固液分離装置と、
　前記第一の固液分離装置を用いて固液分離して得られた液分画と第二の酸とを反応させるように構成された第二の反応槽と、
　第二の固液分離装置と、
　含水率が６３質量％以上であり、孔径が２５０Å以下であり、且つ、比重が１．０９以下である合成吸着剤が充填されたカラムと、
　親水性リグニン誘導体と有機溶離液を分離し、前記親水性リグニン誘導体を精製するように構成された第一の蒸留装置と、
　水と前記ポリアルキレングリコールを分離するように構成された第二の蒸留装置と、
　前記第二の蒸留装置で分離された前記水を前記第一の固液分離装置に供給するように構成された配管と、
　前記第二の蒸留装置で分離された前記ポリアルキレングリコールを前記第一の反応槽に供給するように構成された配管と、
　前記第一の蒸留装置で分離された前記有機溶離液を前記カラムに供給するように構成された配管と、
を備える、酵素安定化剤の製造装置。
　上記態様の酵素安定化剤、並びに、その製造方法及び製造装置によれば、事業採算性が確保され、且つ、発酵阻害物質が除去された酵素安定化剤が得られる。
本実施形態の酵素安定化剤の製造装置の一例を模式的に示す概略構成図である。 実施例１におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）回収率及び親水性リグニン誘導体の回収率を示すグラフである。 実施例２におけるＰＥＧ回収率及び親水性リグニン誘導体の回収率を示すグラフである。 実施例４におけるＰＥＧ回収率及び親水性リグニン誘導体の回収率を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本明細書及び請求の範囲において、各種用語の意味を以下のとおり定義する。
＜酵素の安定化＞
　本明細書における「酵素の安定化」とは、基質と酵素との反応において、酵素安定化剤を存在させることにより、酵素の失活を防ぎ、酵素活性を安定化することを意味する。具体的には、例えば、酵素糖化反応条件下で、残存酵素活性が、酵素安定化剤を使用していない場合と比較して、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上維持されていることをいう。前記酵素糖化反応条件としては、希硫酸前処理済みバガスの乾燥重量１５ｇと、酵素（任意の添加重量）を用いて、本実施形態における酵素安定化剤に含まれる親水性リグニン誘導体を、希硫酸前処理済みバガス乾燥重量１００質量部に対して０．１質量部以上２．２質量部以下となるように加え、水を加えて１００ｍＬとしたものを５０℃、ｐＨ５．０調整下で４８時間糖化反応させる。
　なお、酵素活性測定法は、市販品であればカタログ記載の方法、文献等に記載の方法等の中から当業者が適宜採用することができる。
＜酵素＞
　本明細書における「酵素」とは、化学反応を触媒するタンパク質を中心とした高分子化合物をいい、特に、糖化酵素をいう。糖化酵素としては、セルロースを分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを分解するヘミセルラーゼ、グルコキシダーゼ（βグルコキシダーゼ）、デンプンを分解するアミラーゼ等が挙げられる。
　前記セルラーゼとしては、セルロースをグルコース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、例えば、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ；ＥＧ）、セロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ＣＢＨ）、及びβ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ；ＢＧＬ）の各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げられ、酵素活性の観点から、これらの各活性を有する酵素混合物であることが好ましい。
　前記ヘミセルラーゼとしては、ヘミセルロースをキシロース等の単糖又はオリゴ糖に分解するものであればよく、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びアラビノフラノシダーゼの各活性の少なくとも１つの活性を有するものを挙げることができ、これらの各活性を有する酵素混合物であることが、酵素活性の観点から好ましい。
　これらセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の糖化酵素の由来は限定されることはなく、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の糸状菌、担子菌、細菌類等の糖化酵素生産菌由来のセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等の糖化酵素を用いることができる。
　中でも、本実施形態において酵素安定化剤が適用される糖化酵素としては、セルラーゼであることが好ましい。
＜親水性リグニン誘導体＞
　本明細書中で使用される場合、「親水性リグニン誘導体」とは、前記親水性リグニン誘導体を構成するコニフェリルアルコール骨格のα位の炭素のいずれかにポリアルキレングリコール基を有し、リグノセルロース系バイオマスと、末端に水酸基を有するポリアルキレングリコールとに硫酸を添加して得られるリグニン誘導体のうち、硫酸によりｐＨを２以上３以下にした時に沈殿しないリグニン誘導体をいう。親水性リグニン誘導体としては、重量平均分子量１０００以上３２００以下のものが好ましい。重量平均分子量が上記下限値以上であることで、親水性がより十分なものとなる傾向があり、一方、上記上限値以下であることで、分子量が大きくなりすぎず、酵素安定化剤としての機能をより効果的に発揮することができる。
＜疎水性リグニン誘導体＞
　本明細書中で使用される場合、「疎水性リグニン誘導体」とは、前記疎水性リグニン誘導体を構成するコニフェリルアルコール骨格のα位の炭素のいずれかにポリアルキレングリコール基を有し、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに硫酸を添加して得られるリグニン誘導体のうち、硫酸によりｐＨを２以上３以下にした時に沈殿するリグニン誘導体をいう。疎水性リグニン誘導体としては、分子量４０００以上２００００以下のものが好ましい。
＜リグノセルロース系バイオマス＞
　本明細書において、リグノセルロース系バイオマスとしては、例えば、木材系バイオマス、草本系バイオマス、それらの処理物及びそれらの廃棄物からなる群より選ばれる少なくとも１種であればその種類は問わない。中でも、本実施形態の酵素安定化剤の製造方法において原料として用いられるリグノセルロース系バイオマスとしては、草本系バイオマス及びそれらの処理物が好ましい。草本系バイオマスは、木材系バイオマスよりも栽培年数が短く、農業残渣としての賦存量も多いことから、安定的に大量の原料を入手することが可能である。また、草本系バイオマスでは、木材系バイオマスを原料として用いた場合よりも、後述する工程（５）で得られる液分画中に親水性リグニン誘導体及びその他可溶性成分を多く含む。そのため、従来法のように、脱水濃縮により、得られた液分画から脱水濃縮したポリアルキレングリコールを循環させて、工程（１）で再利用する場合に、前記親水性リグニン誘導体及びその他可溶性成分も循環するため、該親水性リグニン誘導体やその他可溶性成分が濃縮されやすい。その結果、頻繁なブローが必要となる可能性があり、ポリアルキレングリコールの再利用率が低下することが懸念される。これに対して、本実施形態の酵素安定化剤の製造方法では、後述する工程（６）～（９）において、合成吸着剤を用いた分離精製及び親水性リグニン誘導体を分離精製するための蒸留を行うことで、上記その他可溶性成分等の夾雑物の多くは、後述する工程（１）の酵素安定化剤の製造系に循環されずに除去される。そのため、草本系バイオマスは、本実施形態の酵素安定化剤の製造方法において原料として好ましく用いられる。
　また、リグノセルロース系バイオマスは細かく粉砕したもの（例えば、木粉等）であることが好ましい。
　木材系バイオマスとしては、例えば、スギ、ヒノキ、カラマツ、マツ、米マツ、米スギ、米ツガ、ポプラ、シラカバ、ヤナギ、ユーカリ、クヌギ、コナラ、カシ、シイ、ブナ、アカシア、タケ、ササ、アブラヤシ、サゴヤシ等が挙げられる。中でも、木材植物としては、性状の安定性の観点からスギが好ましい。
　また、これらの樹皮、枝条、果房、果実殻等も使用することができる。また、これらを使った合板、繊維板、集成材のような加工材も使用することができる。また、建築物に使用後、解体された部材も使用することができる。また、紙等のリグノセルロース系バイオマスの加工物や古紙も使用することができる。
　草本系バイオマスとしては、例えば、イネ、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ等が挙げられる。
　草本系バイオマスの処理物としては、バイオエタノール製造設備から排出される発酵残渣及び蒸留残渣を好ましく用いることができる。
≪酵素安定剤の製造方法≫
　本実施形態の親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤の製造方法（以下、単に「本実施形態の製造方法」と称する場合がある）は、以下の工程を含む。
　リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させる工程（１）；
　前記工程（１）で得られた反応液にアルカリを添加して中和する工程（２）；
　前記工程（２）で得られたアルカリ中和液を固液分離して、液分画を得る工程（３）；
　前記工程（３）で得られた液分画に第二の酸を添加する工程（４）；
　前記工程（４）で得られた酸性液を固液分離して、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得る工程（５）；
　前記工程（５）で得られた液画分を、含水率が５５質量％以上であり、孔径が３５０Å以下であり、且つ、比重が１．１５以下である合成吸着剤に接触させて、前記親水性リグニン誘導体を前記合成吸着剤に吸着させる工程（６）；
　前記工程（６）で前記合成吸着剤と接触させた後の溶液を回収した後、前記溶液から蒸留により水及びポリアルキレングリコールをそれぞれ分離し、前記水を前記工程（３）又は前記工程（５）に用いられる固液分離装置の洗浄水として再利用し、前記ポリアルキレングリコールを前記工程（１）に再利用する工程（７）；
　有機溶離液を前記合成吸着剤に接触させて、前記工程（６）で前記合成吸着剤に吸着した前記親水性リグニン誘導体を脱着させて、溶出液を回収する工程（８）；
　前記工程（８）で得られた溶出液から蒸留により前記親水性リグニン誘導体及び前記有機溶離液をそれぞれ分離し、前記親水性リグニン誘導体を精製する工程（９）；及び、
　前記工程（９）で分離された前記有機溶離液を前記工程（８）に再利用する工程（１０）。
　従来では、上記工程（１）～（３）で示される酸加溶媒分解法によって得られるリグニン誘導体を含む液分画をそのまま酵素安定化剤として利用していた。発明者らは、上記工程（４）～（５）に示すように、工程（３）で得られた液分画に更に酸を添加して、リグニン誘導体を疎水性分画（固体分画）と親水性分画（液分画）に分けて、親水性分画（液分画）に含まれる親水性リグニン誘導体が酵素安定化剤に適していることを、特許文献３等でこれまでに報告した。酸加溶媒分解法で使用されるポリアルキレングリコールは、溶媒としての役割も担い、一定量は反応に寄与せず、未反応分として反応液中に残存している。そのため、得られた親水性分画（液分画）には、投入した原料ポリアルキレングリコールの質量に対して６０質量％の未反応のポリアルキレングリコールが含まれている。ポリアルキレングリコールのコストは、親水性リグニン誘導体の製造コストの半分以上を占めており、ポリアルキレングリコールの回収及び再利用が事業採算性確保には重要であった。
　また、親水性分画（液分画）には、酢酸やフルフラール等の発酵阻害物質が含まれている。親水性分画（液分画）をそのまま酵素安定化剤として使用することで、上記発酵阻害物質によって糖化工程の後工程である発酵工程における発酵阻害を引き起こすことが懸念されていた。
　これに対して、本実施形態の製造方法では、上記工程（６）において、上記特性を有する合成吸着剤を用いることで、液分画から親水性リグニン誘導体を合成吸着剤に吸着させ、一方、ポリアルキレングリコールは吸着しないため、これらを分離することができる。さらに、上記工程（７）において、分離されたポリアルキレングリコールを含む水溶液を蒸留（好ましくは、減圧蒸留）することで、水と、純度の高いポリアルキレングリコールとを分離精製することができる。分離精製されたポリアルキレングリコールは、上記工程（１）における酸加溶媒分解反応に再利用することができ、上記課題となっていた事業採算性を確保することができる。また、上記工程（７）において分離された水も本実施形態の製造方法において工程（３）等での洗浄水として再利用することができ、コストの削減に寄与する。
　また、上記工程（８）において、有機溶離液に溶出させて、親水性リグニン誘導体を合成吸着剤から脱着させた後、上記工程（９）において蒸留（好ましくは、減圧蒸留）することで、有機溶離液と、純度の高い親水性リグニン誘導体とを分離精製することができる。分離精製された親水性リグニン誘導体は、後述する実施例に示すように、発酵阻害物質が除去されており、酵素安定化剤として活用した際に、糖化工程の後工程である発酵工程における発酵阻害の発生が抑制されている。
　すなわち、本実施形態の製造方法によれば、事業採算性が確保され、且つ、発酵阻害物質が除去された酵素安定化剤が得られる。
　次いで、本実施形態の製造方法の各工程について以下に詳細を説明する。
＜工程（１）＞
　工程（１）では、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させる。
［ポリアルキレングリコール］
　本実施形態の製造方法において、ポリアルキレングリコールとしては、アルキレングリコールが重合したものであれば、特に制限はないが、末端に水酸基を有するものが好ましい。例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールの分子量は本実施形態の製造方法に用いることができれば特に制限はないが、ポリエチレングリコールの場合は、２００以上１０００以下が好ましく、４００以上６００以下がより好ましい。
　これらポリアルキレングリコールは、市販のものを用いてもよいし、当該分野で公知の方法により調製したものを用いてもよい。
［リグニン誘導体］
　リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとに第一の酸を添加して反応させることにより、リグノセルロース系バイオマス中のリグニンからリグニン誘導体を液分画中に得ることができる。このようにして得られるリグニン誘導体を含む液分画は、親水性リグニン誘導体と疎水性リグニン誘導体を含む。
［第一の酸］
　工程（１）で用いられる第一の酸としては、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールからリグニン誘導体を生成させることができれば特に制限はなく、塩酸、硫酸等が用いられ、硫酸が好ましく用いられる。添加量は、通常、ポリアルキレングリコール１００重量部に対して、０．１重量部以上３．０重量部以下である。
　リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとの反応において、リグノセルロース系バイオマスに対して反応させるポリアルキレングリコールの量は、使用されるリグノセルロース系バイオマス中のリグニン及びポリアルキレングリコールの種類、並びに目的とする酵素安定化剤の性能に依存して決定することができる。例えば、加えるポリアルキレングリコールの量は、使用するリグノセルロース系バイオマス中に存在するリグニン中の水酸基の量、及び加えるポリアルキレングリコール中の水酸基の量に基づき算出される。ポリアルキレングリコールは、リグニンのα位の炭素原子に結合している水酸基と反応する。ポリアルキレングリコールの量は、通常、リグノセルロース系バイオマス１０乾燥重量部に対して、ポリアルキレングリコール５重量部以上１００重量部以下であり、１０重量部以上６０重量部以下が好ましく、２０重量部以上５０重量部以下がより好ましい。
　反応温度は、特に制限はないが、通常、１００℃以上２００℃以下であり、１２０℃以上１６０℃以下が好ましい。
　反応時間は、特に制限はないが、通常、３０分間以上１８０分間以下であり、６０分間以上１２０分間以下が好ましい。
＜工程（２）＞
　工程（２）では、工程（１）で得られた反応液にアルカリを添加して中和する。
［アルカリ］
　工程（２）で用いられるアルカリとしては、工程（１）で得られた反応液を中和できるものであれば、特に制限はないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化リチウム等が挙げられる。
　アルカリ添加後の反応液のｐＨは、ｐＨ６以上１２以下が好ましく、ｐＨ６以上１０以下がより好ましい。
＜工程（３）＞
　工程（３）では、工程（２）で得られたアルカリ中和液を固液分離して、液分画を得る。
　アルカリ中和液から固形分を除く方法としては、アルカリ中和液から固形分を除くことができれば特に制限はないが、例えば、遠心分離、スクリュープレス、フィルタープレス、透過膜等が挙げられる。工程（３）で固形分を除いて得られた液分画に、親水性及び疎水性リグニン誘導体が含まれ、親水性リグニン誘導体は本実施形態の酵素安定化剤として用いることができる。
＜工程（４）＞
　工程（４）では、工程（３）で得られた液分画に第二の酸を添加する。
［第二の酸］
　工程（４）で用いられる第二の酸としては、液分画を酸性にすることができれば特に制限はないが、ｐＨを１以上４以下とすることができる酸が好ましく、硫酸が特に好ましい。
　第二の酸の添加量は、通常、工程（３）で得られた液分画１００重量部に対して、０．０１重量部以上３．０重量部以下である。
　液分画に第二の酸を加えて酸性にすることにより、未反応のリグニン及び疎水性リグニン誘導体が沈殿し、続く工程（５）において固液分離をして、固形物を分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画が得られる。
＜工程（５）＞
　工程（５）では、工程（４）で得られた酸性液を固液分離して、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得る。
　固液分離の方法としては、第二の酸を添加して生成する固形物を分離できる方法であれば、特に制限はないが、遠心分離が好ましい。遠心分離は、通常、２０００×ｇ以上２００００×ｇ以下であり、５０００×ｇ以上１５０００×ｇ以下が好ましい。
＜工程（６）＞
　工程（６）では、工程（５）で得られた液画分を、合成吸着剤に接触させて、親水性リグニン誘導体を合成吸着剤に吸着させる。
［合成吸着剤］
　合成吸着剤において、含水率が５５質量％以上であり、孔径が３５０Å以下であり、且つ、比重が１．１５以下である。
　このような特性を有する合成吸着剤を使用することで、疎水性相互作用又はファンデルワールス力によって、親水性リグニン誘導体を効率的に吸着させることができる。
　合成吸着剤の含水率は、５５質量％以上であり、５７質量％以上が好ましく、６０質量％以上がより好ましく、６３質量％以上がさらに好ましい。合成吸着剤の含水率が上記下限値以上であることで、親水性リグニン誘導体をより効率的に吸着することができる。一方で、含水率の上限に特に制限はないが、例えば、１００質量％、９０質量％、８０質量％、又は７５質量％とすることができる。合成吸着剤の含水率とは、合成吸着剤の湿潤重量に対する水分の重量の割合を百分率で示したものであり、例えば、乾燥減量法によって、測定することができる。
　合成吸着剤の孔径は、３５０Å以下であり、３３０Å以下が好ましく、３００Å以下がより好ましく、２５０Å以下がさらに好ましい。合成吸着剤の孔径が上記上限値以下であることで、親水性リグニン誘導体をより効率的に吸着することができる。一方で、孔径の下限に特に制限はないが、例えば、５０Å、７０Å、又は１００Åとすることができる。合成吸着剤の孔径は、例えば、ガス吸着法によって、測定することができる。
　合成吸着剤の比重は、１．１５以下であり、１．１２以下が好ましく、１．１０以下がより好ましく、１．０９以下がさらに好ましい。合成吸着剤の比重が上記上限値以下であることで、親水性リグニン誘導体をより効率的に吸着することができる。一方で、比重の下限に特に制限はないが、例えば、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５とすることができる。合成吸着剤の比重は、例えば、比重瓶法によって、測定することができる。
　合成吸着剤の表面積は、８００ｍ２/ｇ以下であることが好ましく、７００ｍ２/ｇ以下であることがより好ましく、６００ｍ２/ｇ以下であることがさらに好ましく、５７０ｍ２/ｇ以下であることが特に好ましい。合成吸着剤の表面積が上記上限値以下であることで、親水性リグニン誘導体をより効率的に吸着することができる。一方で、表面積の下限に特に制限はないが、例えば、３００ｍ２/ｇ、３５０ｍ２/ｇ、４００ｍ２/ｇ、又は４３０ｍ２/ｇとすることができる。合成吸着剤の表面積は、例えば、ガス吸着ＢＥＴ法によって、測定することができる。
　合成吸着剤の種類としては、例えば、芳香族系合成吸着剤、メタクリル酸系合成吸着剤、ポリスチレン系合成吸着剤等が挙げられる。メタクリル酸系合成吸着剤及びポリスチレン系合成吸着剤は、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）等の架橋剤による架橋構造を有していてもよい。またメタクリル酸系合成吸着剤には、メタクリル酸エステル系合成吸着剤も包含される。中でも、工程（６）で用いられる合成吸着剤としては、親水性リグニン誘導体の官能基特性及び立体構造の特徴から、親水性リグニン誘導体の吸着効率及び後の工程（８）での脱着効率に優れることから、メタクリル酸系合成吸着剤が好ましい。
　上述した特性を有する市販の合成吸着剤としては、例えば、三菱ケミカル社製の商品名「ダイヤイオンＨＰ２ＭＧＬ」（メタクリル酸エステル系合成吸着剤、含水率５５質量％以上６５質量％以下、孔径２４０Å、比重１．０９、表面積５７０ｍ２／ｇ）、ピュロライト社製の商品名「ＰｕｒｏＳｏｒｂＴＭ　ＰＡＤ６１０」（メタクリル酸－ＤＶＢ架橋合成吸着剤、含水率６０質量％以上６６質量％以下、孔径３００Å、比重１．１２、表面積４９０ｍ２／ｇ）、「ＰｕｒｏＳｏｒｂＴＭ　ＰＡＤ９００」（ポリスチレン－ＤＶＢ架橋合成吸着剤、含水率６７質量％以上７３質量％以下、孔径２２０Å、比重１．０２、表面積８５０ｍ２／ｇ）、「ＰｕｒｏＳｏｒｂＴＭ　ＰＡＤ９５０」（メタクリル酸系合成吸着剤、含水率６５質量％以上７１質量％以下、孔径１２０Å、比重１．０７、表面積４５０ｍ２／ｇ）等が挙げられる。
　また、工程（６）において、親水性リグニン誘導体に加えて、発酵阻害物質等の夾雑物の一部は、合成吸着剤に吸着する。これにより、本実施形態の製造方法における系内から、発酵阻害物質等の夾雑物の一部を取り除くことができる。また、後述する工程（８）で、有機溶離液によって、親水性リグニン誘導体と共に、発酵阻害物質等の夾雑物の一部も脱着し、溶出するが、後述する工程（９）における蒸留により、揮発又はサイドカット等により除去させて親水性リグニン誘導体から取り除くことができる。
＜工程（６Ａ）＞
　本実施形態の製造方法は、工程（６）及び工程（７）の間に、
　親水性リグニン誘導体が吸着している合成吸着剤に水を接触させて、合成吸着剤を洗浄し、洗浄液を回収する工程（６Ａ）を更に含むことが好ましい。
　後述する実施例に記載するように、本実施形態の製造方法は、工程（６Ａ）を更に含むことで、工程（６）において合成吸着剤と親水性リグニン誘導体とを接触させた系に残存するポリアルキレングリコールをより効果的に回収することができる。すなわち、回収された洗浄液中にはポリアルキレングリコールが多量に含まれることから、続く工程（７）において、工程（６）において合成吸着剤と接触させた後の溶液と必要に応じて混合して、蒸留に供されることが好ましい。
＜工程（７）＞
　工程（７）では、工程（６）で合成吸着剤と接触させた後の溶液（カラム方式の場合には、フロースルーともいう）を回収した後、溶液から蒸留により水及びポリアルキレングリコールをそれぞれ分離する。
　工程（７）における蒸留方法としては、水とポリアルキレングリコールを分離できる方法であれば特に限定されないが、例えば、常圧蒸留法、減圧蒸留法等が挙げられる。中でも、蒸発させて分離する水の沸点が比較的低いことから、減圧蒸留法であることが好ましい。
　分離された水は、工程（３）又は工程（５）に用いられる固液分離装置の洗浄水として再利用する。また、分離された水は、工程（６Ａ）に用いられる洗浄水としても再利用することができる。
　一方、分離されたポリアルキレングリコールは、工程（１）に再利用する。これにより、本実施形態の製造方法は、これまで製造コストの半分以上を占めていたポリアルキレングリコールの回収及び再利用を達成でき、事業採算性を確保することができる。
＜工程（８）＞
　工程（８）では、有機溶離液を合成吸着剤に接触させて、工程（６）で合成吸着剤に吸着した親水性リグニン誘導体を脱着させて、溶出液を回収する。
［有機溶離液］
　工程（８）で用いられる有機溶離液としては、親水性リグニン誘導体を溶出することができ、合成吸着剤よりも親水性リグニン誘導体との親和性が高いものであれば特に限定されない。このような有機溶離液としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、ベンゼン、及びこれらと酸又はアルカリとの混合液等が挙げられる。中でも、安価で入手が容易であり、且つ、本実施形態の製造方法で得られた酵素安定化剤は特にバイオエタノール製造時の糖化工程に投入されることから、糖化工程及び続く発酵工程に悪影響を及ぼさず安全性の比較的高いものであることから、エタノールが特に好ましい。また、エタノールは、大気圧下での沸点が７９℃と比較的低く、続く工程（９）においてエネルギーの消費を抑えながら回収することができる。
　また、有機溶離液は、水との混合溶液の形で用いてもよいが、親水性リグニン誘導体の脱着効率がより優れることから、有機溶離液の濃度がより高いことが好ましく、エタノールである場合には、その濃度が溶液の総質量に対して９０質量％以上であることが好ましく、９５質量％以上であることがより好ましく、９９質量％以上であることがさらに好ましく、９９．５質量％以上であることが特に好ましい。
　工程（６）、工程（６Ａ）、及び工程（８）は、合成吸着剤の至適温度下であれば特に制限されないが、２０℃以上４０℃以下の温度下で行うことが好ましく、２３℃以上２７℃以下の温度下で行うことがより好ましい。上記温度範囲で処理を行うことで、合成吸着剤への親水性リグニン誘導体の吸着効率及び脱着効率をより向上させることができる。
　工程（６）、工程（６Ａ）、及び工程（８）は、バッチ処理法であってもよく、カラム処理法であってもよいが、連続的に大量の溶液を処理できることから、カラム処理法であることが好ましい。
　カラムの通液方向は、上昇流であってもよく、下降流であってもよいが、機器動力がより小さく、ポリアルキレングリコールの回収率がより向上することから、下降流であることが好ましい。
＜工程（９）＞
　工程（９）では、工程（８）で得られた溶出液から蒸留により親水性リグニン誘導体及び有機溶離液をそれぞれ分離し、親水性リグニン誘導体を精製する。
　工程（７）における蒸留方法としては、親水性リグニン誘導体と有機溶離液を分離できる方法であれば特に限定されないが、例えば、常圧蒸留法、減圧蒸留法等が挙げられる。中でも、蒸発させて分離する有機溶離液、特にエタノールの沸点が比較的低いことから、減圧蒸留法であることが好ましい。
　また、工程（８）で得られた溶出液中には、発酵阻害物質等の夾雑物の一部も含まれるが、その多くは、工程（９）における蒸留によって揮発又はサイドカットによる抜出しで、除去される。
　精製された親水性リグニン誘導体は、必要に応じて、凍結乾燥機等の従来使用されている乾燥方法により完全に乾燥させてもよい。
＜工程（１０）＞
　工程（１０）では、工程（９）で分離された有機溶離液を工程（８）に再利用する。
　分離された有機溶離液を工程（８）に再利用することで、製造コストを抑えることができる。
＜酵素安定化剤＞
　本実施形態の酵素安定化剤は、上述した酵素安定化剤の製造方法により得られる。また、本実施形態の酵素安定化剤は、発酵阻害物質（例えば、酢酸、フルフラール等）が低減されたものであり、具体的には、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である。
　上述した酵素安定化剤の製造方法により得られた酵素安定化剤を使用する場合は、水溶液の形態で使用してもよく、或いは、乾燥させたものを粉体化して使用してもよい。
　本実施形態の酵素安定化剤には、その性能を阻害しない範囲で、任意の添加剤を添加してもよい。そのような添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、水溶性若しくは水不溶性担体、分散剤、水溶性の金属の無機又は有機酸塩等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　酸化防止剤としては、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　水溶性又は水不溶性担体としては、例えば、水、アルコール類（エタノール、イソプロピルアルコール等）、ジオール（例えば、エチレングリコール、１，２－プロパンジオール、１，６－ヘキサンジオール）、他のポリオール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、エーテル類（例えば、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル等）、ケトン類（例えば、シクロヘキサノン等）、エステル類（例えば、コハク酸ジメチル、アジピン酸ジメチル等）、含窒素類（例えば、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等）等の水溶性担体；脂肪族や芳香族の炭化水素系溶剤（例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、キシレン、トルエン、ドデシルベンゼン、ミネラルスピリット、芳香族系ナフサ等）、油脂類（例えば、ヤシ油、大豆油、ナタネ油、ヒマシ油、アマニ油等）等の水不溶性担体等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　分散剤としては、例えば、アクリレートホモポリマー、アクリレートコポリマー又はそれらの混合物等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　水溶性の金属の無機又は有機酸塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、モノ、ジ、トリエタノールアミン塩等のアルカノールアミン塩等が挙げられる。これらは、単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
＜疎水性リグニン誘導体＞
　なお、本実施形態の製造方法において、工程（５）での固液分離で残存した固形分画には、疎水性リグニン誘導体が含まれる。
　この疎水性リグニン誘導体を含む固形分画は、必要に応じて、凍結乾燥機等の従来使用されている乾燥方法により完全に乾燥させてもよい。
　固形分画中の疎水性リグニン誘導体の濃度は、以下の式により算出することができる。
　（疎水性リグニン誘導体濃度）
＝（リグニンのコニフェリルアルコール骨格に起因するＵＶ吸光度から得られる濃度）×｛（ポリアルキレングリコール分子量）＋１８０｝×０．７／１８０
　固形分画に含まれる疎水性リグニン誘導体は、例えば、耐熱フィルム、セメント分散剤、熱硬化性樹脂等の機能性原料として用いることができる。
≪酵素の安定化方法≫
　本実施形態の酵素の安定化方法は、基質と酵素の反応系に、上述した酵素安定化剤の製造方法により得られる酵素安定化剤を添加することを含む。
　本実施形態の酵素の安定化方法に使用される親水性リグニン誘導体は、基本的には上述した酵素安定化剤の製造方法により得られる酵素安定化剤に使用される親水性リグニン誘導体と同様の構成及び作用効果を有する。よって、上述した酵素安定化剤の製造方法と同様の内容については、適宜説明を省略する。
　酵素反応の酵素としては、糖化酵素が好ましく、特にセルラーゼが好ましい。酵素反応の基質としては、セルロースが好ましく、特に、リグノセルロース系バイオマスが好ましい。
　本実施形態の酵素の安定化方法に使用される酵素安定化剤の添加量は、任意であるが、例えば、リグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対して、酵素安定化剤に含まれる親水性リグニン誘導体の重量が、０．１重量％以上３．０重量％以下が好ましく、０．２重量％以上１．０重量％以下がより好ましく、０．３重量％以上０．７重量％以下がさらに好ましい。添加量が上記数値範囲であることで、酵素の失活をより防ぐことができ、酵素活性をより安定化することができる。
　反応液に添加する親水性リグニン誘導体の濃度は、以下の式により算出することができる。
　（親水性リグニン誘導体濃度）
＝（リグニンのコニフェリルアルコール骨格に起因するＵＶ吸光度から得られる濃度）×｛（ポリアルキレングリコール分子量）＋１８０｝×０．８／１８０
≪リグノセルロース系バイオマスの糖化方法≫
　本実施形態のリグノセルロース系バイオマスの糖化方法（以下、単に「本実施形態の糖化方法」と称する場合がある）は、上述した酵素安定化剤の製造方法により得られる酵素安定化剤を添加して、リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化反応を行うことを含む。
　本実施形態の糖化方法に使用する酵素安定化剤は、上記のとおり、酵素の失活を防ぎ、酵素活性を安定化することができる。したがって、本実施形態の糖化方法によれば、使用した酵素を再利用すること、又は酵素使用量を減じることが可能である。
　本明細書中で使用される場合、「リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化方法」とは、リグノセルロース系バイオマスを酵素により糖化する方法であればいずれでもよいが、例えば、特開２００８－０９２９１０号公報（参考文献１）に記載される糖化方法（エタノールの製造方法）であってよい。参考文献１の内容は本明細書中に参照として援用される。
　本実施形態の糖化方法は、例えば、以下の工程を含む。
　リグノセルロース系バイオマスに酸又はアルカリを混合させ、水熱処理（前処理）を行う工程（ａ）；
　前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスに酵素、上述した酵素安定化剤及び水を添加し、バイオマス内のセルロース及びヘミセルロースをそれぞれグルコース及びキシロースの単糖に加水分解（糖化）し糖液を得る工程（ｂ）；及び、
　得られた糖液に、酵母を添加し発酵させ、エタノールを生産する工程（ｃ）。
　本実施形態の糖化方法において、糖化効率は、Ｃ６糖化率を算出することにより調べることができる。ここでＣ６糖化率とは、前処理済バイオマス中のセルロース（グルコース換算）から糖化を経て生成するグルコース量の比率を示す。本来、前処理と糖化を経てキシロース（Ｃ５糖）も生成するが、キシロースは、希硫酸を使った前処理で生成する割合が高いため、酵素糖化効率はＣ６糖化率で調べるのがよい。
　本実施形態の糖化方法に使用される酵素安定化剤は、上述した酵素安定化剤の製造方法において具体的に説明された酵素安定化剤と同様の構成及び作用効果を有する。よって、上述した酵素安定化剤の製造方法と同様の内容については、適宜説明を省略する。
　本実施形態の糖化方法に使用される酵素安定化剤の添加量は、任意であるが、例えば、酵素安定化剤に含まれる親水性リグニン誘導体の重量が酵素糖化されるリグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対して、０．１重量％以上３．０重量％以下が好ましく、０．２重量％以上１．０重量％以下がより好ましく、０．３重量％以上０．７重量％以下がさらに好ましい。添加量が上記数値範囲であることで、酵素のバイオマス成分への吸着をより抑制することができ、酵素の活性をより向上させることができる。
　親水性リグニン誘導体の重量は、上述した酵素の安定化方法で記載した方法により算出することができる。
　本実施形態の糖化方法において用いられる糖化酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ又はβグルコキシダーゼ活性を有する任意の酵素を用いることができる。これら糖化酵素産生菌の例としては、好気性のトリコデルマ属、アスペルギルス属、フミコラ属、イルペックス属、アクレモニウム属等が挙げられる。
　糖化反応に使用する糖化酵素の添加量は、原料基質となるリグノセルロース系バイオマスのセルロース１ｇに対して５ユニット以上５０ユニット以下のセルラーゼ活性を含むように調整する。
　本実施形態の糖化方法により得られる糖化液は、エタノール発酵、乳酸発酵、アミン酸発酵、ブタノール発酵、イソブタノール発酵等の原料として用いることができる。以下に、エタノール発酵に用いる場合について説明する。
　エタノール発酵においては、上記で得られた糖化液を発酵させる。糖化反応に最適な温度と発酵に最適な温度は異なるため、糖化反応は、糖化反応に適した温度で実施し、４０℃以上６０℃以下が好ましい。反応液のｐＨも、糖化反応に適した条件で実施し、４以上７以下が好ましい。糖化反応の終了後、糖化反応液を取り出し、発酵槽へ供給する。発酵槽のエタノール発酵菌は、固定化してもしなくても良いが、固定化した方が好ましい。発酵条件は、エタノール発酵に適した条件で実施する。ｐＨは、４以上８以下、温度は、２０℃以上４０℃以下が好ましい。エタノール発酵中に生産したエタノールを分離回収することもできる。
　得られた糖化液にエタノール発酵菌を投入することにより糖化液を発酵させ、エタノールを製造することができる。このようなエタノール発酵菌としては、例えば、サッカロマイセス属、ザイモモナス属、ピキア属等が挙げられる。また、遺伝子組み換えされたものもアルコール発酵が可能で有れば使用できる。これらのエタノール発酵菌は、エタノール発酵前に液体培地で前培養し、菌体量を増加させておくことが望ましい。エタノール発酵菌の投入量は多いほど発酵効率がよく、糖化反応により生成する糖を同時に完全にエタノールへ変換できる菌体量を確保することが好ましい。
　糖化反応とエタノール発酵は、上記糖化酵素とともにエタノール発酵菌を添加することにより、同時に行うこともできる。同時糖化発酵においては、同一の反応器で糖化反応と発酵を行う方式でもよく、或いは、糖化反応と発酵を別々の反応器で行う方式でもよい。
　同一の反応器で糖化反応と発酵を行う場合には、反応液のｐＨと温度は、糖化反応と発酵、どちらも作用できる条件で行う。条件としては、エタノール発酵菌の発酵条件を優先し、ｐＨは、４以上７以下、温度は、２０℃以上４０℃以下が好ましい。また、同時糖化発酵を嫌気的条件で行うことで、好気性菌である糖化酵素産生菌の増殖を抑制することができ、糖化酵素産生菌の増殖に伴う糖の消費を抑制することができる。また、同時糖化発酵は撹拌することで、糖化反応が進行し易いため、エタノール生産性がより良くなる。また、生成したエタノールを分離回収しながら同時糖化発酵を行うこともできる。この方式は、一つの反応器で全ての糖化反応とエタノール発酵を行えるので製造工程の簡便化が図れる。
　糖化反応と発酵を別々の反応器で同時に行う方式では、糖化反応は、糖化反応に適した温度で実施し、４０℃以上６０℃以下で実施することが好ましい。反応液のｐＨは、発酵条件と同一とし、４以上６以下が好ましい。糖化反応液は連続的に取り出し、発酵槽へ供給する。発酵槽のエタノール発酵菌は、固定化してもよく、或いは、しなくてもよいが、固定化することが好ましい。発酵条件は、ｐＨは、４以上７以下、温度は、２０℃以上３５℃以下が好ましい。エタノール発酵液は再び糖化反応槽へ戻し、糖化反応と発酵を同時に行う。その際、生成したエタノールを分離回収することもできる。
　糖化反応の経過に伴って反応器内のリグノセルロース系バイオマスは分解され、減少するため、必要に応じてリグノセルロース系バイオマスを反応器内に無菌的に投入し反応を継続させることが望ましい。
　また、発酵において、反応器内にエタノールが蓄積し、エタノール濃度が上昇すると発酵が抑制されるので、発酵液からエタノールを分離回収しながら発酵させてもよい。その場合、浸透気化膜を使ってもよく、或いは、エバポレーション装置を使ってもよい。その際、発酵微生物が失活しない５０℃以下で運転することが好ましい。ただし、エタノールを回収後の発酵液を反応器に戻さない場合には、この限りではなく、エタノール回収に適した温度で実施できる。また、エタノール回収後の液中には発酵微生物が残存しているので反応器へ無菌的に戻し、再利用することが望ましい。
　酵素や発酵微生物は必要に応じて無菌的に追加してもよい。
　また、反応器内には不溶性の残渣が蓄積し、撹拌効率を抑制するので遠心分離機等を使って除去してもよい。残渣中にセルロースが大量に残っている場合には、原料であるリグノセルロース系バイオマスと混合してもよく、糖化酵素産生菌培養液を追加し、分解してもよい。
　回収したエタノールは、蒸留装置で蒸留することができる。
≪酵素安定化剤の製造装置≫
　図１は、本実施形態の酵素安定化剤の製造装置の一例を模式的に示す概略構成図である。以下、図１を参照しながら、本実施形態の酵素安定化剤の製造装置の各構成について説明する。
　本実施形態の酵素安定化剤の製造装置１００は、第一の反応槽１と、第一の固液分離装置２と、第二の反応槽３と、第二の固液分離装置４と、カラム５と、第一の蒸留装置６と、第二の蒸留装置７と、第二の蒸留装置７で分離された水を第一の固液分離装置２に供給するように構成された配管１４ｃと、第二の蒸留装置７で分離されたポリアルキレングリコールを第一の反応槽１に供給するように構成された配管１４ｄと、第一の蒸留装置６で分離された有機溶離液をカラム５に供給するように構成された配管１３ｃと、を備える。
　第一の反応槽は、アルカリ供給手段１ａを有する。
　本実施形態の酵素安定化剤の製造装置によれば、事業採算性が確保され、且つ、発酵阻害物質が除去された酵素安定化剤が得られる。
［第一の反応槽］
　第一の反応槽１は、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を反応させるように構成されている。リグノセルロース系バイオマス、ポリエチレングリコール及び第一の酸については、上述の酵素安定化剤にて記載されたものと同じものが挙げられる。
　加えるポリアルキレングリコールの量は、特に制限はなく、通常、リグノセルロース系バイオマス１０乾燥重量部に対して、５重量部以上１００重量部以下であり、１０重量部以上６０重量部以下が好ましく、２０重量部以上５０重量部以下がより好ましい。
　加える第一の酸の量は、例えば、ポリアルキレングリコール１００重量部に対して、０．１重量部以上０．３重量部以下である。
　また、第一の反応槽１は、耐酸性であるものであればよく、特別な限定はない。
　第一の反応槽１は撹拌翼等の撹拌機構を有していてもよい。
　また、第一の反応槽１における反応液の温度は、特に制限はなく、通常、１００℃以上２００℃以下であり、１２０℃以上１６０℃以下であることが好ましい。
　第一の反応槽１内の温度を上記範囲内に保つために、第一の反応槽１は温度調整装置又は温度計１ｂを備えていてもよい。
　また、第一の反応槽１は、アルカリ供給手段１ａを有する。さらに、図１に示すようにリグノセルロース系バイオマス供給手段１ｃ、ポリアルキレングリコール供給手段１ｄ、第一の酸供給手段１ｅ等を有してもよい。
　また、第一の反応槽１は、ｐＨ計を有してもよい。ｐＨ計は、アルカリ供給後の反応液のｐＨを測定し、アルカリ供給量を適宜調整するために、用いればよい。
（アルカリ供給手段）
　アルカリ供給手段１ａは第一の反応槽１に配設されており、アルカリを第一の反応槽１に供給するように構成されている。アルカリを供給することで、第一の反応槽１内において、リグニン誘導体の生成反応が終了した後に、反応液を中和及びリグニン誘導体を液側に抽出することができる。
　アルカリとしては、上述の酵素安定化剤の製造方法において例示されたものと同様である。
　アルカリ供給後の反応液のｐＨは、ｐＨ６以上１２以下であること好ましく、ｐＨ６以上１０以下であることがより好ましい。
　アルカリ供給手段１ａはアルカリの供給量を調整するためのポンプ、弁等を有していてもよい。
［第一の固液分離装置］
　第一の固液分離装置２は、反応液から固形分画を取り除くように構成されている。反応液を第一の固液分離装置２に通すことで、リグニン誘導体を含む液分画を得ることができる。
　第一の固液分離装置２としては、アルカリ中和液から固形分画を除くことができれば、特に制限はないが、例えば、遠心分離、スクリュープレス、フィルタープレス等が挙げられる。
［第二の反応槽］
　第二の反応槽３は、第一の固液分離装置２を用いて固液分離して得られた液分画と第二の酸とを反応させるように構成されている。
　また、第二の反応槽３は、第二の酸供給手段３ａを有してもよい。
　第二の酸供給手段３ａは第二の酸の供給量を調整するためのポンプ、弁等を有していてもよい。
　加える第二の酸の量は、例えば、液分画１００重量部に対して、０．０１重量部以上３．０重量部以下である。
　また、第二の反応槽３は、耐酸性であるものであればよく、特別な限定はない。
　第二の反応槽３は撹拌翼等の撹拌機構を有していてもよい。
［第二の固液分離装置］
　第二の固液分離装置４は、第二の反応槽３で得られた反応液（酸性液）を、固液分離して、固形物を除くように構成されている。酸性液を第二の固液分離装置４に通すことで、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得ることができる。
　第二の固液分離装置４は、酸を添加して生成する固形物を分離できる装置であれば、特に制限はないが、例えば、遠心分離機等が挙げられる。
［カラム］
　カラム５には、含水率が６３質量％以上であり、孔径が２５０Å以下であり、且つ、比重が１．０９以下である合成吸着剤が充填されている。
　合成吸着剤及び親水性リグニン誘導体の溶出に用いられる有機溶離液としては、上述の酵素安定化剤の製造方法において例示されたものと同様である。
　カラム５の大きさ及び材質については、耐酸性であるものであればよく、特別な限定はない。
　カラム５内の温度は、合成吸着剤の至適温度下であれば特に制限されないが、２０℃以上４０℃以下であることが好ましく、２３℃以上２７℃以下であることがより好ましい。温度が上記範囲であることで、合成吸着剤への親水性リグニン誘導体の吸着効率及び脱着効率をより向上させることができる。
　カラム５内の温度を上記範囲内に保つために、カラム５はカラムオーブン等の温度調整装置又は温度計を備えていてもよい。
［第一の蒸留装置］
　第一の蒸留装置６は、親水性リグニン誘導体と有機溶離液を分離し、親水性リグニン誘導体を精製するように構成されている。
　第一の蒸留装置６としては、親水性リグニン誘導体を溶液中に残しながら、有機溶離液を蒸発できる装置であれば、特に制限はないが、単蒸留方式のものであってもよく、内部に棚（トレイ）を設けた構造であるものであってもよく、充填物を充填した構造であるものでもよい。
　第一の蒸留装置６として内部に棚（トレイ）を設けた構造であるものを用いた場合に、塔底から上昇して来た蒸気で、投入された揮発性成分及び塔頂から流下して来た内部還流液が加熱され、低沸点成分の有機溶媒を多く含む蒸気が発生する。塔底からの蒸気は、高沸点成分の水を多く含む蒸気が凝縮する。すなわち、各棚（トレイ）上では熱交換とともに物質交換が行われ、塔頂に近づくのに従って低沸点成分に富み、反対に塔底に近づくのに従って高沸点成分に富む。
　図１には示していないが、塔頂からの低沸点成分に富む塔頂留分は配管を介して装置外に取り出され、凝縮器（コンデンサー）等で凝縮される。凝縮された塔頂留分は、配管を介して還流ポンプ等により第一の蒸留装置に還流量を調節する調節器と調節弁等を経由して一定量で戻される。この還流ポンプ、調節器及び調節弁を総じて還流量調節機構と称する場合がある。残りの塔頂留分はカラム５に再利用される再生有機溶離液として残りの塔頂留分の流量を調節する調節器と調節弁（図示せず）を経由して一定流量で抜き出される。残りの塔頂留分の流量を調節する調節器と調節弁を総じて再生有機溶離液流量調節機構（図示せず）と称する場合がある。抜き出し流量は、カラム５に用いられる再生有機溶離液の使用量に応じて再生有機溶離液流量調節機構によって設定を変更することができる。なお、ここでいう再生有機溶離液は、有機溶離液及び水の混合溶液であってもよく、有機溶離液のみからなる溶液であってもよいが、親水性リグニン誘導体の脱着効率をより向上できることから、有機溶離液のみからなる溶液であることが好ましい。
　一方、図１には示していないが、塔底では再沸器（リボイラー）に加熱用スチームがリボイラー加熱用スチームの流量を調節する調節器と調節弁により一定流量で供給され、一定熱量が第一の蒸留装置６に供給されることになる。この調節器及び調節弁を総じてリボイラー焚き上げ量調節機構と称する場合がある。この熱源でリボイラーから発生する水を多く含む蒸気は一定量で発生し、塔内を上方からの還流液と各トレイ上で接触し、熱及び物質交換しながら蒸留操作がおこなわれる。この発生蒸気量は熱源のリボイラー加熱用スチーム量によるリボイラー焚き上げ量によって調節される。
［第二の蒸留装置］
　第二の蒸留装置７は、水とポリアルキレングリコールを分離するように構成されている。
　第二の蒸留装置７としては、ポリアルキレングリコールを溶液中に残しながら、水を蒸発できる装置であれば、特に制限はないが、単蒸留方式のものであってもよく、内部に棚（トレイ）を設けた構造であるものであってもよく、充填物を充填した構造であるものでもよい。
［配管］
　本実施形態の酵素安定化剤の製造装置に配設される配管は、配設される箇所に応じて、耐酸性や耐熱性を有する材質からなるものであればよく、特別な限定はない。
　本実施形態の酵素安定化剤の製造装置は、図１に示す製造装置１００に限定されず、本実施形態の酵素安定化剤の製造装置が奏する効果を損なわない範囲内において、図１に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
　例えば、図１に示すように、製造装置１００は、第一の蒸留装置６で蒸発させて回収された有機溶離液を貯留するように構成されたタンク１３ｄを更に備えてもよい。タンク１３ｄを備えることで、所望のタイミングでカラム５に通液するまで、有機溶離液を貯留させることができる。また、通液される有機溶離液の濃度を一定に保つことができる。
　また、例えば、図１に示すように、製造装置１００は、第二の蒸発装置７で蒸発させて回収された水を貯留するように構成されたタンク１４ａを更に備えてもよい。タンク１４ａを備えることで、所望のタイミングで第一の固液分離装置２に洗浄するまで、水を貯留させることができる。
　また、例えば、製造装置１００は、配管１３ｂの途中に、液分画をカラム５に通したフロースルー及び洗浄水をカラム５に通した洗浄液を貯留するように構成されたタンクを更に備えてもよい。配管１３ｂの途中にタンクが配設されていることで、第二の蒸留装置７に送られる溶液中のポリアルキレングリコール濃度を一定に保つことができ、第二の蒸留装置の制御がより簡便となり、且つ、エネルギーコストをより抑えることができる。
　また、例えば、製造装置１００は、タンク１４ａから水を第二の固液分離装置４に供給するように構成された配管や、タンク１４ａから水をカラム５に供給するように構成された配管を更に備えてもよい。これら配管を備えることで、水を、各製造工程における洗浄水として再利用することができる。
　図１に示す酵素安定化剤の製造装置１００を用いた酵素安定化剤の製造方法について、以下に説明する。
　まず、第一の反応槽１に、リグノセルロース系バイオマス供給手段１ｃ、ポリアルキレングリコール供給手段１ｄ及び第一の酸供給手段１ｅにより、リグノセルロース系バイオマス、ポリアルキレングリコール及び第一の酸を添加する。各材料の種類、添加量、反応温度及び反応時間は、上述の酵素安定化剤の製造方法に記載されたとおりである。上記材料を反応させて、リグニン誘導体を生成させる。
　次いで、反応後のリグニン誘導体を含む反応液に、アルカリ供給手段１ａからアルカリを添加して、反応液を中和し、リグニン誘導体を液側に抽出する。アルカリの種類、添加量は、上述の酵素安定化剤の製造方法に記載されたとおりである。次いで、中和抽出された反応液は、ポンプ９ｂにより送液量を調整しながら配管９ａを介して、第一の固液分離装置２に送られる。第一の固液分離装置２において、送られた反応液から固形分画を取り除き、液分画を得る。固形分は配管１０ａを介して排出される。
　一方、得られた液分画は、配管１０ｂを介して、第二の反応槽３に送られ、第二の酸供給手段３ａにより、第二の酸が添加される。反応液（酸性液）は配管１１を介して第二の固液分離装置４に送られ、ここで、未反応のリグニン及び疎水性リグニン誘導体を含む固形物が固形分画として配管１２ａを介して排出される。
　一方、得られた液分画には、親水性リグニン誘導体の他に未反応のポリアルキレングリコールが含まれる。そのため、液分画は、配管１２ｂを介して、カラム５に送られる。液分画をカラム５に通液することで、液分画中に親水性リグニン誘導体を合成吸着剤に吸着させる。一方、カラム５を通液したフロースルーは、配管１３ｂを介して第二の蒸留装置７に送られる。
　また、液分画を通液した後のカラム５に水を通液することで、カラム内の合成吸着剤を洗浄することで、カラム５内に残存するポリアルキレングリコールをより効率的に回収することができる。カラム５内を通液した洗浄液は、上述したフロースルーと同様に、配管１３ｂを介して第二の蒸留装置７に送られる。
　次いで、有機溶離液をカラム５に通液して、合成吸着剤に吸着していた親水性リグニン誘導体を溶出する。得られた溶出液は、配管１３ａを介して、第一の蒸留装置６に送られ、塔頂から有機溶離液が蒸発により排出される。
　一方、塔底に残留した溶液には親水性リグニン誘導体が濃縮されている。濃縮精製された親水性リグニン誘導体はそのままバイオエタノール製造の糖化工程において、酵素安定化剤として用いることができる。
　得られた親水性リグニン誘導体は、発酵阻害物質等の夾雑物が除去された高純度のものであるため、酵素の失活を防ぎ、酵素活性を安定化することができ、糖化効率及び続く発酵効率を向上させることができる。
　また、上述したように、フロースルー及び洗浄液は、配管１３ｂを介して、第二の蒸留装置７に送られ、蒸発により、水が塔頂から排出される。
　排出された水は、凝縮器（コンデンサー）８で濃縮及び冷却されて、配管１４ｂを介してタンク１４ａに送られて、貯留される。タンク１４ａに貯留された水は、所望のタイミングで、配管１４ｃを介して、第一の固液分離装置２に送られて、洗浄水として利用される。
　一方、塔底に残留した溶液にはポリアルキレングリコールが濃縮されている。濃縮精製されたポリアルキレングリコールは、配管１４ｄを介してポリアルキレングリコール供給手段１ｄに送られて、貯留される。ポリアルキレングリコール供給手段１ｄに貯留されたポリアルキレングリコールは、所望のタイミングで、第一の反応槽１に添加されて、酸加溶媒分解反応に利用される。これにより、本実施形態の製造方法は、これまで製造コストの半分以上を占めていたポリアルキレングリコールの回収及び再利用を達成でき、事業採算性を確保することができる。
　なお、製造の立ち上げ時には、有機溶離液、ポリアルキレングリコール及び洗浄水は、新品のものを供給する。しかしながら、立ち上げ後、２サイクル目以降には、ポリアルキレングリコールの再利用率約６５質量％以上を達成することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（合成吸着剤の検討１）
１．親水性リグニン誘導体の調製
　バガス乾燥重量２５０ｇに、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、ライオン社製）７４６．２６ｇと９５質量％硫酸３．７４ｇを加え、１５０℃に加熱し、９０分間撹拌して反応させた。反応終了後、０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１５００ｍＬを加えて中和し、リグニン誘導体を抽出した。得られた反応液を遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）し、固形分を除去した。
　得られた上清に３Ｎ硫酸をｐＨ２になるまで加えた。硫酸により沈殿する沈殿物を１３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得た。
２．カラム処理
　カラム（アズワン社製、バイオカラムＣＦ－１８）に以下の表１に示す合成吸着剤（膨潤充填量４０ｍＬ）を充填し、液分画８０ｍＬを通液して、親水性リグニン誘導体を精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、カラム処理における各種条件は以下のとおりである。また、独立した試験を、同じカラムを用いて２回行った（Ｃｙｃｌｅ　１、Ｃｙｃｌｅ２）。
（条件）
（１）工程（６）：液分画通液時（※通液後、フロースルーを回収）
　液分画：８０ｍＬ
　インキュベーター温度：４０℃
　送液速度：３．３５ｍＬ／分
　空間速度（Ｓ．Ｖ．）：５Ｌ／時間／充填樹脂Ｌ
（２）工程（８）：有機溶離液通液時（※通液後、溶出液を回収）
　有機溶離液：８０質量％濃度のエタノール１６０ｍＬ
　インキュベーター温度：４０℃
　送液速度：２．０１ｍＬ／分
　空間速度（Ｓ．Ｖ．）：３Ｌ／時間／充填樹脂Ｌ
　液分画通液後のフロースルーについて、ＨＰＬＣによる分析を行い、通液前の液分画中及びフロースルー中に含まれるＰＥＧ４００の濃度をそれぞれ測定した。ＨＰＬＣによる分析条件は以下に示すとおりである。
（分析条件）
　ＨＰＬＣ：島津社製高速液体クロマトグラフシステム（検出器　ＲＩＤ）
　カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＳＵＧＡＲ　ＳＨ１０１１
　ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＳＵＧＡＲ　ＳＨ－Ｇ
　移動相：０．００１Ｎ硫酸
　流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：７５℃
　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ：６０分
　次いで、ＰＥＧ回収率（質量％）を以下に示す式を用いて算出した。結果を図２（右）に示す。
　（ＰＥＧ回収率）
＝（フロースルー中に含まれるＰＥＧの質量）／（投入したＰＥＧの質量）×１００
　（フロースルー中に含まれるＰＥＧの質量）
＝（フロースルー中に含まれるＰＥＧの濃度）×（回収したフロースルーの容量）
　（投入したＰＥＧの質量）
＝（通液前の液分画中に含まれるＰＥＧの濃度）×（液分画の容量）
　有機溶離液通液後の溶出液について、非還元法による分析を行い、通液前の液分画中及び溶出液中に含まれる親水性リグニン誘導体の濃度をそれぞれ測定した。具体的には、任意容量のサンプルを２－プロパノールと０．２Ｍ水酸化ナトリウムの混合液（容量比１：１）で１０ｍＬに定容した。そこから、２ｍＬ量り取り、酢酸１２０μＬを添加し、２－プロパノールと蒸留水の混合液（容量比１：１）で２５ｍＬに定容した。２８０ｎｍで吸光度測定し以下の式でリグニン濃度を求めた。
　（リグニン濃度（ｇ／Ｌ））
＝（吸光度）×（希釈率）÷（吸光係数（２８．７））
　次いで、親水性リグニン誘導体の回収率（質量％）を以下に示す式を用いて算出した。結果を図２（左）に示す。
　（親水性リグニン誘導体回収率）
＝（リグニン吸着率）×（リグニン脱着率）×１００
　（リグニン吸着率）
＝[｛（投入したリグニンの質量）－（工程（６）のフロースルー中に含まれるリグニンの質量）｝／（投入したリグニンの質量）]×１００
　（リグニン脱着率）
＝｛（工程（８）の溶出液中に含まれるリグニンの質量）／（樹脂に吸着したリグニンの質量）｝×１００
　図２に示すように、含水率が５５質量％以上であり、孔径が３５０Å以下であり、且つ、比重が１．１５以下である合成吸着剤を用いた場合に、ＰＥＧ回収率が４０質量％以上であり、且つ、親水性リグニン誘導体の回収率が６０質量％以上となり、良好であった。また、メタクリル酸系合成吸着剤を用いた場合に、ＰＥＧ回収率が５５質量％超であり、且つ、親水性リグニン誘導体の回収率が８０質量％以上となり特に良好であった。
［実施例２］
（合成吸着剤の検討２）
１．親水性リグニン誘導体の調製
（１）親水性リグニン誘導体（ネピア由来）の調製
　ネピア乾燥重量２５０ｇに、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、ライオン社製）７４６．２６ｇと９５質量％硫酸３．７４ｇを加え、１５０℃に加熱し、９０分間撹拌して反応させた。反応終了後、０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１５００ｍＬを加えて中和し、リグニン誘導体を抽出した。得られた反応液を遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）し、固形分を除去した。
　得られた上清に３Ｎ硫酸をｐＨ２になるまで加えた。硫酸により沈殿する沈殿物を１３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得た。
（２）親水性リグニン誘導体（バガス発酵残渣由来）の調製
　バガスをバイオエタノール製造に供して発酵後に排出される発酵残渣乾燥重量２５０ｇに、ポリエチレングリコール６００（ＰＥＧ６００、ライオン社製）７４６．２６ｇと９５質量％硫酸３．７４ｇを加え、１５０℃に加熱し、９０分間撹拌して反応させた。反応終了後、０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１５００ｍＬを加えて中和し、リグニン誘導体を抽出した。得られた反応液を遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）し、固形分を除去した。
　得られた上清に３Ｎ硫酸をｐＨ２になるまで加えた。硫酸により沈殿する沈殿物を１３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得た。
２．カラム処理
　カラム（アズワン社製、バイオカラムＣＦ－１８）に、上記表１に示す合成吸着剤のうち、ＨＰ２ＭＧＬ、ＰＡＤ６１０、及びＰＡＤ９５０（各膨潤充填量：４０ｍＬ）を充填し、液分画８０ｍＬを通液して、親水性リグニン誘導体を精製した。
　なお、カラム処理における各種条件は以下のとおりである。また、独立した試験を、同じカラムを用いて２回行った（Ｃｙｃｌｅ　１、Ｃｙｃｌｅ２）。
（条件）
（１）工程（６）：液分画通液時（※通液後、フロースルーを回収）
　液分画：８０ｍＬ
　インキュベーター温度：４０℃
　送液速度：２．０１ｍＬ／分
　空間速度（Ｓ．Ｖ．）：３Ｌ／時間／充填樹脂Ｌ
（２）工程（６Ａ）：洗浄水通液時（※通液後、洗浄液を回収）
　蒸留水：８０ｍＬ
　インキュベーター温度：４０℃
　送液速度：３．３５ｍＬ／分
　空間速度（Ｓ．Ｖ．）：５Ｌ／時間／充填樹脂Ｌ
（３）工程（８）：有機溶離液通液時（※通液後、溶出液を回収）
　有機溶離液：８０質量％濃度のエタノール１６０ｍＬ
　インキュベーター温度：４０℃
　送液速度：２．０１ｍＬ／分
　空間速度（Ｓ．Ｖ．）：３Ｌ／時間／充填樹脂Ｌ
　液分画通液後のフロースルーについて、ＨＰＬＣによる分析を行い、通液前の液分画中、洗浄液中及びフロースルー中に含まれるＰＥＧ４００又はＰＥＧ６００の含有量をそれぞれ測定した。ＨＰＬＣによる分析条件は以下に示すとおりである。
（分析条件）
　ＨＰＬＣ：島津社製高速液体クロマトグラフシステム（検出器　ＲＩＤ）
　カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＳＵＧＡＲ　ＳＨ１０１１
　ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＳＵＧＡＲ　ＳＨ－Ｇ
　移動相：０．００１Ｎ硫酸
　流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：７５℃
　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ：６０分
　次いで、ＰＥＧ回収率（質量％）を以下に示す式を用いて算出した。結果を図３（上：ネピア由来：、下：バガス発酵残渣由来）に示す。
　（ＰＥＧ回収率）
＝（フロースルー及び洗浄液中に含まれるＰＥＧの質量）／（投入したＰＥＧの質量）×１００
　（フロースルー及び洗浄液中に含まれるＰＥＧの質量）
＝（フロースルー中に含まれるＰＥＧの濃度）×（回収したフロースルーの容量）＋（洗浄液中に含まれるＰＥＧの濃度）×（回収した洗浄液の容量）
　（投入したＰＥＧの質量）
＝（通液前の液分画中に含まれるＰＥＧの濃度）×（液分画の容量）
　有機溶離液通液後の溶出液について、非還元法による分析を行い、通液前の液分画中及び溶出液中に含まれる親水性リグニン誘導体の濃度をそれぞれ測定した。具体的には、実施例１に示す方法と同様の方法を用いて測定した。
　次いで、親水性リグニン誘導体の回収率（質量％）を以下に示す式を用いて算出した。結果を図３（上：ネピア由来：、下：バガス発酵残渣由来）に示す。
　（親水性リグニン誘導体回収率）
＝（リグニン吸着率）×（リグニン脱着率）×１００
　（リグニン吸着率）
＝[｛（投入したリグニンの質量）－（工程（６）のフロースルー及び工程（６Ａ）の洗浄液中に含まれるリグニンの質量）｝／（投入したリグニンの質量）]×１００
　（リグニン脱着率）
＝｛（工程（８）の溶出液中に含まれるリグニンの質量）／（樹脂に吸着したリグニンの質量）｝×１００
　図３に示すように、親水性リグニン誘導体（ネピア由来）では、いずれの合成吸着剤を用いた場合でも、ＰＥＧ回収率が９０質量％以上であり、且つ、親水性リグニン誘導体の回収率が７５質量％以上であり、良好であった。また、親水性リグニン誘導体（バガス由来）においても、同様に、いずれの合成吸着剤を用いた場合でも、ＰＥＧ回収率が９０質量％以上であり、且つ、親水性リグニン誘導体の回収率が８０質量％以上であり、良好であった。
　また、特に、含水率６３質量％以上であり、比重１．０９以下であり、且つ、孔径２５０Å以下である合成吸着剤を用いた場合に、ＰＥＧ回収率及び親水性リグニン誘導体の回収率がいずれも特に良好になる傾向がみられた。
［実施例３］
（溶出液を用いた単蒸留試験）
　実施例２に示す合成吸着剤のうち、ＰＡＤ９５０を用いて得られた溶出液１２０ｍＬの単蒸留試験を行った。単蒸留条件は以下のとおりである。
（単蒸留条件）
温度：６０℃
圧力：０．２ｂａｒ
時間：１時間
　蒸留後、装置に残った溶液を用いて、リグニンについては、実施例１に示した非還元法により、それ以外の成分については、実施例１に示した条件のＨＰＬＣにより分析した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、蒸留後の溶液中では、発酵阻害物質である酢酸及びフルフラールの含有量が顕著に低減されていた。
［実施例４］
（カラム処理の各種条件の検討）
１．親水性リグニン誘導体の調製
　バガス乾燥重量２５０ｇに、ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００、ライオン社製）７４６．２６ｇと９５質量％硫酸３．７４ｇを加え、１５０℃に加熱し、９０分間撹拌して反応させた。反応終了後、０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１５００ｍＬを加えて中和し、リグニン誘導体を抽出した。得られた反応液を遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）し、固形分を除去した。
　得られた上清に３Ｎ硫酸をｐＨ２になるまで加えた。硫酸により沈殿する沈殿物を１３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得た。
２．カラム処理
　カラム（アズワン社製、バイオカラムＣＦ－１８）に、実施例２に示す合成吸着剤のうち、ＰＡＤ９５０（膨潤充填量４０ｍＬ）を充填し、液分画８０ｍＬを通液して、以下の表３に示す各種条件下で親水性リグニン誘導体を精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　液分画通液後のフロースルーについて、ＨＰＬＣによる分析を行い、通液前の液分画中、洗浄液中及びフロースルー中に含まれるＰＥＧ４００の含有量をそれぞれ測定した。ＨＰＬＣによる分析条件及びＰＥＧ回収率の算出方法は、上記実施例２に記載の方法と同様の方法を用いた。結果を図４（右）に示す。
　有機溶離液通液後の溶出液について、非還元法による分析を行い、通液前の液分画中及び溶出液中に含まれる親水性リグニン誘導体の濃度をそれぞれ測定した。非還元法による分析の詳細は、実施例１に記載の方法を用いた。また、親水性リグニン誘導体の回収率（質量％）の算出方法は、上記実施例２に記載の方法と同様の方法を用いた。結果を図４（左）に示す。
　図４に示すように、いずれの条件下においても、ＰＥＧ回収率が８０質量％以上であり、且つ、親水性リグニン誘導体の回収率が７５質量％以上であり、良好であった。また、特に、カラムの通液方向が下降流であり、エタノール濃度が９０質量％（条件Ｎｏ．３）又は処理温度が２５℃（条件Ｎｏ．４）である場合に、ＰＥＧ回収率が９０質量％近くであり、且つ、親水性リグニン誘導体の回収率が９０質量％以上となり、特に良好であった。
　本実施形態の酵素安定化剤、並びに、その製造方法及び製造装置によれば、事業採算性が確保され、且つ、発酵阻害物質が除去された酵素安定化剤が得られる。
　１：第一の反応槽、１ａ：アルカリ供給手段、１ｂ：温度計、１ｃ：リグノセルロース系バイオマス供給手段、１ｄ：ポリアルキレングリコール供給手段、１ｅ：第一の酸供給手段、２：第一の固液分離装置、３：第二の反応槽、３ａ：第二の酸供給手段、４：第二の固液分離装置、５：カラム、６：第一の蒸留装置、７：第二の蒸留装置、８：凝縮器（コンデンサー）、９ａ，１０ａ，１０ｂ，１１，１２ａ，１２ｂ，１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１４ｂ，１４ｄ，１４ｃ：配管、９ｂ：ポンプ、１３ｄ，１４ａ：タンク，１００：酵素安定化剤の製造装置

Claims (14)

  1. 　以下の工程を含む、親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤の製造方法。
    　リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させる工程（１）；
    　前記工程（１）で得られた反応液にアルカリを添加して中和する工程（２）；
    　前記工程（２）で得られたアルカリ中和液を固液分離して、液分画を得る工程（３）；
    　前記工程（３）で得られた液分画に第二の酸を添加する工程（４）；
    　前記工程（４）で得られた酸性液を固液分離して、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得る工程（５）；
    　前記工程（５）で得られた液画分を、含水率が５５質量％以上であり、孔径が３５０Å以下であり、且つ、比重が１．１５以下である合成吸着剤に接触させて、前記親水性リグニン誘導体を前記合成吸着剤に吸着させる工程（６）；
    　前記工程（６）で前記合成吸着剤と接触させた後の溶液を回収した後、前記溶液から蒸留により水及びポリアルキレングリコールをそれぞれ分離し、前記水を前記工程（３）又は前記工程（５）に用いられる固液分離装置の洗浄水として再利用し、前記ポリアルキレングリコールを前記工程（１）に再利用する工程（７）；
    　有機溶離液を前記合成吸着剤に接触させて、前記工程（６）で前記合成吸着剤に吸着した前記親水性リグニン誘導体を脱着させて、溶出液を回収する工程（８）；
    　前記工程（８）で得られた溶出液から蒸留により前記親水性リグニン誘導体及び前記有機溶離液をそれぞれ分離し、前記親水性リグニン誘導体を精製する工程（９）；及び、
    　前記工程（９）で分離された前記有機溶離液を前記工程（８）に再利用する工程（１０）。
  2. 　前記工程（６）及び前記工程（７）の間に、
    　前記親水性リグニン誘導体が吸着している前記合成吸着剤に水を接触させて、前記合成吸着剤を洗浄し、洗浄液を回収する工程（６Ａ）を更に含み、
    　前記工程（７）において、前記合成吸着剤と接触させた後の溶液及び前記洗浄液を蒸留する、請求項１に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  3. 　前記合成吸着剤がメタクリル酸系合成吸着剤である、請求項１又は２に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  4. 　前記工程（６）及び前記工程（８）を、２０℃以上４０℃以下の温度下で行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  5. 　前記有機溶離液がエタノールである、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  6. 　前記エタノールの濃度が９０質量％以上である、請求項５に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  7. 　前記工程（６）及び前記工程（８）を、カラム処理法で行う、請求項１～６のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  8. 　カラムの通液方向が下降流である、請求項７に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  9. 　前記リグノセルロース系バイオマスが草本系バイオマス及びその処理物である、請求項１～８のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  10. 　前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項１～９のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法により得られ、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である、酵素安定化剤。
  12. 　基質と酵素の反応系に、請求項１～１０のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法により得られ、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である酵素安定化剤を添加することを含む、酵素の安定化方法。
  13. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の酵素安定化剤の製造方法により得られ、酵素安定化剤中の酢酸の含有量が１．３９ｇ／Ｌ以下であり、且つ、フルフラールの含有量が０．２０ｇ／Ｌ以下である酵素安定化剤を添加して、リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化反応を行うことを含む、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
  14. 　アルカリ供給手段を有し、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を反応させるように構成された第一の反応槽と、
    　第一の固液分離装置と、
    　前記第一の固液分離装置を用いて固液分離して得られた液分画と第二の酸とを反応させるように構成された第二の反応槽と、
    　第二の固液分離装置と、
    　含水率が６３質量％以上であり、孔径が２５０Å以下であり、且つ、比重が１．０９以下である合成吸着剤が充填されたカラムと、
    　親水性リグニン誘導体と有機溶離液を分離し、前記親水性リグニン誘導体を精製するように構成された第一の蒸留装置と、
    　水と前記ポリアルキレングリコールを分離するように構成された第二の蒸留装置と、
    　前記第二の蒸留装置で分離された前記水を前記第一の固液分離装置に供給するように構成された配管と、
    　前記第二の蒸留装置で分離された前記ポリアルキレングリコールを前記第一の反応槽に供給するように構成された配管と、
    　前記第一の蒸留装置で分離された前記有機溶離液を前記カラムに供給するように構成された配管と、
    を備える、酵素安定化剤の製造装置。
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