WO2022230990A1 - 人工核酸及びそれを用いた核酸の送達方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、カチオン性人工核酸と親水性重合体とが結合した核酸アナログである。カチオン性人工核酸は、リボース及びデオキシリボースから選択される環構造に塩基が結合した構成単位と、２つの構成単位の間を連結する連結構造と、からなる骨格構造を有し、連結構造は、カチオンの状態で、下記式（Ｃ１）～（Ｃ７）からなる群より選択されるカチオン性基を有し、カチオン性人工核酸は、他のヌクレオチドのリン酸基とカチオン性基との静電相互作用により会合しうる。 （ここで、Ｒ１～Ｒ３は水素又はアルキル基を示し、同一又は異なっていてもよい。Ｒｉｎｇは環式化合物であり複素環であってもよい。）

Description

人工核酸及びそれを用いた核酸の送達方法

　本発明は、核酸アナログ、核酸送達用構造体及びその製造方法並びに核酸送達方法に関し、特に、送達する対象である核酸を標的部位に送達するための核酸送達用構造体及びその製造方法並びに核酸送達方法に関する。

　遺伝子治療の分野では、ＤＮＡやＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを細胞などの標的部位に送達して、遺伝子の発現を抑制したり、遺伝子の組み換えを行ったりすることで、疾患の治療が行われている。このような治療において、標的部位に効率的に核酸を送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術が重要となる。これまで、種々のＤＤＳの手法が開発されている。また、核酸解析、診断トレーサー、分子マシン、分子コンピューターとしてナノマテリアル分野、人工細胞分野への応用も盛んに行われている。

　一方で、例えば、全がんの３０％に関連するがん促進遺伝子のＲＡＳを標的とした創薬は、過去３０年に渡り広く進められてきた。しかし、ＲＡＳタンパクは低分子のポケットが狭く阻害剤の設計が難しいことや、アンチセンス－オリゴヌクレオチド（ＡＳ－ＯＤＮ）やｓｉＲＮＡによるＲＡＳの１つの遺伝子制御ではがん細胞が耐性を獲得することから、未だ有効な治療薬の開発に至っていない。

　特許文献１には、リピッド単層によって内包された核複合体を含んだナノ粒子が開示されている。この複合体は、カチオン性ポリマーの１以上の分子に静電気的に結合された１以上の核酸分子を含んでおり、カチオン性ポリマーはリピッド単層に内在する第１リピッドに共有結合している。ここで、カチオン性ポリマーとしてはポリエチレンイミンなどが、第１リピッドとしてはホスホリピッドなどが例示されており、リピッド単層は１以上の非結合リピッドを更に含んでおり、非結合ホスホリピッド分子の一部はペグ化（ＰＥＧｙ化）されていることが記載されている。このような構成により、核酸のための体内送達剤として利用するのに適したナノ粒子が提供されるとされている。

　特許文献２には、ポリエチレングリコール部分及び末端がチオール基の側鎖を有するポリカチオン部分を構成成分とするブロックコポリマーと、ｓｉＲＮＡとを含む、ポリイオンコンプレックスが記載されている。ここで、ポリカチオン部分は、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドである。これにより、単分散性及び構造安定性が高く、かつ細胞へのｓｉＲＮＡ送達能に優れた、ｓｉＲＮＡ内包高分子ミセル複合体（ポリイオンコンプレックス）を提供することが可能になるとされている。

　特許文献３には、機能性オリゴヌクレオチドとポリ（エチレンオキシド）とのコンジュゲート、ならびに該コンジュゲートとカチオン性ポリマーによるポリイオン複合体及びそのミセルが開示されている。このコンジュゲートは、一般式（Ａ）：ＦｕＮＴ－Ｌ_１－Ｌ_２－ＰＥＧで示され、このＦｕＮＴは機能性オリゴヌクレオチドの残基を、Ｌ_１はアルキレン基を、Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる連結基を、ＰＥＧはポリエチレングリコールを、それぞれ示している。カチオン性ポリマーは、ポリリジンなどから選択される。コンジュゲートとカチオン性ポリマーのポリイオン複合体を形成させ、これを動物細胞に取り込ませると、コンジュゲートはエンドソームの環境下で機能性オリゴヌクレオチドを開裂して放出する。このミセルによれば、オリゴヌクレオチドの動物細胞内での安定性が図られ、標的遺伝子への特異的結合性が向上するとされている。

　さらに、発明者らは、ＤＤＳへの応用展開を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と天然核酸（ＤＮＡ）のコンジュゲート体を合成している（非特許文献１）。

特表２０１１－５０３０７０号（要約、請求項１～６、図１、段落００６０など） 国際公開第０８／０６２９０９号（要約、請求項１など） 国際公開第０５／１００４４７号（要約、請求項１、請求項８など） 「免疫回避型ＰＭＯ／ＤＮＡナノ構造体の創製とＤＤＳ応用」２０１７　年度　実績報告書（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-17H07219/17H072192017jisseki/）

　特許文献１の複合体は、カチオン性ポリマーとして、ポリエチレンイミンのような高分子化合物を使用しているが、送達対象の核酸との相互作用が弱い。また、本文献では、送達対象の核酸（ＤＮＡ）とカチオン性ポリマーとが静電気的に結合しているが、送達されるＤＮＡは二本鎖であり（本文献の図１参照）、一本鎖ＤＮＡの状態で核酸と結合してこれを標的部位に送達することはできない。

　また、本文献の複合体は、カチオン性ポリマーが両親媒性のリピッド（脂質）に共有結合した構造を有しており、この複合体で形成されるナノ構造（予備形成複合体）にＰＥＧ－ＰＥのような非結合性のリピッドを内包させることで体内安定性を付与している（段落００６０、図１参照）。すなわち、本文献では、複合体自体が形成するナノ構造体自体は、ＰＥＧ化されていないため、血中滞留性などの体内安定性が十分ではなく、付加的に内包させた非結合リピッドのＰＥＧによって体内安定性を付与している。なお、非結合リピッドは、カチオン性ポリマーと結合していないリピッドであり、本文献にはカチオン性ポリマーとＰＥＧが結合した分子は開示されていない。

　特許文献２のブロックコポリマーは、ポリカチオン部分がポリペプチドであるため、特許文献１と同様の理由で、送達対象であるｓｉＲＮＡとの相互作用が弱く、また一本鎖の状態でｓｉＲＮＡと結合することはできない。

　特許文献３のコンジュゲートは、機能性オリゴヌクレオチド（ＦｕＮＴ）とＰＥＧが結合したものであるが、この機能性オリゴヌクレオチドはカチオン性ではなくアニオン性のヌクレオチドである。また、本文献のコンジュゲートは、連結基の開裂によって機能性オリゴヌクレオチドを放出するためのものであり、それ自体が送達対象であり、核酸を運ぶための担体ではない。

　上記のように、従来は、送達対象である一本鎖の核酸と結合して標的部位に送達でき、かつ会合等で形成された構造がそれ自体で体内安定性の高い担体は知られていなかった。

　非特許文献１のＤＮＡ―ＰＥＧコンジュゲートは、送達対象である核酸との間で塩基－塩基間の水素結合とπ－πスタッキングの相互作用により相補的二本鎖を形成している。このため、コンジュゲートのＤＮＡと相補的な配列を有する核酸の送達に適している。一方、相補的でない配列の核酸の送達に適したＤＮＡ－ＰＥＧコンジュゲートはこれまで知られていなかった。

　本発明の目的は、相補的な配列だけでなく、相補的でない配列の一本鎖の核酸との間でも会合して送達部位に送達できる核酸アナログを提供することにある。また、本発明の他の目的は、このような核酸アナログによって形成される核酸送達用構造体、核酸アナログや核酸送達用構造体の製造方法、核酸アナログを用いた核酸送達方法を提供することにある。

　本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、生体内ではゲノムＤＮＡとヒストンタンパクの静電相互作用によって精密に高次構造を形成し核内に収納されていることに着目した。そして、コンジュゲートの核酸（あるいは核酸類似体）の連結構造の部分にカチオン性基を導入することで、送達対象である核酸と静電相互作用して会合することを見出し、本発明を完成させた。

〔１〕カチオン性人工核酸と、該カチオン性人工核酸に結合した親水性重合体と、からなる核酸アナログであって、
　前記カチオン性人工核酸は、リボース及びデオキシリボースから選択される環構造に塩基が結合した構成単位と、２つの前記構成単位の間を連結する連結構造と、からなる骨格構造を有し、
　該連結構造は、カチオンの状態で、下記式（Ｃ１）～（Ｃ７）からなる群より選択されるカチオン性基を有し、前記カチオン性人工核酸は、他のヌクレオチドのリン酸基と前記カチオン性基との静電相互作用により会合しうることを特徴とする核酸アナログ。

（ここで、Ｒ_１～Ｒ_３は水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、Ｒ_１～Ｒ_３は同一又は異なっていてもよい。Ｒｉｎｇは４～８個の炭素原子で構成された環式化合物であり、該炭素原子の１つ以上が窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子で置換された複素環であってもよい。）

〔２〕前記カチオン性基のｐＫａが６～９の範囲であることを特徴とする〔１〕に記載の核酸アナログ。

〔３〕前記連結構造が、カチオンの状態で、下記式（Ｌ１）～（Ｌ４）から選択される構造を少なくとも有することを特徴とする〔１〕に記載の核酸アナログ。

（ここで、Ｘ^＋は前記カチオン性基を含む官能基であり、ＺはＯ又はＳを示し、Ｗは－Ｏ－又は－ＮＲ_４－を示し、ここでＲ_４は水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。＊は隣接する前記構成単位との結合手を意味する。）

〔４〕前記カチオン性人工核酸が、下記式（Ｎ１）で示されるヌクレオチド骨格を有することを特徴とする〔１〕に記載の核酸アナログ。

（ここで、Ｘ^＋は前記カチオン性基を含む官能基であり、Ｂａｓｅは塩基を示し、Ｒ₅はＨ又はＯＨを示す。＊は隣接するヌクレオチド骨格のリン酸との結合手を意味し、５’末端又は３’末端においては少なくとも一方が前記親水性重合体と結合し、該親水性重合体と結合していない場合は水素である。）

〔５〕前記Ｘ^＋が、カチオンの状態で、下記式（Ｆ１）で示されるアンモニウムカチオンであることを特徴とする〔４〕に記載の核酸アナログ。

（ここで、Ｒ₁～Ｒ₃は、水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、互いに同一又は異なっていてもよく、ｍは０～１０の整数を示し、ｎは０又は１の整数を示す。）

〔６〕前記親水性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアクリレート、ポリオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリ（カルボキシベタインメタクリレート）、ポリ（スルホベタインメタクリレート）、ポリ（２－メタアクリロイルオキシエチルホスホコリン）、ヒアルロン酸、キトサン及びデキストラン並びにこれらの誘導体から選択されることを特徴とする〔１〕に記載の核酸アナログ。

〔７〕前記親水性重合体が、下記式（Ａ１）で示されるポリエチレングリコール骨格を有することを特徴とする〔７〕に記載の核酸アナログ。

（ここで、ｐは１～２０の整数を示す。）

〔８〕送達対象である核酸を標的部位に送達するための担体であることを特徴とする〔１〕に記載の核酸アナログ。

〔９〕上記〔８〕に記載の核酸アナログと送達対象である核酸とからなり該核酸を標的部位に送達するための核酸送達用構造体であって、前記カチオン性人工核酸と前記核酸とが静電相互作用により会合した会合構造を有することを特徴とする核酸送達用構造体。

〔１０〕複数の前記核酸送達用構造体が会合したナノスケールの構造体であることを特徴とする〔９〕に記載の核酸送達用構造体。

〔１１〕前記会合構造が内側に、前記親水性重合体が外側に位置するベシクル又はミセルであることを特徴とする〔１０〕に記載の核酸送達用構造体。

〔１２〕リガンドで修飾されていることを特徴とする〔１１〕に記載の核酸送達用構造体。

〔１３〕医薬を更に有することを特徴する〔１１〕に記載の核酸送達用構造体。

〔１４〕前記核酸送達用構造体が、中心部に中空部分を有する球状構造体であり、
　該中空部分に医薬が包接されていることを特徴とする〔１３〕に記載の核酸送達用構造体。

〔１５〕上記〔１〕に記載の核酸アナログの製造方法であって、前記カチオン性人工核酸を合成するカチオン性核酸合成工程と、該カチオン性人工核酸と前記親水性重合体とを結合する結合工程とを備え、前記カチオン性核酸合成工程は、前記連結構造にチオリン酸エステルを導入する工程と、該チオリン酸エステルとブロモ化合物とを反応させる工程と、を備えることを特徴とする核酸アナログの製造方法。

〔１６〕上記〔９〕に記載の核酸送達用構造体の製造方法であって、
　前記核酸アナログの前記カチオン性基のｐＫａよりも低く、前記核酸のリン酸のｐＫａよりも高いｐＨ条件で前記核酸アナログと前記核酸とを静電相互作用により会合させて会合核酸構造を形成させる会合工程と、を有することを特徴とする核酸送達用構造体の製造方法。

〔１７〕複数の前記核酸送達用構造体を会合させて、前記会合構造が内側に、前記親水性重合体が外側に位置するベシクル又はミセルを水性溶媒中で形成する会合体形成工程と、を更に備えることを特徴とする〔１６〕に記載の核酸送達用構造体の製造方法。

〔１８〕上記〔９〕に記載の核酸送達用構造体を用いて標的部位に前記核酸を送達するための核酸送達方法であって、
　前記核酸送達用構造体を投与して前記標的部位内に前記核酸送達用構造体を取り込ませる投与工程と、
　前記標的部位内で前記核酸を放出させる放出工程と、を有することを特徴とする核酸送達方法。

〔Ａ〕前記カチオン性人工核酸が、下記式（Ｍ１）で示されるモルフォリノ骨格を有することを特徴とする〔１〕に記載の核酸アナログ。

（ここで、Ｂａｓｅは塩基を示す。＊は隣接するモルフォリノ骨格のリンとの結合手を意味し、５’末端又は３’末端においては少なくとも一方が前記親水性重合体と結合し、該親水性重合体と結合していない場合は水素である。）

　本発明によれば、相補的な配列だけでなく、相補的でない配列の一本鎖の核酸との間でも静電相互作用により会合して送達部位に送達できる核酸アナログを提供することが可能となる。また、本発明によれば、このような核酸アナログによって形成される核酸送達用構造体、核酸アナログや核酸送達用構造体の製造方法、核酸アナログを用いた核酸送達方法を提供することが可能となる。

本発明の核酸アナログや核酸送達用構造体の概略を示す図である。 カチオン性人工核酸の合成スキームの一例を示す図である。 核酸アナログの合成スキームの一例を示す図である。 実施例における構造地の形成評価の実験とその結果を示す図である。ＰＡＧＥイメージ（Ａ，Ｂ）。左図はＡＳ鎖のＳＥＱＩＤ１’のＣｙ３を検出した蛍光像。ここで、ＳＥＱＩＤ１’は、ＳＥＱＩＤ１とＳＥＱＩＤ２を１０：１で混合している。右図はＲＮＡ染色後の画像。（Ａ）ＡＮ４のアニーリング混合物、（Ｂ）ＡＮ５のアニーリング混合物の泳動結果。（Ｃ）ＡＮ４をＴＥＭで観察した図。スケールバーは１００ｎｍ。（Ｄ）ＡＮ５をＡＦＭで観察した結果。（Ｅ，Ｆ）ＤＬＳ測定による粒径評価。 実施例における構造体のｐＨ応答評価と血清耐性評価の実験とその結果を示す図である。ＣＤの結果（Ａ，Ｂ）。（Ａ）ＡＮ４と（Ｂ）ＡＮ５のｐＨ７とｐＨ５における核酸のキラリティ評価。ＤＬＳ測定の結果（Ｃ，Ｄ）。（Ｃ）ＡＮ４と（Ｄ）のｐＨ７とｐＨ５における粒径評価。血清でインキュベートした際のＤＬＳ測定の結果（Ｅ）。 実施例における構造体による核酸送達の細胞評価の実験とその結果を示す図である。（Ａ）ＤＬＤ－１のルシフェラーゼ阻害活性評価。（Ｂ、Ｃ）ＤＬＤ－１へのマイクロＲＮＡの送達評価。細胞生存率（Ｂ）、Ｋ－ＲＡＳタンパクの発現量（Ｃ）。 実施例における共焦点レーザー顕微鏡観察の結果を示す図である。（Ａ）ＮＴ、（Ｂ）Ｎａｋｅｄ、（Ｃ）ＡＮ３、（Ｄ）ＡＮ４、（Ｅ）ＡＮ５、（Ｆ）ＡＮ７、（Ｇ）ＡＮ８、（Ｈ）ＡＮ９。（Ｉ）ＡＮ４の１２０倍率観察像。スケールバーは５０μｍ。 実施例におけるモルフォリノ核酸（ＰＭＯ）－ＰＥＧコンジュゲート体の構造形成評価の実験とその結果を示す図である。 実施例における非相補鎖アニーリングの実験とその結果を示す図である。（Ａ）ＡＮ２５－２７の電気泳動の結果、（Ｂ）ＡＮ２６構造体の共焦点顕微鏡観察、（Ｃ）ＡＮ２６のレニーラルシフェラーゼ（ＲＬ）活性阻害評価、（Ｄ）ＡＮ２６のＭＣＦ―７細胞取り込み評価。 実施例におけるＨＰＬＣの結果を示す図である。 実施例におけるＭＣＦー７のルシフェラーゼ阻害評価の結果を示す図である。 実施例におけるＭＣＦ―７の細胞生存率評価の結果を示す図である。 実施例におけるＭＣＦ―７のＫ－ＲＡＳタンパクの発現量の結果を示す図である。 実施例におけるＤＬＤ－１担がんモデルマウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ評価結果を示す図であり、（Ａ）は抗腫瘍効果、（Ｂ）は動態評価を示す。 （ａ）実施例におけるリガンド導入後のナノ構造体の概要を示す図であり、（Ａ）配列設計、（Ｂ）配列合成、（ｂ）実施例におけるリガンド導入後の人工核酸のＨＰＬＣ上での挙動を示す図である。（ｃ）実施例におけるナノ構造体ＡＮ３０を形成した場合の（Ｃ）生理活性を示す。 実施例におけるナノ構造体ＡＮ４及びリガンド導入後のナノ構造体ＡＮ３０の（Ｄ）細胞取り込みを示す。 実施例におけるナノ構造体ＡＮ８及びリガンド導入後のナノ構造体ＡＮ３１の（Ｂ）細胞取り込みを示す。

１．核酸アナログ
　以下、本発明の核酸アナログについて説明する。本発明の核酸アナログは、カチオン性人工核酸と、このカチオン性人工核酸に結合した親水性重合体と、から構成される。核酸アナログは、送達する対象となる核酸（以下、「送達対象核酸」という場合がある）を標的部位に送達するための担体として好ましく使用される。以下、核酸アナログについて詳細に説明する。

（１）カチオン性人工核酸
　カチオン性人工核酸は、リボース及びデオキシリボースから選択される環構造に塩基が結合した構成単位と、２つの構成単位の間を連結する連結構造と、からなる骨格構造を有している。連結構造は、カチオンの状態で、下記式（Ｃ１）～（Ｃ７）からなる群より選択されるカチオン性基を有している。

（ここで、Ｒ_１～Ｒ_３は水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、Ｒ_１～Ｒ_３は同一又は異なっていてもよい。Ｒｉｎｇは４～８個の炭素原子で構成された環式化合物であり、該炭素原子の１つ以上が窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子で置換された複素環であってもよい。）

　カチオン性人工核酸は、他のヌクレオチドのリン酸基とカチオン性基との静電相互作用により会合しうる。ここで、「他のヌクレオチド」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのヌクレオチドやその類似体を意味し、核酸アナログが担体として使用される場合は、送達対象核酸を構成するヌクレオチドやその類似体を意味する。

　カチオン性基のｐＫａは、他のヌクレオチドのリン酸基と静電相互作用をする点から、他のヌクレオチドのリン酸基のｐＫａよりも高い。核酸アナログのカチオン性基のｐＫａよりも低く、他のヌクレオチドのリン酸基のｐＫａよりも高いｐＨ条件下では、カチオン性基が正に、リン酸基は負に帯電するため、これらの基が静電結合する。ここで、一般に、ヌクレオチドのリン酸基のｐＫａは１未満であることから、カチオン性基のｐＫａは１以上であり、好ましくは３以上、より好ましくは６．０以上である。カチオン性基のｐＫａの上限は、特に限定されないが、１２以下であり、好ましくは１１以下、より好ましくは９以下である。他のヌクレオチドのリン酸基との静電相互作用の強さや、カチオン性人工核酸の構造などの観点から、カチオン性基のｐＫａは６～９の範囲内であることが好ましい。

　塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ－メチルアデニン、Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－メチルチオアデニン、２－アミノアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ－イソブチリルグアニン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、５－メチルシトシン、４－Ｎ－メチルシトシン、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルシトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、又は５，６－ジヒドロウラシルなどを挙げることができる。

　連結構造としては、カチオンの状態で、下記式（Ｌ１）～（Ｌ４）から選択される構造を少なくとも有する者が好ましい。

（ここで、Ｘ^＋は上記式（Ｃ１）～（Ｃ７）のカチオン性基を含む官能基であり、ＺはＯ又はＳを示し、Ｗは－Ｏ－又は－ＮＲ_４－を示し、ここでＲ_４は水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。＊は隣接する上述した構成単位との結合手を意味する。）

　ここで、「カチオンの状態で」とは、カチオン性基が正に帯電したと仮定した場合を意味しており、核酸アナログのおかれている環境条件（溶媒のｐＨや種類など）によっては、カチオン性基は正に帯電していない状態の場合がある。正に帯電していない状態としては、例えば上記式（Ｃ１）を例にしてカチオン性基がアンモニウムの場合、一級アミン（カチオン化すると一級アンモニウム）、二級アミン（カチオン化すると二級アンモニウム）、三級アミン（カチオン化すると三級アンモニウム）の状態などが挙げられる。

　カチオン性人工核酸としては、リボースやデオキシリボースに塩基が結合したヌクレオチドを構成単位とするヌクレオチド骨格を有するものを挙げることができる。なお、参考までに、モルフォリンに塩基が結合した構造を構成単位とするモルフォリノ骨格を有するものも示す。

　ヌクレオチド骨格を有するものとしては、下記式（Ｎ１）で示される構造を挙げることができる。

（ここで、Ｂａｓｅは塩基を示し、Ｒ_５はＨ又はＯＨを示す。＊は隣接するヌクレオチド骨格のリン酸との結合手を意味し、５’末端又は３’末端においては少なくとも一方が上述した親水性重合体と結合し、該親水性重合体と結合していない場合は水素である。）

　このようなヌクレオチド骨格を有する構造としては以下を挙げることができる。

　上記の場合において、Ｘ^＋は、カチオンの状態で、下記式（Ｆ１）で示されるアンモニウムカチオンであることが好ましい。

（ここで、Ｒ_１～Ｒ_３は、水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、互いに同一又は異なっていてもよく、ｍは０～１０の整数を示し、ｎは０又は１の整数を示す。）

　ここで、他のヌクレオチドのリン酸基との静電相互作用の強さは、一級アミン（Ｒ_１～Ｒ_３がすべて水素）＜二級アミン（Ｒ_１～Ｒ_３の２つが水素、他がアルキル基）＜三級アミン（Ｒ_１～Ｒ_３の１つが水素、他がアルキル基）＜四級アンモニウム（Ｒ_１～Ｒ_３がすべてアルキル基）となる。また、後述する実施例でも示すように、三級アミンなどと比較して四級アンモニウムをカチオン性基とする構造体は、環境のｐＨの低下に伴って構造崩壊しやすい性質を有している。これは、四級アンモニウムをカチオン性基とする構造体は、エンドソーム経由で構造体が細胞質に移行すると、弱酸性のエンドソーム内ｐＨに応答して構造崩壊し、送達対象核酸を放出しやすい性質であることを意味する。したがって、Ｘ^＋のカチオン性基としては、これらの中では、特に四級アンモニウムが好ましい。なお、カチオン性基のｐＫａは、構造にもよるが、一級アミンの場合はおおむね６．１～７．９、二級アミンは６．９～７．０、三級アミンは８．０～８．６、四級アンモニウムは８．０～９．０程度である。

　一方、モルフォリノ骨格を有するものとしては、下記式（Ｍ１）で示される構造を挙げることができる。

（ここで、Ｂａｓｅは塩基を示す。＊は隣接するモルフォリノ骨格のリンとの結合手を意味し、５’末端又は３’末端においては少なくとも一方が上述した親水性重合体と結合し、該親水性重合体と結合していない場合は水素である。）

　このようなモルフォリノ骨格を有する構造としては以下を挙げることができる。

　カチオン性人工核酸を構成する環構造と塩基とが結合した構成単位の数（重合度）は、環構造やカチオン性基の種類、送達対象核酸の種類や長さ（塩基数）などの条件によって適宜設定することができる。一般に、カチオン性人工核酸の重合度としては、５～１００程度であり、１０～５０程度が好ましい。送達対象核酸の重合度（塩基数）が２０塩基程度と短い場合、担体であるカチオン性人工核酸の重合度も送達対象核酸と同程度とすることが好ましい。一方、ｍＲＮＡなどの比較的長い核酸の送達を想定した場合は、核酸の長さに対するマイナス電荷の割合が小さくなり、核酸全体に対するマイナス電荷を有する部分の影響が小さくなることから、カチオン性人工核酸と送達対象核酸の会合を妨げないのであれば、カチオン性人工核酸の重合度は送達対象核酸の重合度と異なっていてもよい。例えば、送達対象核酸がｍＲＮＡのような長い核酸の場合、カチオン性人工核酸の重合度は送達対象核酸の重合度よりも小さくてもよい。

　カチオン性人工核酸において、カチオン性基は、構成単位間を結合する連結構造の一部又は全部に導入されるが、後述するベシクルやミセルなどの構造形成の観点から、連結構造の総数に対してカチオン性基が導入されている連結構造の割合が５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、１００％（連結構造のすべて）であることが特に好ましい。連結構造の総数に対してカチオン性基が導入された連結構造の数の割合が低いと、カチオン性人工核酸と送達対象核酸との間で形成される会合構造において、送達対象核酸の負電荷が優勢となり、構造体形成されにくくなる。あるいは、３’や５’末端の一方に連続でカチオン性基が導入された場合や、一個飛ばしなど飛び飛びの連結構造にカチオン性基が導入された場合には、構造体を形成することが考えられるが、これらの構造は、カチオンの導入割合に依存してｐＨ応答に変化が生じ、構造が不安定であると考えられる。このため、カチオン性基が導入される連結構造の割合は高い方が好ましい。

（２）親水性重合体
　親水性重合体は、核酸アナログの用途等に応じて、種々の重合体を使用することができる。特に、核酸を標的部位に送達するための担体として核酸アナログを使用する場合、親水性重合体としては、生体適合性を有するものが好ましい。また、核酸アナログがカチオン性であることから、親水性重合体としては、核酸アナログと電気的に相互作用（吸引、反発）しにくい中性のものが好ましい。

　このような親水性重合体としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアクリレート、ポリオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリ（カルボキシベタインメタクリレート）、ポリ（スルホベタインメタクリレート）、ポリ（２－メタアクリロイルオキシエチルホスホコリン）、ヒアルロン酸、キトサン及びデキストラン並びにこれらの誘導体から選択されることが好ましい。

　このような親水性重合体としては以下を挙げることができる。

　親水性重合体を構成するモノマーの種類やモノマー単位の数（重合度）は、送達する標的部位の周辺環境などの条件によって適宜設定することができる。一般に、親水性重合体の重合度としては、３～１００程度であり、１０～５０程度が好ましい。親水性重合体の重合度が低いと、後述する構造体を形成しにくくなるほか、生体内で異物として排除されやすいなど、分解安定性や血中滞留性が低くなりやすい。逆に、親水性重合体の重合度が高すぎると、構造体のサイズが大きすぎて標的部位への送達対象核酸の送達効率が低くなりやすい。

　特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の担体として核酸アナログを使用する場合、血中滞留性などの点から、親水性重合体としては、ポリエチレングリコールが特に好ましい。ポリエチレングリコールとしては、１０～１００Ｋのポリ値レングリコールを用いる場合もあるが、下記式（Ａ１）で示されるポリエチレングリコール骨格を有することが好ましい。

（ここで、ｐは１～２０の整数を示す。）
　また、Ａ１は、核酸塩基や、リン酸エステル誘導体（－ＰＯ（ＯＨ）－，－ＰＳ（ＯＨ）－，ＰＯ（ＳＨ）－）をモノマー単位とした重合体として用いることもできる。モノマー単位のＡ１のエチレングリコールの繰り返し回数ｑは１～２０、好ましくは３～１０であり、モノマーの構造は同一でも異なっていてもよく、モノマー単位の重合度は１～１０、好ましくは２～１０、さらに好ましくは２～８である。そのようなリン酸エステル誘導体モノマー単位としては、エチレングリコールリン酸エステル誘導体単位、ジエチレングリコールリン酸エステル誘導体単位、トレエチレングリコールリン酸エステル誘導体単位、ヘキサエチレングリコールリン酸エステル誘導体単位などを挙げることができる。これらの誘導体単位は、さらに重合体のモノマーとして用いることもできる。リン酸エステル誘導体単位の重合度は、人工核酸の大きさにもよるが、人工核酸の塩基数が１０～３０であれば、１～１０、好ましくは２～１０、さらに好ましくは２～８である。モノマー単位はトリエチレングリコールリン酸エステル誘導体、ヘキサエチレングリコールリン酸エステル誘導体であることが最も好ましい上記で述べた親水性重合体のモノマーの種類や重合度、特にエチレングリコールリン酸誘導体モノマーの重合度は、後述する構造体の形成がしやすさ、生体内で異物として認識されにくさ、分解安定性や血中滞留性の低くなる、などの観点から、選択することができる。

　カチオン性人工核酸と親水性重合体との結合は、種々の結合様式で結合していても良いし、リンカーを介して結合していてもよい。このような結合としては、エステル結合（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、エーテル結合（－Ｏ－）、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）、ホスホルアルミド（－Ｐ（ＯＨ）－ＮＨ―）、リン酸エステル（－ＯＰＯ－Ｏ－）などを挙げることができる。リンカーとしては、これらが単独または組合わせて用いられていてもよく、アルキル鎖のエステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合などを介していてもよい。これらのリンカーは、カチオン性人工核酸がヌクレオチド骨格の場合、カチオン性人工核酸の５’末端又は３’末端あるいはこれらの両方の水酸基に結合し、カチオン性事項核酸と親水性重合体を介するように結合することが好ましい。カチオン性人工核酸と親水性重合体がリンカーをにより結合する場合は、リンカーが親水性重合体と構造が異なることから電荷を調節することが期待できる。また、ホスホロアミダイドを介した場合は、ポリエチレングリコールからなる重合体と同様に負電荷として振る舞うことから好ましい。さらに、ＰＥＧ抗体の誘導が抑えられるという点からも有利である。さらに、ホスホロアミダイドを介する場合には、核酸自動合成で核酸配列から親水性重合体部分まで一貫して合成できる点は工業的にはメリットとなる。

２．核酸対象核酸の送達用の担体、核酸送達用構造体
　本発明の核酸アナログは、送達対象核酸を標的部位に送達するための担体として特に好ましく用いることができる。図１は、核酸アナログを担体として使用した場合について説明する模式図である。この図に示すように、核酸アナログは、一次構造として、カチオン性基と親水性重合体とを備えており、天然核酸などの送達対象核酸はアニオン性を有している（図の「合成」参照）。このアニオン性の送達対象核酸と核酸アナログのカチオン性基との間で静電相互作用により会合した会合構造が形成され、担体である核酸アナログと送達対象核酸とで構成される複合体（イオンコンプレックス）となる（図の「ナノ粒子形成」の「二本鎖形成」参照）。

　ここで、送達対象核酸とカチオン性基との間で相補性がある場合は、塩基－塩基間の水素結合により二本鎖が形成されるが、本発明では相補性が低い場合であっても、カチオン性基と送達対象核酸のリン酸基との間の静電相互作用により会合しうる点で優れている。すなわち、完全な相補性（１００％マッチ）を有する送達対象核酸だけでなく、例えば８０％や９０％の相補性を有する送達対象核酸であっても、上記の静電相互作用によって会合構造が形成されて複合体となる。このため、非相補鎖である送達対象核酸を標的部位に送達することが可能となる。カチオン性基の種類などにもよるが、カチオン性人工核酸と送達対象核酸の相補性の程度としては、５０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、１００％であることが特に好ましい。

　血液中などの水性環境下では、この複合体の親水性重合体のセグメントどうしが会合し、ナノスケールの核酸送達用構造体（以下、単に「構造体」という場合がある）を形成する。このナノスケールの構造体としては、会合構造のセグメントが内側に、親水性重合体のセグメントが外側に位置するミセルやベシクルなどの構造体がある（図の「ナノ構造体形成」参照）。これらのミセルやベシクルは中心部に中空部分を有する球状構造体を形成し、この中空部分に低分子の化合物などの医薬を包接させることもできる。これにより、標的対象核酸だけでなく低分子の医薬も送達することが可能となる。中空部分の直径は、約５０～５００ｎｍ程度である。

　なお、ミセルは、親水性重合体のセグメントが球状構造体の最外殻に位置し、会合構造のセグメントが球状構造体の中心にある中空部分に面する位置にある構造である。一方、ベシクルは、会合構造のセグメントを介して２つの複合体が会合した二重膜構造をとっており、この二重膜の一方の親水性重合体のセグメントが球状構造体の最外殻に位置し、他方の親水性重合体のセグメントが球状構造体の中心にある中空部分に面する位置にある構造である。このため、ミセルの中空部分には疎水性の医薬などを包接することが好ましく、ベシクルの中空部分には親水性の医薬などを包接することが好ましい。

　このような構造体は、球状の構造体の内部に送達対象核酸が位置しているため、分解安定性が高くなる。また、上記の構造体は、親水性重合体のセグメントを最外殻に有するため、血中滞留性に優れたものとなる。そして、構造体は、標的部位である細胞などにおいてエンドソームに包まれて細胞質に取り込まれ、その後エンドソームを脱出し、細胞質内や核内で医薬である送達対象核酸や低分子医薬を放出する（図の「生化学的評価」参照）。

　このような構造体の用途としては、種々の疾患に対するドラッグデリバリーの担体などを挙げることができる。例えば後述する実施例では、がん促進遺伝子のＫ－Ｒａｓとそのネットワークを対象に、抗オンコマイクロＲＮＡであるマイクロＲＮＡ－１４３を送達対象核酸として送達する担体として、本発明の核酸アナログは有効であることが示されている。

　構造体は、各種のリガンドで表面が修飾されていてもよい。このようなリガンドで構造体の表面を修飾することで、構造体に標的指向性などを付与することができる。リガンドとしては、免疫グロブリン、炭水化物、ペプチド、タンパク質、アプタマーなどを挙げることができる。主なリガンドとその応用分野は以下のとおりである。
・グルコース：腫瘍研究、脳毛細血管内皮細胞へのドラッグデリバリー
・マンノース：巨大リポソームの効率的な形成
・ガラクトース：マクロファージのガラクトース受容体の研究、ガラクトースの肝細胞への標的送達の研究
・スクロース：ドキシルビシンによる癌治療
・マルトース：癌治療におけるドキシルビシンの輸送
・ラクトース：リポソームのサイズと安定性の研究
・オリゴ糖：治療用インヒビターのデザイン
・レクチン：肺のドラッグデリバリー
・トマトレクチン、小麦胚芽アグルチニン：インスリンの経口投与
・ＮＣＬ－アプタマー：広範な癌に対するシスプラチンを使用した化学療法
・ｓｇｃ８アプタマー：白血病ＣＥＭ－ＣＣＲＦ細胞用
・ＮＸ　１８３８：癌細胞のＶＥＧＦに特異的に結合
・Ａｎｔｉ－ＣＤ４４：癌細胞の選択的ターゲティング
・ＤＡＧ－ＮＸ２１３：血管新生を促すＶＥＧＦへの特異性
・ＡＳ１４１１：乳がん細胞ＭＣＦ－７に対する細胞傷害性
・Ｍａｃｕｇｅｎ：黄斑型加齢性黄斑変性症の治療薬
・ＢＯＣＫ：トロンビンの異なる結合部位を認識するための使用
・ＴＡＳＳＥＴ：　標的タンパク質の異なる結合部位を認識するための使用
・ｘＰＳＭ－Ａ９：前立腺がん細胞に発現する前立腺特異的膜抗原に対する使用
・ＩＬ－４Ｒα：腫瘍微小環境を利用した腫瘍増殖の抑制

３．核酸アナログ、核酸送達用構造体の製造方法
（１）核酸アナログの製造方法
　次に、核酸アナログの製造方法について説明する。核酸アナログは、種々の方法で製造することができるが、カチオン性人工核酸と親水性重合体とを個別に合成し、これらを結合する方法を挙げることができる。すなわち、核酸アナログの製造方法は、カチオン性人工核酸を合成するカチオン性核酸合成工程と、親水性重合体を合成する親水性重合体工程と、カチオン性人工核酸と親水性重合体とを結合する結合工程とを有する。

（ａ）２段階合成法
　カチオン性人工核酸は、２段階の反応で合成することができる（２段階合成法）。２段階合成法としては、主に３種類を挙げることができる。以下、順次説明する。

（ａ－１）２段階合成法Ｉ
　この方法では、核酸自動合成により核酸の硫黄化（Ｓ化）を行い、これに親水性重合体ホスホロアミダイト（例えば、エチレングリコールホスホロアミダイト）を連結させてオリゴＰＳ体―親水性重合体を合成したのち、更にＢｒ化合物を反応させて核酸にカチオン性基を導入する（後述する実施例のＴＥＧ－ＰＳオリゴ、ＨＥＧ－ＰＳオリゴの系）。
　カチオン性人工核酸は、ヌクレオチド骨格の場合、後述する実施例に記載のように、連結構造にチオリン酸エステルを導入する工程と、カチオン性基を有するブロモ化合物とチオリン酸エステルとを反応させて連結構造にカチオン性基を導入する工程を含む方法で合成することができる。
（ａ－１－２）チオリン酸エステルの導入
　チオリン酸エステルは、公知のホスホロアミダイト法によって合成することができる。ホスホロアミダイト法の概要としては、５’が４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基で保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドを固相に担持させる（担持工程）。つぎに、ジクロロ酢酸などの脱保護試薬でＤＭＴｒ基を脱保護し（脱保護工程）、４，５－ジシアノイミダゾールなどの活性化剤の存在下でホスホロアミダイトヌクレオチドとカップリングさせる（カップリング工程）。その後、（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）などの硫化剤によって亜リン酸エステルをチオリン酸エステルに変換する（硫化工程）。あるいはヨウ素、ピリジンなどを含む酸化剤によって亜リン酸エステルをリン酸ジエステルに変換する（酸化工程）。この工程を繰り返すことで、連結構造にチオリン酸エステルを含む合成核酸を製造することができる。ホスホロアミダイトの塩基の種類を変えることで、所望の配列を有する合成核酸を製造することができる。なお、酸化工程に替えて硫化工程を行うことで、ヌクレオチド骨格を構成する連結構造の所望の位置にのみチオリン酸エステルを導入することも可能である。

（ａ－１－２）
　次に、得られた合成核酸に、アミン又はアンモニウム基を有するブロモ化合物を反応させる。ブロモ化合物としては、例えば、３－ブロモ－１－プロピルアミン臭化水素酸塩、２－ブロモ－Ｎ，Ｎ－ジエチルエチルアミン臭化水素酸塩、（３－ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミドなどを例示することができる。合成核酸とブロモ化合物との反応は、リン酸緩衝液などで行うことができ、反応条件は適宜設定できるが、例えばｐＨは５～７の範囲内、反応温度は３０～６０℃、反応時間１０～５０時間で行うことができる。

（ａ－２）２段階合成法ＩＩ
　この方法では、核酸自動合成により核酸のボラノホスフェート化（Ｂ化）を行い、これに親水性重合体ホスホロアミダイト（例えば、エチレングリコールホスホロアミダイト）を連結させてオリゴＢ化―親水性重合体を合成（図２）したのち、更にヨウ素酸化によってアミノ基化合物を反応させてカチオン性基を導入する（図３の戦略２）。この方法では、後述のカチオンホスホロアミダイトを用いることで１つのリン酸基に２つのカチオン性基を導入することも可能である（ダブルカチオン導入）。

（ａ－３）２段階合成法ＩＩＩ
　この方法では、核酸自動合成によるカチオン性人工核酸を合成ののち、親水部をクリック反応で導入する（後述する実施例のＰＥＧ－ＰＭＯの系）。すなわち、骨格にカチオン性基を有するカチオン性人工核酸を合成したのち、これにアジドポリエチレングリコールなどの親水性アジド化合物をクリック反応により連結させる方法である。

（ｂ）１段階合成法
　先に説明した方法は、チオリン酸エステルを含む合成核酸を製造し、これにブロモ化合物を反応させる２段階の合成方法であったが、１段階でカチオン性人工核酸を合成することもできる。図２はこの方法のスキームを示している。この方法の概略としては、カチオンホスホロアミダイトとエチレングリコールホスホロアミダイトの核酸自動合成によるカチオン－親水性重合体の１段階合成である（図２、図３の戦略１）。この方法も、基本的には２段階合成法で示したホスホロアミダイト法と類似したスキームであるが、一部に相違がある。

　まず、固相に担持したヌクレオチドに、ジイソプロピルアミド亜リン酸化合物とヌクレオチドモノマーとを反応させる（図の「１．Ｃｏｕｐｌｉｎｇ」）。一部の水酸基を保護基で保護し（「２．Ｃａｐｐｉｎｇ」）、酸化剤又はホウ化剤で酸化又はホウ素化する（「３．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｂｏｒａｎａｔｉｏｎ」）。ヨウ素酸化によってアミノ基化合物を反応させてカチオン性基を導入する。

　図３に核酸アナログの合成スキームの一例を示す。この例では、カチオン性人工核酸としてヌクレオチド骨格を、親水性重合体としてポリエチレングリコールを有する核酸アナログを合成するスキームを示している。図の「ホスホロアミダイト合成」において、化合物１～３の順に公知の方法でホスホロアミダイトヌクレオチドを合成する。一方で、化合物４～６の順に、ホスホロアミダイトポリエチレングリコールを合成する。

　次に、図の「戦略１：カチオン導入オリゴ核酸合成」に示すスキームで核酸アナログを合成する。具体的には、上記のスキームで合成したホスホロアミダイトヌクレオチドとホスホロアミダイトポリエチレングリコールと、分子内にジスルフィド結合とホスホロアミダイトを有するホスホロアミダイトジスルフィドとを原料とする。そして、保護基による保護と脱保護などの反応を行い、カチオン性人工核酸の５’位に親水性重合体を結合する。なお、図の「戦略２：カチオン導入オリゴ核酸合成」に示すスキームのように、固相合成によって一段階でカチオン性人工核酸を合成してもよい。

（２）核酸送達用構造体の製造方法
　次に、核酸送達用構造体の製造方法について説明する。核酸送達用構造体は、送達対象核酸と核酸アナログとを会合させて複合体を形成させる（会合工程）。核酸アナログのカチオン性基と送達対象核酸のリン酸基との間に相補性がある場合は、アニーリングによって両者を結合して二本鎖を形成させる。アニーリングの際の核酸アナログと送達対象核酸の比率としては特に制限はないが、核酸アナログ：送達対象核酸＝１：１～１：１０の範囲内が好ましい。アニーリングは所定温度への昇温と、その後の降温によって行う。アニーリングとしては、８０℃以上への昇温が好ましく、９０℃以上への昇温より好ましい。また、昇温した温度の保持時間としては、５分以上が好ましく、１０分以上がより好ましい。その後、５０℃以下、好ましくは３０℃以下に降温し、１０分以上、好ましくは３０分以上その温度を保持する。

　なお、核酸アナログのカチオン性基と送達対象核酸のリン酸基との静電相互作用の観点から、この工程は、核酸アナログのカチオン性基のｐＫａよりも低く、送達対象核酸のリン酸基のｐＫａよりも高いｐＨ条件下で行うことが好ましい。すなわち、このようなｐＨ条件では、カチオン性基が正に、リン酸基は負に帯電しており、これらの基が静電結合する。このようなｐＨ条件は、カチオン性基のｐＫａなどにもよるが、ｐＨ２～７程度が好ましく、ｐＨ３～６程度がより好ましい。

　次に、複数の複合体を会合させて高次構造を形成させる（会合体形成工程）。この工程では、水や水溶液などの水性溶媒中で複合体どうしが自己凝集してミセルやベシクルなどの構造体が形成される。構造体を形成するための複合体の濃度としては、２５～２５００μＭ程度であり、１００～１０００μＭの範囲内がより好ましい。

４．核酸送達方法
　本発明の核酸送達方法は、上記の核酸送達用構造体を投与して標的部位内に核酸送達用構造体を取り込ませる投与工程と、標的部位内で核酸を放出させる放出工程と、を有する。投与工程では、送達対象核酸と結合した状態の上記の構造体を、人やその他の哺乳動物などに投与する。構造体を含む薬剤は、血液中に投与することが好ましいが、治療対象となる疾患や親水性重合体の種類などに応じて適宜決定することができる。投与された構造体は、細胞が標的部位である場合はエンドソーム経由で細胞質に取り込まれる。放出工程では、標的部位である細胞内に取り込まれた構造体から送達対象核酸が放出される。カチオン性基が四級アンモニウムなどｐＨ応答性の高い構造体では、エンドソーム内の酸性環境下で構造崩壊して送達対象核酸を放出しやすくなる。また、上記のように、構造体の中空部分に低分子の医薬を包接させて評定部位内で放出させることも可能である。このような方法で、標的部位に送達対象核酸や低分子医薬を送達することができる。

　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。

１．核酸アナログ（人工核酸＋親水性重合体）の製造
（１―１）オリゴヌクレオチド合成
　オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ１－４，８，１２－１５，１９－２１，２５，３３，３７）は、Ｇｅｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｉｎｃ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。なお、親水性重合体が結合したオリゴヌクレオチドは、エチレングリコールのホスホロアミダイト体を核酸配列合成と同様にＧｅｎｅ　Ｄｅｓｉｎｇ　Ｉｎｃ．にて自動核酸合成機で連結した（連結部位はホスホジエステル結合）。

　オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ５－７，９－１１，１６－１８，２２－２４，２６－２８）は、それぞれあらかじめ親水性重合体が結合しているＳＥＱＩＤ４、８、１５、２１、２５を出発物質とし、ブロモ化合物（１００－１０００当量）を用いてリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐＨ６．５）中で、４５℃で２４時間反応した。反応後、Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２，　ＣＥ，　１ｍｌ，　３．５－５ＫＤａ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ，ＵＳ）を用いて５－７日間蒸留水で透析し精製した。精製後、凍結乾燥機で濃縮し化合物を得た。ブロモ化合物の３－ブロモ－１－プロピルアミン臭化水素酸塩はＷａｃｏ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。２－ブロモ－Ｎ，Ｎ－ジエチルエチルアミン臭化水素酸塩と、（３－ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミドはＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。ＳＥＱＩＤ ２２―２４は反応後、ＨＰＬＣ精製と脱塩、濃縮を経て生成物を得た(図１０)。溶出時間は下記の表に示した。

（２）モルフォリノ核酸
　モルフォリノ核酸（ＳＥＱＩＤ２９）は、Ｇｅｎｅ　Ｔｏｏｌｓ，ＬＣＣ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，　Ｐｒｅｇｏｎ，ＵＳ）より購入した。オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ３０－３２，３４－３６，３８－４０）は、それぞれＳＥＱＩＤ２９、２４、２８を出発物質とし、アジドポリエチレングリコール化合物（１０当量）を用いて、硫酸銅（ＩＩ）（１０当量）とアスコルビン酸ナトリウム（１０当量）を加え、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、室温で１５分反応し親水性重合体を連結した。反応後、ＨＰＬＣ精製と脱塩、濃縮を経て生成物を得た。アジド化合物のＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）ｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ　ａｚｉｄｅ，　ａｖｅｒａｇｅ　Ｍｎ　１０００（１０Ｋ），　５０００（５０Ｋ），　１００００（１００Ｋ）は、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。

（３）配列一覧
　合成したオリゴヌクレオチドの配列を表２及び表３に示す。ＳＥＱＩＤ１－２はマイクロＲＮＡ－１４３のアンチセンス鎖（ＡＳ－１，２）、ＳＥＱＩＤ３－１１はマイクロＲＮＡ－１４３のセンス鎖（Ｓ－１－９）、ＳＥＱＩＤ１２－１３はレニーラルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、ＳＥＱＩＤ１４－１８レニーラルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖を示す（以下、アンチセンス鎖を「ＡＳ」、センス鎖を「Ｓ」と略す場合がある。）。この表において、「Ｎ」（大文字）はＲＮＡを、「ｄＮ」はＤＮＡを、「Ｎ_ｆ」は２’－ＦＲＮＡを、「Ｎ_ｍ」は２’－ＯＭｅＲＮＡを、「Ｘ」は－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３Ｏ－、「Ｙ」は－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_６Ｏ－を示す。「^＊」は－Ｐ（Ｏ）ＯＨ－を、「^＾」は－Ｐ（Ｓ）ＯＨ－を、「^１」は－Ｐ（Ｓ－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ_２）ＯＨ－を、「^２」は－Ｐ（Ｓ－（ＣＨ_２）_２－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）ＯＨ－を、「^３」は－Ｐ（－Ｓ（ＣＨ_２）_３－Ｎ（ＣＨ_３）_３）ＯＨ－を、「^ｐｍｏ」はモルフォリノ核酸を、それぞれ意味する（これらの一部については下記の化学式を参照。なお、「^＾」については２つの構造が共役した構造を示す。）。「Ｅ」はエチニル基を、「Ｌ」はリガンド化合物（グルコース、ガラクトース、フコース、アミノ糖）を、「Ｓ」はジスルフィドを示す。

　本明細書において、カチオン性人工核酸と親水性重合体からなる核酸アナログと、送達対象である核酸とが会合して形成される構造体は、条件によっては可逆的にカチオン性重合体と核酸アナログの状態を取ることができることから、便宜上、構造体のことを、ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｌｙ　ｉｏｎｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓと称し、ＲＩＯＮ又はＲＩＯと記載することがある。ＲＩＯＮ^＃＃＃、又は、ＲＩＯ^＃＃＃と記載した場合は、上付＃は送達対象である核酸の名称や核酸の配列を示す。さらに、本明細書においては、アミンを、構造１：一級アミン（Ａ）、構造２：三級アミン（Ｂ）、構造３：四級アンモニウム（Ｃ）、親水部は、構造Ｘ：トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、構造Ｙ：ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）と記載する場合がある。
　例：ＲＩＯＮ^１４３（ＴＥＧ－Ｂ）；トリエチレングリコール＋マイクロＲＮＡ－１４３配列＋三級アミンによる構造体
　例：ＲＩＯ^１４３（ＴＥＧ－Ｂ）；トリエチレングリコール＋マイクロＲＮＡ－１４３配列＋三級アミンによる構造体

　以下、上記の表の略称（ＩＤ）及び配列番号（ＳＥＱＩＤ）と実施例の対応を記載する。
　「Ｓ－３」（ＳＥＱＩＤ　５）＝実施例１、
　「Ｓ－４」（ＳＥＱＩＤ　６）＝実施例２、
　「Ｓ－５」（ＳＥＱＩＤ　７）＝実施例３、
　「Ｓ－７」（ＳＥＱＩＤ　９）＝実施例４、
　「Ｓ－８」（ＳＥＱＩＤ　１０＝実施例５、
　「Ｓ－９」（ＳＥＱＩＤ　１１）＝実施例６、
　「Ｓ－１２」（ＳＥＱＩＤ　１６）＝実施例７、
　「Ｓ－１３」（ＳＥＱＩＤ　１７）＝実施例８、
　「Ｓ－１４」（ＳＥＱＩＤ　１８）＝実施例９、
　「Ｓ－１７」（ＳＥＱＩＤ　２２）＝実施例１０、
　「Ｓ－１８」（ＳＥＱＩＤ　２３）＝実施例１１、
　「Ｓ－１９」（ＳＥＱＩＤ　２４）＝実施例１２、
　「Ｓ－２１」（ＳＥＱＩＤ　２６）＝実施例１３、
　「Ｓ－２２」（ＳＥＱＩＤ　２７）＝実施例１４、
　「Ｓ－２３」（ＳＥＱＩＤ　２８）＝実施例１５、
　「Ｓ－３３」（ＳＥＱＩＤ　４２）＝実施例１６、
　「Ｓ－３４」（ＳＥＱＩＤ　４３）＝実施例１７、
　「Ｓ－３５」（ＳＥＱＩＤ　４４）＝実施例１８

２．構造体の形成方法と物性評価
（１）アニーリング
　各ヌクレオチドを滅菌水に溶解した後、ＡＳ：Ｓ＝１：１－１０の重量比で混合した。その後、９８℃で１５分間、２５℃で５０分間、４５℃で５０分間インキュベートし、アニーリング混合物（下記表のＡＮ１－２４）を得た。

（２）構造体の物性評価
　得られたアニーリング混合物は、２０ｗｔ％アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：　Ａｔｏｍｉｃ　ｆｏｒｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、動的光散乱法（ＤＬＳ：　Ｄｙｎａｍｉｃ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、円偏光二色性（ＣＤ：　Ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）などを用いて物性を評価した。

（３）ネイティブＰＡＧＥ
　１０μＭに調整したアニーリング混合物は、７．５又は２０ｗｔ％アクリルアミドゲルに５－１０ｐｍｏｌアプライし、２５－４０分間泳動した。泳動後、Ａｌｌｉａｎｃｅ　Ｑ９（ＵＶＩＴＥＣ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＵＫ）でＣｙ３の蛍光を検出した。撮影後、ＳＹＢｒＧｏｌｄで５分間核酸を染色し、ＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ）の蛍光を検出した。なお、マーカーは１００ｂｐＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．，　Ｓｈｉｇａ，　Ｊａｐａｎ）と２０ｂｐＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．，　Ｓｈｉｇａ，　Ｊａｐａｎ）をサンプルの両端にアプライした。

（４）構造体のＴＥＭ観察
　グリッド基盤上に１０μＭアニーリング混合物を５μＬ滴下し、自然乾燥させた後、リンタングステン酸で染色し、ＪＥＭ－２０１０（ＪＥＯＬ　Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）で観察した。

（５）構造体のＡＦＭ観察
　マイカ基盤上に１．５μＭアニーリング混合物を５μＬ滴下し、一晩自然乾燥させた後、１０分間真空乾燥させて、Ｎａｎｏｃｕｔｅ（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）で観察した。

（６）動的光散乱（ＤＬＳ）測定による構造体の粒子径の評価
　ＤＬＳは、ＤｅｌｓａＭａｘ　ＰＲＯ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，　Ｂｒｅａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて３７℃で測定した。アニーリング混合物の濃度は２０－５０μＭとした。自己相関関数より流体力学的半径（Ｒ_Ｈ）を算出した。ｐＨによる構造変化は１Ｎ　ＨＣｌをｐＨ５になるように調整した。血清耐性評価は、５０％ＦＢＳ中で、３７℃でインキュベートして経時的な構造変化を評価した。

（７）円偏光二色性（ＣＤ：Ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｉｏｓｍ）によるキラリティ評価
　ＣＤは、円二色性分散計（Ｊ－８２０ＫＳ；　ＪＡＳＣＯ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて波長２４０－３２０ｎｍ，温度２０－８０℃の範囲で光路長１ｃｍの石英セルを用いて３７℃で測定を行った。アニーリング混合物の濃度は１．５μＭとした。

（８）構造体の形成評価
　図４（Ａ）はＡＮ４（Ｓ－４（実施例２）とＡＳ－１）、図の（Ｂ）はＡＮ５（Ｓ－５（実施例３）とＡＳ－１）のアニーリング混合物の泳動結果を示した。図の（Ａ）の左図のレーン５から７ではＣｙ３（シアニン色素）に由来するＳＥＱＩＤ１’のバンドが薄くなった。ここで、ＳＥＱＩＤ１’は、ＳＥＱＩＤ１とＳＥＱＩＤ２を９：１で混合したものであり、Ｃｙ３はＳＥＱＩＤ２に由来する。これはＳＥＱＩＤ６の混合比が１から５と増えると、ＳＥＱＩＤ１’が構造形成した可能性が示唆された。この現象は、Ｃｙ３検出後にＲＮＡ染色後の右図のレーン５から７も同様の傾向が観察された。図の（Ｂ）の左図のレーン５から７はＣｙ３に由来するＳＥＱＩＤ１’のバンドが検出されなかった。これは、ＳＥＱＩＤ７のアニーリング混合ではＳＥＱＩＤ７の混合比が１から１０の増加に関係なく、１の時点からの構造形成が示唆された。図の（Ｃ）は、ＡＮ４をＴＥＭで観察した結果で、直径６０ｎｍ程度の構造体が観察された。図の（Ｄ）は、ＡＮ５をＡＦＭで観察した結果で、直径７５ｎｍ程度の構造体が観察された。図の（Ｅ、Ｆ）より、ＡＮ４とＡＦ５の流体力学的半径（Ｒ_Ｈ）はそれぞれ、３５ｎｍと４５ｎｍだった。これらの結果より、アニーリング混合物はナノ構造体を形成することが明らかとなった。他のアニーリング混合物のＲ_Ｈを下記の表に示す。

※アニーリング混合物の粒子系一覧
（ＡＮ３＝ＲＩＯ^１４３（ＴＥＧ－Ａ）、ＡＮ４＝ＲＩＯ^１４３（ＴＥＧ－Ｂ）、ＡＮ５＝ＲＩＯ^１４３（ＴＥＧ－Ｃ）、ＡＮ７＝ＲＩＯ^１４３（ＨＥＧ－Ａ）、ＡＮ８＝ＲＩＯ^１４３（ＨＥＧ－Ｂ）、ＡＮ９＝ＲＩＯ^１４３（ＨＥＧ－Ｃ））

（９）構造体のｐＨ応答評価と血清耐性評価
　図５に、構造体のｐＨ応答による構造変化と構造体の血清中での安定性を評価した結果を示す。図の（Ａ、Ｂ）より、ｐＨ７の条件下では、ＡＮ４とＡＮ５ともに、ＡＮ２に観測されたＡ型らせん構造に特徴的な２６０ｎｍの正のピークは長波長側にシフトし、２１０ｎｍの激しいネガティブの落ち込みは観測されなかった。ｐＨを５に変化させた時、ＡＮ４は変化が見られなかったのに対し、ＡＮ５では２６０ｎｍの正のピークの強度が低下した。この時のＲ_Ｈを測定した結果を図の（Ｃ、Ｄ）に示す。ＡＮ４は、Ｒ_Ｈが３５ｎｍから８５ｎｍと増大した。一方、ＡＮ５では、ｐＨ５の時に、自己相関関数の強度が大幅に低下し、Ｒ_Ｈが算出できなかった。これらの結果から、ＡＮ４は、カチオン性基が三級アミンであるが、ｐＨが７から５に変化することで、構造体のキラリティは大きく変化しないが、Ｒ_Ｈが２倍程度変化することが明らかとなった。ＡＮ５は、カチオン性基が四級アンモニウムであるが、ｐＨが７から５に変化すると、構造体のキラリティもＲ_Ｈも大きく変化し、特に、Ｒ_Ｈが算出できなかったことからｐＨ低下に伴い構造体が崩壊することが示唆された。図の（Ｅ）では、ＡＮ４の経時的な血清耐性をＲ_Ｈから評価した。２４時間と、４８時間において血清とインキュベートする前のＲ_Ｈと比較して変化は見られず、４８時間と長時間において血清耐性を示すことが明らかとなった。

（１０）構造体による核酸送達の細胞評価
　図６では、構造体による核酸送達の評価として、ＤＬＤ－１細胞株を用いたレニーラルシフェラーゼ（ＲＬ）活性阻害評価（図の（Ａ））と、マイクロＲＮＡ－１４３の送達評価（図の（Ｂ、Ｃ））した結果を示す。ＡＮ１２（Ｓ－１２（実施例７）とＡＳ－３）、ＡＮ１３（Ｓ－１３（実施例８）とＡＳ－３）、ＡＮ１４（Ｓ－１４（実施例９）とＡＳ－３）は、添加濃度に依存してＲＬの発現阻害の傾向が評価され、構造体を形成するレニーラルシフェラーゼ配列による阻害活性が確認された（図の（Ａ））。図の（Ｂ）では、ＡＮ４、ＡＮ５が添加濃度依存的にＤＬＤ－１の生存率を大きく低下させた。ＤＬＤ－１からタンパクを抽出し、マイクロＲＮＡ－１４３の標的タンパクであるＫ－ＲＡＳの存在を評価した（図の（Ｃ））。その結果、ＡＮ４やＡＮ５でＫ－ＲＡＳの発現が抑えられていることが明らかとなり、ＡＮ４やＡＮ５は特にマイクロＲＮＡ－１４３を送達できることが示された。他のアニーリング混合物の結果を下記の表に示す。

※アニーリング混合物によるＤＬＤ－１生存率一覧

（１１）共焦点レーザー顕微鏡観察
　それぞれの構造体のＤＬＤ－１細胞への取り込みは、共焦点レーザー顕微鏡で観察された。図７（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）はＲＮＡに由来するＣｙ３の赤色蛍光像が観察され、リソソームの緑色像とは独立して存在することが重ね合わせ像より示された。特に図の（Ｄ）のＡＮ４は強い細胞取り込みが観察された。図の（Ｉ）はＡＮ４の取り込みを１２０倍率で観察した像を示す。結果より構造体は細胞核やリソソームと交わることなく細胞質に取り込まれていることが推測された。

３．モルフォリノ核酸（ＰＭＯ）－ＰＥＧコンジュゲート体の構造形成評価
　図８は、モルフォリノ核酸を用いたアニーリング混合物（ＡＮ２８（Ｓ－２５とＡＳ－７）、ＡＮ２９（Ｓ－２８とＡＳ－７））のｐＨ７と４における電気泳動の結果を示す。泳動後、ゲルをＲＮＡ染色し、撮影した。電気泳動の条件は、７．５ｗｔ％　ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ、Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｖｏｌｕｍｅ：１０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ、Ｔｉｍｅ：４０ｍｉｎ、Ｄｙｅ：Ｓｙｂｒｇｏｌｄ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ→Ｅｂｔｒｆｉｌｌｔｅｒである。レーン１と４は、アニーリング前のＳＥＱＩＤ３４とＳＥＱＩＤ３８である。それぞれＳＥＱＩＤ３０とアニーリングし、ｐＨ７とｐＨ４に調整した。その結果から、ＡＮ２８とＡＮ２９はｐＨが７から４に変化するとバンドが高分子側へシフトした。ＤＬＳによる粒子系の測定より、ＡＮ２９（ｐＨ７）は２ｎｍ（レーン５）、ＡＮ２９（ｐＨ４）は１５０ｎｍ（レーン６）であった。モルフォリノ核酸を用いたアニーリング混合物はｐＨ変化によって構造体を形成することが示唆された。

４．非相補鎖アニーリング混合物の評価
　非相補鎖のアニーリング混合物（ＡＮ２５－２７）の泳動結果を図９（Ａ）に示す。レーン３のＡＮ２５（Ｓ－１７（実施例１０）とＡＳ－３）は、ＳＥＱＩＤ１２（ルシフェラーゼのＡＳ鎖）のバンドが薄くなり、ウェル部分に新たな蛍光が観察された。レーン４のＡＮ２６（Ｓ－１８（実施例１８）とＡＳ－１）は、新たな位置にバンドが観察された。レーン５のＡＮ２７（Ｓ－１９（実施例１２）とＡＳ－３）では非相補鎖の相互作用は特に観察されていない。続いて、共焦点顕微鏡でＡＮ２６を観察した（図の（Ｂ），（Ｃ））。その結果、約２５０ｎｍの蛍光が観察され構造体が存在することが示唆された。ＡＮ２６を用いて、ＭＣＦ―７細胞株（ヒト乳腺がん）を用いたレニーラルシフェラーゼ（ＲＬ）活性阻害評価を行なった（図の（Ｄ））。ＡＮ２６の添加濃度に依存してＲＬの発現が阻害された。この時、ＡＮ２６はＭＣＦ―７に取り込まれることを観測している（図の（Ｅ））。

５．構造体を用いたルシフェラーゼｓｉＲＮＡの送達評価
（１）細胞培養
　ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ－１（Ｋ－ＲＡＳ　ｍｕｔａｎｔ；　Ｇ１３Ｄ）とヒト乳腺細胞株ＭＣＦ―７は、Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｓｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋより購入した。ＤＬＤ－１細胞は、１０％非働化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０（Ｗａｃｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。ＭＣＦ７細胞は、１０％非働化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム含有ＭＥＭα（Ｗａｃｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で培養した。

（２）ルシフェラーゼ阻害評価
　ＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７は、５×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで２４ウェルプレートに播種し、一晩培養した。その後、ｐｓｉＣｈｅｃｋ２（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ＵＳＡ）１００ｎｇをＴｒａｎｓｆａｓｔ（Ｗａｃｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて添加した。翌日、細胞を回収したのち、５×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。次に、最終濃度が１―１０００ｎＭとなるように各アニーリング混合物を添加し、４８時間培養した。その後、上清液を除去しプレートを－２００℃で６時間凍結した。その後、レニーラルシフェラーゼの阻害活性をＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ＵＳＡ）を用いて発光シグナルとして検出した。その結果を図６（Ａ）、図９(Ｄ)、１１に示す。

６．構造体を用いたＲＮＡ医薬（ｍｉＲ－１４３）送達評価
（１）構造体によるＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７増殖抑制効果
　ＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７は１×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。その後、最終濃度が１―１００ｎＭになるように各アニーリング混合物を添加し、７２時間培養した後、残存する生細胞を細胞増殖／細胞毒性アッセイキット（Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ＷＳＴ－８；　Ｗａｃｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて吸光シグナルとして検出した。なお、ＮＴ（ｎｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、ｍｉＲＮＡを導入していないコントロールで、ＡＮ２はリポフェクション試薬を使用していないコントロール（Ｎａｋｅｄ）である。その結果を図６（Ｂ）、図１２に示す。

７．構造体によるＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７増殖抑制メカニズム
（１）ウェスタンブロット解析
（ａ）タンパク質サンプル調整：ＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７は１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。その後、最終濃度が５０ｎＭになるように各アニーリング混合物を添加し、４８時間培養した後、スクレーパーで細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに細胞懸濁液を回収した。遠心して細胞のペレットを得た後、タンパク抽出を行った。タンパク抽出液には、ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、　０．１％ＳＤＳ、　１％ＮＰ－４０、　０．１％デオキシコール酸ナトリウム、　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に１％　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｎａｋａｒａｉ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ　Ｉ，　ＩＩ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，　ＭＡ，　ＵＳ）、及び、ＩＩＩを混合して用いた。タンパク質抽出液に細胞のペレットを懸濁させ、２０分間氷中に静置した。その後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離した。遠心分離した上清を回収し、タンパク質サンプルとした。タンパク質サンプルは、ＳＤＳ　ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ　ＤＴＴ、０．０１％ブロモフェノールブルー）と混和して２０μｇ／μＬに調整し、９８℃で５分間煮沸処理した後、氷上で５分間静置した。

(ｂ）電気泳動、転写、及び検出
　電気泳動には、イージーセパレーター（Ｗａｋｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）及びＳｕｐｅｒ　Ｓｅｐ　Ａｃｅ（Ｗａｋｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いた。泳動後、ゲルをＢｌｏｔｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　０．２Ｍ　グリシン、２０％エタノール）に５分間浸した。ＰＶＤＦメンブレン（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）はメタノールに１０分間浸し、超純水に１０分間浸した。その後、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒに５分間浸した。陽極側から、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙、ＰＶＤＦメンブレン、ゲル、ろ紙の順に重ね、１５Ｖ、３７０ｍＡで４０分間転写した。転写後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０含有５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、Ｂｒｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＰＶＤＦ；）に１時間浸した。ＴＢＳＴで洗浄し、抗体希釈液（２％　ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、ＴＢＳＴ）で希釈した一次抗体に浸して４℃で一晩反応させた。ＴＢＳＴで洗浄した後、二次抗体に浸して室温で１時間静置した。その後、ＴＢＳＴで洗浄し、Ｌｕｍｉｎａｔａ　Ｆｏｒｔｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ＨＲＰ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＷＢＬＵＦ０５００；　Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，　ＭＡ，　ＵＳ）で発光させた後に、ＧｌｏＭａｘ　Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ＵＳＡ）を用いて検出した。コントロールにはａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｄａｎｖｅｒｓ，　ＭＡ，　ＵＳ）を使用した。Ｋ－ＲＡＳに対する抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＵＫ）から購入した。その結果を図６（Ｃ）、図１３に示す。

８．構造体の細胞取り込み
（１）ＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７への構造の取り込み観察
　ＤＬＤ－１、ＭＣＦ―７は、５×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。その後、最終濃度が５０ｎＭになるように各アニーリング混合物を添加し、２４－７２時間培養した後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ３０００；　ＯＬＹＭＰＵＳ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて蛍光像を観察した。なお、核は、Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（Ｗａｋｏ　Ｉｎｃ．，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）で染色し、リソソームはＣｅｌｌＬｉｇｈｔ　Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ）で染色した。

９．リガンド人工核酸
（１）オリゴヌクレオチド合成の実験データ
　オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ４１，４５）はＧｅｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｉｎｃ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ４１（Ｅ＝Ｇｌｕ）、ＳＥＱＩＤ４５（Ｅ＝Ｇｌｕ））は、それぞれＳＥＱＩＤ４１，４５を出発物質とし、アジド化合物（１０当量）を用いて、アスコルビン酸、銅イオンを添加しＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、３０分間室温で反応した（反応の参考文献：ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／Ｃ０ＣＣ０４９７９Ｄ）。ここで「ＳＥＱＩＤ４１（Ｅ＝Ｇｌｕ）」は、ＳＥＱＩＤ４１の親水性基にリガンドとしてグルコースが結合したリガンド人工核酸を意味する。反応に用いる溶液は全て脱気したものを用いた。反応後、高速液体クロマトグラフィーにて反応を確認し分取した。分取後、脱塩処理し凍結乾燥機で濃縮した。その後、ブロモ化合物（１００－１０００当量）を用いてＰＢＳ中４５℃で２４時間反応した。反応後、Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２，ＣＥ，１ｍｌ，３．５－５ＫＤａ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳ）を用いて５－７日間蒸留水で透析した。透析後、凍結乾燥機で濃縮し、化合物（ＳＥＱＩＤ４３（Ｌ＝Ｇｌｕ）、ＳＥＱＩＤ４７（Ｌ＝Ｇｌｕ））を得た。ブロモ化合物（２－ブロモ－Ｎ，Ｎ－ジエチルエチルアミン臭化水素酸塩）はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。新たに合成したオリゴヌクレオチドの配列を表７に、アニーリング混合物を表８に示す。

（２）抗腫瘍効果：ｉｎ　ｖｉｖｏの実験
　実験に供したマウスは、広島大学の動物実験ガイドラインに基づいて飼育した。担がんマウスはマウス背中皮下へハンクス液に懸濁した大腸がん細胞（ＤＬＤ－１細胞、８．０×１０^５ｃｅｌｌｓ）の移植により作製した。固形がん生着後（移植７日後）より３日に１回（計４回）マウスの尾静脈からサンプルを投与した。投与したサンプルは、生理食塩水、ＡＮ１とＡＮ４（容量１００μＬ，核酸（ガイド鎖）３７５μｇ／ｋｇ）である。３日に１回マウスの腫瘍の長径（Ｌｍｍ）と短径（Ｓｍｍ）をノギスで計測し、腫瘍堆積（Ｖｍｍ^３）を体積の式：Ｖ＝（Ｌ×Ｓ^２）×０．５より算出した。担がんマウスの腫瘍の体積変化より抗腫瘍効果を評価した。

（３）抗腫瘍効果
　担がんマウスはマウス背中皮下へハンクス液に懸濁した大腸がん細胞（ＤＬＤ－１細胞８．０×１０^５ｃｅｌｌｓ）の移植により作製した。固形がん生着後（移植７日後）より３日に１回（計４回）生理食塩水、ＡＮ１、ＡＮ４を尾静脈投与（容量１００μＬ，核酸（ガイド鎖）３７５μｇ／ｋｇ）した。３日に１回マウスの腫瘍の長径（Ｌｍｍ）と短径（Ｓｍｍ）をノギスで計測し、腫瘍堆積（Ｖｍｍ^３）を体積の式：Ｖ＝（Ｌ×Ｓ^２）×０．５より算出した。担がんマウスの腫瘍の体積変化より抗腫瘍効果を評価した。

（４）動態評価
　担がんマウスにＡＮ１、ＡＮ４を尾静脈投与（容量１００μＬ，核酸（ガイド鎖）３７５μｇ／ｋｇ）し、尾静脈から経時的（１，２，４，８，２４時間）に採血し、Ｃｙ３の蛍光強度を測定し、投与した核酸の血中における生物学的半減期を求めたところ約２．４時間であった。また、２４時間後にそれぞれの臓器を回収し、Ｃｙ３の蛍光強度を測定したところ、肝臓においてはＣｙ３の蛍光は観測されず、投与した核酸の肝臓への集積は検出されなかったものの、腫瘍細胞においてはＣｙ３の蛍光が観察され集積していることが確認された。なお、ＬＮＰによりＲＮＡｓを投与した先行研究（Ｃｈｅｎ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，２３５，２３６－２４４（２０１６））によると、投与した核酸の血中における半減期は０．２５時間であり、肝臓への集積率は９１．４％。

（５）ＡＮ４（ＲＩＯ^１４３（ＴＥＧ－Ｂ））のｉｎ　ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏで有効性が実証されたＡＮ４をｉｎ　ｖｉｖｏへ展開し、大腸がん担持マウスにおける抗腫瘍効果と組織動態を評価した。その結果を図１４に示す。がん細胞を移植して７日後より、マウスの尾静脈にサンプルを投与し、腫瘍の体積変化を観察した。ＡＮ４を投与したグループは、生理食塩水やＡＮ１（Ｎａｋｅｄ^１４３）を投与したグループと比較して腫瘍体積の増加が抑制され、抗腫瘍効果の誘導が観察された。動態評価では、担がんモデルマウスの尾静脈より蛍光標識したＡＮ４を投与し２４時間後に各臓器を回収し、蛍光強度を測定することで、臓器への取り込みを測定した。その結果、ＡＮ４は、腫瘍に高く取り込まれており、肝臓への蓄積はごくわずかであった。本結果は、核酸の運搬体として広く利用されている脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の課題である肝臓への蓄積を回避する他の運搬技術として展開が期待される。

（６）リガンドＲＩＯＮ^{ｍｉＲ－１４３}の細胞内取り込み
　全身投与におけるＤＤＳは、“パッシブ・ターゲティング”と“アクティブ・ターゲティング”がある。パッシブ・ターゲティングでは、腫瘍周辺の血管内皮の特徴である、Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ（ＥＰＲ効果）の利用が知られている。アクティブ・ターゲティングは、標的細胞や組織だけに特異的送達することによって、より少ない投与量でがんに効率よく核酸を送達することが期待される。そこで、アクティブ・ターゲティングとしてリガンド導入構造体（ＡＮ３０）について検討した。

　その結果を図１５、図１６、図１７に示す。図１５の（ａ）は人工核酸の親水性基にリガンドとしてグルコース（Ｇｌｕ）を結合し、送達するＲＮＡとともに構造体を形成するスキームを表す図である。図１５の（Ｂ）、図１７（Ａ）は、リガンドとしてグルコースをＲＮＡ鎖に結合した反応前後の図である。図１６の（Ｄ）と図１７（Ｂ）は、送達したＲＮＡが細胞に取り込まれていることを示す図である。ＡＮ３０の細胞取り込みを蛍光顕微鏡にて観察したところ、添加６時間後には、ＲＮＡ由来の赤色蛍光が観察され、細胞に取り込まれていることがわかった。ＡＮ３１の細胞取り込み観察では、添加２４時間後にＲＮＡ由来の赤色傾向が観察され、細胞に取り込まれていることがわかった。図１５（Ｃ）の細胞増殖抑制効果の評価では、ＡＮ３０は添加濃度依存的にＤＬＤ－１細胞の生存を抑制した。

Claims (18)

1. 　カチオン性人工核酸と、該カチオン性人工核酸に結合した親水性重合体と、からなる核酸アナログであって、
   　前記カチオン性人工核酸は、リボース及びデオキシリボースから選択される環構造に塩基が結合した構成単位と、２つの前記構成単位の間を連結する連結構造と、からなる骨格構造を有し、
   　該連結構造は、カチオンの状態で、下記式（Ｃ１）～（Ｃ７）からなる群より選択されるカチオン性基を有し、前記カチオン性人工核酸は、他のヌクレオチドのリン酸基と前記カチオン性基との静電相互作用により会合しうることを特徴とする核酸アナログ。
   

   

   （ここで、Ｒ_１～Ｒ_３は水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、Ｒ_１～Ｒ_３は同一又は異なっていてもよい。Ｒｉｎｇは４～８個の炭素原子で構成された環式化合物であり、該炭素原子の１つ以上が窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子で置換された複素環であってもよい。）
2. 　前記カチオン性基のｐＫａが６～９の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アナログ。
3. 　前記連結構造が、カチオンの状態で、下記式（Ｌ１）～（Ｌ４）から選択される構造を少なくとも有することを特徴とする請求項１に記載の核酸アナログ。
   

   

   （ここで、Ｘ^＋は前記カチオン性基を含む官能基であり、ＺはＯ又はＳを示し、Ｗは－Ｏ－又は－ＮＲ_４－を示し、ここでＲ_４は水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示す。＊は隣接する前記構成単位との結合手を意味する。）
4. 　前記カチオン性人工核酸が、下記式（Ｎ１）で示されるヌクレオチド骨格を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸アナログ。
   

   

   （ここで、Ｘ^＋は前記カチオン性基を含む官能基であり、Ｂａｓｅは塩基を示し、Ｒ₅はＨ又はＯＨを示す。＊は隣接するヌクレオチド骨格のリン酸との結合手を意味し、５’末端又は３’末端においては少なくとも一方が前記親水性重合体と結合し、該親水性重合体と結合していない場合は水素である。）
5. 　前記Ｘ^＋が、カチオンの状態で、下記式（Ｆ１）で示されるアンモニウムカチオンであることを特徴とする請求項４に記載の核酸アナログ。
   

   

   （ここで、Ｒ₁～Ｒ₃は、水素又は炭素数１～１０のアルキル基を示し、互いに同一又は異なっていてもよく、ｍは０～１０の整数を示し、ｎは０又は１の整数を示す。）
6. 　前記親水性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアクリレート、ポリオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリ（カルボキシベタインメタクリレート）、ポリ（スルホベタインメタクリレート）、ポリ（２－メタアクリロイルオキシエチルホスホコリン）、ヒアルロン酸、キトサン及びデキストラン並びにこれらの誘導体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の核酸アナログ。
7. 　前記親水性重合体が、下記式（Ａ１）で示されるポリエチレングリコール骨格を有することを特徴とする請求項７に記載の核酸アナログ。
   

   

   （ここで、ｐは１～２０の整数を示す。）
8. 　送達対象である核酸を標的部位に送達するための担体であることを特徴とする請求項１に記載の核酸アナログ。
9. 　請求項８に記載の核酸アナログと送達対象である核酸とからなり該核酸を標的部位に送達するための核酸送達用構造体であって、前記カチオン性人工核酸と前記核酸とが静電相互作用により会合した会合構造を有することを特徴とする核酸送達用構造体。
10. 　複数の前記核酸送達用構造体が会合したナノスケールの構造体であることを特徴とする請求項９に記載の核酸送達用構造体。
11. 　前記会合構造が内側に、前記親水性重合体が外側に位置するベシクル又はミセルであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸送達用構造体。
12. 　リガンドで修飾されていることを特徴とする請求項１１に記載の核酸送達用構造体。
13. 　医薬を更に有することを特徴する請求項１１に記載の核酸送達用構造体。
14. 　前記核酸送達用構造体が、中心部に中空部分を有する球状構造体であり、
    　該中空部分に医薬が包接されていることを特徴とする請求項１３に記載の核酸送達用構造体。
15. 　請求項１に記載の核酸アナログの製造方法であって、前記カチオン性人工核酸を合成するカチオン性核酸合成工程と、該カチオン性人工核酸と前記親水性重合体とを結合する結合工程とを備え、
    　前記カチオン性核酸合成工程は、前記連結構造にチオリン酸エステルを導入する工程と、該チオリン酸エステルとブロモ化合物とを反応させる工程と、を備えることを特徴とする核酸アナログの製造方法。
16. 　請求項９に記載の核酸送達用構造体の製造方法であって、
    　前記核酸アナログの前記カチオン性基のｐＫａよりも低く、前記核酸のリン酸のｐＫａよりも高いｐＨ条件で前記核酸アナログと前記核酸とを静電相互作用により会合させて会合構造を形成させる会合工程と、を有することを特徴とする核酸送達用構造体の製造方法。
17. 　複数の前記核酸送達用構造体を会合させて、前記会合構造が内側に、前記親水性重合体が外側に位置するベシクル又はミセルを水性溶媒中で形成する会合体形成工程と、を更に備えることを特徴とする請求項１６に記載の核酸送達用構造体の製造方法。
18. 　請求項９に記載の核酸送達用構造体を用いて標的部位に前記核酸を送達するための核酸送達方法であって、
    　前記核酸送達用構造体を投与して前記標的部位内に前記核酸送達用構造体を取り込ませる投与工程と、
    　前記標的部位内で前記核酸を放出させる放出工程と、を有することを特徴とする核酸送達方法。

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