WO2023013175A1 - ポルフィリンを含むカチオンポリマーおよびそれを含む組織マーキング剤、および光増感剤 - Google Patents

ポルフィリンを含むカチオンポリマーおよびそれを含む組織マーキング剤、および光増感剤 Download PDF

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WO2023013175A1
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carbon atoms
group
copolymer
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tissue
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徹 吉冨
国平 陳
直輝 川添
裕史 松井
義希 小松
欽司 古屋
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国立研究開発法人物質・材料研究機構
国立大学法人 筑波大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/34—Esters containing nitrogen, e.g. N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate
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    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
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    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups

Definitions

  • the present invention relates to a copolymer containing a repeating unit having a quaternary ammonium cation and a repeating unit having a porphyrin compound or a salt thereof, a tissue marking agent and a photosensitizer containing the same, and methods for producing them.
  • gastrointestinal cancer is usually located inside the gastrointestinal tract, and there is a need for a marking method that can recognize the tumor site from outside the gastrointestinal tract.
  • Non-Patent Document 1 when performing surgery for gastrointestinal cancer, an endoscope is used to inject ink into the tumor site (the tattoo method) prior to surgery, or a clip having a site that develops color with a fluorescent dye or the like is placed to was marked (see Non-Patent Document 1).
  • marking with ink is difficult to distinguish from the color of the tissue and has poor visibility, and it is also difficult to recognize the tumor site from the outside of the gastrointestinal tract.
  • the injected ink diffuses in a short period of time, it is difficult to determine the boundary between the tumor site and normal tissue.
  • the injection of the marking agent must be performed one day before the operation at the latest, and there is also the problem that the scheduling of the operation becomes difficult.
  • Non-Patent Document 2 In response to the problems of the inking method and the clipping method, a method has been proposed in which indocyanine green (ICG) is injected into the submucosa just below the rectal cancer tumor site before surgery to mark the tumor site.
  • ICG indocyanine green
  • Non-Patent Document 2 According to this method, by irradiating near-infrared rays, it becomes possible to recognize the tumor site from outside the digestive tract, and there are no problems associated with the clipping method. However, even in this method, there is still a problem that the fluorescence region varies due to dye diffusion and the separation line becomes unclear (see discussion in Non-Patent Document 2).
  • a marking preparation for marking a site to be resected preoperatively contains a dye such as methylene blue and a thickening agent (Patent Document 1).
  • a marking preparation for marking a site to be resected preoperatively contains a dye such as methylene blue and a thickening agent (Patent Document 1).
  • dyes such as methylene blue are used to clearly distinguish between the marking site and tissue or blood. Also, it is intended to suppress the diffusion of the dye.
  • this marking preparation since the dye is not bound to the tumor site, the anti-diffusion effect is temporary and the dye diffuses in a relatively short time.
  • this marking preparation does not use a fluorescent dye with the application to breast cancer in mind, and cannot recognize the tumor site from the outside of the tissue when applied to gastrointestinal cancer or the like.
  • a photosensitizer is administered into the blood vessels of a cancer patient, allowed to accumulate in cancer or tumor tissue, and irradiated with light of a specific wavelength to generate active oxygen to specifically target only cancer cells.
  • Killing photodynamic therapy has been developed.
  • PDT is a minimally invasive cancer therapy that can selectively kill only tumor cells by photochemical reaction, and is usually performed by intravascular administration to diffuse a photosensitizer throughout the body. For this reason, patients undergoing PDT are required to be strictly restricted from light exposure, and there is concern that the patient's QOL will be lowered.
  • Porphyrin derivatives are known as photosensitizers used in PDT, and polyhematoporphyrin ether and talaporphyrin sodium have already been put to practical use. Considering the patient's QOL, there is a demand for photosensitizers that can be localized by topical administration and that are used in as small amounts as possible. In addition, for physicians and patients, photosensitizers with greater therapeutic effects from a single administration are desired.
  • the present invention provides clear and accurate marking of a target site (typically a tumor site) over a relatively long period of time when used for marking a specific site of living tissue.
  • the present invention provides a copolymer, a method for producing the same, and a tissue marking agent containing the copolymer, which enable the site to be confirmed from the outside of the tissue.
  • the present invention also provides a photosensitizer that locally remains in cancer tissue for a long period of time by local administration.
  • the present inventors have found that a copolymer containing a structural unit having a quaternary ammonium cation and a structural unit having a porphyrin or its salt binds to the tissue site when topically administered and provides the desired effect over a relatively long period of time. We have found that it is possible to mark the site and to confirm the target site from the outside of the tissue. In addition, the present inventors have conceived of using the properties of this copolymer in PDT, and by locally administering a photosensitizer to the target tissue (typically cancer tissue), It has been found that the photosensitizer can be left locally for a long period of time, thereby enabling more effective PDT to be performed.
  • a photosensitizer typically cancer tissue
  • the present invention is based on such findings, and provides the following copolymers, methods for producing the same, and tissue marking agents and photosensitizers containing the copolymers.
  • R 1 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • the porphyrin compound is mesoporphyrin, deuteroporphyrin, hematoporphyrin, protoporphyrin, uroporphyrin, coproporphyrin, cytoporphyrin, rhodoporphyrin, pyroporphyrin, phylloporphyrin; heptacarboxyporphyrin, hexacarboxyporphyrin, pentacarboxyporphyrin and salts of these porphyrins, the copolymer according to any one of [1] to [5].
  • R 1 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms;
  • R 2 , R 3 and R 4 each independently represent a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms,
  • L 2 represents a linear or branched alkylene having 1 to 5 carbon atoms,
  • L 4 represents a linear or branched alkylene having 1 to 5 carbon atoms,
  • the copolymer according to any one of [1] to [6].
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 represent —CH 3 ;
  • L 1 represents -O-,
  • L 3 represents -NH-,
  • L 2 represents -CH 2 -CH 2 -,
  • L 4 represents -CH 2 -CH 2 -CH 2 -,
  • X represents Cl
  • the porphyrin compound is hematoporphyrin dihydrochloride,
  • the copolymer according to any one of [1] to [9] which has a molecular weight (MW) of 1,000 to 100,000.
  • a tissue marking agent comprising the copolymer according to any one of [1] to [10].
  • the tissue marking agent of [11] which is an aqueous solution.
  • the tissue marking agent of [11] or [12] for marking a local part of the gastrointestinal tract.
  • the tissue marking agent according to [13] for marking a part of the gastrointestinal tract extending from the stomach wall to the rectum.
  • a photosensitizer for photodynamic therapy comprising the copolymer of any one of [1] to [10].
  • the photosensitizer according to [16] which is an aqueous solution.
  • a pharmaceutical composition comprising the copolymer of any one of [1] to [10].
  • the tissue marking agent of [11] is locally administered to a target tissue site (typically a tumor site), and the tissue site is irradiated with ultraviolet light having a predetermined wavelength (for example, a wavelength of 350 nm to 420 nm).
  • a method of marking tissue comprising exciting a tissue marking agent with a force.
  • the tissue marking agent of [21] wherein the tissue marking agent is an aqueous solution.
  • [29] Use of the copolymer according to any one of [1] to [10] for preparing a tissue marking agent.
  • the tissue marking agent is an aqueous solution.
  • the tissue marking agent is used to mark a localized part of the gastrointestinal tract.
  • the tissue marking agent is used to mark a part of the gastrointestinal tract extending from the stomach wall to the rectum.
  • the marking is performed for laparoscopic gastrointestinal surgery.
  • [34] Use of the copolymer according to any one of [1] to [10] for preparing a photosensitizer for photodynamic therapy. [35] The use according to [34], wherein the photosensitizer is an aqueous solution. [36] Use of the photosensitizer of [16] for preparing a photodynamic therapy medicament. [37] The use of [36], wherein the medicament is for treating cancer. [38] The use of [37], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
  • the porphyrin compounds include mesoporphyrin, deuteroporphyrin, hematoporphyrin, protoporphyrin, uroporphyrin, coproporphyrin, cytoporphyrin, rhodoporphyrin, pyroporphyrin, phylloporphyrin; heptacarboxyporphyrin, hexacarboxyporphyrin and pentacarboxyporphyrin.
  • the production method according to [39] which is selected from the group consisting of alkylcarboxyporphyrins such as porphyrins, and salts of these porphyrins.
  • the copolymer of the present invention exhibits excellent binding properties to living tissue due to the positive charge derived from the structural unit having a quaternary ammonium cation, and does not diffuse after being injected into the tissue, and stays on for a week or more.
  • a target site can be marked pinpointed over a period of time. In particular, since it always has a positive charge even under various pH conditions, it exhibits excellent binding properties even in biological tissues with various pH environments. Accurate marking over a long period of time.
  • the marking site can be clearly visible from the outside of the tissue by UV irradiation due to the structural unit having the porphyrin compound or its salt.
  • the copolymer of the present invention localizes in target tissues such as cancer tissues for a long period of time and exhibits a high antitumor effect upon laser irradiation. Therefore, the systemic diffusion of the photosensitizer is greatly reduced, the dosage of the photosensitizer required for PDT treatment can be greatly reduced, and the burden on the patient associated with PDT is greatly reduced. It is expected.
  • a single administration of the photosensitizer allows PDT to be performed for a relatively long period of time, increasing the therapeutic effect obtained from a single administration.
  • Example 1 shows chromatograms obtained by subjecting the copolymer PMETAC-co-PAPMAA (HpD) and hematoporphyrin dihydrochloride (HpD) obtained in Example 1 to gel chromatography.
  • the excitation wavelength is 400 nm and the fluorescence wavelength is 635 nm.
  • the solid line is the chromatogram of the copolymer PMETAC-co-PAPMAA (HpD) obtained in Example 1, and the dotted line is the chromatogram of hematoporphyrin dihydrochloride (HpD).
  • the vertical axis indicates fluorescence intensity, and the horizontal axis indicates elution time.
  • Example 1 shows the fluorescence spectrum of the copolymer PMETAC-co-PAPMAA (HpD) obtained in Example 1 when excited at 365 nm.
  • 2 shows an absorption spectrum of the copolymer PMETAC-co-PAPMAA (HpD) (concentration: 0.25 mg/mL) obtained in Example 1.
  • FIG. Absorption spectrum of 10 ⁇ M hematoporphyrin dihydrochloride (HpD) is shown. After local injection of the marking agents of Example 2 and Comparative Example 1 into the mucosal side of the swine large intestine tissue, marking of the injection site from the serosal side (outer side of the gastrointestinal tract) and the mucosal side (inner side of the gastrointestinal tract). A photograph of the condition.
  • the photograph on the left is a photograph showing a state in which the marking agent of Comparative Example 1 was locally injected into the mucosa side of the large intestine tissue
  • the second photograph from the left is a photograph showing the state in which the marking agent of Comparative Example 1 was locally injected into the serosal membrane. It is a photograph seen from the side (outside of the gastrointestinal tract).
  • the third photograph from the left is a photograph showing a state in which the marking agent of Example 2 was locally injected into the mucosa side of the large intestine tissue
  • the second photograph from the right is a state in which the marking agent of Example 2 was locally injected.
  • FIG. 1 shows photographs taken one week after local injection of the marking agents of Comparative Example 2 and Example 2 into the anterior gastric wall of rats and irradiation with ultraviolet rays of 365 nm. White arrows indicate local injection sites. In the photograph with the fluorescence filter, the fluorescence of porphyrin is displayed in white.
  • 2 is a graph showing daily changes in body weight of rats after intraperitoneal injection of the marking agent of Comparative Example 2 and the marking agent of Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing daily changes in ALT, AST, CRE and BUN in rat blood after intraperitoneal injection of the marking agent of Comparative Example 2 and the marking agent of Example 2, respectively.
  • a PBS-administered group was used as a control.
  • FIG. 1 shows a photograph of confirmation of adhesion state of the intestinal tract one week after intraperitoneal injection of the marking agent of Comparative Example 2 and the marking agent of Example 2.
  • FIG. A PBS-administered group was used as a control.
  • 1 is a graph showing the residual state of each photosensitizer over time after administration of the photosensitizers of Example 3 and Comparative Example 3 to cancer tissue in Colon26 tumor-bearing mice. The residual state of the photosensitizer was evaluated by measuring the photosensitizer-based fluorescence from the cancer tissue.
  • FIG. 11(A) shows the change over time in fluorescence intensity from cancer tissue without red visible light irradiation
  • FIG. 11(B) shows that with red visible light irradiation.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in size of cancer tissue in Colon26 tumor-bearing mice when PDT therapy was performed using the photosensitizers of Example 3 and Comparative Example 3 in Colon26 tumor-bearing mice.
  • As a comparative control the change in the size of cancer tissue when the photosensitizers of Example 3 and Comparative Example 3 were administered without irradiation with red visible light is also shown.
  • the copolymer of the present invention (sometimes simply referred to as "copolymer") contains at least a repeating unit represented by formula (I) and a repeating unit represented by formula (II) below.
  • R 1 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 1 and R 5 preferably each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably each independently a hydrogen atom or a carbon represents a linear alkyl group of numbers 1 to 3;
  • R 2 , R 3 and R 4 are preferably each independently a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a cycloalkyl group having 5 to 6 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 7 to 8 carbon atoms.
  • An aralkyl group, or a group of the formula R 6 —C( O)— (wherein R 6 is an OH group, a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a linear or a branched alkoxyl group, or an unsubstituted amino group).
  • R 2 , R 3 and R 4 more preferably each independently represent a linear alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • L 1 is preferably O.
  • L3 is also preferably NH.
  • L 2 and L 4 are more preferably each independently a divalent linear aliphatic hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms or a divalent branched aliphatic hydrocarbon group having 3 to 5 carbon atoms group, particularly preferably a divalent linear aliphatic hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms.
  • a porphyrin compound is an organic compound having a cyclic structure formed by combining four pyrroles called porphine. , rhodoporphyrin, pyroporphyrin, phylloporphyrin, or alkylcarboxyporphyrin such as heptacarboxyporphyrin, hexacarboxyporphyrin, pentacarboxyporphyrin (preferably C1-10 alkyl carboxyporphyrin, more preferably C3-8 alkyl carboxyporphyrin), etc. can.
  • Salts of the porphyrin compounds include acid addition salts and base addition salts.
  • Acid addition salts include inorganic acid salts and organic acid salts.
  • examples of inorganic acid salts include salts derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid.
  • organic acid salts include, for example, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, oxalic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, etc. Salts derived from organic acids are included. Base addition salts also include inorganic and organic base salts.
  • Inorganic base salts include, for example, salts derived from inorganic bases such as sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum and the like.
  • organic base salts include salts derived from organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, trifluoroacetyl and ethanolamine.
  • the porphyrin compound is preferably hematoporphyrin, which has been practically used as a photosensitizer and has been confirmed to be safe. Further, assuming that the copolymer of the present invention is used as a marking agent by injection into a predetermined tissue, it is preferable that the copolymer of the present invention is water-soluble, and in that respect Z is preferably a salt of a porphyrin compound.
  • the salt is preferably an acid addition salt, more preferably an inorganic acid salt such as hydrochloride.
  • Anions represented by X- include inorganic anions and organic anions.
  • inorganic anions include fluorine anions, chlorine anions, bromine anions, iodine anions, and hydroxy anions.
  • Organic anions include: For example, an alkoxy anion having 1 to 4 carbon atoms, a carboxy anion, an alkyl carboxy anion having 2 to 5 carbon atoms, a hydrogen carbonate anion and the like can be mentioned.
  • the copolymer may have repeating units other than those of formula (I) and formula (II), and may include, for example, repeating units in which Z is H in formula (II). Further, the copolymer may be a random copolymer, an alternating copolymer, or a block copolymer (diblock, triblock, or multiblock).
  • the number of repeating units represented by the formula (II) in the copolymer is such that when the copolymer is used as a marking agent, the desired fluorescence intensity can be obtained and the marking agent can be obtained as an aqueous solution.
  • a predetermined range is preferred from the viewpoint of reducing aggregation between polymers.
  • the ratio of the number of repeating units represented by formula (II) to the total number of all repeating units in the copolymer is preferably 0.01 to 50%, and preferably 1 to 30%. is more preferred, and 2 to 20% is particularly preferred.
  • the ratio of the number of repeating units represented by formula (II) to the number of repeating units represented by formula (I) ((II)/(I)) is 1 from the viewpoint of similar points and tissue adhesion. /100000 to 1/1, more preferably 1/1000 to 1/1, more preferably 1/100 to 1/2, and 1/70 to 1/10 is more preferred.
  • a copolymer according to a preferred embodiment of the present invention has 1 to 10 repeating units represented by formula (II) in the copolymer, and a copolymer according to a more preferred embodiment has 1 to 5 and copolymers according to more preferred embodiments have one or two. Although it depends on the structure of the porphyrin moiety, when the number of porphyrin moieties in the copolymer increases, the copolymer becomes hydrophobic and does not dissolve in water. It can get stronger. Interestingly, the copolymer having a smaller number of porphyrin moieties contained in the copolymer emits stronger fluorescence and has one or two repeating units represented by formula (II). A strong fluorescence intensity was confirmed in the polymer.
  • the ratio of the number of repeating units represented by formula (II) to the total number of all repeating units of the copolymer, and the number of repeating units represented by formula (II) and formula (I) is determined by the 1 H NMR method. More specifically, the above ratio is calculated by dissolving the copolymer in heavy methanol or heavy water, measuring 1 H NMR, and analyzing the integral value of protons derived from side chains. Also, the term "water-soluble” is used herein to mean that the corresponding substance exhibits a solubility of at least 1 g/l in pure water.
  • the copolymers of the invention preferably exhibit a solubility of at least 5 g/l, more preferably of at least 10 g/l and particularly preferably of at least 100 g/l.
  • the copolymers are not particularly limited as to molecular weight (MW), and may have, for example, molecular weights (MW) of 300-1,000,000. However, since the molecular weight of the copolymer is one of the factors that can affect properties such as water solubility and viscosity, it is preferably 1,000 to 100,000, more preferably 5,000 to 70,000, considering its use as a marking agent. . As used herein, "molecular weight” refers to weight average molecular weight (Mw) unless otherwise specified. Moreover, both the weight average molecular weight (Mw) and the number average molecular weight (Mn) in the present specification mean values measured by gel filtration chromatography under the following conditions.
  • Measuring device Shimadzu 20AD Column: TSK gel G3000PW and G5000PW columns Eluent: 0.5 M acetic acid aqueous solution (containing 20 mM tetramethylammonium hydroxide pentahydrate) Standard substance: polyethylene glycol Flow rate: 0.5 mL/min
  • the copolymer of the present invention is Reaction Step 1: Formula (IA) and Formula (IIA) (wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , L 1 , L 3 , L 2 , L 4 and X have the same definitions as described for formula (I) or (II)); , preferred and more preferred (further preferred, etc.) options are also as described above.) and reaction step 2: the polymer obtained in reaction step 1 (hereinafter sometimes referred to as an intermediate polymer) is reacted with a porphyrin compound.
  • the polymerization reaction of the compounds of the formulas (IA) and (IIA) is carried out by reacting a mixture of the compounds of the formulas (IA) and (IIA), a thermal polymerization initiator and a solvent. Also, this polymerization reaction can be carried out, for example, at 70° C. under an inert atmosphere such as nitrogen for 20 hours.
  • the mixing ratio of the compound of formula (IIA) to the compound of formula (IA) ((IIA)/(IA)) is the predetermined ratio of repeating units (I) to all repeating units and repeating units (I) and ( II) is preferably adjusted according to the composition ratio, but usually it can be in the range of 1/1000 to 1/2.
  • Structural control such as random copolymers, alternating copolymers, and block copolymers may be carried out by methods generally known in the production of copolymers.
  • thermal polymerization initiators include water-soluble radical generators such as 4,4′-azobis(4-cyanovaleric acid).
  • the solvent include water, ethanol, and a mixed solvent of water and ethanol.
  • Compounds of formula (IA) and formula (IIA) can be commercially available compounds, for example, available from Sigma-Aldrich Co., Ltd. or Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • the polymer synthesized in reaction step 1 is purified by dialysis using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 1000 to 100000 depending on the desired molecular weight distribution.
  • Reaction step 2 By reacting the polymer obtained in reaction step 1 with a porphyrin compound or a salt thereof, porphyrin can be introduced into the amino group of the repeating unit derived from the compound of formula (IIA) in the polymer.
  • Introduction of porphyrin into the intermediate polymer is carried out, for example, by reacting a mixture of the intermediate polymer, a porphyrin compound or a salt thereof, and a condensing agent in a buffer of pH 6-8 for 1-24 hours. can be done.
  • the mixing ratio of the intermediate polymer and the porphyrin compound or its salt is preferably adjusted according to the planned introduction amount of the porphyrin compound or its salt.
  • the amount can be 2 to 20 times the number of moles, and from the viewpoint of production cost, the amount is preferably 2 to 5 times the number of moles.
  • condensing agents include N-hydroxysuccinimide and water-soluble carbodiimide hydrochloride.
  • the copolymer of the present invention can be used as a tissue marking agent, and can locally mark living tissue.
  • the copolymer is water-soluble, and a solution obtained by dissolving the copolymer in pure water, physiological saline, buffer solution, or the like can be used as the tissue marking agent.
  • the tissue marking agent of the present invention may also contain various additives as long as they do not have a negative charge.
  • the concentration of the copolymer in the solution is usually 0.1 mg/mL to 100 mg/mL, preferably 1 mg/mL to 10 mg/mL.
  • Such a solution can be locally injected into a tissue to mark a specific site, and the injection method is not particularly limited and may be a well-known and commonly used method.
  • the injection site is irradiated with ultraviolet light, preferably ultraviolet light having a wavelength of 350 nm to 370 nm, to excite the marking agent and generate fluorescence, thereby confirming the injection site.
  • the copolymer of the present invention contains repeating units having quaternary ammonium cations, it always has a positive charge under various pH conditions. For this reason, it has excellent binding properties to all of various tissues having different pH environments, particularly the digestive tract having various pH environments, more specifically the digestive tract from the stomach wall to the rectum. Suitable for marking local areas.
  • the copolymer of the present invention derives from the repeating unit having a porphyrin skeleton and emits fluorescence when irradiated with UV, so that a specific site can be easily and clearly visualized from the outside of the tissue.
  • the tissue marking agent of the present invention has the advantage that the site to be excised can be confirmed from the outside of the tissue prior to laparoscopic gastrointestinal surgery.
  • the schedule from the injection of the marking agent to the surgical excision of the marked tissue can be determined relatively flexibly. can be done.
  • side effects such as adhesion do not occur after injection into tissue, and a highly safe marking agent is provided.
  • the copolymer of the present invention can also be used as a photosensitizer in PDT therapy, and can be used when performing PDT therapy on a target tissue (for example, cancer tissue).
  • a target tissue for example, cancer tissue
  • the present invention provides pharmaceutical compositions, especially pharmaceutical compositions for treating cancer, comprising the copolymers of the invention.
  • the copolymer is water-soluble, and a solution obtained by dissolving the copolymer in pure water, physiological saline, buffer solution, or the like can be used as the photosensitizer.
  • the photosensitizers and pharmaceutical compositions in solution may also contain various additives provided they do not have a negative charge.
  • the concentration of the copolymer in the solution is usually 0.1 mg/mL to 100 mg/mL, preferably 1 mg/mL to 10 mg/mL.
  • Such a solution is locally injected into the tissue of interest (eg, cancer tissue) using, for example, a gastroscope, colonoscope, bronchoscope, etc., and then into the tissue of interest at a predetermined wavelength (eg, 630 nm to 630 nm).
  • a laser beam usually red visible light
  • a wavelength of 660 nm is irradiated, thereby causing a photochemical reaction in the copolymer of the present invention, generating active oxygen, and degenerating and necrotic cancer cells.
  • the copolymer of the present invention is derived from a repeating unit having a porphyrin skeleton, and denatures and necrotizes target tissue (for example, tumor tissue) upon irradiation with red visible light.
  • the copolymers of the present invention also contain repeating units with quaternary ammonium cations and therefore always have a positive charge under various pH conditions. For this reason, it has excellent binding properties to all various tissues (including various cancer tissues) having different pH environments, particularly the gastrointestinal tract having various pH environments, more specifically the stomach wall. Suitable for PDT of specific tissues (eg, cancer tissues) of the gastrointestinal tract extending to the rectum.
  • Repeating units with quaternary ammonium cations also allow the copolymers of the present invention to be locally maintained in cancer tissue for long periods of time when administered locally to cancer tissue.
  • the systemic diffusion of the photosensitizer is greatly reduced, and PDT therapy with greater therapeutic effect can be performed with a single administration of a small amount of the photosensitizer. This is expected to bring about a high therapeutic effect by PDT therapy without lowering the patient's QOL.
  • thermal polymerization initiator 10 mg of 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA, manufactured by Sigma-Aldrich), 50 mg of APMAA (manufactured by Sigma-Aldrich), METAC (Sigma-Aldrich) Co., Ltd.) and a mixed solvent of water and ethanol were added to a 2 mL flask, and after nitrogen bubbling, polymerization was carried out at 70° C. for 20 hours under nitrogen (above, reaction step 1).
  • ACVA 4,4'-azobis(4-cyanovaleric acid)
  • APMAA manufactured by Sigma-Aldrich
  • METAC Sigma-Aldrich
  • FIG. 2 shows the fluorescence spectrum of PMETAC-co-PAPMAA (HpD) obtained in Example 1. Similar to small molecule HpD, fluorescence signals were observed at 600-700 nm when excited at 365 nm.
  • FIG. 3 shows the absorption spectrum of the copolymer PMETAC-co-PAPMAA (HpD) obtained in Example 1
  • FIG. 4 shows the absorption spectrum of the low molecular weight hematoporphyrin dihydrochloride (HpD).
  • a calibration curve is prepared using the absorbance of low-molecular-weight HpD at 400 nm, and from the number average molecular weight (Mn) of the copolymer (PMETAC-co-PAPMAA), the total number of all repeating units of the copolymer, repeating units
  • Mn number average molecular weight
  • PMETAC-co-PAPMAA the number average molecular weight of the copolymer
  • the ratio was 1 to 2%
  • the composition ratio of PAPMAA (HpD) to PMETAC PAPMAA (HpD)/PMETAC
  • Example 2 PMETAC-co-PAPMAA (HpD) obtained in Example 1 was dissolved in pure water to prepare an aqueous solution of 5 mg/ml (200 ⁇ M in terms of HpD) as a marking agent.
  • Example 1 India ink (manufactured by Kaimei Co., Ltd.), which is used in clinical practice, was used as it was as a marking agent for comparison.
  • Comparative example 2 Hematoporphyrin dihydrochloride (HpD, manufactured by MedChem Express Company) was dissolved in pure water to prepare a 200 ⁇ M aqueous solution as a marking agent.
  • the boundary between the injection site and the surrounding tissue could not be clearly determined.
  • the marking agent of Example 2 was irradiated with ultraviolet light, the injection site could be clearly confirmed from the serosal side (outside the digestive tract), and the boundary between the injection site and the surrounding tissue could also be clearly determined. rice field.
  • Tissue marking agents for the gastrointestinal tract are administered locally using an endoscope, so they may leak into the peritoneal cavity during marking. Therefore, the tissue marking agent should be safe even if it leaks into the abdominal cavity. Therefore, the safety of the tissue marking agent of Example 2 when it leaked into the abdominal cavity was confirmed.
  • 100 ⁇ L each of PBS, the marking agent of Comparative Example 2, and the marking agent of Example 2 were intraperitoneally administered to 6-week-old Wistar male rats, and the body weight of each rat was monitored daily.
  • AST Aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • BUN urea nitrogen
  • CRE creatinine
  • Example 3 PMETAC-co-PAPMAA (HpD) obtained in Example 1 was dissolved in pure water to prepare an aqueous solution of 5 mg/ml (200 ⁇ M in terms of HpD) as a photosensitizer.
  • Comparative Example 3 Hematoporphyrin dihydrochloride (HpD, manufactured by MedChem Express Company) was dissolved in pure water to prepare a 200 ⁇ M aqueous solution, which was used as a photosensitizer.
  • HpD Hematoporphyrin dihydrochloride
  • Colon26 Tumor-Bearing Mouse A mouse colon cancer cell line (Colon26, obtained from RIKEN Cell Bank) was suspended in phosphate-buffered saline (PBS). This cell line (2 ⁇ 10 6 cells, 50 ⁇ L) was injected into the back of mice to obtain Colonn26 tumor-bearing mice.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Figure 11 (A) shows changes in fluorescence intensity from cancer tissue in Colon26 tumor-bearing mice injected with each photosensitizer when not irradiated with red visible light; It shows that when irradiated with light.
  • a decrease in fluorescence intensity was observed with the passage of days after administration of the photosensitizer, but in mice injected with the photosensitizer of Example 3, It showed higher fluorescence intensity compared to mice injected with 3 photosensitizers. This indicates that the photosensitizer of Example 3 remained in the cancer tissue more than that of Comparative Example 3.
  • FIG. 11(A) and FIG. 11(B) shows that the photosensitizer of Example 3 remains in cancer tissue without being affected by continuous irradiation with red visible light. rice field.
  • FIG. 12 also shows the daily change in cancer tissue size when PDT therapy is not performed (that is, red visible light is not irradiated).
  • cancer tissue tends to grow larger as the days pass.
  • the photosensitizer of Example 3 is used and PDT therapy is performed, cancer tissue grows was found to be dramatically suppressed.
  • the copolymer of the present invention can function as a photosensitizer for PDT therapy, remains in cancer tissues for a long period of time, and has a high antitumor effect.

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Abstract

生体組織の特定部位のマーキング剤、ならびにＰＤＴ療法において局所投与される光増感剤として使用可能な新規共重合体を提供する。　以下の式（Ｉ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩ）で示される繰り返し単位とを含む共重合体である。

Description

ポルフィリンを含むカチオンポリマーおよびそれを含む組織マーキング剤、および光増感剤
　本発明は、四級アンモニウムカチオンを有する繰り返し単位と、ポルフィリン化合物またはその塩を有する繰り返し単位とを含む共重合体、それを含む組織マーキング剤、および光増感剤、ならびにそれらの製造方法に関する。
　がん組織の切除手術において、正常な組織をどれだけ残せるかは術後の臓器の正常な機能の維持に重要である。このため、不必要な組織の切除を避けるために術前に腫瘍部位をマーキングしてから施術することが行われている。また、特に、消化管癌は、通常、消化管の内側に存在しており、消化管の外側から腫瘍部位を認識し得るマーキング方法に対するニーズが存在する。
　従来、消化管癌の手術をする際、術前に内視鏡を用いて腫瘍部位に墨を注入したり(点墨法)、蛍光色素等により発色する部位を有するクリップを留置して腫瘍部位をマーキングしていた（非特許文献１を参照）。
　しかし、点墨によるマーキングは、組織の色との判別が困難で視認性が悪く、消化管の外側から腫瘍部位を認識することも困難である。また、注入した墨は短時間で拡散するため、腫瘍部位と正常組織との境界を判断することが難しい。また、墨の拡散を考慮すると、マーキング剤の注入は遅くとも手術の一日前に行う必要があり、手術のスケジューリングが難しくなるといった問題もある。
　クリップを用いたマーキングは、腹腔鏡を用いた手術では使用することができず、組織を自動縫合器で切除しようとしたときに、クリップを巻き込んでしまう問題がある。また、消化管の激しい収縮運動（蠕動運動）によってクリップが外れてしまうこともある。
　このような点墨法およびクリッピング法の問題に対して、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を術前に、直腸がん腫瘍部位の直下の粘膜下層に注入して腫瘍部位をマーキングする方法が提案されている（非特許文献２）。この方法によれば、近赤外線を照射することで、消化管の外側から腫瘍部位を認識することが可能となり、クリッピング法に伴う問題もない。しかし、この方法においても、色素の拡散により蛍光領域がばらつき、切離ラインが不明瞭になるといった問題が依然として存在している（非特許文献２の考察を参照）。
　脂肪組織に富む乳癌にあっては、術前に切除予定部位をマーキングするためのマーキング製剤において、メチレンブルーなどの色素と増粘剤とを含む組成とすることが提案されている（特許文献１）。このマーキング製剤では、メチレンブルーなどの色素を用いることで、マーキング部位と組織や血液との区別を明確にするとともに、増粘剤を配合してマーキング製剤の粘度を高めることで、乳房の脂肪組織内においても色素の拡散を抑えようとするものである。しかし、このマーキング製剤においても、色素が腫瘍部位に結合しているわけではないため、その拡散防止効果は一時的であり、比較的短時間で色素が拡散していく。また、このマーキング製剤では、乳癌での利用を念頭に蛍光色素を用いておらず、消化管癌などに適用した際に、組織の外側から腫瘍部位を認識できるものではない。
　他方、癌治療において、癌患者の血管内に光増感剤を投与し、癌または腫瘍組織に集積させ、特定波長の光を照射することにより活性酸素を発生させ、癌細胞のみを特異的に死滅させる光線力学的治療法（ＰＤＴ）が開発されている。ＰＤＴは、光化学的反応により腫瘍細胞のみを選択的に死滅させることができる低侵襲な癌治療法であるが、通常、血管内投与により実施され、全身へ光増感剤が拡散される。このため、ＰＤＴを受けた患者は、厳しい遮光制限が求められ、患者のＱＯＬの低下が懸念されている。
　ＰＤＴに使用される光増感剤としてポルフィリン誘導体が知られており、ポリヘマトポルフィリンエーテルやタラポルフィリンナトリウムなどは既に実用化されている。患者のＱＯＬを考慮すれば、局所投与により局在化が可能であり、使用される量が可能な限り少量である光増感剤が求められる。また、医師および患者にとって、一回の投与によりより治療効果の大きな光増感剤が望まれる。
内視鏡での術前マーキングとしての点墨法・クリッピング法（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｓｓｏｋｅｎ．ｃｏｍ／ｊｙｏｈｏｓｈｉ／ｓｃ／２０１８１０１１ｍｉｈｏｎ／３．ｐｄｆ） 小沢慶彰，村上雅彦，（２０２０）．腹腔鏡下直腸癌手術における術前マーキング法の検討―点墨法とＩＣＧ蛍光法の比較―．昭和学士会雑誌，８０．１：１－６．
特開平１０－１９４９９８
　本発明は、上述した従来のマーキング剤の問題に鑑み、生体組織の特定部位のマーキングに使用した際に、比較的長期間にわたって、明瞭かつ的確に目的部位（典型的には腫瘍部位）のマーキングが可能であるとともに、当該部位を組織の外側から確認することを可能とする、共重合体及びその製造方法、並びにその共重合体を含む組織マーキング剤を提供するものである。
　本発明はまた、上述した従来の光線力学的療法（ＰＤＴ）の問題に鑑み、局所投与により、癌組織内に局所的に長期間残存する光増感剤を提供するものである。
　本発明者らは、四級アンモニウムカチオンを有する構成単位と、ポルフィリンまたはその塩を有する構成単位とを含む共重合体は、局所投与した組織部位に結合して、比較的長期間に亘り目的の部位のマーキングを可能とし、しかも組織の外側から目的の部位を確認することができることを見出した。また、本発明者らは、この共重合体の特性をＰＤＴで利用することを着想し、目的とする組織（典型的には癌組織）に光増感剤を局所投与することで、組織内に局所的に光増感剤を長期間残存させることができ、これによりより効果的なＰＤＴを実施できることを見出した。
　本発明は、このような知見に基づくものであり、下記の共重合体及びその製造方法、並びにその共重合体を含む組織マーキング剤および光増感剤を提供する。
［１］　以下の式（Ｉ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩ）で示される繰り返し単位とを含む共重合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式（Ｉ）または（ＩＩ）中、
　Ｒ１及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、または式：Ｒ６－Ｃ（＝Ｏ）－（式中、Ｒ６は、ＯＨ基、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルコキシル基、または無置換若しくは置換アミノ基を表す）の基を表し、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、ＯまたはＮＨであり、
　Ｌ２及びＬ４は、２価の基であり、
　Ｚはポルフィリン化合物またはその塩から任意の水素原子を１個除いた基であり、
　Ｘは、アニオンを表す。）
［２］　前記Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の環状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の芳香族炭化水素基、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ７）－（式中、Ｒ７は、水素原子、または炭素数１～１２の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－、－ＣＨ＝Ｎ－、またはこれらを組み合わせた基である、［１］に記載の共重合体。
［３］　前記共重合体の全繰り返し単位数に対する、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、１～５０％である、［１］または［２］に記載の共重合体。
［４］　式（Ｉ）で示される繰り返し単位数に対する式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の比（（ＩＩ）／（Ｉ））が、１／１０００～１／２である、［１］～［３］のいずれかに記載の共重合体。
［５］　式（ＩＩ）で表される構成単位を、１または２つ有する、［１］～［４］のいずれか一項に記載の共重合体。
［６］　前記ポルフィリン化合物が、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン；ヘプタカルボキシポルフィリン、ヘキサカルボキシポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン等のアルキルカルボキシポルフィリン；およびこれらのポルフィリンの塩からなる群から選択される、［１］～［５］のいずれか一項に記載の共重合体。
［７］　Ｒ１及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
　Ｌ２は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表し、
　Ｌ４は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表す、
［１］～［６］のいずれか一項に記載の共重合体。
［８］　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、－ＣＨ３を表し、
　Ｌ１は、－Ｏ－を表し、
　Ｌ３は、－ＮＨ－を表し、
　Ｌ２は、－ＣＨ２－ＣＨ２－を表し、
　Ｌ４は、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－を表し、
　Ｘは、Ｃｌを表し、
　前記ポルフィリン化合物が、ヘマトポルフィリン二塩酸塩である、
［７］に記載の共重合体。
［９］　水溶性である、［１］～［８］のいずれか一項に記載の共重合体。
［１０］　分子量（ＭＷ）は、１０００～１０００００である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の共重合体。
［１１］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載の共重合体を含む、組織マーキング剤。
［１２］　水溶液である、［１１］に記載の組織マーキング剤。
［１３］　消化管の局部をマーキングするための［１１］または［１２］に記載の組織マーキング剤。
［１４］　胃壁～直腸に亘る消化管の局部をマーキングするための［１３］に記載の組織マーキング剤。
［１５］　腹腔鏡下消化管手術ための［１３］または［１４］に記載の組織マーキング剤。
［１６］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載の共重合体を含む、光線力学療法用の光増感剤。
［１７］　水溶液である、［１６］に記載の光増感剤。
［１８］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載の共重合体を含む、医薬組成物。
［１９］　癌治療のための［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］　前記癌が、消化器癌である、［１９］に記載の医薬組成物。
［２１］　［１１］の組織マーキング剤を、目的の組織部位（典型的には腫瘍部位）に局所投与し、前記組織部位に所定の波長（例えば、３５０ｎｍ～４２０ｎｍの波長）の紫外線を照射して組織マーキング剤を励起させることを含む、組織マーキング方法。
［２２］　前記組織マーキング剤は、水溶液である、［２１］に記載の組織マーキング剤。
［２３］　前記目的の組織部位は、消化管の特定の部位である、［２１］または［２２］に記載の組織マーキング方法。
［２４］　前記目的の組織部位は、胃壁～直腸に亘る消化管の特定の部位である、［２３］に記載の組織マーキング方法。
［２５］　腹腔鏡下消化管手術ために実施される、［２３］または［２４］に記載の組織マーキング方法。
［２６］　［１６］に記載の光増感剤を対象の標的部位に投与すること、および前記対象の標的部位に所定の波長（例えば、６３０ｎｍ～６６０ｎｍの波長）のレーザー光を照射することを含む、光線力学療法。
［２７］癌治療のための、［２６］に記載の光線力学療法。
［２８］　前記癌が、消化器癌である、［２７］に記載の光線力学療法。
［２９］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載の共重合体の、組織マーキング剤を調製するための使用。
［３０］　前記組織マーキング剤は水溶液である、［２９］に記載の使用。
［３１］　前記組織マーキング剤は、消化管の局部をマーキングするために使用される、［２９］または［３０］に記載の使用。
［３２］　前記組織マーキング剤は、胃壁～直腸に亘る消化管の局部をマーキングするために使用される、［３１］に記載の使用。
［３３］　前記マーキングは、腹腔鏡下消化管手術ために実施される、［３１］または［３２］に記載の使用。
［３４］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載の共重合体の、光線力学療法用の光増感剤を調製するための使用。
［３５］　前記光増感剤は、水溶液である、［３４］に記載の使用。
［３６］　［１６］に記載の光増感剤の、光線力学療用医薬を調製するための使用。
［３７］　前記医薬は、癌治療用である［３６］に記載の使用。
［３８］　前記癌が、消化器癌である、［３７］に記載の使用。
［３９］　［１］～［１０］のいずれか一項に記載の共重合体を製造する方法であって、
　以下の式（ＩＡ）及び式（ＩＩＡ）の化合物であって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ２、Ｌ４及びＸは［１］～［８］のいずれか一項に定義される通りである、化合物を重合する工程、及び
　前記重合する工程によって得られた重合体をポルフィリン化合物またはその塩と反応させる工程を含む、上記方法。
［４０］　前記ポルフィリン化合物は、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン；ヘプタカルボキシポルフィリン、ヘキサカルボキシポルフィリンおよびペンタカルボキシポルフィリン等のアルキルカルボキシポルフィリン、およびこれらのポルフィリンの塩からなる群から選択される、［３９］に記載の製造方法。
　本発明の共重合体は、四級アンモニウムカチオンを有する構成単位に由来するプラスの電荷により、生体組織への優れた結合性を示し、組織への注入後に拡散することなく、一週間以上の長期間にわたってピンポイントに目的の部位をマーキングすることができる。特に、様々なｐＨ条件下でも常にプラスの電荷を有するため、様々なｐＨ環境を有する生体組織でも優れた結合性を発揮し、例えば胃壁～直腸に亘る胃腸管で、目的の部位を一週間以上の長期間にわたって的確にマーキングできる。
　また、本発明の共重合体を用いて組織をマーキングした場合、ポルフィリン化合物またはその塩を有する構成単位により、ＵＶの照射により組織の外側から明確にマーキング部位を視認することができる。
　また、本発明の共重合体は、癌組織等の目的の組織内に長期間にわたって局在し、レーザ照射により高い抗腫瘍効果を示す。従って、光増感剤の全身への拡散が大幅に低減され、ＰＤＴ治療に必要な光増感剤の投与量も大幅に減少させることができ、ＰＤＴに伴う患者への負担を大幅に軽減することが期待される。また、１回の光増感剤の投与で、比較的長い時間ＰＤＴを実施でき、単回投与により得られる治療効果を増大させることができる。
実施例１で得られた共重合体ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）およびヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ）をゲルクロマトグラフィーにかけて得られたクロマトグラムを示す。励起波長は４００ｎｍで、蛍光波長は６３５ｎｍである。実線は、実施例１で得られた共重合体ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）のクロマトグラムであり、点線は、ヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ）のクロマトグラムである。縦軸は、蛍光強度を示し、横軸は、溶出時間を示す。 実施例１で得られた共重合体ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）の３６５ｎｍで励起した際の蛍光スペクトルを示す。 実施例１で得られた共重合体ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）（濃度：０．２５ｍｇ／ｍＬ）の吸収スペクトルを示す。 １０μＭのヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ）の吸収スペクトルを示す。 ブタの大腸組織の粘膜側に、実施例２および比較例１のマーキング剤を局所注射した後に、漿膜側（消化管の外側）および粘膜側（消化管の内腔側）から注射した部位のマーキング状態を写した写真である。左の写真は、比較例１のマーキング剤を大腸組織の粘膜側に局所注射した状態を示す写真であり、左から２番目の写真は、比較例１のマーキング剤を局所注射した状態を、漿膜側（消化管の外側）から見た写真である。左から３番目の写真は、実施例２のマーキング剤を大腸組織の粘膜側に局所注射した状態を示す写真であり、右から２番目の写真は、実施例２のマーキング剤を局所注射した状態を、漿膜側（消化管の外側）から見た写真であり、右側の写真は、実施例２のマーキング剤を局所注射し、３６５ｎｍの紫外線を照射した状態を、漿膜側（消化管の外側）から見た写真である。矢印は、注射部位を示す。 比較例２のマーキング剤（２００μＭのＨｐＤ）と実施例２のマーキング剤（ＨｐＤ換算値で２００μＭのＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）、５ｍｇ／ｍｌ）をラットの胃前壁に局所注射した後の、胃の蛍光強度の経日変化を示すグラフである。 比較例２および実施例２のマーキング剤を、ラットの胃前壁に局所注射した一週間後に、３６５ｎｍの紫外線を照射した際の写真を示す。白矢印は、局所注射部位を示す。蛍光フィルター有の写真では、ポルフィリンの蛍光は白く表示される。 比較例２のマーキング剤および実施例２のマーキング剤を腹腔内注射した後のラットの体重の経日変化を示すグラフである。 それぞれ、比較例２のマーキング剤および実施例２のマーキング剤を腹腔内注射した後のラット血液中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＲＥおよびＢＵＮの経日変化を示すグラフである。ＰＢＳ投与群をコントロールとして用いた。 比較例２のマーキング剤および実施例２のマーキング剤を腹腔内注射した一週間後に、腸管の癒着状態の確認した際の写真を示す。ＰＢＳ投与群をコントロールとして用いた。 実施例３および比較例３の光増感剤をＣｏｌｏｎ２６担癌マウスにおける癌組織に投与した後の各光増感剤の残存状態を経日的に示すグラフである。光増感剤の残存状態は、癌組織からの光増感剤に基づく蛍光を測定して評価した。図１１（Ａ）は、赤色可視光を照射しなかった場合の癌組織からの蛍光強度の経日的変化を示し、図１１（Ｂ）は、赤色可視光を照射した場合のそれを示す。 Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスに実施例３および比較例３の光増感剤を用いてＰＤＴ療法を実施した際のＣｏｌｏｎ２６担癌マウス中の癌組織のサイズの変化を示す図である。比較対照として実施例３及び比較例３の光増感剤を投与後赤色可視光の照射を行わなかった場合の癌組織のサイズの変化も示す。
　本発明の実施形態を詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
＜本発明の共重合体＞
　本発明の共重合体（単に「共重合体」と称することもある）は、少なくとも以下の式（Ｉ）で示される繰り返し単位および式（ＩＩ）で示される繰り返し単位を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式（Ｉ）または（ＩＩ）中、
　Ｒ１及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、または式：Ｒ６－Ｃ（＝Ｏ）－（式中、Ｒ６は、ＯＨ基、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルコキシル基、または無置換若しくは置換アミノ基を表す）の基を表し、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、ＯまたはＮＨであり、
　Ｌ２及びＬ４は、２価の基であり、
　Ｚはポルフィリン化合物またはその塩から任意の水素原子を１個除いた基であり、
　Ｘは、アニオンを表す。）
　Ｒ１及びＲ５は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、より好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～３の直鎖アルキル基を表す。
　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、好ましくは、それぞれ独立して、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、または炭素数５～６のシクロアルキル基、炭素数７～８のアラルキル基、または式Ｒ６－Ｃ（＝Ｏ）－の基（式中、Ｒ６は、ＯＨ基、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルコキシル基、または無置換アミノ基を表す）を表す。Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、より好ましくは、それぞれ独立して、炭素数１～３の直鎖アルキル基を表す。
　Ｌ１は、好ましくはＯである。また、Ｌ３は、好ましくはＮＨである。
　Ｌ２及びＬ４は、好ましくは、それぞれ独立して、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の環状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の芳香族炭化水素基、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ７）－（式中、Ｒ７は、水素原子、または炭素数１～１２の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－、－ＣＨ＝Ｎ－、またはこれらを組み合わせた基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数５～６の二価の環状脂肪族炭化水素基、炭素数５～６の二価の芳香族炭化水素基、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ７）－（式中、Ｒ７は、水素原子、または炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－、－ＣＨ＝Ｎ－、またはこれらを組み合わせた基である。Ｌ２およびＬ４は、さらに好ましくは、それぞれ独立して、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、または炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基であり、特に好ましくは、炭素数１～３の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基である。
　Ｚは、ポルフィリン化合物またはその塩から任意の水素原子を１個除いた基である。
　ポルフィリン化合物は、ポルフィンと称されるピロールが４つ組み合わさって出来た環状構造を持つ有機化合物であり、例えば、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン、またはヘプタカルボキシポルフィリン、ヘキサカルボキシポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン等のアルキルカルボキシポルフィリン（好ましくはＣ１－１０アルキルカルボキシポルフィリン、より好ましくはＣ３－８アルキルカルボキシポルフィリン）などを例示できる。
　ポルフィリン化合物の塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。また、酸付加塩としては、無機酸塩及び有機酸塩が挙げられる。無機酸塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸から誘導される塩が挙げられ、有機酸塩としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸から誘導される塩が挙げられる。
　塩基付加塩としても、無機塩基塩及び有機塩基塩が挙げられる。無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム等の無機塩基から誘導される塩が挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリフルオロアセチル、エタノールアミン等の有機塩基から誘導される塩が挙げられる。
　ポルフィリン化合物は、実際に光増感剤としても実用化され安全性が確認されているヘマトポルフィリンが好ましい。また、所定の組織へ注入してマーキング剤として利用されることを想定すると、本発明の共重合体は水溶性であることが好ましく、その点で、Ｚはポルフィリン化合物の塩であることが好ましく、塩としては、酸付加塩が好ましく、塩酸塩等の無機酸塩がより好ましい。
　Ｘ－によって表されるアニオンとしては、無機アニオンおよび有機アニオンが挙げられ、無機アニオンとしては、例えば、フッ素アニオン、塩素アニオン、臭素アニオン、ヨウ素アニオン、ヒドロキシアニオン等が例示でき、有機アニオンとしては、例えば、炭素数１～４のアルコキシアニオン、カルボキシアニオン、炭素数２～５のアルキルカルボキシアニオン、炭酸水素アニオン等が例示できる。
　共重合体は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）以外の繰り返し単位を有してよく、例えば、式（ＩＩ）中のＺがＨである繰り返し単位を含んでもよい。
　また、共重合体は、ランダム共重合体、交互共重合体、ブロック共重合体（ジブロック、トリブロック、又はマルチブロック）のいずれであってもよい。
　共重合体中の式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数は、共重合体をマーキング剤として利用した際に、所望の蛍光強度が得られると共に、マーキング剤を水溶液として得られ得るようにし共重合体間の凝集を低減する点から所定の範囲とすることが好ましい。具体的には、共重合体の全繰り返し単位の合計数に対する、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、０．０１～５０％であることが好ましく、１～３０％であることがより好ましく、２～２０％であることが特に好ましい。
　式（ＩＩ）で示される繰り返し単位数と式（Ｉ）で表される繰り返し単位数との比（（ＩＩ）／（Ｉ））は、同様の点および組織への接着性の観点から、１／１０００００～１／１であることが好ましく、１／１０００～１／１であることがより好ましく、１／１００～１／２であることがさらに好ましく、１／７０～１／１０であることがさらに好ましい。
　本発明の好ましい実施形態による共重合体は、共重合体中に式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を１～１０個有し、より好ましい実施形態による共重合体は、１～５個有し、更に好ましい実施形態による共重合体は、１または２つ有する。ポルフィリン部位の構造にもよるが、共重合体中のポルフィリン部位の数が多くなると、共重合体が疎水性となり水に溶解しないだけでなく、ポルフィリン環のスタッキングによりポルフィリンの蛍光が消光する傾向が強くなることがある。また、興味深いことに、共重合体は、共重合体に含まれるポルフィリン部位の数が少ない方が、より強い蛍光を発し、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を、１または２つ有する共重合体で強い蛍光強度が確認された。
　ここで、本願明細書において、共重合体の全繰り返し単位の合計数に対する、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合、ならびに式（ＩＩ）で示される繰り返し単位数と式（Ｉ）で表される繰り返し単位数との比（（ＩＩ）／（Ｉ））は、１Ｈ　ＮＭＲ法によって決定される。より具体的には、共重合体を重メタノール、もしくは重水に溶解し、１Ｈ　ＮＭＲを測定し、側鎖由来のプロトンの積分値を分析することにより、上記割合を算定する。
　また、本願明細書中、「水溶性」との用語は、相応する物質が純水中で少なくとも１ｇ／ｌの溶解度を示すことを意味する。本発明の共重合体は、好ましくは少なくとも５ｇ／ｌの溶解度を示し、より好ましくは少なくとも１０ｇ／ｌの溶解度を示し、特に好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌの溶解度を示す。
　共重合体は、分子量（ＭＷ）について特に制限はなく、例えば、３００～１００００００の分子量（ＭＷ）を有し得る。もっとも、共重合体の分子量は、水溶性、粘度等の特性に影響を及ぼし得る要因の１つであるので、マーキング剤としての利用を考慮すると、１０００～１０００００が好ましく、５０００～７００００がより好ましい。
　本願明細書において使用する場合、「分子量」は、特に断らない限り、重量平均分子量（Ｍｗ）をいう。また、重量平均分子量（Ｍｗ）、および数平均分子量（Ｍｎ）とも、本願明細書においては、以下の条件でゲルろ過クロマトグラフィーによって測定される値を意味する。
測定装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ　２０ＡＤ
カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＰＷ　ａｎｄ　Ｇ５０００ＰＷ　ｃｏｌｕｍｎｓ
溶離液：０．５　Ｍ　酢酸水溶液（２０ｍＭ　ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ　ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ含有）
標準物質：ポリエチレングリコール
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
＜本発明の共重合体の製造方法＞
　本発明の共重合体は、
反応工程１：式（ＩＡ）及び式（ＩＩＡ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ２、Ｌ４及びＸは、式（Ｉ）または（ＩＩ）に関して述べた定義と同じであり、それぞれの好ましい、およびより好ましい（さらに好ましい等も同様である）選択肢も前述の通りである。）
の化合物を重合する工程、及び
反応工程２：反応工程１によって得られた重合体（以下では、中間重合体ということがある）をポルフィリン化合物と反応させる工程
を含む、方法により製造される。
反応工程１
　式（ＩＡ）及び式（ＩＩＡ）の化合物の重合反応は、式（ＩＡ）及び式（ＩＩＡ）の化合物と、熱重合開始剤と、溶媒との混合物を反応させることで行う。また、この重合反応は、例えば、７０℃、窒素下等の不活性雰囲気下、２０時間で行うことができる。式（ＩＡ）の化合物に対する式（ＩＩＡ）の化合物の混合比（（ＩＩＡ）／（ＩＡ））は、予定する、繰り返し単位（Ｉ）の全繰り返し単位に対する比、ならびに繰り返し単位（Ｉ）および（ＩＩ）間の構成比に応じて調整することが好ましいが、通常は、１／１０００～１／２の範囲とすることができる。また、組織接着性等の求められる特性から１/２００～１/５０の範囲とすることが好ましい。また、ランダム共重合体、交互共重合体、およびブロック共重合体といった構造制御は、共重合体の製造において一般的に知られる方法で実施すればよい。
　熱重合開始剤としては、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）など水溶性ラジカル発生剤を挙げることができる。溶媒としては、水、エタノール、または水・エタノール混合溶媒などを挙げることができる。
　式（ＩＡ）及び式（ＩＩＡ）の化合物は、市販の化合物を利用することができ、例えば、シグマアルドリッチ社、または東京化成工業株式会社から入手可能である。
　所望の分子量分布の共重合体を得たい場合には、反応工程１で合成された重合体を、所望の分子量分布に応じて、分画分子量１０００～１０００００の透析膜を用いて透析により精製してもよい。
　反応工程２
　反応工程１によって得られた重合体とポルフィリン化合物またはその塩とを反応させることで、重合体中の式（ＩＩＡ）の化合物に由来する繰り返し単位のアミノ基にポルフィリンを導入することができる。中間重合体へのポルフィリンの導入は、例えば、中間重合体と、ポルフィリン化合物またはその塩と、縮合剤との混合物を、ｐＨ６～８の緩衝液中で、１～２４時間反応させることで行うことができる。中間重合体とポルフィリン化合物またはその塩の混合比は、予定するポルフィリン化合物またはその塩の導入量に応じて調整することが好ましいが、通常一級アミノ基１モルに対して、ポルフィリン化合物またはその塩が２～２０倍のモル数となる量とすることができ、製造コストの点から、２～５倍のモル数となる量とすることが好ましい。縮合剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、水溶性カルボジイミド塩酸塩などを挙げることができる。
　＜本発明の共重合体の用途＞
　本発明の共重合体は、組織マーキング剤として使用することができ、生体の組織を局所的にマーキングすることができる。好ましい実施形態においては、共重合体は水溶性であり、共重合体を純水、生理食塩水、緩衝液等に溶解した溶液を組織マーキング剤とすることができる。また、本発明の組織マーキング剤は、負電荷を有していなければ各種添加剤を含んでもよい。溶液中の共重合体の濃度は、通常０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬとすればよく、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。このような溶液は、組織に局所的に注入して特定部位をマーキングでき、注入方法は特に制限はなく周知・慣用方法でよい。マーキング剤注入後は、紫外線、好ましくは、３５０ｎｍ～３７０ｎｍの波長の紫外線を注入部位に照射してマーキング剤を励起して蛍光を発生させ、これにより注入部位を確認できる。
　本発明の共重合体は、四級アンモニウムカチオンを有する繰り返し単位を含むため、様々なｐＨ条件下でも常にプラスの電荷を有する。このため、ｐＨの異なる環境を有する様々な組織のすべてに対して優れた結合性を有しており、特に様々なｐＨ環境を有する消化管、より具体的には胃壁～直腸に亘る消化管の局部をマーキングするのに適する。
　また、本発明の共重合体は、ポルフィリン骨格を有する繰り返し単位に由来して、ＵＶの照射により蛍光を発し、組織の外側から簡単にはっきりと特定の部位を視認することができる。このため、本発明の組織マーキング剤は、腹腔鏡下消化管手術において、施術前に、切除予定部位を組織の外側から確認できるというメリットがある。また、本発明の共重合体は、組織に注入された後、少なくとも１週間は組織に保持されるため、マーキング剤の注入からマーキングされた組織の切除手術までのスケジュールを比較的柔軟に決めることができる。加えて、組織に注入後に癒着等の副作用を生じないことも確認されており、安全性の高いマーキング剤が提供される。
　本発明の共重合体はまた、ＰＤＴ療法における光増感剤として使用することができ、目的の組織（例えば癌組織）にＰＤＴ療法を実施する際に使用することができる。従って、本発明は、一の実施形態において、本発明の共重合体を含む医薬組成物、とりわけ癌治療のための医薬組成物を提供する。好ましい実施形態においては、共重合体は水溶性であり、共重合体を純水、生理食塩水、緩衝液等に溶解した溶液を光増感剤とすることができる。溶液中のまた、光増感剤及び医薬組成物は、負電荷を有していなければ各種添加剤を含んでもよい。溶液中の共重合体の濃度は、通常０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬとすればよく、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬとすることが好ましい。
　このような溶液は、目的の組織（例えば癌組織）に、例えば、胃カメラ、大腸カメラ、気管支鏡などを用いて局所的に注入され、次いで、目的の組織に所定の波長（例えば、６３０ｎｍ～６６０ｎｍの波長）のレーザー光（通常、赤色可視光）を照射し、これにより本発明の共重合体に光化学反応を引き起こして活性酸素を発生させ、がん細胞を変性・壊死させることができる。
　本発明の共重合体は、ポルフィリン骨格を有する繰り返し単位に由来して、赤色可視光の照射により、目的の組織（例えば腫瘍組織）を変性・壊死させる。
　本発明の共重合体はまた、四級アンモニウムカチオンを有する繰り返し単位を含むため、様々なｐＨ条件下でも常にプラスの電荷を有する。このため、ｐＨの異なる環境を有する様々な組織（各種癌組織を含む）のすべてに対して優れた結合性を有しており、特に様々なｐＨ環境を有する消化管、より具体的には胃壁～直腸に亘る消化管の特定組織（例えば、癌組織）のＰＤＴに適する。四級アンモニウムカチオンを有する繰り返し単位はまた、癌組織に局所的に投与された際に、本発明の共重合体が癌組織に長期間局所的に維持されるのを可能とする。この結果、光増感剤の全身拡散が大幅に低減され、少量の光増感剤の一回の投与により、より治療効果が大きなＰＤＴ療法を実施できる。これは、患者のＱＯＬを低下させることなく、ＰＤＴ療法による高い治療効果をもたらすものと期待される。
　以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　１．ポリカチオン含有ポルフィリン誘導体の製造
（実施例１）
　［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド（ＭＥＴＡＣ）とＮ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミド（ＡＰＭＡＡ）の共重合体（ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ）をフリーラジカル重合によって合成し、次いで、共重合体中のＡＰＭＡＡの一級アミノ基にヘマトポルフィリンを反応させて、共重合体にポルフィリンを導入し、［ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）］を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　具体的には、まず、熱重合開始剤として４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ、シグマアルドリッチ社製）を１０ｍｇ、ＡＰＭＡＡ（シグマアルドリッチ社製）を５０ｍｇ、ＭＥＴＡＣ（シグマアルドリッチ社製）を２００ｍｇおよび水・エタノールの混合溶媒を２ｍＬフラスコに加え、窒素バブリング後、窒素下で２０時間、７０℃で重合を行った（上記、反応工程１）。その後、分画分子量３５００の透析膜を用いて純水に対する透析によって精製を行い、精製物を凍結乾燥して、白い粉末の共重合体（ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ）を回収した。得られた共重合体の分子量を、下記条件で、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した結果、数平均分子量（Ｍｎ）は２３，５００、重量平均分子量（Ｍｗ）は５４，５００、分子量分布Ｍｎ／Ｍｗは、２．３であった。
測定装置：Ｓｈｉｍａｄｚｕ　２０ＡＤ
カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＰＷ　ａｎｄ　Ｇ５０００ＰＷ　ｃｏｌｕｍｎｓ
溶離液：０．５　Ｍ　酢酸水溶液（２０ｍＭ　ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ　ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ含有)
標準物質：ポリエチレングリコール
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　次に、４０ｍｇの共重合体に、２．５ｍｇのヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ、ＭｅｄＣｈｅｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）、１１．５ｍｇのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ、社製）、１５．５ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ、ペプチド研究所社製）を加え、５００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中で２０時間、室温で反応させた（上記反応工程２）。
　図１に示すゲル濾過クロマトグラム（蛍光検出）から、ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）のクロマトグラムは、低分子ヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ）の溶出時間よりも早く、また低分子ＨｐＤの溶出時間には、ピークがなかったことから、ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ一分子中にＨｐＤが導入され、精製により未反応の低分子ＨｐＤが除去されたことを確認した。図２に実施例１で得られたＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）の蛍光スペクトルを示す。低分子ＨｐＤと同様に、３６５ｎｍで励起した際に、６００ｎｍ～７００ｎｍに蛍光シグナルを確認した。
　また、図３に実施例１で得られた共重合体ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）の吸収スペクトルを、図４に低分子ヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ）の吸収スペクトルを示す。低分子ＨｐＤの４００ｎｍの吸光度を用いて検量線を作成し、上記共重合体（ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ）の数平均分子量（Ｍｎ）から、共重合体の全繰り返し単位の合計数に対する、繰り返し単位ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）の数の割合を算出したところ、その割合は１～２％であり、ＰＭＥＴＡＣに対するＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）の構成比（ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）／ＰＭＥＴＡＣ）は、１／５０～１／１００と推定された。また、後述する評価試験で述べる通り、ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌの濃度で純水に溶解することを確認した。
２．マーキング特性評価
（実施例２）
　実施例１で得られたＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）を純水で溶解して、５ｍｇ／ｍｌ（ＨｐＤ換算値で２００μＭ）の水溶液を調製し、マーキング剤とした。
（比較例１）
　臨床現場で用いられている墨（開明社製）を、そのまま比較対象のマーキング剤として用いた。
（比較例２）
　ヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ、ＭｅｄＣｈｅｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を純水で溶解して、２００μＭの水溶液を調製し、マーキング剤とした。
（１）点墨法との比較による視認性の評価
　食肉加工会社から購入したブタの大腸組織の粘膜側に、実施例２および比較例１のマーキング剤を１０μＬ局所注射した。比較例１のマーキング剤では、注射直後、漿膜側（消化管の外側）および粘膜側（消化管の内腔側）からそのまま肉眼で注射部位を確認し、実施例２のマーキング剤では、３６５ｎｍの紫外光を当てて、同様に漿膜側（消化管の外側）から肉眼で注射部位を確認した。
　図５に示す通り、比較例１のマーキング剤では、漿膜側（消化管の外側）から注射部位を確認することが困難であった。また、粘膜側（消化管の内側）から見ても、注射部位とその周囲の組織との境界が明確に判別することができなかった。一方、実施例２のマーキング剤では、紫外光を照射すると、漿膜側（消化管の外側）から注射部位を明確に確認でき、注射部位とその周囲の組織との境界も明確に判別可能であった。
（２）ＨｐＤとの比較によるマーキングの持続性の評価
　比較例２のマーキング剤（２００μＭのＨｐＤ）と実施例２のマーキング剤（ＨｐＤ換算値で２００μＭのＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）、５ｍｇ／ｍｌ）を、それぞれ１０μＬ、開腹して胃を露出させたラットの胃前壁に局所投与し、経日的に蛍光強度を確認した。
　各マーキング剤を投与したラットの胃前壁に３６５ｎｍの光を照射すると、投与直後は、比較例２および実施例２の何れのマーキング剤でも強い蛍光シグナルを発したが、図６に示す通り、投与後一日目で、比較例２のマーキング剤を投与したラットでは、投与部位で蛍光を検出できなくなった（シグナル強度は約２％）。これに対して、実施例２のマーキング剤では、投与後７日目でも強い蛍光シグナルが検出された（それぞれ比較例２および実施例２のマーキング剤を投与したラットの胃に７日後に紫外光を照射した際の蛍光発色状態を示す図７も参照）。
３．安全性試験
　消化管の組織マーキング剤は、内視鏡を用いて局所投与するため、マーキング時に腹腔内に漏れることがある。従って、組織マーキング剤は腹腔内に漏れても安全なものである必要がある。そこで、実施例２の組織マーキング剤について、腹腔内に漏れた際の安全性を確認した。
　具体的には、６週齢のＷｉｓｔａｒ雄ラットの腹腔内に、ＰＢＳ、比較例２のマーキング剤および実施例２のマーキング剤を、それぞれ、１００μＬずつ投与し、それぞれのラットの体重を経日的に測定した。また、ＰＢＳ、または各マーキング剤の投与前、投与の１日後および７日後に、ラットの尾の先端を切断し、ヘパリン加血として採血し、採取した血液を、３０００ｒｐｍ、５分間、室温で遠心分離処理し、血漿を回収した。得られた血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）を、動物用臨床化学分析装置（富士ドライケムＮＸ７０００Ｖ、富士フィルム社製）を用いて測定した。また、７日後の採血後に三種混合麻酔薬で鎮静し腹部を正中切開し臓器の癒着の有無を確認した。その結果、マーキング特性評価の試験での投与量の１０倍量を投与したにもかかわらず、比較例２のマーキング剤および実施例２のマーキング剤によって、体重の変化（図８）、腎臓・肝臓障害を示すＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＵＮ、ＣＲＥの値に変化はなく（図９）、また腸管の癒着も見られなかった（図１０）。従って、ＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）の高い安全性が示された。
４．ＰＤＴ療法用光増感剤の評価
（実施例３）
　実施例１で得られたＰＭＥＴＡＣ－ｃｏ－ＰＡＰＭＡＡ（ＨｐＤ）を純水で溶解して、５ｍｇ／ｍｌ（ＨｐＤ換算値で２００μＭ）の水溶液を調製し、光増感剤とした。
（比較例３）
　ヘマトポルフィリン二塩酸塩（ＨｐＤ、ＭｅｄＣｈｅｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を純水で溶解して、２００μＭの水溶液を調製し、光増感剤とした。
（１）Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウス
　マウス大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏｎ２６、理化学研究所　細胞バンクから入手）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた。この細胞株（細胞２×１０６個、５０μＬ）をマウスの背中に注射し、Ｃｏｌｏｎｎ２６担癌マウスを得た。
（２）ＩＶＩＳ画像診断による癌組織内残存性試験
　細胞株注射後３日目に、実施例３および比較例３の光増感剤５０μＬをＣｏｌｏｎ２６担癌マウスの癌組織近傍に皮下注射し、皮下注射後の赤外可視光の照射の有無による光増感剤の残存状態への影響を調べた。詳細には、一方のＣｏｌｏｎ２６担癌マウスには各光増感剤を皮下注射後の翌日（すなわち、細胞株注射後４日目）から３日間連続して赤色可視光（波長：６３５ｎｍ、強度：１３０ｍＷ／ｃｍ２）を１０分間照射し、もう一方のＣｏｌｏｎ２６担癌マウスには各光増感剤を皮下注射後赤色可視光を照射しなかった。ＩＶＩＳイメージングシステムを用いて、それぞれのＣｏｌｏｎ２６担癌マウスの癌組織からの光増感剤に基づく蛍光を測定し、光増感剤の残存性を評価した。結果を図１１に示す。
　図１１（Ａ）は、赤色可視光を照射しなかった場合の各光増感剤を注射したＣｏｌｏｎ２６担癌マウスにおける癌組織からの蛍光強度の変化を示し、図１１（Ｂ）は、赤色可視光を照射した場合のそれを示す。これらのグラフから理解できる通り、いずれも、光増感剤投与後の日数の経過に伴い、蛍光強度の低下は見られたが、実施例３の光増感剤を注射したマウスでは、比較例３の光増感剤を注射したマウスに比べて、高い蛍光強度を示した。このことは、実施例３の光増感剤は、比較例３に比べて、癌組織内により多く残存していたことを示す。また、図１１（Ａ）と図１１（Ｂ）との比較から、実施例３の光増感剤は、赤色可視光の連続照射の影響を受けることなく癌組織内に残存することが示された。
（３）ＰＤＴ療法による抗腫瘍効果
　細胞株注射後３日目に、実施例３および比較例３の光増感剤５０μＬ、ならびに、コントロールとしてＰＢＳ投与群を、Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスの癌組織近傍に皮下注射した。皮下注射後のＣｏｌｏｎ２６担癌マウスにＰＤＴ療法を行い、癌組織のサイズ（腫瘍サイズ）の経日的変化を調べた。詳細には、皮下注射後の当日から１５日間、赤色可視光（波長：６３５ｎｍ、強度：１３０ｍＷ／ｃｍ２）を、毎日１０分間、Ｃｏｌｏｎ２６担癌マウスの癌組織に照射した。なお、皮下注射当日の赤色可視光の照射は、皮下注射後１０分後に行った。結果を図１２に示す。
　図１２には比較のため、ＰＤＴ療法を行わない（すなわち、赤色可視光を照射しない）場合の癌組織サイズの経日的変化も併せて示す。図１２によれば、全体に日数の経過に伴い、癌組織は大きくなる傾向を示すが、驚くべきことに、実施例３の光増感剤を用い、ＰＤＴ療法を行えば、癌組織の増大が劇的に抑制されることが分かった。
　以上から、本発明の共重合体は、ＰＤＴ療法の光増感剤として機能し得、特に、長期間にわたって癌組織内に残存し、高い抗腫瘍効果を有することが示された。

Claims (20)

  1. 　以下の式（Ｉ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩ）で示される繰り返し単位とを含む共重合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式（Ｉ）または（ＩＩ）中、
    　Ｒ１及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
    　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、または式：Ｒ６－Ｃ（＝Ｏ）－（式中、Ｒ６は、ＯＨ基、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルコキシル基、または無置換若しくは置換アミノ基を表す）の基を表し、
    　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、ＯまたはＮＨであり、
    　Ｌ２及びＬ４は、２価の基であり、
    　Ｚはポルフィリン化合物またはその塩から任意の水素原子を１個除いた基であり、
    　Ｘは、アニオンを表す。）
  2. 　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の環状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の芳香族炭化水素基、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ７）－（式中、Ｒ７は、水素原子、または炭素数１～１２の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－、－ＣＨ＝Ｎ－、またはこれらを組み合わせた基である、請求項１に記載の共重合体。
  3. 　前記共重合体の全繰り返し単位数に対する、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、１～５０％である、請求項１また２に記載の共重合体。
  4. 　式（Ｉ）で示される繰り返し単位数に対する式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の比（（ＩＩ）／（Ｉ））が、１／１０００～１／２である、請求項１～３のいずれか一項に記載の共重合体。
  5. 　式（ＩＩ）で表される構成単位を、１または２つ有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の共重合体。
  6. 　前記ポルフィリン化合物が、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン、アルキルカルボキシポルフィリンおよびこれらのポルフィリンの塩からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の共重合体。
  7. 　Ｒ１及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、または炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
    　Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
    　Ｌ２は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表し、
    　Ｌ４は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表す、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の共重合体。
  8. 　水溶性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の共重合体。
  9. 　重量平均分子量（ＭＷ）は、３００～１００００００である、請求項１～８のいずれか一項に記載の共重合体。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の共重合体を含む、組織マーキング剤。
  11. 　水溶液である、請求項１０に記載の組織マーキング剤。
  12. 　消化管の局部をマーキングするための請求項１０または１１に記載の組織マーキング剤。
  13. 　胃壁～直腸に亘る消化管の局部をマーキングするための請求項１２に記載の組織マーキング剤。
  14. 　腹腔鏡下消化管手術ための請求項１２または１３に記載の組織マーキング剤。
  15. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の共重合体を含む、光線力学療法用の光増感剤。
  16. 　水溶液である、請求項１５に記載の光増感剤。
  17. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の共重合体を含む、医薬組成物。
  18. 　癌治療に用いられる、請求項１７に記載の、医薬組成物。
  19. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の共重合体を製造する方法であって、
    　以下の式（ＩＡ）及び式（ＩＩＡ）の化合物であって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１、Ｌ３、Ｌ２、Ｌ４及びＸは請求項１～７のいずれか一項に定義される通りである、化合物を重合する工程、及び
    　前記重合する工程によって得られた重合体をポルフィリン化合物またはその塩と反応させる工程を含む、方法。
  20. 　前記ポルフィリン化合物は、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン；ヘプタカルボキシポルフィリン、ヘキサカルボキシポルフィリンおよびペンタカルボキシポルフィリン等のアルキルカルボキシポルフィリン、およびこれらのポルフィリンの塩からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
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