WO2022230476A1 - 乳酸球菌の増殖促進剤 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a growth promoter for lactic acid cocci.
- the present invention also relates to a culture medium for lactic acid cocci, a method for culturing lactic acid cocci, and a method for promoting the growth of lactic acid cocci.
- LB medium and MRS medium are generally used for culturing lactic acid bacteria. However, depending on the type of medium, sufficient growth of lactic acid cocci could not be obtained in some cases.
- Patent Document 1 and Patent Document 2 have been known as methods for efficiently culturing lactic acid cocci.
- the purpose of the present invention is to provide a novel growth-promoting agent for lactic acid bacteria.
- Another object of the present invention is to provide a novel culture medium for lactic acid cocci, a novel method for culturing lactic acid cocci, and a novel method for promoting growth of lactic acid cocci.
- the present inventors found that in culturing lactic acid cocci, the growth of lactic acid cocci was promoted by including a dicarboxylic acid or a salt thereof in the medium.
- the present invention is based on this finding.
- a growth-promoting agent for lactic acid bacteria comprising a dicarboxylic acid and/or a salt thereof as an active ingredient.
- the dicarboxylic acid and/or its salt is one or more selected from the group consisting of malic acid, ⁇ -ketoglutaric acid and salts thereof. Proliferation promoter.
- a medium for lactic acid bacteria containing a dicarboxylic acid and/or a salt thereof containing a dicarboxylic acid and/or a salt thereof at a concentration of 0.01 to 8% by mass.
- the medium according to [8] or [9] above which is substantially free of meat extract.
- a method for culturing lactic acid cocci comprising the step of culturing lactic acid cocci in the medium according to any one of [8] to [10] above.
- a method for promoting the growth of lactic acid cocci comprising adding a dicarboxylic acid and/or a salt thereof to a culture medium for lactic acid cocci.
- the growth of lactic acid cocci can be promoted by culturing lactic acid cocci in a medium containing a dicarboxylic acid or a salt thereof, so that lactic acid cocci can be cultured simply and efficiently.
- the present invention is also advantageous in that the growth of lactic acid cocci can be promoted by including dicarboxylic acid or a salt thereof even in a medium containing no animal meat extract.
- FIG. 1 shows the amount of Lactococcus lactis subspecies lactis at each concentration when ⁇ -ketoglutarate or its salt or malic acid was added to MRS medium under anaerobic culture conditions (FIG. 1A: ⁇ - ketoglutarate ( ⁇ KG), Figure 1B: ⁇ -ketoglutarate disodium salt ( ⁇ KG2Na), Figure 1C: malic acid).
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 2 shows the amount of Lactococcus lactis subspecies lactis at each concentration when ⁇ -ketoglutarate or malic acid was added to the MRS medium under aerobic culture conditions (FIG. 2A: ⁇ -ketoglutarate acid ( ⁇ KG), FIG.
- FIG. 2B malic acid
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 3 shows the amount of lactic acid bacteria at each concentration when ⁇ -ketoglutarate ( ⁇ KG) or malic acid was added to GM17 medium under anaerobic culture conditions.
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 4 shows the amount of Lactococcus lactis subspecies lactis at each concentration when ⁇ -ketoglutarate or malic acid was added to GM17 medium under aerobic culture conditions (FIG. 4A: ⁇ -ketoglutarate acid ( ⁇ KG), FIG. 4B: malic acid).
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 4A ⁇ -ketoglutarate acid ( ⁇ KG)
- FIG. 4B malic acid
- FIG. 5 shows the amount of various lactic acid cocci at each concentration when ⁇ -ketoglutarate ( ⁇ KG) was added to the MRS medium under anaerobic culture conditions.
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 6 shows the amount of Lactobacillus lactobacillus at each concentration when ⁇ -ketoglutarate ( ⁇ KG) was added to the MRS medium under anaerobic culture conditions.
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 7 shows the amount of Lactococcus lactis subspecies lactis at each concentration when citric acid was added to the MRS medium under anaerobic culture conditions. The control shows the case without citric acid addition.
- FIG. 8 shows the amount of Pediococcus lactococcus at each concentration when ⁇ -ketoglutarate ( ⁇ KG) or malic acid was added to the MRS medium under anaerobic culture conditions.
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 9 shows the amount of various lactic acid cocci at each concentration when ⁇ -ketoglutarate ( ⁇ KG) was added to MRS medium containing no meat extract under anaerobic culture conditions.
- a control shows the case of no addition of dicarboxylic acid.
- FIG. 10 shows the amount of various lactic acid cocci in a medium containing no meat extract (no meat extract) and a medium containing meat extract (with meat extract) under anaerobic culture conditions.
- the growth promoter of the present invention can be used for culturing lactic acid cocci.
- Lactococci to be targeted for growth promotion are not particularly limited, but examples include the genus Lactococcus, the genus Leuconostoc, the genus Pediococcus, the genus Streptococcus, and the like. of lactic acid bacteria.
- Lactococci of the genus Lactococcus include, for example, Lactococcus lactis , Lactococcus lactis subsp. lactis , Lactococcus garvieae , and Lactococcus lactis. Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp . cremoris , and the like, preferably Lactococcus lactis subspecies lactis.
- Lactococcus bacteria include, for example, Lactococcus lactis subspecies lactis JCM5805, Lactococcus lactis subspecies lactis NBRC12007, Lactococcus lactis subspecies lactis NRIC1150, Lactococcus lactis subspecies lactis JCM20101, Lactococcus lactis subspecies lactis JCM7638, Lactococcus lactis subspecies lactis ATCC11454, Lactococcus garviae NBRC100934, Lactococcus lactis subspecies cremoris JCM16167, Lactococcus lactis JCM16167 Subspecies cremoris NBRC100676, Lactococcus lactis subspecies Holdoniae JCM1180 and Lactococcus lactis subsp.
- Lactococcus lactis subspecies lactis JCM5805 Lactococcus lactis subspecies lactis NBRC12007
- Leuconostoc bacteria include, for example, Leuconostoc lactis.
- Specific examples of Leuconostoc bacteria include, for example, Leuconostoc lactis NBRC12455.
- Pediococcus bacteria include, for example, Pediococcus acidilactici , Pediococcus pentosaceus , Pediococcus cellicola , Pediococcus claussenii ), Pediococcus damnosus , Pediococcus ethanolidurans , Pediococcus inopinatus , Pediococcus parvulus , Pediococcus sti Lessy ( Pediococcus stilesii ) and the like.
- Specific examples of Pediococcus bacteria include Pediococcus acidilactici JCM8797, Pediococcus Damnosus JCM5886, and the like.
- Streptococcus bacteria examples include Streptococcus thermophilus.
- the JCM strain is from the RIKEN BioResource Center Microbial Material Development Office (3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture), and the NBRC strain is from the Independent Administrative Agency Product Evaluation Technology Platform
- the NRIC strain is from the Tokyo University of Agriculture, Strain Storage Room (1-1-1 Sakuragaoka, Setagaya-ku, Tokyo), the ATCC strain are available from the American type culture collection (USA), respectively.
- Lactococcus lactis subspecies lactis JCM5805 strain can be obtained from RIKEN/BioResource Center/Microbial Material Development Office as described above, but in the present invention, it is stored in places other than RIKEN/BioResource Center/Microbial Material Development Office.
- An institutionally archived identical strain of JCM5805 strain can be used. Specifically, the same strain of the JCM5805 strain was transferred to the National Institute of Technology and Evaluation, Biological Resources Division (2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture), Tokyo University of Agriculture, Strain Storage Room (Tokyo). 1-1-1 Sakuragaoka, Setagaya-ku) and the American Type Culture Collection (USA).
- the dicarboxylic acid which is the active ingredient of the growth-promoting agent of the present invention, is not particularly limited as long as it is a compound having two carboxy groups in its structure, but preferably an aliphatic dicarboxylic acid can be used.
- the hydrocarbon chains that make up the aliphatic dicarboxylic acid are preferably saturated hydrocarbon chains.
- the aliphatic dicarboxylic acid in the present invention is preferably an aliphatic dicarboxylic acid having 4 to 6 carbon atoms, more preferably an aliphatic dicarboxylic acid having 4 or 5 carbon atoms.
- aliphatic dicarboxylic acids having 4 to 6 carbon atoms include ketoglutaric acid ( ⁇ -ketoglutaric acid (hereinafter sometimes referred to as “ ⁇ KG”), ⁇ -ketoglutaric acid (acetonedicarboxylic acid)), apple acid, adipic acid, oxalic acid, succinic acid, maleic acid, glutaric acid, etc., preferably ⁇ -ketoglutaric acid and/or malic acid.
- the dicarboxylic acid may be in the form of salts, such as metal salts and ammonium salts.
- metal salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts.
- Ammonium salts include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
- dicarboxylic acid salts include sodium ⁇ -ketoglutarate and sodium malate.
- the proliferation-promoting agent of the present invention can contain either or both of a dicarboxylic acid and a salt thereof as an active ingredient.
- the lower limit (or more or more) of the concentration (solid content concentration) of the dicarboxylic acid and/or its salt in the medium is 0.01% by mass, 0.1% by mass, 0.25% by mass, and 0.5% by mass. and its upper limit (below or below) can be 8% by mass, 4% by mass, or 2% by mass. These lower and upper limits can be combined arbitrarily.
- the concentration range of the dicarboxylic acid and/or its salt in the medium is, for example, 0.01 to 8% by mass, 0.1 to 4% by mass, 0.25 to 4% by mass, 0.5 to 4% by mass. , 0.5 to 3 mass %, 0.5 to 2 mass %.
- the growth-promoting agent of the present invention promotes the growth of lactic acid cocci and efficiently cultures lactic acid cocci by setting the concentration of the dicarboxylic acid in the medium to the concentration range described above. be able to.
- the growth promoter of the present invention can be used by adding it to a medium for culturing lactic acid cocci.
- the medium that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a medium used for culturing lactic acid bacteria, and examples thereof include MRS medium (deMan, Rogosa, & Sharpe medium), M17 medium, LB medium, and the like.
- the growth-promoting agent of the present invention may be added to the medium during culturing of the lactic acid cocci, or may be added in advance before the culturing of the lactic acid cocci.
- the medium that can be used in the present invention can contain a meat extract as a supplementary nutritional ingredient. Livestock meat extracts include, for example, beef extract, pork extract, and chicken extract.
- the medium that can be used in the present invention preferably contains substantially no meat extract, and more preferably does not contain meat extract, from the viewpoints of environmental load, cost, food safety, and the like.
- substantially free of meat extract means that the content of meat extract is less than 0.8% by mass, less than 0.5% by mass, less than 0.3% by mass, or less than 0.1% by mass, for example. less than, less than 0.05% by mass, or less than 0.01% by mass.
- the properties of the meat extract to be used include liquid extract, powder, granules, and the like.
- the content of the meat extract in the medium is calculated by dividing the mass of the solid content, which is the extract pure content of the meat extract, by the mass of the medium and multiplying the result by 100.
- the medium containing no animal meat extract can be appropriately prepared without using any animal meat extract as a raw material for the medium exemplified above.
- the growth-promoting agent of the present invention can be used by adding it to a medium containing no meat extract.
- the conditions for culturing lactic acid cocci using the medium supplemented with the growth-promoting agent of the present invention are not particularly limited, and normal culturing conditions for lactic acid cocci can be applied.
- the culture period for lactic acid cocci can be 20 to 48 hours, preferably 20 to 30 hours from the viewpoint of the growth phase.
- the lower limit (above or above) of the culture temperature for lactic acid cocci can be 20°C, 25°C and 28°C, and the upper limit (below or below) can be 40°C, 35°C and 30°C. .
- These lower and upper limits can be arbitrarily combined, and the culture temperature range is, for example, 20 to 40°C, 20 to 35°C, 25 to 35°C, 30 to 35°C, most preferably about 30°C. can be
- the culture of lactococcus may be liquid culture or solid culture.
- Liquid culture can be performed using a fermenter in which the conditions can be controlled.
- Cultivation may be under either anaerobic or aerobic conditions.
- the stirring speed and the amount of aeration are appropriately selected according to the type of microbial cells and culture conditions.
- the pH of the medium used in the present invention may be in the range of 6.0 to 6.7 as long as it does not affect the growth of lactic acid cocci.
- the pH of the medium can be appropriately adjusted, for example, by adding a base such as sodium hydroxide or an acid such as phosphoric acid to the medium.
- a culture of lactic acid cocci is obtained by culturing lactic acid cocci in a medium supplemented with the growth promoting agent of the present invention.
- the obtained lactic acid coccus culture can be added to foods and drinks as it is or after processing such as concentration, dilution, drying, isolation and purification. That is, the growth-promoting agent of the present invention can be used to promote the growth of lactic acid bacteria for the purpose of application to food and drink. It can be used as an active ingredient.
- a medium for lactic acid bacteria containing dicarboxylic acid and/or its salt is provided.
- the culture medium for lactic acid bacteria of the present invention can be carried out according to the description regarding the growth promoter of the present invention.
- the medium for lactic acid cocci of the present invention is advantageous in that it promotes the growth of lactic acid cocci and enables efficient cultivation of lactic acid cocci.
- a method for culturing lactic acid cocci comprising the step of culturing lactic acid cocci in the medium of the present invention.
- the culture method of the present invention can be carried out according to the description regarding the growth-promoting agent of the present invention and the medium of the present invention.
- a method for promoting the growth of lactic acid cocci comprising adding a dicarboxylic acid and/or a salt thereof to a culture medium for lactic acid cocci.
- the proliferation-promoting method of the present invention can be carried out according to the description regarding the proliferation-promoting agent of the present invention.
- the use of a dicarboxylic acid and/or a salt thereof as an agent for promoting the growth of lactic acid cocci, for promoting the growth of lactic acid cocci, or in the method for promoting the growth of lactic acid cocci of the present invention is provided.
- the use of the present invention can be carried out according to the description of the proliferation-promoting agents and methods of the present invention.
- Example 1 Examination of growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid bacteria (1) In Example 1, the growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid bacteria was examined.
- Aerobic culture MRS medium was used as the medium.
- dicarboxylic acids ⁇ -ketoglutaric acid, disodium ⁇ -ketoglutarate, and malic acid were added to the medium at concentrations (0.5 to 2.0% by mass) shown in FIG.
- Sodium hydroxide was added to reach the same pH (pH 6.2 ⁇ 0.2).
- inoculation seeding was performed so that the concentration of the bacterial cells was 0.1% (v / v) with respect to 10 ml of the medium, and the inoculated medium was used in an automatic culture search device OT-201 (Oriental Instruments Co., Ltd.). It may be referred to as a “bioplotter” in this specification) and cultured at 30° C. for 24 hours (stirring strength condition: Medium).
- Bacterial count measurement The bacterial count was measured by measuring the OD600 (turbidity) of the medium using an absorbance meter (Biochrom GeneQuant1300).
- lactic acid cocci was significant in a concentration-dependent manner in the medium supplemented with ⁇ KG (Fig. 2A) and malic acid (Fig. 2B) compared to the control (dicarboxylic acid-free medium). It was confirmed that Similarly, it was confirmed that the addition of either a dicarboxylic acid or a salt thereof to a medium containing no meat extract promoted the growth of lactic acid cocci.
- Example 2 Examination of growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid bacteria (2)
- a medium different from the medium used in Example 1 was used to examine the growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid cocci.
- M17 medium (Difco M17 Broth, BD, the composition is shown in Table 2, the same applies hereinafter) to which 20 g / L of glucose was added (herein Sometimes referred to as "GM17 medium") was used.
- GM17 medium 20 g / L of glucose was added
- ⁇ -Ketoglutaric acid and malic acid as dicarboxylic acids were added to the medium at concentrations (0.5 to 2% by mass) shown in FIG. was added (pH 6.5 ⁇ 0.2).
- inoculate seed
- FALCON 15 ml conical tube
- concentration of the cells 0.1% (v / v) with respect to 10 ml of the prepared medium
- place in an incubator Tokyo Rikakikaisha ) at 30° C. for 24 hours (static culture).
- Aerobic Culture A GM17 medium was used. ⁇ -Ketoglutaric acid and malic acid as dicarboxylic acids were added to the medium at concentrations (0.5 to 2% by mass) shown in FIG. was added (pH 6.5 ⁇ 0.2). Next, inoculation (seeding) was performed so that the concentration of the bacterial cells was 0.1% (v / v) with respect to 10 ml of the prepared medium, and the inoculated medium was used with an automatic culture search device OT-201 (Oriental Instruments). Co., Ltd., sometimes referred to as “bioplotter” in this specification) and cultured at 30° C. for 24 hours (stirring strength condition: Medium).
- Example 3 Examination of growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid bacteria (3) In Example 3, the growth-promoting effect of ⁇ -ketoglutaric acid on various lactic acid cocci was examined.
- Example 4 Examination of growth-promoting effect of lactobacillus by dicarboxylic acid (4) In Example 4, the growth-promoting effect of ⁇ -ketoglutaric acid on lactobacilli belonging to the genus Lactobacillus was examined.
- Example 5 Examination of growth-promoting effect of tricarboxylic acid on lactic acid cocci
- Example 5 the growth-promoting effect of tricarboxylic acid on lactic acid coccus was investigated.
- Example 6 Examination of growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid bacteria (4) In Example 6, the growth-promoting effect of dicarboxylic acids on lactococcus of the genus Pediococcus was examined.
- FIG. 8A (0.1 to 4% by mass) and FIG. 8C (1 to 4% by mass)
- FIG. 8B 0.1 to 2% by mass
- FIG. 8D concentration shown in FIG. 8D (1 to 2% by mass)
- Example 7 Examination of growth-promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid bacteria (5) In Example 7, the growth promoting effect of dicarboxylic acid on lactic acid cocci was examined in a medium containing no meat extract.
- the medium used was an MRS medium adjusted to the composition shown in Table 7 (adjusted to pH 6.2 by adding phosphoric acid).
- ⁇ -Ketoglutaric acid was added to the medium at a concentration of 2.0% by mass as a dicarboxylic acid, and sodium hydroxide was added so that the pH was the same as the control (dicarboxylic acid-free medium) (pH 6.2 ⁇ 0.2).
- Example 8 Examination of the effect of the meat extract in the medium on the growth of lactic acid cocci In Example 8, the effect of the meat extract in the medium on the growth of lactic acid cocci was examined.
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Abstract
本発明は、乳酸球菌の増殖促進剤の提供を目的とする。本発明によれば、ジカルボン酸またはその塩を有効成分として含んでなる乳酸球菌の増殖促進剤が提供される。ジカルボン酸は、好ましくは炭素数４～６個の脂肪族ジカルボン酸である。乳酸球菌は、好ましくはラクトコッカス属細菌である。本発明によれば、ジカルボン酸を培地に含有させることで乳酸球菌の増殖を促進することができるため、より簡便に乳酸球菌を培養することができる点で有利である。
Description
本願は、先行する日本国出願である特願２０２１－７５８８２（出願日：２０２１年４月２８日）および特願２０２１－１０１５００（出願日：２０２１年６月１８日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明は乳酸球菌の増殖促進剤に関する。本発明はまた、乳酸球菌用培地および乳酸球菌の培養方法ならびに乳酸球菌の増殖促進方法に関する。
乳酸球菌の培養では、一般的にＬＢ培地やＭＲＳ培地などが使用されている。しかしながら、培地の種類によっては、乳酸球菌の増殖が十分に得られない場合があった。これまでに乳酸球菌を効率的に培養する方法としては、特許文献１や特許文献２が知られていた。
本発明は、乳酸球菌の新規な増殖促進剤を提供することを目的とする。本発明はまた、新規な乳酸球菌用培地および乳酸球菌の新規な培養方法ならびに乳酸球菌の新規な増殖促進方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、乳酸球菌の培養において、培地中にジカルボン酸またはその塩を含有させることにより乳酸球菌の増殖が促進されることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ジカルボン酸および／またはその塩を有効成分として含んでなる、乳酸球菌の増殖促進剤。
［２］ジカルボン酸が炭素数４～６の脂肪族ジカルボン酸である、上記［１］に記載の増殖促進剤。
［３］ジカルボン酸および／またはその塩が、リンゴ酸、α－ケトグルタル酸およびそれらの塩からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１］または［２］に記載の増殖促進剤。
［４］乳酸球菌がラクトコッカス属細菌である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［５］乳酸球菌がラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［６］ジカルボン酸および／またはその塩を培地において０．０１～８質量％の濃度で使用する、上記［１］～［５］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［７］畜肉エキスを実質的に含まない培地に添加する、上記［１］～［６］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［８］ジカルボン酸および／またはその塩を含有する、乳酸球菌用培地。
［９］ジカルボン酸および／またはその塩を０．０１～８質量％の濃度で含有する、上記［８］に記載の培地。
［１０］畜肉エキスを実質的に含まない、上記［８］または［９］に記載の培地。
［１１］上記［８］～［１０］のいずれかに記載の培地で乳酸球菌を培養する工程を含む、乳酸球菌の培養方法。
［１２］乳酸球菌の培地にジカルボン酸および／またはその塩を添加する工程を含む、乳酸球菌の増殖促進方法。
［１３］乳酸球菌の増殖促進剤としての、ジカルボン酸および／またはその塩の使用。
［１］ジカルボン酸および／またはその塩を有効成分として含んでなる、乳酸球菌の増殖促進剤。
［２］ジカルボン酸が炭素数４～６の脂肪族ジカルボン酸である、上記［１］に記載の増殖促進剤。
［３］ジカルボン酸および／またはその塩が、リンゴ酸、α－ケトグルタル酸およびそれらの塩からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１］または［２］に記載の増殖促進剤。
［４］乳酸球菌がラクトコッカス属細菌である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［５］乳酸球菌がラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［６］ジカルボン酸および／またはその塩を培地において０．０１～８質量％の濃度で使用する、上記［１］～［５］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［７］畜肉エキスを実質的に含まない培地に添加する、上記［１］～［６］のいずれかに記載の増殖促進剤。
［８］ジカルボン酸および／またはその塩を含有する、乳酸球菌用培地。
［９］ジカルボン酸および／またはその塩を０．０１～８質量％の濃度で含有する、上記［８］に記載の培地。
［１０］畜肉エキスを実質的に含まない、上記［８］または［９］に記載の培地。
［１１］上記［８］～［１０］のいずれかに記載の培地で乳酸球菌を培養する工程を含む、乳酸球菌の培養方法。
［１２］乳酸球菌の培地にジカルボン酸および／またはその塩を添加する工程を含む、乳酸球菌の増殖促進方法。
［１３］乳酸球菌の増殖促進剤としての、ジカルボン酸および／またはその塩の使用。
本発明によれば、ジカルボン酸またはその塩を培地に含有させて乳酸球菌を培養することで乳酸球菌の増殖を促進することができるため、簡便かつ効率的に乳酸球菌を培養することができる点で有利である。本発明によればまた、畜肉エキスを含まない培地においても、ジカルボン酸またはその塩を含有させることで乳酸球菌の増殖を促進することができる点でも有利である。
本発明の増殖促進剤は乳酸球菌の培養に用いることができる。増殖促進の対象となる乳酸球菌は、特に限定されるものではないが、例えば、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ぺディオコッカス（Pediococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属などの乳酸球菌が挙げられる。
ラクトコッカス属の乳酸球菌としては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ガルビエアエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ（Lactococcus lactis subsp. cremoris）などが挙げられ、好ましくはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスである。
ラクトコッカス属細菌の具体例としては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスJCM5805、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスNBRC12007、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスNRIC1150、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスJCM20101、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスJCM7638、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスATCC11454、ラクトコッカス・ガルビエアエNBRC100934、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスJCM16167、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエJCM1180およびラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエJCM11040などが挙げられ、好ましくはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスJCM5805である。
ロイコノストック属細菌としては、例えば、ロイコノストック・ラクティスなどが挙げられる。ロイコノストック属細菌の具体例としては、例えば、ロイコノストック・ラクティスNBRC12455などが挙げられる。
ペディオコッカス属細菌としては、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ペディオコッカス・セリコーラ（Pediococcus cellicola）、ペディオコッカス・クラウッセニー（Pediococcus claussenii）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、ペディオコッカス・エタノーリデュランス（Pediococcus ethanolidurans）、ペディオコッカス・イノピナタス（Pediococcus inopinatus）、ペディオコッカス・パルヴルス（Pediococcus parvulus）、ペディオコッカス・スティレッシー（Pediococcus stilesii）などが挙げられる。ペディオコッカス属細菌の具体例としては、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシJCM8797、ペディオコッカス・ダムノサスJCM5886などが挙げられる。
ストレプトコッカス属細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラスなどが挙げられる。
上記の乳酸球菌株のうち、JCM菌株は、理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室（茨城県つくば市高野台３丁目１番地の１）から、NBRC菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）から、NRIC菌株は、東京農業大学・菌株保存室（東京都世田谷区桜丘１丁目１番１号）から、ATCC菌株は、American type culture collection（米国）から、それぞれ入手することができる。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティスJCM5805菌株は上記の通り理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室から入手することができるが、本発明では理化学研究所・バイオリソースセンター・微生物材料開発室以外の保存機関に保存された、JCM5805菌株の同一菌株を使用することができる。具体的には、JCM5805菌株の同一菌株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）、東京農業大学・菌株保存室（東京都世田谷区桜丘１丁目１番１号）およびAmerican type culture collection（米国）等から入手することができる。
本発明の増殖促進剤の有効成分であるジカルボン酸は、カルボキシ基をその構造中に２個有する化合物であれば特に限定されるものではないが、好ましくは脂肪族ジカルボン酸を用いることができる。脂肪族ジカルボン酸を構成する炭化水素鎖は好ましくは飽和炭化水素鎖である。脂肪族ジカルボン酸はその炭化水素鎖の炭素原子上に、オキソ基（＝Ｏ）および／または水酸基（－ＯＨ）をさらに有していてもよい。本発明において脂肪族ジカルボン酸は、好ましくは炭素数４～６個の脂肪族ジカルボン酸、より好ましくは炭素数４または５の脂肪族ジカルボン酸である。炭素数４～６個の脂肪族ジカルボン酸としては、例えば、ケトグルタル酸（α－ケトグルタル酸（本明細書中、「αＫＧ」ということがある）、β－ケトグルタル酸（アセトンジカルボン酸））、リンゴ酸、アジピン酸、シュウ酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸などが挙げられ、好ましくはα－ケトグルタル酸およびリンゴ酸のいずれかまたは両方である。
本発明においてジカルボン酸は塩の形態であってもよく、例えば、金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩が挙げられる。アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。ジカルボン酸の塩としては、例えば、α－ケトグルタル酸ナトリウム塩、リンゴ酸ナトリウム塩などが挙げられる。なお、本発明の増殖促進剤はジカルボン酸およびその塩のいずれかまたは両方を有効成分とすることができる。
ジカルボン酸および／またはその塩の培地中の濃度（固形分濃度）の下限値（以上または超える）は、０．０１質量％、０．１質量％、０．２５質量％、０．５質量％とすることができ、その上限値（以下または下回る）は、８質量％、４質量％、２質量％とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができる。上記ジカルボン酸および／またはその塩の培地中の濃度の範囲は、例えば、０．０１～８質量％、０．１～４質量％、０．２５～４質量％、０．５～４質量％、０．５～３質量％、０．５～２質量％とすることができる。本発明の増殖促進剤は、ジカルボン酸の培地中の濃度を上記のような濃度範囲となるように設定して使用することで、乳酸球菌の増殖を促進し、効率的に乳酸球菌を培養することができる。
本発明の増殖促進剤は乳酸球菌を培養する培地に添加して使用することができる。本発明において使用できる培地は、乳酸球菌の培養に使用される培地であれば特に限定されず、例えば、ＭＲＳ培地（deMan, Rogosa, & Sharpe培地）、Ｍ１７培地、ＬＢ培地などが挙げられる。本発明の増殖促進剤を培地に添加する時期は、乳酸球菌の培養中であってもよく、乳酸球菌の培養前にあらかじめ添加しておいてもよい。本発明において使用できる培地は、補助栄養成分などとして、畜肉エキスを含有することができる。畜肉エキスとしては、例えば、ビーフエキス、ポークエキス、チキンエキスなどが挙げられる。一方で、本発明において使用できる培地は、環境負荷やコスト、食品安全性などの観点から、畜肉エキスを実質的に含まないものが好ましく、より好ましくは畜肉エキスを含まないものである。ここで、畜肉エキスを「実質的に含まない」とは、例えば、畜肉エキスの含有量が０．８質量％未満、０．５質量％未満、０．３質量％未満、０．１質量％未満、０．０５質量％未満または０．０１質量％未満である場合が挙げられる。ここで、使用する畜肉エキスの性状は、抽出液、パウダー、顆粒等が挙げられる。培地中の畜肉エキスの含有量は、畜肉エキスのエキス純分である固形分質量を培地の質量で除して、１００を乗じることで算出される。畜肉エキスを含まない培地は、上記に例示した培地の原料に畜肉エキスを使用せずに適宜調製することができる。本発明の増殖促進剤は畜肉エキスを含まない培地に添加して使用することができる。
本発明の増殖促進剤を添加した培地を用いた乳酸球菌の培養条件は特に限定されず、通常の乳酸球菌の培養条件を適用することができる。
乳酸球菌の培養期間は、２０～４８時間とすることができ、増殖期の観点から好ましくは２０～３０時間である。
乳酸球菌の培養温度の下限値（以上または超える）は２０℃、２５℃、２８℃とすることができ、その上限値（以下または下回る）は４０℃、３５℃、３０℃とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、培養温度の範囲は、例えば、２０～４０℃、２０～３５℃、２５～３５℃、３０～３５℃、最も好ましくは約３０℃とすることができる。
乳酸球菌の培養は、液体培養であっても固体培養であってもよい。液体培養は、条件制御可能な発酵槽を用いて行うことができ、例えば攪拌培養、通気培養、振とう培養、静置培養などを挙げることができる。培養は、嫌気的条件あるいは好気的条件のいずれであってもよい。攪拌速度や通気量は、微生物菌体の種類や培養条件に応じて適宜選択される。
本発明に用いる培地のｐＨは、乳酸球菌の増殖に影響を及ぼすものでなければよく、例えば、６．０～６．７の範囲とすることができる。培地のｐＨは適宜調整することができ、例えば、水酸化ナトリウムなどの塩基やリン酸などの酸を培地に添加し調整することができる。
本発明の増殖促進剤を添加した培地で乳酸球菌を培養することにより、乳酸球菌の培養物が得られる。得られた乳酸球菌培養物は、そのまま、あるいは、濃縮、希釈、乾燥、単離、精製などの処理後に、飲食品などに配合することができる。すなわち、本発明の増殖促進剤は飲食品への適用を目的とした乳酸球菌の増殖促進に用いることができ、この観点から本発明においては、食品として許容されるジカルボン酸および／またはその塩を有効成分として使用することができる。
本発明の別の側面によれば、ジカルボン酸および／またはその塩を含有する乳酸球菌用培地が提供される。本発明の乳酸球菌用培地は、本発明の増殖促進剤に関する記載に従って実施することができる。本発明の乳酸球菌用培地によれば、乳酸球菌の増殖が促進されるため効率的に乳酸球菌を培養できる点で有利である。
本発明の別の側面によればまた、本発明の培地で乳酸球菌を培養する工程を含む、乳酸球菌の培養方法が提供される。本発明の培養方法は、本発明の増殖促進剤および本発明の培地に関する記載に従って実施することができる。
本発明の別の側面によればさらに、乳酸球菌の培地にジカルボン酸および／またはその塩を添加する工程を含む、乳酸球菌の増殖促進方法が提供される。本発明の増殖促進方法は、本発明の増殖促進剤に関する記載に従って実施することができる。
本発明の別の側面によれば、乳酸球菌の増殖促進剤としての、乳酸球菌の増殖促進のための、または本発明の乳酸球菌の増殖促進方法における、ジカルボン酸および／もしくはその塩の使用が提供される。本発明の使用は、本発明の増殖促進剤および方法に関する記載に従って実施することができる。
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果の検討（１）
例１では、ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
例１では、ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
乳酸球菌にはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス JCM5805菌株（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた。
ア 菌体
乳酸球菌にはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス JCM5805菌株（Lactococcus lactis subsp. lactis）を用いた。
イ 培養方法
（ｉ）嫌気的培養
培地はＭＲＳ培地（MRS BROTH、CODE:CM0359、Oxoid社、組成は表１に示す、本明細書の例３～６において同じ）を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸（富士フィルム和光純薬社）、α－ケトグルタル酸二ナトリウム（本明細書中、「αＫＧ２Ｎａ」ということがある）（富士フィルム和光純薬社）およびリンゴ酸（東京化成工業社）を図１に示す濃度（０．０１～４．０質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．２±０．２）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
（ｉ）嫌気的培養
培地はＭＲＳ培地（MRS BROTH、CODE:CM0359、Oxoid社、組成は表１に示す、本明細書の例３～６において同じ）を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸（富士フィルム和光純薬社）、α－ケトグルタル酸二ナトリウム（本明細書中、「αＫＧ２Ｎａ」ということがある）（富士フィルム和光純薬社）およびリンゴ酸（東京化成工業社）を図１に示す濃度（０．０１～４．０質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．２±０．２）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
（ｉｉ）好気的培養
培地はＭＲＳ培地を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸、α－ケトグルタル酸二ナトリウムおよびリンゴ酸を図２に示す濃度（０．５～２．０質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．２±０．２）。次に、菌体の濃度が培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、植菌した培地を自動培養探索装置ＯＴ－２０１（オリエンタルインスツルメンツ社、本明細書中「バイオプロッター」ということがある）に供し、３０℃で２４時間培養した（攪拌強度条件：Medium）。
培地はＭＲＳ培地を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸、α－ケトグルタル酸二ナトリウムおよびリンゴ酸を図２に示す濃度（０．５～２．０質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．２±０．２）。次に、菌体の濃度が培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、植菌した培地を自動培養探索装置ＯＴ－２０１（オリエンタルインスツルメンツ社、本明細書中「バイオプロッター」ということがある）に供し、３０℃で２４時間培養した（攪拌強度条件：Medium）。
ウ 菌数の測定
菌数の測定は吸光度計（Biochrom GeneQuant1300）を用いて培地のOD600（濁度）を測定することにより行った。
菌数の測定は吸光度計（Biochrom GeneQuant1300）を用いて培地のOD600（濁度）を測定することにより行った。
エ 統計解析
測定値は平均値±標準誤差で表した。一元配置分散分析を行った後にＴｕｋｅｙ検定を行い、対照群に対してｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
測定値は平均値±標準誤差で表した。一元配置分散分析を行った後にＴｕｋｅｙ検定を行い、対照群に対してｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
（２）結果
結果は、図１および図２に示す通りであった。嫌気的培養では、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図１Ａ）およびリンゴ酸（図１Ｃ）を添加した培地において、濃度依存的に乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。また、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ２Ｎａ（図１Ｂ）を添加した培地では、０．１～４質量％の場合に濃度依存的に乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認され、０．０１質量％の場合も乳酸球菌の増殖が促進される傾向にあった。同様に、好気的培養においても、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図２Ａ）およびリンゴ酸（図２Ｂ）を添加した培地において、濃度依存的に乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。同様に、畜肉エキスを含まない培地にジカルボン酸およびその塩のいずれを添加した場合にも乳酸球菌の増殖が促進されることが確認された。
結果は、図１および図２に示す通りであった。嫌気的培養では、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図１Ａ）およびリンゴ酸（図１Ｃ）を添加した培地において、濃度依存的に乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。また、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ２Ｎａ（図１Ｂ）を添加した培地では、０．１～４質量％の場合に濃度依存的に乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認され、０．０１質量％の場合も乳酸球菌の増殖が促進される傾向にあった。同様に、好気的培養においても、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図２Ａ）およびリンゴ酸（図２Ｂ）を添加した培地において、濃度依存的に乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。同様に、畜肉エキスを含まない培地にジカルボン酸およびその塩のいずれを添加した場合にも乳酸球菌の増殖が促進されることが確認された。
例２：ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果の検討（２）
例２では、例１で用いた培地とは異なる培地を用いてジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
例２では、例１で用いた培地とは異なる培地を用いてジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
例１（１）アに記載の乳酸球菌を用いた。
ア 菌体
例１（１）アに記載の乳酸球菌を用いた。
イ 培養方法
（ｉ）嫌気的培養
培地はＭ１７培地（Difco M17 Broth、BD社、組成は表２に示す、本明細書において以下同じ）に２０ｇ／Ｌのグルコースを添加した培地（本明細書中「ＧＭ１７培地」ということがある）を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸およびリンゴ酸を図３に示す濃度（０．５～２質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．５±０．２）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
（ｉ）嫌気的培養
培地はＭ１７培地（Difco M17 Broth、BD社、組成は表２に示す、本明細書において以下同じ）に２０ｇ／Ｌのグルコースを添加した培地（本明細書中「ＧＭ１７培地」ということがある）を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸およびリンゴ酸を図３に示す濃度（０．５～２質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．５±０．２）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
（ｉｉ）好気的培養
培地はＧＭ１７培地を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸およびリンゴ酸を図４に示す濃度（０．５～２質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．５±０．２）。次に、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、植菌した培地を自動培養探索装置ＯＴ－２０１（オリエンタルインスツルメンツ社、本明細書中「バイオプロッター」ということがある）に供し、３０℃で２４時間培養した（攪拌強度条件：Medium）。
培地はＧＭ１７培地を使用した。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸およびリンゴ酸を図４に示す濃度（０．５～２質量％）で培地にそれぞれ添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．５±０．２）。次に、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、植菌した培地を自動培養探索装置ＯＴ－２０１（オリエンタルインスツルメンツ社、本明細書中「バイオプロッター」ということがある）に供し、３０℃で２４時間培養した（攪拌強度条件：Medium）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
例１（１）エの記載と同様にして行った。
例１（１）エの記載と同様にして行った。
（２）結果
結果は、図３および図４に示す通りであった。嫌気的培養では、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図３Ａ）およびリンゴ酸（図３Ｂ）を添加した培地において、乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。同様に、好気的培養においても、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図４Ａ）およびリンゴ酸（図４Ｂ）を添加した培地において、濃度依存的に乳酸球菌の増殖が促進されることが確認された。例１および例２の結果から、培地の種類によらずジカルボン酸により乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。
結果は、図３および図４に示す通りであった。嫌気的培養では、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図３Ａ）およびリンゴ酸（図３Ｂ）を添加した培地において、乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。同様に、好気的培養においても、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図４Ａ）およびリンゴ酸（図４Ｂ）を添加した培地において、濃度依存的に乳酸球菌の増殖が促進されることが確認された。例１および例２の結果から、培地の種類によらずジカルボン酸により乳酸球菌の増殖が有意に促進されることが確認された。
例３：ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果の検討（３）
例３では、α－ケトグルタル酸による各種乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
例３では、α－ケトグルタル酸による各種乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
菌体には表１に記載の乳酸球菌を用いた。
ア 菌体
菌体には表１に記載の乳酸球菌を用いた。
イ 培養方法
ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸を２．０質量％の濃度で培地に添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸を２．０質量％の濃度で培地に添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
測定値は平均値±標準誤差で表した。Ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定を行い、対照群に対してｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
測定値は平均値±標準誤差で表した。Ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ検定を行い、対照群に対してｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
（２）結果
結果は、図５に示す通りであった。ラクトコッカス・ガルビエアエ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスおよびロイコノストック・ラクティスの乳酸球菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、菌株によらずジカルボン酸により増殖が有意に促進されることが確認された。
結果は、図５に示す通りであった。ラクトコッカス・ガルビエアエ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスおよびロイコノストック・ラクティスの乳酸球菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、菌株によらずジカルボン酸により増殖が有意に促進されることが確認された。
例４：ジカルボン酸による乳酸桿菌の増殖促進効果の検討（４）
例４では、α－ケトグルタル酸によるラクトバチルス属の乳酸桿菌の増殖促進効果について検討した。
例４では、α－ケトグルタル酸によるラクトバチルス属の乳酸桿菌の増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
菌体には表２に記載のラクトバチルス属の乳酸桿菌を用いた。
ア 菌体
菌体には表２に記載のラクトバチルス属の乳酸桿菌を用いた。
イ 培養方法
ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸を図６に示す濃度（０．５～２質量％）で培地にそれぞれ添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸を図６に示す濃度（０．５～２質量％）で培地にそれぞれ添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
例１（１）エの記載と同様にして行った。
例１（１）エの記載と同様にして行った。
（２）結果
結果は、図６に示す通りであった。ラクトバチルス属の乳酸桿菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、ジカルボン酸による増殖促進は認められなかった。
結果は、図６に示す通りであった。ラクトバチルス属の乳酸桿菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、ジカルボン酸による増殖促進は認められなかった。
例５：トリカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果の検討
例５では、トリカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
例５では、トリカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
例１（１）アに記載の乳酸球菌と同様のものを用いた。
ア 菌体
例１（１）アに記載の乳酸球菌と同様のものを用いた。
イ 培養方法
培地にジカルボン酸の代わりにトリカルボン酸としてクエン酸（富士フィルム和光純薬社）を図７に示す濃度（０．２５～１質量％）で培地にそれぞれ添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
培地にジカルボン酸の代わりにトリカルボン酸としてクエン酸（富士フィルム和光純薬社）を図７に示す濃度（０．２５～１質量％）で培地にそれぞれ添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
例１（１）エの記載と同様にして行った。
例１（１）エの記載と同様にして行った。
（２）結果
結果は、図７に示す通りであった。乳酸球菌は、対照（クエン酸無添加培地）に対して、クエン酸により増殖が有意に促進することが確認されたが、増殖促進の効果の程度はジカルボン酸の方が大きかった。
結果は、図７に示す通りであった。乳酸球菌は、対照（クエン酸無添加培地）に対して、クエン酸により増殖が有意に促進することが確認されたが、増殖促進の効果の程度はジカルボン酸の方が大きかった。
例６：ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果の検討（４）
例６では、ジカルボン酸によるペディオコッカス属の乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
例６では、ジカルボン酸によるペディオコッカス属の乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
菌体には表５に記載のペディオコッカス属の乳酸球菌を用いた。
ア 菌体
菌体には表５に記載のペディオコッカス属の乳酸球菌を用いた。
イ 培養方法
ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸（図８Ａ（０．１～４質量％）および図８Ｃ（１～４質量％）に示す濃度）およびリンゴ酸（図８Ｂ（０．１～２質量％）および図８Ｄ（１～２質量％）に示す濃度）で培地にそれぞれ添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸（図８Ａ（０．１～４質量％）および図８Ｃ（１～４質量％）に示す濃度）およびリンゴ酸（図８Ｂ（０．１～２質量％）および図８Ｄ（１～２質量％）に示す濃度）で培地にそれぞれ添加したこと以外は例１（１）イ（ｉ）の記載と同様にして行った（嫌気的培養）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
例１（１）エの記載と同様にして行った。
例１（１）エの記載と同様にして行った。
（２）結果
結果は、図８に示す通りであった。ペディオコッカス属の乳酸球菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図８ＡおよびＣ）およびリンゴ酸（図８ＢおよびＤ）を添加した培地において、濃度依存的に有意に増殖が促進されることが確認された。
結果は、図８に示す通りであった。ペディオコッカス属の乳酸球菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、αＫＧ（図８ＡおよびＣ）およびリンゴ酸（図８ＢおよびＤ）を添加した培地において、濃度依存的に有意に増殖が促進されることが確認された。
例７：ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果の検討（５）
例７では、畜肉エキスを含まない培地において、ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
例７では、畜肉エキスを含まない培地において、ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果について検討した。
（１）方法
ア 菌体
菌体には表６に記載の乳酸球菌を用いた。
ア 菌体
菌体には表６に記載の乳酸球菌を用いた。
イ 培養方法
培地は表７に示す組成にて調整したＭＲＳ培地を使用した（リン酸を添加してｐＨ６．２に調整した）。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸を２．０質量％の濃度で培地に添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．２±０．２）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
培地は表７に示す組成にて調整したＭＲＳ培地を使用した（リン酸を添加してｐＨ６．２に調整した）。ジカルボン酸としてα－ケトグルタル酸を２．０質量％の濃度で培地に添加し、対照（ジカルボン酸無添加培地）と同じｐＨになるように水酸化ナトリウムを添加した（ｐＨ６．２±０．２）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
例１（１）エの記載と同様にして行った。
例１（１）エの記載と同様にして行った。
（２）結果
結果は、図９に示す通りであった。畜肉エキスを含まない培地においても、ジカルボン酸の添加によりラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトコッカス・ガルビエアエ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエおよびロイコノストック・ラクティスの乳酸球菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、増殖が有意に促進されることが確認された。
結果は、図９に示す通りであった。畜肉エキスを含まない培地においても、ジカルボン酸の添加によりラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトコッカス・ガルビエアエ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエおよびロイコノストック・ラクティスの乳酸球菌は、対照（ジカルボン酸無添加培地）に対して、増殖が有意に促進されることが確認された。
例８：培地中の畜肉エキスが乳酸球菌の増殖に与える影響の検討
例８では、培地中の畜肉エキスが乳酸球菌の増殖に与える影響について検討した。
例８では、培地中の畜肉エキスが乳酸球菌の増殖に与える影響について検討した。
（１）方法
ア 菌体
菌体には表８に記載の乳酸球菌を用いた。
ア 菌体
菌体には表８に記載の乳酸球菌を用いた。
イ 培養方法
畜肉エキスを含まない培地は、表７に示す組成にて調整したＭＲＳ培地を使用した（初期ｐＨが７．０程度であったためリン酸を添加してｐＨ６．２に調整した）。畜肉エキスを含む培地は、表９に示す組成にて調製したＭＲＳ培地を使用した（リン酸を添加してｐＨ６．２に調整した）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
畜肉エキスを含まない培地は、表７に示す組成にて調整したＭＲＳ培地を使用した（初期ｐＨが７．０程度であったためリン酸を添加してｐＨ６．２に調整した）。畜肉エキスを含む培地は、表９に示す組成にて調製したＭＲＳ培地を使用した（リン酸を添加してｐＨ６．２に調整した）。次に、１５ｍｌコニカルチューブ（FALCON）中で、菌体の濃度が調製した培地１０ｍｌに対して０．１％（ｖ／ｖ）となるように植菌（播種）し、インキュベーター（東京理化器械社）において３０℃で２４時間培養した（静置培養）。
ウ 菌数の測定
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
例１（１）ウの記載と同様にして行った。
エ 統計解析
例１（１）エの記載と同様にして行った。
例１（１）エの記載と同様にして行った。
（２）結果
結果は、図１０に示す通りであった。畜肉エキスの有無のみが異なる培地を用いて乳酸球菌の増殖に与える影響を検討した結果、乳酸球菌の増殖は、畜肉エキスを含まない培地よりも畜肉エキスを含む培地の方が有意に高いことが確認された。また、例７と例８の結果から、畜肉エキスを含まない培地にジカルボン酸を添加した培地の方が、畜肉エキスを含む培地（ジカルボン酸の添加なし）よりもＯＤ６００値が高く、ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果が高いことが確認された（図９および１０）。
結果は、図１０に示す通りであった。畜肉エキスの有無のみが異なる培地を用いて乳酸球菌の増殖に与える影響を検討した結果、乳酸球菌の増殖は、畜肉エキスを含まない培地よりも畜肉エキスを含む培地の方が有意に高いことが確認された。また、例７と例８の結果から、畜肉エキスを含まない培地にジカルボン酸を添加した培地の方が、畜肉エキスを含む培地（ジカルボン酸の添加なし）よりもＯＤ６００値が高く、ジカルボン酸による乳酸球菌に対する増殖促進効果が高いことが確認された（図９および１０）。
Claims (13)
- ジカルボン酸および／またはその塩を有効成分として含んでなる、乳酸球菌の増殖促進剤。
- ジカルボン酸が炭素数４～６の脂肪族ジカルボン酸である、請求項１に記載の増殖促進剤。
- ジカルボン酸および／またはその塩が、リンゴ酸、α－ケトグルタル酸およびそれらの塩からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１または２に記載の増殖促進剤。
- 乳酸球菌がラクトコッカス属細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
- 乳酸球菌がラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５である、請求項１～４のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
- ジカルボン酸および／またはその塩を培地において０．０１～８質量％の濃度で使用する、請求項１～５のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
- 畜肉エキスを実質的に含まない培地に添加する、請求項１～６のいずれか一項に記載の増殖促進剤。
- ジカルボン酸および／またはその塩を含有する、乳酸球菌用培地。
- ジカルボン酸および／またはその塩を０．０１～８質量％の濃度で含有する、請求項８に記載の培地。
- 畜肉エキスを実質的に含まない、請求項８または９に記載の培地。
- 請求項８～１０のいずれか一項に記載の培地で乳酸球菌を培養する工程を含む、乳酸球菌の培養方法。
- 乳酸球菌の培地にジカルボン酸および／またはその塩を添加する工程を含む、乳酸球菌の増殖促進方法。
- 乳酸球菌の増殖促進剤としての、ジカルボン酸および／またはその塩の使用。
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| POOLMAN BERT, MOLENAAR DOUWE, SMID EDDY J, UBBINK TREES, ABEE TJAKKO, RENAULT PIERRE P, KONINGS WIL N: "Microbiology Malolactic Fermentation: Electrogenic Malate Uptake and Malate/Lactate Antiport Generate Metabolic Energy", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 173, 1 October 1991 (1991-10-01), pages 6030 - 6037, XP055982593 * |
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