WO2023038497A1 - 경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드 - Google Patents

경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드 Download PDF

Info

Publication number
WO2023038497A1
WO2023038497A1 PCT/KR2022/013633 KR2022013633W WO2023038497A1 WO 2023038497 A1 WO2023038497 A1 WO 2023038497A1 KR 2022013633 W KR2022013633 W KR 2022013633W WO 2023038497 A1 WO2023038497 A1 WO 2023038497A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
modified peptide
modified
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/013633
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
손동욱
최재순
강성구
장명훈
Original Assignee
바이오센서연구소 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오센서연구소 주식회사 filed Critical 바이오센서연구소 주식회사
Publication of WO2023038497A1 publication Critical patent/WO2023038497A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
    • C07K14/69—Beta-melanotropin

Definitions

  • It relates to a peptide with improved transdermal drug delivery efficacy and lipolytic ability.
  • Obesity is a very serious disease that is rapidly increasing in many countries around the world but has no medically effective treatment.
  • the World Health Organization (WHO) defines a body mass index (BMI) of 30 or more as obesity, and the average obesity rate in OECD member countries is 19.5%, and the rate is gradually increasing.
  • Obesity refers to the state of excessive accumulation of fat in the body due to genetic or lifestyle causes, and causes diseases such as adult diseases and chronic degenerative diseases. are doing Secondary complications such as hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, diabetes, and fatty liver caused by excessive fat accumulation and social disorders that can be caused by obesity are problems.
  • peptides Despite high biocompatibility and physiological activity, peptides have low bioavailability, limiting their use. In particular, effective delivery of peptides was difficult due to the barrier function of the skin, which is famous for the 500 Dalton's Law. The average molecular weight of one amino acid is about 100 daltons, and peptides composed of 5-100 amino acids cannot effectively pass through the skin barrier.
  • the present inventors continued research on transdermal delivery using peptides and, as a result, synthesized a new peptide with excellent skin penetration and permeability and excellent lipolysis effect.
  • beta-melanocyte stimulating hormone (beta-Melanocyte stimulating hormone; ⁇ -MSH) peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is modified, the modified peptide at the C-terminus or N-terminus of the amino acid sequence is to provide
  • Another aspect is to provide a cosmetic composition for lipolysis comprising the modified peptide as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising the modified peptide as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving obesity containing the modified peptide as an active ingredient.
  • Another aspect includes modifying the C-terminal or N-terminal amino acid sequence of beta-melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , To provide a method for producing a modified peptide.
  • ⁇ -MSH beta-melanocyte stimulating hormone
  • Another aspect is to provide a method for preventing or treating obesity comprising administering the modified peptide of claim 1 to a subject in need thereof.
  • Another aspect is to provide a use for the preparation of a composition for preventing or treating obesity of the modified peptide of claim 1.
  • beta-melanocyte stimulating hormone (beta-Melanocyte stimulating hormone; ⁇ -MSH) peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is modified, the modified peptide at the C-terminus or N-terminus of the amino acid sequence to provide.
  • beta-melanocyte stimulating hormone (beta-Melanocyte stimulating hormone; ⁇ -MSH) is an endogenous peptide hormone and neuropeptide, and is a peptide naturally present in the human body. It is also known to have an effect of reducing appetite.
  • the beta-melanocyte stimulating hormone may have 5 to 100 amino acid residues including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid herein may include the 20 standard amino acids that are naturally incorporated into peptides as well as D-isomers and modified amino acids.
  • the peptide may be D-type or L-type, a peptide in which only a portion of the sequence is D-type or L-type, or a racemate thereof.
  • the peptide may be conservatively substituted at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids in a native or unmutated peptide, but is not limited thereto.
  • conservative substitution refers to the substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties.
  • the peptide may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining the biological activity of the native or unmutated peptide.
  • Such amino acid substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • Negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartic acid
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan, and tyrosine
  • hydrophobic amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, and tryptophan.
  • amino acids can be classified into amino acids with electrically charged side chains and amino acids with uncharged side chains, and amino acids with electrically charged side chains include aspartic acid, glutamic acid, lysine, Amino acids with uncharged side chains, including arginine and histidine, can be further classified as nonpolar amino acids or polar amino acids, and nonpolar amino acids are glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine. Methionine, proline, and polar amino acids can be classified as including serine, threonine, cysteine, asparagine, and glutamine. Conservative substitutions with amino acids having similar properties as described above can be expected to exhibit the same or similar activity.
  • the peptide may include post-translational modification of non-standard amino acids and the like.
  • post-translational modifications include phosphorylation, glycosylation, acylation (including eg acetylation, myristoylation and palmitoylation), amidation ( amidation), alkylation, carboxylation, hydroxylation, glycation, biotinylation, ubiquitinylation, changes in chemical properties (e.g. beta -removal deimidation, deamidation) and structural changes (eg formation of disulfide bridges).
  • it may include changes in amino acids caused by chemical reactions occurring in the process of bonding with crosslinkers to form a peptide conjugate, such as changes in amino groups, carboxy groups, or side chains. .
  • the modification of the amino acid sequence is aspartic acid (D), glutamic acid (Glutamic acid, E), lysine (K), arginine (Arginine, R) and histidine (Histidine, H).
  • Any one or more selected from the group consisting of beta- may be added to or deleted from the end of the melanocyte stimulating hormone.
  • the term "terminal" does not mean one amino acid at the most end of the C-terminus or N-terminus of the peptide, but may mean up to 5 amino acids from the most end of the C-terminus or N-terminus.
  • the amino acid sequence may be modified by adding it together with other amino acids without being limited to the types of amino acids described above. In this case, the addition or deletion of the amino acid may not affect the original functionality of beta-melanocyte stimulating hormone.
  • the peptide is 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or greater than 99% homology Or it may include an amino acid sequence having the same identity, but is not limited thereto.
  • “Homology” or “identity” means the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related to each other and can be expressed as a percentage.
  • the terms “homology” and “identity” are often used interchangeably.
  • Whether any two peptide sequences have homology, similarity or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: can be determined using known computer algorithms such as the “FASTA” program using default parameters as in 2444. or, as performed in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453).
  • GCG program package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215] : 403 (1990);Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073) Homology, similarity or identity can be determined using, for example, BLAST of the National Center for Biotechnology Information Database, or ClustalW.
  • GAP program defines the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.
  • the modified peptide can be prepared by a combination of several methods for preparing various peptides.
  • modified peptide of the present invention can be synthesized by a method well known in the art, for example, an automated peptide synthesizer, or can be produced by genetic engineering technology.
  • the modified peptides of the present invention can be prepared by standard synthetic methods, recombinant expression systems, or any other art method.
  • modified peptides according to the present invention can be synthesized in a number of ways, including, but not limited to, for example:
  • a method of obtaining a peptide fragment by any combination of (a), (b) and (c), then linking the fragments to obtain a peptide, and recovering the peptide.
  • preparation of the modified peptides may include modification using L- or D-type amino acids and/or non-natural amino acids; and/or modification of the native sequence, e.g., modification of side chain functional groups, intramolecular covalent bonds, e.g., inter-side chain ring formation, amidation, methylation, acylation, ubiquitination, phosphorylation, aminohexaylation, biotinylation, etc. It includes all that transform by reforming.
  • the above modifications include all substitutions with non-natural compounds.
  • Substituted or added amino acids used in the modification may be 20 amino acids commonly observed in human proteins as well as atypical or non-naturally occurring amino acids.
  • Commercial sources of atypical amino acids may include, but are not limited to, Sigma-Aldrich, ChemPep and Genzyme pharmaceuticals.
  • Peptides containing these amino acids and typical peptide sequences may be synthesized and purchased through commercialized peptide synthesis companies, such as American Peptide Company or Bachem in the US, or Anygen in Korea, but are not limited thereto.
  • the present inventors deleted the N-terminal glutamic acid and C-terminal aspartic acid of beta-melanocyte stimulating hormone and further deleted N-terminal alanine to prepare a modified beta-melanocyte stimulating hormone.
  • the absolute value of the net charge of the beta-melanocyte stimulating hormone may be increased to 1.5 or more.
  • Transdermal delivery efficacy of the peptide can be improved through such a change in the net charge amount.
  • the efficacy of transdermal delivery of peptides by diffusion or microcurrent, for example, iontophoresis may be improved. .
  • the peptide having an increased net charge as described above may have a higher transdermal permeability due to microcurrent than through passive diffusion. Accordingly, the modified peptide by modification of the amino acid sequence may have improved transdermal delivery efficacy compared to conventional beta-melanocyte stimulating hormone.
  • the modified peptide may be a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the modified beta-melanocyte stimulating hormone peptide may have a lipolytic effect, and as the transdermal delivery efficacy is increased through the modification as described above, it is more effectively transdermally delivered than before the modification, so that the lipolytic effect is increased. may have been elevated.
  • the present inventors confirmed that the modified beta-melanocyte stimulating hormone peptide as described above has improved transdermal delivery efficacy and lipolytic effect.
  • the term "iontophoresis” refers to a method of allowing ionized active ingredients to penetrate the skin with electrical repulsive force by changing the electrical environment of the skin by applying a potential difference by flowing a microcurrent through the skin to which the active ingredient is applied means
  • the iontophoresis is a method in which a current from an external power source flows into an electrode patch on the skin and a microcurrent is introduced into the skin, a method in which a battery is attached to the electrode patch itself and a microcurrent is introduced into the skin, and a high concentration It may include a method in which microcurrent is introduced into the skin through a patch equipped with a reversed electrodialysis (RED) means for generating current through a difference in ion concentration between the electrolyte solution and the low-concentration electrolyte solution.
  • RED reversed electrodialysis
  • the present invention is not limited thereto, and various types of iontophoresis can be used, of course.
  • the device causing iontophoresis is at least one battery selected from the group consisting of a flexible battery, a lithium ion secondary battery, an alkaline battery, a dry battery, a mercury battery, a lithium battery, a nickel-cadmium battery, and a reverse electrodialysis battery. or may be a second mask pack, mask sheet, or patch in which the at least one battery is mounted.
  • the transdermal permeability of the peptide was improved by generating a microcurrent by iontophoresis.
  • the beta-melanocyte stimulating hormone peptide may not be a cell-penetrating peptide (CPP).
  • CPP cell penetrating peptide
  • Cationic CPP has a high net charge, especially a high proportion of arginine (R).
  • R arginine
  • Amphiphilic ⁇ -Helix CPP is known to exist in the form of a random coil in a hydrophilic environment such as the cytoplasm, but to have an ⁇ -Helix form with hydrophilic and hydrophobic surfaces when exposed to a hydrophobic environment such as a cell membrane.
  • the beta-melanin cell stimulating hormone peptide may not be a cell penetrating peptide and have a high molecular weight, so that the percutaneous permeability before modification may be low.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for lipolysis comprising the modified peptide as an active ingredient.
  • the cosmetic composition includes a cosmetically effective amount of the peptide; And / or may include a cosmetically acceptable carrier.
  • cosmetic effective amount means an amount sufficient to achieve the lipolysis effect of the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil , It may be formulated as a powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. For example, it may be formulated into a softening lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the formulation of the cosmetic composition is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide are used as carrier components It can be.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, for example, in the case of a spray, additionally chlorofluoro propellants such as hydrocarbons, propane/butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, fatty acid esters of glycerol, polyethylene glycol or sorbitan.
  • the formulation of the cosmetic composition is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspension agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth and the like may be used.
  • the formulation of the cosmetic composition is surfactant-containing cleansing
  • carrier components aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid Amide ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • ingredients included in the cosmetic composition include ingredients commonly used in cosmetic compositions, in addition to peptides and carrier components as active ingredients, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances.
  • a phosphorus adjuvant may be included.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising the modified peptide as an active ingredient.
  • the term "pharmaceutical composition” can refer to a molecule or compound that imparts some beneficial effect upon administration to a subject. Beneficial effects may include enabling diagnostic determination; amelioration of a disease, symptom, disorder or condition; reducing or preventing the occurrence of a disease, condition, disorder or condition; and responding to a disease, symptom, disorder or condition in general.
  • the pharmaceutical composition may give a beneficial effect on obesity or metabolic diseases.
  • prevention refers to partially or completely delaying or preventing the onset or recurrence of a disease, disorder, or its attendant symptoms, preventing the acquisition or re-acquisition of a disease or disorder, or preventing the occurrence or recurrence of a disease or disorder. means of reducing the risk of acquisition.
  • the prevention refers to any action that inhibits or delays the occurrence of obesity or metabolic disease symptoms by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment includes inhibition, alleviation or elimination of the development of a disease, such as obesity or a metabolic disease.
  • the term “improvement” may refer to any activity that at least reduces a parameter associated with alleviation or treatment of a condition, for example, the degree of obesity or metabolic disease symptoms.
  • the “metabolic disease” may refer to a disease caused by excessive synthesis or accumulation of fat due to abnormal energy metabolism in the body due to various causes such as excessive energy intake or hormonal imbalance. Thus, metabolic diseases can be caused by obesity.
  • the type of the metabolic disease is not particularly limited, but may be at least one selected from the group consisting of fatty liver, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, dyslipidemia, and arteriosclerosis.
  • the modified peptide may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the salts are conventional acid addition salts used in the field of medicine, for example obesity or metabolic diseases, for example salts derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, sulfamic acid, phosphoric acid or nitric acid and acetic acid, propionic acid , succinic acid, glycolic acid, stearic acid, citric acid, maleic acid, malonic acid, methanesulfonic acid, tartaric acid, malic acid, phenylacetic acid, glutamic acid, benzoic acid, salicylic acid, 2-acetoxybenzoic acid, fumaric acid, toluenesulfonic acid, oxalic acid or trifluoroacetic acid It includes salts derived from organic acids such as In addition, the salt may be a base addition salt such as ammonium, dimethylamine, monomethylamine, monoethylamine, or
  • the salt includes a common metal salt form, for example, a salt derived from a metal such as lithium, sodium, potassium, magnesium, or calcium.
  • the acid addition salt, base addition salt or metal salt may be prepared according to a conventional method.
  • Pharmaceutically acceptable salts and general methodologies for preparing them are well known in the art. See, for example, P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)]; [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, no. 1, January 1977].
  • triphosphonium salts include benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolazino)phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), bromotris(pyrrolazino)phosphonium hexafluorophosphate (PyBroP), 7 -Including azabenzotriazol-1-yloxytris(pyrrolazino)phosphonium hexafluorophosphate (PyAOP), examples of tetramethyluronium salts include 2-(1H-benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2-(
  • the solvent used for the condensation can be appropriately selected from those known to be useful for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as anhydrous or water-containing N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, etc., halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, etc.
  • Alcohols such as fluoroethanol and phenol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, methyl acetate, ethyl Esters such as acetate and the like, suitable mixtures thereof, and the like can be used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bonding reaction, and is usually selected from the range of about -20°C to 90°C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in excess of 1.5 to 6 fold.
  • the unreacted amino acid can be acetylated with an acid anhydride, acetylimidazole or the like, so that the influence on the subsequent reaction can be avoided.
  • protecting groups for the amino group of the starting amino acid are benzyloxycarbonyl (Z), tert-butoxycarbonyl (Boc), tert-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl , 2-chlorobenzyloxycarbonyl (Cl-Z), 2-bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z), adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitro phenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), trityl and the like.
  • carboxyl-protecting groups for starting amino acids include aryl, 2-adamantyl, 4-nitrobenzyl, 4-methoxy, in addition to the C1-6 alkyl groups, C3-10 cycloalkyl groups, and C7-14 aralkyl groups mentioned above.
  • the hydroxyl groups of serine or threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification include lower (C2-4) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, and groups derived from organic acids and the like.
  • groups suitable for etherification include benzyl, tetrahydropyranyl, tert-butyl (But), trityl (Trt), and the like.
  • protecting groups for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, 2,6-dichlorobenzyl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tert-butyl, and the like.
  • protecting groups for imidazole of histidine are p-toluenesulfonyl (Tos), 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl (Mtr), dinitrophenyl (DNP), benzyloxymethyl (Bom), tert-butoxymethyl (Bum), Boc, Trt, Fmoc, and the like.
  • Examples of protecting groups for the guanidino group of arginine are Tos, Z, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl (Mtr), p-methoxybenzenesulfonyl (MBS), 2,2, 5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc), mesitylene-2-sulfonyl (Mts), 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl Includes phonyl (Pbf), Boc, Z, NO2 and the like.
  • Mtr 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl
  • MSS p-methoxybenzenesulfonyl
  • Pmc 2,2, 5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl
  • Mts mesitylene-2-sulfonyl
  • protecting groups for side chain amino groups of lysine include Z, Cl-Z, trifluoroacetyl, Boc, Fmoc, Trt, Mtr, 4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidenyl (Dde), and the like.
  • protecting groups for indolyl of tryptophan include For, Z, Boc, Mts, Mtr, and the like.
  • protecting groups for asparagine and glutamine include Trt, xantyl (Xan), 4,4'-dimethoxybenzhydryl (Mbh), 2,4,6-trimethoxybenzyl (Tmob), and the like.
  • activated carboxyl groups in the starting materials include corresponding acid anhydrides, azides, active esters [esters with alcohols such as pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol , cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccimide, 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt))], etc.
  • active esters esters with alcohols such as pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol , cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccimide, 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt))]
  • activated amino groups in the starting material include the corresponding phosphorus amide.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon; Anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid (TFA), trimethylsilyl bromide (TMSBr), trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate, tetrafluoroboric acid, tris(tri acid treatment with a solution of fluoro)boric acid, boron tribromide, or a mixture thereof; Base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc.; and reduction with sodium in liquid ammonia; and the like.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon
  • Anhydrous hydrogen fluoride methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroace
  • the elimination reaction by acid treatment described above is generally carried out at a temperature of -20°C to 40°C; Acid treatments include anisole, phenol, thioanisole, metacresol and paracresol; This is done efficiently by adding a cation scavenger such as dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, triisopropylsilane, and the like.
  • a cation scavenger such as dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, triisopropylsilane, and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the protecting group of the imidazole of histidine is removed by thiophenol treatment;
  • the formyl group used as a protecting group for the indole of tryptophan is obtained not only by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithiol and 1,4-butanedithiol, but also by alkali treatment with dilute sodium hydroxide and dilute ammonia. removed by deprotection.
  • Protection of a functional group not to be involved in the reaction between the starting material and the protecting group, removal of the protecting group, activation of a functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known protecting groups and known means.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to conventional peptide markings.
  • the C-terminus of the peptide may be any one of an amide (-CONH2), a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an alkylamide (-CONHRa), and an ester (-COORa).
  • an amide of a peptide it is formed by solid phase synthesis using a resin for amide synthesis, or the ⁇ -carboxyl group of a carboxy terminal amino acid is amidated, and the peptide chain is extended toward the amino group side to a desired chain length. Then, a peptide from which the protecting group for the N-terminal ⁇ -amino group of the peptide chain has been removed and a peptide with only the protecting group for the C-terminal carboxyl group removed from the peptide chain are prepared, and these two peptides are mixed as described above. condensed in a solvent. Regarding the details of the condensation reaction, the same as above applies.
  • the modified peptide may be in the form of a solvate thereof.
  • “Solvate” means that the peptide or salt thereof forms a complex with solvent molecules.
  • the pharmaceutical composition is a formulation for oral administration, a formulation for intraoral application, a formulation for administration by injection, a formulation for dialysis and irrigation, a formulation for application to the bronchi and lungs, a formulation for administration to the eyes, a formulation for administration to the ear, and a formulation for application to the nose. It may be any one formulation selected from the group consisting of formulations for application to the body, formulations for rectal application, formulations for vaginal application, and formulations for application to the skin.
  • composition comprises a pharmaceutically effective amount of the modified peptide; and/or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term "pharmaceutically effective amount” may mean an amount sufficient to achieve the efficacy of preventing or treating obesity of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, liurine fat, glycerogeratin and the like may be used as a base for the suppository.
  • the pharmaceutical composition may include carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, and small molecules in order to increase stability or absorption. Proteins or other Stabilizers can be used as pharmaceuticals.
  • Another aspect provides a method for treating obesity or metabolic disease comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • administration means providing a pharmaceutical composition to a subject by any suitable method.
  • a pharmaceutically effective amount and an effective dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the formulation method, administration method, administration time and/or route of administration of the pharmaceutical composition.
  • the type and degree of response to be achieved by administration of the pharmaceutical composition, the type of subject to be administered, age, weight, general health condition, symptom or degree of disease, gender, diet, excretion, simultaneous or It may vary according to various factors including drugs and other components of the composition used together in this case, and similar factors well known in the medical field.
  • a person of ordinary skill in the art can readily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • Administration of the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered once a day, divided into several administrations. Therefore, the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 1 ug/kg/day to 1,000 mg/kg/day.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual who needs a cure for obesity or metabolic disease or has a desire to lose weight.
  • Another aspect provides a health functional food for preventing or improving obesity containing the modified peptide as an active ingredient.
  • the term "health functional food” refers to a food manufactured and processed by using a specific ingredient as a raw material or by extracting, concentrating, refining, or mixing a specific ingredient contained in a food raw material for the purpose of health supplementation. It refers to food designed and processed to sufficiently exert biological control functions such as biological defense, regulation of biological rhythm, prevention and recovery of disease, etc.
  • the health functional food composition may perform functions related to prevention and improvement of obesity and prevention and improvement of metabolic diseases.
  • the health beverage composition of the present invention may include various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates may include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 10 g, preferably about 0.01 to 0.1 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the health functional food may include food additives acceptable in food science, and may include appropriate carriers commonly used in the manufacture of health functional food.
  • the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages; and the like.
  • the composition of the present invention may include fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 part by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • Another aspect includes modifying the C-terminal or N-terminal amino acid sequence of a beta-melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 To provide a method for producing a modified peptide.
  • ⁇ -MSH beta-melanocyte stimulating hormone
  • the step of modifying the amino acid sequence is any one or more selected from the group consisting of Aspartic acid, Glutamic acid, Lysine, Arginine, and Histidine. It can be addition or deletion. In addition, the N-terminal alanine may be further deleted.
  • the modified peptide according to one aspect can be usefully used for preventing or treating obesity because the transdermal delivery efficacy of the peptide is improved through a change in net charge and has a lipolysis effect.
  • Figure 2 is a graph showing that the skin penetration depth of the peptide can be known by the fluorescence intensity.
  • Figure 3 is a CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) analysis picture showing that the skin permeability of modified ⁇ -MSH peptides is improved compared to conventional ⁇ -MSH peptides.
  • CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy
  • Figure 4 is a graph showing the weight loss when the modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) was applied to obese mice.
  • Figure 5 is a photograph showing the weight loss when the modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) was applied to obese mice.
  • FIG. 6 is a photograph showing that the size of inguinal white fat was reduced when modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) was applied to obese mice.
  • FIG. 8 is a photograph showing that the size of adipose tissue is reduced when the modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) is applied to obese mice.
  • CPP cell penetrating peptide, cell penetrating peptide
  • RED reverse electrodialysis, microcurrent generator
  • the net charge of a peptide is the sum of the charges of each amino acid constituting the peptide, and has a great effect on its behavior in an electromagnetic field. Peptide molecules with a large absolute value of net charge receive strong force in the electromagnetic field, and peptide molecules with zero net charge are not affected by the electromagnetic field. In particular, since the net charge of a peptide changes according to pH, the behavior in the electromagnetic field varies according to the pH condition of the peptide solution.
  • non-CPP peptides having a molecular weight greater than 800 Daltons and a large absolute value of net charge could be expected to increase transdermal delivery efficiency when using microcurrent.
  • Example 1 when the sequence of a peptide that does not satisfy the specific conditions is modified to satisfy the conditions suitable for microcurrent, the skin permeability can be improved.
  • Amino acids that affect the net charge of the peptide are shown in Table 2 below.
  • aspartic acid (D) or glutamic acid (E) is added to the terminal of the parent peptide, the charge becomes -1, and lysine (K), arginine (R) or histidine (Histidine, When H) is added to the end of the parent peptide, the charge becomes +1. Accordingly, it can be seen that the transdermal transduction rate can be improved when microcurrent is used by modifying the parent peptide in such a way as to add or exclude the above amino acids from the terminus that does not affect the functionality of the parent peptide.
  • ⁇ -MSH a non-CPP peptide having a high molecular weight and a small net charge
  • SPPS Solid Phase Peptide Synthesis
  • CPP peptides were mainly classified as amphipathic CPP with an amphipathic alpha helical structure and random coil structure with a high ratio of arginine among constituent amino acids or a large net charge value (Cationic CPP). are classified as amphipathic CPP with an amphipathic alpha helical structure and random coil structure with a high ratio of arginine among constituent amino acids or a large net charge value (Cationic CPP). are classified
  • TFE trifluoroethanol
  • modified ⁇ -MSH peptide 2 was confirmed to have a random coil-oriented secondary structure. Therefore, considering the structure of the existing ⁇ -MSH peptide and the modified ⁇ -MSH peptide, the low arginine ratio, and the low net charge amount, it can be seen that the CPP peptide has weak characteristics and is not a CPP peptide. Accordingly, the modified ⁇ -MSH peptide was not a CPP peptide, and the net charge amount was increased, so that the transdermal permeability could be increased as follows.
  • FITC fluorescent substance
  • Percutaneous penetration depth analysis was performed using CLSM equipment, and tomography was taken at 5 ⁇ m intervals for a total of 150 ⁇ m from 20 ⁇ m on the upper skin to 130 ⁇ m on the lower skin in z-stack mode with the equipment set to the FITC wavelength band.
  • the depth of skin penetration (d 0 ) with the highest intensity of fluorescence is the same as the intensity of natural fluorescence on the skin surface.
  • the maximum penetration depth (d max ) it was calculated by the following formula.
  • the modified ⁇ -MSH peptide compared to the existing ⁇ -MSH peptide showed improved skin permeability when using microcurrent . This is because ⁇ -MSH is not a CPP and has a large molecular weight and a high net charge.
  • Figure 2 is a graph showing that the skin penetration depth of the peptide can be known by the fluorescence intensity.
  • Figure 3 is a CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) analysis picture showing that the skin permeability of modified ⁇ -MSH peptides is improved compared to conventional ⁇ -MSH peptides.
  • CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy
  • citrate synthetase converts it into the form of citrate and moves it to the cytoplasm.
  • Citric acid transported to the cytoplasm is synthesized into neutral fat through a series of processes, so if the activity of citrate synthase can be reduced, the biosynthesis of new neutral fat can be inhibited even if there is a high concentration of acetyl CoA inside the mitochondria due to excessive energy intake. there is.
  • the citrate synthase inhibition assay uses oxaloacetate as a reactant and analyzes the process by which citric acid synthetase produces citric acid.
  • KKD modified ⁇ -MSH peptide 2
  • KKD peptide sample was dissolved in a predetermined buffer solution at 1 to 500 ⁇ g/mL.
  • KKD peptide, citrate synthase, and a reaction auxiliary material acetyl CoA
  • acetyl CoA acetyl CoA
  • the absorbance of the sample where the reaction started was measured at 5-minute intervals for 40 minutes.
  • Tecan Infinite 200 PRO was used as a detector
  • Corning 96 well plate was used as a measuring plate, and absorbance was measured at 412 nm and calculated as follows.
  • KKD modified ⁇ -MSH peptide 2
  • an obese animal model was prepared by feeding C57BL/6 male mice a high fat diet (HFD) for 8 weeks. After 8 weeks, it was confirmed that the HFD-fed mice gained about 1.5 times more weight than the normal feed-fed mice, and it was confirmed that the size of inguinal white adipose tissue (iWAT) was also enlarged.
  • HFD high fat diet
  • KKD peptide was applied and microcurrent was applied for 20 minutes (KKD RED), KKD peptide was applied and microcurrent was not applied (KKD Passive Diffusion), and nothing was applied (Negative Control ) was divided by
  • the peptide was dissolved in a phosphate buffered saline solution, soaked in a non-woven fabric, and then applied to the skin surface by pushing the mouse's abdominal hair.
  • the group to which the microcurrent was applied was activated by attaching an electrode on a non-woven fabric and attaching an opposite electrode to the skin surface that does not come into contact with it, and then connecting it to RED.
  • H&E staining was performed in the following order for staining image analysis of adipose tissue.
  • Adipose tissue was fixed in a 10% formalin solution, solidified in a paraffin solution, and the tissue sectioned at 4 ⁇ m was attached to a slide, deparaffinized in a xylene solution, and subjected to 100, 95, 90, 80, and 70% alcohol concentrations. function through. Thereafter, after washing with hematoxylin solution for 5 minutes and running water for 10 minutes, tissue staining was performed by treating with 1% acid-alcohol for 30 seconds and eosin for 1 minute. The stained tissue was dehydrated again in the order of 70, 80, 90, 95, and 100% alcohol, and finally treated twice for 10 minutes in xylene and sealed through a transparent process.
  • KKD peptide which is a modified peptide of ⁇ -MSH involved in reducing intake and regulating energy metabolism in the body, has an excellent lipolysis effect as the transdermal permeability by microcurrent increases and can be delivered systemically.
  • Figure 4 is a graph showing the weight loss when the modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) was applied to obese mice.
  • Figure 5 is a photograph showing the weight loss when the modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) was applied to obese mice.
  • FIG. 6 is a photograph showing that the size of inguinal white adipose tissue is reduced when modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) is applied to obese mice.
  • FIG. 7 is a graph showing that the size of inguinal white adipose tissue decreased when modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) was applied to obese mice.
  • FIG. 8 is a photograph showing that the size of adipose tissue is reduced when the modified ⁇ -MSH peptide 2 (KKD peptide) is applied to obese mice.

Abstract

경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드에 관한 것으로, 일 양상에 따른 변형 펩타이드는 알짜 전하량의 변화를 통해 펩타이드의 경피 전달 효능이 향상되고 지방 분해 효과가 있어 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드
경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드에 관한 것이다.
비만은 세계 각국에서 빠르게 증가하지만 의학적으로 효과적인 치료법이 없는 매우 심각한 질환이다. 세계 보건기구 (WHO)는 체지방 지수 (BMI: Body Mass Index) 30 이상을 비만으로 규정했는데, OECD 회원국 평균 비만율은 19.5%로 나타났으며, 그 비율은 점차 늘어나고 있다.
비만은 유전적 원인 또는 생활습관상의 원인에 의한 체내 지방의 과잉축적 상태를 말하며, 성인병, 만성퇴행성질환 등의 질병을 유발하여 선진국의 경우 총 국민의료비의 2 ~ 7%가 과체중 및 비만에 의해 발생하고 있다. 비만으로부터 야기될 수 있는 사회적 장애와 과다한 지방 축적으로 생기는 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 당뇨병, 지방간 등 2차적인 합병증이 문제가 된다.
최근들어 아미노산의 중합체로서 단백질보다 구조적으로 단순하지만, 생체 내 단백질과의 상호작용이 매우 크기 때문에 효소의 활성을 강화시키거나 억제시키는 기능이 있는 다양한 펩타이드가 개발되고 있다.
펩타이드는 높은 생체 적합성과 생리활성능에도 불구하고, 낮은 생체 이용률을 가져 활용에 제한이 많았다. 특히 500 달톤의 법칙으로 유명한 피부의 장벽기능으로 인해 펩타이드의 효과적인 전달이 어려웠다. 아미노산의 1개의 평균 분자량은 약 100달톤으로, 보통 5-100개 정도의 아미노산으로 이루어진 펩타이드는 피부장벽을 효과적으로 통과할 수 없었다.
기존 펩타이드의 경피전달을 위한 방법으로는 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, CPP) 또는 지방산을 펩타이드에 결합시키는 것이 있다.
그러나, 높은 생리활성을 가진 기존 펩타이드에 세포 투과성 펩타이드나 지방산을 결합시키는 방식에는, 반응과정에서 유발될 수 있는 펩타이드의 구조 변화에 의한 생리활성능력 감소 및 추가적인 결합 반응에 수반되는 생산비용 증가와 같은 단점들이 존재한다.
이에 본 발명자들은 펩타이드를 이용한 경피전달에 대한 연구를 지속한 결과, 피부 침투 및 투과성이 우수하고 지방분해 효과가 뛰어난 신규 펩타이드를 합성하였다.
일 양상은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH) 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단의 아미노산 서열이 변형된, 변형 펩타이드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 지방 분해용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH)의 C-말단 또는 N-말단의 아미노산 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 변형 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 청구항 1의 변형 펩타이드를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 청구항 1의 변형 펩타이드를 비만 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH) 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단의 아미노산 서열이 변형된, 변형 펩타이드를 제공한다.
상기 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH)은 내인성 펩타이드 호르몬 및 신경 펩타이드로서, 인체내에 자연적으로 존재하는 펩타이드이다. 또한, 식욕을 감소시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
상기 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 잔기의 수가 5 내지 100인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "아미노산"은 자연적으로 펩타이드로 통합되는 20개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드는 D-형 또는 L-형, 서열 중 일부만 D-형이나 L-형으로 구성된 펩타이드, 혹은 이들의 라세미체 형태일 수 있다.
상기 펩타이드는 천연형 또는 비변이된 펩타이드에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산에서 보존적 치환이 일어난 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어“보존적 치환(conservative substitution)”은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 펩타이드는 천연형 또는 비변이된 펩타이드의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 또한, 아미노산은 전하를 띠는(electrically charged) 곁사슬을 갖는 아미노산과 전하를 띠지 않는(uncharged) 곁사슬을 갖는 아미노산으로 분류할 수 있으며, 전하를 띠는 곁사슬을 갖는 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘을 포함하고, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산은 다시 비극성(nonpolar) 아미노산 또는 극성 아미노산(polar)으로 분류할 수 있으며, 비극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신. 메티오닌, 프롤린, 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민을 포함하는 것으로 분류할 수 있다. 상기와 같은 유사한 성질을 갖는 아미노산으로의 보존적 치환은 동일 또는 유사한 활성을 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 아마이드화(amidation), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함할 수 있다. 또한, 펩타이드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열의 변형은 아스파르트산 (Aspartic acid, D), 글루탐산 (Glutamic acid, E), 리신 (Lysine, K), 아르기닌 (Arginine, R) 및 히스티딘 (Histidine, H)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬의 말단에 부가 또는 결실시키는 것일 수 있다. 여기서, 용어 "말단"은 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단의 가장 끝에 있는 아미노산 한 개를 의미하는 것은 아니고 C-말단 또는 N-말단의 가장 끝에서부터 5 개 까지의 아미노산을 의미하는 것일 수 있다. 또한, 상기 기재된 아미노산 종류에 한정하지 않고 다른 아미노산과 함께 추가시킴으로써 아미노산 서열을 변형시키는 것일 수 있다. 이때, 상기 아미노산의 부가 또는 결실에 의해 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬의 본래 기능성에 영향을 주는 것은 아닐 수 있다.
본 명세서에서 '특정 서열번호로 구성되는 펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이 자명하다. 즉, 일부 서열의 차이가 있더라도 일정 수준 이상의 상동성을 나타내며 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬 활성을 나타낸다면 본 발명의 범위에 속할 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
“상동성(homology)” 또는 “동일성(identity)”은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어, “상동성” 및 “동일성”은 종종 상호교환적으로 사용될 수 있다.
임의의 두 펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
일 구체예에서, 다양한 펩타이드 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 상기 변형 펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 변형 펩타이드는 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다. 구체적으로, 본 발명의 변형 펩타이드는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 변형 펩타이드는, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는
(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.
또한, 상기 변형 펩타이드의 제조는 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 아마이드화, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다. 또한, 상기 변형은 비 천연형 화합물로의 치환을 모두 포함한다.
상기 변형에 이용되는 치환되거나 부가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 따라 본 발명자들은 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬의 N-말단의 글루탐산 (Glutamic acid) 및 C-말단의 아스파르트산 (Aspartic acid)을 결실시키고 N-말단의 알라닌(Alanine)을 추가로 결실시켜 변형된 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬을 제조하였다.
일 구체예에 있어서, 상기와 같이 아스파르트산 (Aspartic acid, D), 글루탐산 (Glutamic acid, E), 리신 (Lysine, K), 아르기닌 (Arginine, R) 및 히스티딘 (Histidine, H)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬의 말단에 부가 또는 결실시킴으로써, 상기 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬의 알짜 전하량의 절대값이 1.5 이상으로 증가되는 것일 수 있다. 이러한 알짜 전하량의 변화를 통해 상기 펩타이드의 경피 전달 효능이 향상될 수 있다. 구체적으로, 상기와 같이 아미노산 서열을 변형시켜 알짜 전하량의 절대값을 1.5 이상으로 증가시킴으로써 확산 또는 미세전류, 예를 들어 이온토포레시스(iontophoresis)에 의한 펩타이드의 경피 전달 효능이 향상되는 것일 수 있다. 상기와 같이 알짜 전하량이 증가된 펩타이드는 수동확산(passive diffusion)보다 미세전류에 의한 경피 투과율이 더 높은 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 아미노산 서열의 변형에 의한 변형 펩타이드는 기존 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬에 비해 경피 전달 효능이 향상된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 변형 펩타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 변형된 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬 펩타이드는 지방 분해 효과가 있을 수 있고, 상기와 같이 변형을 통해 경피 전달 효능이 높아짐에 따라 변형 전에 비해 경피에 효과적으로 전달되어 지방 분해 효과가 높아진 것일 수 있다.
일 실시예에서 본 발명자들은 상기와 같이 변형된 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬 펩타이드가 경피 전달 효능이 향상되고 지방 분해 효과가 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 상기 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis, RED) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다. 또한 상기 이온토포레시스를 일으키는 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 하나의 전지가 장착된 제2의 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다. 일 실시예에서, 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬 펩타이드의 아미노산 서열을 변형시켜 알짜 전하량의 절대값을 1.5 이상으로 증가시킴으로써 이온토포레시스에 의해 미세전류를 발생시켜 펩타이드의 경피 투과율이 향상되는 것을 확인하였다.
일 구체예에 있어서, 상기 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬 펩타이드는 세포 투과 펩타이드 (cell-penetrating peptide; CPP)가 아닌 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포 투과 펩타이드(CPP)"는 세포막 투과성 펩타이드로서, 대개 물리화학적 성질에 따라 양이온성(Cationic)과 양친매성 α-나선구조(Amphipathic α-Helix)등으로 분류된다. 양이온성 CPP는 높은 알짜 전하량을 가지고 있으며, 특히 아르기닌(Arginine, R)의 비율이 높다. 양친매성 α-Helix CPP는 세포질과 같은 친수성 환경에서는 랜덤 코일의 형태로 존재하다가 세포막과 같은 소수성 환경에 노출되면 친수성과 소수성면을 가지는 α-Helix 형태를 가지는 것으로 알려져 있다.
상기 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬 펩타이드는 세포 투과 펩타이드가 아니고 분자량이 높아 변형 전에는 경피 투과율이 낮은 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 지방 분해용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상기 화장료 조성물의 지방 분해 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 예를 들어, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "약학적 조성물"은, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭할 수 있다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 비만 또는 대사성 질환에 유리한 효과를 부여하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방(prevention)"은 질환, 장애, 또는 그의 부수적 증상의 발병 또는 재발을 부분적으로 또는 완전히 지연시키거나 방지하거나, 질환 또는 장애의 획득 또는 재획득을 막거나, 질환 또는 장애의 획득의 위험을 감소시키는 방법을 말한다. 예를 들어, 상기 예방은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 비만 또는 대사성 질환 증상의 발생을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 질병, 예를 들어 비만 또는 대사성 질환의 발전의 억제, 경감 또는 제거를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "개선"이란 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 비만 또는 대사성 질환 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 "대사성 질환(metabolic disease)"은 에너지 과잉 섭취 또는 호르몬 불균형 등 다양한 원인으로 체내 에너지 대사가 비정상적으로 일어나 지방이 과다하게 합성되거나 축적되어 발생하는 질환을 의미하는 것일 수 있다. 따라서, 비만에 의해 대사성 질환이 발생할 수 있다. 상기 대사성 질환은 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 지방간, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 이상지질혈증, 및 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변형 펩타이드는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 염은 약학 분야, 예를 들면 비만 또는 대사성 질환 분야에서 사용되는 통상의 산 부가염, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 술팜산, 인산 또는 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 시트르산, 말레산, 말론산, 메탄술폰산, 타르타르산, 말산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 옥살산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은, 암모늄, 디메틸아민, 모노메틸아민, 모노에틸아민, 디에틸아민과 같은 염기 부가 염일 수 있다. 또한, 상기 염은 통상의 금속 염 형태, 예를 들면 리튬, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 또는 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 산 부가염, 염기 부가염 또는 금속염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염 및 그를 제조하는 일반 방법론은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)]; [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조할 수 있다.
보호된 아미노산 또는 펩타이드의 축합을 위하여, 펩타이드 합성에 유용한 각종 활성화 시약, 특히 바람직하게는 트리스포스포늄염, 테트라메틸우로늄염, 카보다이이미드 등이 사용될 수 있다. 트리스포스포늄염의 예는 벤조트라이아졸-1-일옥시트리스(피롤라지노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 브로모트리스(피롤라지노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBroP), 7-아자벤조트라이아졸-1-일옥시트리스(피롤라지노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyAOP)를 포함하고, 테트라메틸우로늄염의 예는 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HATU), 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TBTU), 2-(5-노보난-2,3-다이카복시이미드)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TNTU), O-(N-석시미딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TSTU)를 포함하고, 카보다이이미드의 예는 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), N,N'-다이아이소프로필카보다이이미드(DIPCDI), N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(EDCI·HCl) 등을 포함한다. 이들을 이용하는 축합을 위하여, 라세미화 저해제[예컨대, N-하이드록시-5-노보넨-2,3-다이카복실산 이미드(HONB), 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt), 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸(HOAt), 3,4-다이하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트라이아진(HOOBt), 에틸 2-사이아노-2-(하이드록시이미노)아세테이트(Oxyma) 등]의 첨가가 바람직하다. 축합에 사용되는 용매는 펩타이드 축합 반응에 유용한 것으로 공지된 것들로부터 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 무수 또는 물-함유 N,N-다이메틸폼아마이드, N,N-다이메틸아세트아마이드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 산 아마이드, 염화메틸렌, 클로로폼 등과 같은 할로겐화된 탄화수소, 트라이플루오로에탄올, 페놀 등과 같은 알코올, 다이메틸설폭사이드 등과 같은 설폭사이드, 피리딘 등과 같은 3급 아민, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란 등과 같은 에터, 아세토나이트릴, 프로피오나이트릴 등과 같은 나이트릴, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 등과 같은 에스터, 이들의 적절한 혼합물 등이 사용될 수 있다. 반응 온도는 펩타이드 결합 반응에 사용 가능한 것으로 공지된 범위로부터 적절하게 선택되고, 통상 약 -20℃ 내지 90℃의 범위로부터 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 내지 6배 과잉으로 사용된다. 고상 합성에서, 닌하이드린 반응을 이용하는 시험이 축합이 불충분한 것을 나타낼 경우, 충분한 축합은 보호기의 제거 없이 축합 반응을 반복함으로써 수행될 수 있다. 반응을 반복한 후에도 축합이 여전히 불충분할 경우, 미반응 아미노산은 산 무수물, 아세틸이미다졸 등으로 아세틸화될 수 있으므로 후속 반응에 대한 영향이 회피될 수 있게 된다.
출발 아미노산의 아미노기에 대한 보호기의 예는 벤질옥시카보닐(Z), tert-부톡시카보닐(Boc), tert-펜틸옥시카보닐, 아이소보닐옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 2-클로로벤질옥시카보닐(Cl-Z), 2-브로모벤질옥시카보닐(Br-Z), 아다만틸옥시카보닐, 트라이플루오로아세틸, 프탈로일, 폼일, 2-나이트로페닐설페닐, 다이페닐포스피노티오일, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), 트라이틸 등을 포함한다.
출발 아미노산에 대한 카복실-보호기의 예는, 위에서 언급된 C1-6 알킬기, C3-10 사이클로알킬기, C7-14 아르알킬기 이외에, 아릴, 2-아다만틸, 4-나이트로벤질, 4-메톡시벤질, 4-클로로벤질, 페나실 및 벤질옥시카보닐하이드라자이드, tert-부톡시카보닐하이드라자이드, 트라이틸하이드라자이드 등을 포함한다.
세린 또는 트레오닌의 하이드록실기는, 예를 들어, 에스터화 또는 에터화에 의해 보호될 수 있다. 에스터화에 적합한 기의 예는, 아세틸기 등과 같은 저급(C2-4) 알카노일기, 벤조일기 등과 같은 아로일기, 및 유기산 등으로부터 유래된 기를 포함한다. 또한, 에터화에 적합한 기의 예는 벤질, 테트라하이드로피란일, tert-부틸(But), 트라이틸(Trt) 등을 포함한다.
타이로신의 페놀성 하이드록실기에 대한 보호기의 예는 Bzl, 2,6-다이클로로벤질, 2-나이트로벤질, Br-Z, tert-부틸 등을 포함한다.
히스티딘의 이미다졸에 대한 보호기의 예는 p-톨루엔설포닐(Tos), 4-메톡시-2,3,6-트라이메틸벤젠설포닐(Mtr), 다이나이트로페닐(DNP), 벤질옥시메틸 (Bom), tert-부톡시메틸 (Bum), Boc, Trt, Fmoc 등을 포함한다.
아르기닌의 구아니디노기에 대한 보호기의 예는 Tos, Z, 4-메톡시-2,3,6-트라이메틸벤젠설포닐(Mtr), p-메톡시벤젠설포닐(MBS), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc), 메시틸렌-2-설포닐(Mts), 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조퓨란-5-설포닐(Pbf), Boc, Z, NO2 등을 포함한다.
라이신의 곁사슬 아미노기에 대한 보호기의 예는 Z, Cl-Z, 트라이플루오로아세틸, Boc, Fmoc, Trt, Mtr, 4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥실리덴일(Dde) 등을 포함한다.
트립토판의 인돌릴에 대한 보호기의 예는 폼일(For), Z, Boc, Mts, Mtr 등을 포함한다.
아스파라긴 및 글루타민에 대한 보호기의 예는 Trt, 잔틸(Xan), 4,4'-다이메톡시벤즈하이드릴(Mbh), 2,4,6-트라이메톡시벤질(Tmob) 등을 포함한다.
출발 물질 중의 활성화된 카복실기의 예는 대응하는 산 무수물, 아자이드, 활성 에스터[알코올과의 에스터(예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트라이클로로페놀, 2,4-다이나이트로페놀, 사이아노메틸알코올, 파라나이트로페놀, HONB, N-하이드록시석시미드, 1-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt), 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸(HOAt))] 등을 포함한다. 출발 재료 내 활성화된 아미노기의 예는 대응하는 인 아마이드를 포함한다.
보호기를 제거(removing)(제거(eliminating))하는 방법의 예는, Pd-블랙 또는 Pd-탄소와 같은 촉매의 존재 하에서의 수소 스트림 중의 촉매 환원; 무수 플루오린화수소, 메탄설폰산, 트라이플루오로메탄설폰산, 트라이플루오로아세트산(TFA), 트라이메틸실릴 브로마이드(TMSBr), 트라이메틸실릴 트라이플루오로메탄설포네이트, 테트라플루오로붕산, 트리스(트라이플루오로)붕산, 삼브로민화붕소, 또는 이의 혼합물 용액을 이용한 산 처리; 다이아이소프로필에틸아민, 트라이에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등을 이용한 염기 처리; 및 액체 암모니아 중에서 나트륨에 의한 환원 등을 포함한다. 위에서 기재된 산 처리에 의한 제거 반응은 일반적으로 -20℃ 내지 40℃의 온도에서 수행되고; 산 처리는 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸 및 파라크레졸; 다이메틸설파이드, 1,4-부탄다이티올, 1,2-에탄다이티올, 트라이아이소프로필실란 등과 같은 양이온 포촉제(cation scavenger)를 첨가함으로써 효율적으로 수행된다. 또한, 히스티딘의 이미다졸의 보호기로서 사용되는 2,4-다이나이트로페닐기는 티오페놀 처리에 의해 제거되고; 트립토판의 인돌의 보호기로서 사용되는 폼일기는 1,2-에탄다이티올, 1,4-부탄다이티올 등의 존재 중에서 산처리에 의한 것뿐만 아니라, 희석 수산화나트륨, 희석 암모니아 등에 의한 알칼리 처리에 의한 탈보호에 의해 제거된다.
출발 물질과 보호기의 반응에 관여되지 않아야 하는 작용기의 보호, 보호기의 제거, 반응에 관여하는 작용기의 활성화 등은 공지된 보호기 및 공지된 수단으로부터 적절하게 선택될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 펩타이드에 대해서, 좌측 단부가 통상의 펩타이드 마킹에 따라서 N-말단(아미노 말단)이고, 우측 단부가 C-말단(카복실 말단)이다. 펩타이드의 C-말단은 아마이드(-CONH2), 카복실기(-COOH), 카복실레이트(-COO-), 알킬아마이드(-CONHRa) 및 에스터(-COORa) 중 어느 하나일 수도 있다.
펩타이드의 아마이드를 제조하는 방법에서, 이것은 아마이드 합성을 위하여 수지를 이용하는 고상 합성에 의해 형성되거나, 또는 카복시 말단 아미노산의 α-카복실기가 아마이드화되고, 펩타이드 사슬이 아미노기 측을 향하여 목적하는 사슬 길이로 연장되고, 그 후, 펩타이드 사슬만의 N-말단 α-아미노기에 대한 보호기가 제거된 펩타이드 및 C-말단 카복실기에 대한 보호기만이 펩타이드 사슬에서 제거된 펩타이드가 제조되고, 이들 두 펩타이드는 위에서 기재된 혼합된 용매 중에서 축합된다. 축합 반응에 대한 상세에 대해서, 위에서의 것과 같은 것이 적용된다. 축합에 의해 얻어진 보호된 펩타이드가 정제된 후에, 모든 보호기가 위에서 기재된 방법에 의해 제거되어 목적하는 조질의 펩타이드를 수득할 수 있다. 이 조질의 펩타이드를 주된 분획의 정제 및 동결-건조의 각종 공개적으로 공지된 수단을 이용해서 정제함으로써, 펩타이드의 목적하는 아마이드가 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변형 펩타이드는 그의 용매화물의 형태일 수 있다. “용매화물”은 상기 펩타이드 또는 그의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 의미한다.
상기 약학적 조성물은 경구투여 하는 제제, 구강내 적용하는 제제, 주사로 투여하는 제제, 투석 및 관류용 제제, 기관지·폐에 적용하는 제제, 눈에 투여하는 제제, 귀에 투여하는 제제, 코에 적용하는 제제, 직장으로 적용하는 제제, 질에 적용하는 제제 및 피부에 적용하는 제제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것일 수 있다.
상기 조성물은 상기 변형 펩타이드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount); 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상기 약학적 조성물의 비만 예방 또는 치료 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 또는 대사성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 약학적 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
상기 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 약학적 조성물의 투여량은 1일 1 ug/kg/일 내지 1,OOO mg/kg/일일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 비만 또는 대사성 질환의 치유를 필요로 하거나 체중을 줄이려는 욕구가 있는 개체일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말한다. 상기 건강기능식품 조성물은 비만의 예방 및 개선, 대사성 질환의 예방 및 개선 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 겔, 젤리, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 및 건강 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형 등이 있으며 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체를 포함할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 다른 양상은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH) 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단의 아미노산 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 변형 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열을 변형시키는 단계는 아스파르트산 (Aspartic acid), 글루탐산 (Glutamic acid), 리신 (Lysine), 아르기닌 (Arginine) 및 히스티딘 (Histidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 부가 또는 결실시키는 것일 수 있다. 또한, N-말단의 알라닌(Alanine)을 추가로 결실시키는 것일 수 있다.
상기 변형 펩타이드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
일 양상에 따른 변형 펩타이드는 알짜 전하량의 변화를 통해 펩타이드의 경피 전달 효능이 향상되고 지방 분해 효과가 있어 비만의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 변형된 β-MSH 펩타이드 2의 CD(Cicular Dichroism) 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 형광 세기로 펩타이드의 피부 투과 깊이를 알 수 있음을 나타낸 그래프이다.
도 3은 기존 β-MSH 펩타이드와 비교하여 변형된 β-MSH 펩타이드들의 피부투과율이 향상되었음을 나타내는 CLSM(Confocal Laser Scanning Microscopy) 분석 사진이다.
도 4는 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 체중이 감소된 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 체중이 감소된 것을 나타낸 사진이다.
도 6은 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 서혜부 백색 지방의 크기가 줄어든 것을 나타낸 사진이다.
도 7은 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 서혜부 백색 지방의 크기가 줄어든 것을 나타낸 그래프이다.
도 8은 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 지방 조직의 크기가 줄어든 것을 나타낸 사진이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. 미세전류 적합 펩타이드 선별
미세전류에 의해 피부투과율이 증가하는 특정 조건의 펩타이드가 존재하며, 그를 스크리닝 하여 아래 표 1에 나타내었다.
경피전달 조건 분자량 구조 알짜 전하량(z) 미세전류 강화효과
1 <800 CPP 1.5 <│z│ 없음
2 1.5 >│z│ 없음
3 No CPP 1.5 <│z│ 없음
4 1.5 >│z│ 없음
5 >800 CPP 1.5 <│z│ 없음
6 1.5 >│z│ 없음
7 No CPP 1.5 <│z│ 있음
8 1.5 >│z│ 없음
상기 표 1에 나타낸 바와 같이 CPP(cell penetrating peptide, 세포 투과 펩타이드)는 단독으로도 효과적인 경피전달이 이루어져, RED(reverse electrodialysis, 미세전류 발생장치)에 의한 경피전달 효율 증가가 미미하였다. 분자량이 800 달톤보다 작은 경우에도 단독으로도 경피전달이 잘 이루어져, RED에 의한 경피전달 효율 증가가 미미하였다. 또한, 알짜 전하량이 1.5보다 작은 경우, 미세전류에 의한 영향을 작게 받아 경피전달 효율 증가가 미미하였다.
펩타이드의 알짜전하량은 해당 펩타이드를 구성하는 각 아미노산이 가지는 전하량의 합으로, 전자기장 내에서의 거동에 큰 영향을 미친다. 알짜전하량의 절대값이 큰 펩타이드 분자는 전자기장내에서 강한 힘을 받으며, 알짜전하량이 0인 펩타이드 분자는 전자기장의 영향을 받지 않는다. 특히 펩타이드의 알짜 전하량은 pH에 따라 변하므로, 펩타이드 용액이 가진 pH 조건에 따라 전자기장내에서의 거동이 달라진다.
따라서, 상기 결과에 따라 분자량이 800 달톤보다 크고, 알짜 전하량의 절대값이 큰 non-CPP 펩타이드는, 미세전류 사용시 높은 경피전달 효율 증가를 기대할 수 있었다.
실시예 2. 미세전류에 적합한 펩타이드 서열 디자인
상기 실시예 1에서 나타낸 바와 같은 특정 조건을 만족하지 못하는 펩타이드의 서열을 변형시켜 미세전류에 적합한 조건을 만족시키면, 피부투과율을 향상시킬 수 있었다.
펩타이드의 알짜 전하량에 영향을 주는 아미노산을 하기 표 2에 나타내었다. 아스파르트산 (Aspartic acid, D) 또는 글루탐산 (Glutamic acid, E)을 모펩타이드의 말단에 부가시키는 경우 전하량이 -1이 되고, 리신 (Lysine, K), 아르기닌 (Arginine, R) 또는 히스티딘 (Histidine, H)을 모펩타이드의 말단에 부가시키는 경우 전하량이 +1이 된다. 이에 따라, 모펩타이드에서 상기와 같은 아미노산들을 모펩타이드의 기능성에 영향을 주지 않는 말단에서 부가시키거나 제외시키는 방식으로 펩타이드를 변형시키면 미세전류 이용시 경피전달률을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
이에 대한 예시를 하기 표 3에 나타내었고, 이와 같이 기존의 미세전류에 적합하지 않은 모펩타이드의 말단에 리신 아미노산을 추가하여 변형시킨 펩타이드는 알짜 전하량이 2.0 이상이 되어 미세전류에 적합한 펩타이드가 될 수 있다.
상기 디자인 원리를 활용하여 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 분자량이 크고 알짜 전하량이 작은 non-CPP 펩타이드인 β-MSH를 변형시켜 알짜 전하량을 증가시켰다. 구체적으로, 고체상 펩타이드 합성법(Solid Phase Peptide Synthesis; SPPS) 방법을 통해 기존 모펩타이드 β-MSH의 N말단에 있는 글루탐산 (Glutamic acid, E) 및 알라닌(Alanine, A)을 결실시켜, 알짜 전하량이 0.1에서 1.1로 증가된 변형된 β-MSH 펩타이드 1을 제조하였다. 또한, 기존 모펩타이드 β-MSH의 N말단에 있는 글루탐산 (Glutamic acid, E) 및 알라닌(Alanine, A)을 결실시키고 C-말단의 아스파르트산 (Aspartic acid, D)을 결실시켜, 알짜 전하량이 0.1에서 2.1로 증가된 변형된 β-MSH 펩타이드 2를 제조하였다.
아미노산 (Amino acid) 알짜전하량 (Net charge at pH 7.0)
Basic amino acid Asp(D), Glu(E) -1
Acidic amino acid Lys(K), Arg(R), His(H) 1
기존 모펩타이드 미세전류 부적합 펩타이드
CPP 구조 MW (g/mol) Net charge(at pH 7.0)
X 2000.0 0.0
기존 모펩타이드 말단에 Lys 2개를 추가하여 변형된 펩타이드 미세전류 적합 펩타이드
CPP 구조 MW (g/mol) Net charge(at pH 7.0)
X 2256.3 2.0
기존 β-MSH 펩타이드 변형된 β-MSH 펩타이드 1 변형된 β-MSH 펩타이드 2
서열 MW(g/mol) Net charge(at pH 7.0) 서열 MW(g/mol) Net charge(at pH 7.0) 서열 MW(g/mol) Net charge(at pH 7.0)
AEKKDEGPYRMEHFRWGSPPKD(서열번호 1) 2660.92 0.1 KKDEGPYRMEHFRWGSPPKD(서열번호 2) 2460.73 1.1 KKDEGPYRMEHFRWGSPPK(서열번호 3) 2345.64 2.1
실험예 1. 변형된 펩타이드의 2차구조 분석
상기 실시예 2에서 변형된 β-MSH 펩타이드 2의 2차구조를 분석하였다.
CD분광기를 이용하여 펩타이드 구조분석을 하여 펩타이드의 2차 구조(secondary structure) 및 CPP 특성을 확인하였다. CD 분석을 이용하면, CPP 펩타이드가 취하는 특이적인 양친매성 알파 나선구조(amphipathic alpha helix)구조나, 아미노산 서열 변화에 의한 2차 구조 변화를 확인할 수 있기 때문이다. CPP 펩타이드는 주로 양친매성 알파 나선구조를 가지는 종류(amphipathic CPP)와 랜덤코일(random coil)구조와 함께 구성 아미노산 중 아르기닌(arginine)의 비율이 높거나 알짜 전하량의 값이 큰 종류(Cationic CPP)로 분류된다.
CD 분석 조건은 UV측정 파장에 간섭이 작은 10 mM, pH 7.4, 인산완충생리식염수에 1:1 부피비로 펩타이드 굽힘 유도 용매인 TFE(trifluoroethanol)를 섞은 용액을 사용하였다. 이는 펩타이드의 굽힘으로 형성되는 2차 구조는 대개 수용액 조건이 아닌 세포막과 같은 소수성 환경을 제공해주었을 때 유도되기 때문이다.
기존 β-MSH 펩타이드 및 변형된 β-MSH 펩타이드들의 구조를 확인해본 결과, 하기 표 5 및 도 1에 나타낸 바와 같이 변형된 β-MSH 펩타이드 2는 랜덤코일 위주의 이차구조를 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 이와 같이 기존 β-MSH 펩타이드 및 변형된 β-MSH 펩타이드들의 구조, 낮은 아르기닌(arginine)의 비율, 낮은 알짜 전하량을 고려할 때, CPP 펩타이드로서의 특성이 약해 CPP 펩타이드가 아닌 것을 알 수 있다. 이에, 변형된 β-MSH 펩타이드는 CPP 펩타이드가 아니고, 알짜 전하량이 증가됨으로써, 하기와 같이 경피투과율을 증가시킬 수 있었다.
도 1은 변형된 β-MSH 펩타이드 2의 CD(Cicular Dichroism) 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
2차 구조 구성요소 변형된 β-MSH 펩타이드 2
α-Helix(%) 24.2
β-sheet(%) 15.5
Turn(%) 18.4
Random(%) 41.9
실험예 2. 변형된 펩타이드의 경피전달 효율 향상 확인
상기 실시예 2에서 변형된 β-MSH 펩타이드의 경피전달 효율 향상을 확인하기 위해 변형된 펩타이드에 형광물질(FITC)을 화학적으로 결합시킨 뒤 피부 투과시험 결과를 CLSM 장비로 분석하였다.
피부투과시험은 대표적인 생체외 피부흡수 시험법인 Franz Diffusion Cell을 사용하였으며, Hairless mouse(CrlOri:SKH1-hr, 8 week) 피부의 각질층이 위로 향하게 수용칸에 올려놓은 후 공여칸에 형광물질이 결합된 펩타이드 용액(50 μM, 인산완충생리식염수)을 가하고 미세전류를 적용하거나(RED) 적용하지 않았다(Passive Diffusion). 수용칸에는 인산완충생리식염수를 채웠으며, 온도는 32±1℃ 조건에서 1시간동안 진행하였다.
경피 투과깊이 분석은 CLSM장비를 이용하여 진행하였으며, FITC파장대로 설정된 장비를 z-stack mode로 피부상부 20 μm부터 피부하부 130 μm까지 총 150 μm를 5 μm 간격으로 단층 촬영하였다. 피부 투과깊이는 도 2에 나타낸 것과 같이, 단층 촬영 이미지를 Image-J 프로그램을 이용하여 정량화한 후, 가장 형광의 세기가 높은 깊이(d0)를 피부 표면, 자연 형광의 세기와 같아지는 지점을 최대 투과 깊이(dmax)로 설정한 뒤 하기 식으로 계산하였다.
d = dmax - d0
(d: 피부침투 깊이, dmax: 최대투과 깊이, d0: 피부표면의 깊이)
피부투과 실험 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 기존 β-MSH 펩타이드와 비교하여 변형된 β-MSH 펩타이드가 미세전류 사용시 피부투과율이 향상되었다. 이는 β-MSH가 CPP가 아니고 커다란 분자량을 가지고 있으면서 알짜 전하량이 높아졌기 때문이다.
도 2는 형광 세기로 펩타이드의 피부 투과 깊이를 알 수 있음을 나타낸 그래프이다.
도 3은 기존 β-MSH 펩타이드와 비교하여 변형된 β-MSH 펩타이드들의 피부투과율이 향상되었음을 나타내는 CLSM(Confocal Laser Scanning Microscopy) 분석 사진이다.
실험예 3. 시트르산 합성효소(Citrate synthase) 억제능 확인
시트르산 합성효소는 미토콘드리아 내 acetyl CoA의 농도가 높을 경우, 이를 시트르산의 형태로 변환시켜 세포질로 이동시키는 역할을 수행한다. 세포질로 이동된 시트르산은 일련의 과정을 거쳐 중성지방으로 합성되므로, 시트르산 합성효소의 활성을 저하시킬 수 있다면 에너지 과잉 섭취로 미토콘드리아 내부에 고농도의 acetyl CoA가 존재하더라도 새로운 중성지방의 생합성을 억제할 수 있다.
시트르산 합성효소 억제 분석은 옥살아세트산(oxaloacetate)을 반응물로 사용하며, 시트르산 합성효소가 시트르산을 생성하는 과정을 분석하는 것이다.
상기 실시예 2에서 변형된 β-MSH 펩타이드 2(이하 KKD로 표시됨)의 시트르산 합성효소 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 먼저 KKD 펩타이드 시료를 정해진 완충용액에 1 내지 500 μg/mL로 용해시켰다. 상온조건의 완충용액에 KKD 펩타이드, 시트르산 합성효소, 반응보조물질(acetyl CoA)을 가하고 섞은 뒤 5분간의 안정화 시간을 주었다. 그 다음, 반응물질(oxaloacetate)을 가하면서 반응을 시작하였다. 반응이 시작된 시료를 5분 간격으로 40분간 흡광도를 측정하였다. 검출기는 Tecan Infinite 200 PRO, 측정 플레이트는 Corning 96 well Plate를 사용하였고, 흡광도는 412 nm에서 측정하여 다음과 같이 계산하였다.
계산식: 100% - 100% X (흡광시료 - 흡광빈칸)/(흡광대조군 - 흡광빈칸)
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 KKD 펩타이드가 시트르산 합성효소 억제 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 결과는, KKD 펩타이드가 중성지방의 합성을 억제하는 효과가 있음을 나타낸다.
펩타이드 농도(μM) 500 100 50 10 5 1
억제능 18.9 1.1 0.6 1.7 0.6 0.6
실험예 4. In vivo 에서 변형된 펩타이드의 지방분해 효과 확인
비만 동물모델을 제작하여 상기 실시예 2에서 변형된 β-MSH 펩타이드 2(이하 KKD로 표시됨)의 지방분해 효과를 확인하였다.
구체적으로, C57BL/6 수컷 마우스에 고지방사료(high fat diet, HFD)를 8주간 먹임으로써 비만 동물모델을 제작하였다. 8주 후, HFD를 먹인 마우스가 일반사료를 먹인 마우스보다 체중이 약 1.5배 가량 증가한 것을 확인하였고, 서혜부 백색 지방 조직(inguinal white adipose tissue; iWAT)의 크기도 비대해져 있음을 확인하였다.
제작된 비만 동물을 마취시키고 KKD 펩타이드를 적용한 뒤 20분간 미세전류를 적용한 군(KKD RED), KKD 펩타이드를 적용하고 미세전류를 적용하지 않은 군(KKD Passive Diffusion), 아무것도 적용하지 않은 군(Negative Control)으로 나누었다.
펩타이드는 인산완충생리식염수 용액에 녹여 정량을 부직포에 적신 후 마우스 복부의 털을 밀어 피부 표면에 적용하였다. 미세전류를 적용한 군은 부직포 위에 전극을 부착하고 이와 맞닿지 않는 피부 표면에 반대 전극을 부착한 뒤 RED에 연결하여 활성화시켰다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이 KKD 및 미세전류를 적용한 군에서 대조군에 비해 체중이 현저하게 줄어든 것을 확인하였다.
또한, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이 서혜부 백색 지방 조직의 크기 및 무게가 대조군에 비해 줄어든 것을 확인하였다.
그 다음, 지방조직의 염색 이미지 분석을 위해 다음의 순서로 H&E 염색을 진행하였다. 지방 조직을 10% 포르말린 용액에 고정시키고 파라핀 용액 안에서 고체화한 후 4 μm로 절편한 조직을 슬라이드에 부착시키고 xylene 용액에 탈파라핀 시킨 후, 100, 95, 90, 80, 70% 농도의 알코올 과정을 거쳐 함수하였다. 그 후 헤마톡실린 (hematoxylin)용액 5분, 흐르는 물에 10분 세척한 뒤 1% acid-alcohol에 30초, 에오신에 1분 동안 처리하여 조직 염색을 실시하였다. 염색된 조직은 다시 70, 80, 90, 95, 100% alcohol의 순서로 탈수과정을 거치고 마지막으로 xylene에 10분씩 2번 처리하여 투명과정을 거쳐 봉입하였다.
H&E 염색된 지방조직을 분석한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 지방 조직의 크기가 작아진 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는, 섭식 감소 및 체내 에너지 대사조절에 관여하는 β-MSH를 변형시킨 펩타이드인 KKD 펩타이드가 미세전류에 의한 경피 투과율이 증가하여 전신적으로 전달 가능하게 됨에 따라 지방 분해 효과가 뛰어난 것임을 알 수 있다.
도 4는 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 체중이 감소된 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 체중이 감소된 것을 나타낸 사진이다.
도 6은 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 서혜부 백색 지방 조직의 크기가 줄어든 것을 나타낸 사진이다.
도 7은 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 서혜부 백색 지방 조직의 크기가 줄어든 것을 나타낸 그래프이다.
도 8은 변형된 β-MSH 펩타이드 2(KKD 펩타이드)를 비만 마우스에 적용했을 때 지방 조직의 크기가 줄어든 것을 나타낸 사진이다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH) 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단의 아미노산 서열이 변형된, 변형 펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 서열의 변형은 아스파르트산 (Aspartic acid), 글루탐산 (Glutamic acid), 리신 (Lysine), 아르기닌 (Arginine) 및 히스티딘 (Histidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 부가 또는 결실시키는 것인, 변형 펩타이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 서열의 변형은 N-말단의 글루탐산 (Glutamic acid) 및 C-말단의 아스파르트산 (Aspartic acid)을 결실시키는 것인, 변형 펩타이드.
  4. 청구항 2에 있어서, N-말단의 알라닌(Alanine)을 추가로 결실시키는 것인, 변형 펩타이드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 서열의 변형에 의해 상기 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬의 알짜 전하량의 절대값이 1.5 이상으로 증가되는 것인, 변형 펩타이드.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 변형 펩타이드는 변형되기 전에 비해 경피 투과율이 높아진 것인, 변형 펩타이드.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 경피 투과율은 미세전류에 의한 경피 투과율인 것인, 변형 펩타이드.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 변형 펩타이드는 변형되기 전에 비해 지방 분해능이 높아진 것인, 변형 펩타이드.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 변형 펩타이드는 세포 투과 펩타이드 (cell-penetrating peptide; CPP)가 아닌 것인, 변형 펩타이드.
  10. 청구항 1의 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 지방 분해용 화장료 조성물.
  11. 청구항 1의 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 청구항 1의 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 베타-멜라닌 세포 자극 호르몬(beta-Melanocyte stimulating hormone; β-MSH) 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단의 아미노산 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 변형 펩타이드를 제조하는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 아미노산 서열을 변형시키는 단계는 아스파르트산 (Aspartic acid), 글루탐산 (Glutamic acid), 리신 (Lysine), 아르기닌 (Arginine) 및 히스티딘 (Histidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 부가 또는 결실시키는 것인, 변형 펩타이드를 제조하는 방법.
  15. 청구항 1의 변형 펩타이드를 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 또는 치료하는 방법.
  16. 청구항 1의 변형 펩타이드를 비만 예방 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도.
PCT/KR2022/013633 2021-09-13 2022-09-13 경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드 WO2023038497A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0122079 2021-09-13
KR1020210122079A KR20230039143A (ko) 2021-09-13 2021-09-13 경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023038497A1 true WO2023038497A1 (ko) 2023-03-16

Family

ID=85506813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/013633 WO2023038497A1 (ko) 2021-09-13 2022-09-13 경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230039143A (ko)
WO (1) WO2023038497A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210040505A (ko) * 2019-10-04 2021-04-14 을지대학교 산학협력단 경피약물전달펩티드와 주름개선펩티드의 신규 접합 기능성 펩티드 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210040505A (ko) * 2019-10-04 2021-04-14 을지대학교 산학협력단 경피약물전달펩티드와 주름개선펩티드의 신규 접합 기능성 펩티드 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN ANONYMOUS : "melanotropin beta", XP093046460, retrieved from NCBI *
HAMMAMI RIADH; BÉDARD FRANÇOIS; GOMAA AHMED; SUBIRADE MURIEL; BIRON ERIC; FLISS ISMAIL : "Lasso-inspired peptides with distinct antibacterial mechanisms", AMINO ACIDS., SPRINGER VERLAG., AU, vol. 47, no. 2, 4 December 2014 (2014-12-04), AU , pages 417 - 428, XP035431924, ISSN: 0939-4451, DOI: 10.1007/s00726-014-1877-x *
HSIUNG, H.M. SMILEY, D.L. ZHANG, X.Y. ZHANG, L. YAN, L.Z. CRAFT, L. HEIMAN, M.L. SMITH, D.P.: "Potent peptide agonists for human melanocortin 3 and 4 receptors derived from enzymatic cleavages of human @b-MSH(5-22) by dipeptidyl peptidase I and dipeptidyl peptidase IV", PEPTIDES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 26, no. 10, 1 October 2005 (2005-10-01), AMSTERDAM, NL , pages 1988 - 1996, XP005087774, ISSN: 0196-9781, DOI: 10.1016/j.peptides.2004.12.029 *
SHOME AVIK; MCGREGOR AILSA; CAVADINO ALANA; MOUNTJOY KATHLEEN G.: "Central administration of β-MSH reduces body weight in obese male Pomctm1/tm1 mice", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 1864, no. 10, 22 June 2020 (2020-06-22), AMSTERDAM, NL , XP086224693, ISSN: 0304-4165, DOI: 10.1016/j.bbagen.2020.129673 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230039143A (ko) 2023-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2128663C1 (ru) Производные полипептида, обладающие инсулинотропной активностью, фармацевтическая композиция, способы усиления действия инсулина, способы лечения диабета
WO2019103203A1 (ko) 신규 펩티드 및 이를 포함한 조성물
KR950702578A (ko) 파라티로이드 호르몬(pth) 및 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드(pthrp)의 유사체, 이들의 합성 및 골다공증 치료를 위한 이들의 용도(analogs of pth and pthrp, their synthesis and use for the treatment of osteoporosis)
ES2544573T3 (es) Inhibidores diméricos de afinidad elevada de PSD-95 y su uso para el tratamiento del daño cerebral isquémico y del dolor
KR20140047051A (ko) 개선된 펩티드 제약
WO2005089790A2 (en) Y2/y4 selective receptor agonists for therapeutic interventions
KR102077983B1 (ko) 피부 주름 개선 및 미백용 조성물
WO2016190660A1 (ko) 신규 펩티드 및 이를 포함한 조성물
EP2632945A1 (en) Glucose-dependent insulinotropic peptide analogs
EP3630806B1 (en) Long-acting gip peptide analogues
KR102117216B1 (ko) 강력한 작용제 효과를 지닌 신규한 ｇｈ-ｒｈ 유사체
JPH06509588A (ja) 有機保護活性を備えたペプチド、その調製方法及び治療におけるその使用法
TW202140513A (zh) 人類運鐵蛋白受體結合肽
KR102093093B1 (ko) 피부 노화 개선용 조성물
WO2017034301A1 (ko) 상피세포 성장인자의 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도
KR102520348B1 (ko) 페길화 생활성 펩타이드 및 그의 용도
WO2023038497A1 (ko) 경피 약물전달 효능 및 지방 분해능이 향상된 펩타이드
JP2020127419A (ja) 新規なカリウムチャネルブロッカー及び自己免疫疾患の治療におけるそれらの使用
US8361964B2 (en) Growth hormone releasing factor (GRF) analogs and uses thereof
EP3288967B1 (en) Pharmaceutical compound
WO2024098718A1 (zh) 一种新型长效多肽化合物、组合物及其应用
KR102077984B1 (ko) 피부 주름 예방 및 개선용 조성물
WO2023111278A2 (en) Peptides triple agonists of gip, glp-1 and glp-2
JP2004509065A (ja) α−ＭＳＨおよびその誘導体を用いる遺伝子治療システムおよび方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22867765

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1