WO2023027408A1 - 인코딩 자성입자의 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 시료의 다중검출 분석 장치 및 그 방법 - Google Patents

인코딩 자성입자의 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 시료의 다중검출 분석 장치 및 그 방법 Download PDF

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한영기
백문창
정호영
박수빈
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Definitions

  • the present invention relates to a multi-detection analysis device and method for a sample using deep learning-based decoding of encoded magnetic particles, and more particularly, to a multi-detection diagnosis platform based on magnetic force to quickly and accurately diagnose diseases from biological samples. It relates to a multi-detection analysis device that can be used and a method therefor.
  • Exosomes are small vesicles with a size of 50-150 nm (nanometers) that are secreted from all cells and circulate throughout the body to participate in various physiological activities. Exosomes play an important role in cell-to-cell communication and affect a significant number of cellular activities in human health and disease. They contain abundant biomolecules from the original cell, including membrane and intracellular proteins, nucleic acids and lipids. These properties induce different molecular pathways in exosomes and serve as potential biomarkers for early diagnosis of disease.
  • cancer cells contain their own cancer metastasis-specific proteins in exosomes.
  • the secreted exosomes contain various factors related to cancer, and exosomes are known to significantly contribute to cancer progression and metastasis in the corresponding region by transferring them to normal cells and favorably changing the tumor microenvironment.
  • exosomes specifically secreted from cancer cells Due to the unique biological characteristics of exosomes, many studies have been conducted to utilize exosomes specifically secreted from cancer cells as biomarkers in early diagnosis and prediction of cancer.
  • suspension array method has recently been more researched because it provides higher specificity and improved reproducibility than planar microarray.
  • the present invention can quickly and accurately identify encoded magnetic particles encoded in different types using a deep learning-based rotation pattern discrimination technology, and simultaneously detect different types of target materials in a biological sample from an image using the identification result. It is an object of the present invention to provide a multi-detection analysis device and method that can be used.
  • the present invention provides a multi-detection analysis method for a biological sample using a multi-detection analysis device using deep learning-based decoding, comprising the steps of preparing a plurality of encoded magnetic particles encoded in different types and introducing them into a sample to be analyzed; Obtaining an image of the sample in a state in which the sample is exposed to a rotating magnetic field; inputting a time-series image included in the image to a pre-learned deep learning algorithm; and each encoding magnetism in the image through the deep learning algorithm. Classifying each encoded magnetic particle by analyzing the characteristics of the rotation pattern of the particle over time, and detecting multiple types of target materials in the sample based on the classification result of each encoded magnetic particle in the image.
  • a multi-detection analysis method for a biological sample is provided.
  • the plurality of encoded magnetic particles are attached with different capture antibodies for reacting with different types of target materials for each encoding type
  • the multiple detection analysis method of the biological sample is The method may further include sequentially introducing and reacting a detection antibody for detecting the target substance in a sample and a fluorescent substance attached to the detection antibody.
  • the encoding type of each encoded magnetic particle in the image is identified based on the classification result of each encoded magnetic particle in the image, and the fluorescent material coupled to the encoded magnetic particle for each identified type is identified.
  • the concentration of the target substance corresponding to the type can be quantified.
  • the characteristics of the rotation pattern of the encoded magnetic particles may include at least one of the rotation speed, rotation period, continuous rotation of the encoded magnetic particles, whether an intermittent stop period occurs during rotation, a period of occurrence of a stop period, and a time length of a stop period.
  • the deep learning algorithm may be implemented by including a convolutional long and short term memory neural network (Convolutional LSTM) for image analysis and learning time variance information.
  • Convolutional LSTM convolutional long and short term memory neural network
  • the encoded magnetic particles are produced in a rod shape by photocuring in a state in which superparamagnetic nanoparticles mixed with a photocurable polymer material are aligned in a set direction according to an external magnetic field in a microchannel, and different Can be encoded as type.
  • the encoding types of the encoded magnetic particles are a first type in which the particles are aligned in the horizontal direction (0°), which is the longitudinal direction of the rod, a second type in which the particles are aligned in the vertical direction (90°), and a diagonal direction ( 45°), a fourth type in which particles are aligned in directions between 0° and 90° except for 45°, and a plurality of nanoparticle blocks in which particles are aligned in different directions in the longitudinal direction It may include a fifth type of structure sequentially listed as .
  • the present invention provides an image acquisition unit for obtaining an image obtained by photographing a sample in a state in which a rotating magnetic field is applied to a sample to be analyzed prepared by inputting a plurality of encoded magnetic particles encoded in different types, and included in the image a decoding unit that inputs the pre-learned time-series images to a pre-learned deep learning algorithm and analyzes rotation pattern characteristics of each encoded magnetic particle in the image over time through the deep learning algorithm to classify each encoded magnetic particle; and Provided is a multi-detection analysis device for a biological sample including a detector that multi-detects a plurality of types of target substances in the sample based on classification results of each encoded magnetic particle.
  • a detection antibody for detecting the target material and a fluorescent material attached to the detection antibody may be sequentially introduced into the sample into which the plurality of encoded magnetic particles are applied before the rotational magnetic field is applied to perform a reaction.
  • the detection unit identifies the encoding type of each encoded magnetic particle in the image based on the classification result of each encoded magnetic particle in the image, and analyzes the intensity of the fluorescent substance coupled to the encoded magnetic particle for each identified type.
  • concentration of the target material corresponding to the corresponding type can be quantified.
  • the present invention it is possible to quickly and accurately identify different types of encoded magnetic particles by deep learning analysis of rotation patterns of each encoded magnetic particle in an image captured by exposing encoding magnetic particles encoded in different types to a rotating magnetic field.
  • different types of target substances in a biological sample may be simultaneously detected from an image using the identification result, and a quantitative analysis result thereof may be provided.
  • the present invention identifies the type of each encoded magnetic particle detected in the image through a deep learning model, it does not require complicated special optical equipment to decode the encoded particle at all, and reduces the sample analysis time to prevent diseases and diseases. Related exosomes can be quickly detected and the time for diagnosing diseases can be greatly reduced.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of a multi-detection analysis device for a biological sample according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram explaining a multiple detection analysis method of a biological sample using FIG. 1 .
  • FIG. 3 is a diagram showing an exemplary magnetic field device used for encoding encoded magnetic particles in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram explaining the principle of photo-curing and manufacturing encoded magnetic particles in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating various encoding types according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the structure of a deep learning model for time series analysis of convolutional features according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing a manufacturing process of encoded magnetic particles in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating captured images of encoded magnetic particles for each encoding type.
  • FIG. 9 is a diagram showing the fluorescence intensity according to the concentration of exosomes on encoding magnetic particles to which different capture antibodies are conjugated.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of exosomes reacting with encoded magnetic particles containing different capture antibodies in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of detecting high and low concentration exosomes derived from four types of cell lines in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a view showing results of detecting exosomes present in the blood of normal people and cancer patients (lung cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer) in an embodiment of the present invention.
  • the present invention is a multi-detection analysis device and method for a sample using deep learning-based decoding of encoded magnetic particles, which quickly and accurately identifies encoded magnetic particles encoded in different types in an image using a deep learning-based decoding technique, We propose a method of simultaneously multiplexing different types of target substances in a biological sample using the identification result.
  • the sample to be analyzed may correspond to blood, saliva, urine, and the like.
  • a plurality of encoded magnetic particles encoded (encoded) in different types are input and prepared.
  • a rotating magnetic field is applied to the prepared sample so as to analyze the rotation pattern of magnetic encoded microparticles (MEMP).
  • different capture antibodies for reacting with different types of target materials are attached to the plurality of encoded magnetic particles, respectively, for each encoding type.
  • a detection antibody for detecting a target material and a fluorescent material attached to the detection antibody may be sequentially introduced into the sample and reacted.
  • the encoded magnetic particles are photo-cured in a state in which superparamagnetic nanoparticles mixed with a photocurable polymer material are aligned in a set direction according to an external magnetic field in a microchannel to be manufactured into a bar-type. It can be.
  • the encoded magnetic particles may be encoded in different types according to the alignment direction. For example, not only encoding in directions of 0°, 45°, and 90°, but also a structure in which directions between 0° and 90° and a plurality of different directions are mixed is also possible.
  • the mixed structure has a structure in which sections encoded in different directions with respect to the length direction of the encoded magnetic particles are sequentially arranged.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of a multi-detection analysis device for a biological sample according to an embodiment of the present invention.
  • the apparatus 100 for multi-detection analysis of a biological sample includes an image acquisition unit 110, a decoding unit 120, a detection unit 130, a learning unit 140, an output It includes a unit 150 and a control unit 160.
  • the image acquisition unit 110 acquires an image of a sample in a state in which a rotating magnetic field is applied to a sample to be analyzed prepared by inputting different types of encoded magnetic particles.
  • the image may correspond to an image captured for a set time (eg, 10 seconds, 1 minute).
  • the image acquisition unit 110 may collect images obtained by photographing a sample from a photographing device.
  • the imaging device may include at least one of a camera (eg, a CCD camera) and a microscope.
  • the image acquisition unit 110 may receive an image by being connected to the photographing device through a wired or wireless network.
  • the image acquisition unit 110 may be implemented by including a photographing device.
  • the image acquisition unit 110 may obtain an image of a sample from a photographing device and transmit it to the decoding unit 120 .
  • the video is composed of images of several frames, and may include, for example, images of multiple frames per second (eg, 30 frames).
  • the decoding unit 120 inputs the time-series images included in the video to the pre-learned deep learning algorithm and analyzes the rotation pattern characteristics of each encoded magnetic particle in the video over time through the deep learning algorithm to classify each encoded magnetic particle. do.
  • the decoding unit 120 receives images in units of a set time length (eg, 10 seconds or 1 minute) from the image acquisition unit 110, and a deep learning-based classification model based on a pretrained image of multiple frames constituting the unit image. By applying to, it is possible to decode each encoded magnetic particle in the image.
  • decoding based on deep learning means identifying the types of encoded magnetic particles encoded in different types in advance through deep learning analysis of images.
  • the embodiment of the present invention analyzes the characteristics of the rotation pattern over time of each encoded magnetic particle included in the image through a pre-learned deep learning-based classification model, so that different types of encoded magnetic particles in the image can be analyzed. be able to distinguish
  • the characteristics of the rotation pattern of the encoded magnetic particles may include at least one of the rotation speed of the encoded magnetic particles, the rotation period, whether or not they rotate continuously, whether or not an intermittent stop period occurs during rotation, the period of occurrence of the stop period, and the length of time of the stop period.
  • Characteristics of the rotation pattern of the encoded magnetic particles may be unique for each encoding type.
  • the encoded magnetic particles may continuously rotate without stopping according to time, but may have a pattern of periodically stopping during rotation.
  • the rotation speed or period of the particles, whether or not a still section occurs, and the length of time of the still section may vary.
  • the deep learning algorithm may be implemented by including a convolutional long-short-term memory neural network (Convolutional LSTM (hereinafter referred to as ConvLSTM)) for image analysis and learning time variance information.
  • ConvLSTM convolutional long-short-term memory neural network
  • the ConvLSTM neural network can decode (classify) each encoded magnetic particle by analyzing the characteristics of the rotation pattern of the encoded magnetic particle from the input image.
  • the decoding unit 120 may provide a result of classifying each corresponding encoded magnetic particle in the image to the detection unit 130 .
  • the decoding unit 120 provides a classification result for each object in the image, and may map the classification result to an object location and provide it.
  • the deep learning algorithm may be pre-trained in the learning unit 140 .
  • the learning unit 140 learns the rotation pattern of the encoded magnetic particles for each encoding type by using an image photographed by exposing the encoded magnetic particles to a rotating magnetic field. When the learning is completed, the type (encoding type) of each encoded magnetic particle present in the image can be classified from the input image.
  • the learning unit 140 receives an image for each time of a training video in which an encoding type is labeled for each object in the image, and learns a rotation pattern feature of each object in the image. It can be learned to classify the kind of object (encoding type). That is, the deep learning algorithm may receive an image labeled with a corresponding encoding type for each encoded magnetic particle in the image, and learn rotation pattern characteristics of the encoded magnetic particle for each type.
  • the learning unit 140 analyzes the video taken by exposing the rotating magnetic field to the encoded magnetic particles through a deep learning algorithm, and pre-learns the rotation pattern characteristics of the encoded magnetic particles for each different encoding type, thereby providing a deep learning-based A classification model can be built.
  • the learning unit 140 may implement a classification model of a convolutional LSTM structure.
  • the learning unit 140 and the decoding unit 120 may be included or embedded in the decoding processor.
  • the decoding processor can load an artificial intelligence-based classification model, provide relevant detection results, and update and update the classification model.
  • the detection unit 130 multi-detects different types of target materials in the biological sample based on the classification result of each encoded magnetic particle in the image, and provides detection results.
  • the detection result may include an image of a biological sample, whether a target material is detected in the image, the type and number of detected target materials, and a quantification result of the target material.
  • the target material may correspond to exosomes associated with a disease.
  • a brief description of the detection principle of the target material is as follows. As described above, different types of capture antibodies are attached (conjugated) to each of the encoded magnetic particles encoded in different types.
  • Each type of encoding magnetic particle to which different capture antibodies are attached is introduced into the sample and then reacts with the target substance (exosome) contained in the sample for a set time, and accordingly, an encoding magnetic particle-exosome reaction product is generated in the sample. do. At this time, different capture antibodies attached to each type of encoding magnetic particle operate to react with different specific target substances (exosomes).
  • the detection antibody when the detection antibody is introduced into the sample, exosomes, which are target materials, bind to the detection antibody, generating a reaction product of the encoding magnetic particle-exosome-detection antibody. And, when a fluorescent material is introduced into the sample, the detection antibody reacts with the fluorescent material and the fluorescent material is attached.
  • the encoded magnetic particles that have undergone the final reaction When the encoded magnetic particles that have undergone the final reaction are exposed to an external rotating magnetic field, they rotate in a unique rotation pattern corresponding to their encoding type.
  • the decoding unit 120 classifies the encoding type by decoding each encoded magnetic particle inserted into the biological sample by analyzing the characteristics of the rotation pattern of each encoded magnetic particle in the image.
  • the detection unit 130 identifies the encoding type of each encoding magnetic particle in the image based on the classification result of each encoding magnetic particle in the image received from the decoding unit 120, and determines the amount of the fluorescent material coupled to the encoding magnetic particle for each identified type. The intensity is analyzed to quantify the concentration of the target substance corresponding to the type.
  • the detector 130 may extract the concentration of the target material by detecting the intensity of light emitted from the fluorescent material in the image.
  • the detector 130 may extract or calculate a concentration value corresponding to the currently detected light intensity by using a function or an information table defining the corresponding target material concentration for each light intensity.
  • the function or information table may be constructed for each target material.
  • the information table may have a graph form defining a relationship between fluorescence intensity and concentration, in addition to a general tabular form.
  • the detector 130 may quantitatively analyze the concentration of the target material by detecting and using fluorescence intensity emitted from each particle in the image.
  • fluorescence intensity of a specific particle is 0, it means that a specific target material corresponding to the specific particle does not exist in the sample.
  • the detector 130 may analyze fluorescence intensity from an image obtained through a photographing device. For example, fluorescence intensity of each particle in an image may be acquired using a microscope equipped with a CCD camera. Of course, a variety of well-known techniques and devices can be used to analyze the fluorescence intensity of particles.
  • the control unit 160 controls the operation of each unit 110 to 140 and data flow between each unit.
  • the control unit 160 may include a pre-programmed processor necessary for various control, calculation, and data processing.
  • the controller 160 may store input/output data of the device, data processing results, and the like in a memory or the like.
  • the control unit 160 may match and store an image of a biological sample sample, an image of each frame, whether or not at least one target material has been detected, a quantitative analysis result of the target material, etc., matched with an identification number of the corresponding sample, and , It is possible to output and provide related contents through the output unit 150.
  • the multi-detection analysis device 100 of the present invention receives an image of a sample into which a plurality of types of encoded magnetic particles are input, conducts deep learning analysis, detects a target substance in the sample, and provides a detection result to a web server or an app server. It may be implemented as an on/offline platform such as the like, or may be implemented in the form of an application program, application, etc. on a user terminal.
  • the multiple detection analysis device 100 may be implemented in the form of a user terminal such as a computer, and the computer may include a processor, memory, user interface input/output device, storage device, and the like.
  • the present invention can quickly and accurately diagnose various diseases from a small amount of biological samples. That is, various diseases or disease factors can be diagnosed quickly and easily by simply monitoring and analyzing images captured by exposing different types of encoded magnetic particles to a rotating magnetic field in a biological sample for a set time. .
  • FIG. 2 is a diagram explaining a multiple detection analysis method of a biological sample using FIG. 1 .
  • a plurality of encoded magnetic particles encoded in different types are prepared and put into a biological sample (eg, blood, saliva, urine, etc.) to be analyzed (S210).
  • a biological sample eg, blood, saliva, urine, etc.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a magnetic field device used to encode encoded magnetic particles in an embodiment of the present invention
  • FIG. 4 is a diagram explaining the principle of photo-curing and manufacturing encoded magnetic particles in an embodiment of the present invention. .
  • the top picture of FIG. 3 shows a magnetic field generating device. Encoding When encoding magnetic particles, a static magnetic field is utilized. To this end, the magnetic field generating device operates to generate a static magnetic field. 3 illustrates generating a static magnetic field through magnets mounted on both ends. Of course, the magnetic field generating device may operate to generate a rotating magnetic field in which the direction of the magnetic field changes with time.
  • the encoded magnetic particles may be encoded in different types according to the axial direction of the static magnetic field.
  • the encoded magnetic particles have a bar-type and may be manufactured to have the same length as each other.
  • the encoding types of the encoded magnetic particles are the first type in which the particles are aligned in the horizontal direction (0°), the longitudinal direction of the rod, the second type in which the particles are aligned in the vertical direction (90°), and the diagonal direction (45°). ), a third type in which particles are aligned in a direction between 0 ° and 90 ° except for 45 °, a fourth type in which particles are aligned in a direction between 0 ° and 90 °, and a fifth type in which at least two of the first to fourth types are combined can include At this time, the fifth type has a structure in which a plurality of nanoparticle blocks in which particles are aligned in different directions are sequentially arranged in the longitudinal direction.
  • the encoded magnetic particles may be produced in a microchannel (PDMS channel).
  • a mixed solution of a polymer material and superparamagnetic nanoparticles (SMNP) is injected into a microchannel, exposed to a static magnetic field to align the superparamagnetic nanoparticles in the direction of the magnetic field, It can be prepared by UV curing the target area.
  • SMNP superparamagnetic nanoparticles
  • the superparamagnetic particles may be produced by polymer polymerization by forming a mixture with a polymer material, a curing agent, etc., exposed to an external static magnetic field, aligned in a chain shape according to the direction of the magnetic field, and then photo-curing. At this time, by changing the direction of the external static magnetic field, the superparamagnetic particles can be aligned at various angles, and chain directions corresponding to the magnetic field directions can be formed.
  • the polymer material used is a material that can be cured to form particles, such as Poly-(ethylene glycol) diacrylate, polystyrene, polymethyl-methacrylate (PMMA), silica ), polyvinyltoluene (PVT), styrene/butadiene (S/B), a copolymer, and styrene/vinyltoluene (styrene/vinyltoluene: S/VT).
  • PMMA polymethyl-methacrylate
  • PVT polyvinyltoluene
  • S/B styrene/butadiene
  • S/VT styrene/vinyltoluene
  • a mixed solution of a polymeric monomer and superparamagnetic nanoparticles is injected into a microchannel, and the superparamagnetic nanoparticles in the mixed solution are aligned along the axial direction of a set magnetic field applied from the outside through a magnetic field generating device.
  • a mask (MASK) having an aperture is placed on the target portion of the mixed solution in the microchannel (PDMS channel), and UV light is emitted through the aperture of the mask. is irradiated to UV cure the target area.
  • encoded magnetic particles (MEMP) encoded in set directions eg, 0°, 90°, and 45° directions
  • the first, second, and third types of encoded magnetic particles 10-1, 10-2, and 10-3 aligned in directions of 0°, 90°, and 45°, respectively, are manufactured.
  • the first type has a horizontal pattern
  • the second type has a vertical pattern
  • the third type has a diagonal pattern.
  • the fourth type of nanoparticles also correspond to encoded magnetic particles encoded in a single direction, they are manufactured according to the same principle as above.
  • Figure 4(b) shows the principle of fabricating the fifth type of encoded magnetic particles.
  • the fifth type of encoded magnetic particles 10-5 has a structure in which a plurality of nanoparticle blocks in which particles are aligned in different directions are sequentially arranged in the longitudinal direction. This corresponds to encoding magnetic particles encoded in multiple directions.
  • Fig. 4(c) shows rod-shaped encoded magnetic particles manufactured in various types. In this way, the present invention can be manufactured by encoding the encoded magnetic particles in various types.
  • 4(b) illustrates a method of manufacturing encoded magnetic particles having a mixed structure of the first type (0°) and the second type (90° direction).
  • the direction in which the magnetic field is applied may be adjusted by changing the arrangement of microchannels for the magnetic field generating device, or it is possible to directly change the direction in which the magnetic field is applied in the magnetic field generating device.
  • an external magnetic field is applied in the second direction to align the superparamagnetic nanoparticles in the mixed solution in the second direction, and UV curing is performed while a mask is placed on the second target area adjacent to the first target area. form nanoparticle blocks.
  • the second nanoparticle block is cured next to the first cured nanoparticle block to form a bonded structure.
  • the fifth type of encoded magnetic particle has a structure in which at least two nanoparticle blocks (at least two different patterns) in which particles are aligned in different directions are sequentially arranged in the longitudinal direction.
  • the fifth type has a structure in which N patterns (N is 2 or more) are connected in series, and the opening diameter of the mask used during manufacture may have a size of 1/N compared to that used in the first type. Through this, the production length of the encoded magnetic particles can be made the same.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating various encoding types according to an embodiment of the present invention.
  • first to fourth types of encoded magnetic particles aligned in 0°, 90°, 45°, 30°, and 60° directions, as well as a fifth type of mixed-type encoded magnetic particles composed of combinations thereof can be confirmed.
  • each of the encoded magnetic particles encoded in different types is injected into the sample in a state in which different types of capture antibodies are conjugated.
  • Capture antibodies immobilized on encoding magnetic particles for exosome detection include Anti-PD-L1 (Anti-Programmed Death-Ligand 1), Anti-EpCAM (Anti-Epithelial cell adhesion molecule), Anti-EGFR (Anti-Epidermal growth factor) receptor) may include at least one of them.
  • the capture antibody is not necessarily limited thereto and may include various other antibodies.
  • the detection antibody at least one of Anti-CD63-Biotin, Anti-CD81-Biotin, and Anti-CD9-Biotin or a mixture of three antibodies may be used.
  • the detection antibody is not necessarily limited thereto and may include various other antibodies.
  • the encoded magnetic particles to which the capture antibody is attached react with a specific target material (exosome) contained in the sample.
  • an encoded magnetic particle-exosome reaction product is generated in the sample.
  • different capture antibodies attached to each type of encoding magnetic particle react with different specific target substances (exosomes).
  • a target substance to be detected may be cell-derived exosomes.
  • the cells from which exosomes are derived include normal embryonic kidney cell line (HEK293T), human breast cancer cell lines (MDA-MB231, MCF7), human colon cancer cell line (HCT 116), and human melanoma cell line (SK-MEL- 28) may include at least one of them.
  • HEK293T normal embryonic kidney cell line
  • MDA-MB231, MCF7 human breast cancer cell lines
  • HCT 116 human colon cancer cell line
  • SK-MEL- 28 human melanoma cell line
  • cells from which exosomes are derived are not necessarily limited thereto and may include various other cells.
  • step S210 of introducing the encoded magnetic particles into the sample a step of reacting by sequentially introducing a detection antibody and a fluorescent material into the sample is included.
  • step S220 is performed in which the sample is exposed to a rotating magnetic field and observed.
  • the detection antibody is introduced into the sample and reacted.
  • the encoding magnetic particle-exosome-detection antibody reaction product is generated as the exosome, which is a target material, binds to the detection antibody.
  • the detection antibody reacts with the fluorescent material and the fluorescent material is attached.
  • the fluorescent substance is bound to the encoding magnetic particles.
  • the fluorescent substance may correspond to streptavidin to which the fluorescent substance is attached. That is, as the fluorescent material, StreptAvidin-FITC, which can be combined with detection antibody-biotin, can be used for quantitative analysis of exosomes.
  • the image acquisition unit 110 acquires an image of the sample in a state in which the final reaction is completed and the prepared sample is exposed to a rotating magnetic field (S220).
  • a plate containing a sample is placed in a magnetic field generating device that provides a rotating magnetic field, and an image of the sample is photographed and acquired while applying a rotating magnetic field with a set intensity condition.
  • the image acquiring unit 110 transfers the acquired captured image to the decoding unit 120 .
  • the decoding unit 120 decodes each encoded magnetic particle by analyzing the rotation pattern characteristics of each encoded magnetic particle in the image based on the deep learning algorithm (S230).
  • the time-series image included in the captured image is input to the pre-learned deep learning algorithm, and the rotation pattern characteristics of each encoded magnetic particle in the image are analyzed over time through the deep learning algorithm, so that each encoded magnetic particle to classify
  • the decoding unit 120 transfers the decoding result to the detection unit 130 .
  • a deep learning model implemented as a ConvLSTM neural network
  • the ConvLSTM neural network may decode each encoded magnetic particle using the rotation pattern characteristics of each encoded magnetic particle analyzed from the input time series image.
  • the detection unit 130 multi-detects a plurality of types of target materials in the sample based on the classification result of each encoded magnetic particle in the image (S240).
  • the detection unit 130 identifies the encoding type of each encoded magnetic particle in the image from the decoding result, analyzes the intensity of the fluorescent substance bound to each encoded magnetic particle for each identified type, and analyzes the concentration of the target material corresponding to the corresponding type. quantitatively analyze At this time, a relationship table, function, graph, etc. between the concentration and the intensity of the fluorescent substance may be utilized.
  • the output unit 150 displays an image of a biological sample, an image of each frame constituting the image, whether or not a target material was detected from the biological sample, a detection type, and a quantitative analysis result of the target material, etc. through a display or a user terminal connected to a network.
  • the user terminal may include a desktop, a tablet PC, a smart phone, a smart pad, a laptop computer, and the like.
  • This embodiment of the present invention provides a method for detecting multiple exosomes, which includes reacting capture antibodies immobilized on encoding magnetic particles with respective exosomes, combining encoding magnetic particles with exosome reactants Injecting a biotin-attached detection antibody into the sample to react, injecting fluorescent material-attached streptavidin into the sample to react with the biotin on the encoded magnetic particle-exosome-detection antibody reaction, and reacting; Exposing the encoded magnetic particles that have completed the final reaction to an external rotating magnetic field to obtain a rotation image, analyze the rotation pattern with a deep learning algorithm and decode it, detect the intensity of the fluorescent substance bound to the encoded magnetic particles and exosome concentration It includes the step of quantitatively analyzing.
  • 6 is a diagram illustrating the structure of a deep learning model for time series analysis of convolutional features according to an embodiment of the present invention.
  • 6 shows a deep learning-based encoding magnetic particle classification model, and it can be seen that it is implemented in a structure in which a convolutional neural network-based encoding magnetic particle feature extraction and a long-short-term memory neural network (LSTM neural network)-based time series analysis are combined. there is.
  • LSTM neural network long-short-term memory neural network
  • the length of the unit image used for learning the neural network is 5 seconds, and a total of 150 images obtained by sampling the 5-second-long image at 30 frames per second are input to the ConvLSTM neural network for learning.
  • the original image of the size of H 760 ⁇ W 1200 was adjusted to the size of H 244 ⁇ W 244 and applied to neural network learning.
  • a microfluidic device for fabricating encoded particles by aligning superparamagnetic nanoparticles was fabricated by Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molding process.
  • a mixture of PDMS and a curing agent at a ratio of 10:1 was placed on a wafer mold patterned with SU-8 photoresistry, and cured by heating at 80 °C for 40 minutes.
  • the PDMS device including the microfluidic channel was removed and bonded to a cover glass covered with one layer of PDMS through oxygen plasma treatment.
  • superparamagnetic nanoparticles Under an external static magnetic field, superparamagnetic nanoparticles can align to form chain-like structures along the magnetic field. Using this phenomenon, particles encoded with chains of superparamagnetic nanoparticles aligned in various directions were fabricated.
  • FIG. 7 is a diagram showing a manufacturing process of encoded magnetic particles in an embodiment of the present invention.
  • a photo mask is aligned and attached to the bottom of the microchannel (PDMS channel), and after filling the microchannel with a mixed solution of polymeric monomers and superparamagnetic nanoparticles, the microchannel is exposed to an external magnetic field.
  • the microchannel may be set in a device that generates a parallel magnetic field.
  • the device may be manufactured in a form in which a central portion is penetrated so that UV light can pass therethrough.
  • a separate through hole may be omitted.
  • neodymium magnets are placed on both sides of the magnetic field generating device as shown in FIGS. 3 and 7 to create a parallel magnetic field between the two magnets.
  • FIGS. 3 and 7 In order to form an external magnetic field, neodymium magnets are placed on both sides of the magnetic field generating device as shown in FIGS. 3 and 7 to create a parallel magnetic field between the two magnets.
  • the installation direction of the microchannel for the magnetic field generating device is changed, different types of encoded magnetic particles encoded in various types can be manufactured.
  • a UV light source can be used and an optical equipment composed of an objective lens was set.
  • the superparamagnetic nanoparticles are arranged in the microchannel and then exposed to UV light, the monomer solution containing the superparamagnetic nanoparticles is polymerized by the UV light in one second by the UV light transmitted through the photomask.
  • encoding magnetic particles having each directional chain can be made.
  • encoding in three directions including horizontal (0°), diagonal (45°), and vertical (90°) directions. particles were produced.
  • the manufactured encoded magnetic particles have a rod shape and have a size of 300 ⁇ m ⁇ 100 ⁇ m ⁇ 100 ⁇ m.
  • a photoimmobilization process was applied using benzylamine hydrochloride (Bz) as a linker to conjugate the antibody to the encoded magnetic particles (MEMPs).
  • Bz benzylamine hydrochloride
  • Biotin and fluorescently labeled Streptavidin were used.
  • Bz (100 ⁇ g/ml) and Biotin (100 ⁇ g/ml) were mixed, and 100 ⁇ l of the mixed solution was added together with encoding magnetic particles and reacted.
  • the encoding magnetic particles were washed, and the encoding magnetic particles were incubated in a PBS solution containing 5% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour to block excess activated Bz, and then the encoding magnetic particles were washed with PBS. washed with
  • BSA bovine serum albumin
  • the encoded magnetic particles were reacted with fluorescently labeled Streptavidin (100 ⁇ g/ml) at room temperature for 30 minutes and washed with PBS. Fluorescence images of bound biotin and fluorescence-labeled Streptavidin were obtained and confirmed using a fluorescence microscope equipped with a CCD.
  • a photocuring process was applied to bind capture antibodies with encoding magnetic particles. Using 20 ⁇ g/ml (in PBS) capture antibody and 500 ⁇ g/ml (in PBS) Bz, the capture antibody, Bz solution, and each encoding magnetic particle were mixed, exposed to UV light for 20 minutes, and then washed with PBS. After the reaction, the encoded magnetic particles were stored in PBS at 4°C.
  • HEK293T normal embryonic kidney cell line
  • MDA-MB231, MCF7 human breast cancer cell lines
  • HCT 116 human colon cancer cell line
  • SK-MEL-28 human melanoma cell line
  • HEK293T, MCF7, and MDA-MB231 cells were cultured in high-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • SK-MEL-28 cells were cultured in Minimum Essential Medium
  • HCT116 cells were cultured in RPMI 1640 medium. All culture media contained 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone) and 1% antibiotic antibacterial agent (Hyclone), and were cultured in a 37°C environment containing 5% CO 2 .
  • FBS fetal bovine serum
  • Hyclone antibiotic antibacterial agent
  • each of the supernatants obtained from the five cell lines was centrifuged at 300g for 5 minutes, at 2,500g for 15 minutes, and at 10,000g for 30 minutes to sequentially remove cells, cell debris and microvesicles. .
  • the supernatant obtained after centrifugation was filtered through a 0.22 ⁇ m syringe filter and centrifuged at 120,000 g for 90 minutes. All procedures were performed at 4 °C, and the finally obtained exosomes were stored in PBS for later use.
  • Antibodies that react with target exosome surface proteins are conjugated according to the alignment direction of superparamagnetic nanoparticles, and encoding magnetic particles are reacted with cell-derived exosomes. It was confirmed that a different rotation pattern appeared.
  • a convolutional LSTM deep learning model was used to decode the encoded magnetic particles formed horizontally, vertically, and diagonally using the rotation video of each encoded magnetic particle.
  • Figure 8 is a diagram illustrating captured images of encoded magnetic particles for each encoding type.
  • Figure 8 is a sequence of time-dependent images of particles encoded in three orientations, including horizontal (0°), vertical (90°), and diagonal (45°) orientations, from the top.
  • the encoded magnetic particles show specific motions according to the encoding type, that is, the alignment direction.
  • the rotation pattern appears differently depending on the alignment of superparamagnetic nanoparticles (SMNPs) when the encoded magnetic particles are exposed to a rotating magnetic field.
  • SMNPs superparamagnetic nanoparticles
  • a deep learning-based classification model of the form shown in FIG. 6 was built, and based on the classification model, rotation patterns were analyzed to decode encoded magnetic particles (MEMPs), and multiple analyzes for external protein detection were performed. performed.
  • the MEMP with magnetic axis can be easily decoded without a specific device, and multiple analyzes of multiple targets are possible at the same time, and artificial intelligence Fast analysis is possible through algorithms. Also, the detection process can be further simplified as decoding does not require multi-color labels.
  • Capture antibody (20 ⁇ g/ml, 80 ⁇ l in PBS) anti-PD-L1, anti-EGFR, and anti-EpCAM that can react with exosome surface proteins were transversely (0°), diagonally (45°), and vertically (90°). °) bonded to the encoding magnetic particles.
  • Biotin and anti-CD9-biotin were reacted at room temperature for 1 hour in a mixed solution prepared at a concentration of 20 ⁇ g/ml in PBS solution.
  • FIG. 9 is a diagram showing fluorescence intensities according to concentrations of exosomes on encoding magnetic particles to which different capture antibodies are conjugated.
  • FIG. 9 is an image of each type of encoded magnetic particle taken with a fluorescence microscope. Exosomes 0 to 4.33 ⁇ 10 in MDA-MB231 cells using anti-PD-L1, anti-EGFR, and anti-EpCAM antibodies. Fluorescence intensity reacted on the encoded magnetic particles in the concentration range of 8 /ml is shown.
  • Quantitative analysis of exosome surface proteins was calculated using the fluorescence signal intensity of the exosome marker protein, and a standard curve was obtained between the fluorescence intensity and each exposure concentration. This standard curve was obtained as a relationship between exosome concentration and fluorescence intensity, and the fluorescence intensity was obtained by standardizing the fluorescence intensity value with respect to the encoding magnetic particle size.
  • exosomes extracted from HEK293T, MCF7, SK-MEL-28, and HCT116 cells were reacted with exosomes at a specific concentration to obtain fluorescence intensity values.
  • FIG. 10 is a diagram showing the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of exosomes reacting with encoded magnetic particles containing different capture antibodies in an embodiment of the present invention. Using this standard curve, it is possible to obtain a concentration value corresponding to the fluorescence intensity in the image for each type of target material, exosome.
  • the protein-specific detection signal was analyzed by analyzing the rotation pattern of the encoded magnetic particle and measuring the fluorescence intensity.
  • the protein-specific detection signal was analyzed by analyzing the rotation pattern of the encoded magnetic particle and measuring the fluorescence intensity.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of detecting high and low concentration exosomes derived from four types of cell lines in an embodiment of the present invention.
  • exosomes having different specificities were distinguished according to each concentration.
  • 11A shows the concentration of exosomes by size derived from 4 types of cancer cells (MDA-MB-231, MCF7, SKMEL28 and HCT116).
  • MDA-MB-231, MCF7, SKMEL28 and HCT116 were classified into high-concentration exosomes ('H') and low-concentration exosomes ('L'), respectively.
  • 11 B-D shows the expression levels of three proteins PD-L1, EpCAM, and EGFR expressed on the surface of exosomes for each of four types of cancer cells.
  • Western blot results gold standard data quantifying the concentration of each protein detected in the sample
  • two methods were found in the expression levels of proteins PD-L1, EpCAM, and EGFR expressed on the surface of exosomes by cell. It was verified that the high similarity between the two samples was confirmed, and through this, the performance accuracy of the detection system based on the encoded magnetic particles developed in the present invention was confirmed.
  • FIG. 12 is a view showing results of detecting exosomes present in the blood of normal people and cancer patients (lung cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer) in an embodiment of the present invention.
  • Plasma samples from 20 lung cancer patients (LC), 10 gastric cancer patients (SC), 20 colon cancer patients (CC), and 20 breast cancer patients (BC) were tested to test the potential clinical utility of the encoded magnetic particle-based detection system.
  • LC lung cancer patients
  • SC gastric cancer patients
  • CC colon cancer patients
  • BC breast cancer patients
  • the expression level of proteins such as PD-L1, EpCAM, and EGFR was low in the exosomes present in the plasma of the healthy control group (normal person), but the expression level of the proteins on the exosomes of cancer patients was measured to be relatively higher.
  • cancer patients and control groups were successfully classified for each protein, it was confirmed that it was difficult to distinguish between lung cancer patients (LC) and healthy controls (HC) in the case of PD-L1.
  • LC lung cancer patients
  • HC healthy controls
  • the different types of encoded magnetic particles are quickly and accurately identified by deep learning analysis of the rotation patterns of each encoded magnetic particle in an image captured by exposing the encoded magnetic particles encoded in different types to a rotating magnetic field. and by using the identification result, different types of target substances in a biological sample can be simultaneously detected and quantitatively analyzed in an image.
  • the present invention identifies the type of each encoded magnetic particle detected in an image through deep learning-based decoding, it does not require complicated special optical equipment to decode the encoded particle at all, and also reduces the sample analysis time to prevent diseases. It is possible to quickly detect exosomes related to and significantly reduce the time for diagnosis of diseases.

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Abstract

본 발명은 인코딩 자성입자의 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 시료의 다중검출 분석 장치 및 그 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 생체 시료의 다중검출 분석 방법에 있어서, 서로 다른 유형으로 인코딩된 복수의 인코딩 자성입자를 준비하여 분석대상 시료 내에 투입하는 단계와, 시료를 회전 자기장에 노출시킨 상태에서 시료를 촬영한 영상을 획득하는 단계와, 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고 딥러닝 알고리즘을 통해 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여 각각의 인코딩 자성입자를 분류하는 단계, 및 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 시료 내 복수 종류의 타겟 물질들을 다중 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 분석하여 영상에서 생체 시료 내의 다종의 타겟 물질을 동시 검출할 수 있다.

Description

인코딩 자성입자의 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 시료의 다중검출 분석 장치 및 그 방법
본 발명은 인코딩 자성입자의 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 시료의 다중검출 분석 장치 및 그 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자기력 기반의 다중 검출 진단 플랫폼을 이용하여 생체시료 샘플로부터 질병을 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 다중검출 분석 장치 및 그 방법에 관한 것이다.
엑소좀은 모든 세포에서 분비되며, 체내를 순환하여 다양한 생리적 활동에 관여하는 50-150nm(나노미터)크기를 갖는 작은 소포체이다. 엑소좀은 세포간 통신에서 중요한 역할을 하며 인간 건강 및 질병에서 상당한 수의 세포 활성에 영향을 미친다. 이들은 막 및 세포 내 단백질, 핵산 및 지질을 포함하여 원래 세포로부터의 풍부한 생체 분자를 함유한다. 이러한 특성은 엑소좀에 다른 분자 경로를 유도하고 질병의 조기 진단을 위한 잠재적인 바이오 마커로서의 기능을 제공한다.
특히, 암세포는 자신만이 갖고 있는 암 전이 특이 단백질을 엑소좀에 담아 낸다. 이때, 분비되는 엑소좀에는 암과 관련된 다양한 요소가 포함되어 있는데, 엑소좀은 이를 정상 세포에 전달하여 종양 미세 환경을 호의적으로 바꿈에 따라 해당 부위의 암 진행과 전이에 크게 기여하는 것으로 알려져 있다.
엑소좀의 고유한 생물학적 특성으로 인하여, 암을 조기에 진단하고 예측하는데 있어 암세포에서 특이적으로 분비되는 엑소좀을 바이오 마커로서 활용하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 인체의 복잡성과 종양의 이질성으로 인하여, 단일의 바이오 마커 만으로는 질병의 진행 단계를 정확하게 반영할 수는 없음은 자명하다. 따라서 높은 정확도 및 특이성으로 질병 진단을 달성하기 위해서는 다양한 바이오 마커의 동시 검출 플랫폼 개발이 요구된다.
최근, 여러 표적 분자의 다중검출에 사용되는 방법들은 크게 suspension array와 planar microarray 기술로 구분할 수 있다. 이 중에서 suspension array 방식은 planar microarray 보다 높은 특이성과 향상된 재현성을 제공하기 때문에 최근 들어 더욱 많은 연구가 진행되고 있다.
많은 연구자들은 단일 샘플에서 여러 표적을 동시에 검출하기 위한 진단 도구로써, 암호화(인코딩)된 입자를 활용한 방식들을 제안하였다. 서로 다른 probe 분자를 서로 다른 암호화된 입자에 부착한 후 대상 샘플과 반응시켜 결과를 분석하게 되는데, 부착된 probe 분자를 확인하기 위해서는 각각의 암호화된 입자를 식별할 수 있어야 하므로, 각 입자는 고유 식별자로 인코딩해야 한다.
이를 위해, 분광, 그래픽, 전자 및 물리적 방법과 같은 다양한 원리의 인코딩 방식이 제안되었으나, 이런 방식들은 우수한 다중검출 능력에도 불구하고, 복잡한 제조 과정 및 디코딩을 위한 특수 광학 장비를 필요로 한다는 단점이 있다.
따라서, 보다 간편한 방법의 인코딩과 복잡한 장비를 요구하지 않는 디코딩 방식을 적용한 새로운 다중검출 진단 플랫폼의 개발이 필요하다.
본 발명의 배경이 되는 기술은 한국공개특허 제2019-0089636호(2019.07.31 공개)에 개시되어 있다.
본 발명은, 딥러닝 기반의 회전 패턴 판별 기술을 이용하여 서로 다른 유형으로 암호화된 인코딩 자성입자를 빠르고 정확하게 식별하고, 식별 결과를 이용하여 영상에서 생체 시료 내 서로 다른 종류의 타겟 물질을 동시 검출할 수 있는 다중검출 분석 장치 및 그 방법을 제공하는데 목적이 있다.
본 발명은, 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 다중검출 분석 장치를 이용한 생체 시료의 다중검출 분석 방법에 있어서, 서로 다른 유형으로 인코딩된 복수의 인코딩 자성입자를 준비하여 분석대상 시료 내에 투입하는 단계와, 상기 시료를 회전 자기장에 노출시킨 상태에서 상기 시료를 촬영한 영상을 획득하는 단계와, 상기 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고 상기 딥러닝 알고리즘을 통해 상기 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여 각각의 인코딩 자성입자를 분류하는 단계, 및 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 상기 시료 내 복수 종류의 타겟 물질들을 다중 검출하는 단계를 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 방법을 제공한다.
또한, 상기 복수의 인코딩 자성입자는, 인코딩 유형 별로 서로 다른 종류의 타겟 물질과 반응하기 위한 서로 다른 포획 항체가 각각 부착되며, 상기 생체 시료의 다중검출 분석 방법은, 상기 복수의 인코딩 자성입자가 투입된 시료 내에 상기 타겟 물질을 검출하기 위한 검출 항체 및 상기 검출 항체에 붙는 형광 물질을 순차로 투입하여 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 다중 검출하는 단계는, 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 영상 내 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 식별하고, 상기 식별된 유형 별로 상기 인코딩 자성입자에 결합된 상기 형광 물질의 세기를 분석하여 해당 유형에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정량화할 수 있다.
또한, 상기 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징은, 상기 인코딩 자성입자의 회전 속도, 회전 주기, 연속 회전 여부, 회전 중 간헐적 정지 구간 발생 여부, 정지 구간의 발생 주기, 정지 구간의 시간 길이 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 딥러닝 알고리즘은, 이미지 분석 및 시간 변이 정보를 학습하기 위한 콘볼루셔널 장단기 메모리 신경망(Convolutional LSTM)을 포함하여 구현될 수 있다.
또한, 상기 인코딩 자성입자는, 마이크로 채널 내에서 광경화 고분자 물질에 혼합된 초상자성 나노입자들이 외부 자기장에 따라 설정 방향으로 정렬된 상태에서 광 경화되어 막대 형상으로 제조되고, 정렬 방향에 따라 서로 다른 유형으로 인코딩될 수 있다.
또한, 상기 인코딩 자성입자의 인코딩 유형은, 상기 막대의 길이 방향인 가로 방향(0°)으로 입자가 정렬된 제1 유형, 세로 방향(90°)으로 입자가 정렬된 제2 유형, 대각 방향(45°)으로 입자가 정렬된 제3 유형, 45°를 제외한 0°와 90°사이의 방향으로 입자가 정렬된 제4 유형, 그리고 서로 다른 방향으로 입자가 정렬된 복수의 나노입자 블록이 길이 방향으로 순차 나열된 구조의 제5 유형을 포함할 수 있다.
그리고, 본 발명은, 서로 다른 유형으로 인코딩된 복수의 인코딩 자성입자가 투입되어 준비된 분석대상 시료에 회전 자기장이 인가된 상태에서 상기 시료를 촬영한 영상을 획득하는 영상 획득부와, 상기 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고 상기 딥러닝 알고리즘을 통해 상기 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여 각각의 인코딩 자성입자를 분류하는 디코딩부, 및 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 상기 시료 내 복수 종류의 타겟 물질들을 다중 검출하는 검출부를 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 장치를 제공한다.
또한, 상기 복수의 인코딩 자성입자가 투입된 시료 내에는 상기 회전 자기장 인가 전에 상기 타겟 물질을 검출하기 위한 검출 항체 및 상기 검출 항체에 붙는 형광 물질이 순차로 투입되어 반응이 이루어질 수 있다.
또한, 상기 검출부는, 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 영상 내 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 식별하고, 상기 식별된 유형 별로 상기 인코딩 자성입자에 결합된 상기 형광 물질의 세기를 분석하여 해당 유형에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정량화할 수 있다.
본 발명에 따르면, 서로 다른 유형으로 인코딩된 인코딩 자성입자를 회전 자기장에 노출하여 촬영한 영상에서, 각 인코딩 자성입자의 회전 패턴을 딥러닝 분석하여, 서로 다른 유형의 인코딩 자성입자를 빠르고 정확하게 식별할 수 있고, 식별 결과를 이용하여 영상에서 생체 시료 내의 서로 다른 종류의 타겟 물질을 동시 검출하고, 그에 대한 정량 분석 결과를 제공할 수 있다.
이러한 본 발명은 영상 내 검출되는 각 인코딩 자성입자의 종류를 딥러닝 모델을 통하여 식별하므로, 암호화된 입자를 디코딩하기 위한 복잡한 특수 광학 장비를 전혀 필요로 하지 않음은 물론, 시료 분석 시간을 줄여서 질병과 관련한 엑소좀을 빠르게 검출하고 질병 진단 시간을 크게 단축할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 생체 시료의 다중검출 분석 장치의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 도 1을 이용한 생체 시료의 다중검출 분석 방법을 설명한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자의 인코딩에 사용된 자기장 장치를 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자를 광 경화하여 제조하는 원리를 설명한 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 다양한 인코딩 유형을 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 콘볼루션 특징의 시계열 분석 딥러닝 모델의 구조를 예시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자의 제조 과정을 보여주는 도면이다.
도 8은 인코딩 유형 별 인코딩 자성입자를 캡쳐한 이미지를 예시한 도면이다.
도 9는 서로 다른 포획 항체가 접합된 인코딩 자성입자 상의 엑소좀 농도에 따른 형광 세기를 보여주는 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 서로 다른 포획항체를 포함하고 있는 인코딩 자성입자와 반응한 엑소좀 농도와 형광 세기 간의 관계를 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 4가지 종류 세포주에서 유래한 고농도 및 저농도 엑소좀을 검출한 결과를 도시한 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 정상인과 암 환자(폐암, 위암, 대장암, 유방암)의 혈액 내에 존재하는 엑소좀 검출 결과를 보여주는 도면이다.
그러면 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시 예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시 예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 인코딩 자성입자의 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 시료의 다중검출 분석 장치 및 그 방법으로, 딥러닝 기반의 디코딩 기법을 이용하여 서로 다른 유형으로 암호화된 인코딩 자성입자를 영상에서 빠르고 정확하게 식별하며, 식별 결과를 이용하여 생체 시료 내의 서로 다른 종류의 타겟 물질을 동시에 다중 검출하는 기법을 제안한다.
본 발명의 실시예에서 분석대상 시료는 혈액, 타액, 소변 등에 해당할 수 있다. 분석대상 시료 내에는 서로 다른 유형으로 인코딩(암호화)된 복수의 인코딩 자성입자가 투입되어 준비된다. 준비된 시료 상에는 인코딩 자성입자(magnetic encoded microparticles; MEMP)의 회전 패턴 분석이 가능하도록 회전 자기장(rotating magnetic field)이 인가된다.
본 발명의 실시예에서 복수의 인코딩 자성입자는 인코딩 유형 별로 서로 다른 종류의 타겟 물질과 반응하기 위한 서로 다른 포획 항체가 각각 부착된다. 아울러, 회전 자기장 인가 전에, 시료 내에는 타겟 물질을 검출하기 위한 검출 항체 및 검출 항체에 붙는 형광 물질이 순차로 투입되어 반응될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 인코딩 자성입자는 마이크로 채널 내에서 광경화 고분자 물질에 혼합된 초상자성 나노입자들이 외부 자기장에 따라 설정 방향으로 정렬된 상태에서 광 경화되어 막대 형상(bar-type)으로 제조될 수 있다.
여기서, 인코딩 자성입자는 정렬 방향에 따라 서로 다른 유형으로 인코딩될 수 있다. 예를 들면, 0°, 45°, 90° 방향의 인코딩뿐만 아니라, 0°과 90° 사이의 방향, 그리고 서로 다른 복수의 방향이 혼합된 구조도 가능하다. 혼합 구조의 경우 인코딩 자성입자의 길이 방향에 대해 서로 다른 방향으로 인코딩된 구간이 순차 나열된 구조를 갖는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 생체 시료의 다중검출 분석 장치의 구성을 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 실시예에 따른 생체 시료의 다중검출 분석 장치(100)는 영상 획득부(110), 디코딩부(120), 검출부(130), 학습부(140), 출력부(150), 제어부(160)를 포함한다.
우선, 영상 획득부(110)는 서로 다른 유형의 인코딩 자성입자가 투입되어 준비된 분석대상 시료에 회전 자기장이 인가된 상태에서, 시료를 촬영한 영상을 획득한다. 이때 영상은 설정 시간(예: 10초, 1분) 동안 촬영된 영상에 해당할 수 있다.
영상 획득부(110)는 촬영 장치로부터 시료를 촬영한 영상을 수집할 수 있다. 여기서, 촬영 장치는 카메라(예: CCD 카메라), 현미경 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
영상 획득부(110)는 촬영 장치와 유무선 네트워크를 통해 연결되어 영상을 수신할 수 있다. 물론 영상 획득부(110)는 촬영 장치를 포함하여 구현될 수도 있다.
영상 획득부(110)는 시료를 촬영한 영상을 촬영 장치로부터 획득하고 이를 디코딩부(120)로 전달할 수 있다. 영상은 여러 프레임의 이미지들로 구성되는데, 예를 들어 초당 복수 프레임(예: 30 frames)의 이미지를 포함할 수 있다.
디코딩부(120)는 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고 딥러닝 알고리즘을 통해 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여 각각의 인코딩 자성입자를 분류한다.
디코딩부(120)는 설정 시간 길이(예: 10초, 1분) 단위의 영상을 영상 획득부(110)로부터 전달받고, 단위 영상을 구성한 복수 프레임의 이미지를 사전 학습된 딥러닝 기반의 분류 모델에 적용함으로써, 영상 내 각 인코딩 자성입자를 디코딩할 수 있다. 여기서, 딥러닝 기반의 디코딩이란 영상의 딥러닝 분석을 통하여 사전에 서로 다른 유형으로 암호화된 인코딩 자성입자들의 유형을 식별하는 것을 의미한다.
이와 같이, 본 발명의 실시예는, 영상에 포함된 각 인코딩 자성입자들의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 기 학습된 딥러닝 기반의 분류 모델을 통하여 분석함으로써, 영상 내 서로 다른 유형의 인코딩 자성입자를 구분할 수 있게 된다.
여기서, 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징은, 인코딩 자성입자의 회전 속도, 회전 주기, 연속 회전 여부, 회전 중 간헐적 정지 구간 발생 여부, 정지 구간의 발생 주기, 정지 구간의 시간 길이 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징은 인코딩 유형 별로 고유하게 나타날 수 있다.
인코딩 유형에 따라, 인코딩 자성입자는 시간에 따라 멈춤 없이 연속하여 회전할 수도 있지만, 회전 중에 주기적으로 정지하는 패턴을 가질 수 있다. 아울러, 인코딩 유형에 따라 입자의 회전 속도나 주기, 정지 구간의 발생 유무, 정지 구간의 시간 길이 등이 달라질 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 딥러닝 알고리즘은 이미지 분석 및 시간 변이 정보를 학습하기 위한 콘볼루셔널 장단기 메모리 신경망(Convolutional LSTM; 이하 ConvLSTM)을 포함하여 구현될 수 있다.
ConvLSTM 신경망은 입력 이미지로부터 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 분석하여, 각각의 인코딩 자성입자를 디코딩(분류)할 수 있다.
디코딩부(120)는 영상 내 해당하는 각 인코딩 자성입자를 분류한 결과를 검출부(130)로 제공할 수 있다. 여기서 디코딩부(120)는 이미지 내 각 객체 별로 분류 결과를 제공하며, 분류 결과를 객체 위치에 매핑하여 제공할 수도 있다.
딥러닝 알고리즘은 학습부(140)에서 사전 학습될 수 있다. 학습부(140)는 각각의 인코딩 유형 별로, 인코딩 자성입자에 대해 회전 자기장을 노출하여 촬영한 영상을 이용하여 인코딩 자성입자의 회전 패턴을 학습한다. 학습이 완료되면, 입력된 영상으로부터 영상에 존재한 각 인코딩 자성입자의 종류(인코딩 유형)를 분류할 수 있게 된다.
예를 들어, 학습부(140)는 이미지 내 각 객체 별로 인코딩 유형이 라벨링된 상태의 훈련용 영상의 시간 별 이미지를 입력받아, 영상 내 각 객체의 회전 패턴 특징을 학습하는 것을 통하여, 영상 내 각 객체의 종류(인코딩 유형)를 분류하도록 학습될 수 있다. 즉, 딥러닝 알고리즘은 이미지 내 인코딩 자성입자 별로 해당 인코딩 유형이 라벨링된 이미지를 입력받고 각 유형 별로 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 학습할 수 있다.
이처럼, 학습부(140)는 인코딩 자성입자에 회전 자기장을 노출하여 촬영한 영상을 딥러닝 알고리즘을 통해 분석하여, 서로 다른 인코딩 유형 별로 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 사전 학습함으로써, 딥러닝 기반의 분류 모델을 구축할 수 있다. 학습부(140)는 Convolutional LSTM 구조의 분류 모델을 구현할 수 있다.
여기서, 학습부(140)와 디코딩부(120)는 디코딩 프로세서에 포함 또는 내장될 수 있다. 디코딩 프로세서는 인공지능 기반의 분류 모델을 탑재하고, 관련 검출 결과를 제공할 수 있으며, 분류 모델을 업데이트 및 갱신할 수 있다.
검출부(130)는 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 생체 시료 내 서로 다른 종류의 타겟 물질들을 다중 검출하고, 검출 결과를 제공한다.
이때, 검출 결과는 생체시료를 촬영한 영상, 영상 내 타겟 물질의 검출 여부, 검출된 타겟 물질의 종류 및 가짓 수, 타겟 물질의 정량화 결과 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 서로 다른 유형으로 인코딩된 4개의 인코딩 자성입자를 시료에 모두 투입한 상태에서 회전 자기장을 인가하여 관측하게 되면, 해당 시료로부터 최대 4 종류의 타겟 물질을 검출할 수 있다. 여기서 타겟 물질은 질병과 관련한 엑소좀에 해당할 수 있다.
타겟 물질의 검출 원리를 간단히 설명하면 다음과 같다. 앞서 설명한 바와 같이, 서로 다른 유형으로 인코딩된 인코딩 자성입자 각각에는 서로 다른 종류의 포획 항체가 부착(접합)된다.
서로 다른 포획 항체가 부착된 각 유형의 인코딩 자성입자는 시료 내에 투입된 후에 시료에 함유된 타겟 물질(엑소좀)과 설정 시간동안 반응하게 되고, 이에 따라 시료 내에는 인코딩 자성입자-엑소좀 반응물이 생성된다. 이때, 각 유형의 인코딩 자성입자에 부착된 서로 다른 포획 항체는 서로 다른 특정한 타겟 물질(엑소좀)과 반응하도록 동작한다.
이후에, 시료 내에 검출 항체가 투입되면, 타겟 물질인 엑소좀이 검출 항체와 결합하면서 인코딩 자성입자-엑소좀-검출항체 반응물이 생성된다. 그리고 시료 내에 형광물질이 투입되면, 검출항체가 형광물질과 반응하여 형광물질이 부착된다.
여기서 물론, 상술한 바와 같이 검출 항체와 형광 물질을 순차로 투입하여 반응시키는 방식 이외에도, 검출 항체와 형광 물질이 결합되어 있는 물질을 한 번에 투입하여 반응시키는 것도 가능하다.
최종 반응이 완료된 인코딩 자성입자는 외부의 회전 자기장에 노출되면, 자신의 인코딩 유형에 대응되는 고유의 회전 패턴으로 회전하게 된다.
디코딩부(120)는 영상 내 각각의 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 분석하는 것을 통하여 생체 시료 내에 투입된 각 인코딩 자성입자를 디코딩하여 인코딩 유형을 분류하게 된다.
검출부(130)는 디코딩부(120)로부터 받은 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 영상 내 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 식별하고, 식별된 유형 별로 인코딩 자성입자에 결합된 형광 물질의 세기를 분석하여 해당 유형에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정량화한다.
검출부(130)는 영상 내에서 형광 물질에서 발생시키는 광의 세기를 검출하여 해당 타겟 물질의 농도를 추출할 수 있다.
이를 위해, 검출부(130)는 광의 세기 별로 그에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정의한 함수 또는 정보 테이블을 활용하여, 현재 검출된 광의 세기에 대응한 농도 값을 추출 또는 연산할 수 있다. 여기서 함수나 정보 테이블은 타겟 물질 별로 구축될 수도 있다. 이때 정보 테이블은 일반적인 표 형태 이외에도 형광 세기와 농도 간의 관계를 정의한 그래프 형태를 가질 수 있다.
이와 같이, 검출부(130)는 영상 내에서 각 입자에서 발산하는 형광 세기를 검출 및 이용하여 타겟 물질의 농도를 정량 분석할 수 있다. 여기서 물론 특정 입자의 형광 세기가 0이면, 그에 대응되는 특정 타겟 물질이 시료에 존재하지 않음을 의미한다.
이처럼, 각 유형으로 인코딩된 인코딩 자성입자 각각의 형광 세기를 알면, 각 유형에 대응하는 타겟 물질 별로 시료 내 검출 유무 및 검출 농도를 확인할 수 있다.
검출부(130)는 촬영 장치를 통해 얻은 영상으로부터 형광 세기를 분석할 수 있다. 예를 들면, CCD 카메라가 장착된 현미경을 이용하여 영상 내 각 입자의 형광 세기를 획득할 수 있다. 물론 입자의 형광 세기 분석에는 기 공지된 다양한 기법과 장치가 활용 가능하다.
제어부(160)는 각 부(110~140)의 동작 및 각 부 간의 데이터 흐름을 제어한다. 아울러, 제어부(160)는 각종 제어, 연산 및 데이터 처리에 필요한 사전 프로그래밍된 프로세서를 내장할 수 있다.
이러한 제어부(160)는 장치의 입출력 데이터, 데이터 처리 결과 등을 메모리 등에 저장할 수 있다. 예를 들어, 제어부(160)는 생체시료 샘플을 촬영한 영상, 각 프레임의 이미지, 적어도 하나의 타겟 물질의 검출 여부, 타겟 물질의 정량 분석 결과 등을 해당 시료의 식별번호와 매칭하여 저장할 수 있고, 관련 내용을 출력부(150)를 통해 출력하여 제공할 수 있다.
이러한 본 발명의 다중검출 분석 장치(100)는 복수 유형의 인코딩 자성입자가 투입된 샘플을 촬영한 영상을 입력받아 딥러닝 분석하여 샘플 내 타겟 물질을 검출하고 검출 결과를 제공하기 위한 웹 서버 또는 앱 서버 등의 온오프라인 플랫폼으로 구현되거나, 사용자 단말 등에 응용 프로그램, 어플리케이션(Application) 등의 형태로 구현될 수 있다.
물론, 다중검출 분석 장치(100)는 컴퓨터 등의 사용자 단말의 형태로 구현될 수 있으며, 컴퓨터는 프로세서, 메모리, 유저 인터페이스 입출력 장치, 저장 장치 등을 포함할 수 있다.
이러한 본 발명에 따르면, 샘플 내 서로 다른 종류의 항원(타겟 물질)과 반응하는 서로 다른 유형의 인코딩 자성입자들에 대한 딥러닝 기반의 디코딩을 이용하여, 생체 시료에 존재한 타겟 물질의 종류, 타겟 물질의 정량화 결과 등을 종합적으로 제공한다.
아울러, 본 발명은 소량의 생체시료 샘플로부터 다양한 질병을 빠르고 정확하게 진단할 수 있다. 즉, 서로 다른 유형의 인코딩 자성입자들을 생체 시료 내에 투입한 상태에서 회전 자기장에 노출시켜 촬영한 영상을 설정 시간 동안 모니터링 및 분석하는 것만으로, 여러 가지 질병 혹은 질병 인자를 빠르고 용이하게 진단할 수 있다.
다음은 상술한 구성을 바탕으로 생체 시료의 다중검출 분석 방법에 관하여 구체적으로 설명한다.
도 2는 도 1을 이용한 생체 시료의 다중검출 분석 방법을 설명한 도면이다.
먼저, 서로 다른 유형으로 인코딩된 복수의 인코딩 자성입자를 준비하고 이들을 분석대상이 되는 생체시료(예: 혈액, 타액, 소변 등)에 투입한다(S210).
도 3은 본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자의 인코딩에 사용된 자기장 장치를 예시적으로 나타낸 도면이고, 도 4는 본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자를 광 경화하여 제조하는 원리를 설명한 도면이다.
도 3의 상단 그림은 자기장 발생 디바이스를 나타낸다. 인코딩 자성입자의 인코딩 시에는 정적 자기장이 활용된다. 이를 위해 자기장 발생 디바이스는 정적 자기장을 발생하도록 동작한다. 도 3의 경우 양단에 장착된 자석을 통하여 정적 자기장을 발생하는 것을 예시한다. 물론 자기장 발생 디바이스는 시간에 따라 자기장 방향이 가변하는 회전 자기장을 발생하도록 동작할 수도 있다.
도 3의 하단 그림과 같이, 인코딩 자성입자는 정적 자기장의 축 방향에 따라 서로 다른 유형으로 인코딩될 수 있다. 여기서, 인코딩 자성입자는 막대 형상(bar-type)을 가지며 서로 동일한 길이로 제작될 수 있다.
여기서, 인코딩 자성입자의 인코딩 유형은, 막대의 길이 방향인 가로 방향(0°)으로 입자가 정렬된 제1 유형, 세로 방향(90°)으로 입자가 정렬된 제2 유형, 대각 방향(45°)으로 입자가 정렬된 제3 유형, 45°를 제외한 0°와 90°사이의 방향으로 입자가 정렬된 제4 유형, 그리고 제1 내지 제4 유형 중 적어도 2가지 유형이 조합된 제5 유형을 포함할 수 있다. 이때, 제5 유형은 서로 다른 방향으로 입자가 정렬된 복수의 나노입자 블록이 길이 방향으로 순차 나열된 구조를 갖는다.
본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자는 마이크로 채널(PDMS 채널) 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 고분자 물질과 초상자성 나노입자(superparamagnetic nanoparticles; SMNP)의 혼합 용액을 마이크로 채널 내에 주입하고, 이를 정적 자기장에 노출하여 초상자성 나노입자를 자기장(magnetic field)의 방향으로 정렬한 다음, 타겟 부위를 UV 경화하는 방식으로 제조할 수 있다.
즉, 초상자성 입자들은 고분자 물질, 경화제 등과 혼합물을 이루고, 외부 정적 자기장에 노출되어 자기장 방향에 따라 체인 형태로 정렬된 후, 광 경화와 같은 방법으로 고분자 중합반응에 의해 제작될 수 있다. 이때, 외부 정적 자기장의 방향을 변경함으로써 다양한 각도로 초상자성 입자를 정렬시킬 수 있으며, 자기장 방향에 대응하는 체인 방향을 각각 형성할 수 있다.
사용된 고분자 물질은 경화되어 입자를 형성할 수 있는 물질로 폴리에틸렌다이아크릴레이트(Poly-(ethylene glycol) diacrylate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl-methacrylate:PMMA), 실리카(silica), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene:PVT), 스티렌/부타디엔(styrene/butadiene:S/B), 공중합체(copolymer), 그리고 스티렌/비닐톨루엔(styrene/vinyltoluene:S/VT) 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.
인코딩 자성입자의 인코딩 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 고분자 물질의 단량체와 초상자성 나노입자의 혼합 용액을 마이크로 채널 내 주입하고, 자기장 발생 디비이스를 통하여 외부에서 인가되는 설정 방향의 자기장의 축 방향에 따라 혼합 용액 상의 초상자성 나노입자를 정렬한다.
도 4의 (a)는 외부 자기장에 의해 혼합 용액 상의 초상자성 나노입자들이 각기 다른 방향으로 정렬된 모습을 나타낸다.
다음, 도 4의 (a)와 같이, 개구면이 형성된 마스크(MASK)를 마이크로 채널(PDMS channel) 내 혼합 용액의 타겟 부위 상에 배치한 다음, 마스크의 개구면을 통해 UV 광(UV light)을 조사하여 타겟 부위를 UV 경화한다. 이후에, UV 경화된 블록 부분을 마이크로 채널에서 분리하면, 설정 방향(예: 0°, 90°, 45°방향)으로 인코딩된 인코딩 자성입자(MEMP)가 제조된다.
도 4의 (a)는 서로 다른 축 방향의 정적 자기장을 사용하여 각기 다른 방향으로 정렬된 상태의 혼합 용액의 일부면에 마스크를 적용하여 UV 경화하는 모습을 나타낸다. 이를 통해, 각각 0°, 90°, 45°방향으로 정렬된 제1, 제2, 제3 유형의 인코딩 자성입자(10-1,10-2,10-3)가 각각 제조된다. 제1 유형의 경우, 가로 패턴, 제2 유형은 세로 패턴, 제3 유형은 대각선 패턴을 가진다. 물론 제4 유형의 나노 입자 역시 단일 방향으로 인코딩된 인코딩 자성입자에 해당하므로 위와 동일한 원리로 제조된다.
도 4의 (b)는 제5 유형의 인코딩 자성입자를 제작하는 원리를 나타낸다. 도 4의 (b)와 같이, 제5 유형의 인코딩 자성입자(10-5)는 서로 다른 방향으로 입자가 정렬된 복수의 나노입자 블록이 길이 방향으로 순차 나열된 구조를 갖는다. 이는 다중 방향으로 인코딩된 인코딩 자성입자에 해당한다.
도 4의 (c)는 여러 타입으로 제조된 막대형 인코딩 자성입자의 모습을 나타낸다. 이와 같이 본 발명은 인코딩 자성입자를 여러 타입으로 인코딩하여 제작할 수 있다.
다음은 도 4의 (b)를 참조하여, 혼합 패턴을 가진 제5 유형의 인코딩 자성입자를 인코딩하는 방법을 설명한다. 이러한 도 4의 (b)는 제1 유형(0°)과 제2 유형(90°방향)이 혼합된 구조를 갖는 인코딩 자성입자 제조 방법을 예시한다.
먼저, 마이크로 채널 내에 상기 혼합 용액이 주입된 상태에서 제1 방향으로 외부 자기장을 인가하여 혼합 용액 상의 초상자성 나노입자를 제1 방향으로 정렬한 다음, 혼합 용액의 제1 타겟 부위에 마스크를 배치한 상태에서 UV 경화하여 제1 나노입자 블록을 형성한다(도 4(b)의 좌측 그림).
여기서, 자기장 인가 방향은 자기장 발생 디바이스에 대한 마이크로 채널의 배치를 변경하는 것을 통해 조정할 수도 있고, 자기장 발생 디바이스에서 자기장 인가 방향을 직접 변경하는 것도 가능하다.
다음, 제2 방향으로 외부 자기장을 인가하여 혼합 용액 상의 초상자성 나노입자를 제2 방향으로 정렬한 다음, 제1 타겟 부위와 이웃한 제2 타겟 부위에 마스크를 배치한 상태에서 UV 경화하여 제2 나노입자 블록을 형성한다. 이에 따르면 먼저 경화된 제1 나노입자 블록 옆에 제2 나노입자 블록이 경화되면서 접합된 구조가 된다.
이후, UV 경화된 전체 블록 부분을 마이크로 채널에서 분리하여 다중 방향으로 인코딩된 인코딩 자성입자(10-5)를 제조한다. 이와 같이, 제5 유형의 인코딩 자성입자의 경우 서로 다른 방향으로 입자가 정렬된 적어도 두 개의 나노입자 블록(서로 다른 적어도 두 가지 패턴)이 길이 방향으로 순차 나열된 구조를 갖는다.
제5 유형은 N개(N은 2 이상)의 패턴이 직렬 연결된 구조이며, 제조 시 사용되는 마스크의 개구면 직경은 제1 유형에서 사용된 것과 대비하여 1/N의 크기를 가질 수 있다. 이를 통하여, 인코딩 자성입자의 제조 길이를 동일하게 할 수 있다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 다양한 인코딩 유형을 도시한 도면이다. 도 5에는 0°, 90°, 45°, 30°, 60°방향으로 정렬된 제1 내지 제4 유형의 인코딩 자성입자뿐만 아니라, 이들의 조합으로 구성된 혼합형의 제5 유형의 인코딩 자성입자를 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예에서, 서로 다른 유형으로 인코딩된 인코딩 자성입자 각각은 서로 다른 종류의 포획 항체가 접합된 상태에서 시료 내에 투입된다.
엑소좀 검출을 위해 인코딩 자성입자에 고정시키는 포획 항체는 Anti-PD-L1 (Anti-Programmed Death-Ligand 1), Anti-EpCAM (Anti-Epithelial cell adhesion molecule), Anti-EGFR (Anti- Epidermal growth factor receptor) 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있다. 물론, 포획 항체는 반드시 이에 한정되지 않으며 그 밖의 다양한 항체들이 포함될 수 있다.
또한, 검출 항체는 Anti-CD63-Biotin, Anti-CD81-Biotin, Anti-CD9-Biotin 중에서 적어도 하나 또는 3가지 항체의 혼합 항체물을 사용할 수 있다. 물론, 검출 항체는 반드시 이에 한정되지 않으며 그 밖의 다양한 항체들이 포함될 수 있다.
여기서, 포획 항체가 부착된 인코딩 자성입자는 시료에 함유된 특정 타겟 물질(엑소좀)과 반응하게 된다.
이때, 인코딩 자성입자 표면에서는 생체물질 간의 특이적 반응에 의한 결합을 위해, 엑소좀(Exosome) 표면 단백질-항체반응, 항원-항체반응, 아비딘(Avidin), 뉴트라아비딘(NeutrAvidin) 또는 스트렙트아비딘(StreptAvidin)-바이오틴(Biotin) 반응, 상보적 관계에 있는 DNA(complementary DNA), 면역글로불린 G(Immunoglobulin G)-단백질 A(Protein A), 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L 간의 반응 중 적어도 어느 하나가 이루어질 수 있다.
이러한 반응에 따라 시료 내에는 인코딩 자성입자-엑소좀 반응물이 생성된다. 또한, 각 유형의 인코딩 자성입자에 부착된 서로 다른 포획 항체는 서로 다른 특정한 타겟 물질(엑소좀)과 반응한다.
본 발명의 실시예에서 검출하고자 하는 타겟 물질은 세포로부터 유래한 엑소좀이 될 수 있다. 여기서, 엑소좀이 유래되는 세포는 normal embryonic kidney cell line (HEK293T), human breast cancer cell lines (MDA-MB231, MCF7), human colon cancer cell line (HCT 116), human melanoma cell line (SK-MEL-28) 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있다. 물론, 엑소좀이 유래되는 세포는 반드시 이에 한정되지 않으며 그 밖의 다양한 세포들이 포함될 수 있다.
여기서, 인코딩 자성입자를 시료에 투입하는 S210 단계 이후에는, 시료 내에 검출 항체 및 형광 물질을 순차로 투입하여 반응시키는 단계를 포함한다. 이러한 반응이 모두 완료되면 시료를 회전 자기장에 노출시켜 관측하는 S220 단계를 진행한다.
구체적으로, S210 단계 이후, 시료 내에 검출 항체를 투입하여 반응시킨다. 이에 따르면, 타겟 물질인 엑소좀이 검출 항체와 결합하면서 인코딩 자성입자-엑소좀-검출항체 반응물이 생성된다.
다음으로 시료 내에 형광물질을 투입하여 반응시킨다. 이에 따르면, 검출항체가 형광물질과 반응하여 형광물질이 부착된다. 결과적으로는 인코딩 자성입자에 형광 물질이 결합되게 된다. 이때, 형광 물질은 형광 물질이 부착된 스트렙트아비딘에 해당할 수 있다. 즉, 형광 물질은 엑소좀의 정량 분석을 위해 검출 항체-바이오틴과 결합할 수 있는 StreptAvidin-FITC를 사용할 수 있다.
이후, 영상 획득부(110)는 최종 반응이 완료되어 준비된 시료를 회전 자기장에 노출시킨 상태에서 시료를 촬영한 영상을 획득한다(S220). 예를 들어, 시료가 담긴 플레이트를 회전 자기장을 제공하는 자기장 발생 디바이스에 배치하고 설정 강도 조건의 회전 자기장을 인가하는 상태에서 시료의 영상을 촬영하고 획득한다.
최종 반응이 완료된 인코딩 자성입자가 회전 자기장에 노출되면, 자신의 인코딩 유형에 대응되는 고유의 회전 패턴으로 회전하게 되며, 이러한 회전 패턴을 분석하면 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 판별할 수 있다. 영상 획득부(110)는 획득한 촬영 영상을 디코딩부(120)로 전달한다.
디코딩부(120)는 딥러닝 알고리즘을 기반으로 영상 내 각 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 분석하여 각 인코딩 자성입자를 디코딩한다(S230).
구체적으로는, 쵤영한 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고, 딥러닝 알고리즘을 통해 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여, 각각의 인코딩 자성입자를 분류한다. 디코딩부(120)는 디코딩한 결과를 검출부(130)로 전달한다.
본 발명의 실시예에서는 ConvLSTM 신경망으로 구현된 딥러닝 모델을 사용한다. ConvLSTM 신경망은 입력된 시계열 이미지로부터 분석되는 각 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징을 이용하여 각각의 인코딩 자성입자를 디코딩할 수 있다.
다음으로, 검출부(130)는 영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 시료 내 복수 종류의 타겟 물질들을 다중 검출한다(S240).
이때, 검출부(130)는 디코딩 결과로부터 영상 내 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 식별하고, 식별된 유형 별로 각 인코딩 자성입자에 결합된 형광 물질의 세기를 분석하여 해당 유형에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정량 분석한다. 이때, 농도와 형광 물질의 세기 간의 관계 테이블, 함수, 그래프 등을 활용할 수 있다.
출력부(150)는 생체시료를 촬영한 영상, 영상을 구성한 각 프레임의 이미지, 생체 시료로부터 타겟 물질의 검출 여부, 검출 종류, 타겟 물질의 정량 분석 결과 등을 디스플레이 또는 네트워크 연결된 사용자 단말기 등을 통하여 출력하여 제공할 수 있다. 여기서 사용자 단말기는 데스크탑, 태블릿 PC, 스마트폰, 스마트 패드, 노트북 등을 포함할 수 있다.
이러한 본 발명의 실시예는 다중 엑소좀 검출 방법을 제공하며, 다중 엑소좀 검출 방법은, 인코딩 자성입자에 고정화된 포획 항체를 각각의 엑소좀과 반응시키는 단계, 인코딩 자성입자-엑소좀 반응물과 결합하도록, 바이오틴이 부착된 검출 항체를 시료에 투입하여 반응시키는 단계, 인코딩 자성입자-엑소좀-검출항체 반응물 상의 바이오틴과 반응하도록, 형광 물질이 부착된 스트렙트아비딘을 시료에 투입하여 반응시키는 단계, 최종 반응이 완성된 인코딩 자성입자를 외부 회전 자기장에 노출시켜 회전 영상을 획득하고 딥러닝 알고리즘으로 회전 패턴을 분석하여 디코딩하는 단계, 인코딩 자성입자에 결합된 형광물질의 세기를 검출하여 엑소좀의 농도를 정량 분석하는 단계를 포함한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 콘볼루션 특징의 시계열 분석 딥러닝 모델의 구조를 예시한 도면이다. 이러한 도 6은 딥러닝 기반의 인코딩 자성입자 분류 모델을 나타내며, 콘볼루션 신경망(Convolutional 신경망) 기반 인코딩 자성입자 특징 추출과 장단기 메모리 신경망(LSTM 신경망) 기반 시계열 분석이 결합된 구조로 구현된 것을 알 수 있다.
본 발명의 실시예에서 신경망의 학습에 사용되는 단위 영상의 길이는 5초이고, 5초 길이의 영상을 초당 30 프레임으로 샘플링하여 얻은 총 150개의 이미지를 ConvLSTM 신경망에 입력하여 학습하였다. 이때, H 760 × W 1200 크기의 원본 이미지를 H 244 × W 244 크기로 조정하여 신경망 학습에 적용하였다. 다음은 본 발명의 구체적인 실시예를 설명한다.
<실시예 1> 인코딩 자성입자 제작을 위한 칩 제작
초상자성 나노입자의 정렬에 의해 인코딩된 입자를 제조하기 위한 미세유체소자는 Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molding process로 제작되었다.
PDMS와 경화제를 10:1의 비율로 혼합하여 SU-8 포토레지스트리로 패터닝된 웨이퍼 몰드 위에 올리고, 80 ℃에서 40분간 가열하여 경화시켰다. 미세유체채널을 포함한 PDMS 소자를 떼어내 한 층의 PDMS가 깔린 커버글라스 위에 산소 플라즈마 처리를 통해 접합하였다.
<실시예 2> 인코딩 자성입자 제작
외부 정적 자기장 하에서 초상자성 나노입자는 자기장을 따라 사슬 모양의 구조를 형성하도록 정렬될 수 있다. 이러한 현상을 이용하여 여러 방향으로 정렬된 초상자성 나노입자 사슬로 인코딩된 입자를 제작하였다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 인코딩 자성입자의 제조 과정을 보여주는 도면이다.
먼저, 마이크로 채널(PDMS channel) 하부에 포토 마스크(MASK)를 정렬하여 부착시키고, 고분자 물질의 단량체와 초상자성 나노입자의 혼합 용액을 마이크로 채널에 채운 후, 마이크로 채널을 외부 자기장에 노출시킨다. 마이크로 채널은 평행 자기장을 발생하는 디바이스(device)에 세팅될 수 있다.
이때 디바이스는 UV 광이 투과 가능하도록 중앙부가 관통된 형태로 제작될 수 있다. 물론 디바이스가 투명 재질로 구현되면 별도의 관통 구멍이 생략될 수 있다.
외부 자기장을 형성하기 위하여, 자기장 발생 디바이스(device)의 도 3 및 도 7과 같이 양쪽에 네오디늄 자석(Neodymium magnet)을 배치하여, 양쪽 자석 사이에 평행 자기장을 만들 수 있도록 하였다. 여기서 자기장 발생 디바이스에 대한 마이크로 채널의 설치 방향을 변경하면, 다양한 유형으로 인코딩된 서로 다른 종류의 인코딩 자성입자가 제조될 수 있다.
UV경화형 고분자의 광중합을 위한 광학 장비로는 UV광원을 사용할 수 있고, 대물 렌즈로 구성된 광학 장비를 설정하였다. 초상자성 나노입자가 마이크로 채널에 정렬된 후 UV 광에 노출시키면, 포토마스크를 통해 투과된 UV광에 의해, 초상자성 나노입자를 포함하는 단량체 용액은 1초 만에 UV광에 의해 중합된다.
본 발명을 이용하면, 각각의 방향 사슬을 가진 인코딩 자성입자를 만들 수 있는데, 본 발명의 실시예에서는 가로(0°), 대각선(45°), 세로(90°)를 포함한 세 가지 방향으로 인코딩된 입자를 제작하였다. 제작된 인코딩 자성입자는 막대 형상을 가지며, 300㎛ × 100㎛ × 100㎛ 크기를 가진다.
<실시예 3> 인코딩 자성입자와 엑소좀 검출 항체 고정화 방법
인코딩 자성입자(MEMPs)에 항체를 접합시키기 위해 Bz(benzylamine hydrochloride)를 링커로 사용하여 광경화 프로세스(photoimmobilization process)를 적용하였다. Bz의 링커 기능을 확인하기 위해 Biotin과 형광 표지된 Streptavidin을 사용하였다. Bz(100μg/ml)과 Biotin (100μg/ml)을 혼합하고 혼합용액 100μl를 인코딩 자성입자와 함께 넣고 반응시켰다. 반응하는 동안 18 mW/cm2의 강도에서 20분 동안 UV 광원(λ = 365nm)를 20분 조사하였다. 반응 후 인코딩 자성입자를 세척하고, 잉여의 활성화된 Bz를 blocking하기 위해 인코딩 자성입자를 5% 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)이 포함된 PBS 용액에서 1 시간 incubation 한 다음 인코딩 자성입자를 PBS로 세척하였다.
인코딩 자성입자를 형광 표지된 Streptavidin (100μg/ml)과 실온에서 30분 동안 반응시키고, PBS로 세척하였다. 결합된 biotin과 형광 표지된(fluorescence-labeled) Streptavidin의 형광 이미지는 CCD가 장착된 형광 현미경으로 얻어 확인하였다. 엑소좀 다중 분석을 위해, 광경화 과정을 적용하여 포획 항체(capture antibodies)를 인코딩 자성입자와 결합했다. 20μg/ml (in PBS) 포획 항체 및 500μg/ml (in PBS) Bz를 사용하고, 포획 항체와 Bz 용액 및 각각의 인코딩 자성입자를 혼합하여 20분 동안 UV 광에 노출시킨 후 PBS로 세척하였다. 반응을 마친 인코딩 자성입자는 4℃에서 PBS에 보관되었다.
<실시예 4> 엑소좀 추출을 위한 세포 준비 및 엑소좀 추출
Normal embryonic kidney cell line (HEK293T), human breast cancer cell lines (MDA-MB231, MCF7), human colon cancer cell line (HCT 116), human melanoma cell line (SK-MEL-28)를 포함한 5 개의 세포주를 사용하여 엑소좀을 추출하였다.
HEK293T, MCF7 및 MDA-MB231 세포는 high-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium에서 배양되었으며, SK-MEL-28 세포는 Minimum Essential Medium에서, HCT116 세포는 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 모든 배양 배지에는 10% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone) 및 1% 항생제 항균제 (Hyclone)를 포함하고, 5% CO2가 포함된 37 ℃ 환경에서 배양되었다. FBS로부터의 간섭을 줄이기 위해, 세포(5 x 106개)를 PBS로 2회 세척하고 엑소좀 분리 전에 24시간 동안 무 혈청 배지 (FBS 없음)에서 배양하였다. 엑소좀을 분리하기 위해 5개의 세포주에서 얻은 각각의 상층액을 300g에서 5분, 2,500g에서 15분, 10,000g에서 30분 동안 연속적으로 원심 분리하여 세포, 세포 파편 및 미세 소포체를 순차적으로 제거하였다. 원심 분리 후 얻어진 상층액을 0.22μm의 주사기 필터로 여과하고 120,000g에서 90분간 원심 분리하였다. 모든 과정은 4°C에서 수행하였고, 최종적으로 얻은 엑소좀은 이후 사용을 위해 PBS에 보관하였다.
<실시예 5> 인코딩 자성입자의 분류 알고리즘 구현을 위한 딥러닝 모델 학습
초상자성 나노입자의 정렬 방향에 따라 표적 엑소좀 표면 단백질과 반응하는 항체를 접합하고, 인코딩 자성입자를 세포 유래 엑소좀과 반응시킨 후, 회전 자기장에 노출시켜, 각 유형의 인코딩 자성입자에 따라 서로 다른 회전 패턴이 나타남을 확인하였다. 각각의 인코딩 자성입자의 회전 동영상을 이용하여 가로, 세로, 대각선으로 형성된 인코딩 자성입자를 디코딩하기 위해 Convolutional LSTM 딥러닝 모델을 사용하였다.
딥러닝 모델을 학습시키기 위해 가로, 세로, 대각선 세가지 방향으로 정렬된 인코딩 자성입자의 회전 패턴 영상을 1시간 촬영하였다. 각 영상의 초당 frame 수를 계산하여 324,000개의 영상 이미지로 분할하여 원래 H 760 x W 1200 크기의 영상을 H 224 x W 224로 조절하였다. 모든 이미지의 평균과 표준 편차 값을 이용하여 이미지를 정규화하였고, 정규화된 영상을 5초 단위로 영상을 분할하여 2,160개의 회전 영상을 얻었다. 획득한 이미지의 90%는 학습 세트로, 10%는 테스트 세트로 분할 사용하여 반복 훈련을 진행하였다. 그 결과, 우선적으로 학습시켜 최적화된 모델은 인코딩 자성입자의 디코딩에 있어 100%의 정확도를 보였다. 이후 다양한 조건에 대한 성능 검증을 위해 다수의 10분 단위의 회전 영상을 추가하여 학습시켰고 그 결과 분류 정확도는 약 75%로 나타났다.
<실시예 6> 딥러닝을 이용한 인코딩 자성입자의 디코딩
도 8은 인코딩 유형 별 인코딩 자성입자를 캡쳐한 이미지를 예시한 도면이다. 도 8은 가로(0°), 세로(90°), 대각선(45°)을 포함한 세 가지 방향으로 인코딩된 입자에 대한 시간 별 이미지를 위에서부터 나열한 것이다.
인코딩 자성입자는 인코딩 유형 즉, 정렬 방향에 따라 특정한 움직임을 보여준다. 회전 패턴은 인코딩 자성입자가 회전 자기장에 노출되었을 때 초상자성 나노입자(SMNP)의 정렬에 따라 다르게 나타난다. 이 원리를 이용하여, 도 6과 같은 형태의 딥러닝 기반의 분류 모델을 구축하였고, 분류 모델을 기반으로 회전 패턴을 분석하여 인코딩 자성입자(MEMP)를 해독하고, 외부 단백질 검출에 대한 다중 분석을 수행하였다.
기존에는 입자 디코딩을 위한 추가 탐지 프로그램 또는 복잡한 장비가 필요하였지만, 본 발명의 실시예에서는 자기축이 있는 MEMP는 특정 장치 없이도 간단하게 디코딩이 가능하고 동시에 여러 대상에 대한 다중 분석이 가능하며, 인공지능 알고리즘을 통해 빠른 분석이 가능하다. 또한 디코딩에는 다중 색상 레이블이 필요하지 않으므로 탐지 프로세스가 더욱 간소화될 수 있다.
<실시예 7> 인코딩 자성입자를 이용한 엑소좀 검출 및 정량분석
엑소좀 표면 단백질과 반응할 수 있는 포획 항체 (PBS 내 20μg/ml, 80μl) anti-PD-L1, anti-EGFR, anti-EpCAM을 각각 가로 (0°), 대각선 (45°), 세로 (90°) 인코딩 자성입자에 접합시켰다. 각각의 포획 항체를 접합한 인코딩 자성입자를 실온에서 1시간 동안 엑소좀과 반응시킨 후, 엑소좀 표면의 CD63, CD81, CD9 마커와 반응할 수 있는 항체인 anti-CD63-biotin, anti-CD81-biotin, anti-CD9-biotin을 PBS 용액 내 20μg/ml의 농도로 제작한 혼합 용액에 실온에서 1시간 동안 반응하였다.
도 9는 서로 다른 포획 항체가 접합된 인코딩 자성입자 상의 엑소좀 농도별 형광 세기를 보여주는 도면이다. 이러한 도 9는 형광 현미경으로 촬영된 각 유형의 인코딩 자성입자에 대한 이미지로, MDA-MB231 세포에서의 anti-PD-L1, anti-EGFR, anti-EpCAM 항체를 사용하여 엑소좀 0 ~ 4.33 × 108 개/ml 농도 범위에서 인코딩 자성입자 상에서 반응한 형광 세기를 보여준다.
엑소좀 표면 단백질의 정량적 분석은 엑소좀 마커 단백질의 형광 신호 강도를 이용하여 계산하였고, 형광 강도와 각 노출 농도 사이에서 표준 곡선을 구했다. 이 표준 곡선은 엑소좀의 농도에 대한 형광 세기 사이의 관계로 얻어졌으며, 형광 세기는 인코딩 자성입자 크기에 대한 형광 세기 값으로 표준화하여 얻었다.
또한, 여러 세포주에서의 다중 분석을 위해 같은 방법으로 HEK293T, MCF7, SK-MEL-28, HCT116 세포에서 추출한 엑소좀을 이용하여 특정 농도의 엑소좀을 반응시켜 형광 세기 값을 얻었다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 서로 다른 포획항체를 포함하고 있는 인코딩 자성입자와 반응한 엑소좀 농도와 형광 세기 간의 관계를 도시한 도면이다. 이러한 표준 곡선을 이용하면, 타겟 물질인 엑소좀의 종류 별로, 이미지 내 형광 세기에 대응하는 농도 값을 얻을 수 있다.
<실시예 8> 엑소좀 다중 검출
다중 검출을 하기 위해서는 표적 단백질에 대한 높은 특이성 입증이 필요하다. 다중 분석 능력 확인을 위해, 하나의 생체시료 샘플에 대해 세 가지 유형의 인코딩 자성입자를 반응시켜 엑소좀 표면 단백질 PD-L1, EGFR, EpCAM의 동시 검출과 함께, 특정 포획 항체와 비 대응 엑소좀 간의 교차 반응을 조사하였다.
단백질 특이적 검출 신호는 인코딩 자성입자의 회전 패턴 분석과 형광 세기를 측정하여 분석하였다. 모든 인코딩 자성입자를 한꺼번에 엑소좀과 반응시킨 경우와 각각의 인코딩 자성입자를 개별적으로 엑소좀과 반응시킨 경우를 비교 분석한 결과, 3가지 인코딩 자성입자 간의 형광 세기에 있어 큰 차이가 없음을 확인하였고, 이를 통해 엑소좀 표면 단백질과 각각의 포획 항체 간의 교차 반응성이 없어 all-in-one 반응이 가능함을 확인하였다.
<실시예 9> 4가지 암세포 유래주 엑소좀 검출
도 11은 본 발명의 실시예에서 4가지 종류 세포주에서 유래한 고농도 및 저농도 엑소좀을 검출한 결과를 도시한 도면이다.
특이성이 다른 엑소좀별로 각각의 농도에 따라 구분이 가능한지를 확인하기 위해, 인코딩 자성입자를 사용하여 4가지 유형의 암세포에서 유래한 엑소좀의 고농도 및 저농도 엑소좀 분석을 진행하였다. 도 11A는 4종의 암세포(MDA-MB-231, MCF7, SKMEL28 및 HCT116)로부터 유래된 엑소좀의 사이즈 별 각 농도를 나타낸다. 실험을 위하여 MDA-MB-231, MCF7, SKMEL28 및 HCT116에서 유래한 엑소좀을 각각 고농도 엑소좀('H')과 저농도 엑소좀('L')으로 분류하였다.
먼저, MDA-MB-231, MCF7, SKMEL28 및 HCT116에서 유래한 고농도의 엑소좀을 적용하여 실험하였으며, 그 결과는 도 11 B-D과 같다. 이때, 암세포별 엑소좀의 표면 단백질의 발현량을 비교하기 위해, 측정에 사용된 암세포 유래 엑소좀의 농도는 거의 동일한 농도(약 1 × 108 개/ml)로 적정되어 사용되었다.
도 11 B-D은 4종의 암세포별 엑소좀 표면에 발현된 3가지 단백질 PD-L1, EpCAM, EGFR의 발현량을 나타낸 것이다. 이때, 그래프 상단에는 비교를 위하여 웨스턴 블랏(Western blot) 결과(샘플에서 검출된 단백질 별 농도를 정량화한 gold standard 데이터)를 함께 도시하였다. 검출된 엑소좀의 농도에 따른 형광 강도를 웨스턴 블랏과 비교한 결과, 세포별 엑소좀 표면에 발현된 단백질 PD-L1, EpCAM, EGFR의 발현량에 있어 두 방법(본 발명의 방법과 웨스턴 블랏) 간 높은 유사성을 보임을 검증할 수 있었고, 이를 통해 본 발명에서 개발한 인코딩 자성입자 기반의 검출시스템의 성능 정확도를 확인하였다.
다음, 각 암세포별 엑소좀의 농도별 구분을 확인하기 위해, MDA-MB-231, MCF7, SKMEL28 및 HCT116에서 각각 유래한 고농도 엑소좀('H') 및 저농도 엑소좀('L')을 이용하여 각각의 형광세기를 측정 및 비교하였으며, 실험 결과는 도 11 E-H를 참조한다. 그 결과 t-test를 통해 대부분의 경우 암세포의 엑소좀 농도(저농도/고농도)별로 엑소좀상 PD-L1, EpCAM, EGFR의 발현량이 명확히 구분되는 것으로 확인되었다. 즉, 저농도와 고농도 간 형광세기 차이가 큰 것이 관측된다. 다만, MCF7 세포주에서는 EGFR의 발현량이, SKMEL28 세포주에서는 EpCAM과 EGFR 발현량이 농도 별로 큰 차이를 보이지 않는 것으로 분석되었다.
<실시예 10> 임상 환자 혈액 내 엑소좀 검출
도 12는 본 발명의 실시예에서 정상인과 암 환자(폐암, 위암, 대장암, 유방암)의 혈액 내에 존재하는 엑소좀 검출 결과를 보여주는 도면이다.
인코딩 자성입자 기반의 검출시스템의 잠재적 임상 효용성을 테스트하기 위해 폐암 환자(LC) 20명, 위암 환자(SC) 10명, 대장암 환자(CC) 20명, 유방암 환자(BC) 20명의 혈장 검체와, 건강한 대조군(HC)인 정상인 10명의 혈장 검체 등 총 80명의 혈장 검체를 사용하여 분석하였다.
분석결과, 도 12 A-C와 같이, 건강한 대조군(정상인)의 혈장 내 존재하는 엑소좀에서는 PD-L1, EpCAM, EGFR 등의 단백질 발현량이 적게 나타났으나, 암 환자의 엑소좀 상 상기 단백질들의 발현량은 상대적으로 더 높은 것으로 측정되었다. 각각의 단백질별로 암 환자와 대조군 그룹을 성공적으로 분류하였으나, PD-L1의 경우에는 폐암 환자(LC)와 건강한 대조군(HC)을 구별하기 어려움을 확인하였다. 여기서, 별표 개수가 많을수록 건강한 대조군과 구별이 잘됨을 나타낸다.
또한, 도 12 D와 같이, 개발된 검출시스템의 암 종류별 검출능력을 확인하기 위해 Receiver Operating Characteristics(ROC) 분석법으로 검증한 결과, 폐암 환자 및 대조군의 AUC(Area Under Curve) 값에 있어, EpCAM과 EGFR의 경우에는 0.920과 0.975로 높은 검출 수준을 보였으나, PD-L1의 경우는 0.560으로 현저히 낮은 값으로 계산되었다. 그 외 나머지 암 환자와 건강한 대조군에서는 분명한 차이가 관찰되었다.
이상과 같은 본 발명에 따르면, 서로 다른 유형으로 인코딩된 인코딩 자성입자를 회전 자기장에 노출하여 촬영한 영상에서 각 인코딩 자성입자의 회전 패턴을 딥러닝 분석하여 서로 다른 유형의 인코딩 자성입자를 빠르고 정확하게 식별할 수 있고 식별 결과를 이용하여 영상에서 생체 시료 내의 서로 다른 종류의 타겟 물질을 동시 검출하고 정량 분석할 수 있다.
이러한 본 발명은 영상 내 검출되는 각 인코딩 자성입자의 종류를 딥러닝 기반의 디코딩을 통하여 식별하므로 암호화된 입자를 디코딩하기 위한 복잡한 특수 광학 장비를 전혀 필요로 하지 않음은 물론, 시료 분석 시간을 줄여서 질병과 관련한 엑소좀을 빠르게 검출하고 질병 진단 시간을 크게 단축할 수 있다.
본 발명은 도면에 도시된 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (14)

  1. 딥러닝 기반 디코딩을 이용한 다중검출 분석 장치를 이용한 생체 시료의 다중검출 분석 방법에 있어서,
    서로 다른 유형으로 인코딩된 복수의 인코딩 자성입자를 준비하여 분석대상 시료 내에 투입하는 단계;
    상기 시료를 회전 자기장에 노출시킨 상태에서 상기 시료를 촬영한 영상을 획득하는 단계;
    상기 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고 상기 딥러닝 알고리즘을 통해 상기 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여 각각의 인코딩 자성입자를 분류하는 단계; 및
    영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 상기 시료 내 복수 종류의 타겟 물질들을 다중 검출하는 단계를 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 복수의 인코딩 자성입자는 인코딩 유형 별로 서로 다른 종류의 타겟 물질과 반응하기 위한 서로 다른 포획 항체가 각각 부착되며,
    상기 다중검출 분석 방법은,
    상기 복수의 인코딩 자성입자가 투입된 시료 내에 상기 타겟 물질을 검출하기 위한 검출 항체 및 상기 검출 항체에 붙는 형광 물질을 순차로 투입하여 반응시키는 단계를 더 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 다중 검출하는 단계는,
    영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 영상 내 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 식별하고, 상기 식별된 유형 별로 상기 인코딩 자성입자에 결합된 상기 형광 물질의 세기를 분석하여 해당 유형에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정량화하는 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징은,
    상기 인코딩 자성입자의 회전 속도, 회전 주기, 연속 회전 여부, 회전 중 간헐적 정지 구간 발생 여부, 정지 구간의 발생 주기, 정지 구간의 시간 길이 중 적어도 하나를 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 딥러닝 알고리즘은,
    이미지 분석 및 시간 변이 정보를 학습하기 위한 콘볼루셔널 장단기 메모리 신경망(Convolutional LSTM)을 포함하여 구현된 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 인코딩 자성입자는,
    마이크로 채널 내에서 광경화 고분자 물질에 혼합된 초상자성 나노입자들이 외부 자기장에 따라 설정 방향으로 정렬된 상태에서 광 경화되어 막대 형상으로 제조되고,
    정렬 방향에 따라 서로 다른 유형으로 인코딩되는 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  7. 청구항 6에 있어서
    상기 인코딩 자성입자의 인코딩 유형은,
    상기 막대의 길이 방향인 가로 방향(0°)으로 입자가 정렬된 제1 유형,
    세로 방향(90°)으로 입자가 정렬된 제2 유형,
    대각 방향(45°)으로 입자가 정렬된 제3 유형,
    45°를 제외한 0°와 90°사이의 방향으로 입자가 정렬된 제4 유형, 그리고
    서로 다른 방향으로 입자가 정렬된 복수의 나노입자 블록이 길이 방향으로 순차 나열된 구조의 제5 유형을 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 방법.
  8. 서로 다른 유형으로 인코딩된 복수의 인코딩 자성입자가 투입되어 준비된 분석대상 시료에 회전 자기장이 인가된 상태에서 상기 시료를 촬영한 영상을 획득하는 영상 획득부;
    상기 영상에 포함된 시계열 이미지를 기 학습된 딥러닝 알고리즘에 입력하고 상기 딥러닝 알고리즘을 통해 상기 영상 내 각 인코딩 자성입자의 시간에 따른 회전 패턴 특징을 분석하여 각각의 인코딩 자성입자를 분류하는 디코딩부; 및
    영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 상기 시료 내 복수 종류의 타겟 물질들을 다중 검출하는 검출부를 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 복수의 인코딩 자성입자는 인코딩 유형 별로 서로 다른 종류의 타겟 물질과 반응하기 위한 서로 다른 포획 항체가 각각 부착되며,
    상기 복수의 인코딩 자성입자가 투입된 시료 내에는 상기 회전 자기장 인가 전에 상기 타겟 물질을 검출하기 위한 검출 항체 및 상기 검출 항체에 붙는 형광 물질이 순차로 투입되어 반응이 이루어지는 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 검출부는,
    영상 내 각 인코딩 자성입자의 분류 결과를 기반으로 영상 내 각 인코딩 자성입자의 인코딩 유형을 식별하고, 상기 식별된 유형 별로 상기 인코딩 자성입자에 결합된 상기 형광 물질의 세기를 분석하여 해당 유형에 대응하는 타겟 물질의 농도를 정량화하는 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 인코딩 자성입자의 회전 패턴 특징은,
    상기 인코딩 자성입자의 회전 속도, 회전 주기, 연속 회전 여부, 회전 중 간헐적 정지 구간 발생 여부, 정지 구간의 발생 주기, 정지 구간의 시간 길이 중 적어도 하나를 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 딥러닝 알고리즘은,
    이미지 분석 및 시간 변이 정보를 학습하기 위한 콘볼루셔널 장단기 메모리 신경망(Convolutional LSTM)을 포함하여 구현된 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
  13. 청구항 8에 있어서,
    상기 인코딩 자성입자는,
    마이크로 채널 내에서 광경화 고분자 물질에 혼합된 초상자성 나노입자들이 외부 자기장에 따라 설정 방향으로 정렬된 상태에서 광 경화되어 막대 형상으로 제조되고,
    정렬 방향에 따라 서로 다른 유형으로 인코딩되는 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
  14. 청구항 13에 있어서
    상기 인코딩 자성입자의 인코딩 유형은,
    상기 막대의 길이 방향인 가로 방향(0°)으로 입자가 정렬된 제1 유형,
    세로 방향(90°)으로 입자가 정렬된 제2 유형,
    대각 방향(45°)으로 입자가 정렬된 제3 유형,
    45°를 제외한 0°와 90°사이의 방향으로 입자가 정렬된 제4 유형, 그리고
    서로 다른 방향으로 입자가 정렬된 복수의 나노입자 블록이 길이 방향으로 순차 나열된 구조의 제5 유형을 포함하는 생체 시료의 다중검출 분석 장치.
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