WO2023033337A1 - 스페로이드 또는 오가노이드 미세 유체 칩 및 이를 이용한 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 형성 방법 - Google Patents

스페로이드 또는 오가노이드 미세 유체 칩 및 이를 이용한 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 형성 방법 Download PDF

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culture
forming
microfluidic chip
supply unit
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전누리
김영택
이승렬
김수룡
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Seoul National University R&DB Foundation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic chip for 3-dimensionally simulating a spheroid or organoid in vitro model.
  • spheroids and organoids must first be formed in advance on another platform (U-shaped 96 well plate), and the formed spheroids and organoids are placed in a well plate using a pipette. After extracting and injecting it into the chip, considerable skill is required. In addition, reproducibility is not secured, and convenience and efficiency are low because there may be differences in experimental results depending on the individual ability of the experimenter.
  • One object of the present invention is to provide a microfluidic chip capable of producing a three-dimensional vascularized spheroid or organoid in vitro model on a single chip.
  • Another object of the present invention is to provide a microfluidic chip to which hanging drop and 3D bioprinting are applicable.
  • a microfluidic chip for three-dimensionally simulating a spheroid or organoid in vitro model includes a supply unit, a formation unit formed under the supply unit, and a lower portion of the formation unit. and may include a culture unit receiving culture cells or blood vessel composition materials from the supply unit, and the fluid supplied through the supply unit may be condensed and formed inside the formation unit to be maintained in a state of being spaced apart from the lower portion of the culture unit. there is.
  • the supply unit may be formed in a tapering shape that becomes narrower toward the bottom.
  • the supply unit may include a first supply unit for supplying the cells for culture and a second supply unit for supplying the material for forming blood vessels.
  • the first supply part is formed on the upper part of the second supply part so that the cells for culture are supplied along the side of the supply part, and the second supply part is formed on the upper part of the formation part to supply the material for forming blood vessels. This may be directly supplied to the forming section.
  • a step may be formed in the first supply unit.
  • the forming portion may include a tapering shape that becomes narrower toward the top.
  • one or more of the three-dimensional vascularized spheroids and organoids may be formed therein.
  • the microfluidic chip may further include a reservoir that is formed in contact with the upper portion of the culture unit and is partitioned from the supply unit and the formation unit, and capable of supplying the culture medium or test material to the culture unit.
  • the microfluidic chip may further include an injection part capable of supplying vascular endothelial cells to an edge of the culture part and a channel connecting the injection part and the culture part.
  • the microfluidic chip may further include a base part formed below the culture part.
  • the method for forming a spheroid or organoid in vitro model using a microfluidic chip includes the steps of supplying cells for culture to the supply unit of the microfluidic chip, and supplying the supplied cells for culture to the supply unit and the forming unit. It may include forming spheroids or organoids by condensing and forming spheroids or organoids, supplying a material for forming blood vessels to the supply unit, and forming three-dimensional vascularized spheroids or organoids to the culture unit.
  • the step of supplying a culture solution, a test substance, or vascular endothelial cells to the culture unit may be further included.
  • the microfluidic chip according to the present invention is equipped with an inlet that meets the pipette tip specifications, and enables the formation of spheroids or organoids by various 3D bioprinting and hanging drop methods. Through this, the existing process of forming spheroids or organoids externally and transferring them to a microfluidic chip through co-culture with blood vessels can be integrated and conveniently and quickly performed on one chip.
  • a vascularized spheroid or organoid model may be obtained by co-cultivating a material for forming blood vessels with the formed spheroid or organoid. This is an in vitro model with higher in vivo similarity than existing models, and can be used as a model for drug development.
  • microfluidic chip of the present invention can be manufactured through a 3D printer and injection molding, high efficiency can be secured.
  • FIG. 1A is a plan view of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1B is a perspective view of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • 2A is a view showing a well, which is a culture unit of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken along line A-A' of FIG. 2A.
  • FIG. 3A is a cross-sectional view taken along line A-A' of FIG. 2A.
  • 3B is a view showing an interface between a supply unit and a formation unit of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • 3C is a view showing a surface where a forming unit and a culturing unit of a microfluidic chip are in contact according to an embodiment of the present invention.
  • 4A is a plan view of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • 4B is a bottom view of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4C is a cross-sectional view taken along A-A' of FIG. 2A.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a process of forming a three-dimensional vascularized spheroid or organoid in vitro model as an example of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • 6A is a diagram for explaining optimal conditions for performing hanging drop and 3D bioprinting according to an embodiment of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • 6C is a diagram for explaining optimal conditions for performing hanging drop and 3D bioprinting according to an embodiment of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7A is a diagram illustrating 3D modeling when hanging drop and 3D bioprinting according to an embodiment of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention succeed (pinning) or fail (bulging).
  • FIG. 7B is a view showing a picture taken with a fluorescence microscope when hanging drop and 3D bioprinting according to an embodiment of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention are successful.
  • FIG. 8 is a diagram showing the correlation between spheroid diameter and cell number according to an example of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing the change over time or the number of cells of spheroids or organoids according to an example of a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing photographs of patterning spheroids or organoids using normal cell lines (HCT116, U87MG, HEPG2, SW620) and cancer patient cells (Patient #1, Patient #2).
  • FIG. 11 is a diagram showing a fluorescence micrograph of a three-dimensional vascularized spheroid or organoid in vitro model manufactured according to an example of a microfluidic chip according to one embodiment of the present invention.
  • step of (doing) or “step of” as used throughout the present specification does not mean “step for”.
  • spheroid' used throughout the present specification refers to a cell mass formed by cell-to-cell junctions by external forces without natural self-assembly or the presence of a scaffold.
  • spheroids maintain the composition of the natural ECM by secreting ECM on their own without the need to separately add a substance that serves as an ECM (extracellular matrix) from the outside.
  • Spheroids have been used to reproduce the basic properties of brain tissue, such as the diversity of cellular composition, electrophysiological properties, ECM secretion and physical properties. Dingle made spheroids from newborn rat cerebral cortical cells at four different densities (1K, 2K, 4K, and 8K cells/spheroid). After 14 days, they reached a stable size and were assembled similarly to the biological density (2 ⁇ 4 x 105 cells/mm3). Immunohistochemical analysis confirmed the presence of not only neurons but also several glial cells, including astrocytes, oligodendrocytes and even microglia.
  • Organoids using PSCs and adult stem cells can represent some of the basic functions of human tissue.
  • ASCs adult stem cells
  • organoids produce more stable 3D cell structures that can be maintained for longer periods of time than spheroids.
  • organoids are more suitable than other methods for preserving the intrinsic capabilities of various types of cells and reproducing detailed parts of the developmental process.
  • many achievements have been made in discovering the basic structure and physiological characteristics of real tissues. Nevertheless, models made through such self-assembly have some limitations.
  • they vary greatly in size and shape.
  • Matrigel can play the role of a niche (microenvironment) in which PSCs are sensed and grown, Matrigel is mostly used to form neural organoids.
  • organoids involving the use of Matrigel cannot avoid the problem of batch to batch inconsistency, i.e., heterogeneity in the composition of Matrigel produced, which is why organoids It is difficult to use for high throughput screening.
  • organoid models are generally larger in size than spheroid models. Because of this, necrosis of cells due to lack of nutrients and oxygen in the center is inevitable. Therefore, it is necessary to form a capillary network within the organoid structure to promote gas and nutrient exchange (Pei et al., 2017).
  • 'hanging drop' used throughout the present specification refers to, for example, 10 to 50 ⁇ l of culture solution suspended and fixed on the lid of a culture vessel, and cells gathered at the lower part of the droplet due to gravity. It means a model for 3-dimensional cell culture in the form of a lump (spheroid).
  • the inkjet method has advantages of high printing speed and low cost, but there is a risk of cell damage due to thermal stress.
  • the microextrusion method is the most widely used because it has the advantage of being able to manufacture various shapes by stacking cells at a high density, but it is necessary to further improve the printing precision and speed.
  • the stereolithography method has the advantage that there is no clogging of cells in the nozzle and precise printing is possible, but it is necessary to improve the slow output speed and improve the compatibility between the material and the cells for stereolithography (Kim Dong-rip, Jeon Yale. 2018).
  • 'cells for culture' used throughout the present specification refers to cells intended to create a 3D vascularized spheroid or organoid in vitro model using the microfluidic chip according to the present invention, and its types include vascular endothelial cells, fibroblasts, etc. Including, but not limited to.
  • the term 'material for forming blood vessels' used throughout the present specification is a material that is injected to form spheroids or organoids by methods such as hanging drop or 3D bioprinting in the forming unit and then 3-dimensionally vascularize them. It includes, but is not limited to, extracellular matrix, fibroblasts, vascular cells, culture media, and the like.
  • 'constant fluid' used throughout the present specification is a material for moving cells for culture or materials for vascular composition, and may include all types of cell culture media commonly used, but is not limited thereto.
  • the microfluidic chip 1000 for three-dimensionally simulating a spheroid or organoid in vitro model according to the present invention is formed in a supply unit 200 and a lower portion of the supply unit 200. It may include a formation unit 320 and a culture unit 340 formed below the formation unit 320 and receiving a supply of cells for culture or materials for forming blood vessels from the supply unit 200 .
  • a formation unit 320 and a culture unit 340 formed below the formation unit 320 and receiving a supply of cells for culture or materials for forming blood vessels from the supply unit 200 .
  • the microfluidic chip 1000 may include a plurality of wells 100 that are one or more culture units.
  • the well 100 may include a supply unit 200 into which a supply member (hereinafter, a supply member) such as a pipette or a syringe may be inserted.
  • a supply member such as a pipette or a syringe
  • the supply unit 200 may be formed in a tapering shape that becomes narrower toward the bottom.
  • the supply unit 200 includes a first supply unit 210 for supplying cells for culture and certain fluids (hereinafter, cells for culture) and a second supply unit for supplying materials for forming blood vessels and certain fluids (hereinafter, materials for forming blood vessels). 220, and a step 230 may be formed in the first supply unit 210.
  • the supply unit 200 may be formed in a tapering shape that becomes narrower toward the bottom so that cells for culture supplied to the first supply unit 210 through the supply member flow along the side of the supply unit 200 . Specifically, when cells for culture are supplied by bringing the tip of the supply member in contact with the side surface of the first supply unit 210, an effect of minimizing the inflow of air into the cells for culture can be obtained.
  • a step 230 may be formed in the first supply unit 210 for convenience of supply to the first supply unit 210 .
  • the step 230 may be formed as a flat surface, and more specifically, may be formed to have the same or similar length as the outer diameter of the supply member. Through this, the tip of the supply member can be mounted on the step 230, making supply convenient, and since the length of the step 230 corresponds to the length of the outer diameter of the supply member, the gap between the supply member and the first supply unit 210 is reduced. The effect of reducing air inflow can be obtained.
  • the second supply unit 220 is formed below the first supply unit 210 and above the forming unit 320 so that the material for forming blood vessels can be directly supplied to the forming unit 320. This will be described together with the formation part 320 .
  • a forming unit 320 may be formed under the supplying unit 200 , and the forming unit 320 may include an interface 322 in contact with the supplying unit 200 .
  • the lower portion of the forming unit 320 may be formed in a cylindrical shape from a surface in contact with the culturing unit 340 to a certain height, and then in a tapering shape that becomes narrower toward the upper portion.
  • the interface 322 and the surface where the forming unit and the culturing unit come into contact may be formed in a circular shape.
  • a tip of the supply member inserted into the second supply unit 220 may come into contact with the interface 322 .
  • the shape and size of the interface 322 is formed to correspond to the shape and size of the tip of the supply member, so that no gap is created when the supply member comes into contact with the interface 322 .
  • the cells for forming blood vessels in the second supply unit 220 may be supplied after placing the tip of the supply member so as to come into contact with the interface 322 . Through this, the cells for forming blood vessels can pass through the formation unit 320 and move directly to the culture unit 340 under the formation unit 320 without being affected by surface tension. In this process, the spheroids or organoids formed in the forming unit 320 may move to the culturing unit 340 together with the supplied cells for forming blood vessels.
  • a culturing unit 340 may be formed under the forming unit 320 .
  • any one or more of the above spheroids and organoids and supplied cells for forming blood vessels may be located to form one or more of three-dimensional vascularized spheroids and organoids.
  • one or more of the three-dimensional vascularized spheroids and organoids are formed in the culture unit 340, and may be formed larger than the formation unit 320 for subsequent experiments.
  • the well 100 is formed in contact with the top of the culture unit 340 in addition to the supply unit 200 and is partitioned from the supply unit 200 and the formation unit 320, and a culture medium or test material is supplied to the culture unit 340.
  • a reservoir 420 capable of supplying may be included. Specifically, a barrier rib exists between the reservoir 420, the forming unit 320, and the supply unit 200, and a lower portion of the reservoir 420 may be formed to be connected to an upper portion of the culturing unit 340.
  • a culture medium or test substance may be supplied to the reservoir 420 when an experiment is performed using the microfluidic chip 1000 on which one or more of 3D vascularized spheroids and organoids are formed.
  • the well 100 may include an injection unit 440 and a channel 460 connecting the injection unit 440 and the culture unit 340 .
  • the injection unit 440 may supply vascular endothelial cells to be located at the edge of the culture unit 340 .
  • the supplied vascular endothelial cells may move to the culture unit 340 along the channel 460 .
  • the injection unit 440 is not connected to the supply unit 200, the forming unit 320, or the reservoir 420, and is connected to the culturing unit 340 only through the channel 460.
  • the channel 460 may be formed in an 'L' shape inside the microfluidic chip.
  • the vascular endothelial cells supplied to the injection unit 440 move to the culture unit 340 through the channel 460 and are located at the edge of one or more of the 3D vascularized spheroids and organoids formed in the culture unit 340. can do. Thereafter, the vascular endothelial cells form a vascular endothelial tissue and serve as a passage through which materials can be smoothly exchanged in and out of any one or more of the three-dimensional vascularized spheroids and organoids, or the cells can move within the culture unit 340. can be performed.
  • a base part 480 may be further provided under the culture part 340 .
  • the microfluidic chip 1000 of the present invention may be manufactured or sold without the base part 480, but it is preferable to additionally include the base part 480 when in use.
  • Materials that can be used for the base portion 480 include, but are not limited to, polycarbonate film (PC flim) or glass.
  • Example 1 Formation of a three-dimensional vascularized spheroid or organoid in vitro model
  • Step 1 Hanging drop and 3D bioprinting (Day 0)
  • a pipette is inserted into the first supply unit 210 to supply cells for culture to the side of the first supply unit 210 . It is more convenient to use the step 230 formed in the first supply unit 210.
  • the supplied cells for culture flow along the side of the supply unit 200 and are condensed in the formation unit 320 to form.
  • the ligated cells are used to form one or more of spheroids and organoids using hanging drops and 3D bioprinting.
  • a pipette is inserted into the second supply unit 220 to supply the material for blood vessel formation to the second supply unit 220 .
  • the tip of the pipette is brought into contact with the interface 322 of the forming unit 320 without gaps. Accordingly, the material for forming blood vessels does not form inside the forming unit, and passes through the forming unit 320 and moves to the bottom surface of the culturing unit 340 .
  • any one or more of the spheroids and organoids already formed in the forming unit 320 moves to the culturing unit 340 together with the supplied material for forming blood vessels.
  • vascular endothelial cells may be supplied to the edge of the model through the injection unit 440 and the channel 460 so that material exchange between the culture medium and the model is smoothly performed.
  • culture medium and test materials may be supplied through the reservoir 420 .
  • Example 2 Optimal conditions for hanging drop and 3D bioprinting
  • the volume of the fluid material accommodated in the supply unit 200 and the forming unit 320 is V ( ⁇ l), the diameter of the interface at the bottom of the forming unit 320 is D (mm), and the culture unit 340 from the interface )
  • the distance between the bottom surfaces is H (mm), and the angle between the boundary surface of the upper portion of the forming part 320 and the tapering shape is ⁇ .
  • the condition between the height H of the lower portion of the forming portion 320 and the diameter of the interface between the upper and lower portions of the forming portion is as follows. (see Fig. 6c).
  • D is preferably at least 1 mm or more.
  • FIG. 8 is a diagram showing the correlation between the diameter ( ⁇ m) of a spheroid and the number of cells.
  • microfluidic chip 1000 of the present invention Using an embodiment of the microfluidic chip 1000 of the present invention, a spheroid or organoid in vitro model of a normal cell line or cancer patient cell was constructed.
  • FIG. 9 is a diagram showing the process of manufacturing an in vitro model. Referring to this diagram, it can be seen that (1) as the number of cells inside the model increases (top), and (2) as culture progresses (bottom), cell aggregation is better. there is.
  • FIG. 10 is a photograph of patterning spheroids or organoids using normal cell lines (HCT116, U87MG, HEPG2, SW620) and cancer patient cells (Patient #1, Patient #2). Specifically, a total of 20,000 cells, 10,000 each of cancer cells and fibroblasts, were diluted in 12ul of the culture medium, and then injected into the microfluidic chip 1000 to proceed with patterning.
  • FIG. 11 shows a fluorescence micrograph of a 3-dimensional vascularized spheroid or organoid prepared using the microfluidic chip 1000 according to the present invention.

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Abstract

본원 발명의 일 목적을 달성하기 위하여 본원 발명에 따른 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 3차원으로 모사하기 위한 미세 유체 칩은, 공급부, 상기 공급부의 하부에 형성되는 형성부, 상기 형성부의 하부에 형성되며, 상기 공급부로부터 배양용 세포 또는 혈관 조성용 물질을 공급받는 배양부를 포함할 수 있으며, 상기 공급부를 통해 공급된 유체가 상기 형성부 내부에 응축되어 맺혀 상기 배양부의 하부로부터 이격된 상태로 유지될 수 있다.

Description

스페로이드 또는 오가노이드 미세 유체 칩 및 이를 이용한 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 형성 방법
본 발명은 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 3차원으로 모사하기 위한 미세 유체 칩에 관한 것이다.
인간의 질병 치료를 위해 수많은 약물이 개발되고 평가되고 있으며, 약물 개발을 위한 체외 인간 조직 및 장기 모사 모델 연구가 진행되고 있다. 모델 중 세포들을 모아서 3차원으로 형성하는 스페로이드(Spheroid) 및 오가노이드(Organoid)가 있는데, 이는 2차원으로 배양된 세포보다 복잡하고 다채로운 미세환경을 제공할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 일반적인 스페로이드 및 오가노이드는 관류 가능한 3차원 혈관이 부재하여 산소 및 영양분 공급이 원활하게 되지 않고, 모델 내 체내 환경을 조성하기 어렵다는 문제점을 지니고 있다.
이러한 한계점을 극복하고자 미세 유체 칩 내에서 스페로이드 및 오가노이드와 혈관 네트워크를 공배양한 모델들이 개발 되었다. 그러나 선행 공배양 모델들의 경우 공통적으로 칩 내 스페로이드 및 오가노이드를 주입하는 과정이 상당히 복잡하고 어렵다는 단점이 존재한다.
구체적으로, 선행 공배양 모델들은 먼저 다른 플랫폼(U-shaped 96 well plate)에서 스페로이드 및 오가노이드를 미리 형성하여야 하며, 형성된 스페로이드 및 오가노이드를 웰 플레이트(well plate) 내에서 파이펫을 사용하여 추출한 후 칩 내에 주입하는 과정에서 상당한 숙련도를 필요로 한다. 또 실험자의 개별 능력에 따라 실험 결과에 차이가 생길 수 있어 재현성이 확보되지 않으며 편리성과 효율성이 낮은 실정이다.
본원 발명의 일 목적은 하나의 칩에서 3차원 혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 제작할 수 있는 미세 유체 칩을 제공하기 위한 것이다.
본원 발명의 다른 일 목적은 행잉드랍(Hanging drop) 및 3D 바이오프린팅이 적용 가능한 미세 유체 칩을 제공하기 위한 것이다.
본원의 기술적 과제는 이에 제한되지 않으며 통상의 기술자가 이해할 수 있는 범위의 모든 과제를 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.
본원 발명의 일 목적을 달성하기 위하여 본원 발명에 따른 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 3차원으로 모사하기 위한 미세 유체 칩은, 공급부, 상기 공급부의 하부에 형성되는 형성부, 상기 형성부의 하부에 형성되며, 상기 공급부로부터 배양용 세포 또는 혈관 조성용 물질을 공급받는 배양부를 포함할 수 있으며, 상기 공급부를 통해 공급된 유체가 상기 형성부 내부에 응축되어 맺혀 상기 배양부의 하부로부터 이격된 상태로 유지될 수 있다.
일 실시예에서, 공급부는 하부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상으로 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 공급부는 상기 배양용 세포를 공급하기 위한 제1공급부와 상기 혈관 조성용 물질을 공급하기 위한 제2공급부를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 제1공급부는 상기 제2공급부의 상부에 형성되어 상기 배양용 세포가 공급부의 측면을 따라 공급되게 할 수 있으며, 상기 제2공급부는 상기 형성부 상부에 형성되어 상기 혈관 조성용 물질이 상기 형성부에 직접 공급되게 할 수 있다.
일 실시예에서, 제1공급부에는 단차가 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 형성부는 상부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 배양부는 내부에 3차원 혈관화된 스페로이드 및 오가노이드 중 하나 이상이 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 미세 유체 칩은 상기 배양부의 상부에 접하고 상기 공급부 및 상기 형성부와 구획되어 형성되며 상기 배양부에 배양액 또는 실험 물질을 공급할 수 있는 리저버를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 미세 유체 칩은 상기 배양부의 가장자리에 혈관 내피세포를 공급할 수 있는 주입부 및 상기 주입부와 상기 배양부를 연결하는 채널을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 미세 유체 칩은 상기 배양부의 하부에 형성된 베이스부를 추가로 포함할 수 있다.
본원 발명에 따른 미세 유체 칩을 이용하여 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 형성하는 방법은, 상기 미세 유체 칩의 공급부에 배양용 세포를 공급하는 단계, 상기 공급된 배양용 세포가 상기 공급부와 형성부 사이에 응축되어 맺혀 스페로이드 또는 오가노이드를 형성하는 단계, 상기 공급부에 혈관 조성용 물질을 공급하는 단계 및 배양부에 3차원 혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 배양부에 배양액, 실험 물질, 또는 혈관 내피 세포를 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본원 발명에 따른 미세 유체 칩은 파이펫 팁 규격에 맞는 주입구를 구비하여 다양한 3D 바이오프린팅 및 행잉드랍의 방법으로 스페로이드 또는 오가노이드 형성을 가능하게 한다. 이를 통해 기존에 외부에서 스페로이드 또는 오가노이드를 형성하고 혈관과의 공배양을 통해 미세 유체 칩으로 옮기는 과정이 통합되어 하나의 칩에서 간편하고 신속하게 수행될 수 있다.
형성된 스페로이드 또는 오가노이드와 함께 혈관 조성용 물질이 공배양되어 혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드 모델을 확보할 수 있다. 이는 기존 모델에 비해 높은 체내 유사성을 확보한 체외 모델로서, 약물 개발을 위한 모델로 활용 가능하다.
또한 3D프린터 및 사출 성형을 통해 본 발명의 미세 유체 칩을 제작할 수 있어 높은 효율성을 확보할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 평면도를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 사시도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 배양 단위인 웰을 나타낸 도면이다.
도 2b는 도 2a의 A-A'에 따른 단면도를 나타낸 도면이다.
도 3a는 도 2a의 A-A'에 따른 단면도를 나타낸 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 공급부와 형성부 사이 계면을 나타낸 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 형성부와 배양부가 접하는 면을 나타낸 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 평면도를 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 저면도를 나타낸 도면이다.
도 4c는 도 2a의 A-A'에 따른 단면도를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예로서 3차원 혈관화 된 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 형성하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅이 이루어지기 위한 최적 조건을 설명하기 위한 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅이 이루어지기 위한 최적 조건을 설명하기 위한 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅이 이루어지기 위한 최적 조건을 설명하기 위한 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅이 성공(pinning) 또는 실패(bulging)했을 때의 3차원 모델링을 나타낸 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅이 성공했을 때의 모습을 형광현미경으로 촬영한 사진을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 스페로이드 지름과 세포수의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 의한 스페로이드 또는 오가노이드의 세포수 또는 시간에 따른 변화를 나타낸 도면이다.
도 10은 일반 세포주(HCT116, U87MG, HEPG2, SW620)와 암환자 세포(환자#1, 환자#2)를 이용하여 스페로이드 또는 오가노이드를 패터닝한 사진을 나타낸 도면이다
도 11은 본 발명의 일 구현에에 따른 미세 유체 칩의 일 실시예에 따라 제작한, 3차원 혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델의 형광 현미경 사진을 나타낸 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용하는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용하는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는 "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '스페로이드(spheroid)'는 자연적인 자가 조립이나 스캐폴드의 존재 없이 외부 힘에 의한 세포 간 접합으로 형성된 세포 덩어리를 말한다. 일반적으로 스페로이드는 외부에서 ECM(세포외기질, extracellular matrix)의 역할을 하는 물질을 따로 넣어줄 필요 없이 스스로 ECM을 분비하여 자연적인 ECM의 조성을 유지한다.
스페로이드는 뇌 조직의 세포 구성의 다양성, 전기 생리학적 특성, ECM 분비 및 물성과 같은 기초적인 특성을 재현하기 위해 이용되어왔다. Dingle은 신생 랫트의 대뇌 피질 세포를 네 개의 다른 밀도(1K, 2K, 4K, 8K cells/spheroid)로 스페로이드를 만들었다. 14 일 후에 안정한 크기에 도달하여 생체 밀도와 유사하게 조립되었다(2 ~ 4 x 105 cells/mm3). 면역 조직 화학 분석 결과 뉴런뿐만 아니라 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 심지어 소교세포까지 포함하는 여러 개의 신경교세포가 그 안에 존재함이 확인되었다. 패치 클램프 실험으로 스페로이드 내의 뉴런이 전기적으로 활성을 드러내고, 연접후(postsynaptic) 전류(PSCs)의 발생을 검출해 시냅스 네트워크가 형성되었음을 보여주었다. 또한, 라미닌을 분비하고 신생 쥐 피질과 유사한 탄성 계수를 나타내었다 (Pei et al., 2017).
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '오가노이드(organoid)'는 실제 장기의 세포 구성, 구조 및 기능을 닮은 큰 세포 집합체이다. PSCs와 성체줄기세포(ASCs)를 이용하여 오가노이드는 인간 조직의 기초적인 기능 중 일부를 나타낼 수 있다. 여러 가지 면에서 유기체는 진보된 스페로이드라고 할 수 있다. 왜냐하면 오가노이드에서 줄기 세포는 공간적으로 구분된 분화와 세포 정렬을 스스로 구성함에 반해 스페로이드 모델에서는 줄기세포 또는 선구 세포(progenitor cell)가 부족하여 자가 재생 및 분화가 미진하게 일어나기 때문이다. 결과적으로 오가노이드는 스페로이드보다 더 오랜 기간 동안 유지될 수 있는 보다 안정한 3D 세포 구조체를 만들어낸다.
일반적으로 오가노이드는 다양한 종류의 세포들의 내재적인 능력을 보존하고 발달과정에서의 세부적인 부분들을 재현하는 데에 다른 방법들보다 더 적합하다. 특히 실제 조직의 기본적인 구조와 생리학적 특징을 발견하는데 많은 성과가 있었다. 그럼에도 불구하고 이러한 자체 조립을 통해 만들어지는 모델에는 몇 가지 한계가 있다. 첫째, 크기와 모양이 매우 다양하다. 또한, PSCs가 감지되어 자라는 니치(niche, 미세주변환경)의 역할을 마트리겔(Matrigel)이 할 수 있다는 것이 밝혀지면서 신경 오가노이드를 형성할 때는 대부분 마트리겔이 이용되는데, 마트리겔의 조성이 완전히 분석되지 않았기 때문에, 마트리겔의 사용을 포함하는 많은 오가노이드들은 배치-투-배치 불일치(batch to batch inconsistency), 즉 생산된 마트리겔 조성의 불균질로 인한 문제를 피할 수 없으며, 이 때문에 오가노이드를 고효율 스크리닝(high throughput screening)에 이용하기 힘들다. 또한 일반적으로 오가노이드 모델은 스페로이드 모델보다 사이즈가 크다. 이 때문에 중심부에서 양분과 산소의 결핍으로 인한 세포의 괴사는 불가피하다. 따라서 기체 및 영양소 교환을 촉진하기 위해서는 모세 혈관 네트워크를 오가노이드 구조 안에 형성해야 할 필요가 있다 (Pei et al., 2017).
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '행잉드랍(hanging drop)'은, 예를들어 10~50ul의 배양액을 배양 용기의 뚜껑에 배양 용기의 뚜껑에 매달아 고정하고, 중력으로 인해 물방울의 아래 부분에 모인 세포를 하나의 덩어리 형태(스페로이드)로 3차원 세포배양하는 모델을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '3D 바이오프린팅(3D bio printing)'은 3D 프린팅 기술과 생명공학이 융합된 개념을 의미한다. 이를 이용하여 살아있는 세포를 원하는 형상으로 쌓아 올려 조직, 장기를 제작할 수 있다. 기본적인 출력 방식은 일반 3D 프린팅과 동일하나, 3D 바이오프린팅은 살아있는 세포를 출력하기 위해 생체적합성을 갖는 고분자, 생체 재료 등을 기본 소재로 사용한다는 차이점이 있다. 3D 바이오프린팅 기법으로는 작은 크기의 방울로 재료를 분사하여 출력하는 잉크젯(Inkjet) 방식, 일정 점도 이상의 재료를 공압이나 피스톤으로 밀어내는 미세 압출(Micro-extrusion) 방식, 그리고 광 경화성 수지 표면에 광원을 조사하는 광 조형 방식이 있다. 잉크젯 방식은 출력 속도가 빠르고, 적은 비용이 장점이 될 수 있겠지만, 열응력에 의한 세포가 손상될 위험이 있다. 미세 압출 방식은 세포를 고밀도로 적층할 수 있어 다양한 형상 제작이 가능하다는 장점이 있어 가장 널리 사용되고 있지만, 프린팅 정밀도와 속도를 보다 향상시키는 것이 필요하다. 광 조형 방식은 노즐에서의 세포 막힘 현상이 없을 뿐만 아니라 정교한 프린팅이 가능하다는 장점을 가지고 있지만, 느린 출력 속도를 개선하고, 광 조형을 위한 소재와 세포간의 적합성을 향상시키는 것이 필요하다(김동립, 전예일. 2018).
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '배양용 세포'는 본원 발명에 따른 미세 유체 칩을 이용하여 3D혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 만들고자 하는 세포로, 그 종류는 혈관내피세로, 섬유아세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '혈관 조성용 물질'은 형성부에서 행잉드롭 또는 3D 바이오프린팅 등의 방법으로 스페로이드 또는 오가노이드를 형성한 후 이를 3차원 혈관화하기 위해 주입하는 물질로, 그 종류는 세포외기질, 섬유아세포, 혈관세포, 배양액 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 '일정 유체'는 배양용 세포 또는 혈관 조성용 물질을 이동시키기 위한 물질로, 일반적으로 사용되는 모든 종류의 세포 배양액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
구현예. 본원 발명에 따른 미세 유체 칩(1000) 예시
도 1a 내지 도 3c를 참조하면, 본원 발명에 따른 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 3차원으로 모사하기 위한 미세 유체 칩(1000)은, 공급부(200), 상기 공급부(200)의 하부에 형성되는 형성부(320), 상기 형성부(320)의 하부에 형성되며, 상기 공급부(200)로부터 배양용 세포 또는 혈관 조성용 물질을 공급받는 배양부(340)를 포함할 수 있다. 이하, 각 도면을 참조하여 본원 발명의 일 구현예에 따른 미세 유체 칩(1000)의 구조를 설명한다.
도 1a의 평면도를 참조하면 본원 발명에 따른 미세 유체 칩(1000)은 하나 이상의 배양단위인 웰(100)을 복수 개 포함할 수 있다.
도 2a를 참조하면, 웰(100)은 파이펫, 주사기 등의 공급부재(이하, 공급부재)가 삽입될 수 있는 공급부(200)를 포함할 수 있다. 도 2b를 참조하면 공급부(200)는 하부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상으로 형성될 수 있다. 또한 공급부(200)는 배양용 세포 및 일정 유체(이하, 배양용 세포)를 공급하기 위한 제1공급부(210)와 혈관 조성용 물질 및 일정 유체(이하, 혈관 조성용 물질)를 공급하기 위한 제2공급부(220)를 포함할 수 있으며, 제1공급부(210)에는 단차(230)가 형성될 수 있다.
공급부(200)는 하부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상으로 형성되어 공급부재를 통해 제1공급부(210)로 공급된 배양용 세포가 공급부(200)의 측면을 따라 흐르도록 할 수 있다. 구체적으로, 공급부재의 팁을 제1공급부(210)의 측면에 접하여 배양용 세포를 공급할 경우, 배양용 세포 내 공기의 유입을 최소화하는 효과를 얻을 수 있다.
또한 제1공급부(210)에 대한 공급의 편의를 위해 제1공급부(210)에 단차(230)가 형성될 수 있다. 단차(230)는 평탄한 면으로 형성될 수 있으며, 더 구체적으로 공급부재의 외경 길이와 동일 또는 유사한 길이로 형성될 수 있다. 이를 통해 공급부재의 팁을 단차(230)에 거치할 수 있어 공급이 편리해지며, 단차(230)의 길이가 공급부재의 외경길이와 대응되므로 공급부재와 제1공급부(210) 사이 빈틈이 적어져 공기 유입을 줄이는 효과를 얻을 수 있다.
도 2b와 도 3a를 참조하면 제2공급부(220)는 제1공급부(210)의 하부, 형성부(320)의 상부에 형성되어 혈관 조성용 물질이 형성부(320)에 직접 공급되게 할 수 있으며 이는 형성부(320)와 함께 설명하도록 한다.
도 3a 내지 도 3c를 참조하면 공급부(200)의 하부에 형성부(320)가 형성될 수 있으며, 형성부(320)는 공급부(200)와 접하는 계면(322)을 포함할 수 있다. 형성부(320)의 하부는 배양부(340)와 접하는 면으로부터 일정 높이까지 원통 형상, 그 이후로 상부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상으로 형성될 수 있다. 계면(322) 및 형성부와 배양부가 접하는 면은 원형으로 형성될 수 있다.
형성부(320)가 상술한 형상을 취함에 따라, 제1공급부(210)에 공급되어 공급부(200)의 측면을 따라 형성부(320)로 흘러 들어온 배양용 세포는 형성부의 상부와 하부에 걸쳐 맺힐 수 있게 된다. 더욱 구체적으로, 제1공급부(210) 및 형성부(320)는 계면(322)을 기준으로 모래시계 모양으로 형성될 수 있으며, 이러한 모양을 통해 배양용 세포는 표면장력에 의해 형성부의 상부와 하부에 응축되어 맺혀 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상이 형성될 수 있게 된다. 상기 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상의 형성과정은 행잉드랍 또는 3D 바이오프린팅 방법을 통해 진행될 수 있으나, 상기 방법에 한정되는 것은 아니다.
계면(322)에는 제2공급부(220)에 삽입된 공급부재의 팁이 맞닿을 수 있다. 더욱 바람직하게, 계면(322)의 모양 및 크기는 공급부재의 팁의 모양 및 크기와 대응되도록 형성되어 공급부재가 계면(322)에 맞닿았을 때 틈이 생기지 않을 수 있다. 배양용 세포를 공급부(200)의 측면에 공급하는 것과는 달리, 제2공급부(220)에서 혈관 조성용 세포는 공급부재의 팁을 계면(322)과 맞닿도록 위치시킨 후 공급될 수 있다. 이를 통해 혈관 조성용 세포는 표면장력의 영향 없이 곧바로 형성부(320)를 지나 형성부(320) 하부의 배양부(340)로 이동할 수 있다. 이 과정에서 형성부(320)에서 형성된 스페로이드 또는 오가노이드는 공급된 혈관 조성용 세포와 함께 배양부(340)로 이동할 수 있다.
도 3a를 참조하면 형성부(320)의 하부에 배양부(340)가 형성될 수 있다. 배양부(340)에는 상기한 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상과 공급된 혈관 조성용 세포가 위치하여 3차원 혈관화된 스페로이드 및 오가노이드 중 하나 이상이 형성될 수 있다. 또한 배양부(340)에는 3차원 혈관화 된 스페로이드 및 오가노이드 중 하나 이상이 형성되고, 그 이후의 실험을 위하여 형성부(320)보다 크게 형성될 수 있다.
도 4a를 참조하면 웰(100)은 공급부(200) 외에도 배양부(340)의 상부에 접하고 공급부(200) 및 형성부(320)와 구획되어 형성되며 배양부(340)에 배양액 또는 실험 물질을 공급할 수 있는 리저버(420)를 포함할 수 있다. 구체적으로 리저버(420)와 형성부(320) 및 공급부(200) 사이에는 격벽이 존재하며, 리저버(420)의 하부 일부는 배양부(340)의 상부 일부와 이어지도록 형성될 수 있다. 리저버(420)에는 3차원 혈관화된 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상이 형성된 미세 유체 칩(1000)을 이용하여 실험을 진행할 때 배양액 또는 실험 물질이 공급될 수 있다.
도 4a 및 4b를 참조하면 웰(100)은 주입부(440) 및 주입부(440)-배양부(340)를 연결하는 채널(460)을 포함할 수 있다. 주입부(440)는 배양부(340)의 가장자리에 위치할 혈관 내피세포를 공급할 수 있다. 공급된 혈관 내피세포는 채널(460)을 따라 배양부(340)로 이동할 수 있다. 구체적으로, 주입부(440)는 공급부(200), 형성부(320), 또는 리저버(420)와 연걸되지 않으며, 오직 채널(460)을 통해 배양부(340)와 연결된다. 이에 따라 채널(460)은 미세 유체 칩 내부에서 'L' 모양으로 형성될 수 있다.
주입부(440)에 공급된 혈관 내피 세포는 채널(460)을 통해 배양부(340)로 이동하여 배양부(340)에 형성된 3차원 혈관화된 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상의 가장자리에 위치할 수 있다. 이후 혈관 내피 세포는 혈관 내피 조직을 형성하며 3차원 혈관화된 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상의 내외로 물질 교환이 원활하게 이루어지도록 하거나, 배양부(340) 내에서 세포가 이동할 수 있는 통로 역할을 수행할 수 있다.
도 4c를 참조하면 배양부(340)의 하부에 베이스부(480)를 추가로 구비할 수 있다. 본원 발명의 미세 유체 칩(1000)은 베이스부(480)가 없는 상태로 제작 또는 판매될 수 있으나, 사용 시에는 베이스부(480)를 추가로 구비함이 바람직하다. 베이스부(480)로 사용할 수 있는 재료는 폴리카보네이트 필름(Polycarbonate film; PC flim) 또는 유리(Glass)가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 3차원 혈관화 된 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 형성
도 5를 참조하여 실시예 1에 따른 체외 모델 형성과정을 설명한다.
아래는 체외 모델을 형성하는 하나의 과정에 불과하며, 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시했을 뿐 본 발명이 아래 실시예로 제한되어 해석된다는 것을 의미하지는 않는다.
Step 1. 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅(Day 0)
파이펫을 제1공급부(210)에 삽입해 배양용 세포를 제1공급부(210)의 측면에 공급한다. 제1공급부(210)에 형성된 단차(230)를 이용하면 더 편리하다. 공급된 배양용 세포는 공급부(200)의 측면을 따라 흘러 형성부(320) 내부에 응축되어 맺힌다. 맺힌 세포는 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅을 활용하여 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상을 형성하도록 한다.
Step 2. 혈관 패터닝(Day 1)
파이펫을 제2공급부(220)에 삽입해 혈관 조성용 물질을 제2공급부(220)에 공급한다. 이때 파이펫의 팁을 형성부(320)의 계면(322)에 빈틈없이 맞닿게 한다. 이에 따라 혈관 조성용 물질은 형성부 내부에 맺히지 않으며, 형성부(320)을 지나 배양부(340)의 바닥면으로 이동하게 된다. 이와 동시에 이미 형성부(320)에 형성된 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상은 공급된 혈관 조성용 물질과 함께 배양부(340)로 이동한다.
Step 3. 3차원 혈관화(Day 7~)
배양부(340)에 3차원 혈관화 된 스페로이드 및 오가노이드 중 어느 하나 이상의 체외 모델이 형성된다. 추가적으로, 주입부(440) 및 채널(460)을 통해 모델 가장자리에 혈관 내피 세포를 공급하여 배양액과 모델 간의 물질 교환이 원활히 이루어질수록 있도록 할 수 있다. 모델이 완성된 후에는 리저버(420)를 통해 배양액과 실험 물질을 공급할 수 있다.
실시예 2. 행잉드랍 및 3D바이오프린팅 최적조건
본 발명의 일 실시예로서 행잉드랍의 최적조건을 설명한다.
도 6a를 참조하면, 공급부(200) 및 형성부(320)에 수용된 유체 물질의 체적을 V(μl), 형성부(320) 하부의 경계면의 지름을 D(mm), 경계면으로부터 배양부(340) 바닥면 사이의 거리를 H(mm), 형성부(320) 상부의 경계면과 테이퍼링 형상 사이의 각도를 α라고 한다.
이때, 세포가 형성부(320)의 계면(322)에 효과적으로 맺히기 위한 체적과 경계면 지름간의 조건은 도 6b와 같다. (아래에서부터 α = 30°, 45°, 60°, 64°, 75°, 90°)
도 6b를 참조하면, 각 α값에 대해 직선으로 표현된 일차 함수 이하의 영역에서 하기의 수학식 조건을 만족할 때 안정적으로 배양용 세포의 행잉드랍 및 3D 바이오프린팅이 가능한 것을 확인할 수 있었으며(pinning; 도 7a 및7b 참조), 그 외의 경우 배양용 세포 방울이 터지는 현상(bulging; 도 7a 참조)이 일어날 수 있다.
또한, 상기한 구현예에 대해, 형성부(320) 하부의 높이(H)와 형성부의 상부와 하부의 경계면 지름간의 조건은 다음과 같다. (도 6c 참조).
[수학식] H > = 0.35D (α값과 무관함)
별개로, D가 1mm 미만일 때 스페로이드 또는 오가노이드가 제대로 형성되지 않음을 확인한 바, D는 최소 1mm이상인 것이 바람직하다.
또한, 도 8은 스페로이드의 지름(μm)과 세포 수 간의 상관관계를 나타낸 도면이다.
실시예 3. 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 제작
본원 발명의 미세 유체 칩(1000)의 일 구현예를 사용하여 일반 세포주 또는 암환자 세포의 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 제작하였다.
도 9는 체외 모델을 제작하는 과정을 나타낸 도면으로, 이를 참조하면 (1) 모델 내부에 세포 수가 많을수록(위), (2) 배양이 진행될수록(아래) 세포간의 응집이 잘 이루어진다는 것을 알 수 있다.
도 10은 일반 세포주(HCT116, U87MG, HEPG2, SW620)와 암환자 세포(환자#1, 환자#2)를 이용하여 스페로이드 또는 오가노이드를 패터닝한 사진이다. 구체적으로 암세포와 섬유아세포를 각각 10,000개씩 총합 20,000개의 세포를 12ul의 배양액에 희석한 후 미세 유체 칩(1000)에 주입하여 패터닝을 진행하였다.
특정 시간이 지나게 되면 특정한 지름을 가진 스페로이드 또는 오가노이드가 형성되는데, 실험 개시로부터 24시간 이후 200μm에서 300μm사이의 지름을 가진 스페로이드 또는 오가노이드가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 11은 본원 발명에 따른 미세 유체 칩(1000)을 활용하여 제작한, 3차원화 혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드의 형광 현미경 사진을 나타낸다.

Claims (12)

  1. 미세 유체 칩에 있어서,
    공급부;
    상기 공급부의 하부에 형성되는 형성부; 및
    상기 형성부의 하부에 형성되며, 상기 공급부로부터 배양용 세포 또는 혈관 조성용 물질을 공급받는 배양부를 포함하고,
    상기 공급부를 통해 공급된 유체가 상기 형성부 내부에 응축되어 맺혀 상기 배양부의 하부로부터 이격된 상태로 유지되는 것인, 미세 유체 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공급부는
    하부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상으로 형성된 것인,
    미세 유체 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 공급부는 상기 배양용 세포를 공급하기 위한 제1공급부; 및
    상기 혈관 조성용 물질을 공급하기 위한 제2공급부
    를 포함하는, 미세 유체 칩.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1공급부는 상기 제2공급부의 상부에 형성되어 상기 배양용 세포가 공급부의 측면을 따라 공급되게 하고,
    상기 제2공급부는 상기 형성부 상부에 형성되어 상기 혈관 조성용 물질이 상기 형성부에 직접 공급되게 하는,
    미세 유체 칩.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제1공급부에는 단차가 형성되는 것인,
    미세 유체 칩.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형성부는 상부를 향할수록 좁아지는 테이퍼링 형상을 포함하는 것인,
    미세 유체 칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양부는
    내부에 3차원 혈관화된 스페로이드 및 오가노이드 중 하나 이상이 형성 가능하도록 구성된 것인,
    미세 유체 칩.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 배양부의 상부에 접하고,
    상기 공급부 및 상기 형성부와 구획되어 형성되며,
    상기 배양부에 배양액 또는 실험 물질을 공급할 수 있는 리저버를 추가로 포함하는,
    미세 유체 칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 배양부의 가장자리에 혈관 내피세포를 공급할 수 있는 주입부; 및
    상기 주입부와 상기 배양부를 연결하는 채널을 추가로 포함하는,
    미세 유체 칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 배양부의 하부에 형성된 베이스부를 추가로 포함하는,
    미세 유체 칩.
  11. 미세 유체 칩을 이용하여 스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델을 형성하는 방법에 있어서,
    상기 미세 유체 칩의 공급부에 배양용 세포를 공급하는 단계;
    상기 공급된 배양용 세포가 상기 공급부와 형성부 사이에 응축되어 맺혀 스페로이드 또는 오가노이드를 형성하는 단계;
    상기 공급부에 혈관 조성용 물질을 공급하는 단계; 및
    배양부에 3차원 혈관화된 스페로이드 또는 오가노이드를 형성하는 단계
    를 포함하는,
    스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 형성 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 배양부에 배양액, 실험 물질, 또는 혈관 내피 세포를 공급하는 단계를 더 포함하는,
    스페로이드 또는 오가노이드 체외 모델 형성 방법.
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