WO2022240240A1 - Nk 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 포함하는 동결보존 제형 - Google Patents

Nk 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 포함하는 동결보존 제형 Download PDF

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홍천표
고동우
구종범
김동환
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    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells

Definitions

  • a low-speed freezing method such as a slow programmable freezing (SPF) method developed in the 1970s is used worldwide (Fertility and Sterility. 93 (6): 1921-8).
  • SPF slow programmable freezing
  • cells are coated with cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, and hydroxylethyl starch (HES) to prevent formation of ice crystals inside/outside cells. method is used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HES hydroxylethyl starch
  • cryoprotectants exhibits inherent toxicity, and since they are concentrated in cells during the freezing process, they are fatal to immune cell therapy or may be toxic when administered to patients later ( Peer J. 3: e1039).
  • cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide (DMSO) and hydroxyethyl starch (HES) are reported to exhibit high toxicity to human cells (Transfusion and Apheresis Science 46 (2012) 137-147).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HES hydroxyethyl starch
  • cryopreservation formulations containing cryoprotectants add additional processing and associated costs to cell production and preservation processes.
  • cryoprotectants alone are accompanied by the problem of loss of cell activity and viability. Therefore, there is a need to develop a cryopreservation method and formulation capable of maintaining the activity of immune cell therapeutics during subsequent reconstitution while minimizing the concentration of toxic additives in the composition of a solution for cryopreservation of immune cell therapeutics.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, immune disease or infectious disease comprising NK cells and the composition for cryopreservation.
  • cryoprotectant selected from the group consisting of glucose, polyethylene glycol and trehalose.
  • the base solution may be characterized in that it includes any one or more of sodium, chloride, potassium, magnesium, acetate and gluconate, preferably sodium, chloride, potassium, magnesium, acetate and gluconate It may be characterized by including.
  • the osmolality of the base solution is about 200 mOsm/L to about 400 mOsm/L, preferably about 250 mOsm/L to about 350 mOsm/L, more preferably about 280 mOsm /L to about 310 mOsm/L, most preferably about 300 mOsm/L or about 294 mOsm/L.
  • the base solution may be characterized in that it occupies the remaining composition fraction except for the preferred composition ratio of other components to be described below.
  • the albumin may be characterized as plasma albumin, preferably human plasma albumin.
  • DMSO Dimethylsulfoxide
  • DMSO Dimethylsulfoxide
  • DMSO Dimethylsulfoxide
  • DMSO is reported to cause various cell damages due to non-specific cytotoxicity (Transfusion and Apheresis Science 46 (2012) 137-147; and Bone Marrow Transplant 2003;31(11):1043-51 etc). It has been reported that the cell damage mechanism of DMSO is due to rapid increase in intracellular osmotic pressure and mitochondrial damage.
  • composition for cryopreservation of the present invention may be characterized in that it contains a low concentration of DMSO.
  • the DMSO is about 0.001% (v / v) or more and less than about 10% (v / v), preferably about 0.005% (v / v) to about 8% (v / v), more preferably It may be characterized in that it is included in a final concentration of about 0.1% (v / v) to about 6% (v / v), most preferably about 5% (v / v).
  • the present invention is characterized by including at least one cryoprotectant selected from the group consisting of glucose, polyethylene glycol and trehalose.
  • the polyethylene glycol has an average molecular weight of about 400 g / mol, from about 0.01% (w / v) to about 10% (w / v), preferably from about 0.02% (w / v) About 6% (w/v), more preferably from about 0.045% (w/v) to about 2.5% (w/v), most preferably from about 0.625% (w/v) to about 2.5% (w/v) It may be characterized in that it is included in the final concentration of v).
  • the polyethylene glycol has an average molecular weight of about 4000 g / mol, about 0.01% (w / v) to about 10% (w / v), preferably about 0.02% (w / v) to About 6% (w/v), more preferably from about 0.045% (w/v) to about 2.5% (w/v), most preferably from about 0.225% (w/v) to about 2.25% (w/v) It may be characterized in that it is included in the final concentration of v).
  • NK cells preferably, it may be characterized in that it is a composition for cryopreservation of NK cells consisting of:
  • cryoprotectant selected from the group consisting of glucose, polyethylene glycol and trehalose.
  • the pH of the base solution may be about 4.0 to about 8.0, preferably about 6.0 to about 8.0, more preferably about 7.0 to about 8.0, and most preferably about 7.4.
  • the polyethylene glycol has an average molecular weight of about 400 g / mol, from about 0.01% (w / v) to about 10% (w / v), preferably from about 0.02% (w / v) About 6% (w/v), more preferably from about 0.045% (w/v) to about 2.5% (w/v), most preferably from about 0.625% (w/v) to about 2.5% (w/v) It may be characterized in that it is included in the final concentration of v).
  • cryoprotectant when the cryoprotectant is trehalose, about 0.5% (w / v) to about 10% (w / v), preferably about 1% (w / v) to about 9% (w / v) ), more preferably at a final concentration of about 1.7% (w/v) to 8.5% (w/v).
  • the human plasma albumin is at a final concentration of about 1% (w/v) to about 10% (w/v), preferably about 2% (w/v) to about 8% (w/v). ), more preferably, about 3% (w / v) to about 5% (w / v), most preferably about 4% (w / v).
  • the present invention relates to a cryopreservation formulation of NK cells comprising NK cells and the composition for cryopreservation of the present invention.
  • a cryopreservation formulation is prepared by suspending cells in the cryopreservation composition of the present invention, a vial containing the cryopreservation formulation is placed in a container box for freezing containing isopropyl alcohol, and placed in an ultra-low temperature freezer for several hours to several tens of hours. It may be performed by freezing the cells by dropping the temperature constantly for a period of time, but is not limited thereto.
  • the immune cell therapy may be characterized in that it is used after thawing the cryopreserved NK cryopreservation formulation of the present invention.
  • the immune cell therapy may be characterized in that it is ready to use after thawing.
  • Ready to use means that after thawing, it can be used/administered immediately at a pharmaceutically effective concentration without a separate dilution/concentration, reconstitution or rehydration process.
  • the immune cell therapy of the present invention is in a ready-to-use form, user convenience is improved, and errors that may occur during dilution/concentration, reconstitution, or rehydration are minimized. It has the advantage of being able to prevent activity deviation and contamination due to
  • 'infectious disease' is a disease caused by infection with a virus or pathogen, and is a concept that includes all diseases that can be transmitted and infected through respiratory, blood, and skin contact.
  • infectious diseases include hepatitis B and C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, influenza, etc., but are not limited thereto. not.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the progression of cancer, immune disease or infectious disease by administration of the pharmaceutical composition for prevention or treatment of the present invention
  • treatment refers to cancer, immune disease or suppression of the development of an infectious disease, alleviation or elimination of symptoms.
  • the pharmaceutical composition for prevention or treatment of the present invention may include at least one known active ingredient having a therapeutic effect on cancer, immune disease or infectious disease together with the NK cells and the composition for cryopreservation of the present invention.
  • the pharmaceutical composition for prevention or treatment of the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient depends on the route of administration, the age, sex, weight and severity of the patient.
  • the pharmaceutical composition for prevention or treatment according to the present invention may be appropriately selected according to various factors such as, etc., and the pharmaceutical composition for prevention or treatment according to the present invention can be administered in combination with a known compound having an effect of preventing, improving or treating symptoms of cancer, immune disease or infectious disease. can
  • NK activation beads in the NK Cell Activation/Expansion Kit (Cat#: 130-112-968) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)
  • 500 ⁇ L Anti-Biotin MACSiBead Particles were added, mixed, 300 ⁇ L MACS buffer was added, and mixed for 2 hours at 2-8°C using a microtube rotator.
  • NK activation beads per 1x10 6 cells to a new tube
  • 1 mL NK MACS medium Cat#: 130-094-483 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes.
  • NK MACs medium (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-094-483) based on 5 ⁇ L per 10 6 NK cells to release NK activation beads.
  • the NK cells prepared in Example 1 were suspended in the composition for cryopreservation of NK cells at 1x10 6 cells/mL to prepare a frozen formulation of NK cells, dispensed into vials by 1ml, and stored in a cryogenic freezer for one day. , transferred to LN2 and cryopreserved.
  • Example 1 As a result of confirming the viable cell number and viability of NK cells frozen for 4 weeks according to Example 1, as shown in FIG. 1, based on the NK cells stored frozen in the frozen formulation using the control group (CS10), it was confirmed that the frozen formulations using the candidate groups in Table 1 showed substantially equivalent levels of cell yield and viability. Among them, the yields of candidate groups 1-2 to 1-3, candidate groups 2-1 to 2-2, and candidate group 3-2 were added tended to be high, and candidate group 2-1 containing PEG as a stabilizer showed the highest yield. Yield is shown.
  • Fc blocking solution prepared by 200X Fc block (Biolegend, San Diego, CA, USA) solution at 1X concentration in FACS buffer was added to each well was added and left on ice for 10 minutes.
  • FITC-labeled anti-human CD3 antibody FITC anti-human CD3 Antibody (Clone UCHT1)
  • PE-Cy7-labeled anti-human CD56 antibody PE/Cyanine7 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (Clone 5.1H11)
  • BV421-labeled anti-human CD14 antibody Brilliant Violet 421TM anti-human CD14 Antibody (Clone 63D3)
  • BV480-labeled anti-human CD19 antibody BV480 Mouse Anti-Human CD19 (Clone SJ25C1)
  • PE -labeled anti-human CD16 antibody PE anti-human CD16 Antibody (Clone 3G8)
  • BV711-labeled anti-human NKp46 antibody Brilliant Violet 711 TM anti-human CD335 (NKp46) Antibody (Clone 9E2)
  • BD HorizonTM BV650 Mouse Anti-Human CD3 antibody BD HorizonTM BV650 Mouse Anti-Human CD
  • Example 5 Identification of cytotoxic markers of cryopreserved NK cells
  • Fc blocking solution prepared by 200X Fc block (Biolegend, San Diego, CA, USA) at 1X concentration in FACS buffer was added to each well and iced. was left on for 10 minutes.
  • PerCP-labeled anti-human CD3 Antibody (Clone HIT3a), APC-Cy7-labeled anti-human CD56 antibody (APC/Cyanine7 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (Clone 5.1H11) ), BV421-labeled anti-human Tim-3 antibody (Brilliant Violet 421TM anti-human CD366 (Tim-3) Antibody (Clone F38-2E2)), BV785-labeled anti-human CD16 antibody (Brilliant Violet 785TM Anti-human CD16 Antibody (Clone 3G8)) and PE-labeled anti-human PD-1 antibody (PE anti-human CD279 (PD-1) Antibody (Clone A17188B)) were added to each well with 50 ⁇ L FACS buffer. After reacting at 4° C. temperature for 20 minutes, 100 ⁇ L FACS buffer was added and centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes.
  • BD Perm/WashTM buffer was diluted to 1X concentration in DW and reacted for 30 minutes. Then, 100 ⁇ L of the prepared wash buffer was added to each well and centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant, add 200 ⁇ L wash buffer, and centrifuge at 1,300 rpm for 5 minutes.
  • Example 6-1 100uL each of the stained target cells of Example 6-1 was dispensed into the 96-well-plate prepared in 6-2, and the cells were co-cultured at 37° C. and 5% CO2 for 4 hours by blocking light. After co-culture, after centrifugation at 2000 rpm for 3 minutes, 100 uL of the supernatant was obtained and dispensed into a new flat bottom 96-well-plate, and fluorescence was measured at wavelengths of 485 nm and 535 nm (FIGS. 4 to 6).
  • the viable cell number and viability of frozen NK cells for 2 weeks were measured using an ADAM cell counter Accustain kit (DigitalBio) according to the manufacturer's manual.
  • the chip was inserted into an ADAM counter and the number of viable cells was measured, and the results are shown in FIG. 7 . According to the results of FIG. 7 , it was confirmed that the yield and viability of Candidate Groups 2-3 to 2-7 after thawing and Comparative Example 2 were at the same level.
  • PerCP anti-human CD3 Antibody (Clone HIT3a), PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD56 (NCAM-1) Clone B159)), Alexa Fluor® 700 labeled anti-human CD14 antibody (Alexa Fluor® 700 Mouse Anti-Human CD14 (Clone M5E2)), BV786 labeled anti-human CD19 antibody (BV786 Mouse Anti-Human CD19 ( Clone SJ25C1)), APC-H7 labeled anti-human CD16 antibody (APC-H7 Mouse Anti-Human CD16 (Clone 3G8)), BV711 labeled anti-human NKp46 antibody (Brilliant Violet 711TM anti-human CD335 ( NKp46) Antibody (Clone 9E2)), PE-CF594-labeled anti-human NKG2D antibody (PE-CF594 Mouse Anti-Human CD314 (NKG2D) (Clone 1D11)), BV421-labeled anti-human NKG2C
  • Example 10 Identification of NK cell cytotoxicity markers of compositions for cryopreservation by PEG molecular weight
  • NK MACS medium 10 mL of NK MACS medium (NK MACS medium, Miltenyi), and centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and 10 mL of NK MACS medium was added to dissolve the pellet.
  • PerCP-labeled anti-human CD3 Antibody (Clone HIT3a), APC-Cy7-labeled anti-human CD56 antibody (APC/Cyanine7 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (Clone 5.1H11) ), BV421-labeled anti-human Tim-3 antibody (Brilliant Violet 421TM anti-human CD366 (Tim-3) Antibody (Clone F38-2E2)), BV785-labeled anti-human CD16 antibody (Brilliant Violet 785TM Anti-human CD16 Antibody (Clone 3G8)) and PE-labeled anti-human PD-1 antibody (PE anti-human CD279 (PD-1) Antibody (Clone A17188B)) were added to each well with 50 ⁇ L FACS buffer. After reacting at 4° C. temperature for 20 minutes, 100 ⁇ L FACS buffer was added and centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes.
  • BD Perm/WashTM buffer was diluted to 1X concentration in DW and reacted for 30 minutes. Then, 100 ⁇ L of the prepared wash buffer was added to each well and centrifuged at 1,300 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant, add 200 ⁇ L wash buffer, and centrifuge at 1,300 rpm for 5 minutes.
  • Example 11 Confirmation of cancer cell killing ability of NK cells of composition for cryopreservation by PEG molecular weight
  • NK cells frozen for 4 weeks with each cryopreservation formulation were obtained, centrifuged at 1,300 rpm for 10 minutes, and then suspended in RPMI 1640 medium (Welgene, LM011-01) at a concentration of 1x10 6 cells/mL.
  • the ratio shown in Table 15 was dispensed into a 96-well-plate according to the E:T ratio (10:1, 3:1, 1:1, 0.3:1).
  • 200uL of RPMI 1640 medium was added and set as “MM”.
  • cryoprotectants that exhibit various side effects due to non-specific toxicity are not included or included in low concentrations and replaced with non-toxic biocompatible cryoprotectants, the patient immediately thaws without additional culture or replacement of the solution with an injection solution. It has the advantage that it can be administered to the body and can be used as a pharmaceutical formulation. Therefore, it is very useful for long-term storage and clinical use of NK cell-based immunotherapeutic agents used for the treatment of very limited indications.

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Abstract

본 발명은 NK세포의 동결보존을 위한 조성물 및 NK 세포의 동결보존 제형에 관한 것으로, 본 발명의 NK세포의 동결보존용 조성물은 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), HES(Hydroxy Ethyl Starch)을 포함하지 않는 저농도의 DMSO 조건에서도 세포의 표면 마커와 NK세포 탈과립 능력이 현재 상용되는 동결보존용 배지를 사용한 제형과 동등하거나 향상된 수준을 나타냄과 동시에, 보다 높은 세포 수득률 및 현저히 뛰어난 NK세포의 암세포 살상 능력을 나타낸다. 특히, 비특이적 독성으로 다양한 부작용을 나타내는 종래의 동결보호제를 포함하지 않거나 저농도로 포함하고, 비독성의 생체 친화적 동결보호제로 대체하기 때문에, 별도의 추가 배양 또는 주사 용액으로의 솔루션의 교체 없이도 해동 즉시 환자에게 투여가 가능하여 약학적 제형으로도 사용 가능하다는 장점이 있다. 따라서, 매우 제한적인 적응증의 치료용도로 사용되는 NK세포 기반 면역치료제의 장기보관 및 임상적 사용에 있어 매우 유용하다.

Description

NK 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 포함하는 동결보존 제형
본 발명은 NK세포의 동결보존을 위한 조성물 및 NK 세포의 동결보존 제형에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베이스 용액(Base solution); 알부민(albumin); DMSO; 및 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 동결보호제를 포함하거나, 바람직하게는 이들로 구성되는 NK 세포의 동결보존용 조성물, 이를 포함하는 NK 세포의 동결보존 제형 및 약학 조성물에 관한 것이다.
면역치료법(immunotherapy)은 면역 시스템의 활성화 또는 억제를 통해 질병을 치료하는 방법으로, 이러한 면역치료법은 생체 유래의 물질(사이토카인, 케모카인, 인터류킨, 면역 이펙터 세포 등)을 사용하기 때문에, 생체 친화적인 특성을 나타내어 기존의 약물보다 부작용이 적고 내성을 일으킬 가능성이 적다는 장점이 있다(Expert Opinion on Biological Therapy. 1 (4): 641-53). 이 중 림프구, 대식세포, 수지상세포, 자연살해 세포(NK 세포), 세포독성 T 림프구(CTL) 등과 같은 면역 이펙터 세포를 처리하여 면역 시스템을 조절하는 면역세포 치료법은 기존의 치료법인 화학약품, 방사선 치료에 비해 비교적 부작용이 작고 다른 치료법과 같이 동반치료를 수행했을 시 우수한 효과를 나타내므로 최근에 중요성이 더욱 부각되고 있다.
면역세포 치료법은 환자 또는 공여자로부터 추출된 T 세포, NK 세포, 수지상세포 등의 면역세포를 공학적인 방법으로 세포의 기능을 강화시키고, 배양을 걸쳐 세포 수를 증폭 시켜 다시 환자에게 처리함으로써 암세포에 특인 면역 반응을 발생시켜 암세포의 사멸을 유도한다. 이때 체외에서 면역세포를 배양한 후 다시 환자에게 주입하는 과정이 수행되기 때문에 ‘입양세포전달(Adoptive Cell Transfer)’ 혹은 ‘입양면역요법’이라는 명칭으로 불리기도 한다(CANCER RESEARCH INSTITUTE, 2020-07-09, Adoptive Cell Therapy TIL, TCR, CAR T, AND NK CELL THERAPIES).
면역세포 치료법에 있어서, T 세포를 중심으로 하는 T 세포 기반 면역세포 치료제에 대한 연구가 지금까지 가장 활발히 수행되어 왔다. 특히, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하도록 엔지니어링된 CAR-T 세포는 MHC를 통해 항원이 세포 표면에 제시되지 않더라도, 암세포 특이적인 공격이 가능하다는 점에서 장점이 있다. 현재, Kymriah®,Yescarta®, Provenge® 등의 다양한 CAR-T 세포 치료제가 FDA 승인되어 임상에서 사용되고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 CAR-T 치료제는 모두 B세포에 발현되는 CD19라는 단백질을 표적으로하여, B-세포 무형성증, 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome, CRS), 및 신경독성과 같은 부작용을 수반하며, 이로 인해 급성 림프구성 백혈병 및 대형 B 세포 림프종을 제외한 추가적인 임상적 적용이 제한되고 있다.
NK 세포 기반의 면역세포 치료제는 항원 전감작(pre-sensitization)이나 인간 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA) 매칭없이 종양을 표적으로 삼을 수 있으며, 동종 이식의 경우 이식 대 숙주 질환(GvHD)을 거의 유발하지 않고, T세포와 달리 IL-3와 과립구 과식세포(granulocytemacrophage) 군집 자극인자를 분비하기 때문에 사이토카인 방출 증후군을 유발할 가능성이 적다. 또한 NK세포에 의해 분비되는 PD-1 수준은 매우 낮아 고형 종양에도 높은 효과를 나타낸다. 위와 같이 NK 세포 기반의 면역세포 치료제는 T 세포 기반의 면역세포 치료제에 대비하여 많은 장점을 나타내며, 따라서, 광범위한 임상적 응용 잠재력을 갖는 새로운 면역세포 치료제로서 부상하고 있다(Cancer Letters 472 (2020): 175-180; Frontiers in Immunology 10 (2019): 2683).
한편, 면역세포 치료제는 살아있는 면역 세포의 활성에 그 효과가 결정되기 때문에, 세포의 생존성, 활성을 유지하면서도 장기간 보관할 수 있는 방법을 개발하는 것이 임상적 적용에 있어 중요한 요소 중 하나이다. 동결보존(cryopreservation)은 생물, 기관, 조직, 세포 등의 생물학적 구성물을 보존하는데 있어서 가장 일반적으로 사용되는 방법이다(Bioversity International, CATIE, IRD. p. 61). 다만, 동결보존은 용액에 의한 효과(solution effects), 세포 내/외 얼음 결정 형성, 및 탈수와 같은 세포에 치명적인 영향을 나타낼 수 있기 때문에, 세포의 효과적인 보존을 위해서는 냉동 방법 및 동결 제형에 대한 개발이 필수적으로 수반되어야 한다.
냉동 방법과 관련하여, 1970년대 개발된 SPF(slow programmable freezing) 방법과 같은 저속 동결 방법이 전세계적으로 사용되고 있다(Fertility and Sterility. 93 (6): 1921-8). 또한, 면역세포 치료제의 동결보존에 있어서, 세포 내/외의 얼음 결정 형성 방지를 위해, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤(glycerol), HES (hydroxylethyl starch)와 같은 동결보호제(Cryoprotectant)로 세포를 코팅하는 방법이 사용된다.
그러나, 이러한 동결보호제의 사용은 대부분 고유한 독성을 나타내며, 동결과정에서 세포 내에 농축되기 때문에 면역세포 치료제에 치명적이거나, 추후 환자에게 투여하는 경우에 독성을 나타낼 수 있다는 연구결과가 다수 보고되고 있다(PeerJ. 3: e1039). 특히, 디메틸 설폭사이드(DMSO)및 HES(hydroxyethyl starch)와 같은 수많은 동결보호제의 경우, 인간 세포에 높은 독성을 나타내는 것으로 보고된다(Transfusion and Apheresis Science 46 (2012) 137-147). 따라서, 동결보호제를 포함하는 동결보존 제형은 세포 생산 및 보존 공정에 추가적인 공정 및 관련 비용을 부가한다. 또한, 동결방지제 단독으로는 세포 활성 및 생존성의 손실이라는 문제가 수반된다. 따라서, 면역세포 치료제의 동결보존을 위한 용액의 조성에서 독성을 나타내는 첨가물의 농도를 최소화하면서도, 추후 재구성시 면역세포 치료제의 활성을 유지할 수 있는 동결보존 방법 및 제형의 개발이 요구된다.
면역세포 치료제는 그 종류 및 기능에 따라 발현 분자, 신호 전달 체계, 생산 물질 등이 전혀 상이하기 때문에, 면역세포 치료제의 종류에 따라 맞춤형 동결보존 방법 및 제형의 연구 및 개발이 필요하다. 그러나, 최근까지 NK 세포 기반의 면역세포 치료제는 배양 및 분화의 어려움 등으로 임상에의 사용이 T 세포 기반의 면역세포 치료제에 비해 연구 및 투자가 저조하였기 때문에, 동결보존 방법 및 제형에 대한 보고가 부족하다.
이러한 요구에 부응하여, PCT-US2020-050742는 NK 세포 치료제의 동결보존 제형을 개시한다. PCT-US2020-050742는 Plasmalyte A, HSA, 및 DMSO를 포함하는 NK 세포의 동결보존 배지를 개시하나, 10%에 해당하는 고농도의 DMSO를 포함하는 것을 특징으로 한다. 그러나, A. Stolzing 등의 보고(Transfusion and Apheresis Science 46 (2012) 137-147) 및 Rowley SD 등의 보고(Bone Marrow Transplant 2003;31(11):1043-51)와 같은 다수의 문헌에서, DMSO를 10% 이상의 함량으로 포함하는 동결보존 세포를 인체에 주입하는 경우, 독성을 나타내며, 낮은 농도로 포함하는 경우에 독성의 감소 뿐만 아니라 면역세포 치료제의 치료효과가 더욱 향상될 수 있는 것으로 보고된다. 또한, 10% 이상의 DMSO를 포함하는 면역세포 치료제의 제형은 메스꺼움, 구토, 오한, 심혈관 질환과 같은 비교적 가벼운 부작용부터(Anticancer Res 1998;18(6B):4705-8; Bone Marrow Transplant2000;25(2):173-7; Transfusion 1991;31(2):138-41), 신경독성 및 신경 부종과 같은 심각한 부작용에 이르기까지(Cytotherapy 1999;1(6):439-46; Neurology 2007;68(11):859-61.) 높은 독성을 나타낸다.
이러한 배경기술 하에서 본 발명자들은 새로운 NK 세포 치료제의 동결 제형을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 독성을 나타내는 동결보호제의 농도를 감소시키고, 이를 생체 친화적 물질로 대체하여 NK 세포의 동결보존용 조성물 및 이를 포함하는 제형을 개발하였으며, 상기 제형으로 NK 세포 치료제를 동결 보존 후에도 높은 세포 수득률/생존률을 나타내며, 우수한 암세포 살상능력을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 NK 세포를 효과적으로 동결보존하기 위한 NK 세포의 동결보존용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 NK 세포의 동결보존 제형을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 NK 세포의 동결보존용 조성물을 이용한 NK 세포의 동결보존 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 NK 세포 및 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 세포치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 NK 세포 및 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 NK 세포의 동결보존용 조성물을 제공한다:
(i) 베이스 용액(base solution);
(ii) 혈장 알부민(serum albumin);
(iii) DMSO; 및
(iv) 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 동결보호제.
본 발명은 또한, 상기 동결보존용 조성물의 NK 세포의 동결 보존 제형의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, NK 세포 및 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 NK 세포의 동결보존 제형을 제공한다.
본 발명은 또한
(a) NK 세포를 상기 동결보존용 조성물에 현탁하여 NK 세포 동결보존 제형을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 NK 세포 동결보존 제형을 동결시키는 단계를 포함하는 NK세포의 동결보존 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, NK 세포 및 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 면역세포 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, NK 세포 및 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 NK세포의 동결보존 제형, 면역세포 치료제 또는 약학 조성물의 이용한 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 NK 세포의 동결보존 제형 또는 면역세포 치료제의 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 NK 세포의 동결보존 제형, 면역치료제 또는 약학 조성물의 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
도 1은 각각의 NK 세포 동결보존 제형을 4주간 동결보존하고, 해동 후 세포 수득율(A) 및 생존율(B)을 비교한 결과이다. 각 그룹별 실험 횟수는 다음과 같다: 비교예(n=12); 후보군 1-1(n=11); 후보군 1-2(n=2); 후보군 1-3(n=2); 후보군 2-1(n=10); 후보군 2-2(n=2); 후보군 3-1(n=9); 후보군 3-2(n=2).
도 2는 각각의 제형으로 동결보존된 NK 세포를 해동한 후, NK세포의 자연살해 세포의 활성 또는 저해를 나타내는 표면 마커를 확인한 결과이다. 각 그룹별 실험 횟수는 다음과 같다: 비교예(n=20); 후보군 1-1(n=16); 후보군 1-2(n=6); 후보군 1-3(n=3); 후보군 2-1(n=17); 후보군 2-2(n=3); 후보군 3-1(n=17); 후보군 3-2(n=3).
도 3은 각각의 제형으로 동결보존된 NK 세포를 해동한 후, NK세포의 자연살해 세포독성 마커(탈과립 마커)를 확인한 결과이다. 각 그룹별 실험 횟수는 다음과 같다: 비교예(n=20); 후보군 1-1(n=16); 후보군 1-2(n=6); 후보군 1-3(n=3); 후보군 2-1(n=17); 후보군 2-2(n=3); 후보군 3-1(n=17); 후보군 3-2(n=3).
도 4는 각각의 제형으로 동결보존된 NK 세포를 해동한 후, 각각의 E:T ratio에서 표적 암세포(K562)에 대한 살상 능력을 확인한 결과이다.
도 5는 각각의 제형으로 동결보존된 NK 세포를 해동한 후, 각각의 E:T ratio에서 표적 암세포(BT474)에 대한 살상 능력을 확인한 결과이다.
도 6은 각각의 제형으로 동결보존된 NK 세포를 해동한 후, 각각의 E:T ratio에서 표적 암세포(MDA-MB-231)에 대한 살상 능력을 확인한 결과이다.
도 7은 다양한 평균 분자량 및 농도의 PEG를 포함하는 제형으로 동결보존된 NK세포를 해동한 뒤, NK 세포의 수율 및 생존율을 확인한 결과이다.
도 8은 다양한 평균 분자량 및 농도의 PEG를 포함하는 제형으로 동결보존된 NK세포를 해동한 뒤, NK 세포의 세포 표면 마커를 확인한 결과이다.
도 9는 다양한 평균 분자량 및 농도의 PEG를 포함하는 제형으로 동결보존된 NK세포를 해동한 뒤, NK 세포의 세포독성 마커를 확인한 결과이다.
도 10은 다양한 평균 분자량 및 농도의 PEG를 포함하는 제형으로 동결보존된 NK세포를 해동한 뒤, NK 세포의 암세포 살상능력을 확인한 결과이다. 도 10A는 K562 암세포에 대한 해동된 NK 세포의 살상능력을 나타내며, 도 10B는 DLD-1 암세포에 대한 해동된 NK 세포의 살상능력을 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에 기재된 농도 범위에 있어서, “내지”는 양 임계 범위를 포함(이상 및 이하)하는 의미로 사용되었으며, 양 임계 범위를 포함하지 않는 경우 “초과” 및 “미만”으로 농도 범위를 기재하였다. 본 명세서에서 수치에 사용된 “약”은 통상의 기술자에 의해 기재된 수치와 실질적으로 동등한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대되는 범위를 포함하는 의미로 사용되며, 예를 들어, 기재된 수치 값의 ±20%, ±10%, ±5% 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
최근 NK 세포 기반의 면역세포 치료제는 T 세포 기반의 면역세포 치료제에 대비하여 많은 장점을 나타내며, 따라서, 광범위한 임상적 응용 잠재력을 갖는 새로운 면역세포 치료제로서 부상하고 있다(Cancer Letters 472 (2020): 175-180; Frontiers in Immunology 10 (2019): 2683).
면역세포 치료제는 살아있는 면역 세포의 활성에 그 효과가 결정되기 때문에, 세포의 생존성, 활성을 유지하면서도 장기간 보관할 수 있는 방법을 개발하는 것이 임상적 적용에 있어 중요한 요소 중 하나이며, 일반적인 보관방법인 동결보존(cryopreservation)의 경우, 용액에 의한 효과(solution effects), 세포 내/외 얼음 결정 형성, 및 탈수와 같은 한계의 극복을 위해 동결 제형에 대한 최적화가 필수적으로 수반되어야 한다.
종래 세포 내/외 얼음 결정 형성 등에 대한 동결보호제(cryoprotectant)로서, 고농도(약 8~10%(v/v) 이상)의 메틸 설폭사이드(DMSO), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 및 HES(hydroxyethyl starch)등이 일반적으로 사용되어 왔다. 그러나 상기한 동결보호제 물질은 고유한 독성을 나타내며, 동결과정에서 세포 내에 농축되기 때문에 면역세포 치료제에 치명적이거나, 추후 환자에게 투여하는 경우에 독성을 나타낼 수 있다는 연구결과가 다수 보고되고 있다(PeerJ. 3: e1039).
본 발명의 일 실시예에서는, 고유한 비특이적 독성을 갖는 동결보호제를 생체 친화적이고 비독성의 첨가물질(글루코스, PEG 및 트레할로스)로 대체하여, HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 및 HES(hydroxyethyl starch)를 포함하지 않는 저농도의 DMSO를 포함하는 NK세포의 동결보존용 조성물을 설계하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 다양한 조성비로 동결보호제(글루코스, PEG 및/또는 트레할로스)를 첨가한 후, 세포 수득률/생존률, 세포 표면 마커 및 독성 마커 발현을 비교한 결과 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 및 HES(hydroxyethyl starch)를 포함하지 않는 저농도의 DMSO를 사용하였음에도 불구하고 시판되는 동결보존용 조성물보다 동등하거나 높은 수준의 세포 생존률 및 마커 발현 특성을 나타내는 것을 확인하였으며, 세포 수득률 및 표적 암세포에 대한 살상능력은 현저하게 상승하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음을 포함하는 NK 세포의 동결보존용 조성물에 관한 것이다:
(i) 베이스 용액(base solution);
(ii) 알부민(serum albumin);
(iii) DMSO; 및
(iv) 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 추가 동결보호제.
본 발명의 용어, “베이스 용액”은 인간의 혈액 또는 체액과 유사한 특성을 가져, NK 세포에 손상을 주지 않는 용액으로, 바람직하게는 본 발명의 동결보존용 조성물에 가장 큰 부피비율로 포함되어 베이스가 되는 액체 조성물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트(및/또는 락테이트) 및 글루코네이트로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트 및 글루코네이트 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트 및 글루코네이트를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 NK세포의 활성 및 생존성에 부정적인 영향을 주지 않는 것이라면, 상기 개시된 물질 이외에도, 추가적인 염, 당, 지질, 단백질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 NK 세포의 손상을 막기 위해, 적절한 pH 및 삼투농도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 사람의 혈장 또는 체액과 비슷한 pH 및 삼투농도(Osmolality)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액의 pH는 약 4.0 내지 약 8.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0, 더욱 바람직하게는 약 7.0 내지 약 8.0, 가장 바람직하게는 약 7.4 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액의 삼투몰농도(Osmolality)는 약 200 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 바람직하게는 약 250 mOsm/L 내지 약 350 mOsm/L, 보다 바람직하게는 약 280 mOsm/L 내지 약 310 mOsm/L, 가장 바람직하게는 약 300 mOsm/L 또는 약 294 mOsm/L인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 시중에서 판매되는 수액 또는 이의 변형 조성물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 플라즈마 솔루션 A(Plasma solution A), Plsma-lyte(예, Plasma-lyte A, Plasma-lyte 148, Plasma-lyte 56 등) 하트만 용액(Hartmann’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution), 약 0.5% saline, Sterofundin, 또는 이들과 유사한 조성의 용액이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 플라즈마 솔루션 A 또는 Plsma-lyte(예, Plasma-lyte A, Plasma-lyte 148, Plasma-lyte 56 등)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 아래 조성을 갖는 플라즈마 솔루션 A를 사용하였으며, 본 발명의 실시예에서 제조된 NK 세포의 동결보존용 조성물에 포함된 플라즈마 솔루션 A의 조성은 아래와 같다:
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본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 상기 플라즈마 솔루션 A와 같이, 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트, 및 글루코네이트를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 플라즈마 솔루션 A에 포함된 각 성분의 동결보존용 조성물 내 최종농도는 동결보존용 조성물에 포함된 베이스솔루션의 분율(%(v/v))에 따라 상이할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 동결보존용 조성물의 베이스 용액이 포함하는 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트, 및 글루코네이트의 최종농도(%(w/v))는 바람직하게는 실시예에서 상기 표의 최종 농도의 ±20%, 보다 바람직하게는 ±10%일 수 있으며, 이 경우에도 본 발명의 실시예에서 확인한 것과 실질적으로 동등한 효과를 기대할 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 하기에서 기술할 다른 구성성분의 바람직한 조성비를 제외한 나머지 조성 분율을 차지하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 알부민을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어, “알부민”은 인체 혈장에 가장 많이 존재하는 주요 단백질로서(약 50~60%), 혈장 삼투압, 영양분 및 이온 등의 세포 내 전달, 면역 및 에너지 대사에 관여한다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민은 혈장 알부민, 바람직하게는 인간 혈장 알부민인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민은 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 최종 농도, 바람직하게는 약 2%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 더욱 바람직하게는, 약 3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 4%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민은 이와 유사한 역할을 수행하는 다른 단백질로 대체 또는 조합되어 포함될 수 있다. 알부민과 유사한 역할을 수행하는 단백질로는 예를 들어, 알파-태아 단백질(α-fetoprotein), 비타민 D 결합 단백질(vitamin D binding protein) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 DMSO를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어, “DMSO(Dimethylsulfoxide)”는 황화다이메틸을 산화하여 얻는 화합물로, 세포의 동결보존에 있어서 세포 내/외의 얼음 결정 형성 등으로부터 세포를 보호하기 위한 동결보호제(cryoprotectant)로 가장 많이 사용된다. 그러나, 다양한 문헌에서, DMSO는 비특이적인 세포 독성으로 인해 다양한 세포 손상을 야기하는 것으로 보고된다(Transfusion and Apheresis Science 46 (2012) 137-147; 및 Bone Marrow Transplant 2003;31(11):1043-51 등). DMSO의 세포손상 기전은 세포 내 삼투압의 급속한 증가, 미토콘드리아 손상 등에 의한 것으로 보고되었으며, 특히 가임기 여성에서 수정란의 착상이상을 야기해 임신 중 태아의 발달에 심각한 손상을 야기 등 다양한 부작용 보고된 바 있다(Theranostics (IF: 8.712)). 또한, DMSO와 함께 동결보호제로 사용되는 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 및 HES(Hydroxy Ethyl Starch) 또한, 비특이적인 세포독성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Transfusion and Apheresis Science 46 (2012) 137-147). 약 10%(v/v)의 DMSO는 세포에 치명적인 독성을 나타내는 것으로 보고되며, 약 5% (v/v)이하의 DMSO를 사용하는 것이 세포에 치명적이지 않을 수 있음이 보고된 바 있다.
따라서, 본 발명의 동결보존용 조성물은 저농도의 DMSO를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DMSO는 약 0.001%(v/v) 이상 약 10%(v/v) 미만, 바람직하게는 약 0.005%(v/v) 내지 약 8%(v/v), 더욱 바람직하게는 약 0.1%(v/v) 내지 약 6%(v/v), 가장 바람직하게는 약 5%(v/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 및/또는 HES(Hydroxy Ethyl Starch)를 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
종래의 보고 및 시판되는 세포의 동결보존용 조성물의 경우와 같이, 충분한 동결보호효과를 위해 일반적으로 사용되는 DMSO의 농도는 약 8-10%(v/v) 이상이다. 본 발명의 배지조성물은 저농도의 DMSO를 사용하여 유의미한 부작용 및 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다. 따라서, 충분한 동결보호효과를 위해 추가적인 동결보호제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 동결보호제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제는 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 약 100g/mol 내지 약 20000g/mol의 평균 분자량, 바람직하게는 약 200g/mol 내지 약 20000g/mol의 평균 분자량, 더욱 바람직하게는 약 400g/mol 내지 약 20000g/mol의 평균 분자량, 가장 바람직하게는 약 200g/mol, 약 400g/mol, 약 2000g/mol 또는 약 20000g/mol의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 평균 분자량은 동결보존제형에 포함된 폴리에틸렌글리콜의 각 분자가 갖는 분자량의 평균을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존제형에 포함된 폴리에틸렌글리콜은 상기 평균 분자량을 기준으로 약 ±50%, 바람직하게는 약 ±40%, 더욱 바람직하게는 약 ±30%, 더욱 바람직하게는 약 ±20%, 가장 바람직하게는 약 ±10% 또는 약 ±5% 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 할 수 잇다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제가 글루코스인 경우, 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 바람직하게는 약 1%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 1%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 가장 바람직하게는 약 1.25%(w/v) 내지 2.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제가 폴리에틸렌글리콜인 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.04%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 약 0.225%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 약 0.625%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v), 약 0.225%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v), 또는 약 0.625%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 약 400g/mol의 평균 분자량을 갖는 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.625%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 약 4000g/mol의 평균 분자량을 갖는 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.225%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 약 20000g/mol의 평균 분자량을 갖는 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제가 트레할로스인 경우, 약 0.5%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 1%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 1.7%(w/v) 내지 8.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 혈장 알부민은 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 최종 농도, 바람직하게는 약 2%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 더욱 바람직하게는, 약 3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 4%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는, 다음으로 구성되는(consist of) NK 세포의 동결보존용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다:
(i) 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트 및 글루코네이트로 구성된 베이스 용액(base solution);
(ii) 인간 혈장 알부민(Human serum albumin);
(iii) DMSO; 및
(iv) 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 동결보호제.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 NK 세포의 손상을 막기 위해, 적절한 pH 및 삼투농도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 사람의 혈장 또는 체액과 비슷한 pH 및 삼투농도(Osmolality)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액의 pH는 약 4.0 내지 약 8.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0, 더욱 바람직하게는 약 7.0 내지 약 8.0, 가장 바람직하게는 약 7.4 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액의 삼투몰농도(Osmolality)는 약 200 mOsm/L 내지 약 400 mOsm/L, 바람직하게는 약 250 mOsm/L 내지 약 350 mOsm/L, 보다 바람직하게는 약 280 mOsm/L 내지 약 310 mOsm/L, 가장 바람직하게는 약 300 mOsm/L 또는 약 294 mOsm/L인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이스 용액은 시중에서 판매되는 수액 또는 이의 변형 조성물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는 플라즈마 솔루션 A, Plsma-lyte(예, Plasma-lyte A, Plasma-lyte 148, Plasma-lyte 56 등) 또는 이들과 유사한 조성의 용액이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 플라즈마 솔루션 A에 포함된 각 성분의 동결보존용 조성물 내 최종농도는 동결보존용 조성물에 포함된 베이스솔루션의 분율(%(v/v))에 따라 결정됨은 통상의 기술자에게 자명하다 할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 동결보존용 조성물의 베이스 용액을 구성하는 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트, 및 글루코네이트의 최종농도(%(w/v))는 바람직하게는 실시예에서 기재된 각 성분의 최종 농도의 ±20%, 보다 바람직하게는 ±10%일 수 있으며, 이 경우에도 본 발명의 실시예에서 확인한 것과 실질적으로 동등한 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 혈장 알부민은 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 최종 농도, 바람직하게는 약 2%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 더욱 바람직하게는, 약 3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 4%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DMSO는 약 0.001%(v/v) 이상 약 10%(v/v) 미만, 바람직하게는 약 0.005%(v/v) 내지 약 8%(v/v), 더욱 바람직하게는 약 0.1%(v/v) 내지 약 6%(v/v), 가장 바람직하게는 약 5%(v/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제는 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 동결보호제로서 다양한 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜, 예를 들어, PEG-400, PEG-4000 또는 PEG-20000의 폴리에틸렌 글리콜을 다양한 농도로 사용한 동결보존 제형을 해동 후, NK 세포의 수율 및 생존율을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 약 100g/mol 내지 약 20000g/mol의 평균 분자량, 바람직하게는 약 200g/mol 내지 약 20000g/mol의 평균 분자량, 더욱 바람직하게는 약 400g/mol 내지 약 20000g/mol의 평균 분자량, 가장 바람직하게는 약 200g/mol, 약 400g/mol, 약 2000g/mol 또는 약 20000g/mol의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 평균 분자량은 동결보존제형에 포함된 폴리에틸렌글리콜의 각 분자가 갖는 분자량의 평균을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존제형에 포함된 폴리에틸렌글리콜은 상기 평균 분자량을 기준으로 약 ±50%, 바람직하게는 약 ±40%, 더욱 바람직하게는 약 ±30%, 더욱 바람직하게는 약 ±20%, 가장 바람직하게는 약 ±10% 또는 약 ±5% 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제가 글루코스인 경우, 약 0.5%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 바람직하게는 약 1%(w/v) 내지 약 4%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 1%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 가장 바람직하게는 약 1.25%(w/v) 내지 2.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제가 폴리에틸렌글리콜인 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.04%(w/v) 내지 약 3%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 약 0.225%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 약 0.625%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v), 약 0.225%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v), 또는 약 0.625%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v) 의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 약 400g/mol의 평균 분자량을 갖는 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.625%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 약 4000g/mol의 평균 분자량을 갖는 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.225%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 약 20000g/mol의 평균 분자량을 갖는 경우, 약 0.01%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 0.02%(w/v) 내지 약 6%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 0.045%(w/v) 내지 약 2.25%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보호제가 트레할로스인 경우, 약 0.5%(w/v) 내지 약 10%(w/v), 바람직하게는 약 1%(w/v) 내지 약 9%(w/v), 더욱 바람직하게는 약 1.7%(w/v) 내지 8.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 혈장 알부민은 약 1%(w/v) 내지 약 10%(w/v)의 최종 농도, 바람직하게는 약 2%(w/v) 내지 약 8%(w/v), 더욱 바람직하게는, 약 3%(w/v) 내지 약 5%(w/v), 가장 바람직하게는 약 4%(w/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 실시예의 후보군 1-1 내지 1-2, 후보군 2-1 내지 2-2 및 후보군 3-1(표 1)은 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), HES(Hydroxy Ethyl Starch)을 포함하지 않는 저농도의 DMSO 조건에서도 세포의 표면 마커(도 2)와 NK세포 탈과립 능력(도 3)이 종래의 동결보존용 배지(CS10)를 사용한 제형과 동일한 수준을 나타냄과 동시에 보다 높은 세포 수득률(도1, A) 및 현저히 뛰어난 NK세포의 실제 암세포 살상 능력(도 4 내지 도 6)을 나타내었다. 이 중 후보군 2-1의 경우 해동 시 가장 높은 수득률을 보이면서도 높은 암세포 살상능력을 안정적으로 나타내었다.
본 발명은 다른 관점에서, NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물을 포함하는 NK 세포의 동결보존 제형에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 NK 세포의 동결보존 제형은 NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물외에도, 에너지원, 기타 단백질 등의 추가성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “NK 세포” 는 ‘자연 살해 세포(Natural killer cell)’ 불리며, 선천성 면역의 구성자로 MHC 독립적인 세포 사멸을 유도한다. 본 발명에 있어서, 상기 NK 세포는 생물 내에 자연적으로 존재하는 NK 세포뿐만 아니라, 유전자 조작된 NK 세포(예, CAR-NK 등), NK 세포 기반의 세포 치료제들을 포괄하는 광의의 의미로 사용된다. 상기 NK 세포는 다양한 표면 마커에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 상기 NK 세포는 CD3(-)CD56(+) NK세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 관점에서, 상기 동결보존용 조성물은 위에서 기재한 것과 동일한 특징을 공유할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) NK 세포를 상기 동결보존용 조성물에 현탁하여 NK 세포 동결보존 제형을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 NK 세포 동결보존 제형을 동결시키는 단계를 포함하는 NK세포의 동결보존 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 NK 세포를 약 1x102 cells/mL 내지 약 1x1013 cells/mL, 바람직하게는 약 1x105 cells/mL 내지 1x109 cells/mL의 농도로 현탁하여 동결보존 제형을 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 ‘동결’은 통상적인 방법을 통하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 ‘동결’은 유리화 동결(vitrification), 완만 동결(slow freezing) 등의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 동결에서 본 발명의 동결보존용 조성물은 세포 내 얼음 결정 형성을 방지하고, 세포를 보호하는 기능을 수행할 수 있으며, 해동 후 세포의 수득률/생존률을 현저히 높일 수 있다.
본 발명의 용어, “유리화 동결(vitrification)”은 세포를 냉각함으로써 유리화 하는 것을 의미한다(Nature. 313 (6003): 573-5; Cryo Letters. 25 (4): 241-54). 유리화 동결은 얼음결정의 형성없이 동결보존이 가능한 이점이 있다. 상기 유리화 동결은 수 분 내지 수 시간 이내에 최종 도달 온도까지 냉각시키는 비교적으로 온도의 급격한 감소를 통해 수행될 수 있다. 상기 유리화 동결은 통상의 방법으로 수행될 수 있으며, 최종 도달온도 및 온도의 감소 속도는 세포의 종류, 동결보존 제형 등에 따라 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 계산될 수 있다(G. Allahbadia et al., Vitrification in Assisted Reproduction, ⓒ Springer India 2015). 예를 들어, 상기 유리화 동결은 본 발명의 동결보존용 조성물에 세포를 현탁시켜 동결보존 제형을 제조하고, CRF(controlled rate freezing)와 같은 장비를 이용하여 수 분 내지 수 시간 이내에 속도로 온도를 감소시켜 최종 도달 온도에 도달하면 동결된 세포를 질소 탱크에 보관하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “완만 동결(slow freezing 또는 slow cooling)은 비교적 느리게 온도를 감소시켜, 세포를 천천히 동결시키는 방법을 의미하며, 느린 프로그램 가능한 동결(slow programmable freezing)과 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용될 수 있다. 상기 완만 동결은 수 시간 내지 수십 시간 동안 최종 도달 온도까지 냉각시키는 비교적 느린 온도의 감소를 통해 수행될 수 있다. 상기 완만 동결은 통상의 방법으로 수행될 수 있으며, 최종 도달온도 및 온도의 감소 속도는 세포의 종류, 동결보존 제형 등에 따라 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 동결보존용 조성물에 세포를 현탁시켜 동결보존제형을 제조하고, 상기 동결보존제형이 담긴 바이알을 이소프로필 알코올이 담긴 냉동용 컨테이너 박스에 넣고, 초저온 냉동고에서 수 시간 내지 수십 시간 동안 온도를 일정하게 떨어뜨려 세포를 동결시켜 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 인체에 독성 및 부작용을 나타내는 HES 및/또는 HEPES등의 동결보호제를 포함하지 않으며, 인체에 유해하지 않은 수준의 저농도 DMSO를 동결보호제로 포함하고, 생체 친화적이고 비독성인 동결보호제의 배합으로 NK세포의 높은 생존율/수득률과 함께, 표적 암세포에 대한 살상능력의 현저한 향상을 나타내도록 한다. 유독성 동결보호제의 최소화로 인해 본 발명의 동결보존용 조성물 및 NK 세포를 포함하는 제형은 별도의 추가 공정 또는 처리 없이도 대상에 투여되어 대상에게서 NK 세포치료제의 의도한 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물을 포함하는 면역세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 용어, “면역세포 치료제”는 투여된 대상의 면역체계를 직/간접적으로 활성화시키거나 세포의 직접적인 효과를 통해 질환을 치료하는 면역요법에 사용되는 제제로서, 환자, 동종 또는 이종의 대상으로부터 추출된 면역세포 또는 공학적으로 엔지니어링된 면역세포를 포함하는 치료제를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포 치료제는 동결보존된 본 발명의 NK 동결보존 제형을 해동한 뒤 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “해동(Thawing)”은 동결보존된 세포를 녹여서 재활성화 하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 해동은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 약 37℃로 미리 데워진 water bath에 동결보존된 면역세포 치료제가 담긴 용기를 약 1시간 이상 담가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포의 종류, 동결보존제형, 용량 등에 따라 온도, 해동시간이 조절될 수 있다.
특히, 본 발명의 면역세포 치료제는 생체에 독성을 나타내는 것으로 알려진 동결보호제인 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), HES(Hydroxy Ethyl Starch)를 포함하지 않으며, 종래 알려진 동결보존용 조성물 보다 현저히 낮은 저농도의 DMSO를 포함하기 때문에 별도의 유해성 동결보호제의 제거 절차 없이도 즉시 사용할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포 치료제는 해동 뒤, 즉시 사용할 수 있는(Ready to use) 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, “즉시 사용할 수 있는(Ready to use)”은 해동 후, 별도의 희석/농축, 재가용화(reconstitution) 또는 재수화(rehydration) 과정 없이 약학적으로 유효한 농도로 즉시 사용/투여 가능함을 의미한다.
본 발명의 면역세포 치료제는 즉시 사용할 수 있는 형태이므로 (ready to use), 사용자의 편의성이 제고될 뿐만 아니라 희석/농축 또는 재가용화(reconstitution) 또는 재수화(rehydration)과정에서 발생할 수 있는 오류 등으로 인한 활성 편차, 오염 등을 방지할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포 치료제는 의학적 또는 약학적으로 유효한 농도로 NK 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 면역세포 치료제는 NK 세포를 1x102 내지 1x1013 cells/mL, 바람직하게는 1x105 내지 1x109 cells/mL의 최종 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물을 포함하는 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 본 발명의 NK 동결보존 제형을 해동한 뒤, 사용 또는 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 해동 뒤, 즉시 사용할 수 있는(Ready to use) 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 NK 세포를 1x102 내지 1x1013 cells/mL, 바람직하게는 1x105 내지 1x109 cells/mL의 최종 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수있다.
본 발명에 있어서, 상기 NK 세포는 생물 내에 자연적으로 존재하는 NK 세포뿐만 아니라, 유전자 조작된 NK 세포(예, CAR-NK 등), NK 세포 기반의 세포 치료제들을 포괄하는 광의의 의미로 사용된다. 상기 NK 세포는 다양한 표면 마커에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 상기 NK 세포는 CD3(-)CD56(+) NK세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암, 면역 질환 또는 감염성 질환 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 NK세포의 동결보존제형, 면역세포 치료제 또는 약학 조성물을 이용한 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 NK세포의 동결보존제형, 면역세포 치료제 또는 약학 조성물은 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 대상에게 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 NK세포의 동결보존제형, 면역세포 치료제 또는 약학 조성물은 해동 뒤, 즉시 사용할 수 있는(Ready to use) 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명의 NK세포의 동결보존제형, 면역세포 치료제 또는 약학 조성물의 동결보존 제형의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 NK세포의 동결보존제형, 면역세포 치료제 또는 약학 조성물의 동결보존 제형의 암, 면역질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암, 면역 질환 또는 감염성 질환 예방 또는 치료를 위한 상기 NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 상기 NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 ‘암’은 ‘종양’과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 약학 조성물은 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 암에 적용이 가능하다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기(organ)에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다. 본 발명에 따른 면역치료제 또는 약학 조성물을 이용하여 치료가능한 암은 특별히 한정되는 것은 아니며, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, ‘면역 질환’은 비정상적인 면역 반응에 의해 발생하는 질환으로, 예를 들어, 자가면역질환, 이식거부 또는 관절염인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 자가면역질환은 예를 들어, 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능 저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere’s syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 전신성 경피증, 천식 또는 궤양성 대장염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 이식거부는 동종이식 거부반응(allograft rejection) 또는 이식편대숙주질환(GVHD)일 수 있다.
본 발명에 있어서, ‘감염성 질환’은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus; HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “예방”은 본 발명의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여로 암, 면역 질환 또는 감염성 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, “치료”는 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 발전의 억제, 증상의 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명에 따른 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 NK 세포를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 NK 세포 및 본 발명의 동결보존용 조성물과 함께 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PBMC 유래 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포 준비 및 배양
실시예 1-1: 자연 살해 세포 준비
CD3(-) 세포를 수득하기 위해, PBMC(peripheral blood mononuclear cell, Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA, Cat#: SER-PBMC-200-F)를 ADAM-MC2 자동 세포 계수기(NanoEnTek, ㈜코스모진텍 구입)를 이용하여 세포수를 측정하였다. 계수된 PBMC를 새로운 튜브로 옮긴 후 300×g, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리 하였다.
CliniMACS PBS/EDTA buffer(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 200-070-029)에 0.5%(v/v) HSA(human serum albumin)와 1 mM 농도의 EDTA를 추가한 CliniMACS 버퍼(pH 7.2)를 제조하고, 원심분리가 끝난 상기 PBMC 세포에 대해 1×107 세포수 당 80 μL 의 CliniMACS 버퍼와 20 μL 의 CD3 자성비드(Miltenyi biotech, 130-050-101)를 처리하여 세포 pellet을 현탁한 후, 4℃ 온도에서 15분간 반응시켰다. 세척을 위해 10 mL MACS 버퍼를 넣고 340×g, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 세포 pellet을 0.5 mL의 CliniMACS 버퍼에 재현탁하였다. LD 컬럼(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-042-901)에 먼저 2 mL의 MACS 버퍼를 흘려준 후, 상기 세포 재현탁액을 흘려주어, LD 컬럼을 통과하여 나오는 CD3(-) 세포를 수득하였다. 이때, LD 컬럼 내에 남아있는 세포가 충분히 분리될 수 있도록 2 mL의 CliniMACS 버퍼를 3회 흘려주어 CD3(-) 세포를 수득한 뒤, 새로운 튜브에 담아 340×g, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리 하였다. 그 후, 상층액을 제거한 후, 1×107 개의 세포 수 당 80 μL의 MACS 버퍼와 20 μL의 CD56 자성비드(Miltenyi biotech, Cat#: 130-050-401)를 넣고 4℃ 온도에서 15분간 반응시켰다. 세척을 위해 10 mL CliniMACS 버퍼를 넣어 340×g, 4℃ 온도에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을버리고 0.5 mL의 CliniMACS 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁하였다. LS 컬럼(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-042-901)에 먼저 3 mL의 CliniMACS 버퍼를 흘려준 후, 상기 세포 현탁액을 흘려주었다. 이때, LS컬럼 내에 남아있는 세포가 충분히 분리될 수 있도록 2 mL의 CliniMACS 버퍼를 3회 흘려주어 주었다. 그 후, LS 컬럼을 자성스탠(Magnet stand)에서 분리한 후, 5 mL의 CliniMACS 버퍼를 넣고 피스톤으로 압력을 주어 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포를 수득하였다.
상기 수득한 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포를 새로운 튜브에 담아 340×g, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하고 배양배지에 현탁시켜 세포 계수기를 이용하여 세포수를 측정하였다.
실시예 1-2: 자연살해세포 배양
NK Cell Activation/Expansion Kit (Cat#: 130-112-968) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)내 NK activation Beads를 제조하기 위해 100 μL CD335 (NKp46)-Biotin + 100 μL CD2- Biotin를 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣고 혼합한 후, 500 μL Anti-Biotin MACSiBead Particles를 넣고 혼합 후 300 μL MACS buffer를 넣고 마이크로 튜브 로테이터를 이용하여 2-8°C에서 2시간동안 혼합하였다. CD3(-)CD56(+) 세포수를 고려하여 1x106 cells당 5 μL NK activation Beads를 새로운 튜브에 옮겨 준 뒤, 1 mL NK MACS medium(Cat#: 130-094-483) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 넣어주고 300×g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액 제거 후 사용할 NK MACs medium (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-094-483)를 106 NK cells당 5 μL 기준으로 추가하여 NK activation Beads를 풀어준다. (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-094-483)에 5% human AB serum(MILAN Analytica AG, Rheinfelden, Switzerland Cat#: 000084)이 첨가된 배지에서 GI-101(GICELL Inc) 50 nM/mL 존재하에 자연살해세포를 21일간 배양하였다.
실시예 2: NK 세포 동결보존용 조성물의 제조 및 동결보존
실시예 2-1: NK 세포 동결보존용 조성물의 제조
동결보존용 조성물을 제조하기 위해 50%(v/v)의 플라스마솔루션에이주(에이치케이노엔), 5%(v/v)의 DMSO(Avantor, CAT# 9033-04-01), 20%(v/v)의 알부민주(녹십자)를 순서대로 혼합하여 표 1의 기본조성을 준비하였다. 그 후, 추가적인 동결보호제로, Glucose(JW중외제약), PEG400(Polyethylene Glycol 400 (USP-NF, BP, Ph. Eur. pure, pharma grade, PanReac AppiliChem, CAT# 142436), 트레할로스(Trehalose, Spectrum, CAT# T9601)를 표 1에 기재된 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 이때, 추가된 동결보호제의 용량(Volume)은 전체 조성물의 25%가 되도록 플라스마솔루션에이주에 희석하여 사용하였다. 대조군으로는 상업적으로 구매가능한 동결보존용 조성물인 CS10 배지(표 2)를 사용하였다.
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실시예 2-2: NK 세포의 동결보존
실시예 1에서 제조된 NK 세포를 상기 NK 세포 동결보존용 조성물에 1x106 cells/mL이 되도록 현탁하여, NK 세포의 동결제형을 제조하고, 바이알에 1ml씩 분주하여 하루 동안 초저온 냉동고에 보관한 뒤, LN2로 이동하여 동결보존하였다.
실시예 3: 해동 후 동결제형 후보군별 수율 및 생존율 확인
4주동안 동결보존된 NK세포의 생존 세포 수 및 생존율은 ADAM cell counter Accustain kit(DigitalBio)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 측정하였다.
구체적으로는, 동결된 NK세포를 Thawing 한 후, 1x106 cell/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석하고, 14μL씩 바닥이 둥근 96 웰 플레이트의 2개의 웰에 각각 분주하였다. 배양한 세포를 계수하여 2개의 웰 중 하나에는 총 세포 수를 측정할 수 있는 T 용액(solution) 14 μL를 첨가하여 희석된 세포와 섞어준 뒤, 이 중 14 μL를 취하여 계수기 칩(chip)의 T 패널에 넣었다. 한편, 죽은 세포 수를 측정할 수 있는 N 용액을 다른 하나의 웰에 14 μL 첨가하여 희석된 세포와 섞어준 뒤, 이 중 14 μL를 취하여 계수기 칩의 N 패널에 넣어주었다. 상기 칩을 ADAM 계수기에 삽입하고 생존 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실시예 1에 따라 4주동안 동결된 NK세포의 생존 세포 수 및 생존율을 확인한 결과, 도 1에 도시된 것과 같이, 대조군(CS10)을 사용한 동결제형으로 동결 보관된 NK세포를 기준으로 보았을 때, 표 1의 후보군을 사용한 동결제형은 대체적으로 동등 수준의 세포 수득률 및 생존율을 보임을 확인하였다. 이 중에서도 후보군 1-2 내지 1-3, 후보군 2-1 내지 2-2 및 후보군 3-2를 첨가한 후보군의 수율이 높은 경향을 보였으며, PEG를 안정화제로 포함하는 후보군2-1은 가장 뛰어난 수율을 나타내었다.
실시예 4: 동결보존된 NK 세포의 표면 마커 확인
8종의 동결제형을 사용해서 동결되었던 자연살해세포들을 각각 NK MACS medium(NK MACS medium, Miltenyi) 10 mL에 풀고, 1,300 rpm 조건에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 NK MACS medium 10 mL을 넣어 펠릿을 현탁하였다.
PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 μg/mL 폴리믹신B(PolymyxinB), 100 U/mL 페니실린(Penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(Streptomycin), 1 mM 피루브산나트륨(Sodium pyruvate)을 첨가하여 FACS버퍼를 제조하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2×106 cells/mL이 되도록 FACS buffer로 희석하였다. 96 well plate에 희석한 세포 용액을 100 μL씩 넣고, 1,300 rpm조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 FACS buffer 200 μL을 넣어 펠릿을 풀어주었다. 1,300rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고, 200X Fc block(Biolegend, San Diego, CA, USA) 용액을 FACS 버퍼에 1X 농도로 제조한 Fc 블로킹 용액(Fc blocking solution) 50 μL를 각 웰(well)에 넣고 얼음에 10분간 방치하였다.
FITC가 표지된 항-인간 CD3 항체(FITC anti-human CD3 Antibody (Clone UCHT1)), PE-Cy7가 표지된 항-인간 CD56 항체(PE/Cyanine7 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (Clone 5.1H11)), BV421가 표지된 항-인간 CD14항체(Brilliant Violet 421™ anti-human CD14 Antibody (Clone 63D3)), BV480가 표지된 항-인간 CD19 항체(BV480 Mouse Anti-Human CD19 (Clone SJ25C1)), PE가 표지된 항-인간 CD16 항체(PE anti-human CD16 Antibody (Clone 3G8)), BV711가 표지된 항-인간 NKp46 항체(Brilliant Violet 711™ anti-human CD335 (NKp46) Antibody (Clone 9E2)), BV650가 표지된 항-인간 NKG2D 항체(BD Horizon™ BV650 Mouse Anti-Human CD314 (NKG2D) (Clone 1D11)), BV605가 표지된 항-인간 NKG2C 항체(BV605 Mouse Anti-Human CD159c (NKG2C) (Clone 134591)), BV785가 표지된 항-인간 CXCR3 항체(Brilliant Violet 785™ anti-human CD183 (CXCR3) Antibody (Clone EH12.2H7)), PE가 표지된 항-인간 CCR5 항체(PE anti-human CD195 (CCR5) Antibody (Clone J418F1)) 및 BV650가 표지된 항-인간 DNAM-1 항체(BD OptiBuild™ BV650 Mouse Anti-Human CD226 (Clone DX11))를 50 μL FACS buffer와 함께 각 웰(well)에 넣어 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, FACS 버퍼를 100 μL 넣고, 1,300 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 이때, 형광이 같은 마커는 패널을 분리하여 염색을 진행하였다. 사용된 배지 및 버퍼 등의 재료는 표 3에 나열하였으며, 마커 및 항체 정보는 아래 표 4에 나열하였다.
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상층액을 제거하고, 200 μL FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 1,300 rpm조건에서 5분간 원심분리 후, 200 μL FACS buffer에 재현탁하였다. 유세포분석기 (Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)를 이용하여 세포의 표현형을 확인하였다.
그 결과 도 2와 같이, 대조군(CS10)과 표 1의 각 후보군1-1 내지 3-2 제형으로 동결보존된 NK세포의 자연살해 세포의 활성 또는 저해를 나타내는 표면 마커들의 발현율이 동등한 수준으로 나타남을 확인하였다.
실시예 5: 동결보존된 NK 세포의 세포독성 마커 확인
8종의 동결제형을 사용해서 동결보존된 NK세포들을 각각 NK MACS medium(NK MACS medium, Miltenyi) 10 mL에 풀고, 1,300 rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 NK MACS medium 10 mL을 넣어 펠릿을 풀어주었다.
PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 μg/mL 폴리믹신B(PolymyxinB), 100 U/mL 페니실린(Penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(Streptomycin), 1 mM 피루브산나트륨(Sodium pyruvate)을 첨가하여 FACS버퍼를 제조하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2×106 cells/mL이 되도록 NK MACS medium으로 희석하였다. 96 well plate에 희석한 세포 용액을 100 μL씩 넣고, NK MACS medium에 500X stimulation cocktail (eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X))을 2X의 농도로 희석하였다. 제조한 stimulation 용액을 각 웰에 100 μL씩 넣고, 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 4시간 배양하였다.
4시간 배양 후, 1,300 rpm조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 FACS buffer 200 μL을 넣어 펠릿을 풀어주었다. 1,300rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고, 200X Fc block(Biolegend, San Diego, CA, USA) 용액을 FACS 버퍼에 1X 농도로 제조한 Fc 블로킹 용액(Fc blocking solution) 50 μL를 각 웰에 넣고 얼음에 10분간 두었다.
PerCP가 표지된 항-인간 CD3 항체(PerCP anti-human CD3 Antibody (Clone HIT3a)), APC-Cy7가 표지된 항-인간 CD56 항체(APC/Cyanine7 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (Clone 5.1H11)), BV421가 표지된 항-인간 Tim-3항체(Brilliant Violet 421™ anti-human CD366 (Tim-3) Antibody (Clone F38-2E2)), BV785가 표지된 항-인간 CD16 항체(Brilliant Violet 785™ anti-human CD16 Antibody (Clone 3G8)) 및 PE가 표지된 항-인간 PD-1 항체(PE anti-human CD279 (PD-1) Antibody (Clone A17188B)) 를 50 μL FACS buffer와 함께 각 웰에 넣어 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 μL FACS 버퍼를 넣고, 1,300 rpm으로 5분간 원심 분리하였다.
상층액을 제거하고, 200 μL FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 1,300 rpm조건에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 100 μL BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation and Permeabilization Solution으로 현탁한 후 얼음에 30분간 두었다.
BD Perm/Wash™ buffer를 DW에 1X 농도로 희석하여 30분 반응 후, 제조한 wash buffer를 각 웰에 100 μL씩 넣고 1,300 rpm 조건에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 200 μL wash buffer를 넣고 1,300 rpm 조건에서 5분간 원심분리하였다.
FITC가 표지된 항-인간 IFN-γ 항체(FITC anti-human IFN-γ Antibody (Clone 4S.B3)), PE-Cy7가 표지된 항-인간 Granzyme B 항체(PE/Cyanine7 anti-human/mouse Granzyme B Recombinant Antibody (Clone QA16A02)) 및 APC가 표지된 항-인간 Perforin 항체(APC anti-human Perforin Antibody (Clone B-D48))를 100 μL wash buffer와 함께 각 웰에 넣어 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 μL wash buffer 넣고, 1,300 rpm으로 5분간 원심 분리하였다.
상층액을 제거하고, 200 μL wash buffer를 넣어 현탁한 후 1,300 rpm조건에서 5분간 원심분리 후, 200 μL FACS buffer에 재현탁하였다. 유세포분석기 (Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)를 이용하여 세포의 독성 마커 발현을 확인하였다.
사용된 배지 및 버퍼 등의 재료는 표 5에 나열하였으며, 사용된 마커 및 항체 정보는 아래 표 6에 나열하였다.
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그 결과, 도 3에 도시한 것과 같이, 비교예(CS10)와 표 2의 각 후보군1-1 내지 3-2 제형으로 동결보존된 NK세포는 탈과립 물질로 알려진 IFN-γ, perforin, Granzyme B가 동등한 수준으로 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 6: 동결보존된 NK세포의 암세포 살상 능력 확인
실시예 5에서 사용된 재료의 정보는 다음 표 7과 같다.
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000008
실시예 6-1: 타겟 세포(Target Cell)의 준비
타겟 세포(K562, BT474, MDA-MB-231)을 수득한 후, 1,300rpm 5분간 원심분리 한 뒤, RPMI 1640 배지 (Welgene, LM011-01)에 1x106 cells/mL의 농도로 현탁하였다. 준비된 1x106 cells의 타겟 세포 당 30uL의 Calcein-AM를 넣어 염색하였다. 빛을 차단하여 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 1시간 배양한 후, 10mL의 RPMI 1640 배지로 2번 세척하였다. 상층액을 버리고 RPMI 1640 배지로 현탁하여 1x105 cells/mL의 농도로 타겟 세포 현탁액을 제조하였다.
실시예 6-2: 이펙터 세포(Effector Cell) 준비
각 동결보존 제형으로 4주동안 동결된 NK세포를 5x106 개 수득하여 1,300rpm, 10 분간 원심분리한 뒤, RPMI 1640 배지 (Welgene, LM011-01)에 1x106 cells/mL의 농도로 현탁하였다. 표 8에 도시된 비율로 E:T ratio (10:1, 3:1, 1:1, 0.3:1)에 맞춰 96-well-plate에 분주하였다. NK세포가 없는 웰에 RPMI 1640 배지 100uL를 넣어 “Spontaneous Value”를 만들고, 2% Triton X-100/DPBS 100uL를 넣어 “Maximum Value”로 정한다. 또한, RPMI 1640 배지 200uL를 넣어 “MM”으로 정하였다.
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실시예 6-3: 공배양
실시예 6-1의 염색된 타겟 세포를 6-2에서 준비된 96-well-plate에 100uL씩 분주하고, 빛을 차단하여 4시간동안 37℃, 5% CO2 조건으로 공배양하였다. 공배양 후, 2000rpm 3 분간 원심분리한 뒤, 100uL의 상층액을 수득하여 새로운 flat bottom 96-well-plate에 분주하고, 485nm, 535nm의 파장으로 형광을 측정하였다(도4 내지 6).
그 결과, 도 4 내지 도 6에 도시한 것과 같이 NK 세포의 암세포 살상능력은 Glucose를 첨가한 후보군 1-1, PEG를 첨가한 후보군 2-1 및 Trehalose를 첨가한 후보군 3-1을 동결제형으로 이용한 NK세포에서 대조군(CS10) 대비 유의미하게 향상된 암세포 살해 능력을 나타내는 것을 확인하였다. 타겟 세포에 따라 능률은 조금씩 차이를 보였으나, 전체적으로 유사한 경향성을 나타내었으며, 본 발명의 후보군의 동결제형으로 동결보존된 NK세포의 암세포 살상능력이 현저히 우수함을 확인하였다.
상기 실시예들의 결과를 종합할 때, 본 발명의 후보군 1-1 내지 1-2, 후보군 2-1 내지 2-2 및 후보군 3-1은 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), HES(Hydroxy Ethyl Starch)을 포함하지 않는 저농도의 DMSO 조건에서도 세포의 표면 마커(도 2)와 NK세포 탈과립 능력(도 3)이 종래의 동결보존용 배지(CS10)를 사용한 제형과 동일한 수준을 나타냄과 동시에 보다 높은 세포 수득률(도1, A) 및 현저히 뛰어난 NK세포의 실제 암세포 살상 능력(도 4 내지 도 6)을 나타내었다. 이 중 후보군 2-1의 경우 해동 시 가장 높은 수득률을 보이면서도 높은 암세포 살상능력을 안정적으로 나타내었다.
실시예 7: PEG 분자량별 NK 세포 동결보존용 조성물의 제조 및 동결보존
실시예 7-1: NK 세포 동결보존용 조성물의 제조
동결보존용 조성물을 제조하기 위해 50%(v/v)의 플라스마솔루션에이주(에이치케이노엔), 5%(v/v)의 DMSO(Avantor, CAT# 9033-04-01), 20%(v/v)의 알부민주(녹십자)를 순서대로 혼합하여 표 1의 기본조성을 준비하였다. 그 후, 추가적인 동결보호제로 PEG400(Polyethylene Glycol 400 (USP-NF, BP, Ph. Eur. pure, pharma grade, PanReac AppiliChem, CAT# 142436), PEG4000(Sigma, CAT#81242), PEG20000(Sigma, CAT#81275)을 표 1에 기재된 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 이때, 추가된 동결보호제의 용량(Volume)은 전체 조성물의 25%가 되도록 플라스마솔루션에이주에 희석하여 사용하였다. 대조군으로는 비교예2와 같이 PEG를 첨가하지 않고 기본조성 성분만 포함하는 조성물을 사용하였다.
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000010
실시예 7-2: NK 세포의 동결보존
실시예 1에서 제조된 NK 세포를 상기 NK 세포 동결보존용 조성물에 1x106 cells/mL이 되도록 현탁하여, NK 세포의 동결제형을 제조하고, 바이알에 1ml씩 분주하여 하루 동안 초저온 냉동고에 보관한 뒤, LN2로 이동하여 동결보존하였다.
실시예 8: 해동 후 PEG 분자량별 동결보존용 조성물의 수율 및 생존율 확인
2주동안 동결된 NK세포의 생존 세포 수 및 생존율은 ADAM cell counter Accustain kit(DigitalBio)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하여 측정하였다.
구체적으로는, 동결된 NK세포를 Thawing 한 후, 1x106 cell/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석하고, 13 ㎕씩 바닥이 둥근 96 웰 플레이트의 2개의 웰에 각각 분주하였다. 배양한 세포를 계수하여 2개의 웰 중 하나에는 총 세포 수를 측정할 수 있는 T 용액(solution) 13 ㎕를 첨가하여 희석된 세포와 섞어준 뒤, 이 중 13 ㎕를 취하여 계수기 칩(chip)의 T 패널에 넣었다. 한편, 죽은 세포 수를 측정할 수 있는 N 용액을 다른 하나의 웰에 13 ㎕ 첨가하여 희석된 세포와 섞어준 뒤, 이 중 13 ㎕를 취하여 계수기 칩의 N 패널에 넣어주었다.
상기 칩을 ADAM 계수기에 삽입하고 생존 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 결과에 따르면, 해동 후 후보군 2-3 내지 2-7와 비교예2의 수율 및 생존률(viability)은 동등한 수준인 것으로 확인되었다.
실시예 9: PEG 분자량별 동결보존용 조성물의 NK 세포의 표면 마커 확인
표9의 6종의 동결제형을 사용해서 동결되었던 자연살해세포들을 각각 NK MACS medium(NK MACS medium, Miltenyi) 10 mL에 풀고, 1,300 rpm 조건에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 NK MACS medium 10 mL을 넣어 펠릿을 현탁하였다.
PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 μg/mL 폴리믹신B(PolymyxinB), 100 U/mL 페니실린(Penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(Streptomycin), 1 mM 피루브산나트륨(Sodium pyruvate)을 첨가하여 FACS버퍼를 제조하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2×106 cells/mL이 되도록 FACS buffer로 희석하였다. 96 well plate에 희석한 세포 용액을 100 μL씩 넣고, 1,300 rpm조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 FACS buffer 200 μL을 넣어 펠릿을 풀어주었다. 1,300rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고, 200X Fc block(Biolegend, San Diego, CA, USA) 용액을 FACS 버퍼에 1X 농도로 제조한 Fc 블로킹 용액(Fc blocking solution) 50 μL를 각 웰(well)에 넣고 얼음에 10분간 방치하였다.
PerCP가 표지된 항-인간 CD3 항체(PerCP anti-human CD3 Antibody (Clone HIT3a)), PE-Cy7가 표지된 항-인간 CD56 항체(PE-Cy™7 Mouse Anti-Human CD56 (NCAM-1) (Clone B159)), Alexa Fluor® 700가 표지된 항-인간 CD14항체(Alexa Fluor® 700 Mouse Anti-Human CD14 (Clone M5E2)), BV786가 표지된 항-인간 CD19 항체(BV786 Mouse Anti-Human CD19 (Clone SJ25C1)), APC-H7가 표지된 항-인간 CD16 항체(APC-H7 Mouse Anti-Human CD16 (Clone 3G8)), BV711가 표지된 항-인간 NKp46 항체(Brilliant Violet 711™ anti-human CD335 (NKp46) Antibody (Clone 9E2)), PE-CF594가 표지된 항-인간 NKG2D 항체(PE-CF594 Mouse Anti-Human CD314 (NKG2D) (Clone 1D11)), BV421가 표지된 항-인간 NKG2C 항체(BV421 Mouse Anti-Human CD159c (NKG2C) (Clone 134591)), BV605가 표지된 항-인간 CXCR3 항체(BV605 Mouse Anti-Human CD183 (Clone 1C6/CXCR3)), APC가 표지된 항-인간 CCR5 항체(APC Mouse Anti-Human CD195 (Clone 3A9)), Alexa Fluor® 647 가 표지된 항-인간 DNAM-1 항체(Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Human CD226 (Clone DX11))를 50 ㎕ FACS buffer와 함께 각 well에 넣어 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 ㎕ FACS 버퍼를 넣고, 1,300 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 이때 형광이 같은 marker는 패널을 분리하여 염색을 진행하였다. 사용된 배지 및 버퍼 등의 재료는 표 10에 나열하였으며, 마커 및 항체 정보는 아래 표 11에 나열하였다.
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000011
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000012
상층액을 제거하고, 200 μL FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 1,300 rpm조건에서 5분간 원심분리 후, 200 μL FACS buffer에 재현탁하였다. 유세포분석기 (Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)를 이용하여 세포의 표현형을 확인하였다.
그 결과, 도 8과 같이 후보군 2-3 내지 2-7와 비교예2의 세포 표면 마커의 발현 양상은 동등한 수준을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 10: PEG 분자량별 동결보존용 조성물의 NK 세포의 세포독성 마커 확인
표 9의 6종의 동결보호제를 사용해서 동결되었던 자연살해세포들을 각각 NK MACS medium(NK MACS medium, Miltenyi) 10 mL에 풀고, 1,300 rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 NK MACS medium 10 mL을 넣어 펠릿을 풀어주었다.
PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 μg/mL 폴리믹신B(PolymyxinB), 100 U/mL 페니실린(Penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(Streptomycin), 1 mM 피루브산나트륨(Sodium pyruvate)을 첨가하여 FACS버퍼를 제조하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2×106 cells/mL이 되도록 NK MACS medium으로 희석하였다. 96 well plate에 희석한 세포 용액을 100 μL씩 넣고, NK MACS medium에 500X stimulation cocktail (eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X))을 2X의 농도로 희석하였다. 제조한 stimulation 용액을 각 웰에 100 μL씩 넣고, 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 4시간 배양하였다.
4시간 배양 후, 1,300 rpm조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 FACS buffer 200 μL을 넣어 펠릿을 풀어주었다. 1,300rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고, 200X Fc block(Biolegend, San Diego, CA, USA) 용액을 FACS 버퍼에 1X 농도로 제조한 Fc 블로킹 용액(Fc blocking solution) 50 μL를 각 웰에 넣고 얼음에 10분간 두었다.
PerCP가 표지된 항-인간 CD3 항체(PerCP anti-human CD3 Antibody (Clone HIT3a)), APC-Cy7가 표지된 항-인간 CD56 항체(APC/Cyanine7 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (Clone 5.1H11)), BV421가 표지된 항-인간 Tim-3항체(Brilliant Violet 421™ anti-human CD366 (Tim-3) Antibody (Clone F38-2E2)), BV785가 표지된 항-인간 CD16 항체(Brilliant Violet 785™ anti-human CD16 Antibody (Clone 3G8)) 및 PE가 표지된 항-인간 PD-1 항체(PE anti-human CD279 (PD-1) Antibody (Clone A17188B)) 를 50 μL FACS buffer와 함께 각 웰에 넣어 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 μL FACS 버퍼를 넣고, 1,300 rpm으로 5분간 원심 분리하였다.
상층액을 제거하고, 200 μL FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 1,300 rpm조건에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 100 μL BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation and Permeabilization Solution으로 현탁한 후 얼음에 30분간 두었다.
BD Perm/Wash™ buffer를 DW에 1X 농도로 희석하여 30분 반응 후, 제조한 wash buffer를 각 웰에 100 μL씩 넣고 1,300 rpm 조건에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 200 μL wash buffer를 넣고 1,300 rpm 조건에서 5분간 원심분리하였다.
FITC가 표지된 항-인간 IFN-γ 항체(FITC anti-human IFN-γ Antibody (Clone 4S.B3)), PE-Cy7가 표지된 항-인간 Granzyme B 항체(PE/Cyanine7 anti-human/mouse Granzyme B Recombinant Antibody (Clone QA16A02)) 및 APC가 표지된 항-인간 Perforin 항체(APC anti-human Perforin Antibody (Clone B-D48))를 100 μL wash buffer와 함께 각 웰에 넣어 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 μL wash buffer 넣고, 1,300 rpm으로 5분간 원심 분리하였다.
상층액을 제거하고, 200 μL wash buffer를 넣어 현탁한 후 1,300 rpm조건에서 5분간 원심분리 후, 200 μL FACS buffer에 재현탁하였다. 유세포분석기 (Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)를 이용하여 세포의 독성 마커 발현을 확인하였다.
사용된 배지 및 버퍼 등의 재료는 표 12에 나열하였으며, 사용된 마커 및 항체 정보는 아래 표 13에 나열하였다.
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000013
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000014
그 결과, 도 9와 같이 후보군 2-3 내지 2-7와 비교예2의 세포독성 마커의 발현 양상은 동등한 수준을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 11: PEG 분자량별 동결보존용 조성물의 NK세포의 암세포 살상 능력 확인
실시예 11에서 사용된 재료의 정보는 다음 표 14과 같다.
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000015
실시예 11-1: 타겟 세포(Target Cell)의 준비
타겟 세포(K562, DLD-1)를 수득한 후, 1,300rpm 5분간 원심분리 한 뒤, RPMI 1640 배지 (Welgene, LM011-01)에 1x106 cells/mL의 농도로 현탁하였다. 준비된 1x106 cells의 타겟 세포 당 30uL의 Calcein-AM를 넣어 염색하였다. 빛을 차단하여 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 1시간 배양한 후, 10mL의 RPMI 1640 배지로 2번 세척하였다. 상층액을 버리고 RPMI 1640 배지로 현탁하여 1x105 cells/mL의 농도로 타겟 세포 현탁액을 제조하였다.
실시예 11-2: 이펙터 세포(Effector Cell) 준비
각 동결보존 제형으로 4주동안 동결된 NK세포를 5x106 개 수득하여 1,300rpm, 10 분간 원심분리한 뒤, RPMI 1640 배지 (Welgene, LM011-01)에 1x106 cells/mL의 농도로 현탁하였다. 표 15에 도시된 비율로 E:T ratio (10:1, 3:1, 1:1, 0.3:1)에 맞춰 96-well-plate에 분주하였다. NK세포가 없는 웰에 RPMI 1640 배지 100uL를 넣어 “Spontaneous Value”를 만들고, 2% Triton X-100/DPBS 100uL를 넣어 “Maximum Value”로 정한다. 한 well 당 RPMI 1640 배지 100uL와 2% Triton X-100/DPBS 100uL를 3번 반복하여 넣고, 이를 “MT”로 정한다. 또한, RPMI 1640 배지 200uL를 넣어 “MM”으로 정하였다.
Figure PCTKR2022006901-appb-img-000016
실시예 11-3: 공배양
실시예 11-1의 염색된 타겟 세포를 11-2에서 준비된 96-well-plate에 100uL씩 분주하고, 빛을 차단하여 4시간동안 37℃, 5% CO2 조건으로 공배양하였다. 공배양 후, 2000rpm 3 분간 원심분리한 뒤, 100uL의 상층액을 수득하여 새로운 flat bottom 96-well-plate에 분주하고, 485nm, 535nm의 파장으로 형광을 측정하였다
그 결과, 도 10과 같이 후보군 2-3 내지 2-7은 해동 후 NK세포의 암세포 살상 능력이 회복된 것을 확인할 수 있었으나, 비교예2는 세포 표면 마커 또는 세포독성 마커가 후보군 2-3 내지 2-7과 동등한 수준임에도 불구하고 암세포에 대한 실질적인 살상 활동 능력이 회복되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 후보군 2-3 내지 2-7이 포함된 동결용 조성물의 PEG는 해동 후 NK세포 암세포 살상능력을 회복 시키는 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명의 NK세포의 동결보존용 조성물은 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), HES(Hydroxy Ethyl Starch)을 포함하지 않는 저농도의 DMSO 조건에서도 세포의 표면 마커와 NK세포 탈과립 능력이 현재 상용되는 동결보존용 배지를 사용한 제형과 동등하거나 향상된 수준을 나타냄과 동시에, 보다 높은 세포 수득률 및 현저히 뛰어난 NK세포의 암세포 살상 능력을 나타낸다. 특히, 비특이적 독성으로 다양한 부작용을 나타내는 종래의 동결보호제를 포함하지 않거나 저농도로 포함하고, 비독성의 생체 친화적 동결보호제로 대체하기 때문에, 별도의 추가 배양 또는 주사 용액으로의 솔루션의 교체 없이도 해동 즉시 환자에게 투여가 가능하여 약학적 제형으로도 사용 가능하다는 장점이 있다. 따라서, 매우 제한적인 적응증의 치료용도로 사용되는 NK세포 기반 면역치료제의 장기보관 및 임상적 사용에 있어 매우 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 다음을 포함하는 NK 세포의 동결보존용 조성물:
    (i) 베이스 용액(base solution);
    (ii) 혈장 알부민(serum albumin);
    (iii) DMSO; 및
    (iv) 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 동결보호제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 베이스 용액은 나트륨, 클로라이드, 칼륨, 마그네슘, 아세테이트 및 글루코네이트 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 베이스 용액의 pH는 4.0 내지 8.0 인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베이스 용액의 삼투몰농도는 200 mOsm/L 내지 400 mOsm/L 인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 DMSO는 0.001%(v/v) 내지 10%(v/v)의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 또는 HES(Hydroxy Ethyl Starch)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 혈장 알부민은 1%(w/v) 내지 10%(w/v)의 최종 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 동결보호제는 글루코스, 폴리에틸렌글리콜 및 트레할로스(Trehalose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 동결보호제는 글루코스이고, 상기 글루코스는 0.5%(w/v) 내지 5%(w/v) 의 최종농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 동결보호제는 폴리에틸렌글리콜이고, 상기 폴리에틸렌글리콜은 400g/mol 내지 20000g/mol의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 동결보호제는 폴리에틸렌글리콜이고, 상기 폴리에틸렌글리콜은 0.045%(w/v) 내지 2.5%(w/v)의 최종농도로 포함되는것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 동결보호제는 트레할로스이고, 상기 트레할로스는 5%(w/v) 내지 10%(w/v)의 최종농도로 포함되는(include)것을 특징으로 하는 NK 세포의 동결보존용 조성물.
  13. NK 세포; 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물을 포함하는 NK 세포의 동결보존 제형.
  14. NK 세포를 상기 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물에 현탁하여 NK 세포 동결보존 제형을 제조하는 단계; 및
    상기 NK 세포 동결보존 제형을 동결시키는 단계를 포함하는 NK세포의 동결보존 방법.
  15. NK 세포; 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물을 포함하는 면역세포 치료제.
  16. NK 세포; 및 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 동결 보존용 조성물을 포함하는 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제13항의 NK 세포의 동결보존 제형을 이용한 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료방법.
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