WO2022191738A1 - Противовирусное средство для лечения sars-cov-2 - Google Patents
Противовирусное средство для лечения sars-cov-2 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2022191738A1 WO2022191738A1 PCT/RU2022/000050 RU2022000050W WO2022191738A1 WO 2022191738 A1 WO2022191738 A1 WO 2022191738A1 RU 2022000050 W RU2022000050 W RU 2022000050W WO 2022191738 A1 WO2022191738 A1 WO 2022191738A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cov
- sars
- seq
- virus
- genome
- Prior art date
Links
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 title description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 116
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 66
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 39
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 16
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 16
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- YEDNBEGNKOANMB-REOHCLBHSA-N (2r)-2-amino-3-sulfanylpropanamide Chemical compound SC[C@H](N)C(N)=O YEDNBEGNKOANMB-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims abstract description 13
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 claims abstract description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 21
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 21
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 33
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 12
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 abstract description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 abstract description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 2
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 78
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 57
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 32
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 32
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 17
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 14
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- -1 miRNA Chemical class 0.000 description 7
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 4
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 4
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 4-methylpiperidine Chemical compound CC1CCNCC1 UZOFELREXGAFOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101800000120 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 description 2
- 101800000517 Leader protein Proteins 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 101150016678 RdRp gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- ZCGNOVWYSGBHAU-UHFFFAOYSA-N favipiravir Chemical compound NC(=O)C1=NC(F)=CNC1=O ZCGNOVWYSGBHAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950008454 favipiravir Drugs 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical compound C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 1,2-ethanedithiol Chemical compound SCCS VYMPLPIFKRHAAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXHNLMTVIGZXSG-UHFFFAOYSA-N 1-Methylpyrrole Chemical compound CN1C=CC=C1 OXHNLMTVIGZXSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001556 1-Phosphatidylinositol 4-Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010029190 1-Phosphatidylinositol 4-Kinase Proteins 0.000 description 1
- ZCUJYXPAKHMBAZ-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-imidazole Chemical group C1=CNC(C=2C=CC=CC=2)=N1 ZCUJYXPAKHMBAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[[4-[2-[bis(4-methylphenyl)methylamino]-2-oxoethoxy]phenyl]-(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(=O)NC(C=2C=CC(C)=CC=2)C=2C=CC(C)=CC=2)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035742 Air-borne transmission Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 101100151946 Caenorhabditis elegans sars-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150068419 ORF 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108357 ORF1/2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 102100031776 SH2 domain-containing protein 3A Human genes 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 101500023563 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 description 1
- 101000779242 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF3a protein Proteins 0.000 description 1
- 101000953879 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000005557 airborne transmission Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000009459 flexible packaging Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IKGLACJFEHSFNN-UHFFFAOYSA-N hydron;triethylazanium;trifluoride Chemical compound F.F.F.CCN(CC)CC IKGLACJFEHSFNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- ZADHKSJXSZBQFB-HHHXNRCGSA-N lipid fragment Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCC[C@@H](C)CCCCCCCC(C)C ZADHKSJXSZBQFB-HHHXNRCGSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 230000017239 negative regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно биотехнологии, вирусологии, иммунологии и фармакологии, а именно настоящее изобретение в целом относится к получению комбинированного лекарственного средства (КЛС), обладающего противовирусным эффектом в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и родственных вирусов при условии тождественности генетической мишени, против которой направлен специфический компонент данного препарата. Комбинированное лекарственное средство для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, содержит: (i) эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей, характеризующихся структурой (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT (ii) дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; K - лизин; X - SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F); С - цистеин или цистеинамид. (iii) фармацевтически приемлемое вспомогательное средство (растворитель). Изобретение обеспечивает подавление репликации вируса SARS-CoV-2, что дает новую возможность для лечения инфекции COVID19, вызываемой данным вирусом.
Description
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЕЧЕНИЯ SARS-COV-2
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно биотехнологии, вирусологии, иммунологии и фармакологии, а именно настоящее изобретение, в целом, относится к получению комбинированного лекарственного средства (КЛС), обладающего противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2 и родственных вирусов при условии тождественности генетической мишени, против которой направлен специфический компонент данного препарата. Противовирусное действие КЛС основано на механизме РНК-интерференции (РНКи) и включает специфическое распознавание геномных мишеней вируса с последующим привлечением собственных белковых комплексов клетки, разрушающих вирусный геном (и его мРНК- транскрипты) и, тем самым, нарушающих процесс воспроизводства (репликации) вируса. КЛС может применяться, как в стационаре, так и амбулаторно для подавления репликации вируса SARS-CoV-2, снижения вирусной нагрузки, снижения риска передачи инфекции воздушно-капельным путем, облегчения симптомов COVID-19, связанных с репликацией вируса и уменьшения риска развития вызванных вирусной инфекцией клинических осложнений.
Уровень техники
В декабре 2019 года в китайском городе Ухань была зафиксирована вспышка тяжелой острой респираторной инфекции COVID-19, которая в последствии приобрела характер пандемии. Этиологическим фактором этой пандемии является новый штамм коронавируса SARS-CoV-2. Вирус SARS-CoV-2 и родственные ему вирусы SARS-CoV и MERS-CoV могут вызывать тяжелые респираторные заболевания у людей и возникли в результате трансвидового перехода от животных к человеку.
SARS-CoV-2, так же, как вирусы SARS-CoV и MERS-CoV, относится к семейству Coronaviridae, роду Beta-coronavirus. В целом коронавирусы - это оболочечные вирусы, имеющие относительно большой (около 30 000 оснований) несегментированный геном, представленный одноцепочечной (+)РНК. Геномная (+)РНК коронавирусов непосредственно служит матрицей для трансляции вирусных белков. В отличие от многих других РНК-вирусов, геномная РНК коронавирусов по общей структуре схожа с клеточной мРНК: имеет кэп-структу ру на 5'-конце и полиадениловый хвост на З'-конце.
После входа вируса в клетку на матрице геномной (+)РНК вируса транслируется вирусная репликаза (РНК-зависимая РНК-полимераза), которая синтезирует (-)РНК, комплементарную геномной РНК. В состав вирусного репликазного комплекса входят экзонуклеазы, исправляющие ошибки РНК-полимеразы (proofreading activity), в связи с чем частота мутаций в геноме коронавирусов сравнительно невелика. На матрице (-)РНК та же репликаза синтезирует новые копии геномной (+) РНК, которые включаются в новые вирионы, а также более короткие субгеномные (+)РНК, служащие матрицами для трансляции вирусных белков.
В рамках борьбы с новой инфекцией был разработан ряд профилактических вакцин, а также средств неспецифической терапии, облегчающих течение заболевания. Однако в дополнение к существующим средствам терапии необходимы специфические препараты, оказывающие непосредственное действие на вирус, приводящие к облегчению симптомов заболевания, ускоренному разрешению заболевания, блокированию передачи инфекции и уменьшению риска развития клинических осложнений.
В настоящее время в патентной литературе имеются данные об успешном применении малых интерферирующих РНК (миРНК) в отношении инфекций, вызванных различными вирусами, в том числе коронавирусами.
В патенте CN101173275В (07.05.2008) описано изобретение, представляющее собой две двуцепочечные молекулы РНК (дцРНК), направленные к двум отдельным участкам вирусной РНК, кодирующем белок М вируса атипичной пневмонии -1 (SARS- CoV-1). Одна из молекул миРНК направлена к участку с координатами 220-241 вирусной РНК, кодирующей М-белок SARS, тогда как вторая к участку 460-480. Комбинация этих двух молекул миРНК подавляла экспрессию вирусных генов более чем на 70%.
В документе CN1648249A (03.08.2005) описываются последовательности миРНК, сконструированные для подавления экспрессии генов М, N, и Е вируса SARS-CoV-1. Показано, что три из них (Rs 15, 58 и 90) ингибируют экспрессию белков слияния GFP-M, GFP-N и GFP-E, соответственно. Еще три молекулы миРНК N°8*, 51* и 56*) содержали модификацию на 3’ конце смысловой цепи. Эти модифицированные миРНК более эффективно ингибировали экспрессию генов вируса SARS-CoV-I по сравнению с оригинальными миРНК.
В документе US20050004063A1 (06.01.2005) раскрыты шесть молекул миРНК (SARSi-1-б), направленных к области генома, кодирующей репликазу 1А вируса SARS- CoV-1. Показано, что самой эффективной была миРНК SARSi-4 (5 - gcacuugucuaccuugaugtt-3 '). Кроме того, в этом патенте описаны миРНК (SARSi-7-ll)
направленные на область генома, кодирующую гены S, Е, N и М вируса SARS-CoV-1. Авторы показали, что SARSi-2, SARSi-3, SARSi-4 и SARSi-7-ll ингибировали репликацию коронавируса SARS-CoV-I в культуре клеток FRhk-4. Самой эффективной оказалась миРНК SARSi-4, которая практически полностью ингибировала репликацию вируса. За ней следовали SARSi-2 и SARSi-3.
Также известны последовательности миРНК, сконструированные для подавления экспрессии генов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу, хеликазу, нуклеопротеин N и протеолитические ферменты вируса SARS-CoV-1. Эти миРНК ингибировали репликацию штамма BJ01 коронавируса SARS-CoV-I на 50-90%. При этом самыми эффективными были миРНК, направленные к генам, кодирующим протеолитические ферменты (CN1569233A, 26.01.2005). Раскрыты последовательности трех молекул миРНК, направленных к гену, кодирующему ORF3a вируса SARS-CoV-1 (CN101085986B, 12.12. 2007). Этот ген играет важную роль в репликации вируса поэтому сконструированные молекулы миРНК эффективно подавляют репликацию вируса.
Эффективность 62 молекул миРНК (способность ингибировать репликацию SARS- CoV-1), направленных к разным участкам генома вируса SARS-CoV-I, была протестирована в культуре клеток Vero и/или FRhk-4 (US20070270360A1, 22.11.2007).
В документе CN101182517A (21.05.2008) описывается смесь молекул миРНК, направленных к разным мишеням. В частности, к участку генома вируса SARS-CoV-1, кодирующему белок Spike (5'-AAGCTCCTAATTACACTCAAC-3’), белок nsp-9 (5 - AAGGATGAGGAAGGCAATTTA-3'), nsp-10 (5'-AAGGATAAGTCAGCTCAATGC-3') и nsp-13 (5'-ACTGGCACACTACTTGTCGA-3'). Эффективность смеси миРНК тестировали в культуре клеток FRhK-4, зараженной вирусом SARS-CoV-1.
Известно исследование, которое проводили на макаках-резусах, инфицированных SARS-CoV-1. Смесь препаратов миРНК вводили в количестве 30мг (5% растворе глюкозы) на животное (US2007/0203082A, 30.08.2007)
В документе W02004092383A2 (10.02.2005) изобретение включает в себя несколько типов нуклеиновых кислот, такие как: миРНК, микро-РНК (miRNA) и короткие шпилечные РНК (shR A), а также способы, используемые для модуляции экспрессии РНК вируса SARS-CoV-1. Аналогичные изобретения описаны в патенте US20040192626 А 1 (30.09.2004) и в патенте US20050020525A1 (27.01.2005). Отличие от разрабатываемого препарата заключается в том, что в его состав которого входят только миРНК, ингибирующие репродукцию SARS-CoV-2.
Патент CN102453712B (19.02.2014) описывает изобретение на основе миРНК для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-1 посредством молекул миРНК, направленных к гену хозяина, кодирующему PI4KB (phosphatidylinositol 4-kinase IIIb). Этот фермент опосредует проникновение вируса в клетку. В отличие от разрабатываемого препарата, миРНК, описанные в патенте N° CN102453712B направлены не к вирусному геному, а к геному клетки-хозяина.
Патент US7339051B2 (04.03.2008) описывает олигомерные соединения, состоящие из 8-80 азотистых оснований, направленных к геному SARS-CoV-1. Эти соединения гибридизуются с вирусной нуклеиновой кислотой и снижают репликацию SARS-CoV-I не менее чем на 50%. Они направлены на рамки считывания генома вируса SARS-CoV-I и при гибридизации с вирусной РНК регулируют процесс рибосомального сдвига рамки считывания. В отличие от разрабатываемого препарата в патенте М° US7339051B2 описываются антисмысловые РНК и рибозимы.
Наиболее близкими по техническому решению являются изобретения CN111139241 А от 12.05.2020 и CN111139242A от 12.05.2020, раскрывающие малые интерферирующие нуклеиновые кислоты для ингибирования нового штамма коронавируса SARS-CoV-2. Отличием заявленного средства является новый, ранее не описанный состав молекул миРНК, направленных против генома SARS-CoV-2 в участках, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRP), лидерный протеин (nspl) и ген N, которые ингибируют репликацию этого вируса.
Однако следует отметить, что внедрение в клиническую практику препаратов на основе миРНК ограничивается рядом факторов, к которым относятся недостаточная эффективность и безопасность средств доставки миРНК в клетки-мишени. Кроме того, важное ограничение заключается в необходимости контроля специфичности используемых миРНК и снижения неспецифического влияния миРНК на активность других генов в том числе генов в геноме человека.
Известно, что миРНК можно доставлять в клетки млекопитающих в экспериментах in vitro и in vivo множеством способов, известных специалистам в этой области, включая непосредственный контакт с клетками ("депротеинизированная" миРНК) или использование комбинации с одним или несколькими средствами.
В настоящее время известны изобретения для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот (НК), в т. ч. миРНК, путем трансфекции, на основе на основе липидов, полимеров, катионных пептидов. Наиболее перспективными среди них являются дендримерные катионные пептиды (ДКП). ДКП представляют собой разветвленные
трехмерные структуры с плотным гидрофобным ядром и внешним слоем положительно- заряженных групп (например, амино- или гуанидиновая группы). Наличие большого количества концевых катионных групп позволяет ДКП эффективно связывать и конденсировать НК. Применение ДКП для трансфекции в значительной степени снимает проблему протеолитической устойчивости ввиду того, что они содержат неприродные e- амидные связи, недоступные для природных ферментов.
Многие методы получения комплексов дендримеров с миРНК и плазмидами и протоколы их доставки в клетки широко опубликованы, но в большинстве источников в качестве дендримерной основы используются дендримерные производные диамино- этана/пропана/бутана, которые не имеют определенной структуры и неспособны к биодеструкции (Например, в патенте PCT/GB02/04706 от 24.04.2003 “Dendrimers for use in targeted delivery”).
В патенте US 6376248 от 23.04.2002 "Peptide-enhanced transfections» описаны многочисленные композиции для трансфекции клеток эукариот, включающие комплексы НК с пептидами, где нуклеиновая кислота связана ковалентно с линейным катионным ТАТ-пептидом (из ВИЧ), дендримером или липопептидом. Указанные в документе дендримеры являются производными непептидного дендримера РАМАМ (от компании Dendritech Inc.), к концевым группам которого, присоединены остатки лизина (LysDmer) или аргинина (ArgDmer). Однако известное решение обладает повышенной токсичностью, сложностью в получении, имеет ограниченный срок хранения.
Известна публикация [1], где описывается использование ДКП, вариант полилизинового дендримера, где в терминальные ветви дендримера вводят фенил- имидазольные остатки для повышения амфипатичности молекулы. Наибольшая эффективность в плане защиты НК (на примере плазмидной ДНК) от деградации нуклеазами была получена с помощью полилизинового дендримера, имеющего степень ветвления 5 (генерации G5), этот же препарат, единственный, проявлял приемлемую трансфекционную эффективность. В другой работе этих же авторов [2] дендримеры с генерацией G5, с концевыми остатками аргинина, показывали высокую эффективность в отношении трансфекции клеток плазмидной ДНК и последующей экспрессии гена GFP (зеленый флуоресцирующий белок) или pGL3 (люциферазы). Дендример с генерацией G6 хотя и был также эффективен, но оказался намного более токсичен, вероятно из-за высокой плотности положительного заряда. Необходимо отметить, что выход при синтезе таких дендримеров довольно низкий и препараты не были использованы для подавления экспрессии генов (с помощью РНКи).
Патент CN102911252В от 06.02.2013 “Cationic lipid containing peptide dendrimer, transgenic earner and preparation method and application of transgenic carrier” описывает соединения, как носители для внутриклеточной доставки плазмид, содержащих гены GFP или pGL3. Структура описываемых носителей сдержит короткий аргинин-содержащий дендример с липидным фрагментом, содержащим холестерин. Однако, трансфекция в формате РНК-интерференции (миРНК) в патенте не приводится.
В патенте RU 2575603 от 20.02.2016 (РСТ: ЕР 2011/003719) «Получение комплексов нуклеиновых кислот и поперечно-сшитых дисульфидными связями катионных компонентов, предназначенных для трансфекции и стимуляции» авторы предлагают применять композицию, содержащую полимерный носитель и молекулу- переносчик, в качестве иммуностимулирующего агента или адъюванта. В том числе заявлены олигопептиды и белки с общей формулой (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Om)0;(Xaa)x, однако авторы не указывают, линейные ли это пептиды или дендримеры. В качестве НК используют одноцепочечную РНК с целью индукции врожденного или адаптивного иммунитета.
В статье [3] описываются ДКП с генерацией G3 для трансфекции клеток молекулами миРНК. Дендримерные пептиды на основе лизина содержат гидрофобный участок, представленный либо гидрофобными аминокислотами, либо жирными кислотами для того, чтобы более эффективно выходить из эндосомы в цитоплазму после интернализации клетки комплексом НК/пептид. Среди них наиболее активные в ми-РНК- трансфекции ДКП были: (KL)8(KKL)4(KLL)2KK(C16)K(Ci6) и (KL)8(KXL)4(KLL)2KLLLL), Однако, нужно подчеркнуть, что синтез и очистка таких пептидов (длина 37 и 39 аминокислот + жирные кислоты) довольно сложная и крайне дорогостоящая процедура (сделанная вручную), в результате, выходы были очень низкие (менее 10 процентов).
В статье [4] описано применение полилизиновых дендримеров содержащих более 40 остатков лизина для улучшенной доставки ДНК (плазмиды) в клетки в качестве средств для противоопухолевой терапии, указывается высокая скорость и эффективность трансфекции, а также относительно малая токсичность для здоровой ткани. Их применение для РНКи не описано. Очевидно, ввиду высокой молекулярной массы выходы пептидов при твердофазном синтезе были очень низкие.
Дендримерный пептид ЛТП, описанный в патенте RU 2572575 С1 от 20.01.2016, обладающий трансфекционной активностью при образовании комплексов с НК, низкой токсичностью в отношении клеток млекопитающих. Однако по сравнению с
липосомальным средством доставки для in vitro исследований Lipofectamine®2000, ЛТП имеет трансфекционную активность на 2-3 порядка ниже.
Таким образом, в настоящее время существует острая необходимость в разработке нового противовирусного средства, эффективного в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2. Одним из путей достижения этой цели является создание КЛС специфического противовирусного действия, подавляющего воспроизводство вируса по механизму РНКи.
В состав КЛС по настоящему изобретению входит ДКП, осуществляющий доставку миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, внутрь клетки. ДКП образует комплексы с отрицательно заряженными миРНК и конденсирует их в компактные наноструктуры, и это, с одной стороны, обеспечивает защиту миРНК от действия нуклеаз, а с другой, способствует их транслокации через клеточные мембраны за счет эндоцитоза. В составе КЛС ДКП находится в избытке, обеспечивая суммарный положительный заряд всего комплекса, что повышает эффективность его проникновения в клетки, т.к. поверхность клетки обычно несет отрицательный заряд.
Краткое содержание изобретения
Настоящее изобретение в целом обеспечивает новое лечение состояний и нарушений, связанных с симптомами COVID-19.
Целью, лежащей в основе данного изобретения, является получение нового этиотропного противовирусного средства, обладающего высокой эффективностью в отношении SARS-CoV-2.
Решение этой проблемы обеспечено получением комбинированного лекарственного средства с созданными молекулами миРНК, способными опосредовать мишень-специфические подавление репликации вируса SARS-CoV-2 за счет механизма РНКи, и ДКП, обладающего повышенной трансфекционной активностью и выступающего в роли носителя для молекул миРНК.
В общем варианте осуществления КЛС для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, содержит: (i) эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 - SEQ ID NO 33, или содержащих модификацию LNA в одной или нескольких позициях смысловой и антисмысловой цепи указанных последовательностей, (ii) дендримерный катионный
пептид (KK-46), обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурной формулой R.8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - 5 аминокислот в любом порядке, где аминокислоты представляют собой: триптофан (W), лейцин (L), изолейцин (I), треонин (Т), валин (V), пролин (Р), глутаминовую кислоту (Е); Н - гистидин; Z - гидрофобный аминокислотный остаток, содержащий аланин (А) или фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид, (Ш) фармацевтически приемлемое вспомогательное средство (растворитель).
Эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS- CoV-2 также представлено в виде двух комплементарных цепей структуры (+G)G AAGG AAGUU CU GUU G A A(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где знаком «+» отмечены LNA- модифицированные нуклеотиды, a dT - обозначен дезокситимидин.
Эффективное количество дендримерного катионного пептида, обладающего трансфекционной активностью содержит линейный участок аминокислотных остатков, представленный последовательностью SEQ ID NO 3.
КЛС (siRk-12-EM/KK-46) по настоящему изобретению содержит: (i) эффективное количество молекул миРНК (siRk-12-EM), направленных против генома вируса SARS- CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей, характеризующихся структурой (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где модифицированные нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепи представлены модификацией LNA (ii) ДКП, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид.
Эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS- CoV-2, в составе КЛС составляет от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 1 мкг до 100 мг, в особенности от 10 мкг до 10 мг и катионного дендримерного пептида от 1 мкг до 10 г, предпочтительно от 10 мкг до 1 г, в особенности от 1 мг до 100 мг.
Комбинированное лекарственное средство предназначено для ингаляционного или интраназального введения.
Способ лечения профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, включает введение в организм млекопитающих заявленного КЛС в эффективном количестве. Комбинированное лекарственное средство вводится
одновременно, отдельно или последовательно с другими терапевтическими средствами. При этом способ лечения включает ингаляционное или интраназальное введение КЛС.
Набор для получения комбинированного лекарственного средства содержит по меньшей сере два контейнера, где первый контейнер содержит компонент (А): эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS- CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 - SEQ ID NO 33, ил содержащих модификацию LNA в одной или нескольких позициях смысловой и антисмысловой цепи указанных последовательностей, второй контейнер содержит компонент (Б): дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурной формулой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - 5 аминокислот в любом порядке, где аминокислоты представляют собой: триптофан (W), лейцин (L), изолейцин (I), треонин (Т), валин (V), пролин (Р), глутаминовую кислоту (Е); Н - гистидин; Z - гидрофобный аминокислотный остаток, содержащий аланин (А) или фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинами д, и инструкцию по применению.
Набор дополнительно содержит один или несколько контейнеров с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. В наборе компонент (А) и компонент (Б) находятся в лиофилизированной форме.
В одном варианте осуществления изобретения набор содержит компонент (А), где эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS- CoV-2, представлено в виде двух комплементарных цепей, характеризующихся структурой (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где модифицированные нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепи представлены модификацией LNA. Компонент (В) представляет собой катионный дендримерный пептид со структурной формулой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F);C -цистеин или цистеинамид, в виде биосовместимой соли или основания.
Технический результат заключается в создании эффективного противовирусного средства, обеспечивающего подавление репликации вируса SARS-CoV-2 и безопасную его доставку в клетки-мишени.
Указанный технический результат достигается тем, что синтетические миРНК представляющие собой дуплексы комплементарных одноцепочечных РНК с
нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 или в вариантах осуществления последовательностями SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO:33 специфически воздействуют на один или несколько участков в геноме вируса SARS-CoV-2 или на мРНК-транскрипты вируса. Технический результат по настоящему изобретению достигается тем, что созданы синтетические миРНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, где указанные миРНК направлены против региона в геноме SARS-CoV- 2, кодирующего RdRp.
Также указанный технический результат достигается тем, что создано КЛС, содержащее модифицированные синтетические миРНК структуры (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где знаком «+» отмечены LNA- модифицированные нуклеотиды, a dT - обозначен дезокситимидин, где указанные миРНК осуществляют более эффективное блокирование репликативного цикла вируса по сравнению с не модифицированными миРНК. При этом модификация молекулы миРНК нуклеотидами LNA приводит к увеличению резистентности миРНК к воздействию нуклеаз с сохранением антивирусного эффекта, что в итоге обеспечивает пролонгированный противовирусный эффект.
Также указанный технический результат достигается тем, что обеспечивается эффективная и безопасная доставка полученных синтетических миРНК с помощью ДКП, обладающего трансфекционной активностью, обеспечивающего суммарный положительный заряд всего комплекса, что повышает эффективность его проникновения в клетки и характеризующегося структурой R K X K H KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид, что позволяет проводить противовирусную терапию на основе механизма РНКи.
Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами.
Краткое описание графических материалов.
ФИГ. 1. Схематическое изображение генома вируса SARS-CoV-2 с указанием мишеней, против которых направлены миРНК по настоящему изобретению и его вариантах (nspl — лидерный протеин, RdRp - РНК-полимераза, N - нуклеопротеин).
ФИГ. 2. Схематическое изображение механизма биологического эффекта препаратов на основе молекул миРНК, направленных против геномных мишеней коронавирусов.
ФИГ. 3. Модифицированная миРНК обладает повышенной устойчивостью к деградации нуклеазами: а) Стабильность немодифицированной siRk-12 (круглый маркер) и модифицированной siRk-12-EM (квадратный маркер) в 50% сыворотке мыши сравнивали в течение 264 ч при 37°С (N=4). b) Для этого аликвоты каждого образца (3 мкг миРНК на дорожку геля) анализировали методом 1.5% агарозного гель-электрофореза. Количество миРНК в различных временных точках рассчитывалось методом анализа электрофореграмм с использованием программного обеспечения ImageLab (BioRad); Различия между несколькими группами анализировали методом ANOVA с тестом Даннетса.
ФИГ. 4. Плазмидные конструкции и положение участков связывания молекул миРНК в геноме SARS-CoV-2. Схема бицистронной экспрессионной плазмиды, кодирующей люциферазу светлячков (Luc) и полноразмерный фермент RdRp (pVAXl-pRdRp-full-IRES- LUC) (a) Nspl (pVAXl-LP-IRES-LUC) (b), или N (pVAXl-N-IRES-LUC) (c), d) позиции участков связывания молекул миРНК в геноме SARS-CoV-2. Отмечена область гена ORF1 (nspl -лидерный белок), на которую создана ОТ-ПЦР-РВ тест-система для количественной детекции вирусной нагрузки в клетках.
ФИГ. 5. Противовирусный эффект молекул миРНК в экспериментах in vitro на модели с использованием рекомбинантных плазмид. Клетки Нер-2 трансфецировали каждой из плазмид, кодирующих гены SARS-CoV-2, и ген люциферазы светлячка (pVAXl-pRdRp- full-IRES-LUC) (a), pVAXl-N-IRES-LUC (b) или pVAX-LP-IRES-LUC (с) с последующей трансфекцией специфической, направленной против генома SARS-CoV-2 или контрольной миРНК. В качестве положительного и отрицательного контроля использовали миРНК, направленные против гена люциферазы (siLuc) и гена флуоресцентного белка GFP (siGFP). Lipofectamine3000 использовался в качестве средства доставки плазмид и миРНК. Спустя 24 часа клетки были собраны, лизированы и в лизатах была оценена активность люциферазы. Данные выражены в виде относительных единиц люминесценции (RLU) на 10 тыс. клеток. Различия между несколькими группами были оценены с помощью теста Краскела-Уоллиса с последующим использованием (при необходимости) непарного U-теста Манна-Уитни. На диаграмме показаны медианы пяти независимых экспериментов ± SD.
ФИГ. 6. Противовирусный эффект молекул миРНК в экспериментах in vitro на модели инфекции клеток Vero Е6 вирусом SARS-CoV-2. Клетки Vero Е6 трансфецировали комплексами миРНК/Lipofectamine 3000. Среда с комплексами была удалена через четыре
И
часа после трансфекции и клетки были инфицированы SARS-CoV-2 при MOI = 0,0001. Вирусную нагрузку определяли методом ОТ-ПЦР-РВ. Результаты выражены в виде количества копий РНК вируса на мл. Различия между несколькими группами оценивали с помощью теста Краскела-Уоллиса с последующим использованием (при необходимости) непарного U-теста Манна-Уитни. На диаграмме показаны медианы пяти независимых экспериментов ± SD.
ФИГ. 7. Ингибирование репликации SARS-CoV-2 в экспериментах in vitro комплексами, состоящими из ^модифицированных или LNA-модифицированных миРНК (siRk-12 и siRk-12-EM) и ДКП КК-46. Клетки Vero Е6 трансфецировали комплексами siRk-12/KK-46 или siRk-12-EM/K-46 в трех концентрациях (ось х). Среды с комплексами удаляли через четыре часа после трансфекции, и клетки заражали SARS-CoV-2 при MOI = 0,0001. Через 48 часов супернатанты и клетки были собраны. Вирусную нагрузку определяли методом ОТ-ПЦР-РВ в лизатах клеток (а) и супернатантах клеток (Ь). Результаты выражены в виде копий вирусной РНК на мл. Различия между несколькими группами были оценены с помощью теста Краскела-Уоллиса с последующим использованием (при необходимости) непарного U-теста Манна-Уитни. На диаграмме показаны медианы пяти независимых экспериментов ± SD.
ФИГ. 8. Оценка трансфекционной активности ДКП КК-46 на клетках Vero С1008 (Е6), НЕК293, А549, HepG2, ФЭЧ, HeLa. Клетки трансфецировали с помощью ДКП в 3 разведениях (с массовыми соотношениями пептида к НК - 50:1, 25:1 и 12,5:1) в комплексе с плазмидой pGL3 Luciferase Reporter Vector (0,3 мкг). В качестве положительного контроля использовали коммерческий трансфекционный агент Lipofectamine2000 (Lf) в комплексе с pGL3. В качестве отрицательного контроля использовали плазмиду pGL3 без носителя (Р1). Данные выражены в относительных единицах люминесценции (RLU). Различия между несколькими группами проанализированы с помощью критерия Стьюдента с использованием программы Statistica 8.0. На диаграмме показаны медианы пяти независимых экспериментов.
ФИГ. 9. Химическая схема синтеза ДКП КК-46.
ФИГ. 10. Трасфекционные свойства ДКП КК-46. Клетки Нер-2 трансфецировали комплексами pGL3 Luciferase Reporter Vector (0,25 мкг) и ДКП КК-46 (ось х) в различных массовых соотношениях 100:1, 50:1, 25:1, 20:1,12,5:1,5:1. Проведена оценка активности люциферазы через сутки после трансфекции. В качестве положительного контроля использовали комплекс pGL3/Lipofectamin3000. Данные выражены в относительных
единицах люминесценции (RLU). Различия между несколькими группами были проанализированы методом ANOVA с использованием теста Тьюки. На диаграмме показаны медианы пяти независимых экспериментов. *Р<0.05, **Р<0.01.
ФИГ. 11. Дозозависимое ингибирование репликации SARS-CoV-2 в легких хомячков после ингаляционного введения КЛС siRk-12-EM/KK-46, состоящего из модифицированных молекул миРНК (siRk-12-EM) и ДКП КК-46 в экспериментах in vivo. Сирийских хомячков заражали SARS-CoV-2 в дозе 105 БОЕ на животное и обрабатывали тремя дозами КЛС siRk-12-EM/KK-46 (0,7, 1,96 и 5,6 мг/кг). Ингаляции с комплексами повторялись ежедневно в течение шести суток. Через два и шесть дней после инфицирования животных забивали и проводили определение вирусного титра (а) и макроскопическую оценку плюс оценку гистопатологии (б) в легких. Гидроксихлорохин назначали per os (в течение 1 часа после инфицирования доза 3,8 мг/животное, а затем ежедневно в течение 6 дней после инфицирования 1,5 мг/животное). Результаты выражены в виде БОЕ на мл (а) или баллов (б), полученных для гистологического анализа патологических изменений в легких хомяков; с) кривая "доза-ответ" по титру вируса в легких на шестой день после инфицирования, где ED50 составляет ~ 3.453 мг/кг. Различия между несколькими группами были оценены с помощью теста Краскела- Уоллиса с последующим тестированием с использованием непарного U-теста Манна- Уитни. На диаграмме указаны медианы одного эксперимента (пять животных на группу) ± SDs.
ФИГ. 12. Влияние многократных ингаляционных введений КЛС siRk-12-EM/KK-46 (содержащего модифицированные молекулы миРНК siRk-12-EM и ДКП КК-46) в низких дозах у сирийских хомячков. Сирийские хомячки были инфицированы SARS-CoV-2 в дозе 105 БОЕ/животное и подвергнуты аэрозольной обработке различными дозами препарата (0,175, 0,35 и 1,0 мг/кг) дважды в сутки с интервалом в два часа. Таким образом суточная доза препарата составила 0,35, 0,7 и 2 мг/кг. Через два и шесть дней после инфицирования животных забивали, анализировали вирусные титры (а) и проводили макроскопическую оценку и оценку гистопатологических повреждений (б) в легком. Фавипиравир назначали per os (через 1 час после инфицирования дозу 1 ,2 мг на животное вводили дважды в сутки, а затем ежедневно в течение 6 дней после инфицирования 0,4 мг на животное дважды в сутки). Результаты выражены в виде БОЕ на мл (а) или баллов (б), полученных для гистологического анализа патологических изменений в легких. Различия между несколькими группами были оценены с помощью теста Краскела-У оллиса с
последующим тестированием с использованием непарного U-теста Манна-Уитни. На диаграмме указаны медианы одного эксперимента (пять животных на группу) ± SDs.
Подробное описание изобретения
Варианты КЛС, предусмотренные в данном документе, включают без ограничения фармацевтические композиции по данному изобретению. Выражение «фармацевтическая композиция» относится к составу композиции с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами, обычно приемлемыми в данной области техники для доставки соединения или лекарственного средства млекопитающему, например, человеку.
«Фармацевтически приемлемый» относится к тем соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые в пределах обоснованного медицинского суждения подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или осложнения.
Фармацевтические лекарственные формы могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое в данном контексте включает, но не ограничивается ими, любые растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие носители, дисперсионные или суспензионные добавки, поверхностно-активные агенты, изотонические агенты, загустители или эмульгаторы, консерванты и т.п., в соответствии с конкретной требуемой лекарственной формой.
Соответственно, лекарственные формы согласно настоящему изобретению могут содержать одно или более вспомогательных веществ, каждое в количестве, которое может увеличивать стабильность миРНК, увеличивать клеточную трансфекцию миРНК.
Лекарственные формы фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, могут быть получены любым известным способом. В целом, такие способы получения включают стадию взаимодействия активного ингредиента с вспомогательным веществом и/или одним или более вспомогательными ингредиентами.
В конкретных вариантах осуществления предусмотренная в данном документе фармацевтическая композиция составлена таким образом, чтобы содержащиеся в ней активные ингредиенты были биодоступными после введения композиции субъекту. В вариантах осуществления фармацевтические композиции могут быть получены путем комбинирования молекул миРНК и ДКП с соответствующим фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом и могут быть
составлены в виде препаратов в твердой форме (лиофилизированной форме) или жидкости. Однако, в определенных вариантах осуществления указанные соединения могут быть растворены или суспендированы в стерильной воде, физиологическом растворе, фосфатном буферном растворе или любом другом растворителе, призванном обеспечить физиологические условия для функционирования КЛС.
КЛС настоящего изобретения может быть произведено в лекарственной форме, предназначенной для ингаляционного введения. В одном из воплощений настоящего изобретения твердая лекарственная форма (лиофилизат) растворяется или диспергируется в жидкой среде перед применением и полученная суспензия, эмульсия, или раствор вводится ингаляционно. Процедуру ингаляции осуществляют в течение 5-20 минут с использованием небулайзера.
Такие фармацевтические составы можно получать, упаковывать в качестве лиофилизатов, растворов и/или суспензий, необязательно стерильных, содержащих активные ингредиенты, и их можно удобным образом вводить с использованием любого устройства для распыления и/или пульверизации.
Такие составы, кроме того, могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но не ограничиваясь ими, вкусовую добавку, такую как сахарин натрий, летучее масло, буферное вещество, поверхностно-активное вещество и/или консервант.
Составы, описанные в настоящем описании в качестве пригодных для внутрилегочной доставки, пригодны также для интраназальной доставки фармацевтической композиции и могут быть произведены в виде назальных капель или назального спрея.
Составы, пригодные для ингаляционного или назального введения могут содержать, например, от приблизительно только 0,1% (масс./масс.) и вплоть до 100% (масс./масс.) активного ингредиента, и могут содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, указанных в настоящем описании.
Согласно настоящему изобретению, КЛС может быть использовано для профилактики или лечения COVID-19, вызываемой SARS-CoV-2.
Термин "лечение" относится к частичному или полному снижению, облегчению, улучшению, ослаблению, отсрочке возникновения, ингибированию прогрессирования, снижению тяжести и/или уменьшению частоты возникновения одного или более симптомов или признаков конкретной инфекции, заболевания, расстройства и/или патологического состояния. Лечение может быть введено субъекту, не проявляющему
признаков заболевания, инфекции, расстройства и/или патологического состояния, и/или субъекту, демонстрирующему лишь ранние признаки заболевания, инфекции, расстройства и/или патологического состояния для снижения риска развития патологии, связанной с заболеванием, инфекцией, расстройством и/или патологическим состоянием.
Особый интерес представляет лечение существующего заболевания, когда лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы пациента.
Используемая в данном документе фраза «улучшение по меньшей мере одного симптома» относится к уменьшению одного или более симптомов заболевания или состояния, от которого субъект получает лечение.
КЛС может быть введено на ранней стадии инфекции во время инкубационной фазы, или во время активной инфекции после возникновения симптомов.
В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению миРНК в составе КЛС могут быть введены в терапевтически эффективном количестве, а также с другими профилактическими или терапевтическими соединениями.
В данном контексте термин "терапевтически эффективное количество" означает количество агента, подлежащего доставке (например, миРНК), которое является достаточным при введении субъекту, страдающему от инфекции, заболевания, расстройства и/или патологического состояния или предрасположенному к ним, с целью лечения, улучшения симптомов, предупреждения и/или отсрочки возникновения инфекции, заболевания, расстройства и/или патологического состояния.
«Терапевтически эффективное количество» может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума и средство для получения желаемого ответа у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также относится к такому, при котором любые токсичные или вредные эффекты средства перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.
КЛС вводится одновременно, отдельно, последовательно с другими терапевтическими средствами, или в комбинации с другими известными методами лечения вирусной инфекции, в частности в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2 или родственных вирусов при условии тождественности генетической мишени, против которой направлено КЛС. Такие терапевтические средства могут быть приняты в данной области в качестве стандартного лечения для конкретного состояния, описываемого в данном документе, такого как COVID-19.
Молекулы миРНК по настоящему изобретению можно получать общепринятыми способами в этой области, включающими химический синтез или экспрессию
нуклеиновой кислоты in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления миРНК получают с использованием твердофазного химического синтеза.
Молекулы миРНК по изобретению являются двухцепочечными и содержат 21 (в ^модифицированном исполнении SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29) или 22 (в модифицированном исполнении SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) пары оснований.
Эффективное количество молекул малых интерферирующих РНК представляет собой количество, необходимое для осуществления по меньшей мере 25% снижения параметра, например, ингибирования репликации генов коронавируса. Диапазон эффективного количества миРНК составляет 0,001-5,0 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления “супрессия”, или “сайленсинг”, или “ингибирование” используются взаимозаменяемо для обозначения понижающей регуляции экспрессии продукта последовательности-мишени относительно ее нормального уровня экспрессии в организме дикого типа. Супрессия включает экспрессию, которая уменьшается на примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% относительно уровня экспрессии дикого типа.
В определенных вариантах осуществления композиция может уменьшать уровень экспрессии в клетке на приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 100% по сравнению с клеткой, которая не контактировала с данной композицией.
Используемые в данном документе термины «снижение» или «понижение» или «уменьшение» или «сокращение» или «ослабление» относятся в целом к способности предусматриваемых композиций производить или вызывать меньший физиологический ответ по сравнению с ответом, вызываемым контрольной молекулой/композицией, например
«Уменьшенный» или «сниженный» ответ обычно является «статистически значимым» ответом и может включать уменьшение в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз.
В основных вариантах осуществления нуклеотиды в одном или нескольких (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22) положениях
независимо в одной или обеих цепях молекулы миРНК являются модифицированными, что не приводит к изменению свойства специфического нацеливания на геном вируса.
В другом варианте данного изобретения молекула миРНК может содержать по меньшей мере один модифицированный аналог нуклеотида. Аналоги нуклеотидов могут быть локализованы в положениях, которые по существу не определяют мишень- специфическую активность, например, опосредующую РНК активность, например, в районе при 5 '-конце и/или 3 '-конце двухцепочечной молекулы РНК. Модифицированная миРНК по настоящему изобретению может содержать один или несколько химически модифицированных рибонуклеотидов антисмысловой цепи или смысловой цепи или и той, и другой одновременно.
Модификации можно использовать для улучшения характеристик in vitro или in vivo, таких как стабильность, активность, иммуногенность и/или биодоступность.
В частности, каждая нуклеотидная последовательность миРНК может содержать по меньшей мере один модифицированный аналог нуклеотида.
Модификации в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой модификации рибонуклеиновых кислот (РНК), например, модифицирована заблокированными нуклеиновыми кислотами (LNA).
Последовательность двухцепочечной молекулы РНК данного изобретения имеет достаточную идентичность относительно молекулы нуклеиновой кислоты-мишени для опосредования мишень-специфической РНКи.
Идентичность означает степень родства последовательностей между нуклеотидными последовательностями, которую определяют на основе совпадения порядка и природы нуклеотидов в последовательностях. В одном из вариантов осуществления антисмысловая нить миРНК, имеющая комплементарность, составляющую 80% и от 80% вплоть до 100%, например, комплементарность 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью мРНК-мишени, считают по существу комплементарной, и ее можно применять в настоящем изобретении. Процент комплементарности описывает процент следующих друг за другом нуклеотидов в первой молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать пары оснований согласно правилу Уотсона-Крика с группой следующих друг за другом нуклеотидов во второй молекуле нуклеиновой кислоты.
Варианты ДКП по настоящему изобретению представлены общей формулой RSK X K H2KZC, где R - аргинин;
К - лизин;
X - 5 аминокислот в любом порядке, где аминокислоты представляют собой: триптофан (W), лейцин (L), изолейцин (I), треонин (Т), валин (V), пролин (Р), глутаминовую кислоту
(E);
Н - гистидин;
Z - гидрофобный аминокислотный остаток, предпочтительно аланин (А) или фенилаланин
(F);
С -цистеин или цистеинамид;
Катионный дендримерный пептид представлен структурной формулой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - SEQ ГО NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F);C -цистеин или цистеинамид, в виде биосовместимой соли или основания.
В основных вариантах осуществления L-аминокислоты в одном или нескольких положениях могут быть заменены на D-изомерные остатки, С-конец пептида может быть, как в карбоксильной, так и в амидной форме, что не приводит к изменению специфических трансфекционных свойств.
В другом варианте данного изобретения молекула ДКП может содержать различный порядок из набора аминокислот, локализованных в положениях, которые по существу определяют трансфекционную активность комплексом гидрофобных свойств, например, между второй и третьей точкой ветвления.
Любой из вариантов ДКП может быть получен в виде биосовместимой соли (например, трифторацетата, ацетата, хлорида, фосфата) или основания.
Диапазон эффективного количества ДКП составляет 0,01-50,0 мг/мл.
Массовое соотношение молекул малых интерферирующих РНК и ДКП в целом может составлять от 2:1 до 1:2000, например, от 1:1 до 1:1000, от 1:2 до 1:100 или от 1:5 до 1:50. Более предпочтительно это соотношение составляет от 1:10 до 1:50, например от 1:15 до 1:25.
Растворители включают, но не ограничиваются ими, фосфатные буферные растворы не содержащую пирогенов воду, изотонический солевой раствор.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу производства комбинированного лекарственного средства для применения в ингибировании репликативного цикла вируса SARS-CoV-2 у нуждающихся в этом живых индивидуумов, включающему комбинирование i) эффективного количества молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух
комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 4 - SEQ ID NO 33, содержащими модификации LNA в смысловой и/или антисмысловой цепи указанных последовательностей, (ii) ДКП, обладающего трансфекционной активностью и характеризующегося структурной формулой RSK4X4K2H2KZC, в качестве фармацевтического носителя.
Изобретение также предоставляет наборы для применения в настоящих способах. Набор может, кроме того, включать описание выбора индивидуума, подходящего для лечения. Инструкции, поставляемые с наборами по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или упаковочном вкладыше (например, листе бумаги, включенном в набор).
Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящие упаковки включают без ограничения флакончики, бутыли, гибкую упаковку и им подобные. Инструкции в целом включают информацию, относящуюся к дозировке, схеме введения и пути введения для предполагаемого лечения.
В состав набора для получения КЛС входит по меньшей мере 2 контейнера (флакона) с лиофильно высушенным компонентом (А) и компонентом (Б), представленными порошком белого цвета. В другом варианте осуществления набор содержит растворитель.
Варианты наборов могут быть представлены следующими контейнерами, но не ограничиваются ими.
Вариант 1 : Флакон 1) миРНК siRk-12-EM. Флакон 2) пептид КК-46.
Вариант 2: Флакон 1) миРНК siRk-12-EM, NaCl, КС1, Na2HPC>4, КН2РО4. Флакон 2) пептид КК-46, NaCl, КС1, Na2HP04, KH2R04
Вариант 3: Флакон 1) миРНК siRk-12-EM, NaCl, Флакон 2) пептид КК-46, NaCl.
Вариант 4: Флакон 1) миРНК siRk-12-EM. Флакон 2) пептид КК-46. Флакон 3-4) Вода для инъекций
Вариант 5: Флакон 1) миРНК siRk-12-EM, NaCl, КС1, Na2HP04, КН2РО4. Флакон 2) пептид КК-46, NaCl, КС1, Na2HP0 , KH2R0 3-4) Вода для инъекций
Вариант 6: Флакон 1) миРНК siRk-12-EM. Флакон 2) пептид КК-46. Флакон 3-4) Фосфатный буферный раствор
Вариант 7: Флакон 1) миРНК siRk-12-EM. Флакон 2) пептид КК-46. Флакон 3-4) Изотонический раствор NaCl.
Вариант 8: Двухкамерный флакон 1) миРНК siRk-12-EM в комплекте с растворителем.
Двухкамерный флакон 2) пептид КК-46 в комплекте с растворителем.
Осуществление изобретения
Далее приведено детальное описание экспериментальных примеров, подтверждающих эффективность полученного средства для профилактики или лечения заболеваний в соответствии с данным изобретением, где приведенные примеры не предназначены для ограничения объема изобретения.
ПРИМЕР 1. Синтез миРНК, обладающих противовирусной активностью в отношении коронавируса SARS-CoV-2 и подтверждение биологической активности.
Вирусный геном SARS-CoV-2 представлен одноцепочечной положительной молекулой рибонуклеиновой кислоты РНК (+ssRNA) длиной около 30 тпн, кодирующей не менее 5 открытых рамок считывания (Open Reading Frame, ORF). Первый ORF (ORFla/b) занимает около 70% всего генома и кодирует 16 неструктурных белков (nspl- 16), в том числе РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, необходимую для репликации вируса. Остальные 30% генома кодируют 4 основных структурных белка, необходимых для сборки вириона: шиповидный белок (S), мембранный белок (М), белок оболочки (Е), белок нуклеокапсида (N) (ФИГ.1). Весь этот комплекс белков необходим для воспроизводства вируса, включающего репликацию генома и сборку новых вирусных частиц.
Процесс воспроизводства вируса может быть подавлен с помощью механизма РНКи в терапевтических целях. РНКи основана на отрицательной регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Суть процесса заключается в блокировании трансляции вирусных белков за счет комплементарного связывания РНК-мишени с короткими (21-26 п.н.) двуцепочечными молекулами миРНК. Противовирусный эффект обусловлен привлечением клеточных ферментов (DICER, Ago, мультисубъединичного комплекса RISC), ответственных за деградацию РНК-мишени вируса (ФИГ. 2).
Синтез РНК-олигоуклеотидов осуществляли твердофазным амидофосфатным синтезом на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе (Polygen, Германия). Суть метода заключается в добавлении одного нуклеотидного звена к иммобилизованному защищенному нуклеозиду или олигонуклеотиду. Нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером (CPG, controlled pore glass), используемым в качестве полимерной подложки, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты подавались в растворенном состоянии. В синтезе РНК использовались 2 -0-TBDMS- фосфорамидиты (ChemGenes, США) соответствующих азотистых оснований. Наличие TBDMS-защитной группы на 2’-конце рибозы предотвращает разрушение молекулы во время синтетического процесса. После ее удаления комплексом триэтиламина и
триэтиламина тригидрофторида (TEA/TEA*3HF) формируется 2’-гидроксил соответствующий «природной» РНК-молекуле.
Очистка РНК-олигонуклеотидов проводилась методом обращено-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Такой метод очистки был выбран исходя из того, что только целевой компонент (синтетический РНК-олигонуклеотид) содержит на 5'-конце гидрофобную диметокситритильную группу. Все побочные продукты с более низкой молекулярной массой, которые могли появиться в результате твердофазного синтеза, не несут на 5'-конце диметокситритильной группы. Оптимальным методом выделения для такого компонента является градиентная хроматография на обращено-фазовой колонке С18 с полярным растворителем (50 % ацетонитрил) в качестве элюента, где целевой компонент будет обладать наибольшим временем удерживания и соответственно может легко быть отделен от нецелевых продуктов. РНК-олигонуклеотид содержит модифицированные группы, повышающие его стабильность (ФИГ. 3)
Полученный РНК-олигонуклеотид высушивали в мягких условиях (не выше 15°С) и разводили в деионизированной воде MQ/DEPC (DNAse/RNAse free) в концентрации 600 нмоль/л. олигонуклеотиды объединяются в эквимолярных количествах, перемешиваются и подвергаются дуплексированию, т.е. образованию водородных связей между азотистыми основаниями нуклеотидов двух цепей, в соответствии со стандартной методикой, в следующих комбинациях:
Молекула нуклеиновой кислоты по любому из вариантов осуществления, где a) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность :
GGAAGG A AGUU CU GUU G ААТТТ (SEQ ID NO 1) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность :
UUCAACAGAACUUCCUUCCTTT (SEQ ID NO 2) или b) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
AGACGUGGUCCAGAACAAATT (SEQ ID NO 4) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UUUGUUCUGGACCACGUCUTT (SEQ ID NO 5) или c) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
ACUGAGGGAGCCUUGAAUATT (SEQ ID NO 6) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UAUUCAAGGCUCCCUCAGUTT (SEQ ID NO 7) или d) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
CCCACCAACAGAGCCUAAATT (SEQ ID NO 8) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UWAGGCUCUGUUGGUGGGTT (SEQ ID NO 9) или e) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GCAUAUUGACGCAUACAAATT (SEQ ID NO 10) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UUUGUAUGCGUCAAUAUGCTT (SEQ ID NO 11) или f) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GUAGUUGAAGUUGUUGAUATT (SEQ ID NO 12) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UAUCAACAACUUCAACUACTT (SEQ ID NO 13) или g) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GAAUAGAGCUCGCACCGUATT (SEQ ID NO 14) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UACGGUGCGAGCUCUAUUCTT (SEQ ID NO 15) или h) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GGUGUCUCUAUCUGUAGUATT (SEQ ID NO 16) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UACUACAGAUAGAGACACCTT (SEQ ID NO 17) или
i) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GGUGUACUGACAUUAGAUATT (SEQ ID NO 18) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UAU CU AAU GU С AGU АС АССТТ (SEQ ID NO 19) или j) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
CUUCGUAAGAACGGUAAUATT (SEQ ID NO 20) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UAUUACCGUUCUUACGAAGTT (SEQ ID NO 21) или k) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность :
GUU ACGAUGGUGGCUGU AUTT (SEQ ID NO 22) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
AUACAGCCACCAUCGUAACTT (SEQ ID NO 23) или l) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GUAAGGCUAGACUUUAUUATT (SEQ ID NO 24) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UAAUAA AGUCU AGCCUU АСТТ (SEQ ID NO 25) или ш) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
AUGGGGUAAGGCUAGACWUAUUAT (SEQ ID NO 26) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
AUAAUA AAGU CU AGCCUU ACCCCAUUU (SEQ ID NO 27) или n) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GGAAGGAAGUUCUGUUGAATT (SEQ ID NO 28)
второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UUCAACAGAACUUCCUUCCTT (SEQ ID NO 29) или o) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность :
UCAGGAGUAUGCUGAUGUCTT (SEQ ID NO 30) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GAC AUC AGC AUACUCCUGATT (SEQ ID NO 31 ) или p) первый фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
UGUUGGACUGAGACUGACCTT (SEQ ID NO 32) второй фрагмент смежных нуклеотидов содержит следующую нуклеотидную последовательность:
GGUCAGUCUCAGUCCAACATT (SEQ ID NO 33)
Таким образом, спроектированные и синтезированные молекулы миРНК, направлены против консервативных участков генома вируса SARS-CoV-2 с пониженной частотой мутаций.
Первичный скрининг противовирусной активности миРНК проводился на неинфекционной модели in vitro с использованием векторов, экспрессирующих вирусные гены, объединенных с геном репортером (ген светлячковой люциферазы). Сконструированы три вектора, экспрессирующие полноразмерные гены и генные фрагменты лидерного белка SARS-CoV-2 (NCBI RefSeq NC_045512.2) NSP1 (540 п.о.), RdRp РНК-зависимой РНК-полимеразы (2796 п.о.) и нуклеокапсидного белка N (1260 п.о.) (pVAXl-LP-IRES-LUC, pVAXl-RdRp-full-IRES-LUC и pVAXl-N-IRES-LUC, соответственно) (ФИГ. 4а-с) Молекулы миРНК по изобретению направлены против геномных мишеней в пределах гена ORF1/2 (RdRp - регион гена РНК-зависимой РНК полимеразы) (ФИГ. 4d). Биологический эффект молекул миРНК определяли по снижению активности люциферазы в лизатах клеток. (ФИГ. 4d).
Подтверждение биологической активности молекул миРНК проводили в экспериментах in vitro на инфекционной модели заражения клеток Vero вирусом SARS- CoV-2, а количественную оценку проводили с помощью ОТ-ПЦР-тест-системы, сконструированной на ген nspl (ФИГ. 4d).
Для первичного определения биологической активности молекул миРНК в условиях in vitro клетки Нер-2 высаживали в 24-луночный планшет в количестве 100 тыс клеток на лунку в 600 мкл полной питательной среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки, 2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L- глутамина) накануне трансфекции и инкубировали сутки при 37°С в СОг инкубаторе до достижения 75% конфлюентности. Перед внесением трансфекционной смеси в лунках с клетками заменяли полную питательную среду DMEM на бессыворточную среду DMEM (2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина) с промежуточной отмывкой клеток с помощью физиологического раствора (0.9% раствор хлорида натрия). Трансфекцию проводили в два этапа. Первую дисперсию трансфекционного агента общим объемом 80 мкл, состоящего из 0,25 мкг плазмиды, кодирующий определенный участок генома вируса SARS-CoV-2 и 0,5 мкл коммерческого трансфекционного агента Lipofectamine3000 (с добавкой РЗООО), готовили в бессывороточной среде OPTIMEM. Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Вторую дисперсию трансфекционного агента общим объемом 87,5 мкл, состоящего из 7,5 мкл соответствующей миРНК и 1,5 мкл коммерческого трансфекционного агента Lipofectamine3000, готовили в бессывороточной среде OPTIMEM. В качестве контроля в одну из лунок после 1 трансфекции никаких миРНК не вносили. В качестве неспецифичных к плазмидам миРНК использовали siUTR, siIL4, siGFP, в качестве специфичной - siLuc. Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Клетки инкубировали при 37°С в СО2 инкубаторе. Через 4 часа в каждую лунку добавляли бОмкл 10% фетальной бычьей сыворотки. После этого клетки инкубировали при 37°С в СОг инкубаторе в течение 20 часов и затем определяли люциферазную активность методом люциферазного теста. Тест проводился с использованием коммерческого набора “Luciferase Assay System” (Promega) согласно рекомендациям производителя. Для этого удаляли ростовую среду из лунок, затем добавляли 150 мкл лизирующего буфера Glo lysis byffer, lx (USA). Клетки выдерживали 15 минут при 37°С в СОг инкубаторе для достижения полного лизиса. Затем соскабливали их со дна ячеек и переносили клеточную суспензию в пробирки типа eppendorf на 1,5 мл. Для осаждения клеточного дебриза полученный лизат центрифугировали 2 минуты на 10000 оборотов. Отбирали по 50 мкл супернатанта в отдельные пробирки типа eppendorf на 1 ,5 мл и добавляли к ним люциферазный субстрат в соотношении 1:1. Эффективность трансфекции оценивали по уровню люминисценции
на Glomax 20/20 luminometr. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (ш). Определяли межгрупповые различия и оценивали достоверности различий между группами с помощью критерия Стьюдента с использованием программы Statistica 8.0.
Для подтверждения активности молекул миРНК проводили эксперименты in vitro на модели репликации SARS-CoV-2 в клетках Vero С1008 (Е6) (Почки зеленой мартышки). Клетки высаживали в 24-луночный планшет в количестве 100-150 тыс. клеток на лунку в 600 мкл полной питательной среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки, 2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина) накануне эксперимента и инкубировали сутки при 37°С в СОг инкубаторе до достижения 75% конфлюентности. Перед внесением миРНК в лунках с клетками заменяли полную питательную среду DMEM на бессыворточную среду DMEM в количестве 500 мкл (2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина). Дисперсию исследуемого препарата общим объемом 100 мкл, состоящего из 0,5 мкг миРНК и 1 мкл коммерческого трансфекционного реагента Lipofectamme3000, готовили в бессывороточной среде OPTIMEM. Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали 100 мкл бессывороточной среды OPTIMEM, не содержащей молекул миРНК. Клетки инкубировали при 37°С в СОг инкубаторе в течение 4 часов. После чего удаляли смеси MnPHK/Lipofectamine3000/optiMEM и клетки заражали SARS-CoV-2 при минимальной заражающей дозе = 0,001 в бессывороточной среде объемом 500 мкл, инкубировали 1 час при 37°С в СО2 инкубаторе. Затем производили замену культуральной среды на полную питательную среду DMEM в количестве 400 мкл для создания оптимальных условий культивирования клеток. После чего клетки были повторно обработаны смесью 0.5 мг миРНК и 1 мкл Lipofectamine3000 в 100 мкл бессывороточной среды OPTIMEM. Через 1 и 4 суток после инфекции оценивалась вирусная нагрузка методом ОТ-ПЦР. Для этого собирали супернатанты и клеточные лизаты, из которых затем выделяли РНК для последующей постановки реакции ОТ-ПЦР с целью определения количества копий вирусной РНК. Клетки лизировали непосредственно в лунке без использования механических и ферментативных методов отделения. Каждый вариант миРНК был изучен в 1 концентрации в дублях в 4-х независимых повторах. Данные представлены в виде количества копий вирусной РНК на 1 мл супернатанта и на 100 тыс. клеток, а также были нормализованы в % относительно неспецифических молекул миРНК, принятых за 100%.
По результатам первичного скрининга восемь из 15 разработанных миРНК (SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 33) существенно снижали активность люциферазы in vitro по сравнению с неспецифическими миРНК (siGFP) и/или клетками, трансфецированными только плазмидой (ФИГ. 5). SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8/ SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12/ SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16/ SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20/ SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 28/ SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30/ SEQ ID NO: 31 значительно снижали уровень люминесценции, в %: 82. 43 (Р <0.05), 74.53 (Р <0.01), 69.21 (Р <0.05), 84.03 (Р <0.01), 67.95 (Р <0.05), 88.28 (Р <0.01), 68.77 (Р = 0.0519) и 65.17 (Р = 0.0519), соответственно, по сравнению с клетками, трансфецированными только плазмидой и 84,67 (Р <0.05), 76,35 (Р <0.05), 64,88 (Р = 0.0568), 81,78 (Р <0.05), 63,45 (Р = 0.0666), 89,12 (Р <0.01), 71 (Р <0.05) и 67,66 (Р <0.05), соответственно, по сравнению с клетками, трансфецированными неспецифическими миРНК. Контрольная миРНК siLuc значительно снижала экспрессию люциферазы светлячка, в %: 70,24 (Р<0,001), 77,69 (Р<0,05) и 53,1 (NS) по сравнению с клетками, трансфецированными только плазмидой pRdRp-full, pVAX-N-IRES LUC и pVAX-LP-IRES-LUC, соответственно; в %: 72. 37 (Р<0,01), 74,56 (Р<0,05) и 56,63 (НД) по сравнению с клетками, трансфецированными pVAX-N-IRES-LUC и pVAX-LP-IRES-LUC, соответственно, с последующей трансфекцией siGFP. Согласно результатам, приведенным на ФИГ. 6 SEQ ID NO: 8/ SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28/ SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30/ SEQ ID NO: 31 значительно снижали экспрессию люциферазы в клетках, котрансфецированных плазмидой и миРНК. Эти молекулы были отобраны в качестве наиболее эффективных в отношении вируса SARS-CoV-2.
Созданные синтетические миРНК последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 в составе комбинированного лекарственного средства направлены против региона гена RdRp.
По результатам экспериментов с целью подтверждения активности отобранных в ходе первичного скрининга молекул миРНК выявлено существенное отличие в концентрации вирусной РНК между клетками, обработанными специфическими миРНК SEQ ID NO: 28/ SEQ ID NO: 29, направленными против гена RdRp, по сравнению как с клетками трансфецированными неспецифическими миРНК (siLuc), так и с инфицированными клетками (Р<0,05) (ФИГ. 6).
Таким образом авторы настоящего изобретения установили, что молекула нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 28/ SEQ ID NO: 29, содержащая двухцепочечную структуру, где двухцепочечная структура образована первой цепью и второй цепью, где первая цепь
содержит фрагмент смежных нуклеотидов, и вторая цепь содержит фрагмент смежных нуклеотидов, где первая цепь состоит из:
(i) нуклеотидной последовательности GGAAGGAAGUUCUGUUGAATT (SEQ ID NO: 28) а втора цепь состоит из:
(и) нуклеотидной последовательности UUCAACAGAACUUCCUUCCTT (SEQ ID NO: 29) способна вызывать максимальную РНК-интерференцию.
Эту нуклеиновую кислоту, включающую цепи с данными последовательностями, будут обозначать в настоящем описании как siRk-12 (или siRk-12-EM в ее модифицированном исполнении) - молекула нуклеиновой кислоты по изобретению.
ПРИМЕР 2. Получение модифицированных миРНК.
Синтез модифицированных РНК-олигоуклеотидов осуществляли твердофазным амидофосфатным синтезом на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе (Polygen, Г ермания) в соответствии со способом получения, указанным в ПРИМЕРЕ 1. Отличием метода является добавление одного или нескольких модифицированных нуклеотидных звеньев к иммобилизованному защищенному нуклеозиду или олигонуклеотиду.
В состав миРНК включены модифицированные нуклеотиды (LNA, Locked Nucleic Acids), обеспечивающие надежную связь миРНК с мишенью и повышающие стабильность дуплексов. Для подтверждения структуры полученных молекул РНК использовали масс- спектрометр BRUKER microflex LT (матрица 3-НРА)
Получена молекула нуклеиновой кислоты siRk-12-EM по любому из вариантов осуществления, где молекула нуклеиновой кислоты состоит из а) первого фрагмента смежных нуклеотидов, имеющего следующую структуру:
(+G) G AAGG A AGUU CU GUU GA A(+T)(+T)dT второго фрагмента смежных нуклеотидов, имеющего следующую структуру:
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT , где dT - дезокситимидин, «+» отмечены LNA-модифицированные нуклеотиды.
Указанные цепи формируют дуплексную область с полной комплементарностью и/или частично некомплементарную, а также имеющих фрагменты, выходящие за пределы дуплексной области.
В одном из вариантов осуществления дуплексная область содержит один или множество модифицированных нуклеотидов, обозначаемых в настоящем описании как "модифицированные группы", где каждая модифицированная группа состоит из
одного или нескольких идентично модифицированных нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления каждая модифицированная группа в дуплексной области является идентичной, т.е. каждая модифицированная группа состоит из равного количества идентично модифицированных нуклеотидов, расположенных непосредственно друг за другом, в терминальных позициях или в любой из позиций 1-22. В другом варианте осуществления модифицированная группа может иметь терминальное положение и выходить за пределы комплементарной части РНК- дуплекса
Нуклеиновая кислота указанной структуры, включающая все эти варианты осуществления, будут обозначать в настоящем описании как siRk-12-EM - молекула нуклеиновой кислоты по изобретению.
ПРИМЕР 3. Сравнение стабильности модифицированных и немодифицированных миРНК.
При использовании миРНК предпочтительно использование модификаций, повышающих эффективность молекул и их устойчивость к ферментативной деградации РНКазами. Одним из возможных способов модификации является синтез ковалентно- замкнутых нуклеиновых кислот (LNA - «locked nucleic acid»). Такая модификация приводит к образованию более прочных дуплексов, а также к устойчивости к нуклеазной деградации. Введение подобных модификаций в олигонуклеотидную последовательность позволяет пролонгировать время нахождения миРНК в биологических средах (сыворотка крови, слизистые оболочки, цитоплазма клетки и т.д.), что усиливает их биологический эффект.
Повышенная стабильность модифицированных миРНК подтверждена экспериментально при смешивании миРНК (С=Т мг/мл) с FBS в соотношении 1:1 и последующей инкубацией смеси миРНК/FBS при +37С в течение 5 суток. Детекцию не деградировавшей миРНК осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Количественное определение миРНК определяли с помощью программного обеспечения Image Lab (BioRad) (ФИГ. 3). Показано, что LNA-модификация молекулы миРНК приводит к увеличению стабильности дуплексов миРНК и сохранению их структуры в течение 264 часов, что в среднем в 2-3 раза больше по сравнению с немодифицированной миРНК. С другой стороны, модификация не приводит к потере активности миРНК (ФИГ. 7).
Таким образом, использование модифицированных миРНК для подавления экспрессии генов является одним из вариантов для достижения пролонгированного противовирусного эффекта.
ПРИМЕР 4. Синтез дендримерных пептидов и подтверждение трансфекционной активности.
Для доставки миРНК в клетки-мишени в состав КЛС введен пептидный вектор, играющий роль транспортера миРНК (ДКП, образующий комплексы с отрицательно заряженными молекулами миРНК и конденсирующий их в компактные наноструктуры).
Оптимальное соотношение ДКП/миРНК составляет 12,5-50/1 по массе. Доставка действующего вещества миРНК в клетку (трансфекция) осуществляется за счет транслокации комплекса миРНК с пептидным вектором через клеточные мембраны по механизму эндоцитоза. Для проявления специфической активности миРНК в составе средства siRk-12-EM/KK46 проникают в цитоплазму клетки-мишени, обеспечивая терапевтический эффект.
Реагенты и растворители для получения дендримерных пептидов были получены от компаний Sigma-Aldrich/Merck, Anaspec, ApexBio, Gyros Proteins, Alfa Aesar, Merck, Fluka AG, Reachem, Novabiotech, Protein Technologies Inc, Carl Roth GmbH, Scharlau, Fisher Chemical с качеством либо для пептидного синтеза, либо ВЭЖХ, либо ГЖХ/МС, либо для анализа. Для синтеза пептидов использовали автоматический синтезатор пептидов PS3 (Protein Technologies Inc., США) или мануальный синтез.
Для очистки пептидов использовалась высокоэффективной жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Одна из используемых систем состояла из бинарного насоса 321- Н (Gilson), колонки Vydac 218ТР1022 (Grace), фотометрического детектора Spectroflow 757 (Kratos Analytical), регистратора 2210 (LKB) и коллектора фракций Multirac 2111 (LKB), другая система ВЭЖХ- Серии LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония). При элюировании использовали линейный градиент 5-70% элюента В (25 минут) при 10 мл/мин с детектированием при 226/280 нм. Элюент А содержал 0,1% TFA/H2O; элюент В содержал чистый ацетонитрил (Sigma-Aldrich).
Функциональные группы боковых цепей Fmoc-аминокислот (AnaSpec, США/ Sigma Aldrich, Германия / Iris Biotech, Германия) были защищены трет-бутилом (t-Bu) для гидроксильных и карбоксильных групп, трет-бутилоксикарбонилом (Вое) или флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) для e-аминогруппы лизина, тритильной группой (Trt) для SH-группы цистеина и имидазольной группы гистидина, и 2,2,4,6,7-пентаметил-
дигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf) для гуанидиновой группы аргинина. Синтез осуществляли либо вручную, либо автоматически на пептидном синтезаторе PS3 (Protein Technologies Inc., США) с использованием смолы стирол-МВНА (смола Rink-amide- МВНА) или смол на ПЭГ-основе (Rink-amide chemmatrix, TGR-, TGA-). При ручном варианте смесь DIC/HBT использовалась для реакции конденсации, в то время как в автоматическом синтезе для конденсации использовали смесь HBTU/NMM. Растворителем, использованным для всех стадий синтеза, в обоих случаях был N,N- диметилформамид (DMF) или смесь DMF с N-метилпирролидоном (NMP); снятие Fmoc- защиты после каждой стадии конденсации проводили в растворе 4-метилпиперидина (для Fmoc), а полное снятие защит осуществляли путем использования трифторуксусной кислоты (TFA) (все защитные группы боковых цепей, кроме Fmoc, были лабильными для TFA).
Схема твердофазного синтеза основана на повторяющемся цикле стандартных операций, который включает:
1) На старте навеску исходной смолы, например Rink Amide, вносят в реактор, добавляют ДМФА, энергично перемешивают суспензию до полного набухания смолы, операцию повторяют 3 раза по 10-30 мин, удаляя растворитель фильтрованием под давлением.
2) Удаление Fmoc-защиты 20% раствором 4-метилпиперидина (МПП) в течение 10-20 мин 2 раза.
3) Промывку смолы.
4) Присоединение аминокислоты путем добавления в реактор активированной Fmoc- аминокислоты в среде ДМФА или N-мети л пиррол идона (МП) и инкубацией в течение 30 мин -2 ч.
5) Промывку смолы с пептидом.
6) Операции по пунктам 2-5 повторяются.
Отщепление пептидов от смолы проводили в 95% растворе TFA с добавлением скавенджеров, например, тиоанизола, 1 ,2-этандитиола или триизопропилсилана и деионизированной воды. Сырые пептидные продукты осаждали диэтиловым эфиром, экстрагировали разбавленной уксусной кислотой и затем высушивали лиофильно. Заявляемые ДКП - стабильные вещества при хранении в сухом виде. Их синтез можно осуществлять, используя автоматический пептидный синтезатор или в ручном режиме. В результате были получены варианты дендримерного пептида общей формулы R8K X K2H KZC, где R- аргинин;
К - лизин;
X - 5 аминокислот в любом порядке, где аминокислоты представляют собой: триптофан (W), лейцин (L), изолейцин (I), треонин (Т), валин (V), пролин (Р), глутаминовую кислоту
(E);
Н - гистидин;
Z - гидрофобный аминокислотный остаток, предпочтительно аланин (А) или фенилаланин
(F);
С -цистеин или цистеинамид;
Для проведения анализа на трансфекционную активность ДКП клетки Vero С 1008 (Е6), НЕК293, А549, HepG2, ФЭЧ, HeLa высеивали в 48-луночный планшет в количестве 4-104 клеток на лунку в 300 мкл соответствующей полной питательной среды (DMEM, или F12, или Игла-Мем, или RPMI, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина) накануне трансфекции и инкубировали сутки при 37°С в СОг инкубаторе до достижения 75% конфлюентности. Дисперсию трансфекционного агента в 3 разведениях (с массовыми соотношениями пептида к НК - 50:1, 25:1 и 12,5:1) общим объемом 80 мкл, состоящего из 0,3 мкг плазмиды pGL3 и раствора пептида в соответствующей концентрации согласно массовым соотношениям к НК, готовили в бессывороточной среде OPTIMEM. В качестве положительного контроля использовали коммерческий трансфекционный агент Lipofectamine2000 (Lf). В качестве отрицательного контроля использовали плазмиду pGL3 без носителя (Р1). Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Перед внесением трансфекционной смеси в лунках с клетками заменяли полную питательную среду на бессыворточную. Клетки инкубировали при 37°С в СОг инкубаторе в течение 4 часов. Затем к клеткам добавляли 30 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки инкубировали при 37°С в СОг инкубаторе в течение 24 часов и затем определяли люциферазную активность методом люциферазного теста. Тест проводился с использованием коммерческого набора “Luciferase Assay System” (Promega) согласно рекомендациям производителя. Для этого удаляли ростовую среду из лунок, затем добавляли 100 мкл лизирующего буфера (Glo lysis buffer, lx, USA). Клетки выдерживали 15 минут при 37°С в СОг инкубаторе для достижения полного лизиса. Затем соскабливали их со дна ячеек и переносили клеточную суспензию в пробирки типа eppendorf на 1,5 мл. Для осаждения клеточного дебриса полученный лизат центрифугировали 2 минуты на 10000 оборотов. Отбирали по 50 мкл супернатанта в отдельные пробирки типа eppendorf на 1,5 мл и добавляли к ним
люциферазный субстрат в соотношении 1:1. Эффективность трансфекции оценивали по уровню люминисценции на Glomax 20/20 luminometr. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (т) (ФИГ. 8). Определяли межгрупповые различия и оценивали достоверности различий между группами с помощью критерия Стьюдента с использованием программы Statistica 8.0
Синтез ДКП (КК-46), характеризующийся тем, что в формуле X - SEQ ID NO 3, осуществляли в соответствии с Примером 4 по химической схеме, представленной на ФИГ. 9.
Таким образом, обеспечивается эффективная и безопасная доставка полученных синтетических миРНК с помощью ДКП, обладающего трансфекционной активностью, обеспечивающего суммарный положительный заряд всего комплекса, что повышает эффективность его проникновения в клетки и характеризующегося структурой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид, что позволяет проводить противовирусную терапию на основе РНКи.
ПРИМЕР 5. Оптимизация состава комплекса миРНК/пептидный носитель.
Для оценки оптимального соотношения пептида и нуклеиновой кислоты клетки Нер-2 трансфецировали комплексами pGL3 Luciferase Reporter Vector (0,25 мкг) и различным количеством пептидного дендримера КК-46 в различных массовых соотношениях 100:1, 50:1, 25:1, 20:1,12,5:1,5:1. Проведена оценка активности люциферазы. В качестве положительного контроля использовали комплекс pGL3/ Lipofectamine3000. Результаты теста приведены на ФИГ. 10. Диапазон оптимальных массовых соотношений в комплексе «нуклеиновая кислота/КК-46» находится в интервале от 1/12,5 до 100/1.
ПРИМЕР 6. Получение комбинированного лекарственного средства siRk-12-EM/KK46 и его состав.
Для получения лекарственного средства эффективное количество миРНК (siRk-12 или siRk-12-EM) и пептида КК-46 растворяют в равных объемах подходящего растворителя (например, 2,5 мл или 3,5 мл для каждого), содержимое каждого флакона перемешивают с помощью шприца, вортекса или встряхиванием и объединяют. Замораживание раствора не допускается.
Вариант 1: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - 0,088 мг; 2) пептид КК-46 - 1,762 мг;
Вариант 2: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - 0,176 мг; 2) пептид КК-46 - 3,524 мг;
Вариант 3: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - 0,528 мг; 2) пептид КК-46 - 10,572 мг;
Вариант 4: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - 1,056 мг; 2) пептид КК-46 - 21,144 мг;
Вариант 5: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - 3,168 мг; 2) пептид КК-46 - 63,432 мг;
Где в варианте 1-5 добавляют физиологический раствор (0,9% NaCl) - 5 мл;
Где в варианте 1-5 добавляют физиологический раствор (0,9% NaCl) - 7 мл;
Где в варианте 1-5 добавляют стерильную воду очищенную - 5 мл;
Где в варианте 1-5 добавляют стерильную воду очищенную - 7мл;
Где в варианте 1-5 добавляют фосфатный буферный раствор - 5 мл;
Где в варианте 1-5 добавляют фосфатный буферный раствор - 7 мл;
Вариант 6: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - как в варианте 1-5, вместе с NaCl - 20 мг, КС1 - 0,5 мг, Na2HPC>4 - 3,6 мг, КН2РО4 - 0,6 мг; 2) пептид КК-46 - как в варианте 1- 5, вместе с NaCl -20 мг, КС1- 0,5 мг, Na2HP04 - 3,6 мг, КН2РО4 - 0,6 мг.
Вариант 7: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - как в варианте 1-5, NaCl -20 мг, КС1- 0,5 мг, Na2HP04 - 3,6 мг, КН2РО4 - 0,6 мг; 2) пептид КК-46 - как в варианте 1-5, NaCl -20 мг, КС1- 0,5 мг, Na2HPC>4 - 3,6 мг, КН2РО4 - 0,6 мг.
Вариант 8: 1) миРНК siRk-12 или siRk-12 ЕМ - как в варианте 1-5, NaCl -20 мг, КС1- 0,5 мг, Na2HP04 - 3,6 мг, КН2РО4 - 0,6 мг; 2) пептид КК-46 - как в варианте 1-5, NaCl -20 мг, КС1- 0,5 мг, Na2HPC>4 - 3,6 мг, КН2РО4 - 0,6 мг; 3) Растворитель как выше указано.
ПРИМЕР 7. Подтверждение противовирусной активности комбинированного лекарственного средства in vivo.
Для подтверждения активности КЛС siRk-12-EM/KK46 in vivo использовались сирийские хомячки (самки в возрасте 4-5 недель, вес 40-60 г). Было сформировано шесть групп животных (N=10). Пять из шести групп были интраназально инфицированы 105 БОЕ/особь штамма В SARS-CoV-2 на 0-й день. В тот же день (через час после инфицирования) и на 1-й день инфицированные животные получили аэрозоль siRk-12- ЕМ/КК46 в трех дозах: 0,7, 1,96 или 5,6 мг/кг. Хомяки подвергались анестезии и помещались в ингаляционную камеру. Аэрозоли формировались с помощью обычного
микросеточного распылителя Xiaomi Andon VP-M3A Micro Mesh Nebulizer. Положительную контрольную группу составили животные, принимавшие Гидроксихлорохин, ресуспендированный в 1% растворе крахмала перорально (через 1 час после инфицирования в дозе 3,8 мг/особь, а затем ежедневно в течение 6 дней после инфицирования в дозе 1,5 мг/особь). Контрольная группа включала животных, инфицированных вирусом SARS-CoV-2. Интактная группа не получала никакого лечения и служила в качестве отрицательного контроля. Пять животных из каждой группы были забиты на 2-й день после инфицирования, легкие были удалены. Проведена макроскопическая оценка состояния легких. Правая доля легкого была гомогенизирована, а вирусный титр оценивался с помощью подсчета бляшек для определения количества БОЕ. Пять животных, оставшихся в каждой группе, подверглись воздействию аэрозоля siRk- 12-ЕМ/КК46 в 3, 4, 5 дни и были забиты на 6 день после инфицирования. Легкие были удалены и обработаны, как описано выше (ФИГ 11).
По результатам исследования показано, что ингаляционное введение КЛС siRk- 12- ЕМ/КК46 в дозах 0,7, 1,96 и 5,6 мг/кг, приводит к статистически значимому купированию патологоанатомических изменений в легких на 2 и 6 сутки после инфицирования. Наиболее выраженный эффект на макроскопические изменения в легких отмечен в группе 3 (доза 5,6 мг/кг) на 2 и 6 сутки наблюдения. При этом минимальная доза препарата КЛС siRk-12-EM/KK46, приводящая к улучшению состояния легких, составляет 0,7 мкг/кг.
Определен индекс подавления продукции вируса SARS-CoV-2 в легких инфицированных сирийских хомяков методом образования негативных колоний в культуре клеток Vero. КЛС siRk-12-EM/KK46 в дозе 5,6 мг/кг обеспечивал снижение уровня вирусной нагрузки в органе - мишени (легких) леченых животных на 2,3 lg на 6 сутки после инфицирования, что свидетельствует об угнетении его репродукции. При этом минимальная доза, обеспечивающая статистически значимое подавление репродукции вируса в легких, составляет 0,7 мг/кг.
Вторая серия экспериментов in vivo проводилась по той же схеме с двумя исключениями. Во-первых, мы подвергали животных воздействию аэрозоля siRk- 12- ЕМ/КК-46 в дозе 0,175, 0,35 и 1,0 мг/кг дважды в сутки с интервалом в два часа, что давало суточную дозу противовирусных комплексов 0,35, 0,7 и 2,0 мг/кг/сут соответственно. Второй контрольной группе животных назначали фавипиравир перорально (в течение 1 часа после инфицирования 2 раза в сутки вводили дозу 1 ,2 мг на особь, а затем ежедневно в течение 6 дней после инфицирования 2 раза в сутки 0,4 мг на особь) (ФИГ 12).
У инфицированных животных, получивших ингаляции препаратом КЛС siRk-12- ЕМ/КК46 в дозах 0,35; 0,7 и 2,0 мг/кг/сут, отмечено статистически значимое купирование патологоанатомических изменений в легких на 2 и 6 сутки после инфицирования. Наиболее высокий коэффициент защиты по макроскопическим изменениям в легких отмечен в группе 3 (доза 2,0 мг/кг) на 6 сутки наблюдения. Минимальная доза КЛС siRk- 12-ЕМ/КК46, приводящая к статистически значимому улучшению состояния легких, составляет 0,35 мкг/кг/сут.
На 2 сутки после инфицирования ингаляции препаратом siRk-12-EM/KK46 в дозах 0,35; 0,7 и 2,0 мг/кг/сут индекс подавления репликации вируса составил 1,7; 1,8 и 1,9 lg, соответственно; на 6 сутки после инфицирования индекс подавления репликации вируса составил 1,4 ,1,5 и 1,9 lg, соответственно.
Таким образом, КЛС siRk-12-EM/KK46 в дозе 2,0 мг/кг при ингаляционном введении в течение 7 дней по 2 ингаляции в день с интервалом 2 часа обеспечивал выраженное снижение уровня вирусной нагрузки в органе - мишени (легких) на 1 ,9 lg на 2 и 6 сутки после инфицирования, что свидетельствует об угнетении репродукции вируса.
Минимальная доза, обеспечивающая статистически значимое подавление репродукции вируса в легких, составляет 0,35 мг/кг/сут.
Таким образом, КЛС, содержащее модифицированные синтетические миРНК структуры (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где указанные миРНК осуществляют более эффективное блокирование репликативного цикла вируса по сравнению с не модифицированными миРНК. При этом модификация молекулы миРНК нуклеотидами LNA приводит к увеличению резистентности миРНК к воздействию нуклеаз с сохранением антивирусного эффекта, что в итоге обеспечивает пролонгированный противовирусный эффект.
ПРИМЕР 8. Обоснование выбора дозы лекарственного средства для лечения COVID-19 у человека.
В исследованиях по изучению специфической активности на сирийских хомячках массой 40-60 г (средняя масса животного 50 г) установлено, что препарат в единовременной дозе 0,175 мг/кг обладает статистически значимым антивирусным эффектом. Препарат вводился в течение 7 дней по 2 ингаляции в сутки в дозе 0,175 мг/кг. Таким образом суточная доза составляет 0,35 мг/кг/сут. Для генерации аэрозоли использовали меш-небулайзер модель XIAOMI ANDON VP-M3A со следующими
характеристиками: скорость распыления раствора 0,2 мл/мин, скорость потока 5 л/мин; т.е. из 0,2 мл раствора препарата генерируется 5 л аэрозоли.
Учитывая, что коэффициент межвидового пересчета доз для сирийских хомячков равен 8,1 [5], то единовременная терапевтическая доза для человека составляет 0,022 мг/кг (1,54 мг) (0,175 мг/кг / 8,1), а суточная терапевтическая доза составляет 0,044 мг/кг/сут (3,08 мг/сут).
Легочная вентиляция для человека составляет 8,732 л/мин по данным [6-8]. Таким образом за 20 мин ингаляции человек получит -175 л аэрозоли (8,732 л/мин * 20 мин = 174,6 л). Небулайзер за 20 минут генерирует 100 л аэрозоли (скорость потока 5 л/мин). Соответственно в 100 л должно содержаться 1,54 мг препарата; концентрация аэрозоли при этом должна составлять 0,015 мг/л (1,54 мг / 100 л = 0,015 мг/л).
С учетом того, что из раствора концентрацией 1 мг/мл генерируется аэрозоль с концентрацией в ней препарата 0,04 мг/л, то необходимо уменьшить концентрацию раствора в 2,7 раза (0,04 мг/л / 0,015 мг/л = 2,7), чтобы получить аэрозоль с концентрацией 0,015 мг/л. Таким образом, концентрация раствора препарата, необходимая для ингаляции человеку составит 0,37 мг/мл (1 мг/мл / 2,7 = 0,37 мг/мл).
С учетом скорости распыления небулайзера 0,2 мл/мин и скорости генерируемого потока 5 л/мин, из раствора препарата концентрацией 1 мг/мл образуется аэрозоль с концентрацией в ней препарата 0,04 мг/л (0,2 мл * 1 мг/мл / 5 л = 0,04 мг/л).
Учитывая производительность небулайзера 0,2 мл/мин, необходимый объем раствора препарата для процедуры ингаляции длительностью 20 минут составит 4 мл (0,2 мл/мин * 20 минут = 4 мл). Остаточный объем раствора лекарства в камере небулайзера составляет 0,1 - 0,5 мл (в зависимости от модели). Таким образом, для 20-минутной ингаляции потребуется -5 мл.
Так как необходимая концентрация раствора препарата составляет 0,37 мг/мл, то для получения 5 мл необходимо 1,85 мг препарата.
ПРИМЕР 9. Набор для получения фармацевтической композиции для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2.
Набор для получения комбинированного лекарственного средства содержит два контейнера, где первый контейнер содержит компонент (А): эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2, второй контейнер содержит компонент (Б): катионный дендримерный
пептид KK-46, обладающий трансфекционной активностью, и инструкцию по применению.
Набор представляет собой комбинацию 2 компонентов (siRk-12-EM и КК-46), фасуемых в индивидуальные флаконы в массовом соотношении 1/20, где фасовка миРНК (siRk-12-EM) составляет 0,088 мг/флакон, а фасовка пептида КК-46 составляет 1,762 мг/флакон.
Вышеизложенное описание настоящего изобретения представлено с целью иллюстрации, и специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, поймет, что настоящее изобретение может быть легко модифицировано в другие конкретные формы без изменения технического замысла или основных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что вышеописанные примеры являются только иллюстративными во всех аспектах, а не ограничивающими.
Цитируемая литература
1. Luo К., Li С., Wang G., Nie Y., Не В., Wu Y., Gu Z. Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J. Control Release, 2011, 55(l):77-87. doi: 10.1016/j.jconrel.2010.10.006.
2. Luo K., et al. “Arginine functionalized peptide dendrimers as potential gene delivery vehicles” Biomaterials, 2012, 33(19) 4917-4927.
3. Heitz M., et al. Stereoselective pH responsive peptide dendrimers for siRNA» (Bioconjug. Chem. 2019, 30(8):2165-2182.
4. Gorzkiewicz M., Konopka M., Janaszewska A., Tarasenko I.I., ... Klajnert-Maculewicz B. Application of new lysine-based peptide dendrimers D3K2 and D3G2 for gene delivery: Specific cytotoxicity to cancer cells and transfection in vitro. Bioorg. Chem., 2020, 95, 103504.
5. Van Hoosier G.J., McPherson C. Laboratory Hamsters. 1st ed. 1987. 400 p.
6. Миронов A.H. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 2012.
7. Трахтенберг И.М. et al. Проблема нормы в токсикологии (современные представления и методические подходы, основные параметры и константы). Москва: Медицина, 1991. 208 р.
8. Каркищенко Н.Н., Грачева С.В. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. Москва, 2010.
Claims
1. Комбинированное лекарственное средство для профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, содержащее: (i) эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 - SEQ ID NO 33 или содержащих модификацию LNA в одной или нескольких позициях смысловой и антисмысловой цепи указанных последовательностей, (и) дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурной формулой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - 5 аминокислот в любом порядке, где аминокислоты представляют собой: триптофан (W), лейцин (L), изолейцин (I), треонин (Т), валин (V), пролин (Р), глутаминовую кислоту (Е); Н - гистидин; Z - гидрофобный аминокислотный остаток, содержащий аланин (А) или фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид, (iii) фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
2. Комбинированное лекарственное средство по п.1, где эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2 представлено в виде двух комплементарных цепей структуры
(+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT.
3. Комбинированное лекарственное средство по п.1, где эффективное количество дендримерного катионного пептида, обладающего трансфекционной активностью содержит линейный участок аминокислотных остатков, представленный последовательностью SEQ ID NO 3.
4. Комбинированное лекарственное средство по п.1, содержащее: (i) эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей, характеризующихся структурой (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где модифицированные нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепи представлены модификацией LNA (п) дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и
характеризующийся структурой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X
- SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид.
5. Комбинированное лекарственное средство п.1, где эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2 составляет от 1 мкг до 100 мг, предпочтительно от 10 мкг до 10 мг, и катионного дендримерного пептида от 10 мкг до 1 г, предпочтительно от 1 мг до 100 мг.
6. Комбинированное лекарственное средство по п.1, предназначено для ингаляционного или интраназального введения.
7. Способ профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS- CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих комбинированного лекарственного средства по пп.1-4 в эффективном количестве.
8. Способ профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS- CoV-2 по п.7, где комбинированное лекарственное средство вводится одновременно, отдельно или последовательно с другими терапевтическими средствами.
9. Способ профилактики или лечения коронавирусной инфекции, вызываемой SARS- CoV-2 по п.7, включающий ингаляционное или интраназальное введение комбинированного лекарственного средства.
10. Набор для получения комбинированного лекарственного средства по п.1, содержащий по меньшей мере два контейнера, где первый контейнер содержит компонент (А): эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 4 - SEQ ID NO 33, содержащих модификацию LNA в одной или нескольких позициях смысловой и антисмысловой цепи указанных последовательностей, второй контейнер содержит компонент (Б): дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурной формулой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - 5 аминокислот в любом порядке, где аминокислоты представляют собой: триптофан (W), лейцин (L), изолейцин (I), треонин (Т), валин (V), пролин (Р), глутаминовую кислоту (Е); Н
- гистидин; Z - гидрофобный аминокислотный остаток, содержащий аланин (А) или фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид, и инструкцию по применению.
И. Набор по п.10, который по меньшей мере содержит один или более контейнеров с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.
12. Набор no p.IO, где компонент (А) и компонент (Б) находятся в лиофилизированной форме.
13. Набор по п.10, где компонент (А) содержит эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей, характеризующихся структурой (+G)GAAGGAAGUUCUGUUGAA(+T)(+T)dT и
UUCAACAGAACUUCCUUCC(+T)(+T)dT, где модифицированные нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепи представлены модификацией LNA.
14. Набор по п.10, где компонент (Б) представляет собой катионный дендримерный пептид со структурной формулой R8K4X4K2H2KZC, где R - аргинин; К - лизин; X - SEQ ID NO 3; Н - гистидин; Z - фенилаланин (F); С -цистеин или цистеинамид, в виде биосовместимой соли или основания.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2021106335 | 2021-03-11 | ||
RU2021106335A RU2746362C9 (ru) | 2021-03-11 | 2021-03-11 | Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2022191738A1 true WO2022191738A1 (ru) | 2022-09-15 |
Family
ID=75521159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/RU2022/000050 WO2022191738A1 (ru) | 2021-03-11 | 2022-02-18 | Противовирусное средство для лечения sars-cov-2 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2746362C9 (ru) |
WO (1) | WO2022191738A1 (ru) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008121265A (ru) * | 2005-10-28 | 2009-12-10 | Топиджен Фармасьютикалз Инк. (Ca) | Малые интерферирующие олигонуклеотиды, содержащие арабинозо-модифицированные нуклеотиды |
RU2017114964A (ru) * | 2014-10-02 | 2018-11-07 | Протива Байотерапьютикс, Инк. | Композиции и способы для подавления экспрессии гена вируса гепатита в |
CN111139242A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-05-12 | 苏州吉玛基因股份有限公司 | 一种小干扰核酸及组合物和应用 |
CN111139241A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-05-12 | 苏州吉玛基因股份有限公司 | 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用 |
RU2725813C2 (ru) * | 2013-03-15 | 2020-07-06 | Дзе Чилдрен’З Хоспитал Оф Филадельфия | Векторы, содержащие спейсерные/филлер полинуклеотидные последовательности, и способы их применения |
-
2021
- 2021-03-11 RU RU2021106335A patent/RU2746362C9/ru active
-
2022
- 2022-02-18 WO PCT/RU2022/000050 patent/WO2022191738A1/ru active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008121265A (ru) * | 2005-10-28 | 2009-12-10 | Топиджен Фармасьютикалз Инк. (Ca) | Малые интерферирующие олигонуклеотиды, содержащие арабинозо-модифицированные нуклеотиды |
RU2725813C2 (ru) * | 2013-03-15 | 2020-07-06 | Дзе Чилдрен’З Хоспитал Оф Филадельфия | Векторы, содержащие спейсерные/филлер полинуклеотидные последовательности, и способы их применения |
RU2017114964A (ru) * | 2014-10-02 | 2018-11-07 | Протива Байотерапьютикс, Инк. | Композиции и способы для подавления экспрессии гена вируса гепатита в |
CN111139242A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-05-12 | 苏州吉玛基因股份有限公司 | 一种小干扰核酸及组合物和应用 |
CN111139241A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-05-12 | 苏州吉玛基因股份有限公司 | 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2746362C9 (ru) | 2021-04-26 |
RU2746362C1 (ru) | 2021-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10195145B2 (en) | Method for treating fibrosis using siRNA and a retinoid-lipid drug carrier | |
DK2850189T3 (en) | COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR MODULATING GENEPRESSION | |
JP2013544511A (ja) | 特異的内在性miRNAにより発現を活性化する組成物および方法 | |
RU2501859C2 (ru) | Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции | |
EP3777843A1 (en) | Drug delivery particle and method for producing the same | |
US20220040292A1 (en) | Composition and Method of mRNA Vaccines Against Novel Coronavirus Infection | |
Vasconcelos et al. | Effects of cargo molecules on membrane perturbation caused by transportan10 based cell-penetrating peptides | |
US11732264B2 (en) | Compositions and methods for treating COVID-19 | |
CN113058042B (zh) | 一种可鼻喷的稳定递载rna分子的脂质纳米颗粒制备方法 | |
WO2016134146A2 (en) | Rna interference therapeutics against ebola virus | |
KR20080061397A (ko) | Rna 치료제용 펩티드 리보핵산 축합물 입자들의화합물들과 방법들 | |
RU2746362C1 (ru) | Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2 | |
US8957186B2 (en) | Recombinant protein for intracellular delivery of siRNA and composition comprising the same | |
EP4183879A1 (en) | Double-stranded oligonucleotide and composition for treating covid-19 containing same | |
CA3194161A1 (en) | Nucleoside containing sirnas for treating viral diseases | |
US20220049251A1 (en) | dsRNA Directed to Coronavirus Proteins | |
US20240158794A1 (en) | NUCLEOSIDE CONTAINING siRNAS FOR TREATING VIRAL DISEASES | |
US20230272400A1 (en) | SYNTHESIS METHOD OF TARGETED DRUG nCoVshRNA 2ACE2 | |
US20220241426A1 (en) | Peptide for use in the reduction of side effects in the form of immunostimulatory reactions/effects | |
US20230304010A1 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
US20230323353A1 (en) | Antisense rna for treatment of sars-associated coronavirus | |
EP3180033B1 (de) | Peptid zur verwendung in der reduktion von nebenwirkungen in form von immunstimulatorischen reaktionen/effekten | |
EP4359528A1 (en) | Sirna combinations targeting sars-cov-2 and/or host factor transcripts |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 22767591 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 202392426 Country of ref document: EA |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 22767591 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |