KR100729283B1

KR100729283B1 - Ｖｄｕｐ1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를유효성분으로 포함하는 자연살해세포 분화제 및 분화 방법

Info

Publication number: KR100729283B1
Application number: KR1020050048933A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 윤석란; 이기녕; 김선욱; 유대열
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-06-08
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2007-06-18
Also published as: KR20060128073A

Abstract

본 발명은 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 조절용 유전자를 이용한 세포분화제 및 세포분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자 또는 VDUP1를 조절하는 vitamin D3를 유효성분으로 함유하는 분화제 및 이를 이용한 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 VDUP1 유전자는 종전에 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 조절하는 것으로 알려져 있지 않은 유전자로, 상기 유전자를 결손 시킨 마우스를 제조하여 자연살해세포로의 분화 조절기능을 확인하였고, 상기 유전자 조절을 통해 암세포 살상기능이 있는 자연살해세포로 분화를 조절함으로써 항암 세포치료법에 유용하게 사용할 수 있다.

VDUP1, Vitamin D3, 자연살해세포, 분화, 분화제, 세포치료법.

Description

ＶＤＵＰ1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 분화제 및 분화 방법{AN AGENT FOR DIFFERENTIATING HEMATOPOIETIC STEM CELL INTO NATURAL KILLER CELL COMPRISING VDUP1 PROTEIN OR GENE EDCODING THE SAME, AND A METHOD OF DIFFERENTIATING HEMATOPOIETIC STEM CELL INTO NATURAL KILLER CELL USING THEREOF}

도 1은 마우스의 조혈줄기세포(HSC)로부터 NK전구체 세포(pNK)를 거쳐 OP9 간질 세포(stromal cell) 존재 하(+OP9), 또는 OP9부재 하(-OP9)에서 성숙한 NK세포(mNK)로 분화시키고, NK 세포의 분화 단계별 세포에서 전체 세포질 RNA를 분리하여 VDUP1 유전자를 RT-PCR로 분석하여 나타낸 아가로즈 겔 사진이다.

도 2a는 VDUP1 결손 마우스를 만들기 위한 게놈상의 전략을 나타낸 모식도이다.

도 2b는 제조된 VDUP1 결손 마우스(-/-)의 VDUP1 유전자를 RT-PCR 분석으로 나타낸 아가로즈 겔 사진이다.

도 2c는 VDUP1 결손 마우스(-/-)의 장기별 VDUP1 유전자를 노던 블롯 분석으로 나타낸 사진이다.

도 3a는 정상 마우스(+/+)와 VDUP1 결손 마우스(-/-)로부터 비장(Spleen), 골수(BM) 및 폐(Lung)로부터 단일 세포들을 분리하여 FITC 표지된 항-CD3항체와 PE 표지된 항-NK1.1 항체로 염색하여 림프구 중 NK 세포(CD3-/NK1.1+) 비율을 FACS로 분석한 그래프이다.

도 3b는 정상 마우스(+/+)와 VDUP1 결손 마우스(-/-)로부터 골수(BM) 및 림프절(LN)로부터의 단일세포를 분리하여 NK 세포 표지인자인 DX-5 발현을 FACS로 분석한 그래프이다.

도 3c는 정상 마우스(+/+)와 VDUP1 결손 마우스(-/-)의 비장(Spleen)과 골수(BM)에 있는 NK 세포의 Ly49 NK 수용체 및 NKG2D 수용체의 발현을 FACS로 분석한 그래프이다.

도 3d는 정상 마우스(+/+)와 VDUP1 결손 마우스(-/-)의 소장에서의 CD122의 생체내 조건에서의 발현을 FACS로 분석한 그래프이다.

도 3e는 정상 마우스(+/+)와 VDUP1 결손 마우스(-/-)로부터 비장세포를 분리하여 IL-2로 24시간 활성화한 후, YAC-1에 대한 세포살상능력(cytotoxicity)을 측정한 그래프이다.

도 4a는 시험관 내 조건에서 정상 마우스의 조혈줄기세포로부터 NK세포로 분화시키면서 분화단계별(HSC, pNK, mNK)로 세포질 RNA를 분리하여 VDUP1의 발현을 RT-PCR 분석으로 나타낸 아가로즈 겔 사진이다.

도 4b는 정상 마우스와 VDUP1 결손 마우스의 조혈줄기세포로부터 시험관 내 조건에서 NK 세포로 분화시켜 분화 각 단계에 있는 세포(pNK, mNK)들의 IL-2 수용체 β(CD122), PU.1, ETS-1, LTβR, MEF, id2, 및 β-액틴 유전자들의 발현을 RT- PCR 분석으로 나타낸 아가로즈 겔 사진이다.

도 4c는 정상 마우스와 VDUP1 결손 마우스의 조혈줄기세포로부터 시험관 내 조건에서 NK 세포로 분화시켜 분화 각 단계에 있는 세포들에 대해 CD122 및 NKG2A의 발현을 FACS로 분석한 그래프이다.

도 4d는 VDUP1과 NK세포 분화의 중요 인자로 알려진 CD122와의 관계를 조사한 것으로, 293T 세포에 CD122 프로모터 루시퍼라제 리포터 플라스미드(CD122luc) 및 pFLAG-mVDUP1을 트랜스펙션하여 루시퍼라제 분석으로 분석한 그래프이다.

도 4f는 정상 마우스(+/+)와 VDUP1 결손 마우스(-/-)에서의 골수에서 IL-15 발현을 RT-PCR 분석으로 나타낸 아가로즈 겔 사진이다.

도 5a는 정상 마우스의 조혈줄기세포로부터 pNK를 거쳐 mNK로 분화 시키는 과정 중 vitamin D3를 처리하고 OP9과 IL-15 존재 하에서 배양하여 mNK세포로 분화시킨 NK 1.1 양성인 NK세포군을 FACS 분석으로 나타낸 그래프이다.

도 5b는 낮은 농도(10nM)의 vitamin D3를 처리하여 분화시킨 NK세포의 표적세포인 Yac-1에 대한 살상능을 ⁵¹Cr 방출 분석으로 나타낸 그래프이다. E/T 는 효과 세포 및 표적 세포의 비율을 나타낸다.

도 5c는 정상 마우스의 비장으로부터 성숙한 NK세포를 분리하여 24 시간 동안 IL-2 및/또는 vitamin D3를 처리한 후 ⁵¹Cr 방출 분석으로 나타낸 그래프이다. 도 6은 VDUP1 발현 벡터의 모식도이다.

본 발명은 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 조절용 유전자를 이용한 세포분화제 및 이를 이용한 세포분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자 또는 VDUP1를 조절하는 vitamin D3를 유효성분으로 함유하는 분화제 및 이를 이용하여 조혈줄기세포에서 자연살해 세포로의 분화 방법에 관한 것이다.

성체 줄기세포 중 하나인 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액을 구성하는 모든 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 및 림프구)로 분화할 수 있는 세포로서, 주로 골수에 있는 조혈줄기세포로부터 생체의 면역체계를 구성하는 세포로 지속적으로 자가 재생된다. 이들 면역체계를 구성하는 세포들 중 특히, 자연살해세포(natural killer cell, 이하 “NK 세포”라 약칭함)는 비특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있다. 이러한 NK 세포의 살해능은 림포카인활성세포(lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구(tumor infiltration lymphocytes, TIL)을 이용하여 고형암(solid tumor) 치료에 이용하거나, 공여자 임파구 주입(donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법(J. Immunol., 36: 3910-3915, 1986; Hematologia, 84: 1110-1149, 1999)을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 요법으로 응용되고 있 다. 또한, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암(Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2003), 흑색종암(Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), 폐암(Lung Cancer, 35: 23-18, 2002) 등 다양한 질병들과 관련되어 있음이 보고되어 이러한 질병들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두하고 있다.

NK 세포는 골수의 조혈줄기세포로부터 유래 되는데 조혈줄기세포로부터 NK로의 분화는 여러 단계를 거친다고 알려져 있으나 아직까지 완전히 규명되지 않고 있다.

Vitamin D3 upregulating protein 1(VDUP1)은 혈액종양세포인 HL-60 세포에서 비타민 D3 (vitamin D3)에 의해 증가하는 유전자로 처음 알려졌다(Biochem. Biophys. Acta, 1219: 26-32, 1994). 최근에는 VDUP1이 티오레독신(thioredoxin, Trx)과 반응하여 Trx의 기능을 억제하고, 다른 인자들과 Trx의 작용도 저해한다고 보고 되었다(J. Biol. Chem., 274: 21645- 21650, 1999, J. Immunol., 164: 6287-6295, 2000). 이는 VDUP1은 세포 내의 산화 환원반응을 조절하는 Trx에 음성 조절자(negative regulator)로 작용하여 산화적 스트레스(oxidative stress)에 세포를 더욱 민감하게 한다는 것을 의미한다. 또한, VDUP1 안티 센스(anti sense) DNA가 설치류 흑색종(murine melanoma) 세포에서 멜라닌 합성(melanin synthesis)이나 종양형성(tumorigenesis)을 조절하며(Immunology Letters, 86: 235-247, 2003), 암세포의 세포주기를 억제하여 항암효과를 나타내고 실제로 암 조직에서 VDUP-1의 발현이 정상조직에 비해 감소하여 있다고 알려져 있다. 이와 같이 VDUP1의 발현은 여 러 면역세포들에서 현저한데 그 역할은 아직 정확하게 규명되지 않고 있다.

이에 본 발명자들은 VDUP1이 IL-2 수용체 β(CD122)의 조절을 통해 시험관 내 조건(in vitro)에서 NK 세포 분화에 관여한다는 것을 VDUP1 유전자의 결손 마우스를 통해 검정하고, VDUP1을 조절하는 vitamin D3가 NK 세포 분화를 조절한다는 것을 확인하여 이러한 NK 세포 분화조절 유전자를 이용함으로써 살상능력과 다양한 면역조절 기능이 있는 NK 세포로의 분화를 조절하고 나아가 암을 치료할 수 있는 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 줄기 세포로부터 자연살해세포로의 분화 조절용 유전자, VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1)의 기능을 확인함으로써 VDUP1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자 및 VDUP1 유전자를 조절하는 vitamin D3를 이용하여 NK 세포로의 분화제 및 분화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 VDUP1 단백질이 서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 VDUP1 유전자가 서열번호 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자가 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 포함된 것을 특징으로 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 비바이러스성 벡터가 도 6으로 나타내어지는 pFLAG-mVDUP1인 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, Vitamin D3를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 Vitamin D3가 VDUP1 유전자를 조절하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 분화제를 항암 세포치료용으로 이용하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 암이 유방암, 흑색종암, 위암, 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 또한, VDUP1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 조혈줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법이 OP9 간질세포 및 IL-15를 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, Vitamin D3를 조혈줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는 조 혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 Vitamin D3의 양이 10-20 nM인 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, VDUP1 유전자의 결손으로 자연 살해세포군이 감소한 VDUP1 결손 마우스를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 마우스가 기탁번호: KCTC10794BP으로 기탁된 것을 특징으로 하는 VDUP1 결손 마우스를 제공한다.

본 발명은 또한, 정상 마우스 및 VDUP1 결손 마우스의 유전자 발현을 비교하여 자연살해세포 분화에 관여하는 VDUP1 유전자의 기능을 밝히는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, VDUP1 단백질, 그를 코딩하는 유전자 또는 Vitamin D3를 투여하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 세포살상능력을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법이 IL-2를 함께 투여하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 세포살상능력을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 도 6의 pFLAG-mVDUP1으로 나타내어지는 VDUPI 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 분화된 자연살해세포 검출 마커용 VDUP1 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 있어서, “분화 조절 유전자”라 함은 줄기 세포에서 자연살해 세포로의 분화를 조절하는 유전자로 분화를 촉진 또는 억제하는 기능을 하는 모든 유전자를 말한다. 즉, 본 발명의 분화 조절 유전자는 분화를 촉진시켜 다음 단계로 진행할 수 있게 할 수도 있고, 각 단계를 유지하는데 필수적인 기능을 할 수도 있으며, 다음 분화 단계로 진행하지 못하게 하는 기능을 할 수도 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 포함하는 자연살해세포 분화 조절제를 제공한다. 상기 VDUP1 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 서열 번호 1로 기재되는 것이 바람직하며, 상기 VDUP1유전자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 2로 기재되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 유전자는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 포함된 것이 바람직하며, 도 6의 pFLAG-mVDUP1 나타내어지는 것이 더욱 바람직하다. 또한, VDUP1 유전자를 조절하는 Vitamin D3를 유효성분으로 포함하는 자연 살해세포 분화제를 제공한다.

본 발명은 NK 세포를 분리 정제하여 분화단계별로 VDUP1 유전자의 발현을 분석하여 NK 세포로 성숙함에 따라 VDUP1 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다(도 1 참조). 또한, VDUP1에 농도 의존적으로 NK 세포에서 발현되는 유전자인, CD122의 프로모터의 활성을 증가시킴을 확인하였다(도 4d 참조). 더욱이, VDUP1 유전자를 조절한다고 알려진 vitamin D3를 분리된 조혈줄기세포에 처리하여 NK로 분화함을 확인함(도 5a 참조)으로써 VDUP 1 유전자가 MK 세포로 분화하는데 중요한 유전자임을 처음으로 제시하였다.

본 발명은 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 유전자의 결손으로 자연 살해세포 군이 감소한 VDUP1 결손 마우스를 제공한다. 또한, 본 발명은 정상 마우스 및 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 결손 마우스의 유전자 발현을 비교하여 자연살해세포 분화에 관여하는 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 유전자의 기능을 밝히는 방법을 제공한다.

본 발명은 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein-1) 유전자를 결손 시킨 마우스를 제조하였다(도 2 참조). 본 발명자들은 상기 결손 마우스의 수정란을 2005년 4월 26일자로 한국 세포주연구재단에 기탁하였다(기탁번호: KCTC10794BP).

상기 VDUP1결손 마우스의 비장, 골수 및 폐 각에서 NK 마커인 NK1.1의 발현으로 NK 세포군이 정상 마우스에 비해 현저히 감소하여 있음을 확인하였다(도 3a 참조). 또한, 골수와 림프절로부터 단일 세포를 분리하여 또 다른 NK 표지인자인 DX-5 발현을 FACS로 분석하여 비교한 결과도 NK1.1과 유사하게 DX-5의 발현이 VDUP1 결손 마우스에서 감소하여 있음을 관찰하였다(도 3b 참조). NK1.1-PE 및 Ly49-FITC 또는 NKG2D-FITC로 이중 염색하여 NK 세포 중에서 NK 수용체인, Ly49 NK 수용체 및 NKG2D 수용체의 발현도 FACS로 분석하여 VDUP1 결손 마우스의 비장과 골 수에 있는 림프구의 NK 수용체들의 발현 역시 VDUP1 결손 마우스에서 결여 또는 감소하여 있음을 확인하였다(도 3c 참조). 정상 마우스와 VDUP1 결손마우스의 소장에서의 생체내 조건에서의 CD122의 발현을 FACS로 분석하여 CD122의 생체내 조건에서의 발현 역시 VDUP1 결손 마우스의 소장에서 결여되어있음을 확인하였다(도 3d 참조). 상기 결과들로부터 NK 세포의 분화 조절제로서 VDUP1유전자의 기능을 더욱 확실히 확인하였다.

본 발명은 또한, VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 조혈줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 상기 분화시키는 방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, OP9 간질세포 및 IL-15를 함께 배양하는 것이 바람직하다. 또한, Vitamin D3를 조혈줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 이에 특별히 제한되는 것은 아니나, Vitamin D3의 양은 10-20 nM인 것이 바람직하고, 이에 특별히 제한되는 것은 아니나, OP9 간질세포 및 IL-15를 함께 배양하는 것이 바람직하다.

VDUP1을 조절한다고 알려진 vitamin D3가 직접적으로 NK 세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스 조혈줄기세포로부터 pNK를 거쳐 mNK로 분화하는 과정중 1,25-dihydroxy vitamin D(3)를 처리하고 OP9 및 IL-15 존재 하에서 배양하여 mNK로 분화시킨 다음 FACS 분석 및 ⁵¹Cr 방출 분석(release assay)을 수행하였 다. NK 세포 집단이 vitamin D3의 농도 의존적으로 증가함을 확인하였고(도 5a 참조) 낮은 농도(10 nM)에서 vitamin D3를 처리하여 분화시킨 NK 세포에서 표적세포인 Yac-1에 대한 세포살상능력(cytotoxicity)이 vitamin D3를 처리하지 않은 군에 비해 증가하였다(도 5b 참조). 더구나, 정상 마우스의 비장으로부터 성숙한 NK 세포를 분리하여 24시간동안 IL-2와 함께 vitamin D3를 처리한 후 ⁵¹Cr-방출 분석(release assay)을 수행하여, vitamin D3처리에 의해 세포살상능력 또한 증가함을 확인할 수 있었다(도 5c 참조). 따라서, 상기 결과들은 vitamin D3 또는 VDUP-1이 NK 분화과정에 관여하고 그의 세포살상능력에도 직접적 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 분화제를 항암 세포치료용으로 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 분화제를 제공한다. 상기 암은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 유방암, 흑색종암, 위암, 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

NK 세포의 분화와 활성에 결함이 생기게 되면 다양한 암이 발생하게 되는데, 예를 들어, 유방암(Breast Cancer Res Treat., 66: 255-263, 2003), 흑색종암(Melanoma Res., 2003, 13: 349-356) 및 폐암(Lung Cancer, 35: 23-18, 2002)이 발생한다고 보고되어 있다. 따라서, 본 발명의 NK 세포 분화 조절제를 이용하면 NK 세포 분화를 조절함으로써 암, 특히 상기 기재된 암을 치료할 수 있다는 것이 자명하다.

본 발명의 세포 분화 조절제는 임상, 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 분화 조절제는 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 유전자에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 치료제의 유효용량은 0.1 ~ 0.2 mg/kg 이고, 바람직하게는 0.15 mg/kg 이며, 하루 1 ~ 3회 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 골수로부터 조혈줄기세포의 분리

6 내지 9주령의 C57BL/6 마우스(대한실험동물센터, 한국)의 경골과 대퇴골을 비롯한 모든 뼈를 분쇄하여 분쇄물을 70 마이크론 세포 스트레이너(strainer)로 통과시킨 다음, 용해 용액(Sigma, St. Louse, MO)을 처리하여 적혈구를 제거함으로써 골수세포를 얻었다. 골수세포를 계통 마커(CD11b: 대식세포 마커, Gr-1:과립구 마커, B220: B세포 마커, NK1.1: NK세포 마커, CD2: T세포 마커, TER-119: 적혈구 마커)에 대하여 바이오틴(biotin) 표지된 항체들과 반응시킨 후 세척하고, 스트렙트아비딘(streptavidin)이 표지된 자석 비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 반응시켰다. 자석이 표지된 Lin⁺ 세포들은 SuperMACS(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)의 자장 안에서 CS 컬럼(Miltenyi Biotec)에 통과시켜서 수거하였다. 컬럼을 통과한 나머지 Lin^- 세포들을 c-kit과 결합한 자석 비드와 반응시키고 MS 컬럼(Miltenyi Biotec)을 통과시킨 후 컬럼에 잔류하는 c-kit⁺세포를 얻었다. 이렇게 얻은 Lin^- c-kit⁺인 조혈줄기 세포(hematopoietic stem 세포, 이하 "HSC 세포"라 약칭함)의 순 도는 형광 유세포 계수기(FACS) (BD Bioscience, Mountainview, CA)로 확인한 결과, 96% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다.

<실시예 2> 조혈줄기세포로부터 NK 세포로의 분화 유도

상기 실시예 1에서 골수로부터 분리한 HSC 세포를 2 × 10⁶ 세포수/웰의 농도로 마우스 SCF(30 ng/㎖, BioSource, Camarillo, CA), 마우스 Flt3L(50 ng/㎖, PeproTech, Rocky Hill, NJ), 마우스 IL-7(0.5 ng/㎖, PeproTech), 인도메타신(2 g/㎖, Sigma), 젠타마이신(20 g/㎖) 및 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 완전 배지를 사용하여 6-웰 플레이트(Falcon, USA)에 접종하였다. 상기 세포를 37℃, 5% CO₂에서 6일 동안 배양하는데, 배양 3일 후 배양 상층액 절반을 버리고 상기 접종시와 같은 조성의 사이토카인이 함유된 새로운 배지로 갈아 주었다. 배양 6일 후, FITC 표지된 CD122항체와 자석 비드가 붙은 항 FITC 항체를 이용하여 MACS로 CD122⁺인 NK 전구체 세포(premature NK 세포, 이하 “pNK 세포”라 약칭함)를 분리하였다. NK 전구체 세포의 순도는 형광 유세포 계수기(FACS)로 분석한 결과, 92% 이상이었다.

성숙한 NK 세포(mature NK 세포, 이하 “mNK 세포”라 약칭함)로의 분화를 위해서는 6일 후 HSC 세포를 회수하여 OP9 간질 세포(stromal cell)(Science, 265: 1098-1101, 1994)와 함께 또는 단독으로 마우스 IL-15(20 ng/㎖, PeproTech, USA)의 존재 하에서 배양하였다. 배양 3일 후, 배양 배지의 절반을 같은 조성의 새로운 배지로 갈아주고, 배양 12일째, FITC로 표지된 항-NK1.1 항체와 자석 비드 (MACS)가 붙은 항-FITC 항체를 이용하여 NK1.1⁺세포를 분리하였다. 성숙한 NK 세포는 항-CD122, NK1.1, DX5, NK 세포 수용체 항체들을 이용하여 유세포 계수기(flow cytometry, FACS)로 분석하였다.

<실시예 3> 분리 정제한 NK 세포의 분화단계별 VDUP1 유전자의 발현분석

NK 세포의 분화 단계별 특이적 세포를 얻기 위해, 마우스의 골수로부터 분리한 Lin^- c-kit ⁺ HSC(> 95%)를 SCF, Flt-3L, IL-7 존재하에서 6일간 배양한 후, CD122⁺인 pNK 세포(95%)를 분리하고, 유세포 계수기로 분석하였다. 그리고 mNK 세포(-OP9 또는 +OP9)는 IL-15 단독 또는 IL-15와 OP9 간질 세포를 함께 6일간 더 배양한 후 세포를 수득하여 유세포 계수기로 분석하였다. 간질 세포와 함께 배양하였을 때, 더 많은 mNK 세포(-OP9; 94% 및 +OP9; > 95%)를 얻을 수 있었다. mNK 세포 표면의 Ly49 수용체들은 mNK 세포의 기능에 중요한 역할을 하고 그들의 발현은 다른 면역세포들과의 상호연관(communication)에 의한 신호전달에 의해 조절된다. 골수에서 유래된 HSC와 간질 세포와의 동시배양이 mNK 세포의 NK 수용체인 Ly49 수용체 발현에 필수적인가를 알아보기 위해, IL-15의 존재하에서 단독 또는 OP9 세포와 함께 mNK 세포를 배양하고 NK 수용체인 Ly49 발현을 조사하였다. OP9와 함께 배양하였을 때(+OP9) mNK 세포에서 NK 수용체인 Ly49C/I 및 Ly49G2의 발현이 유도되었지만, OP9와 함께 배양하지 않으면(-OP9) Ly49C/I 및 Ly49G2의 발현이 유도되지 않았다. 이는 OP9 간질 세포와의 동시 배양이 NK 세포의 추후의 성숙(maturation)에 필수적이라는 것을 암시한다.

NK 세포 분화단계별 VDUP1 유전자 발현 분석을 RT-PCR로 분석하였다(도 1). 모든 세포에서 Trizol 시약(Life Technology, USA)을 이용하여 제조사의 권고에 따라 RNA를 분리하고, RT-PCR 키트(Quiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 권고에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 포함하는 PCR 혼합물을 95℃에서 1분간 가열하고, HSC와 mNK 세포에 대해서는 95℃ 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로, NK 전구체 세포에 대해서는 95℃ 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 28회 또는 32회로 PCR을 행하고, 72℃에서 10분 더 확장 반응시킨 다음 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 에티듐 브로마이드 염색으로 확인하였다.

도 1에서 보듯이, NK 세포 분화단계별 VDUP1 유전자 발현 분석을 RT-PCR로 분석한 결과 NK 세포로 성숙(maturation)함에 따라 VDUP1 유전자의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> VDUP1 결손 마우스의 생산

VDUP1 유전자가 결핍된 VDUP1 결손(knockout) 마우스를 생산하기 위해 우선 VDUP1 게놈을 분석하여 VDUP1의 엑손 8개 전체를 lacZ/neo 유전자와 바꾼 타겟 벡터를 제조하였다(도 2a). 상기 벡터를 129Sv 마우스 배아세포에 넣은 후 G418 항생제, 및 칸시클로버(Gancyclovir)가 함유되어 있는 배지에서 배양하였다. 이 배지에서 살아남은 배아 세포 중 VDUP1 한쪽 대립유전자(allele)가 결손된 배아세포를 골라 C57BL/6 마우스의 배반포(blastocyst)에 넣어 VDUP1가 결손된 키메라 마우스를 얻었다. 상기 마우스는 계속 생식선(germ-line)으로 다음 세대로 번식하여 최종적으로 VDUP1 결손 마우스를 생산하였다.

상기 VDUP1 결손 마우스를 확인하기 위하여, RT-PCR 및 장기별 노던 블롯 을 수행하였다(도 2b 및 도 2c). RT-PCR을 수행하기 위하여, 실시예 3에서 기술한 대로 cDNA를 형성하였고, PCR은 5'-ATTCCCCTTCCAGGTGGA-3' 및 5'-TTGAAATTGGCTCTGT-3' 프라이머를 이용하여 cDNA를 포함하는 PCR 혼합물을 95℃에서 1분간 가열하고, 95℃ 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분의 조건으로 32회로 PCR을 행하고, 72℃에서 10분 더 확장반응한 다음 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 에티디듐 브로마이드 염색으로 확인하였다. 노던블롯을 수행하기 위하여, 마우스에서 위, 뇌, 폐, 비장 등을 비롯한 각 장기를 떼어내, 조직 파쇄기 (tissue homogenizer)로 RNAzol B (Tel-Test, Friendswood, TX) 용액 안에서 분쇄하고 RNA를 정제하였다. 30 ㎍의 RNA를 2.2 M 포름알데히드를 함유한 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 나일론 막(GeneScreen^PLUS, NEN Life Science Products, Boston, MA)에 부착시켰다. 이 나일론 막은 ³²P-표지된 VDUP1 cDNA를 첨가한 ExpressHyb solution (Clontech, USA)에서 65^oC, 16시간 동안 반응시키고, 세 번 이상 세척하여 비특이적으로 부착된 탐침(probe)을 제거하고 자가 방사선상(autoradiogram)을 만들어서 수행하였다.

도 2b 및 도 2에서 보듯이, VDUP1 결손 마우스(-/-)에서는 VDUP1를 검출할 수 없었으므로 유전자가 제거됨을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 상기 결손 마우스의 수정란을 2005년 4월 26일자로 한국 세포주연구재단에 기탁하였다(기탁번호: KCTC10794BP).

<실시예 5> VDUP1 결손 마우스에서의 NK 분화 분석

정상마우스와 VDUP1이 결손된 마우스로부터 비장, 골수, 폐로부터 단일 세포들을 분리하여 FITC 표지된 항-CD3항체 및 PE 표지된 항-NK1.1.항체로 염색하여 림프구중 NK 세포(CD3-/NK1.1+) 비율을 FACS로 분석하였다(도 3a).

도 3a에서 보듯이, VDUP1결손 마우스의 비장, 골수, 폐 각에서 NK 세포군이 정상 마우스에 비해 현저히 감소하여 있었다.

또한, 골수와 림프절로부터의 단일세포를 분리하여 또 다른 NK 표지인자인 DX-5 발현을 FACS로 분석하였다(도 3b).

도 3b에서 보듯이, 다른 NK 표지인자인 DX-5 발현을 비교한 결과도 NK1.1과 유사하게 DX-5의 발현이 VDUP1 결손 마우스에서 감소하여 있음을 관찰하였다.

NK1.1-PE와 Ly49-FITC 또는 NKG2D-FITC로 이중 염색하여 NK 세포중에서 NK 수용체인 Ly49 NK 수용체 및 NKG2D NK 수용체의 발현도 FACS로 분석하였다(도 3c).

도 3c에서 보듯이, VDUP1 결손 마우스의 비장과 골수에 있는 림프구의 NK 수용체들의 발현 역시 VDUP1 결손 마우스에서 결여 또는 감소하여 있음을 알 수 있었다.

정상 마우스와 VDUP1 결손마우스의 소장에서의 생체내 조건에서의 CD122의 발현을 FACS로 분석하였다(도 3d).

도 3d에서 보듯이, CD122의 생체내 조건에서의 발현 역시 VDUP1 결손 마우스의 소장에서 결여되어 있음을 알 수 있다.

<실시예 6> NK 세포살상능력 분석(cytotoxicity assay)

시험관 내 조건에서 분화시킨 NK 세포 또는 비장에서 분리한 NK 세포에 IL-2 (10u/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세척 후 배양시킨 NK 세포를 효과세포(Effector cell): 표적세포(Target cell) 비율에 따라 표적세포인 ⁵¹Cr-표지된 Yac-1 세포 (10⁴/well)과 함께 96 웰 둥근 바닥 플레이트(well round bottom plate, Falcon, USA)에서 4시간 동안 배양 후, 100ul의 배양 상층액의 방사능을 감마-카운터로 측정하였다(도 3e).

도 3e에서 보듯이, 정상 마우스와 VDUP1 결손 마우스로부터 비장세포를 분리하여 IL-2로 24시간 활성화시킨 후, YAC-1에 대한 세포살상능력을 측정한 결과, VDUP1 결손 마우스의 세포살상능력이 정상 마우스에 비해 감소하여 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> NK 세포 분화과정 중 발현되는 유전자의 분석

VDUP1이 NK 세포로의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 시험관 내 조건에서 정상 마우스의 조혈줄기세포로부터 NK 세포로의 분화 과정 중에 각 단계에 있는 세포(HSC, pNK, mNK)의 세포질 RNA를 실시예 3에서 기술한 대로 분리하여 VDUP1의 RT-PCR을 수행하였다(도 4a).

도 4a에서 보듯이, VDUP1의 발현이 pNK 단계부터 증가하기 시작하여 mNK까지 유지됨을 알 수 있었다.

한편, 정상 마우스와 VDUP1 결손 마우스의 조혈줄기세포로부터 시험관 내 조건에서 NK 세포로 분화시켜 분화 각 단계에 있는 세포들의 CD122, PU.1, ETS-1, LT βR, MEF, id2, β-액틴 유전자들의 발현을 RT-PCR로 조사 비교하였다(도 4b).

도 4b에서 보듯이, VDUP1 결손 마우스의 pNK, mNK에서 CD122의 발현이 정상 마우스에 비해 감소하여 있음을 확인하였다.

또한, 시험관 내 조건에서 NK 분화단계별로 CD122나 NK 1.1.의 발현을 FACS로 분석하였다(도 4c).

도 4c에서 보듯이, 정상 마우스와 비교하여 VDUP1 결손 마우스의 pNK에서 CD122의 발현이 감소하여 있고, mNK 단계에서 NK 1.1이나 NKG2A의 발현이 저하되어 있었다.

<실시예 8> VDUP1 이 CD122 프로모터 활성에 미치는 영향

293T 세포를 0.1 ㎍의 CD122 프로모터(-857/97) 루시퍼라제 리포터 플라스미드(luciferase reporter plasmid), 0.1 ㎍의 레닐라 루시퍼라제 플라스미드(renilla luciferase plasmid)(CD122luc) 및 여러 농도의 VDUP1 발현벡터(pFLAG-mVDUP1; 마우스 VDUP1 cDNA를 pFLAG-CMV2 발현벡터(Clontech, USA)의 Hind III와 Xba I 위치에 삽입하여 VDUP1 발현벡터를 제작함(도 6))를 트랜스펙션 하였다. 전체 DNA의 농도는 양은 엠티 벡터(empty vector)로 조정하였다. 48시간 배양 후, 제조사의 권고대로 세포 용출물로 루시퍼라제 활성(luciferase activity)을 측정하였다(Promega, Madison, WI)(도 4d). 트랜스펙션 효율(Transfection efficiency)은 레닐라 루시퍼라제 활성(renilla luciferase activity)을 측정하여 표준화하였다.

도 4d에서 보듯이, VDUP1의 농도 의존적으로 CD122의 프로모터 활성 (promotor activity)이 유도됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 9> Vitamin D3가 NK 세포 분화에 미치는 효과

VDUP1을 조절한다고 알려진 vitamin D3가 직접적으로 NK 세포의 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스 조혈줄기세포로부터 pNK를 거쳐 mNK로 분화시키는 과정중 1,25-dihydroxy vitamin D(3)를 처리하고 OP9 및 IL-15 존재 하에서 배양하여 mNK로 분화시킨 다음 FACS 분석(도 5a) 및 ⁵¹Cr 방출 분석(release assay)(도 5b)을 수행하였다.

도 5a에서 보듯이, NK 세포 집단이 vitamin D3에 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

도 5b에서 보듯이, 낮은 농도(10 nM)에서 vitamin D3를 처리하여 분화시킨 NK 세포에서 Yac-1에 대한 세포살상능력이 vitamin D3를 처리하지 않은 군에 비해 증가하였다.

더구나, 정상 마우스의 비장으로부터 성숙한 NK 세포를 분리하여 24시간 동안 IL-2와 함께 vitamin D3를 처리한 후 ⁵¹Cr-방출 분석을 수행하였다.

도 5c에서 보듯이, vitamin D3 처리에 의해 세포살상능력이 증가함을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 결과들은 vitamin D3 또는 VDUP-1이 NK 분화과정에 관여하고 그의 세포살상능력에도 직접적 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 VDUP1이 IL-2 수용체 B(CD122)의 조절을 통해 시험관 내 조건(in vitro)에서 NK 세포 분화에 관여한다는 것을 VDUP1 유전자의 결손 마우스를 통해 확인하고 VDUP1을 조절하는 vitamin D3가 NK 세포 분화를 조절한다는 것을 확인하여, 상기 NK 세포 분화조절 유전자를 이용함으로써 살상능력과 다양한 면역조절 기능이 있는 NK 세포의 분화를 조절하고 나아가 항암 세포치료법 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 분화제.
제 1항에 있어서, VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질은 서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제.
제 1항에 있어서, VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 유전자는 서열번호 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제.
제 1항에 있어서, 상기 유전자는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터에 포함된 것을 특징으로 자연살해세포 분화제.
제 4항에 있어서, 상기 비바이러스성 벡터는 도 6으로 나타내어지는 pFLAG-mVDUP1인 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 분화제를 항암 세포 치료용으로 이용하는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제.
제 8항에 있어서, 암은 유방암, 흑색종암, 위암, 간암, 및 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자연살해세포 분화제.
VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자를 조혈줄기세포에 투여하는 단계를 포함하는 조혈줄기세포를 생체외에서 자연살해세포로 분화시키는 방법.
제 10항에 있어서, 조혈줄기세포를 OP9 간질세포 및 IL-15(Interleukin-15)와 함께 배양하는 것을 특징으로 하는 조혈줄기세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법.
삭제
삭제
삭제
VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 유전자의 결손으로 자연 살해세포 군이 감소된 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 결손 마우스.
제 15항에 있어서, 기탁번호: KCTC10794BP으로 기탁된 것을 특징으로 하는 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 결손 마우스.
정상 마우스 및 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 결손 마우스의 유전자 발현을 비교하여 자연살해세포 분화에 관여하는 VDUP1(Vitamin D3 upregulating protein 1) 유전자의 기능을 밝히는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제