WO2022201007A1 - Biosensor para la detección óptica de la infección por el virus del papiloma humano en fluidos biológicos - Google Patents

Biosensor para la detección óptica de la infección por el virus del papiloma humano en fluidos biológicos Download PDF

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Definitions

  • FIG. 1 Schematic illustration of the biosensor with dedrimers. Each dendrimer binds at the amino end to a reporter probe and at the arms to another reporter probe coupled to a nanoparticle.
  • dendrimers have a polyvalent surface, which can be modified by a variety of ligands and makes the formation of conjugates or complexes possible;
  • a "reporter probe” corresponds to a nucleotide sequence that hybridizes to specific regions of the molecular markers.
  • the reporter probes are coupled to one or more biotin-like molecules.
  • the reporter probes are coupled to a fluorescent dye, such as fluorescein-5-isothiocyanate (FITC).
  • FITC fluorescein-5-isothiocyanate
  • the reporter probes used correspond to molecular markers of the HPV-16 and HPV-18 genotypes.
  • the reporter probes comprise sequences that allow the L1, L2, E6 and E7 genes of the HPV-16 and HPV-18 genotypes to be detected.
  • the reporter probes comprise the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29 (Table 1 ).
  • the biosensor of the present invention may further comprise "nanospheres".
  • the nanospheres are selected from the group made up of gold, silver, silicon, iron/silicon and silver/albumin nanospheres, 150 nm to 500 nm in diameter, which are coupled with avidin-type proteins in their surface.

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Abstract

La presente invención hace referencia a un biosensor para la detección óptica de la infección por el virus del papiloma humano (VPH) en fluidos biológicos, el cual comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera, y una nanopartícula. Asimismo, la presente invención se encuentra dirigida a un método de detección in vitro de VPH en fluidos biológicos, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con un biosensor óptico. La presente invención permite realizar un diagnóstico rápido, reproducible y económico de marcadores asociados a la infección por VPH en diferentes tipos demuestras biológicas, lo que a su vez facilita el monitoreo de la infección a nivel poblacional.

Description

BIOSENSOR PARA LA DETECCIÓN ÓPTICA DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN FLUIDOS BIOLÓGICOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
El presente desarrollo está relacionado con el campo del diagnóstico clínico, particularmente con dispositivos que utilizan hibridación de ácidos nucleicos para detección de infecciones virales, y más particularmente con un biosensor para la detección óptica de la infección por el virus del papiloma humano en fluidos biológicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus del papiloma humano (VPH) es un patógeno capaz de infectar el epitelio cutáneo y mucoso de una manera específica de especie induciendo proliferación celular. Este virus ha sido reconocido como el agente etiológico para el desarrollo de varios tipos de cáncer tanto en hombres como en mujeres. A nivel mundial, la infección por VPH causa hasta el 4,5% (640.000 casos) de todos los casos nuevos de cáncer (8,6% mujeres; 0,9% hombres), lo que representa el 29,5% de todos los tumores relacionados con infecciones (Ervik M, Lam F, Ferlay J, Mery L, Soerjomataram I, Bray F. Cáncer Today. Lyon, France: International Agency for Research on Cáncer; 2016. http://gco.iarc.fr/today. Fecha de revisión: 17 de Agosto de 2017; Plummer M, de Martel C, Vignat J, Ferlay J, Bray F, Franceschi S. 2016. Lancet Glob Health , 4(9): e609-e616).
El cáncer cervical asociado a la infección por el VPH es la tercera causa principal de muerte por cáncer en mujeres, con más de 550.000 casos diagnosticados anualmente y un total de 288.000 muertes por año (Bernard E, Pons-Salort M, Favre M, Heard I, Delarocque-Astagneau E, Guillemot D, et al. 2013. BMC Infect Dis, 13:37-373). Adicionalmente, en las últimas décadas se ha observado un aumento en la incidencia de tumores de cabeza y cuello, orales y orofaríngeos relacionados con el VPH (Gillison ML, Chaturvedi AK, Anderson WF, Fakhry C. 2015. J Clin Oncol , 33(29): 3235-3242; Castellsagué X, Alemany L, Quer M, et al. 2016. J Nati Cáncer Inst, 108(6):djv403), siendo el carcinoma de células escamosas orofaríngeo (OPSCC, por sus siglas en inglés) y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC, por sus siglas en inglés) los más prevalentes, representando un importante problema de salud mundial, con más de 400.000 casos y más de 200.000 muertes al año (Miller DL, Puricelli MD, Stack MS. 2012. Biochem J , 443(2): 339-353). El VPH también se asocia causalmente con un porcentaje variable de cánceres de vulva, vagina y pene (International Agency for Research on Cáncer. 2011. http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vollOOB/rnonolOOB.pdf. Fecha de revisión: 17 de Agosto de 2017).
Actualmente, se estima 14 millones de nuevas infecciones genitales por VPH cada año, con 80% a 90% de hombres y mujeres sexualmente activos infectados en algún momento de su vida, de los cuales 40% a 45% están infectados con genotipos de alto riesgo (VPH-16 y VPH-18). De manera similar, se estima que 26 millones de personas tienen una infección oral activa por VPH, con 6,2 millones de nuevas infecciones cada año (Chesson HW, Dunne EF, Hariri S, Markowitz LE. 2014. Sex Transm Dis, 41(11): 660-664).
Debido a factores como la larga latencia clínica entre la infección y la oncogénesis (a menudo decenas de años) y la falta de tratamiento clínico para las infecciones persistentes por VPH que aún no han inducido cambios celulares anormales, la disponibilidad de tecnologías para el monitoreo de marcadores virales en fluidos biológicos, como hisopado cervical o un enjuague oral, facilita la detección temprana de la progresión maligna de la enfermedad y, por lo tanto, permite realizar el tratamiento adecuado y oportuno del paciente.
Dicha detección y tratamiento oportuno tienen una especial relevancia para países en vías de desarrollo, teniendo en cuenta que en los últimos años las tasas de mortalidad por cáncer de cuello uterino y los carcinomas orales han aumentado en los países de ingresos bajos y medianos, debido principalmente al acceso limitado a los servicios de salud y la baja cobertura de los programas de detección y tratamiento. Alrededor del mundo, el enfoque estándar para la detección del cáncer de cuello uterino es a través de la citología cervical o prueba de Papanicolau, la cual permite detectar lesiones precancerosas en etapa temprana. No obstante, esta técnica presenta algunas desventajas relacionadas con baja sensibilidad, dificultad para la interpretación de resultados (lo que genera altas tasas de falsos negativos y positivos), la incomodidad generada en el paciente, el tiempo de respuesta, y la necesidad de personal experimentado y capacitado (Nanda K, McCrory DC, Myers ER, Bastían LA, Hasselblad V, Hickey JD, etal. 2000. Ann Intern Med, 132(10): 810-819).
Actualmente, en conjunto con las pruebas citológicas, se realizan ensayos moleculares basados en amplificación de ácidos nucleicos para la detección de VPH. Por ejemplo, Singh y Dash describen el uso de quantum dots (Qdots) para el monitoreo temprano y diagnóstico de biomarcadores de cáncer, en particular de cáncer oral (Singh, D.K. & Dash, K.C. 2018. J BioSci. and Biotechnol , 7(1): 204-208). En este artículo, se menciona el ensamblaje de un gran número de Qdots de CdSe/ZnS en dendrímeros nanocristales (NC), los cuales amplifican en gran medida las señales electroquimioluminiscentes (ECL, por sus siglas en inglés). De acuerdo con este estudio, los Qdots conjugados con diferentes tipos de ligandos diana o fármacos o genes anti-cáncer tienen potencial para mejorar la eficiencia de las imágenes y liberación de fármacos para el tratamiento del cáncer a través de la unión selectiva a los receptores sobre-expresados en las células cancerosas y la superficie de los tejidos.
Yu-Hong y colaboradores desarrollaron un ensayo de detección de infecciones por VPH- 16 basado en hibridación con Qdots y nanopartículas superparamagnéticas, que difiere de la reacción convencional de hibridación en que ocurre en una solución homogénea y tiene un tiempo total para la detección de no más de una hora (Yu-Hong, W., Rui, C. & Ding, L.A. 2011. Nanoscale Res Lett, 6: 461). Los autores concluyen que el método de hibridación desarrollado es fácil y consume menos tiempo que la PCR tipo-específica para la detección cualitativa de VPH- 16 en muestras de fluido cervical, listando como una ventaja que el ensayo de hibridación descrito sólo requiere la extracción del ADN de las muestras y una incubación simple y separación magnética. La patente US7883903B2 menciona que existe una variedad de ensayos y formatos de ensayo, incluyendo formatos de inmunoensayo y arreglos que pueden emplear conjugados de sustrato quimioluminiscente dendrímero polimérico, todos los cuales involucran una señal quimioluminiscente visible para indicar la presencia o la concentración de una sustancia particular en una muestra. El analito buscado en la muestra puede ser una enzima, o puede ser una molécula reportera unida a una sonda, un antígeno o un anticuerpo o cualquier miembro de un par específico de unión, para detectar la presencia del otro miembro del par específico de unión.
Sin embargo, si bien estos ensayos permiten obtener resultados sensibles, selectivos y reproducibles, son costosos y de difícil acceso; lo cual prolonga el diagnóstico y la terapia adecuada. En este sentido, existe una importante necesidad no satisfecha de proporcionar diagnósticos rápidos, reproducibles y económicos que permitan detectar marcadores asociados a la infección por VPH en diferentes tipos de muestras biológicas, para un tamizaje y monitoreo efectivos a nivel poblacional en centros de atención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un biosensor para la detección óptica de VPH en muestras biológicas que comprende una superficie funcionalizada; un dendrímero; un espaciador; una sonda de captura; una sonda reportera; y una nanopartícula. La invención también se refiere a un método de detección in vitro de VPH en fluidos biológicos que comprende poner en contacto dicho fluido con el biosensor óptico.
En un aspecto de la invención, el biosensor permite detectar marcadores asociados a la infección por VPH a partir de diferentes fluidos biológicos que incluyen, entre otros, saliva y fluido cervical.
En otro aspecto de la invención, los marcadores asociados a la infección por VPH incluyen, sin limitarse a secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas Ll, L2, E6 y E7 de los genotipos VPH- 16 y VPH- 18. En otro aspecto de la invención, la señal detectable es una señal fluorescente que se genera cuando ocurre un evento de unión entre una secuencia de ADN presente en la muestra y una sonda de oligonucleótidos específica del biosensor.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Ilustración esquemática del biosensor con dedrímeros. Cada dendrímero se une por el extremo amino a una sonda reportera y por los brazos a otra sonda reportera acoplada a una nanopartícula.
FIG. 2 Ilustración esquemática del biosensor en donde las nanopartículas conjugadas con biotina, se unen a una proteína de tipo avidina presente en una nanoesfera del biosensor.
FIG. 3A Curvas de amplificación de los productos de PCR de la secuencia L1 de los genotipos virales VPH-16 y VPH-18. ;
FIG. 3B Curvas de fusión de los productos de PCR de la secuencia L1 de los genotipos virales VPH-16 y VPH-18.
FIG. 4A Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 16 en función de la energía libre de Gibbs.
FIG. 4B Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 18 en función de la energía libre de Gibbs.
FIG. 5A Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 16 en relación con el porcentaje de formamida.
FIG. 5B Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 18 en relación con el porcentaje de formamida. FIG. 6 Hibridación fluorescente in situ de las sondas de captura de la secuencia
L1 de VPH. Se observan los núcleos de las células azules con las señales rojas fluorescentes resultado de la hibridación de la sonda de captura con la secuencia L1 in vitro. A. VPH- 16; B. VPH- 18.
FIG. 7 Microscopía de fluorescencia - Detección de VPH- 16 con biosensor con esferas de silicio acopladas a estreptavidina y Qdots conjugados a biotina A. 1 copia viral; B. 10 copias virales; C. 100 copias virales; D. 1.000 copias virales; E. 10.000 copias virales; F. 100.000 copias virales.
FIG. 8 Microscopía de fluorescencia - Detección de VPH- 18 con biosensor con esferas de silicio acopladas a estreptavidina y Qdots conjugados a biotina. A. 1 copia viral; B. 10 copias virales; C. 100 copias virales; D. 1.000 copias virales; E. 10.000 copias virales; F. 100.000 copias virales.
FIG. 9 Porcentaje de hibridación de la sonda de detección en relación al número de copias virales de VPH- 16 en soporte funcionalizado con N-oxisuccinimida.
FIG. 10 Microscopía de fluorescencia - Detección de VPH con biosensor con dendrímeros 8 carboxilo, 1 amino. A. VPH-16, 1 copia viral; B. VPH-16 10 copias virales; C. VPH-18, 1 copia viral; D. VPH-18, 10 copias virales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Para propósitos de interpretar los términos usados a lo largo del presente documento se debe tener en cuenta su significado usual en el campo técnico, a menos que se incorpore una definición particular o el contexto indique claramente lo contrario. Adicionalmente, los términos utilizados en forma singular también incluirán la forma plural.
Biosensor Para efectos de la presente invención, el término “ biosensor ” hace referencia a un dispositivo que permite determinar la presencia o ausencia de biomoléculas en una muestra biológica mediante la cuantificación de una señal producida luego de la interacción entre dichas biomoléculas y un elemento de detección.
El biosensor de la presente invención comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera y una nanopartícula.
Para efectos de la presente invención, la “ superficie funcionalizada ” corresponde a un soporte sólido, el cual permite la inmovilización estructurada de sondas de ácidos nucleicos. Para acoplar los ácidos nucleicos en soportes planos, deben quedar grupos funcionales libres de las cadenas de ADN para una adecuada inmovilización.
Dichos soportes sólidos pueden estar conformados por materiales como vidrio, papel, silicio, nitrocelulosa, oro, plata, poliestireno y grafeno. En una modalidad de la invención el soporte sólido se selecciona entre vidrio y papel. En una modalidad particular, el soporte sólido es vidrio. El vidrio es un material muy utilizado para inmovilizar ácidos nucleicos principalmente debido a su baja autofluorescencia, rigidez, bajo costo, y resistencia a altas temperaturas.
Para realizar la inmovilización de los ácidos nucleicos en la superficie del soporte sólido, esta última es tratada con agentes químicos que le confieren una carga positiva. Este proceso, conocido como ‘ funcionalizaciórí permite la unión de las secuencias de ácidos nucleicos a la superficie por medio de interacciones electrostáticas o enlaces de tipo covalente. Los agentes químicos que permiten la funcionalización de la superficie del soporte sólido incluyen, pero no se limitan a: compuestos con grupos aminosilano, epoxi, carboxilato, éster y compuestos biotinilados. En una modalidad de la invención los agentes químicos se seleccionan del grupo que comprende poli-L-lisina, N-oxisuccinimida (NOS), epoxi-3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GOPS), sulfato éster, 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) y estreptavidina. En una modalidad particular, la superficie se funcionaliza con APTES. En el contexto de la presente invención, se entiende por “ dendrímeros ” macromoléculas tridimensionales de construcción arborescente con dimensiones a escala nanométrica.
Un dendrímero se compone de tres partes topológicas diferentes, a saber: (i) un núcleo focal, que imparte propiedades únicas al tamaño de la cavidad, la capacidad de absorción y las características de captura y liberación; (ii) bloques de construcción con varias capas interiores que tienen unidades repetidas; y (iii) múltiples grupos funcionales periféricos, los cuales afectan la solubilidad y la capacidad de quelación del dendrímero.
Los dendrímeros se caracterizan por las siguientes propiedades:
- Monodispersidad: estructura uniforme con un peso molecular definido;
- Polivalencia: la presencia de múltiples grupos funcionales hace que los dendrímeros tengan una superficie polivalente, la cual puede ser modificada mediante una variedad de ligandos y hace posible la formación de conjugados o complejos;
Autoensamblaje: se ha demostrado que debido a las anteriores propiedades, los dendrímeros se autoensamblan en vesículas y micelas;
Interacciones electrostáticas: la presencia de cargas en la superficie permite el autoensamblaje en agregados de diferentes formas debido a las interacciones electrostáticas con ácidos nucleicos;
- Estabilidad química y física: la arquitectura única de los dendrímeros les confiere estabilidad frente a estímulos químicos y físicos, y hace posible la formación de complejos estables.
En el contexto de la presente invención, los dendrímeros se seleccionan entre dendrímeros amino-funcionales, dendrímeros carboxi-funcionales, dendrímeros biotinilados, dendrímeros hidroxilados y dendrímeros pireno-funcionales. En una modalidad particular, los dendrímeros del biosensor se seleccionan del grupo conformado por dendrímeros amino-funcionales y carboxi-funcionales. En otra modalidad particular, los dendrímeros carboxi-funcionales son dendrímeros poliéster de ácido 2,2-bis(hidroximetil)propionico (bis-MPA). En una modalidad particular adicional, el dendrímero de bis-MPA tiene 8, 16 o 32 grupos carboxilo y un grupo amino en la superficie. En una modalidad particular adicional, el dendrímero de bis-MPA tiene 8 grupos carboxilo y un grupo amino en la superficie.
Los dendrímeros del biosensor de la presente invención permiten amplificar los eventos de hibridación de las secuencias específicas de ácidos nucleicos, lo que a su vez permite amplificar la señal óptica producida por la hibridación de secuencias. Los dendrímeros pueden unirse a una sonda reportera y a moléculas de tipo biotina. En una modalidad de la invención, un dendrímero se une a la superficie funcionalizada por un extremo y a la sonda de captura por los brazos, amplificando de esta manera los eventos de hibridación. En otra modalidad, un dendrímero se une por el extremo amino a una sonda reportera y por los brazos a otra sonda reportera acoplada a una nanopartícula, facilitando de esta manera la amplificación de la señal fluorescente. Esta configuración se observa de manera esquemática en la Figura 1.
En el contexto de la presente invención, un “ espaciador ” es una molécula que se une coval entem ente a las sondas de captura en su extremo 3’ o 5’, y que sirve como puente de unión entre dichas sondas de captura y el soporte sólido. En una modalidad particular de la invención, los espaciadores se seleccionan del grupo que comprende moléculas NH2-C6.12; trietilenglicol (TEG) y hexaetilenglicol (HEG).
En la presente invención, las “ sondas de captura ” corresponden a secuencias de nucleótidos que se unen por hibridación a regiones específicas de los genes empleados como marcadores moleculares. En una modalidad particular de la invención, las sondas de captura empleadas corresponden a marcadores moleculares de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad adicional, las sondas de captura comprenden secuencias que permiten detectar los genes Ll, L2, E6 y E7 de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad aún más particular de la presente invención, las sondas de captura comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 (Tabla 1). De acuerdo con la presente invención, una “ sonda reportera ” corresponde a una secuencia de nucleótidos que se une por hibridación a regiones específicas de los marcadores moleculares. En algunas modalidades de la invención, las sondas reporteras están acopladas a una o más moléculas de tipo biotina. En otra modalidad de la invención, las sondas reporteras están acopladas a un colorante fluorescente, tal como la fluoresceína-5-isotiocianato (FITC). En una modalidad de la invención, las sondas reporteras empleadas corresponden a marcadores moleculares de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad adicional, las sondas reporteras comprenden secuencias que permiten detectar los genes Ll, L2, E6 y E7 de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad aún más particular de la presente invención, las sondas reporteras comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 (Tabla 1).
Tabla 1. Secuencias de nucleótidos
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En el contexto de la presente invención, el término “ nanopartícula” hace referencia a cristales artificiales de tamaños nanométricos con propiedades semiconductoras, los cuales han sido recubiertos con una cubierta semiconductora adicional para mejorar las propiedades ópticas del material. Las nanopartículas empleadas en la presente invención se caracterizan por presentar un espectro de emisión estrecho y simétrico, con el máximo de emisión en una longitud de onda entre 605 nm a 655 nm; y por tener una cubierta de polímero que permite que los materiales se conjuguen con moléculas biológicas y conserven sus propiedades ópticas.
En una modalidad de la invención, las nanopartículas se seleccionan entre un carbón dot y un quantum dot. En una modalidad particular de la invención, el carbón dot utilizado en el biosensor se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, polietilenglicol (PEG) conjugado con biotina, amina y tiol. En otra modalidad de la invención, el quantum dot utilizado en el biosensor se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, ácido oleico, amina y PEG.
En una modalidad particular de la invención, las nanopartículas funcionalizadas con carboxilo, polietilenglicol (PEG), ácido oleico, amina y tiol se unen con el dendrímero. En otra modalidad particular de la invención, las nanopartículas conjugadas con biotina, se unen a una proteína de tipo avidina presente en una nanoesfera del biosensor. Esta configuración se observa de manera esquemática en la Figura 2.
El biosensor de la presente invención puede comprender adicionalmente “nanoesferas” . Para efectos de la presente invención, las nanoesferas se seleccionan del grupo conformado por nanoesferas de oro, plata, silicio, hierro/silicio y plata/albúmina, de 150 nm a 500 nm de diámetro, que están acopladas con proteínas de tipo avidina en su superficie.
En una modalidad particular de la invención, las proteínas tipo avidina de las nanoesferas se unen por medio de enlaces no covalentes a las moléculas de biotina presentes en las sondas reporteras. En otra modalidad particular de la invención, las proteínas tipo avidina de las nanoesferas se unen a las moléculas de biotina de las nanopartículas. En una modalidad particular de la invención, la sonda de captura se híbrida con el ADN blanco de las secuencias del genoma de VPH y se une a la sonda reportera acoplada a biotina. La biotina se une al extremo amino del dendrímero, el cual tiene ocho brazos carboxilo, a los cuales se une otra sonda reportera acoplada a biotina. Finalmente estas moléculas de biotina se unen a las proteínas tipo avidina de las nanopartículas.
En una modalidad, el biosensor puede detectar entre 1 a 100.000 copias virales. En una modalidad particular, se detecta 1 copia viral. En otra modalidad particular, se detectan 10 copias virales. En otra modalidad particular se detectan 100 copias virales.
Método de detección de VPH
Otro aspecto de la invención comprende un método de detección in vitro de VPH en fluidos biológicos, en donde dicho método comprende poner en contacto una muestra de un fluido biológico con un biosensor óptico, en donde el biosensor comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera y una nanopartícula.
Los fluidos biológicos que pueden ser analizados incluyen, pero no se limitan a: saliva, fluido cervical, plasma sanguíneo, sangre y orina. En una modalidad particular de la invención, la muestra se puede diluir en un factor de 1/10, 1/20 o 1/100 para facilitar la lectura de fluorescencia. En esta modalidad, la muestra se puede diluir en solución salina, buffer fosfato, o buffer Tris-HCl. En una modalidad de la invención, la detección se puede realizar en un volumen de muestra entre 100 y 500 pL.
En el contexto de la presente invención, el ADN contenido en la muestra se desnaturaliza y se híbrida con la sonda de captura al interior del biosensor, en presencia de un buffer de formamida (pH 7, 5-8, 5) a una temperatura de reacción entre 37 a 42 °C. Luego de la unión de la sonda de captura con el ADN diana presente en la muestra y la hibridación de dicho ADN diana con la sonda reportera, ocurre la unión de las nanoesferas acopladas a la molécula tipo avidina y de las nanopartículas acopladas a una molécula tipo biotina a dichas nanoesferas, las cuales se excitan a una longitud de onda entre 605 a 655 nm en el espectro rojo con un filtro de rodamina. La señal de fluorescencia generada en este último paso se detecta en un microscopio de fluorescencia, en donde la intensidad de la señal es directamente proporcional al número de copias virales presentes en la muestra analizada.
El método de detección de la presente invención tiene un límite de detección de VPH entre 10 y 100.000 copias virales, con un coeficiente de variación de 4,47 % y una especificidad de 0,92.
La presente invención se presenta en detalle a través de los siguientes ejemplos, los cuales son suministrados solamente con propósitos ilustrativos y no con el objetivo de limitar su alcance.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño y análisis bioinformático de las sondas de captura y las sondas reporteras
1.1 Obtención del ADN de VPH Secuencia L1
Se amplificó regiones específicas de los genes L1 y E6 de los genotipos VPH- 16 y VPH-18 por PCR en tiempo real utilizando los cebadores descritos en la Tabla 2. Se verificó la especificidad del producto de PCR por la generación de las curvas de fusión. Los resultados del ensayo con los cebadores GP5+/GP6+, los cuales amplifican una secuencia de aproximadamente 150 pb, demostraron la presencia de un solo pico de melting a 78°C, lo que demuestra la especificidad de los productos obtenidos con dichos cebadores (Figura 3B).
Tabla 2. Cebadores de los genes L1 y E6 de VPH
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1.2 Diseño de las sondas de detección y cálculo de la temperatura de hibridación
Las sondas de captura y reporteras se diseñaron mediante el programa Beacon Designer 8.0 y se determinaron las temperaturas óptimas teóricas de hibridación ADN-sonda con el programa UNAfold del servidor web DINAMelt, de acuerdo con el contenido de guanina - citosina (G+C) y adenina - timina (A+T) de cada sonda para VPH-16 y VPH-18. Las secuencias evaluadas corresponden a las SEQ ID NOs: 1 y 9.
Adicionalmente, se realizaron emparejamientos de las secuencias con el software Malthfish para definir la estabilidad de las interacciones ADN-ADN entre la sonda y el blanco, esto mediante la evaluación del cambio de energía libre de hibridación suponiendo una estructura de sonda lineal y un sitio blanco completamente accesible (Figuras 4A y 4B). Para el genotipo VPH-16 se calculó una temperatura de hibridación óptima de 78,2° C a una concentración de sonda de 0,00001 ng/pL con una energía libre de Gibbs de -8,1, sugiriendo que a esta temperatura la hibridación ocurre de manera espontánea, mientras que para el genotipo VPH-18 se calculó una temperatura de hibridación de 82,5 °C. Posteriormente, se calcularon las temperaturas de hibridación de las sondas de captura y las sondas reporteras en presencia de formamida, solvente que se utiliza para reducir la estabilidad térmica de la doble cadena de ADN y de esta forma facilitar la hibridación a temperaturas entre 30 y 45 °C. Igualmente, se calculó la concentración de formamida necesaria para obtener eficiencias de hibridación de 1,0 (Figuras 5A y 5B), encontrándose valores de 68,2% y 71,2% para las sondas del gen L1 de VPH-16 y VPH-18, respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3. Eficiencia de hibridación de la sonda para VPH-16 y VPH-18 con la secuencia blanco
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* Concentración de formamida para la desnaturalización. ** Concentración de formamida 0%.
1.3 Análisis de la efectividad de hibridación de las sondas de captura v sondas reporteras
A partir de la información obtenida del análisis de las condiciones de hibridación y la temperatura calculada para cada tipo viral se realizó Northern blot después de haber realizado la hibridación de cada tipo viral con el ADN blanco utilizando el buffer PerfectHybTM Plus (Sigma Aldrich), y posteriormente la hibridación se verificó por la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH, siglas en inglés). Los resultados de microscopía de fluorescencia obtenidos con las sondas para el gen L1 de los genotipos VPH-16 y VPH-18 se observan en la Figura 6 Ay B, respectivamente.
Ejemplo 2. Evaluación de sustratos para la funcionalización del soporte sólido
El vidrio es un material muy utilizado para inmovilizar ácidos nucleicos principalmente debido a su baja autofluorescencia, rigidez, bajo costo, y resistencia a altas temperaturas. En el presente caso, se emplearon cuatro sustratos de inmovilización para acoplar las moléculas de ADN en soportes de vidrio: poli-L-lisina, APTES, estreptavidina y NOS.
Se recubrieron láminas de vidrio de microscopio con poli-L-lisina al 1% (Sigma, EUA) y posterior a la reacción de acoplamiento con diferente número de copias de VPH-18 se evaluó la unión del ADN a la superficie utilizando el colorante naranja de acridina. Se observó un aumento de la fluorescencia proporcional la concentración de la muestra, lo que sugiriere el acoplamiento del ADN a esta superficie. Sin embargo, pese a la relativa efectividad del sustrato para inmovilizar los ácidos nucleicos y a la simplicidad del proceso de funcionalización, el recubrimiento con poli-L-lisina no es fácilmente reproducible, lo cual se atribuye a sus bajos niveles de adsorción y a la baja estabilidad de la capa adsorbida, obteniendo un revestimiento de poli-L-lisina con una cobertura superficial de un grosor de aproximadamente 1 nm. Adicionalmente, esto puede conducir a un desperdicio sustancial de moléculas de poli-L-lisina de alto costo que se eliminan por lavado durante el recubrimiento y durante la posterior exposición a soluciones.
Por otra parte, la utilización de láminas de vidrio funcionalizadas con APTES permitió obtener resultados reproducibles en la inmovilización de los ácidos nucleicos. A este respecto, varios autores han demostrado que el APTES produce una capa uniforme de aminas con estabilidad química, soluble en medios acuosos sin producir uniones no específicas y suficiente longitud para eliminar interferencia estérica no deseada con el soporte. Además, el ruido de fondo de hibridación de las láminas cubiertas con aminosilano es menor que el producido por poli-L-lisina, posiblemente debido a la única capa de aminosilano que se forma sobre la superficie que favorece la unión específica al ADN.
Adicionalmente, se utilizaron láminas recubiertas con estreptavidina, SuperAvidin de Arraylt® que contienen un tratamiento de avidina altamente uniforme unido covalentemente a un sustrato de vidrio atómicamente plano, que ofrece una superficie universal de unión a biotina de alta capacidad para aplicaciones de microarreglos de ADN y proteínas.
Finalmente, se utilizó una superficie para la detección colorimétrica de ADN biotinilado “DNA-BIND” Corning®, la cual utiliza los espaciadores NH2C12 y puede ser leída en el espectofotómetro TECAN. Esta consta de una superficie de poliestireno que está cubierta con una capa de grupos NOS. Este acoplamiento es específico y no se ve afectado por las aminas que se unen a los anillos de adenina, guanina y citosina. Cuando las aminas primarias reaccionan con los grupos NOS a un pH alcalino, el éster comienza una sustitución nucleofílica, la amina ataca al grupo carbonilo y desplaza el grupo NOS.
Ejemplo 3. Evaluación de la amplificación y transducción de la señal óptica.
3.1 Biosensor de vidrio funcionalizado con APTES Se evaluó la capacidad de detección del biosensor de vidrio funcionalizado con APTES y utilizando para la amplificación de la señal nanoesferas de silicio acopladas a estreptavidina y Qdots conjugados a biotina (Sigma Aldrich) que al ser excitados por una longitud de onda de 655 nm generan una señal roja fluorescente. La señal óptica resultante se observó en el microscopio Zeizz acoplado a una cámara CCD con una magnificación de 20X y captura de las imágenes respectivas en el filtro de rodamina. Para los genotipos VPH-16 y VPH-18 se observaron las señales fluorescentes desde 1 hasta 100.000 copias virales, siendo la fluorescencia directamente proporcional a las copias virales (Figuras 7 A-F y 8 A-F).
La densidad superficial de los productos de PCR de la secuencia L1 de VPH-16 y VPH-18 que se inmovilizaron y acoplaron constituye un parámetro importante para la fase de hibridación o bioreconocimiento. Una inmovilización débil del analito produce señales débiles de hibridación, pero, una densidad alta del analito en la superficie puede disminuir la tasa de hibridación. Este fenómeno se observó en las concentraciones más altas de copias virales tanto de VPH-16 como VPH-18 (Figuras 7 F y 8 F), las cuales produjeron señales débiles de hibridación, probablemente porque la densidad del analito resultó en un obstáculo estérico del ADN inmovilizado covalentemente que impidió la entrada del oligonucleótido de ADN (sonda). En varios estudios de hibridación utilizando oligonucleótidos y productos de PCR como sondas, la superficie de cubrimiento óptima se produjo con un oligonucleótido de 157 pb a una concentración de 5 mM, lo cual corresponde a una densidad de superficie de 500 Á2 por molécula (resultados no mostrados). Oligonucleótidos más largos de 347 pb producen resultados de hibridación 30 % más bajos, sugiriendo la interferencia estérica de largos fragmentos por la densidad que producen en la superficie. 3.2 Biosensor funcionalizado con NOS
Además, para determinar la correlación entre la señal observada en el microscopio de fluorescencia y el número de copias virales en la muestra se evaluó la intensidad de fluorescencia generada con el ADN acoplado a la superficie NOS y posterior hibridación con la sonda de detección acoplada a FITC, la cual fue leída en el fluorómetro TECAN a una longitud de onda de excitación/emisión de 495 nm/519 nm. Se generaron gráficas a partir de los datos de intensidad de fluorescencia luego de restar la fluorescencia del buffer de hibridación, y utilizando el programa DYNAMICBIOSENSOR (Sense Marker). Se observó que la fracción de unión o hibridación del ADN con la sonda de detección aumenta con el número de copias virales, con un tiempo de detección de 20 segundos (Figura 9).
3.3 Biosensor con dendrímeros
Se utilizaron los dendrímeros 8 carboxil, 1 amina (Sigma), para mejorar la amplificación de la señal. Se utilizaron las sondas de captura de SEQ ID NO: 1 y 8 las sondas reporteras de SEQ ID NO: 18 y 24 acopladas a biotina y unida al extremo amino del dendrímero, el cual tiene ocho brazos carboxilo en los cuales se ligaron otras sondas reporteras de SEQ ID NO: 18 y 24 acopladas a los Qdots.
Después de realizar las reacciones de acoplamiento e hibridación de las sondas, se observó la señal generada en el microscopio de fluorescencia utilizando el filtro de rodamina para determinar si los dendrímeros mejoran la señal con una y diez copias virales tanto del genotipo VPH-16 como VPH-18. Tal como se puede observar en la Figuras 10A-D, al introducir los dendrímeros en el biosensor, la señal se amplifica de manera significativa, lo que permite la detección a partir de una copia viral.
Ejemplo 4. Evaluación de la funcionalidad del biosensor con saliva fisiológica simulada
Para determinar la sensibilidad y especificidad del biosensor, se preparó saliva fisiológica simulada según lo reportado por Marques, M.R.C. et al., 2011 (Tabla 4). Igualmente, se realizaron diluciones del ADN de los genotipos VPH-16 y VPH-18 en solución salina desde 1 copia hasta 10.000 copias utilizando los plásmidos pl6Ll-GFP y pl8Ll-GFP, y ADN viral obtenido de células HeLa y SiHa con copias integradas de VPH-18 y VPH-16, respectivamente. Para la detección, se depositaron 100 a 500 pL de una mezcla de solución de plásmidos o ADN celular preparado en saliva simulada y bufFer formamida sobre la superficie del biosensor, el cual fue incubado durante 10 min a 42 °C, para posteriormente realizar la lectura de la señal obtenida con un microscopio de fluorescencia.
Tabla 4. Composiciones de saliva simulada (adaptado de M.R.C. etal. , 2011
Dissolution Technol , 18(3): 15-28)
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un biosensor para la detección óptica de virus del papiloma humano (VPH) en muestras biológicas que comprende: a) una superficie funcionalizada; b) un dendrímero; c) un espaciador; d) una sonda de captura; e) una sonda reportera; y f) una nanopartícula.
2. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la superficie funcionalizada se selecciona entre vidrio, papel, silicio, nitrocelulosa, oro, plata, poliestireno y grafeno.
3. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la superficie se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende amino, silano, epoxi, carboxilato, éster y biotinilados.
4. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el dendrímero se selecciona entre amino-funcionales, carboxi-funcionales, biotinilados, hidroxilados y pireno-funcionales.
5. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el espaciador se selecciona entre moléculas NH2-C6.12; trietilenglicol (TEG) y hexaetilenglicol (HEG).
6. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la sonda de captura se selecciona entre las secuencias de nucleótidos del grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 18.
7. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la sonda reportera se selecciona entre las secuencias de nucleótidos del grupo que comprende las SEQ ID NO: 19 a 30.
8. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la nanopartícula se selecciona entre un carbón dot y un quantum dot.
9. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 8, en donde el carbón dot se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, PEG terminado en biotina, amina y tiol.
10. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 8, en donde el quantum dot se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, ácido oleico, amina y PEG.
11. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, que además comprende una nanoesfera seleccionada del grupo que comprende nanoesferas de oro, plata, silicio, hierro/silicio y plata/albúmina.
12. Un método de detección in vitro de VPH en una muestra biológica que comprende poner en contacto dicha muestra con un biosensor óptico, en donde el biosensor comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera y una nanopartícula.
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