WO2022201007A1 - Biosensor for the optical detection of human papillomavirus infection in biological fluids - Google Patents

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Definitions

  • FIG. 1 Schematic illustration of the biosensor with dedrimers. Each dendrimer binds at the amino end to a reporter probe and at the arms to another reporter probe coupled to a nanoparticle.
  • dendrimers have a polyvalent surface, which can be modified by a variety of ligands and makes the formation of conjugates or complexes possible;
  • a "reporter probe” corresponds to a nucleotide sequence that hybridizes to specific regions of the molecular markers.
  • the reporter probes are coupled to one or more biotin-like molecules.
  • the reporter probes are coupled to a fluorescent dye, such as fluorescein-5-isothiocyanate (FITC).
  • FITC fluorescein-5-isothiocyanate
  • the reporter probes used correspond to molecular markers of the HPV-16 and HPV-18 genotypes.
  • the reporter probes comprise sequences that allow the L1, L2, E6 and E7 genes of the HPV-16 and HPV-18 genotypes to be detected.
  • the reporter probes comprise the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29 (Table 1 ).
  • the biosensor of the present invention may further comprise "nanospheres".
  • the nanospheres are selected from the group made up of gold, silver, silicon, iron/silicon and silver/albumin nanospheres, 150 nm to 500 nm in diameter, which are coupled with avidin-type proteins in their surface.

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Abstract

The present invention relates to a biosensor for the optical detection of human papillomavirus (HPV) infection in biological fluids, which comprises: a functionalised surface, a dendrimer, a spacer, a capture probe, a reporter probe and a nanoparticle. The present invention further relates to a method for the in vitro detection of HPV in biological fluids, wherein said method comprises bringing said sample into contact with an optical biosensor. The present invention enables rapid, reproducible and cost-effective diagnosis of markers associated with HPV infection in different types of biological samples, which in turn facilitates population-level monitoring of the infection.

Description

BIOSENSOR PARA LA DETECCIÓN ÓPTICA DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN FLUIDOS BIOLÓGICOS BIOSENSOR FOR THE OPTICAL DETECTION OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS INFECTION IN BIOLOGICAL FLUIDS
CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION
El presente desarrollo está relacionado con el campo del diagnóstico clínico, particularmente con dispositivos que utilizan hibridación de ácidos nucleicos para detección de infecciones virales, y más particularmente con un biosensor para la detección óptica de la infección por el virus del papiloma humano en fluidos biológicos. The present development is related to the field of clinical diagnosis, particularly with devices that use nucleic acid hybridization to detect viral infections, and more particularly with a biosensor for the optical detection of human papillomavirus infection in biological fluids.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION
El virus del papiloma humano (VPH) es un patógeno capaz de infectar el epitelio cutáneo y mucoso de una manera específica de especie induciendo proliferación celular. Este virus ha sido reconocido como el agente etiológico para el desarrollo de varios tipos de cáncer tanto en hombres como en mujeres. A nivel mundial, la infección por VPH causa hasta el 4,5% (640.000 casos) de todos los casos nuevos de cáncer (8,6% mujeres; 0,9% hombres), lo que representa el 29,5% de todos los tumores relacionados con infecciones (Ervik M, Lam F, Ferlay J, Mery L, Soerjomataram I, Bray F. Cáncer Today. Lyon, France: International Agency for Research on Cáncer; 2016. http://gco.iarc.fr/today. Fecha de revisión: 17 de Agosto de 2017; Plummer M, de Martel C, Vignat J, Ferlay J, Bray F, Franceschi S. 2016. Lancet Glob Health , 4(9): e609-e616). The human papillomavirus (HPV) is a pathogen capable of infecting the cutaneous and mucosal epithelium in a species-specific manner, inducing cell proliferation. This virus has been recognized as the etiological agent for the development of various types of cancer in both men and women. Globally, HPV infection causes up to 4.5% (640,000 cases) of all new cancer cases (8.6% women; 0.9% men), accounting for 29.5% of all infection-related tumors (Ervik M, Lam F, Ferlay J, Mery L, Soerjomataram I, Bray F. Cancer Today. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2016. http://gco.iarc.fr/ today.Revision date: 2017 Aug 17;Plummer M, de Martel C, Vignat J, Ferlay J, Bray F, Franceschi S. 2016. Lancet Glob Health, 4(9):e609-e616).
El cáncer cervical asociado a la infección por el VPH es la tercera causa principal de muerte por cáncer en mujeres, con más de 550.000 casos diagnosticados anualmente y un total de 288.000 muertes por año (Bernard E, Pons-Salort M, Favre M, Heard I, Delarocque-Astagneau E, Guillemot D, et al. 2013. BMC Infect Dis, 13:37-373). Adicionalmente, en las últimas décadas se ha observado un aumento en la incidencia de tumores de cabeza y cuello, orales y orofaríngeos relacionados con el VPH (Gillison ML, Chaturvedi AK, Anderson WF, Fakhry C. 2015. J Clin Oncol , 33(29): 3235-3242; Castellsagué X, Alemany L, Quer M, et al. 2016. J Nati Cáncer Inst, 108(6):djv403), siendo el carcinoma de células escamosas orofaríngeo (OPSCC, por sus siglas en inglés) y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC, por sus siglas en inglés) los más prevalentes, representando un importante problema de salud mundial, con más de 400.000 casos y más de 200.000 muertes al año (Miller DL, Puricelli MD, Stack MS. 2012. Biochem J , 443(2): 339-353). El VPH también se asocia causalmente con un porcentaje variable de cánceres de vulva, vagina y pene (International Agency for Research on Cáncer. 2011. http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vollOOB/rnonolOOB.pdf. Fecha de revisión: 17 de Agosto de 2017). Cervical cancer associated with HPV infection is the third leading cause of cancer death in women, with more than 550,000 cases diagnosed annually and a total of 288,000 deaths per year (Bernard E, Pons-Salort M, Favre M, Heard I, Delarocque-Astagneau E, Guillemot D, et al 2013. BMC Infect Dis, 13:37-373). Additionally, an increase in the incidence of head and neck, oral, and oropharyngeal tumors related to HPV has been observed in recent decades (Gillison ML, Chaturvedi AK, Anderson WF, Fakhry C. 2015. J Clin Oncol , 33(29 ): 3235-3242; Castellsagué X, Alemany L, Quer M, et al. 2016. J Nati Cancer Inst, 108(6):djv403), being oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC) and head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) the most prevalent, representing a major global health problem, with more than 400,000 cases and more than 200,000 deaths per year (Miller DL, Puricelli MD, Stack MS. 2012. Biochem J , 443(2): 339-353). HPV is also causally associated with a variable percentage of cancers of the vulva, vagina, and penis (International Agency for Research on Cancer. 2011. http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vollOOB/rnonolOOB.pdf. Date of revision: August 17, 2017).
Actualmente, se estima 14 millones de nuevas infecciones genitales por VPH cada año, con 80% a 90% de hombres y mujeres sexualmente activos infectados en algún momento de su vida, de los cuales 40% a 45% están infectados con genotipos de alto riesgo (VPH-16 y VPH-18). De manera similar, se estima que 26 millones de personas tienen una infección oral activa por VPH, con 6,2 millones de nuevas infecciones cada año (Chesson HW, Dunne EF, Hariri S, Markowitz LE. 2014. Sex Transm Dis, 41(11): 660-664). Currently, there are an estimated 14 million new genital HPV infections each year, with 80% to 90% of sexually active men and women infected at some point in their lives, of whom 40% to 45% are infected with high-risk genotypes (HPV-16 and HPV-18). Similarly, an estimated 26 million people have active oral HPV infection, with 6.2 million new infections each year (Chesson HW, Dunne EF, Hariri S, Markowitz LE. 2014. Sex Transm Dis, 41( 11): 660-664).
Debido a factores como la larga latencia clínica entre la infección y la oncogénesis (a menudo decenas de años) y la falta de tratamiento clínico para las infecciones persistentes por VPH que aún no han inducido cambios celulares anormales, la disponibilidad de tecnologías para el monitoreo de marcadores virales en fluidos biológicos, como hisopado cervical o un enjuague oral, facilita la detección temprana de la progresión maligna de la enfermedad y, por lo tanto, permite realizar el tratamiento adecuado y oportuno del paciente. Due to factors such as the long clinical latency between infection and oncogenesis (often tens of years) and the lack of clinical treatment for persistent HPV infections that have not yet induced abnormal cellular changes, the availability of technologies for monitoring Viral markers in biological fluids, such as cervical swabs or an oral rinse, facilitate early detection of malignant progression of the disease and, therefore, allow appropriate and timely treatment of the patient.
Dicha detección y tratamiento oportuno tienen una especial relevancia para países en vías de desarrollo, teniendo en cuenta que en los últimos años las tasas de mortalidad por cáncer de cuello uterino y los carcinomas orales han aumentado en los países de ingresos bajos y medianos, debido principalmente al acceso limitado a los servicios de salud y la baja cobertura de los programas de detección y tratamiento. Alrededor del mundo, el enfoque estándar para la detección del cáncer de cuello uterino es a través de la citología cervical o prueba de Papanicolau, la cual permite detectar lesiones precancerosas en etapa temprana. No obstante, esta técnica presenta algunas desventajas relacionadas con baja sensibilidad, dificultad para la interpretación de resultados (lo que genera altas tasas de falsos negativos y positivos), la incomodidad generada en el paciente, el tiempo de respuesta, y la necesidad de personal experimentado y capacitado (Nanda K, McCrory DC, Myers ER, Bastían LA, Hasselblad V, Hickey JD, etal. 2000. Ann Intern Med, 132(10): 810-819). Such early detection and treatment are especially relevant for developing countries, taking into account that in recent years the mortality rates from cervical cancer and oral carcinomas have increased in low- and middle-income countries, mainly due to limited access to health services and low coverage of detection and treatment programs. Around the world, the standard approach to detecting cervical cancer is through cervical cytology or Pap smear, which allows detecting precancerous lesions at an early stage. However, this technique has some disadvantages related to low sensitivity, difficulty in interpreting results (which generates high rates of false negatives and positives), discomfort generated in the patient, response time, and the need for experienced personnel. and trained (Nanda K, McCrory DC, Myers ER, Bastian LA, Hasselblad V, Hickey JD, etal. 2000. Ann Intern Med, 132(10): 810-819).
Actualmente, en conjunto con las pruebas citológicas, se realizan ensayos moleculares basados en amplificación de ácidos nucleicos para la detección de VPH. Por ejemplo, Singh y Dash describen el uso de quantum dots (Qdots) para el monitoreo temprano y diagnóstico de biomarcadores de cáncer, en particular de cáncer oral (Singh, D.K. & Dash, K.C. 2018. J BioSci. and Biotechnol , 7(1): 204-208). En este artículo, se menciona el ensamblaje de un gran número de Qdots de CdSe/ZnS en dendrímeros nanocristales (NC), los cuales amplifican en gran medida las señales electroquimioluminiscentes (ECL, por sus siglas en inglés). De acuerdo con este estudio, los Qdots conjugados con diferentes tipos de ligandos diana o fármacos o genes anti-cáncer tienen potencial para mejorar la eficiencia de las imágenes y liberación de fármacos para el tratamiento del cáncer a través de la unión selectiva a los receptores sobre-expresados en las células cancerosas y la superficie de los tejidos. Currently, in conjunction with cytological tests, molecular assays based on nucleic acid amplification are performed for the detection of HPV. For example, Singh and Dash describe the use of quantum dots (Qdots) for early monitoring and diagnosis of cancer biomarkers, particularly oral cancer (Singh, D.K. & Dash, K.C. 2018. J BioSci. and Biotechnol , 7(1 ): 204-208). In this article, the assembly of a large number of CdSe/ZnS Qdots on nanocrystal (NC) dendrimers, which greatly amplify electrochemiluminescent (ECL) signals, is mentioned. According to this study, Qdots conjugated with different types of target ligands or anti-cancer drugs or genes have potential to improve the efficiency of imaging and drug delivery for cancer treatment through selective binding to receptors on -expressed on cancer cells and tissue surfaces.
Yu-Hong y colaboradores desarrollaron un ensayo de detección de infecciones por VPH- 16 basado en hibridación con Qdots y nanopartículas superparamagnéticas, que difiere de la reacción convencional de hibridación en que ocurre en una solución homogénea y tiene un tiempo total para la detección de no más de una hora (Yu-Hong, W., Rui, C. & Ding, L.A. 2011. Nanoscale Res Lett, 6: 461). Los autores concluyen que el método de hibridación desarrollado es fácil y consume menos tiempo que la PCR tipo-específica para la detección cualitativa de VPH- 16 en muestras de fluido cervical, listando como una ventaja que el ensayo de hibridación descrito sólo requiere la extracción del ADN de las muestras y una incubación simple y separación magnética. La patente US7883903B2 menciona que existe una variedad de ensayos y formatos de ensayo, incluyendo formatos de inmunoensayo y arreglos que pueden emplear conjugados de sustrato quimioluminiscente dendrímero polimérico, todos los cuales involucran una señal quimioluminiscente visible para indicar la presencia o la concentración de una sustancia particular en una muestra. El analito buscado en la muestra puede ser una enzima, o puede ser una molécula reportera unida a una sonda, un antígeno o un anticuerpo o cualquier miembro de un par específico de unión, para detectar la presencia del otro miembro del par específico de unión. Yu-Hong et al. developed a detection assay for HPV-16 infections based on hybridization with Qdots and superparamagnetic nanoparticles, which differs from the conventional hybridization reaction in that it occurs in a homogeneous solution and has a total time for detection of no over an hour (Yu-Hong, W., Rui, C. & Ding, LA 2011. Nanoscale Res Lett, 6:461). The authors conclude that the hybridization method developed is easy and less time consuming than type-specific PCR for the qualitative detection of HPV-16 in cervical fluid samples, listing as an advantage that the described hybridization assay only requires the extraction of the DNA from the samples and a simple incubation and magnetic separation. Patent US7883903B2 mentions that there are a variety of assays and assay formats, including immunoassay formats and arrays that can employ polymeric dendrimer chemiluminescent substrate conjugates, all of which involve a visible chemiluminescent signal to indicate the presence or concentration of a particular substance. in a sample. The analyte sought in the sample may be an enzyme, or it may be a reporter molecule linked to a probe, an antigen or an antibody or any member of a specific binding pair, to detect the presence of the other member of the specific binding pair.
Sin embargo, si bien estos ensayos permiten obtener resultados sensibles, selectivos y reproducibles, son costosos y de difícil acceso; lo cual prolonga el diagnóstico y la terapia adecuada. En este sentido, existe una importante necesidad no satisfecha de proporcionar diagnósticos rápidos, reproducibles y económicos que permitan detectar marcadores asociados a la infección por VPH en diferentes tipos de muestras biológicas, para un tamizaje y monitoreo efectivos a nivel poblacional en centros de atención. However, although these tests allow obtaining sensitive, selective and reproducible results, they are expensive and difficult to access; which prolongs diagnosis and appropriate therapy. In this sense, there is an important unmet need to provide rapid, reproducible and inexpensive diagnostics that allow the detection of markers associated with HPV infection in different types of biological samples, for effective screening and monitoring at the population level in care centers.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención se refiere a un biosensor para la detección óptica de VPH en muestras biológicas que comprende una superficie funcionalizada; un dendrímero; un espaciador; una sonda de captura; una sonda reportera; y una nanopartícula. La invención también se refiere a un método de detección in vitro de VPH en fluidos biológicos que comprende poner en contacto dicho fluido con el biosensor óptico. The present invention refers to a biosensor for the optical detection of HPV in biological samples that comprises a functionalized surface; a dendrimer; a spacer; a capture probe; a reporter probe; and a nanoparticle. The invention also refers to a method of in vitro detection of HPV in biological fluids that comprises putting said fluid in contact with the optical biosensor.
En un aspecto de la invención, el biosensor permite detectar marcadores asociados a la infección por VPH a partir de diferentes fluidos biológicos que incluyen, entre otros, saliva y fluido cervical. In one aspect of the invention, the biosensor allows markers associated with HPV infection to be detected from different biological fluids including, among others, saliva and cervical fluid.
En otro aspecto de la invención, los marcadores asociados a la infección por VPH incluyen, sin limitarse a secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas Ll, L2, E6 y E7 de los genotipos VPH- 16 y VPH- 18. En otro aspecto de la invención, la señal detectable es una señal fluorescente que se genera cuando ocurre un evento de unión entre una secuencia de ADN presente en la muestra y una sonda de oligonucleótidos específica del biosensor. In another aspect of the invention, the markers associated with HPV infection include, without limitation, nucleotide sequences that encode the Ll, L2, E6 and E7 proteins of the HPV-16 and HPV-18 genotypes. In another aspect of the invention, the detectable signal is a fluorescent signal that is generated when a binding event occurs between a DNA sequence present in the sample and a biosensor-specific oligonucleotide probe.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 Ilustración esquemática del biosensor con dedrímeros. Cada dendrímero se une por el extremo amino a una sonda reportera y por los brazos a otra sonda reportera acoplada a una nanopartícula. FIG. 1 Schematic illustration of the biosensor with dedrimers. Each dendrimer binds at the amino end to a reporter probe and at the arms to another reporter probe coupled to a nanoparticle.
FIG. 2 Ilustración esquemática del biosensor en donde las nanopartículas conjugadas con biotina, se unen a una proteína de tipo avidina presente en una nanoesfera del biosensor. FIG. 2 Schematic illustration of the biosensor where biotin-conjugated nanoparticles bind to an avidin-type protein present in a biosensor nanosphere.
FIG. 3A Curvas de amplificación de los productos de PCR de la secuencia L1 de los genotipos virales VPH-16 y VPH-18. ; FIG. 3A Amplification curves of the PCR products of the L1 sequence of the viral genotypes HPV-16 and HPV-18. ;
FIG. 3B Curvas de fusión de los productos de PCR de la secuencia L1 de los genotipos virales VPH-16 y VPH-18. FIG. 3B Melting curves of the PCR products of the L1 sequence of the viral genotypes HPV-16 and HPV-18.
FIG. 4A Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 16 en función de la energía libre de Gibbs. FIG. 4A Hybridization efficiency of HPV 16 L1 sequence capture probes as a function of Gibbs free energy.
FIG. 4B Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 18 en función de la energía libre de Gibbs. FIG. 4B Hybridization efficiency of HPV 18 L1 sequence capture probes as a function of Gibbs free energy.
FIG. 5A Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 16 en relación con el porcentaje de formamida. FIG. 5A Hybridization efficiency of the capture probes of the HPV 16 L1 sequence in relation to the percentage of formamide.
FIG. 5B Eficiencia de hibridación de las sondas de captura de la secuencia L1 de VPH 18 en relación con el porcentaje de formamida. FIG. 6 Hibridación fluorescente in situ de las sondas de captura de la secuenciaFIG. 5B Hybridization efficiency of the HPV 18 L1 sequence capture probes in relation to the percentage of formamide. FIG. 6 Fluorescent in situ hybridization of sequence capture probes
L1 de VPH. Se observan los núcleos de las células azules con las señales rojas fluorescentes resultado de la hibridación de la sonda de captura con la secuencia L1 in vitro. A. VPH- 16; B. VPH- 18. HPV L1. Blue cell nuclei are seen with red fluorescent signals resulting from hybridization of the capture probe with the L1 sequence in vitro. A. HPV-16; B. HPV-18.
FIG. 7 Microscopía de fluorescencia - Detección de VPH- 16 con biosensor con esferas de silicio acopladas a estreptavidina y Qdots conjugados a biotina A. 1 copia viral; B. 10 copias virales; C. 100 copias virales; D. 1.000 copias virales; E. 10.000 copias virales; F. 100.000 copias virales. FIG. 7 Fluorescence microscopy - Detection of HPV-16 with biosensor with silicon beads coupled to streptavidin and Qdots conjugated to biotin A. 1 viral copy; B. 10 viral copies; C. 100 viral copies; D. 1,000 viral copies; E. 10,000 viral copies; F. 100,000 viral copies.
FIG. 8 Microscopía de fluorescencia - Detección de VPH- 18 con biosensor con esferas de silicio acopladas a estreptavidina y Qdots conjugados a biotina. A. 1 copia viral; B. 10 copias virales; C. 100 copias virales; D. 1.000 copias virales; E. 10.000 copias virales; F. 100.000 copias virales. FIG. 8 Fluorescence microscopy - Detection of HPV-18 with biosensor with silicon spheres coupled to streptavidin and Qdots conjugated to biotin. A. 1 viral copy; B. 10 viral copies; C. 100 viral copies; D. 1,000 viral copies; E. 10,000 viral copies; F. 100,000 viral copies.
FIG. 9 Porcentaje de hibridación de la sonda de detección en relación al número de copias virales de VPH- 16 en soporte funcionalizado con N-oxisuccinimida. FIG. 9 Percentage of hybridization of the detection probe in relation to the number of viral copies of HPV-16 in support functionalized with N-oxysuccinimide.
FIG. 10 Microscopía de fluorescencia - Detección de VPH con biosensor con dendrímeros 8 carboxilo, 1 amino. A. VPH-16, 1 copia viral; B. VPH-16 10 copias virales; C. VPH-18, 1 copia viral; D. VPH-18, 10 copias virales. FIG. 10 Fluorescence microscopy - HPV detection with biosensor with 8-carboxyl, 1-amino dendrimers. A. HPV-16, 1 viral copy; B. HPV-16 10 viral copies; C. HPV-18, 1 viral copy; D. HPV-18, 10 viral copies.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Para propósitos de interpretar los términos usados a lo largo del presente documento se debe tener en cuenta su significado usual en el campo técnico, a menos que se incorpore una definición particular o el contexto indique claramente lo contrario. Adicionalmente, los términos utilizados en forma singular también incluirán la forma plural. For purposes of interpreting the terms used throughout this document, their usual meaning in the technical field should be taken into account, unless a particular definition is incorporated or the context clearly indicates otherwise. Additionally, terms used in the singular form will also include the plural form.
Biosensor Para efectos de la presente invención, el término “ biosensor ” hace referencia a un dispositivo que permite determinar la presencia o ausencia de biomoléculas en una muestra biológica mediante la cuantificación de una señal producida luego de la interacción entre dichas biomoléculas y un elemento de detección. biosensor For purposes of the present invention, the term "biosensor" refers to a device that allows determining the presence or absence of biomolecules in a biological sample by quantifying a signal produced after the interaction between said biomolecules and a detection element.
El biosensor de la presente invención comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera y una nanopartícula. The biosensor of the present invention comprises a functionalized surface, a dendrimer, a spacer, a capture probe, a reporter probe, and a nanoparticle.
Para efectos de la presente invención, la “ superficie funcionalizada ” corresponde a un soporte sólido, el cual permite la inmovilización estructurada de sondas de ácidos nucleicos. Para acoplar los ácidos nucleicos en soportes planos, deben quedar grupos funcionales libres de las cadenas de ADN para una adecuada inmovilización. For purposes of the present invention, the "functionalized surface" corresponds to a solid support, which allows the structured immobilization of nucleic acid probes. To attach nucleic acids to planar supports, free functional groups must remain on the DNA strands for proper immobilization.
Dichos soportes sólidos pueden estar conformados por materiales como vidrio, papel, silicio, nitrocelulosa, oro, plata, poliestireno y grafeno. En una modalidad de la invención el soporte sólido se selecciona entre vidrio y papel. En una modalidad particular, el soporte sólido es vidrio. El vidrio es un material muy utilizado para inmovilizar ácidos nucleicos principalmente debido a su baja autofluorescencia, rigidez, bajo costo, y resistencia a altas temperaturas. Said solid supports can be made up of materials such as glass, paper, silicon, nitrocellulose, gold, silver, polystyrene and graphene. In one embodiment of the invention, the solid support is selected from glass and paper. In a particular embodiment, the solid support is glass. Glass is a widely used material for immobilizing nucleic acids mainly due to its low autofluorescence, rigidity, low cost, and resistance to high temperatures.
Para realizar la inmovilización de los ácidos nucleicos en la superficie del soporte sólido, esta última es tratada con agentes químicos que le confieren una carga positiva. Este proceso, conocido como ‘ funcionalizaciórí permite la unión de las secuencias de ácidos nucleicos a la superficie por medio de interacciones electrostáticas o enlaces de tipo covalente. Los agentes químicos que permiten la funcionalización de la superficie del soporte sólido incluyen, pero no se limitan a: compuestos con grupos aminosilano, epoxi, carboxilato, éster y compuestos biotinilados. En una modalidad de la invención los agentes químicos se seleccionan del grupo que comprende poli-L-lisina, N-oxisuccinimida (NOS), epoxi-3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (GOPS), sulfato éster, 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) y estreptavidina. En una modalidad particular, la superficie se funcionaliza con APTES. En el contexto de la presente invención, se entiende por “ dendrímeros ” macromoléculas tridimensionales de construcción arborescente con dimensiones a escala nanométrica. In order to immobilize the nucleic acids on the surface of the solid support, the latter is treated with chemical agents that give it a positive charge. This process, known as 'functionalization', allows the binding of nucleic acid sequences to the surface by means of electrostatic interactions or covalent bonds. Chemical agents that allow functionalization of the solid support surface include, but are not limited to: compounds with aminosilane, epoxy, carboxylate, ester, and biotinylated compounds. In one embodiment of the invention, the chemical agents are selected from the group comprising poly-L-lysine, N-oxysuccinimide (NOS), epoxy-3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS), sulfate ester, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), and streptavidin. In a particular embodiment, the surface is functionalized with APTES. In the context of the present invention, "dendrimers" are understood as three-dimensional macromolecules of arborescent construction with dimensions on the nanometric scale.
Un dendrímero se compone de tres partes topológicas diferentes, a saber: (i) un núcleo focal, que imparte propiedades únicas al tamaño de la cavidad, la capacidad de absorción y las características de captura y liberación; (ii) bloques de construcción con varias capas interiores que tienen unidades repetidas; y (iii) múltiples grupos funcionales periféricos, los cuales afectan la solubilidad y la capacidad de quelación del dendrímero. A dendrimer is composed of three different topological parts, namely: (i) a focal core, which imparts unique properties to cavity size, absorptive capacity, and capture and release characteristics; (ii) multi-layered building blocks having repeating units; and (iii) multiple peripheral functional groups, which affect the solubility and chelation capacity of the dendrimer.
Los dendrímeros se caracterizan por las siguientes propiedades: Dendrimers are characterized by the following properties:
- Monodispersidad: estructura uniforme con un peso molecular definido; - Monodispersity: uniform structure with a defined molecular weight;
- Polivalencia: la presencia de múltiples grupos funcionales hace que los dendrímeros tengan una superficie polivalente, la cual puede ser modificada mediante una variedad de ligandos y hace posible la formación de conjugados o complejos; - Polyvalence: the presence of multiple functional groups makes dendrimers have a polyvalent surface, which can be modified by a variety of ligands and makes the formation of conjugates or complexes possible;
Autoensamblaje: se ha demostrado que debido a las anteriores propiedades, los dendrímeros se autoensamblan en vesículas y micelas; Self-assembly: Due to the above properties, dendrimers have been shown to self-assemble into vesicles and micelles;
Interacciones electrostáticas: la presencia de cargas en la superficie permite el autoensamblaje en agregados de diferentes formas debido a las interacciones electrostáticas con ácidos nucleicos; Electrostatic interactions: the presence of charges on the surface allows self-assembly into aggregates of different shapes due to electrostatic interactions with nucleic acids;
- Estabilidad química y física: la arquitectura única de los dendrímeros les confiere estabilidad frente a estímulos químicos y físicos, y hace posible la formación de complejos estables. - Chemical and physical stability: the unique architecture of dendrimers gives them stability against chemical and physical stimuli, and makes the formation of stable complexes possible.
En el contexto de la presente invención, los dendrímeros se seleccionan entre dendrímeros amino-funcionales, dendrímeros carboxi-funcionales, dendrímeros biotinilados, dendrímeros hidroxilados y dendrímeros pireno-funcionales. En una modalidad particular, los dendrímeros del biosensor se seleccionan del grupo conformado por dendrímeros amino-funcionales y carboxi-funcionales. En otra modalidad particular, los dendrímeros carboxi-funcionales son dendrímeros poliéster de ácido 2,2-bis(hidroximetil)propionico (bis-MPA). En una modalidad particular adicional, el dendrímero de bis-MPA tiene 8, 16 o 32 grupos carboxilo y un grupo amino en la superficie. En una modalidad particular adicional, el dendrímero de bis-MPA tiene 8 grupos carboxilo y un grupo amino en la superficie. In the context of the present invention, the dendrimers are selected from amino-functional dendrimers, carboxy-functional dendrimers, biotinylated dendrimers, hydroxylated dendrimers and pyrene-functional dendrimers. In a particular embodiment, the biosensor dendrimers are selected from the group consisting of amino-functional and carboxy-functional dendrimers. In another particular embodiment, the carboxy-functional dendrimers are polyester dendrimers of 2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid (bis-MPA). In a further particular embodiment, the bis-MPA dendrimer has 8, 16, or 32 carboxyl groups and one amino group on the surface. In a further particular embodiment, the bis-MPA dendrimer has 8 carboxyl groups and one amino group on the surface.
Los dendrímeros del biosensor de la presente invención permiten amplificar los eventos de hibridación de las secuencias específicas de ácidos nucleicos, lo que a su vez permite amplificar la señal óptica producida por la hibridación de secuencias. Los dendrímeros pueden unirse a una sonda reportera y a moléculas de tipo biotina. En una modalidad de la invención, un dendrímero se une a la superficie funcionalizada por un extremo y a la sonda de captura por los brazos, amplificando de esta manera los eventos de hibridación. En otra modalidad, un dendrímero se une por el extremo amino a una sonda reportera y por los brazos a otra sonda reportera acoplada a una nanopartícula, facilitando de esta manera la amplificación de la señal fluorescente. Esta configuración se observa de manera esquemática en la Figura 1. The biosensor dendrimers of the present invention allow the hybridization events of specific nucleic acid sequences to be amplified, which in turn allows the optical signal produced by the sequence hybridization to be amplified. Dendrimers can bind a reporter probe and biotin-like molecules. In one embodiment of the invention, a dendrimer binds to the functionalized surface at one end and to the capture probe at the arms, thereby amplifying hybridization events. In another embodiment, a dendrimer is linked at the amino end to a reporter probe and at the arms to another reporter probe coupled to a nanoparticle, thus facilitating the amplification of the fluorescent signal. This configuration is seen schematically in Figure 1.
En el contexto de la presente invención, un “ espaciador ” es una molécula que se une coval entem ente a las sondas de captura en su extremo 3’ o 5’, y que sirve como puente de unión entre dichas sondas de captura y el soporte sólido. En una modalidad particular de la invención, los espaciadores se seleccionan del grupo que comprende moléculas NH2-C6.12; trietilenglicol (TEG) y hexaetilenglicol (HEG). In the context of the present invention, a "spacer" is a molecule that covalently binds capture probes at their 3' or 5' end, and serves as a binding bridge between said capture probes and the support. solid. In a particular embodiment of the invention, the spacers are selected from the group comprising NH 2 -C 6.12 molecules; triethylene glycol (TEG) and hexaethylene glycol (HEG).
En la presente invención, las “ sondas de captura ” corresponden a secuencias de nucleótidos que se unen por hibridación a regiones específicas de los genes empleados como marcadores moleculares. En una modalidad particular de la invención, las sondas de captura empleadas corresponden a marcadores moleculares de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad adicional, las sondas de captura comprenden secuencias que permiten detectar los genes Ll, L2, E6 y E7 de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad aún más particular de la presente invención, las sondas de captura comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 (Tabla 1). De acuerdo con la presente invención, una “ sonda reportera ” corresponde a una secuencia de nucleótidos que se une por hibridación a regiones específicas de los marcadores moleculares. En algunas modalidades de la invención, las sondas reporteras están acopladas a una o más moléculas de tipo biotina. En otra modalidad de la invención, las sondas reporteras están acopladas a un colorante fluorescente, tal como la fluoresceína-5-isotiocianato (FITC). En una modalidad de la invención, las sondas reporteras empleadas corresponden a marcadores moleculares de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad adicional, las sondas reporteras comprenden secuencias que permiten detectar los genes Ll, L2, E6 y E7 de los genotipos VPH-16 y VPH-18. En una modalidad aún más particular de la presente invención, las sondas reporteras comprenden las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 (Tabla 1). In the present invention, "capture probes" correspond to nucleotide sequences that hybridize to specific regions of genes used as molecular markers. In a particular embodiment of the invention, the capture probes used correspond to molecular markers of the HPV-16 and HPV-18 genotypes. In a further embodiment, the capture probes comprise sequences that allow the L1, L2, E6 and E7 genes of the HPV-16 and HPV-18 genotypes to be detected. In an even more particular embodiment of the present invention, the capture probes comprise the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16 or 17 (Table 1). According to the present invention, a "reporter probe" corresponds to a nucleotide sequence that hybridizes to specific regions of the molecular markers. In some embodiments of the invention, the reporter probes are coupled to one or more biotin-like molecules. In another embodiment of the invention, the reporter probes are coupled to a fluorescent dye, such as fluorescein-5-isothiocyanate (FITC). In one embodiment of the invention, the reporter probes used correspond to molecular markers of the HPV-16 and HPV-18 genotypes. In an additional embodiment, the reporter probes comprise sequences that allow the L1, L2, E6 and E7 genes of the HPV-16 and HPV-18 genotypes to be detected. In an even more particular embodiment of the present invention, the reporter probes comprise the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 or 29 (Table 1 ).
Tabla 1. Secuencias de nucleótidos
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Table 1. Nucleotide sequences.
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En el contexto de la presente invención, el término “ nanopartícula” hace referencia a cristales artificiales de tamaños nanométricos con propiedades semiconductoras, los cuales han sido recubiertos con una cubierta semiconductora adicional para mejorar las propiedades ópticas del material. Las nanopartículas empleadas en la presente invención se caracterizan por presentar un espectro de emisión estrecho y simétrico, con el máximo de emisión en una longitud de onda entre 605 nm a 655 nm; y por tener una cubierta de polímero que permite que los materiales se conjuguen con moléculas biológicas y conserven sus propiedades ópticas. In the context of the present invention, the term "nanoparticle" refers to artificial crystals of nanometric sizes with semiconductor properties, the which have been coated with an additional semiconductive coating to improve the optical properties of the material. The nanoparticles used in the present invention are characterized by having a narrow and symmetrical emission spectrum, with the emission maximum at a wavelength between 605 nm and 655 nm; and by having a polymer shell that allows the materials to conjugate with biological molecules and retain their optical properties.
En una modalidad de la invención, las nanopartículas se seleccionan entre un carbón dot y un quantum dot. En una modalidad particular de la invención, el carbón dot utilizado en el biosensor se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, polietilenglicol (PEG) conjugado con biotina, amina y tiol. En otra modalidad de la invención, el quantum dot utilizado en el biosensor se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, ácido oleico, amina y PEG. In one embodiment of the invention, the nanoparticles are selected from a carbon dot and a quantum dot. In a particular embodiment of the invention, the dot carbon used in the biosensor is functionalized with functional groups selected from the group comprising carboxyl, polyethylene glycol (PEG) conjugated with biotin, amine and thiol. In another embodiment of the invention, the quantum dot used in the biosensor is functionalized with functional groups selected from the group comprising carboxyl, oleic acid, amine, and PEG.
En una modalidad particular de la invención, las nanopartículas funcionalizadas con carboxilo, polietilenglicol (PEG), ácido oleico, amina y tiol se unen con el dendrímero. En otra modalidad particular de la invención, las nanopartículas conjugadas con biotina, se unen a una proteína de tipo avidina presente en una nanoesfera del biosensor. Esta configuración se observa de manera esquemática en la Figura 2. In a particular embodiment of the invention, the functionalized nanoparticles with carboxyl, polyethylene glycol (PEG), oleic acid, amine and thiol are linked with the dendrimer. In another particular embodiment of the invention, the biotin-conjugated nanoparticles bind to an avidin-type protein present in a nanosphere of the biosensor. This configuration is seen schematically in Figure 2.
El biosensor de la presente invención puede comprender adicionalmente “nanoesferas” . Para efectos de la presente invención, las nanoesferas se seleccionan del grupo conformado por nanoesferas de oro, plata, silicio, hierro/silicio y plata/albúmina, de 150 nm a 500 nm de diámetro, que están acopladas con proteínas de tipo avidina en su superficie. The biosensor of the present invention may further comprise "nanospheres". For purposes of the present invention, the nanospheres are selected from the group made up of gold, silver, silicon, iron/silicon and silver/albumin nanospheres, 150 nm to 500 nm in diameter, which are coupled with avidin-type proteins in their surface.
En una modalidad particular de la invención, las proteínas tipo avidina de las nanoesferas se unen por medio de enlaces no covalentes a las moléculas de biotina presentes en las sondas reporteras. En otra modalidad particular de la invención, las proteínas tipo avidina de las nanoesferas se unen a las moléculas de biotina de las nanopartículas. En una modalidad particular de la invención, la sonda de captura se híbrida con el ADN blanco de las secuencias del genoma de VPH y se une a la sonda reportera acoplada a biotina. La biotina se une al extremo amino del dendrímero, el cual tiene ocho brazos carboxilo, a los cuales se une otra sonda reportera acoplada a biotina. Finalmente estas moléculas de biotina se unen a las proteínas tipo avidina de las nanopartículas. In a particular embodiment of the invention, the avidin-like proteins of the nanospheres bind via non-covalent bonds to the biotin molecules present in the reporter probes. In another particular embodiment of the invention, the avidin-type proteins of the nanospheres bind to the biotin molecules of the nanoparticles. In a particular embodiment of the invention, the capture probe hybridizes with the target DNA of the HPV genome sequences and binds to the biotin-coupled reporter probe. Biotin binds to the amino terminus of the dendrimer, which has eight carboxyl arms, to which another biotin-coupled reporter probe binds. Finally, these biotin molecules bind to the avidin-like proteins of the nanoparticles.
En una modalidad, el biosensor puede detectar entre 1 a 100.000 copias virales. En una modalidad particular, se detecta 1 copia viral. En otra modalidad particular, se detectan 10 copias virales. En otra modalidad particular se detectan 100 copias virales. In one embodiment, the biosensor can detect between 1 to 100,000 viral copies. In a particular embodiment, 1 viral copy is detected. In another particular embodiment, 10 viral copies are detected. In another particular modality, 100 viral copies are detected.
Método de detección de VPH HPV detection method
Otro aspecto de la invención comprende un método de detección in vitro de VPH en fluidos biológicos, en donde dicho método comprende poner en contacto una muestra de un fluido biológico con un biosensor óptico, en donde el biosensor comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera y una nanopartícula. Another aspect of the invention comprises a method for in vitro detection of HPV in biological fluids, wherein said method comprises contacting a sample of a biological fluid with an optical biosensor, wherein the biosensor comprises a functionalized surface, a dendrimer, a spacer, a capture probe, a reporter probe and a nanoparticle.
Los fluidos biológicos que pueden ser analizados incluyen, pero no se limitan a: saliva, fluido cervical, plasma sanguíneo, sangre y orina. En una modalidad particular de la invención, la muestra se puede diluir en un factor de 1/10, 1/20 o 1/100 para facilitar la lectura de fluorescencia. En esta modalidad, la muestra se puede diluir en solución salina, buffer fosfato, o buffer Tris-HCl. En una modalidad de la invención, la detección se puede realizar en un volumen de muestra entre 100 y 500 pL. Biological fluids that can be analyzed include, but are not limited to: saliva, cervical fluid, blood plasma, blood, and urine. In a particular embodiment of the invention, the sample can be diluted by a factor of 1/10, 1/20 or 1/100 to facilitate fluorescence reading. In this modality, the sample can be diluted in saline, phosphate buffer, or Tris-HCl buffer. In one embodiment of the invention, detection can be performed on a sample volume between 100 and 500 pL.
En el contexto de la presente invención, el ADN contenido en la muestra se desnaturaliza y se híbrida con la sonda de captura al interior del biosensor, en presencia de un buffer de formamida (pH 7, 5-8, 5) a una temperatura de reacción entre 37 a 42 °C. Luego de la unión de la sonda de captura con el ADN diana presente en la muestra y la hibridación de dicho ADN diana con la sonda reportera, ocurre la unión de las nanoesferas acopladas a la molécula tipo avidina y de las nanopartículas acopladas a una molécula tipo biotina a dichas nanoesferas, las cuales se excitan a una longitud de onda entre 605 a 655 nm en el espectro rojo con un filtro de rodamina. La señal de fluorescencia generada en este último paso se detecta en un microscopio de fluorescencia, en donde la intensidad de la señal es directamente proporcional al número de copias virales presentes en la muestra analizada. In the context of the present invention, the DNA contained in the sample is denatured and hybridized with the capture probe inside the biosensor, in the presence of a formamide buffer (pH 7.5-8.5) at a temperature of reaction between 37 to 42 °C. After the union of the capture probe with the target DNA present in the sample and the hybridization of said target DNA with the reporter probe, the union of the nanospheres coupled to the avidin-like molecule and the nanoparticles coupled to an avidin-like molecule occurs. biotin to these nanospheres, which are excited at a length of wave between 605 to 655 nm in the red spectrum with a rhodamine filter. The fluorescence signal generated in this last step is detected in a fluorescence microscope, where the intensity of the signal is directly proportional to the number of viral copies present in the analyzed sample.
El método de detección de la presente invención tiene un límite de detección de VPH entre 10 y 100.000 copias virales, con un coeficiente de variación de 4,47 % y una especificidad de 0,92. The detection method of the present invention has an HPV detection limit between 10 and 100,000 viral copies, with a coefficient of variation of 4.47% and a specificity of 0.92.
La presente invención se presenta en detalle a través de los siguientes ejemplos, los cuales son suministrados solamente con propósitos ilustrativos y no con el objetivo de limitar su alcance. The present invention is presented in detail through the following examples, which are provided for illustrative purposes only and not for the purpose of limiting its scope.
EJEMPLOS EXAMPLES
Ejemplo 1. Diseño y análisis bioinformático de las sondas de captura y las sondas reporteras Example 1. Design and bioinformatic analysis of capture probes and reporter probes
1.1 Obtención del ADN de VPH Secuencia L1 1.1 Obtaining HPV DNA Sequence L1
Se amplificó regiones específicas de los genes L1 y E6 de los genotipos VPH- 16 y VPH-18 por PCR en tiempo real utilizando los cebadores descritos en la Tabla 2. Se verificó la especificidad del producto de PCR por la generación de las curvas de fusión. Los resultados del ensayo con los cebadores GP5+/GP6+, los cuales amplifican una secuencia de aproximadamente 150 pb, demostraron la presencia de un solo pico de melting a 78°C, lo que demuestra la especificidad de los productos obtenidos con dichos cebadores (Figura 3B). Specific regions of the L1 and E6 genes of the HPV-16 and HPV-18 genotypes were amplified by real-time PCR using the primers described in Table 2. The specificity of the PCR product was verified by generating melting curves. . The results of the assay with the GP5+/GP6+ primers, which amplify a sequence of approximately 150 bp, showed the presence of a single melting peak at 78°C, which demonstrates the specificity of the products obtained with these primers (Figure 3B ).
Tabla 2. Cebadores de los genes L1 y E6 de VPH
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Table 2. HPV L1 and E6 gene primers.
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1.2 Diseño de las sondas de detección y cálculo de la temperatura de hibridación 1.2 Design of the detection probes and calculation of the hybridization temperature
Las sondas de captura y reporteras se diseñaron mediante el programa Beacon Designer 8.0 y se determinaron las temperaturas óptimas teóricas de hibridación ADN-sonda con el programa UNAfold del servidor web DINAMelt, de acuerdo con el contenido de guanina - citosina (G+C) y adenina - timina (A+T) de cada sonda para VPH-16 y VPH-18. Las secuencias evaluadas corresponden a las SEQ ID NOs: 1 y 9. The capture and reporter probes were designed using the Beacon Designer 8.0 program and the optimal theoretical DNA-probe hybridization temperatures were determined with the UNAfold program of the DINAMelt web server, according to the content of guanine - cytosine (G+C) and adenine-thymine (A+T) of each probe for HPV-16 and HPV-18. The evaluated sequences correspond to SEQ ID NOs: 1 and 9.
Adicionalmente, se realizaron emparejamientos de las secuencias con el software Malthfish para definir la estabilidad de las interacciones ADN-ADN entre la sonda y el blanco, esto mediante la evaluación del cambio de energía libre de hibridación suponiendo una estructura de sonda lineal y un sitio blanco completamente accesible (Figuras 4A y 4B). Para el genotipo VPH-16 se calculó una temperatura de hibridación óptima de 78,2° C a una concentración de sonda de 0,00001 ng/pL con una energía libre de Gibbs de -8,1, sugiriendo que a esta temperatura la hibridación ocurre de manera espontánea, mientras que para el genotipo VPH-18 se calculó una temperatura de hibridación de 82,5 °C. Posteriormente, se calcularon las temperaturas de hibridación de las sondas de captura y las sondas reporteras en presencia de formamida, solvente que se utiliza para reducir la estabilidad térmica de la doble cadena de ADN y de esta forma facilitar la hibridación a temperaturas entre 30 y 45 °C. Igualmente, se calculó la concentración de formamida necesaria para obtener eficiencias de hibridación de 1,0 (Figuras 5A y 5B), encontrándose valores de 68,2% y 71,2% para las sondas del gen L1 de VPH-16 y VPH-18, respectivamente (Tabla 3). Additionally, sequence pairings were performed with Malthfish software to define the stability of DNA-DNA interactions between probe and target, by evaluating the change in free energy of hybridization assuming a linear probe structure and target site. completely accessible (Figures 4A and 4B). For the HPV-16 genotype, an optimum hybridization temperature of 78.2°C was calculated at a probe concentration of 0.00001 ng/pL with a Gibbs free energy of -8.1, suggesting that at this temperature hybridization it occurs spontaneously, while for the HPV-18 genotype a hybridization temperature of 82.5 °C was calculated. Subsequently, the hybridization temperatures of the capture probes and the reporter probes were calculated in the presence of formamide, a solvent used to reduce the thermal stability of double-stranded DNA and thus facilitate hybridization at temperatures between 30 and 45 °C Likewise, the concentration of formamide necessary to obtain hybridization efficiencies of 1.0 was calculated (Figures 5A and 5B), finding values of 68.2% and 71.2% for the L1 gene probes of HPV-16 and HPV- 18, respectively (Table 3).
Tabla 3. Eficiencia de hibridación de la sonda para VPH-16 y VPH-18 con la secuencia blanco
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Table 3. Hybridization efficiency of the HPV-16 and HPV-18 probe with the target sequence.
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* Concentración de formamida para la desnaturalización. ** Concentración de formamida 0%. * Formamide concentration for denaturation. ** Formamide concentration 0%.
1.3 Análisis de la efectividad de hibridación de las sondas de captura v sondas reporteras 1.3 Analysis of the hybridization effectiveness of capture probes and reporter probes
A partir de la información obtenida del análisis de las condiciones de hibridación y la temperatura calculada para cada tipo viral se realizó Northern blot después de haber realizado la hibridación de cada tipo viral con el ADN blanco utilizando el buffer PerfectHybTM Plus (Sigma Aldrich), y posteriormente la hibridación se verificó por la técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH, siglas en inglés). Los resultados de microscopía de fluorescencia obtenidos con las sondas para el gen L1 de los genotipos VPH-16 y VPH-18 se observan en la Figura 6 Ay B, respectivamente. From the information obtained from the analysis of the hybridization conditions and the temperature calculated for each viral type, a Northern blot was performed after having hybridized each viral type with the target DNA using the PerfectHybTM Plus buffer (Sigma Aldrich), and Subsequently, the hybridization was verified by the fluorescent in situ hybridization (FISH) technique. The fluorescence microscopy results obtained with the probes for the L1 gene of the HPV-16 and HPV-18 genotypes are shown in Figure 6 A and B, respectively.
Ejemplo 2. Evaluación de sustratos para la funcionalización del soporte sólido Example 2. Evaluation of substrates for solid support functionalization
El vidrio es un material muy utilizado para inmovilizar ácidos nucleicos principalmente debido a su baja autofluorescencia, rigidez, bajo costo, y resistencia a altas temperaturas. En el presente caso, se emplearon cuatro sustratos de inmovilización para acoplar las moléculas de ADN en soportes de vidrio: poli-L-lisina, APTES, estreptavidina y NOS. Glass is a widely used material for immobilizing nucleic acids mainly due to its low autofluorescence, rigidity, low cost, and resistance to high temperatures. In the present case, four immobilization substrates were used to mount the DNA molecules on glass supports: poly-L-lysine, APTES, streptavidin and NOS.
Se recubrieron láminas de vidrio de microscopio con poli-L-lisina al 1% (Sigma, EUA) y posterior a la reacción de acoplamiento con diferente número de copias de VPH-18 se evaluó la unión del ADN a la superficie utilizando el colorante naranja de acridina. Se observó un aumento de la fluorescencia proporcional la concentración de la muestra, lo que sugiriere el acoplamiento del ADN a esta superficie. Sin embargo, pese a la relativa efectividad del sustrato para inmovilizar los ácidos nucleicos y a la simplicidad del proceso de funcionalización, el recubrimiento con poli-L-lisina no es fácilmente reproducible, lo cual se atribuye a sus bajos niveles de adsorción y a la baja estabilidad de la capa adsorbida, obteniendo un revestimiento de poli-L-lisina con una cobertura superficial de un grosor de aproximadamente 1 nm. Adicionalmente, esto puede conducir a un desperdicio sustancial de moléculas de poli-L-lisina de alto costo que se eliminan por lavado durante el recubrimiento y durante la posterior exposición a soluciones. Microscope glass slides were coated with 1% poly-L-lysine (Sigma, USA) and after the coupling reaction with different numbers of copies of HPV-18, the binding of DNA to the surface was evaluated using the orange dye. of acridine. An increase in fluorescence proportional to the concentration of the sample was observed, which which suggests the coupling of DNA to this surface. However, despite the relative effectiveness of the substrate to immobilize nucleic acids and the simplicity of the functionalization process, poly-L-lysine coating is not easily reproducible, which is attributed to its low levels of adsorption and low stability. of the adsorbed layer, obtaining a poly-L-lysine coating with a surface coverage of a thickness of approximately 1 nm. Additionally, this can lead to a substantial waste of expensive poly-L-lysine molecules which are washed away during coating and during subsequent exposure to solutions.
Por otra parte, la utilización de láminas de vidrio funcionalizadas con APTES permitió obtener resultados reproducibles en la inmovilización de los ácidos nucleicos. A este respecto, varios autores han demostrado que el APTES produce una capa uniforme de aminas con estabilidad química, soluble en medios acuosos sin producir uniones no específicas y suficiente longitud para eliminar interferencia estérica no deseada con el soporte. Además, el ruido de fondo de hibridación de las láminas cubiertas con aminosilano es menor que el producido por poli-L-lisina, posiblemente debido a la única capa de aminosilano que se forma sobre la superficie que favorece la unión específica al ADN. On the other hand, the use of glass plates functionalized with APTES allowed to obtain reproducible results in the immobilization of nucleic acids. In this regard, several authors have shown that APTES produces a uniform layer of amines with chemical stability, soluble in aqueous media without producing non-specific bonds and sufficient length to eliminate unwanted steric interference with the support. In addition, the hybridization background of aminosilane-coated sheets is lower than that produced by poly-L-lysine, possibly due to the unique layer of aminosilane that forms on the surface that favors specific binding to DNA.
Adicionalmente, se utilizaron láminas recubiertas con estreptavidina, SuperAvidin de Arraylt® que contienen un tratamiento de avidina altamente uniforme unido covalentemente a un sustrato de vidrio atómicamente plano, que ofrece una superficie universal de unión a biotina de alta capacidad para aplicaciones de microarreglos de ADN y proteínas. Additionally, Arraylt® SuperAvidin streptavidin-coated slides containing a highly uniform avidin treatment covalently bound to an atomically flat glass substrate were used, offering a universal high-capacity biotin-binding surface for DNA microarray applications and proteins.
Finalmente, se utilizó una superficie para la detección colorimétrica de ADN biotinilado “DNA-BIND” Corning®, la cual utiliza los espaciadores NH2C12 y puede ser leída en el espectofotómetro TECAN. Esta consta de una superficie de poliestireno que está cubierta con una capa de grupos NOS. Este acoplamiento es específico y no se ve afectado por las aminas que se unen a los anillos de adenina, guanina y citosina. Cuando las aminas primarias reaccionan con los grupos NOS a un pH alcalino, el éster comienza una sustitución nucleofílica, la amina ataca al grupo carbonilo y desplaza el grupo NOS. Finally, a surface was used for the colorimetric detection of biotinylated DNA "DNA-BIND" Corning®, which uses the NH 2 C 12 spacers and can be read in the TECAN spectrophotometer. This consists of a polystyrene surface that is covered with a layer of NOS groups. This coupling is specific and is not affected by amines that are attached to the adenine, guanine, and cytosine rings. When primary amines react with NOS groups at alkaline pH, the ester begins a nucleophilic substitution, the amine attacks the carbonyl group and displaces the NOS group.
Ejemplo 3. Evaluación de la amplificación y transducción de la señal óptica. Example 3. Evaluation of the amplification and transduction of the optical signal.
3.1 Biosensor de vidrio funcionalizado con APTES Se evaluó la capacidad de detección del biosensor de vidrio funcionalizado con APTES y utilizando para la amplificación de la señal nanoesferas de silicio acopladas a estreptavidina y Qdots conjugados a biotina (Sigma Aldrich) que al ser excitados por una longitud de onda de 655 nm generan una señal roja fluorescente. La señal óptica resultante se observó en el microscopio Zeizz acoplado a una cámara CCD con una magnificación de 20X y captura de las imágenes respectivas en el filtro de rodamina. Para los genotipos VPH-16 y VPH-18 se observaron las señales fluorescentes desde 1 hasta 100.000 copias virales, siendo la fluorescencia directamente proporcional a las copias virales (Figuras 7 A-F y 8 A-F). 3.1 Glass biosensor functionalized with APTES The detection capacity of the glass biosensor functionalized with APTES and using for the amplification of the signal silicon nanospheres coupled to streptavidin and Qdots conjugated to biotin (Sigma Aldrich) that when excited by a length 655nm waveforms generate a red fluorescent signal. The resulting optical signal was observed in the Zeizz microscope coupled to a CCD camera with a magnification of 20X and capture of the respective images in the rhodamine filter. For the HPV-16 and HPV-18 genotypes, fluorescent signals were observed from 1 to 100,000 viral copies, the fluorescence being directly proportional to the viral copies (Figures 7A-F and 8A-F).
La densidad superficial de los productos de PCR de la secuencia L1 de VPH-16 y VPH-18 que se inmovilizaron y acoplaron constituye un parámetro importante para la fase de hibridación o bioreconocimiento. Una inmovilización débil del analito produce señales débiles de hibridación, pero, una densidad alta del analito en la superficie puede disminuir la tasa de hibridación. Este fenómeno se observó en las concentraciones más altas de copias virales tanto de VPH-16 como VPH-18 (Figuras 7 F y 8 F), las cuales produjeron señales débiles de hibridación, probablemente porque la densidad del analito resultó en un obstáculo estérico del ADN inmovilizado covalentemente que impidió la entrada del oligonucleótido de ADN (sonda). En varios estudios de hibridación utilizando oligonucleótidos y productos de PCR como sondas, la superficie de cubrimiento óptima se produjo con un oligonucleótido de 157 pb a una concentración de 5 mM, lo cual corresponde a una densidad de superficie de 500 Á2 por molécula (resultados no mostrados). Oligonucleótidos más largos de 347 pb producen resultados de hibridación 30 % más bajos, sugiriendo la interferencia estérica de largos fragmentos por la densidad que producen en la superficie. 3.2 Biosensor funcionalizado con NOS The areal density of the HPV-16 and HPV-18 L1 sequence PCR products that were immobilized and coupled is an important parameter for the hybridization or biorecognition phase. A weak immobilization of the analyte produces weak hybridization signals, but a high density of the analyte on the surface can decrease the rate of hybridization. This phenomenon was observed at the highest concentrations of viral copies of both HPV-16 and HPV-18 (Figures 7F and 8F), which produced weak hybridization signals, probably because analyte density resulted in steric hindrance of the analyte. Covalently immobilized DNA that prevented entry of the DNA oligonucleotide (probe). In several hybridization studies using oligonucleotides and PCR products as probes, the optimal surface coverage occurred with a 157 bp oligonucleotide at a concentration of 5 mM, corresponding to a surface density of 500 Å 2 per molecule (results). not shown). Oligonucleotides longer than 347 bp produce 30% lower hybridization results, suggesting steric interference from long fragments due to the density they produce on the surface. 3.2 Biosensor functionalized with NOS
Además, para determinar la correlación entre la señal observada en el microscopio de fluorescencia y el número de copias virales en la muestra se evaluó la intensidad de fluorescencia generada con el ADN acoplado a la superficie NOS y posterior hibridación con la sonda de detección acoplada a FITC, la cual fue leída en el fluorómetro TECAN a una longitud de onda de excitación/emisión de 495 nm/519 nm. Se generaron gráficas a partir de los datos de intensidad de fluorescencia luego de restar la fluorescencia del buffer de hibridación, y utilizando el programa DYNAMICBIOSENSOR (Sense Marker). Se observó que la fracción de unión o hibridación del ADN con la sonda de detección aumenta con el número de copias virales, con un tiempo de detección de 20 segundos (Figura 9). In addition, to determine the correlation between the signal observed in the fluorescence microscope and the number of viral copies in the sample, the intensity of fluorescence generated with the DNA coupled to the NOS surface and subsequent hybridization with the detection probe coupled to FITC was evaluated. , which was read in the TECAN fluorometer at an excitation/emission wavelength of 495 nm/519 nm. Graphs were generated from the fluorescence intensity data after subtracting the fluorescence from the hybridization buffer, and using the DYNAMICBIOSENSOR program (Sense Marker). It was observed that the fraction of DNA binding or hybridization with the detection probe increases with the number of viral copies, with a detection time of 20 seconds (Figure 9).
3.3 Biosensor con dendrímeros 3.3 Biosensor with dendrimers
Se utilizaron los dendrímeros 8 carboxil, 1 amina (Sigma), para mejorar la amplificación de la señal. Se utilizaron las sondas de captura de SEQ ID NO: 1 y 8 las sondas reporteras de SEQ ID NO: 18 y 24 acopladas a biotina y unida al extremo amino del dendrímero, el cual tiene ocho brazos carboxilo en los cuales se ligaron otras sondas reporteras de SEQ ID NO: 18 y 24 acopladas a los Qdots. The 8-carboxyl, 1-amine dendrimers (Sigma) were used to improve signal amplification. The capture probes of SEQ ID NO: 1 and 8 were used, the reporter probes of SEQ ID NO: 18 and 24 coupled to biotin and linked to the amino end of the dendrimer, which has eight carboxyl arms in which other reporter probes were linked. of SEQ ID NO: 18 and 24 coupled to the Qdots.
Después de realizar las reacciones de acoplamiento e hibridación de las sondas, se observó la señal generada en el microscopio de fluorescencia utilizando el filtro de rodamina para determinar si los dendrímeros mejoran la señal con una y diez copias virales tanto del genotipo VPH-16 como VPH-18. Tal como se puede observar en la Figuras 10A-D, al introducir los dendrímeros en el biosensor, la señal se amplifica de manera significativa, lo que permite la detección a partir de una copia viral. After performing the coupling and hybridization reactions of the probes, the signal generated was observed in the fluorescence microscope using the rhodamine filter to determine if the dendrimers improve the signal with one and ten viral copies of both the HPV-16 and HPV genotypes. -18. As can be seen in Figures 10A-D, when the dendrimers are introduced into the biosensor, the signal is significantly amplified, which allows detection from a viral copy.
Ejemplo 4. Evaluación de la funcionalidad del biosensor con saliva fisiológica simulada Example 4. Evaluation of biosensor functionality with simulated physiological saliva
Para determinar la sensibilidad y especificidad del biosensor, se preparó saliva fisiológica simulada según lo reportado por Marques, M.R.C. et al., 2011 (Tabla 4). Igualmente, se realizaron diluciones del ADN de los genotipos VPH-16 y VPH-18 en solución salina desde 1 copia hasta 10.000 copias utilizando los plásmidos pl6Ll-GFP y pl8Ll-GFP, y ADN viral obtenido de células HeLa y SiHa con copias integradas de VPH-18 y VPH-16, respectivamente. Para la detección, se depositaron 100 a 500 pL de una mezcla de solución de plásmidos o ADN celular preparado en saliva simulada y bufFer formamida sobre la superficie del biosensor, el cual fue incubado durante 10 min a 42 °C, para posteriormente realizar la lectura de la señal obtenida con un microscopio de fluorescencia. To determine the sensitivity and specificity of the biosensor, simulated physiological saliva was prepared as reported by Marques, MRC et al., 2011 (Table 4). Likewise, DNA dilutions of the HPV-16 and HPV-18 genotypes were made in saline from 1 copy to 10,000 copies using plasmids p16L1-GFP and p18Ll-GFP, and viral DNA obtained from HeLa and SiHa cells with integrated copies of HPV-18 and HPV-16, respectively. For detection, 100 to 500 pL of a mixture of plasmid solution or cellular DNA prepared in simulated saliva and bufFer formamide were deposited on the surface of the biosensor, which was incubated for 10 min at 42 °C, for later reading. of the signal obtained with a fluorescence microscope.
Tabla 4. Composiciones de saliva simulada (adaptado de M.R.C. etal. , 2011 Table 4. Compositions of simulated saliva (adapted from M.R.C. etal., 2011
Dissolution Technol , 18(3): 15-28)
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Dissolution Technol, 18(3): 15-28)
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un biosensor para la detección óptica de virus del papiloma humano (VPH) en muestras biológicas que comprende: a) una superficie funcionalizada; b) un dendrímero; c) un espaciador; d) una sonda de captura; e) una sonda reportera; y f) una nanopartícula. 1. A biosensor for the optical detection of human papillomavirus (HPV) in biological samples comprising: a) a functionalized surface; b) a dendrimer; c) a spacer; d) a capture probe; e) a reporter probe; and f) a nanoparticle.
2. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la superficie funcionalizada se selecciona entre vidrio, papel, silicio, nitrocelulosa, oro, plata, poliestireno y grafeno. 2. The biosensor according to Claim 1, wherein the functionalized surface is selected from glass, paper, silicon, nitrocellulose, gold, silver, polystyrene and graphene.
3. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la superficie se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende amino, silano, epoxi, carboxilato, éster y biotinilados. 3. The biosensor according to Claim 1, wherein the surface is functionalized with functional groups selected from the group comprising amino, silane, epoxy, carboxylate, ester and biotinylated.
4. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el dendrímero se selecciona entre amino-funcionales, carboxi-funcionales, biotinilados, hidroxilados y pireno-funcionales. 4. The biosensor according to Claim 1, wherein the dendrimer is selected from amino-functional, carboxy-functional, biotinylated, hydroxylated and pyrene-functional.
5. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde el espaciador se selecciona entre moléculas NH2-C6.12; trietilenglicol (TEG) y hexaetilenglicol (HEG). 5. The biosensor according to Claim 1, wherein the spacer is selected from NH 2 -C 6.12 molecules; triethylene glycol (TEG) and hexaethylene glycol (HEG).
6. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la sonda de captura se selecciona entre las secuencias de nucleótidos del grupo que comprende las SEQ ID NO: 1 a 18. 6. The biosensor according to Claim 1, wherein the capture probe is selected from the nucleotide sequences of the group comprising SEQ ID NO: 1 to 18.
7. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la sonda reportera se selecciona entre las secuencias de nucleótidos del grupo que comprende las SEQ ID NO: 19 a 30. 7. The biosensor according to Claim 1, wherein the reporter probe is selected from the nucleotide sequences of the group comprising SEQ ID NO: 19 to 30.
8. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde la nanopartícula se selecciona entre un carbón dot y un quantum dot. 8. The biosensor according to Claim 1, wherein the nanoparticle is selected from a carbon dot and a quantum dot.
9. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 8, en donde el carbón dot se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, PEG terminado en biotina, amina y tiol. 9. The biosensor according to Claim 8, wherein the dot carbon is functionalized with functional groups selected from the group comprising carboxyl, biotin-terminated PEG, amine and thiol.
10. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 8, en donde el quantum dot se funcionaliza con grupos funcionales seleccionados del grupo que comprende carboxilo, ácido oleico, amina y PEG. 10. The biosensor according to Claim 8, wherein the quantum dot is functionalized with functional groups selected from the group comprising carboxyl, oleic acid, amine and PEG.
11. El biosensor de acuerdo con la Reivindicación 1, que además comprende una nanoesfera seleccionada del grupo que comprende nanoesferas de oro, plata, silicio, hierro/silicio y plata/albúmina. 11. The biosensor according to Claim 1, further comprising a nanosphere selected from the group comprising gold, silver, silicon, iron/silicon and silver/albumin nanospheres.
12. Un método de detección in vitro de VPH en una muestra biológica que comprende poner en contacto dicha muestra con un biosensor óptico, en donde el biosensor comprende una superficie funcionalizada, un dendrímero, un espaciador, una sonda de captura, una sonda reportera y una nanopartícula. 12. A method of in vitro detection of HPV in a biological sample comprising contacting said sample with an optical biosensor, wherein the biosensor comprises a functionalized surface, a dendrimer, a spacer, a capture probe, a reporter probe and a nanoparticle.
PCT/IB2022/052576 2021-03-24 2022-03-22 Biosensor for the optical detection of human papillomavirus infection in biological fluids WO2022201007A1 (en)

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