WO2023059064A1 - 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물 - Google Patents

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WO2023059064A1
WO2023059064A1 PCT/KR2022/014996 KR2022014996W WO2023059064A1 WO 2023059064 A1 WO2023059064 A1 WO 2023059064A1 KR 2022014996 W KR2022014996 W KR 2022014996W WO 2023059064 A1 WO2023059064 A1 WO 2023059064A1
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natural killer
cells
cancer
killer cells
peptide
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최인표
정해용
김한나
윤석란
변재은
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한국생명공학연구원
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving the activity of natural killer cells, and more particularly, to a composition for restoring the reduced activity of natural killer cells by TGF- ⁇ .
  • Natural killer cells are lymphocytes present in bone marrow, lymph nodes, and peripheral blood, and account for about 10 to 15% of all lymphocytes. Phenotypes are CD3-negative and CD56-positive, and as immune cells equipped with the ability to kill cancer cells or virus-infected cells, they play an important role in the innate immune response. The function of natural killer cells is regulated by the interaction between cell surface receptors and corresponding target cell ligands without stimulation of specific antigens, and these receptors are largely divided into active receptors and inhibitory receptors.
  • Active receptors that regulate the function of natural killer cells by transmitting activation signals to natural killer cells include natural cytotoxicity receptors (NCRs) such as NKp30, NKp44, and NKp46, NKG2D, and the like.
  • NCRs natural cytotoxicity receptors
  • Activated natural killer cells can destroy target cells by synthesizing various granules and secreting them out of the cells.
  • Perforin and Granzyme play a major role in destroying target cells. Perforin gathers on the cell membrane of the target cell to form a complex to open a hole in the cell membrane to cause cell lysis. by inducing cell death.
  • natural killer cells induce apoptosis of cancer cells by binding to death receptors of cancer cells using death ligands such as FasL and TRAIL.
  • death ligands such as FasL and TRAIL.
  • the binding of these receptors activates caspase-8 and caspase-10 in cancer cells, which activates caspase-3 and caspase-7, resulting in apoptosis.
  • TGF- ⁇ is a cytokine with immunosuppressive activity and suppresses the anticancer activity of T cells or natural killer cells.
  • TGF- ⁇ is produced and secreted to suppress the immune function in the microenvironment of cancer, thereby helping the growth of cancer tissues.
  • TGF- ⁇ secretion in metastatic cancer is closely related to poor cancer prognosis.
  • inhibition of TGF- ⁇ production or signaling enhances the anticancer activity of natural killer cells.
  • TGF- ⁇ suppresses the production of IFN- ⁇ of natural killer cells and suppresses the killing ability by CD16.
  • An object of the present invention is to provide a composition capable of enhancing the activity of natural killer cells.
  • the present invention provides a composition for enhancing the activity of natural killer cells, comprising a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • the present invention provides a cell therapy agent for preventing or treating cancer, including natural killer cells treated with a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same.
  • the present invention provides a method for enhancing the activity of natural killer cells, comprising treating natural killer cells with a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same.
  • the present invention provides a cancer treatment method comprising the step of administering to a subject in need of treatment a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same. .
  • the present invention comprises the steps of (a) treating natural killer cells with a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same; and (b) administering the natural killer cells of step (a) to a subject.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient; and administering natural killer cells to a subject.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention not only increases the cell killing ability of natural killer cells, but also reduces the increased homoeolysis by TGF- ⁇ , and further increases the sensitivity of natural killer cells to cancer cells. Even to improve, the peptide of the present invention can be usefully used as an active ingredient of an anticancer agent or an anticancer adjuvant.
  • Figure 1 shows the results confirming that the cell killing ability of NK92 cells, which was reduced by TGF- ⁇ , was restored by treatment with a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • 1A is a diagram schematically illustrating the principle that the peptide exhibits an effect on natural killer cells, and B, C, and D are the cell killing ability of NK92 cells against lung cancer cell line H460, lung cancer cell line H3122, and blood cancer cell line K562, respectively. It shows the experimental result of measuring .
  • Figure 2 shows the results confirming that the cell killing ability of primary NK cells reduced by TGF- ⁇ is restored by treatment with a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • 2A, B, and C show the experimental results of measuring the cell killing ability of primary NK cells for lung cancer cell line H460, lung cancer cell line H3122, and blood cancer cell line K562, respectively.
  • Figure 3 is a view showing the reduction of the killing ability of NK92 for the lung cancer cell line H460 treated with TGF- ⁇ and the restoration of the reduced sensitivity by the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1.
  • Figure 3A is an explanatory diagram schematically showing the test of NK92 cell killing ability after treatment of lung cancer cell line H460 cells with TGF- ⁇
  • Fig. 3B is an explanatory diagram schematically showing the test of NK92 cell killing ability when H460 cells are treated with TGF- ⁇ . decreased to less than half, and it was shown that the reduced killing activity was recovered by the peptide.
  • FIG. 4 shows the results of confirming that Fratricide is increased between natural killer cells by TGF- ⁇ and Fratricide is decreased by the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 4A schematically illustrates the effect of reducing the allokill of natural killer cells by using NK92 reacted with TGF- ⁇ as a target cell
  • FIG. 4B and C show NK92 and primary NK cells, respectively. It is shown that the increase in homokilling of NK-92 cells in response to TGF- ⁇ and the decrease of homokilling by the peptide.
  • FIG. 5 is a diagram showing that expression of TGF- ⁇ in lung cancer cells is inhibited by the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 5A illustrates the effect of the peptide on reducing TGF- ⁇ expression in lung cancer cell line H460 cells
  • FIG. 5B shows that the peptide reduces TGF- ⁇ expression in H460 cells.
  • One aspect of the present invention provides a composition for enhancing the activity of natural killer cells.
  • composition for enhancing the activity of natural killer cells of the present invention includes, as an active ingredient, a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof, or a polynucleotide encoding the peptide.
  • the peptide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof, or may consist only of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof.
  • a functional equivalent of the peptide is that some or all of the 13 amino acids constituting the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids, some of the 13 amino acids are deleted, or at least one of the 13 amino acids Amino acids of are added, or some or all of the 13 amino acids are modified, and may have the activity of a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid substitution may be a conservative substitution, for example, mutual substitution between aliphatic uncharged amino acids (Gly, Ala, Val, Leu, Ile), and mutual substitution between hydrophilic uncharged amino acids (Ser, Thr, Asn, Gln). , mutual substitution between aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), mutual substitution between acidic amino acids (Asp, Glu), mutual substitution between basic amino acids (His, Lys, Arg), non-polar uncharged amino acids (Cys, Met) , Pro) and the like.
  • Deletion or addition of the amino acid may occur, for example, in a part that is not directly involved in a part that does not affect the activity of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and in particular, the addition of an amino acid is At least one amino acid may be inserted at the N-terminus or C-terminus as well as in the middle of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • modification of the amino acid may be phosphorylation, acetylation, methylation, glycosylation, or the like, of some or all of the 13 amino acids constituting the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the functional equivalent is one having at least 60% homology, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80% or at least 85%, for example at least 90% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. can
  • the polynucleotide may encode the peptide, and may have, for example, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or an equivalent nucleotide sequence.
  • the equivalent nucleotide sequence is different from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but means that the sequence of the encoding peptide is the same as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the equivalent nucleotide sequence may have 60% or more homology, 70% or more, 80% or more, or 90% or more, for example, 95% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide may be included in a vector.
  • the vector is preferably self-replicating, and more preferably capable of expressing the polynucleotide, such as a plasmid, cosmid, or phage.
  • the vector containing the polynucleotide may be transformed into a host cell.
  • the host cell is preferably capable of expressing a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an equivalent thereof from the polynucleotide contained in the vector, and further secreting the expressed peptide to the outside of the cell may be more desirable.
  • the natural killer cells are cytotoxic lymphocytes constituting a major component of the innate immune system, and are defined as large granular lymphocytes (LGL) and play an important role in the innate and adaptive immune systems.
  • the natural killer cells may include natural killer progenitor cells as well as mature natural killer cells.
  • the natural killer cells may be derived from mammals, and the mammals may be humans, monkeys, goats, sheep, rats, mice, etc., and in particular, humans, monkeys, or mice.
  • the activity of the natural killer cells may be the ability to kill target cells such as cancer cells or virus-infected cells, degranulation of natural killer cells, stimulation of activating receptors of natural killer cells, or inactivation of inhibitory receptors,
  • the activating receptors may be NKG2D, 2B4, DNAM-1, NCRs, and the like, and the inhibitory receptors PD-1, LAG-3, TIM-3, and the like.
  • Improving the activity of natural killer cells may mean an increase in cytotoxicity of natural killer cells against target cells, a decrease in homoeostasis (fratricide), an improvement in sensitivity to target cells, and the like. there is.
  • the increase in the cell killing ability of the natural killer cells may be an increase in the expression or secretion of substances involved in killing target cells, such as perforin, granzyme, and interferon, or including the above substances. It may be that the degranulation of the granules is increased.
  • the perforin may be Perforin-1, Perforin-2, etc.
  • the granzyme may be granzyme A, granzyme B, granzyme H, granzyme K, granzyme M, etc.
  • the interferon may be interferon It may be a type 1 interferon such as - ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , or interferon- ⁇ , a type 2 interferon such as interferon- ⁇ , or a type 3 interferon such as interferon-L1.
  • the homokiller may mean that natural killer cells exhibit cell killing ability to each other, that is, a phenomenon in which natural killer cells themselves act as effector cells and target cells at the same time.
  • Allokill among the natural killer cells can be increased by TGF- ⁇ , and the decrease in the homokiller of the natural killer cells means that the degree to which natural killer cells recognize other natural killer cells as target cells is reduced. .
  • the improvement of the sensitivity of the natural killer cells to the target cells means that the natural killer cells can more easily recognize the target cells.
  • the cell killing ability of lung cancer cell lines and blood cancer cell lines of NK92 or primary natural killer cells reduced by TGF- ⁇ is restored by treatment with a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (see FIGS. 1 and 2), and the sensitivity of NK92 or primary natural killer cells reduced by TGF- ⁇ to lung cancer cell lines is restored (see FIG. 3), while natural killer cells increased by TGF- ⁇
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof or a polynucleotide encoding the peptide of the present invention can enhance the activity of natural killer cells It can be used as an active ingredient for
  • another aspect of the present invention provides a method for enhancing the activity of natural killer cells, comprising the step of treating natural killer cells with the above-described peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same.
  • composition for enhancing the activity of natural killer cells may be used as an anticancer agent or an anticancer adjuvant. Therefore, another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, wherein the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprises a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof, or the peptide A polynucleotide encoding a may be included as an active ingredient.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 when administered to an animal model transplanted with melanoma cells, the number of cancer nodules metastasizing to the lung is reduced compared to the negative control.
  • Confirmed Bar (see FIG. 6), a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention or a functional equivalent thereof, or a polynucleotide encoding the peptide can be used as an active ingredient for preventing or treating cancer.
  • the cancer generally refers to a physiological state of mammals characterized by unregulated cell growth, and abnormal proliferation occurs due to problems in the regulation function of normal division, differentiation, and death of cells, resulting in damage to surrounding tissues and organs. It refers to a state in which a lump is formed by infiltration and the existing structure is destroyed or transformed.
  • the cancer may be solid cancer or metastatic cancer, such as colorectal cancer including colon cancer and rectal cancer, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, prostate cancer, brain tumor, head and neck carcinoma, melanoma, myeloma, leukemia, lymphoma, stomach cancer, lung cancer , pancreatic cancer, liver cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, bladder cancer, kidney cancer, ureteric cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, bone cancer, skin cancer , head cancer, neck cancer, skin melanoma, intraocular melanoma, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, central nervous system (CNS) tumor, primary CNS lymphoma .
  • CNS central nervous system
  • the prevention refers to any action that inhibits or delays the occurrence or progression of cancer, and the treatment includes not only the death of cancer cells, but also the reduction of growth of cancer cells, reduction of recurrence, anticancer activity of the immune system against cancer cells, and immunity. It refers to any effect in which cancer cells do not deteriorate further, such as memory formation or reduction of cancer cell invasion, but is not limited thereto.
  • composition may further contain other active ingredients exhibiting anticancer activity.
  • composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or additives in addition to the above active ingredients.
  • the meaning of 'pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity more than is adaptable to the subject of application (prescription).
  • the carrier is defined as a compound that facilitates the addition of the compound into cells or tissues.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof, or the polynucleotide encoding the peptide of the present invention can be administered alone or in combination with any convenient carrier, and such dosage forms can be administered single or repeated. It may be a dosage form.
  • the composition may be a solid formulation or a liquid formulation. Solid preparations include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, and suppositories. Solid formulations may include carriers, flavoring agents, binders, preservatives, disintegrants, lubricants, fillers, and the like, but are not limited thereto.
  • Liquid preparations include solutions, suspensions, and emulsions such as water and propylene glycol solutions, but are not limited thereto, and may be prepared by adding appropriate colorants, flavoring agents, stabilizers, viscosifiers, and the like.
  • the powder contains a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is an active ingredient of the present invention, or a functional equivalent thereof, or a polynucleotide encoding the peptide, and a suitable pharmaceutically acceptable carrier such as lactose, starch, or microcrystalline cellulose. It can be prepared by simple mixing.
  • the granule is a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention or a functional equivalent thereof, or a polynucleotide encoding the peptide, a suitable pharmaceutically acceptable carrier, and pharmaceuticals such as polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.
  • a suitable pharmaceutically acceptable carrier such as water, ethanol, isopropanol, or the like
  • a dry granulation method using compression force may be prepared by mixing the granules with a suitable pharmaceutically acceptable lubricant such as magnesium stearate and then tableting them using a tableting machine.
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent thereof or a polynucleotide encoding the peptide of the present invention may be used as an oral agent or an injection (eg, intramuscular injection, intraperitoneal injection), depending on the disease to be treated and the condition of the individual. It may be administered by injection, intravenous injection, infusion, subcutaneous injection, implant), inhalant, nasal agent, vaginal agent, rectal agent, sublingual agent, transdermal agent, topical agent, etc., but is not limited thereto. Depending on the route of administration, it can be formulated into an appropriate dosage unit formulation containing a pharmaceutically acceptable carrier, excipients, and vehicles that are commonly used and non-toxic.
  • the composition may be administered at about 0.0001 mg/kg to about 10 g/kg daily, and at a daily dosage of about 0.001 mg/kg to about 1 g/kg.
  • the dosage may vary depending on the degree of purification of the mixture, the patient's condition (age, sex, weight, etc.), the severity of the condition being treated, and the like. If necessary, for convenience, the total daily dose may be administered in several divided doses throughout the day.
  • another aspect of the present invention provides a cell therapy agent for preventing or treating cancer, including natural killer cells treated with a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same.
  • cellular therapeutic agent refers to cells and tissues manufactured through isolation, culture, and special manipulation from an object, and is a drug (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention.
  • drug US FDA regulation
  • living autologous, allogenic, and xenogenic cells are proliferated in vitro, selected, or the biological characteristics of cells are changed in other ways. Means medicines used for their intended purpose.
  • a therapeutic agent used for the treatment of cancer refers to a therapeutic agent used for the treatment of cancer, and includes, as an active ingredient, a natural killer cell whose killing power against cancer cells is increased by treating a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 described above or a polynucleotide encoding the same. It can be used as a cell therapy for the treatment and prevention of cancer.
  • another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the above-described peptide, subject It provides a cancer treatment method comprising the step of administering to.
  • Another aspect of the present invention also provides a method of treating cancer comprising the steps of:
  • step (b) administering the natural killer cells of step (a) to a subject.
  • the method of the present invention uses natural killer cells having increased killing power against cancer cells by treating the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the same, redundant descriptions thereof are omitted to avoid excessive complexity in the present specification.
  • NK92 cells were cultured in ⁇ -MEM (Welgene) culture medium supplemented with 12.5% FBS (Fetal Bovine Serum, Corning, united states origin, 35-015-CV) and 12.5% horse serum (Gibco) in accordance with ATCC culture conditions in 0.2 mM M.I. Oinositol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) and IL-2 cytokine (Peprotech) were added at a concentration of 20 ng/ml and used as a culture medium. It was cultured in a 37 °C CO 2 incubator (water jacketed incubator, Thermo electron corporation) supplied with % CO 2 .
  • the cells were cultured in a T-75 flask (Thermo) in 20-30 ml at a concentration of 1x10 5 cell/ml, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes every 2-3 days with a Beckman Coulter to obtain the supernatant. After removal, the culture medium was exchanged.
  • the CD3-separated cells were reacted with 10 ml of ACK buffer for 10 minutes to remove remaining red blood cells, and then washed twice using phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with 2% FBS. Washing was carried out by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes in a Beckman Coulter to remove the supernatant. Using the cells thus obtained, culture was performed as natural killer cells.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the natural killer cell culture condition was 10 ng/ml IL-15 (Peprotech), 10 ng/ml IL-21 ( Peprotech), 10 -6 M hydrocortisone (Hydrocortisone, Peprotech) and 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) were added and cultured.
  • the cell culture concentration was cultured in a 6-well plate at a concentration of 2x10 6 cell / ml, and centrifuged with a centrifuge (Beckman Coulter) at 1200 rpm for 5 minutes every 2-3 days to remove the supernatant, and then exchange the culture medium. .
  • FACS flow cytometry was performed by dispensing 2x10 4 cells into a FACS tube (Falcon), centrifuging with FBS-added PBS (FACS buffer) at 1500 rpm for 3 minutes in a centrifuge (Beckman Coulter), washing, and then removing the supernatant. Then, 100 ul of FACS buffer was added again to proceed.
  • lung cancer cell lines H460 and H3122 were cultured and used as target cell lines.
  • H460 and H3122 cells were cultured in RPMI (Welgene) supplemented with 10% FBS (Corning, united states origin, 35-015-CV) and 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) was added according to ATCC culture conditions.
  • the culture medium was used and cultured in a 37°C CO 2 incubator (water jacketed CO 2 incubator, Thermo electron corporation) supplied with 5% CO 2 .
  • the cells were cultured at a concentration of 2x10 5 cell/ml in an amount of about 10 ml in a 100 mm x 20 mm cell culture dish (corning). Cells were observed and culture medium exchanged every 2-3 days.
  • a hematological cancer cell line K562 was cultured and used as a target cell line.
  • K562 cells were treated with 1% antibiotics-antimycotic (Gibco) in RPMI (Welgene) culture medium supplemented with 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Corning, united states origin, 35-015-CV) according to ATCC culture conditions.
  • the added culture medium was used and cultured in a 37°C CO 2 incubator (water jacketed CO 2 incubator, Thermo electron corporation) supplied with 5% CO 2 .
  • the cells were cultured at a concentration of 2x10 5 cells/ml in about 20ml in a 75T Flask (corning). Culture medium was exchanged every 2-3 days.
  • a peptide consisting of 13 amino acids of SEQ ID NO: 1 was synthesized by requesting Peptron Co., Ltd. (Peptron, Daejeon, Korea), and used in the following experiments.
  • a TGF- ⁇ signal inhibitor was added to 1x10 5 cell/ml of NK92 cells or primary NK cells, respectively, at 37° C. for 2 hours After each incubation, 10 ng/ml of TGF- ⁇ was added and cultured again under the same conditions for 24 hours. Then, 20 ⁇ M of the peptide of Example [1-5] or 5 ⁇ M of SB431542 was added and cultured at 37° C. for 2 hours, then 10 ng/ml of TGF- ⁇ was added and cultured for 24 hours under the same conditions. . NK92 cells and primary NK cells cultured as described above were used as effector cells for the killing ability test.
  • lung cancer cell lines H460 and H3122 cells and blood cancer cell line K562 were used as target cells for evaluating cell killing ability.
  • Each of the H460, H3122 and K562 cell lines of 1x10 6 cells/ml was dyed by culturing at 37° C. for 1 hour with a culture solution supplemented with 5ul of calcein-AM (calcein-AM, invitrogen), followed by staining at 1000 rpm for 5 minutes. Washed by centrifugation.
  • Example [2-2] Each of the target cells stained with calcein-AM in Example [2-2] was dispensed into a 96-well plate, and the effector cells prepared in Example [2-1] were treated.
  • E: T ratio the ratio of effector cells and target cells
  • E: T ratio The ratio was 10:1 and incubated at 37°C for 4 hours.
  • the culture cultured as described above was centrifuged at 100 rcf for 5 minutes to separate the supernatant, which was dispensed in 100 ul each into a 96-well black plate, and then ELISA analysis was performed (fluorescence 480 nm / 530 nm, SpectraMax i3x Molecular Device). .
  • the cell killing ability of NK92 cells was reduced by TGF- ⁇ for all three types of target cells, but the peptide of Example [1-5] or SB431542 reduced NK92 cells. It was confirmed that the cell killing ability of was restored again. In addition, the same effect of restoring the cell killing ability of natural killer cells by the peptides of Examples [1-5] was confirmed not only in NK92 cells, but also in primary NK cells as shown in FIG. 2.
  • Each of the target cells stained with Calcein-AM as described above was dispensed into a 96-well plate, and fresh NK92 cells were used as the main effector cells and treated so that the E: T ratio was 20: 1, and 37 Incubated for 4 hours at °C.
  • the culture cultured as described above was centrifuged at 100 rcf for 5 minutes to separate the supernatant, which was dispensed in 100 ul each on a 96-well black plate, and then ELISA analysis was performed (fluorescence 480 nm / 530 nm, SpectraMax i3x Molecular Device).
  • Example [2-1] 1x10 6 cells/ml of NK92 cells cultured in the same manner as in Example [2-1], 5ul of calcein-AM (calcein-AM, invitrogen) was added to the culture medium at 37 °C 1 After staining by incubation for a period of time, the cells were washed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes and prepared as 'target' cells. Each of the target cells stained with Calcein-AM as described above was dispensed into a 96-well plate, and fresh NK92 cells or primary NK cells were used as main effector cells, and the above Example [2-3] As in, it was treated at a ratio of 20:1 or 10:1 and incubated at 37°C for 4 hours.
  • the culture cultured as described above was centrifuged at 100 rcf for 5 minutes to separate the supernatant, which was dispensed in 100 ul each into a 96-well black plate, and then ELISA analysis was performed (fluorescence 480 nm / 530 nm, SpectraMax i3x Molecular Device). .
  • 2x10 5 cells / ml of lung cancer cell line H460 was cultured for 2 hours to stabilize it, and then treated with the peptides of Examples [1-5] at concentrations of 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, and 20 ⁇ M, respectively, or SB431542 at a concentration of 5 ⁇ M , and cultured at 37° C. for 24 hours, then treated with the same concentration of the peptide or SB431542 of Example [1-5], and then cultured at 37° C. for 24 hours.
  • the culture cultured as above was centrifuged at 100 rcf for 5 minutes to separate the supernatant and the pellet, and the supernatant was dispensed in 100 ul each on a 96-well black plate, and then ELISA analysis was performed (absorption 450 nm, SpectraMax i3x Molecular Device) The amount of secretion of TGF- ⁇ was measured.
  • Example [1-5] In order to confirm the anticancer effect of the peptide prepared in Example [1-5] in vivo , 24-month-old C57BL6J mice were given 25 mg/kg of the peptide of Example [1-5] once a week. It was intraperitoneally administered 4 times for 4 weeks at intervals. Then, 4x10 5 B16F10 melanomas per mouse were administered through the tail vein, and the number of cancer nodules metastasized to the lungs was counted to confirm anticancer effects.

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Abstract

본 발명은 자연살해 세포의 활성을 향상시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물을 제공한다. 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 자연살해 세포의 세포 살상능을 증가시킬 뿐만 아니라, TGF-β에 의해 증가된 동종살해를 감소시키고, 나아가 자연살해 세포의 암 세포에 대한 민감도를 향상시키기까지 하는바, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 항암제 또는 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

자연살해 세포의 활성 향상용 조성물
본 발명은 자연살해 세포의 활성을 향상시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 TGF-β에 의한 저하된 자연살해 세포의 활성을 회복시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
자연살해 세포(natural killer cell, NK cell)는 골수, 림프절, 말초혈액에 존재하는 림프구로, 전체 림프구의 약 10~15%를 차지한다. 표현형으로는 CD3 음성, CD56 양성인 것이 특징이며, 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포를 살상할 수 있는 능력을 갖춘 면역세포로서 선천성 면역반응에 중요한 역할을 담당하고 있다. 자연살해 세포는 특정한 항원의 자극 없이 세포 표면의 수용체와 그에 대응하는 표적세포 리간드의 상호작용에 의해 기능이 조절되고, 이들 수용체는 크게 활성 수용체와 억제 수용체로 구분된다. 자연살해 세포에 활성화 신호를 전달하여 자연살해 세포의 기능을 조절하는 활성 수용체에는 대표적으로 NKp30, NKp44, NKp46 등과 같은 NCRs(natural cytotoxicity receptors), NKG2D 등이 잘 알려져 있다. 활성화된 자연살해 세포는 다양한 과립(granule)들을 합성하고 세포 밖으로 분비하여 표적세포를 파괴할 수 있다. 과립에 포함되어 있는 대표적인 단백질 중 퍼포린(Perforin)과 그랜자임(Granzyme)은 표적세포를 파괴하는데 주요한 역할을 한다. 퍼포린은 표적세포의 세포막에 모여 복합체를 형성하여 세포막에 구멍을 뚫어 세포의 용해를 일으키며, 그랜자임은 세포에 생성된 구멍을 통해 세포 내로 들어가서 카스파아제(caspase)를 활성화시킬 뿐만 아니라 다양한 기전을 통해 세포고사(cell death)를 유도한다. 또한 자연살해 세포는 FasL, TRAIL과 같은 사멸 리간드(death ligand)를 이용하여 암 세포의 사멸 수용체(death receptor)와 결합함으로써 암 세포의 세포 자살을 유도한다. 이 수용체들의 결합은 암 세포내의 카스파아제-8, 카스파아제-10을 활성화시키고 이로 인해 카스파아제-3, 카스파아제-7이 활성화되어 결과적으로 세포 자살이 일어나게 되는 것이다.
이러한 특성으로 자연살해 세포를 항암치료에 적용해 왔다. 그러나 대부분 성공적인 치료는 혈액암에 국한되었고 고형암에서는 그 효과가 미미하였다. 고형암 치료에서는 일단 자연살해 세포가 고형암의 조직으로 이동하고 침투하는 것부터가 어렵다. 뿐만 아니라 암 조직에 들어갔다 하더라도, 암 조직이 가지고 있는 면역억제 미세환경으로 인해 적절한 항암효과를 내지 못하고 있다.
한편, TGF-β는 면역억제 활성을 가진 사이토카인으로 T 세포나 자연살해 세포의 항암 활성을 억제한다. 특히, 고형암에서는 TGF-β가 생산이 되고 분비되어 암의 미세환경 내의 면역 기능을 억제함으로 암 조직의 성장에 도움을 준다. 전이가 되는 암에서의 TGF-β 분비는 암의 나쁜 예후와 밀접한 관계가 있다. 실제로, TGF-β 생산이나 신호전달을 억제하면 자연살해 세포의 항암 활성이 향상된다. TGF-β는 자연살해 세포의 IFN-γ의 생산을 억제하고 CD16에 의한 살상능을 억제한다.
이에, TGF-β에 의해 억제된 자연살해 세포의 활성 회복이나 고형암 또는 전이암에 대한 항암 면역 활성을 향상시키기 위한 성분의 연구 및 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 자연살해 세포의 활성을 향상시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리한 자연살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 자연살해 세포에 처리하는 단계를 포함하는 자연살해 세포의 활성 향상 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 자연살해 세포에 처리하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 자연살해 세포를 대상(subject)에게 투여하는 단계;를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 자연살해 세포를, 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 자연살해 세포의 세포 살상능을 증가시킬 뿐만 아니라, TGF-β에 의해 증가된 동종살해를 감소시키고, 나아가 자연살해 세포의 암 세포에 대한 민감도를 향상시키기까지 하는바, 본 발명의 상기 펩타이드는 항암제 또는 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 TGF-β에 의해 감소된 NK92 세포의 세포 살상능이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 처리에 의해 회복됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 A는 상기 펩타이드가 자연살해 세포에서 효과를 나타내는 원리를 개략적으로 설명한 도면이고, B, C 및 D는 각각 폐암세포주 H460, 폐암세포주 H3122 및 혈액암세포주 K562에 대한 NK92 세포의 세포 살상능을 측정한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 TGF-β에 의해 감소된 1차 NK 세포의 세포 살상능이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 처리에 의해 회복됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 A, B 및 C는 각각 폐암세포주인 H460, 폐암세포주 H3122 및 혈액암세포주인 K562에 대한 1차 NK 세포의 세포 살상능을 측정한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 TGF-β를 처리한 폐암세포주 H460에 대한 NK92의 살상능 감소 및 서열번호 1의 아미노산을 갖는 펩타이드에 의해 저하된 민감도의 회복을 나타낸 도면이다. 도 3의 A는 폐암세포주인 H460 세포에 TGF-β를 처리한 후 NK92세포 살상능을 시험을 개략적으로 나타낸 설명도이고, 도 3의 B는 TGF-β를 H460세포에 처리하면 NK92의 살상능이 절반 이하로 감소하고, 감소된 살상능이 상기 펩타이드에 의해 회복되는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 TGF-β에 의해 자연살해 세포간 동종살해(fratricide)의 증가함 및 서열번호 1의 아미노산을 갖는 펩타이드에 의해 동종살해가 감소함을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 A는 TGF-β를 첨가하여 반응시킨 NK92를 표적세포로 하여 자연살해 세포의 동종살해가 감소하는 효과를 개략적으로 설명한 것이고, 도 4의 B 및 C는 각각 NK92와 1차 NK 세포가 TGF-β에 반응한 NK-92 세포에 대한 동종살해의 증가 및 상기 펩타이드에 의해 동종살해가 감소함을 나타낸 것이다
도 5는 서열번호 1의 아미노산을 갖는 펩타이드에 의해 폐암세포에서의 TGF-β 발현이 억제됨을 나타낸 도이다. 도 5의 A는 상기 펩타이드가 폐암세포주 H460 세포에서 TGF-β 발현을 감소하는 효과를 설명한 것이고, 도 5의 B는 상기 펩타이드에 의해 H460세포에서 TGF-β의 발현이 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 상기 펩타이드가 동물모델에서 B16F10 흑색종의 폐 전이를 억제함을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다.
상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 포함하는 것일 수 있고, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물만으로 이루어지는 것일 수도 있다. 상기 펩타이드의 기능적 등가물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 구성하는 13개의 아미노산들 중 일부 또는 전부가 다른 아미노산으로 치환되거나, 상기 13개의 아미노산들 중 일부가 결실되거나, 상기 13개의 아미노산들에 적어도 하나의 아미노산이 부가되거나, 또는 상기 13개의 아미노산들 중 일부 또는 전부가 변형(modification)된 것으로서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 보존적 치환일 수 있고, 예컨대 지방족 비하전 아미노산들(Gly, Ala, Val, Leu, Ile) 간의 상호치환, 친수성 비하전 아미노산들(Ser, Thr, Asn, Gln) 간의 상호치환, 방향족 아미노산들(Phe, Tyr, Trp) 간의 상호치환, 산성 아미노산들(Asp, Glu)간의 상호치환, 염기성 아미노산들(His, Lys, Arg) 간의 상호치환, 비극성 비하전 아미노산들(Cys, Met, Pro) 간의 상호치환 등일 수 있다. 상기 아미노산의 결실 또는 부가는 예컨대 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 부분에서 직접 관여하지 않는 부분에서 일어날 수 있으며, 특히 아미노산의 부가는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단은 물론, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 중간에 적어도 하나의 아미노산이 삽입되는 것일 수 있다. 또한, 상기 아미노산의 변형(modification)은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 구성하는 13개의 아미노산들 중 일부 또는 전부에 인산화, 아세틸화, 메틸화, 당쇄화 등이 일어난 것일 수 있다. 경우에 따라서는 상기 기능적 등가물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 또는 85% 이상, 예컨대 90% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩타이드를 암호화하는 것일 수 있고, 예컨대 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 등가의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 등가의 염기서열은 상기 서열번호 2의 염기서열과는 상이하나, 암호화하는 펩타이드의 서열이 서열번호 2의 염기서열과 동일한 것을 의미한다. 경우에 따라서는 상기 등가의 염기서열은 상기 서열번호 2의 염기서열과 60% 이상의 상동성, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 예컨대 95% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 자가 복제될 수 있는 것이 바람직하고, 나아가 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수도 있는 것이 더욱 바람직할 수 있고, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파아지 등일 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터는 숙주세포 내에 형질전환된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 벡터에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 등가물을 갖는 펩타이드를 발현시킬 수 있는 것이 바람직하고, 나아가 상기와 같이 발현된 펩타이드를 세포 외부로 분비할 수 있는 것이 더욱 바람직할 수 있다.
상기 자연살해 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형 과립 림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 선청성 면역계와 적응면역계에서 중요한 역할을 담당한다. 상기 자연살해 세포는 성숙한 자연살해 세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 자연살해 세포는 포유동물 유래일 수 있고, 상기 포유동물은 인간, 원숭이, 염소, 양, 랫, 마우스 등일 수 있고, 특히 인간, 원숭이 또는 마우스일 수 있다.
상기 자연살해 세포의 활성은 암 세포 또는 바이러스에 감염된 세포 등과 같은 표적세포에 대한 살상능, 자연살해 세포의 탈과립화 현상 또는 자연살해 세포의 활성화 수용체가 자극되거나 억제성 수용체가 비활성화되는 것일 수 있고, 이때 상기 활성화 수용체는 NKG2D, 2B4, DNAM-1, NCRs 등일 수 있고, 상기 억제성 수용체 PD-1, LAG-3, TIM-3 등일 수 있다.
상기 자연살해 세포의 활성이 향상된다는 것은 자연살해 세포의 표적세포에 대한 세포 살상능(cytotoxicity)의 증가, 동종살해(fratricide)의 감소, 표적세포에 대한 민감도(sensitivity)의 향상 등을 의미할 수 있다. 상기 자연살해 세포의 세포 살상능의 증가는 표적세포를 사멸(cell death)시키는데 관여하는 퍼포린, 그랜자임, 인터페론 등의 물질의 발현이나 분비가 증가되는 것일 수 있고, 또는 상기와 같은 물질들이 포함된 과립(granule)의 탈과립화가 증가되는 것일 수 있다. 특히, 상기 퍼포린은 퍼포린-1, 퍼포린-2 등일 수 있고, 상기 그랜자임은 그랜자임 A, 그랜자임 B, 그랜자임 H, 그랜자임 K, 그랜자임 M 등일 수 있고, 상기 인터페론은 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-κ, 인터페론-ω 등과 같은 1형 인터페론이나, 인터페론-γ과 같은 2형 인터페론, 또는 인터페론-L1과 같은 3형 인터페론일 수 있다. 또한, 상기 동종살해는 자연살해 세포들 상호간에 세포 살상능을 나타내는 것, 다시 말해서 자연살해 세포 자체가 주효세포(effector cell)이면서 동시에 표적세포(target cell)로서 작용하는 현상을 의미할 수 있다. 상기 자연살해 세포들 간의 동종살해는 TGF-β에 의해 증가할 수 있고, 상기 자연살해 세포의 동종살해의 감소는 자연살해 세포가 다른 자연살해 세포를 표적세포로 인식하는 정도가 감소되는 것을 의미한다. 또한, 상기 자연살해 세포의 표적세포에 대한 민감도의 향상은 자연살해 세포가 표적세포를 더욱 쉽게 인식할 수 있게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예들에서는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 처리에 의해, TGF-β에 의해 저하된 NK92 또는 1차 자연살해 세포의 폐암 세포주 및 혈액암 세포주에 대한 세포 살상능이 회복되고(도 1 및 도 2 참고), TGF-β에 의해 저하된 NK92 또는 1차 자연살해 세포의 폐암 세포주에 대한 민감도가 회복되는 한편(도 3 참고), TGF-β에 의해 증가된 자연살해 세포들 간의 동종살해가 감소되는 것으로 확인된바(도 4 참고), 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 자연살해 세포의 활성을 향상시키기 위한 유효성분으로 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 상술한 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 자연살해 세포에 처리하는 단계를 포함하는 자연살해 세포의 활성 향상 방법을 제공한다.
한편, 상기 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물은 항암제 또는 항암 보조제로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고, 상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 흑색종 세포가 이식된 동물 모델에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 투여한 경우, 음성대조군에 비해 폐로 전이되는 암의 결절(nodule) 수가 감소되는 것으로 확인된바(도 6 참고), 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 암의 예방 또는 치료를 위한 유효성분으로 이용될 수 있다.
상기 암은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 의미하고, 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다. 상기 암은 고형암 또는 전이암일 수 있고, 예컨대 결장암 및 직장암을 포함하는 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체선종 등일 수 있고, 특히 상기와 같은 종류의 암들 중에서 TGF-β가 과발현 또는 과활성화된 것일 수 있다.
상기 예방은 암의 발생이나 진행을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 치료는 암 세포가 사멸하는 것뿐만 아니라 암 세포의 성장의 감소, 재발의 감소, 암 세포에 대한 면역계 항암 활성 및 면역 기억 형성 또는 암세포의 침습 감소 등, 암 세포가 더 이상 악화 되지 않는 모든 효과를 의미하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 외에, 항암 활성을 나타내는 다른 유효성분을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 상기와 같은 유효성분들 외에, 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 더 포함할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 담체는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 약학적으로 허용가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 갖는 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리한 자연살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 세포치료제를 제공한다.
용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명에서는 암의 치료를 위해 사용되는 치료제를 의미하고, 상술한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하여 암세포에 대한 살상력이 증대된 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하면 암의 치료 및 예방을 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상술한 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을, 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 다음 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다:
(a) 상술한 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 자연살해 세포에 처리하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 자연살해 세포를 대상(subject)에게 투여하는 단계.
본 발명의 방법은 본 발명의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리하여 암세포에 대한 살상력이 증대된 자연살해 세포를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[실시예 1]
[1-1] NK92 세포 배양
NK92 세포는 ATCC 배양조건을 따라 12.5% FBS(Fetal Bovine Serum, Corning, united states origin, 35-015-CV)와 12.5% 말혈청(Gibco)을 첨가한 α-MEM(Welgene) 배양액에 0.2 mM 마이오 이노시톨, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 0.02 mM 엽산, 1% 항생제-항진균제(antibiotics- antimycotic, Gibco)와 IL-2 사이토카인(Peprotech) 20 ng/ml 농도로 첨가하여 배양액으로 사용하였으며, 5% CO2가 공급되는 37 ℃ CO2 배양기(water jacketed incubator, Thermo electron corporation)에서 배양하였다.
세포는 1x105 cell/ml 의 농도로 T-75 플라스크(Thermo)에 20-30 ml 정도로 배양하였으며, 2-3일 마다 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 배양액을 교환하였다.
[1-2] 1차(primary) NK 세포 배양
병원으로부터 기증받은 제대혈(IRB승인번호 P01-201610-31-002)에 혈액 1ml 당 2ul 씩 Rosettesep Human CD3 depletion cocktail(STEMCELL technologies, catalog #15621 )을 첨가하여 20분간 반응시켰다. 15ml씩 분주된 피콜(GE healthcare, Ficoll-paque premium)에 반응시킨 혈액을 35ml 씩 서서히 올린다. 이때 혈액과 피콜층이 섞이지 않도록 주의해야 한다. 혈액에서의 세포층 분리를 위해 2000 rpm, Decel 0 조건에서 25분 동안 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심 분리하여 혈액으로부터 적혈구 및 CD3 세포를 분리 배출한다. CD3가 분리된 세포를 ACK 버퍼 10ml로 10분 동안 반응시켜 남아있는 적혈구를 제거해 준 후, 2% FBS가 첨가된 PBS(phosphate-buffered saline)를 사용하여 2회 세척을 진행하였다. 세척은 1500 rpm, 5분간 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심 분리하여 상층액을 제거하는 방식으로 진행하였다. 이렇게 얻어진 세포를 사용하여 자연살해 세포로 배양을 진행하였다.
자연살해 세포 배양 조건은 10% FBS(Corning, united states origin, 35-015-CV)을 첨가한 alpha-MEM(Welgene)에 10ng/ml IL-15(Peprotech), 10 ng/ml IL-21(Peprotech), 10-6 M 하이드로코르티손(Hydrocortisone, Peprotech)과 1 % 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotic, Gibco)를 추가하여 배양하였다. 세포배양농도는 2x106 cell/ml 의 농도로 6웰 플레이트에 배양하였으며, 2-3일 마다 1200 rpm, 5분 동안 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심 분리하여 상층액을 제거한 후, 배양액을 교환하였다.
NK세포의 분화정도는 3일마다 FACSCanto II(BD Biosciences) 유세포 분석기로 확인하였다. FACS 유세포 분석은 FACS 튜브(Falcon)에 2x104세포를 분주하고 FBS가 첨가된 PBS(FACS 버퍼) 로 1500 rpm, 3분동안 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심분리하여 세척을 해준 후 상층액을 제거한 뒤, 다시 100 ul의 FACS 버퍼를 첨가하여 진행하였다. CD56 APC(BD) 항체와 CD3 PE(BD) 항체를 각각 1ul 씩 첨가한 후 4℃에서 20분간 염색한 후, FACS 버퍼를 500ul씩 추가하여 1500 rpm, 3분동안 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심 분리하여 세척하였다. 상층액을 제거한 후 200 ul의 FACS 버퍼를 첨가하여 FACSCanto II(BD Biosciences)로 분석을 수행하였다.
배양 7-9 일째 CD56 분화도가 90% 정도 확인되었으며, 분화가 확인된 1차 자연살해 세포(primary NK cell)를 사용하여 실험을 진행하였다.
[1-3] 폐암 세포주 H460, H3122 세포 배양
살상능 시험에서 표적세포주로 폐암 세포주인 H460, H3122를 배양하여 사용하였다. H460, H3122 세포는 ATCC 배양조건을 따라 10% FBS(Corning, united states origin, 35-015-CV)이 첨가된 RPMI(Welgene)배양액에 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotic, Gibco)를 추가한 배양액을 사용하였으며, 5% CO2가 공급되는 37℃ CO2 배양기(water jacketed CO2 incubator, Thermo electron corporation)에서 배양하였다. 세포는 2x105 cell/ml 의 농도로 100mm x 20mm 세포배양접시(corning)에 10ml 정도로 배양하였다. 2-3일 마다 세포 관찰 및 배양액 교환을 해주었으며, H460, H3122의 배양액 교환시 상층액을 모두 제거하고, 0.025% Trysin-EDTA(Gibco) 2ml로 3분간 37℃에서 반응시킨 후, 부착세포를 때어내어 1000 rpm, 5분동안 원심분리기(Beckman Coulter)로 원심 분리하여 새로운 배양액으로 교환하였다.
[1-4] 혈액암 세포주 K562 세포 배양
살상능 시험에서 표적세포주로 혈액암 세포주인 K562를 배양하여 사용하였다. K562 세포는 ATCC 배양조건을 따라 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Corning, united states origin, 35-015-CV)이 첨가된 RPMI(Welgene) 배양액에 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotic, Gibco)를 추가한 배양액을 사용하였으며, 5% CO2가 공급되는 37℃ CO2 배양기(water jacketed CO2 incubator, Thermo electron corporation)에서 배양하였다. 세포는 2x105 cell/ml의 농도로 75T Flask(corning)에 20ml 정도로 배양하였다. 2-3일 마다 배양액을 교환하였다.
[1-5] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 준비
아울러, 서열번호 1의 13개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 ㈜ 펩트론(Peptron, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였고, 이를 이하의 실험에서 이용하였다.
[실시예 2]
TGF에 의해 저하된 자연살해 세포의 세포 살상능(cytotoxicity) 회복
상기 실시예 [1-5]에서 준비한 펩타이드가, TGF-β에 의해 저하된 자연살해 세포의 세포 살상능에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.
[2-1] 주효세포(effector cell)의 준비
이를 위하여, 먼저 1x105cell/ml의 NK92 세포 또는 1차 NK 세포에 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드 20μM 또는 TGF-β 신호억제제인 SB431542 5μM의 농도로 각각 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 각각 배양한 후, 10ng/ml의 TGF-β를 첨가하고 다시 동일한 조건에서 24시간 동안 각각 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 [1-5]의 펩티드 20μM 또는 SB431542 5μM을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 다시 10ng/ml의 TGF-β를 첨가하고 동일한 조건에서 24시간 동안 각각 배양하였다. 상기와 같이 배양된 NK92 세포와 1차 NK 세포를 살상능 시험의 주효세포(effector cell)로 사용하였다.
[2-2] 표적세포(target cell)의 준비
한편, 세포 살상능을 평가하기 위한 표적세포(target cell)로는 폐암세포주인 H460, H3122 세포와 혈액암세포주인 K562를 각각 이용하였다. 1x106cells/ml의 H460, H3122 및 K562 세포주 각각을, 5ul의 칼세인-AM(calcein-AM, invitrogen)이 첨가된 배양액으로 37℃에서 1시간 동안 배양하여 염색한 후, 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세척하였다.
[2-3] 세포 살상능의 평가
상기 실시예 [2-2]에서 칼세인-AM으로 염색된 각각의 표적세포들을 96웰 플레이트에 분주하고, 상기 실시예 [2-1]에서 준비한 주효세포들을 처리하였다. 이때, 주효세포로 NK92 세포가 이용되는 경우에는 주효세포와 표적세포의 비율(E:T 비율)이 20:1이 되도록 처리하고, 주효세포로 1차 NK 세포가 이용되는 경우에는 E:T 비율이 10:1이 되도록 처리하였고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 배양된 배양물을 100rcf로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 이를 96 웰 블랙 플레이트에 100ul씩 분주한 후, ELISA 분석을 수행하였다(형광 480nm/530nm, SpectraMax i3x Molecular Device).
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 3종의 표적세포 모두에 대하여, TGF-β에 의해 NK92 세포의 세포 살상능이 저하되었으나, 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드나 SB431542에 의하여 NK92 세포의 세포 살상능이 다시 회복되는 것으로 확인되었다. 아울러, 상기와 같은 실시예 [1-5의 펩타이드에 의한 자연살해 세포의 세포 살상능 회복 효과는 NK92 세포뿐만 아니라, 도 2에 도시된 바와 같이 1차 NK 세포에서도 동일하게 확인되었다.
[실시예 3]
TGF에 의해 저하된 암세포에 대한 자연살해 세포의 민감도 회복
상기 실시예 [1-5]에서 준비한 펩타이드가, TGF-β에 의해 저하된 암 세포에 대한 자연살해 세포의 민감도에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.
이를 위하여, 먼저 1x105cell/ml의 H460 폐암세포주에 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드 20μM 또는 TGF-β 신호억제제인 SB431542를 5μM의 농도로 각각 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 각각 배양한 후, 10ng/ml의 TGF-β를 첨가하고 다시 동일한 조건에서 24시간 동안 각각 배양하였다. 그런 다음, 상기 실시예 [1-5]의 펩티드 20μM 또는 SB431542 5μM을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 다시 10ng/ml의 TGF-β를 첨가하고 동일한 조건에서 24시간 동안 각각 배양하였다. 상기와 같이 배양된 H460 세포 1x106cells/ml를, 5ul의 칼세인-AM(calcein-AM, invitrogen)이 첨가된 배양액으로 37℃에서 1시간 동안 배양하여 염색한 후, 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세척하여 '표적'세포로 준비하였다.
상기와 같이 칼세인-AM으로 염색된 각각의 표적세포들을 96웰 플레이트에 분주하고, 아무것도 처리하지 않은(fresh) NK92 세포를 주효세포로 이용하여 E:T 비율이 20:1이 되도록 처리하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 배양된 배양물을 100 rcf로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 이를 96 웰 블랙 플레이트에 100ul씩 분주한 후, ELISA 분석을 수행하였다(형광 480nm/530nm, SpectraMax i3x Molecular Device).
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, TGF-β가 처리된 H460 세포에 대해서는 자연살해 세포가 충분한 세포 살상능을 나타내지 못하였나, 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드나 SB431542가 처리된 H460 세포에 대해서는 자연살해 세포의 세포 살상능이 다시 회복되는 것으로 확인되었다.
[실시예 4]
자연살해 세포의 동종살해(fratricide) 억제
TGF-β가 자연살해 세포 간의 동종살해(fratricide)에 어떠한 영향을 미치는지, 나아가 상기 실시예 [1-5]에서 준비한 펩타이드가 자연살해 세포 간의 동종살해에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.
이를 위하여, 상기 실시예 [2-1]에서와 같은 방법으로 배양한 1x106cells/ml의 NK92 세포를, 5ul의 칼세인-AM(calcein-AM, invitrogen)이 첨가된 배양액으로 37℃에서 1시간 동안 배양하여 염색한 후, 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세척하여 '표적'세포로 준비하였다. 상기와 같이 칼세인-AM으로 염색된 각각의 표적세포들을 96웰 플레이트에 분주하고, 아무것도 처리하지 않은(fresh) NK92 세포 또는 1차 NK 세포를 주효세포로 이용하여 상기 실시예 [2-3]에서와 같이 20:1 또는 10:1의 비율로 처리하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 배양된 배양물을 100rcf로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 이를 96 웰 블랙 플레이트에 100ul씩 분주한 후, ELISA 분석을 수행하였다(형광 480nm/530nm, SpectraMax i3x Molecular Device).
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, TGF-β가 처리된 NK92 세포에 대해서는 자연살해 세포의 동종살해 활성이 매우 높은 것으로 확인되었으나, 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드나 SB431542에 의하여 자연살해 세포의 동종살해 활성이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다.
[실시예 5]
암 세포에서의 TGF-β 발현 억제
상기 실시예 [1-5]에서 준비한 펩타이드가, 암 세포에서 TGF-β의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.
이를 위하여, 2x105cell/ml의 폐암세포주 H460을 2시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드를 각각 5μM, 10μM 및 20μM의 농도로 처리하거나 또는 SB431542를 5μM의 농도로 처리하여 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 다시 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드 또는 SB431542를 동일한 농도로 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기와 같이 배양된 배양물을 100rcf로 5분 동안 원심분리하여 상층액과 펠릿을 분리하고, 이중 상층액을 96 웰 블랙 플레이트에 100ul씩 분주한 후 ELISA 분석을 수행하여(흡광 450nm, SpectraMax i3x Molecular Device) TGF-β의 분비량을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드가 처리된 농도에 의존적으로 H460 세포로부터 분비되는 TGF-β의 양이 감소되는 것으로 확인되었다.
[실시예 6]
동물모델에서의 항암 효과
상기 실시예 [1-5]에서 준비한 펩타이드의 항암 효과를 인 비보(in vivo)에서 확인하기 위하여, 24개월령의 C57BL6J 마우스에 25mg/kg의 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드를 주 1회 간격으로 4주 동안 4회 복강투여 하였다. 그런 다음, 상기 마우스 1마리당 4x105개의 B16F10 흑색종을 꼬리정맥으로 투여하고, 폐로 전이된 암의 결절(nodule)의 개수를 세어 항암효과를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 상기 실시예 [1-5]의 펩타이드가 투여된 마우스들의 폐에서는 음성대조군 대비 결절의 수가 현저히 감소된 것으로 확인되었다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 TGF-β의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 펩타이드는 자연살해 세포의 세포 살상능을 향상시키는 것인, 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 펩타이드는 자연살해 세포의 동종살해(fratricide) 활성을 감소시키는 것인, 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 항암제 또는 항암보조제인 것인, 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 암은 고형암 또는 전이암인 것인, 자연살해 세포의 활성 향상용 조성물.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 펩타이드는 상기 암에서 TGF-β의 발현 또는 활성을 억제하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 펩타이드는 상기 암의 암세포에 대한 자연살해 세포의 민감성(susceptibility)을 향상시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 암은 TGF-β가 과발현 또는 과활성화된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 처리한 자연살해 세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 세포치료제.
  12. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 자연살해 세포에 처리하는 단계를 포함하는 자연살해 세포의 활성 향상 방법.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을, 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  14. 다음 단계를 포함하는 암 치료 방법:
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 자연살해 세포에 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 자연살해 세포를 대상(subject)에게 투여하는 단계.
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