WO2022177263A1 - Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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WO2022177263A1
WO2022177263A1 PCT/KR2022/002211 KR2022002211W WO2022177263A1 WO 2022177263 A1 WO2022177263 A1 WO 2022177263A1 KR 2022002211 W KR2022002211 W KR 2022002211W WO 2022177263 A1 WO2022177263 A1 WO 2022177263A1
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WO
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diaportheone
pharmaceutical composition
present
disease
amyloid beta
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/002211
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English (en)
French (fr)
Inventor
안성수
탄마리오
심규환
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가천대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention was made by the project specific number 1711115820 under the support of the Ministry of Science and ICT of the Republic of Korea.
  • Myung Myung "The etiological mechanism of Korean Alzheimer's disease-related mutations, multi-variate analysis of biomarkers, and Korean-type cell and animal model development studies for new drug development" .
  • the present invention relates to the discovery of new drugs in natural products, and more particularly, Diaportheone A1, Diaportheone A2, pharmaceutically acceptable salts thereof, or prevention of neurodegenerative diseases by neuroprotection comprising a combination thereof as an active ingredient Or it relates to a pharmaceutical composition for treatment, and the pharmaceutical composition is used for the prevention or treatment of Alzheimer's disease.
  • Chromone is widely distributed in nature as a benzoannelated ⁇ -pyrone heterocyclic compound.
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ Abnormal amyloid beta
  • oxidative stress and neuroinflammation are some of the pathological features associated with AD.
  • strategic treatment at an early stage of the invention has proven beneficial.
  • acetyl cholinesterase inhibitors galantamine, rivastigmine, donepezil, tacrine, and the NMDA receptor antagonist memantine are natural products that include the acetyl cholinesterase inhibitors galantamine, rivastigmine, donepezil, tacrine, and the NMDA receptor antagonist memantine. It is a base compound. Although these drugs provide symptomatic relief for the symptoms of Alzheimer's disease, they have no significant effect on disease progression and prevention. Therefore, it is difficult to find an alternative treatment or treatment.
  • Diaportheone A1 and Diaportheone A2 are synthetic analogues of the natural product Diaportheone A. This enantiomeric compound is an intermediate compound in the overall synthesis of Diaportheone A. Diaportheone A1 and Diaportheone A2 were isolated from 99% ee (enantiomeric excess) and their absolute configuration was determined by X-ray crystallography (Tan et al., 2019). A literature search revealed no molecular targets related to the structures of Diaportheone A1 and A2.
  • the present inventors made intensive research efforts to discover and discover new drugs that provide significant effects in relieving symptoms of Alzheimer's disease, inhibiting disease progression, preventing and treating, from natural products, and developing a pharmaceutical composition including the same.
  • two isomers Diaportheone A1 and Diaportheone A2 having a chromone structure, have neuroprotective effects such as reduction of reactive oxygen species (ROS) and reduction of mitochondrial membrane potential loss and inhibition of aggregation of amyloid beta (A ⁇ ).
  • ROS reactive oxygen species
  • a ⁇ amyloid beta
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases by neuroprotection comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease by neuroprotection comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases by neuroprotection comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition the Diaportheone A1 is represented by the following formula (1), and the Diaportheone A2 is represented by the following formula (2), it provides a pharmaceutical composition:
  • Diaportheone A1 and Diaportheone A2 having a chromone structure have neuroprotective effects such as reduction of reactive oxygen species (ROS) and reduction of mitochondrial membrane potential loss and inhibition of aggregation of amyloid beta (A ⁇ ). It was identified as a compound having an anti-amyloidogenic effect.
  • ROS reactive oxygen species
  • a ⁇ amyloid beta
  • Diaportheone A is a natural product having a chromone structure, also known as "1,8-dihydroxy-2,3-dihydro-1H-cyclopenta[b]chromen-9-one" with the IUPAC name. As, it means a compound represented by the following formula (3):
  • Diaportheone B has the IUPAC name "(1S,3aR,9aS)-1,8-dihydroxy-2,3,3a,9a-tetrahydro-1H-cyclopenta[b]chromen-9-one"
  • a natural product having a chromone structure also known as a compound represented by the following formula (4):
  • Diaportheone A and B herein are endophytic fungi of a tropical plant Pandanus amaryllifolius ( Pandanus amaryllifolius ) Diaporthe sp . It can be isolated from P133 or synthesized by methods known in the art (see Tan et al., 2019; and Bungihan et al., 2011).
  • Diaportheone A and B of the present specification inhibit the growth of pathogenic strains that commonly cause tuberculosis in mammals, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, respectively, at a minimum inhibitory concentration (MIC) of 100.9 ⁇ M and It is known to have inhibitory anti-tuberculosis activity at 3.5 ⁇ M (see Bungihan et al., 2011).
  • Diaportheone A1 is a synthetic analogue of the natural product Diaportheone A of the present specification, and has a structure in which the hydroxyl group connected to carbon 8 of Diaportheone A is substituted with a methoxy group, and As a compound in which the absolute configuration of carbon is S, it refers to a compound represented by the following formula (1), which is enantiomerically related to Diaportheone A2:
  • Diaportheone A1 of the present invention is as follows: S-1-hydroxy-8-methoxy-2,3-dihydrocyclopenta[b]chromen-9(1H)-one.
  • Diaportheone A1 of the present invention may be synthesized or purified with reference to methods known in the art (see Tan et al., 2019), but is not limited thereto.
  • Diaportheone A1 of the present invention is at least 50% ee (enantiomeric excess), at least 55% ee, at least 60% ee, at least 65% ee, at least 70% ee, at least 75 % ee, at least 80% ee, at least 85% ee, at least 90% ee, at least 95% ee, at least 96% ee, at least 97% ee, at least 98% ee, or at least 99% ee.
  • Diaportheone A1 of the present invention has an optical activity of 95% ee or more.
  • Diaportheone A1 of the present invention has an optical activity of 99% ee or more.
  • enantiomeric excess refers to those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. It has a self-understood meaning, meaning the absolute value of the difference in mole fractions of one enantiomer and the other enantiomer, which is to be expressed herein as percent enantiomeric excess (% ee) expressed as a percentage of enantiomeric excess (ee).
  • the optical purity of the S-isomer in the mixture is at least 99% ee, it means that the mixture contains at least 99.5% of the S-isomer and less than 0.5% of the R-isomer.
  • Diaportheone A2 is a synthetic analogue of the natural product Diaportheone A of the present specification and has a structure in which the hydroxyl group connected to carbon 8 of Diaportheone A is substituted with a methoxy group,
  • R a compound in which the absolute configuration of carbon is R, it refers to a compound represented by the following formula (2), which is enantiomerically related to Diaportheone A1:
  • Diaportheone A2 of the present invention is as follows: R-1-hydroxy-8-methoxy-2,3-dihydrocyclopenta[b]chromen-9(1H)-one.
  • Diaportheone A2 of the present invention may be synthesized or purified with reference to a method known in the art to which the present invention belongs (see Tan et al., 2018), but is not limited thereto.
  • Diaportheone A2 of the present invention is at least 50% ee, at least 55% ee, at least 60% ee, at least 65% ee, at least 70% ee, at least 75% ee, at least 80% ee, an optical activity of at least 85% ee, at least 90% ee, at least 95% ee, at least 96% ee, at least 97% ee, at least 98% ee, or at least 99% ee.
  • Diaportheone A1 of the present invention has an optical activity of 95% ee or more.
  • Diaportheone A1 of the present invention has an optical activity of 99% ee or more.
  • a compound of the present invention refers to Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It means a combination of, and is meant to include a pharmaceutical composition comprising the same.
  • the term "pharmaceutically acceptable salts thereof” refers to a desired pharmacological effect, i.e., a preventive or therapeutic effect of Alzheimer's disease such as inhibition of aggregation of amyloid beta (A ⁇ ), reduction of reactive oxygen species (ROS) and mitochondria. It refers to a salt of the compound Diaportheone A1 or Diaportheone A2 of the present invention having a neuroprotective effect such as a reduction in membrane potential loss.
  • salts include inorganic acids such as hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen iodide, acetate, adipate, alginate, aspartate, benzoate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, bisulfate, sulfamate, sulfate, naph Thilate, butyrate, citrate, camphorate, camphorsulfonate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecylsulfate, ethanesulfonate, fumarate, glucoheptanoate, glycerophosphate, hemisulphate, heptano ate, hexanoate, 2-hydroxyethane sulfate, lactate, maleate, methanesulfonate, 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, oxalate, tosylate, undecanoate, etc.
  • neurotoxicity refers to the relative preservation of the structure and/or function of nerve cells or nerve tissue, and includes those having a protective effect from neurotoxicity.
  • neurotoxicity refers to a direct or indirect adverse effect on the structure or function of the nervous system by exposure to a biological, chemical, or physical agent.
  • neurodegenerative disease refers to a disease characterized by progressive loss or degeneration of the structure or function of the central nervous system or peripheral nervous system.
  • prevention refers to the prevention or protective treatment of a disease or disease state.
  • treatment refers to the reduction, suppression, sedation or eradication of a disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier" of the present invention is pharmacologically compatible with Diaportheone A1, Diaportheone A2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which are the active ingredients of the present invention, which are commonly used in the art to which the present invention pertains. can do.
  • Pharmaceutically acceptable carriers of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose , water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include excipients, stabilizers, diluents, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
  • excipients stabilizers, diluents, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers, carriers, excipients, stabilizers or diluents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, percutaneous (percutaneous) injection ) administration, intracerebral injection, intraspinal injection, and the like.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration mode, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient, An ordinarily skilled physician can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. Meanwhile, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.0001-1000 mg/kg (body weight) per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • composition of the present invention inhibits aggregation of amyloid beta (A ⁇ ).
  • Amyloid beta (A ⁇ ) refers to a polypeptide derived from amyloid precursor protein (APP).
  • Amyloid beta (A ⁇ ) of the present invention includes at least one or more amyloid beta species known in the art to which the present invention belongs, for example, A ⁇ 1-40 , A ⁇ 1-42 , A ⁇ 1 -43 , etc., but are not limited thereto.
  • composition of the present invention inhibits the production of oligomers of amyloid beta (A ⁇ ).
  • oligomer of A ⁇ refers to a soluble aggregate formed by the accumulation of amyloid beta (A ⁇ ) monomers themselves, and the A ⁇ oligomer of the present invention is a dimer, trimer (trimer), tetramer (tetramer), pentamer (pentamer) and decamer (decamer) to ADDL (A ⁇ -derived diffusible ligand), dodecamer (dodecamer) and A ⁇ *56 can contain a variety of structures.
  • composition of the present invention inhibits fibril production of amyloid beta (A ⁇ ).
  • the term “fibril of A ⁇ ” refers to an insoluble aggregate in which an oligomer of amyloid beta is integrated.
  • the composition of the present invention reduces reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS reactive oxygen species
  • the active oxygen species of the present invention is hydrogen peroxide (hydrogen peroxide, H 2 O 2 ), peroxide, superoxide (superoxide, O 2 - ), hydroxyl radical (hydroxyl radical, ⁇ OH), alkoxy radical (RO ⁇ ), peroxy radical (ROO ⁇ ), organic hydroperoxide (ROOH), singlet oxygen ( 1 O 2 ) and alpha-oxygen (alpha-oxygen, ⁇ -O) at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention reduces the loss of mitochondrial membrane potential ( ⁇ m) caused by amyloid beta or oxidative stress.
  • mitochondrial membrane potential ( ⁇ m) refers to a potential generated by a proton pump essential for energy storage processes in oxidative phosphorylation.
  • the mitochondrial membrane potential of the present invention is determined by conventional methods well known in the art, for example, Rhodamine B hexyl ester, MitoTracker Red CMXRos, Rhodamine 6G, DiS-C3(3), HRB & HR101, TMRE (tetramethylrhodamine, methyl ester) may be measured using a dyeing method, but is not limited thereto.
  • oxidative stress is caused by an imbalance between the production and accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cells and tissues and the ability of a biological system to detoxify these active products. means a phenomenon.
  • ROS reactive oxygen species
  • cell viability refers to the proportion of viable and/or healthy cells within a cell population.
  • Cell viability can be measured and/or calculated by conventional methods well known in the art.
  • the cell viability of the present invention may be measured by an ATP luminescence assay method.
  • mitochondrial dysfunction refers to loss of normal mitochondrial biological function, loss of efficiency of electron transport chain, reduction of synthesis of high-energy molecules such as ATP, free radicals increased production of reactive oxygen species, loss of mitochondrial membrane potential, mitochondrial fragmentation, mutations in mitochondrial DNA, and the like.
  • composition of the present invention reduces mitochondrial dysfunction caused by amyloid beta or oxidative stress.
  • the neurodegenerative disease of the present invention is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis sclerosis), ischemic brain injury, encephalitis, meningitis, Guillain-Barre syndrome and traumatic brain injury.
  • the neurodegenerative disease of the present invention may include a disease characterized by loss of structure or function of neurons due to oxidative stress, such as an increase in reactive oxygen species (ROS), or apoptosis of neurons.
  • ROS reactive oxygen species
  • the neurodegenerative disease of the present invention is Alzheimer's disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for preventing or treating Alzheimer's disease.
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ amyloid beta
  • PD Parkinson's disease
  • PD refers to a gradual loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra, tremor at rest, bradykinesia, and stiffness ( It refers to a neurodegenerative disease characterized by a slow progression of motor disorders such as rigidity and cognitive impairment such as dementia over a long period of time.
  • the term "Huntington's disease (HD)” is caused by a mutation in which the CAG repeat sequence is abnormally increased in the Huntington gene located on the fourth short arm (4p16.3) of chromosome 4 and is inherited as an autosomal dominant, It refers to a degenerative neurological disease accompanied by chorea, psychosis and dementia.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • Lou Gehrig's disease the cerebral cortex, brainstem and spinal cord motor neurons are gradually lost and voluntary muscle control is lost. It means a degenerative neurological disease that causes loss.
  • multiple sclerosis refers to a demyelinating disease in which the myelin sheath of nerve cells is peeled off in the central nervous system, an abnormality occurs in nerve signal conduction, and the nerve cells die.
  • ischemic brain injury refers to a state in which brain blood flow is stopped or reduced, resulting in decreased brain function or death of nerve cells.
  • encephalitis refers to an inflammatory disease of the brain caused by infection with viruses, bacteria, fungi, or parasites.
  • meningitis refers to a disease in which meninges are inflammatory due to viral or bacterial infection.
  • GNS Guide-Barre syndrome
  • IPP acute inflammatory demyelinating polyneuropathy
  • TBI traumatic brain injury
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient according to another aspect described above. It provides a method of treating a neurodegenerative disease comprising administering to a subject in need thereof.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the neurodegenerative disease is cognitive disorder, dementia, Lewy body dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease ( Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, ischemic brain injury, encephalitis, meningitis, Guillain-Barre syndrome , or traumatic brain injury.
  • cognitive disorder dementia, Lewy body dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease ( Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, ischemic brain injury, encephalitis, meningitis, Guillain-Barre syndrome , or traumatic brain injury.
  • the subject of the present invention is a mammal.
  • the mammal includes, but is not limited to, dogs, cats, cows, horses, pigs, mice, rats, guinea pigs, rabbits, non-human primates and humans. it's not going to be
  • the non-human primate is prosimians, old world monkeys, new world monkeys, or anthropoids.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient according to another aspect described above.
  • a method of neuroprotection comprising administering to a subject in need thereof.
  • Neuroprotection comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient according to another aspect of the present invention Since it is made by administering a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases by
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases by neuroprotection comprising Diaportheone A1, Diaportheone A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof as an active ingredient.
  • Figure 2 is amyloid beta 1-42 (A ⁇ 1-42 ) MDS (multimer detection system) analysis for the experimental group treated only with a negative control (negative control, No drug) and A ⁇ 1-42 with Diaportheone A1 and Diaportheone A2 show the results.
  • a ⁇ 1-42 MDS (multimer detection system) analysis for the experimental group treated only with a negative control (negative control, No drug) and A ⁇ 1-42 with Diaportheone A1 and Diaportheone A2 show the results.
  • Figure 4 shows the neuroprotective effect of Diaportheone A1 and Diaportheone A2 on amyloid beta 1-42 (A ⁇ 1-42 )-induced SH-SY5Y cells through analysis of percent cell viability.
  • Figure 6 shows the results of analysis of the ROS level of Diaportheone A2 in H 2 O 2 -induced SH-SY5Y cells.
  • Diaportheone A1 and Diaportheone A2 Two enantiomers of the present invention, Diaportheone A1 and Diaportheone A2, were synthesized with reference to a previously reported method (Tan, MA et al., 2019). More specifically, Diaportheone A1 and A2 were prepared as synthetic intermediates that were racemic mixtures in the overall synthesis of Diaportheone A (4 steps, total yield 56%). The synthesis was initiated from mono-dimethylation of commercially available methyl-2,6-dimethoxybenzoate using BCl 3 in 97% yield. The mono-dimethylated benzoate product was converted to ⁇ -ketosulfoxide in 67.2% yield as yellow crystals using sodium methylsulfinylmethide (5 equiv.
  • Diaportheone A1 and A2 obtained above are dissolved in EtOH (ethanol), MeOH (methanol), EtOAc (ethyl acetate), CHCl 3 , CH 2 Cl 2 , or DMSO (dimethyl sulfoxide) solvent to prepare a stock solution It was diluted with DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) solution so that final concentrations were 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M and 50 ⁇ M, and used as a test substance in the following examples. A composition containing only the solvent was used as a control.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Neuroblastoma SH-SY5Y cells (neuroblastoma, ATCC CRL-2266) were cultured at 37° C. and 5% CO 2 in DMEM supplemented with 10% FBS, 1% kanamycin and 1% antibiotic-antimycotic. and subcultured twice a week. In the following examples, the experiment was performed when the SH-SY5Y cells cultured by the method of Example 2 reached a cell confluency of 80% to 90%.
  • the cytotoxicity of the two test substances of the present invention was confirmed in SH-SY5Y cells using ATP luminescence assay.
  • Cell viability was measured and analyzed through the following ATP luminescence assay. 2 ⁇ 10 4 cells/well of SH-SY5Y cells were subcultured in 96-well plates and then cultured for 24 hours. Thereafter, the cells were treated with the test substance of Example 1 for 24 hours. After removing the medium, the cells were washed with PBS, a fresh medium was added, and incubated for an additional 30 minutes. Then, CellTiter-Glo® luminescent reagent was added and luminescence was checked in a multi-plate reader. Data were analyzed and percent cell viability compared to controls. Cell viability percent (%) was expressed as the mean ⁇ SD (standard deviation) of the values repeated three times, and normalized using the value of control cells. The results are shown in FIG. 1 .
  • Example 1 the two test substances of Example 1, Diaportheone A1 and Diaportheone A2, showed no toxicity in SH-SY5Y cells up to a concentration of 50 ⁇ M. Therefore, in the following examples, neuroprotection experiments were performed by applying concentrations of 1 ⁇ M, 10 ⁇ M and 20 ⁇ M.
  • Thioflavin T (ThT) analysis was performed.
  • Thioflavin T assay was performed as follows. Amyloid beta (A ⁇ 1-42 , dissolved in PBS (phosphate buffered saline)) AggreSure TM ) was incubated in a 384-well plate at 37° C. for 24 hours with or without the test substance of Example 1 or phenol red (phenol red, positive control). ThT solution (Sigma Aldrich) was added and incubated for an additional 15 minutes. The fluorescence signal (excitation wavelength (Ex, excitation wavelength): 450 nm; emission wavelength (Em, emission wavelength): 510 nm) was measured using a PerkinElmer Victor-3® micro-plate reader. As a result of the experiment, the amyloid-beta aggregation inhibition rate (%) of diaportheone A1 and A2 is shown in Table 1 below.
  • diaportheone A1 of Example 1 was 80.41% ⁇ 1.4 (50 ⁇ M), diaportheone A2 in Example 1 compared to 65.78% ⁇ 2.97 (50 ⁇ M) of amyloid beta aggregation inhibition rate of phenol red, a positive control. was 73.68% ⁇ 1.7 (50 ⁇ M), indicating a significant difference ( p ⁇ 0.05) in the aggregation inhibition rate of amyloid beta.
  • Diaportheone A1 (50 ⁇ M) 80.41% ⁇ 1.40 Diaportheone A1 (5 ⁇ M) 34.75% ⁇ 2.50 Diaportheone A2 (50 ⁇ M) 73.68% ⁇ 1.70 Diaportheone A2 (5 ⁇ M) 35.21% ⁇ 2.80 Phenol Red (50 ⁇ M) (positive control) 65.78% ⁇ 2.97
  • the present inventors confirmed the effect of the two test substances of the present invention to inhibit aggregation of amyloid beta.
  • Example 5 Inhibitory effect of amyloid beta (A ⁇ ) oligomer production
  • MDS Multimer Detection System
  • the MDS analysis method is as follows. A ⁇ in a monomer state and two types of test substances according to Example 1 were added to a microplate and incubated at room temperature. To monitor the increase in the production of A ⁇ oligomers with time, the mixture was transferred at 0 hours, 2 hours and 4 hours and stored at -80°C. After coating the plate with the A ⁇ -targeting 6E10 antibody, a blocking buffer containing bovine serum albumin (BSA) was treated.
  • BSA bovine serum albumin
  • the HRP-conjugated WO2 antibody (horseradish peroxidase conjugated WO2 antibody) that recognizes and attaches to the A ⁇ epitope overlapping with the 6E10 antibody was treated. After adding TMB (tetramethylbenzidine) solution and reacting for 30 minutes, Stop Solution was added to terminate the reaction. Absorbance was measured through a microplate reader and the values of A ⁇ oligomers were compared. The MDS data is expressed as the average of the values repeated two times. The results are shown in FIG. 2 .
  • the negative control group treated only with amyloid beta 1-42 exhibited an oligomer signal of 1.963 ⁇ 0.219 at 4 hours.
  • the oligomer signal of Diaportheone A1 according to Example 1 was 1.697 ⁇ 0.026, and the oligomer signal of Diaportheone A2 was 1.433 ⁇ 0.067.
  • the present inventors confirmed that the two test substances of the present invention directly inhibited the production of amyloid beta 1-42 oligomers.
  • the neuroprotective potential of the two test substances of the present invention was confirmed by damaging SH-SY5Y cells with A ⁇ or H 2 O 2 .
  • Neuroblastoma SH-SY5Y cells were prepared in the same way as in Example 2, and the prepared neuroblastoma SH-SY5Y cells (ATCC CRL-2266) were subcultured at 2 ⁇ 10 4 cells/well and 24 hours. incubated during After stabilization, cells were pretreated with a compound of the present invention for 6 hours before incubation with amyloid beta 1-42 (5 ⁇ M) or H 2 O 2 (100 ⁇ M).
  • a solvent control group control cells not treated with the test substance of the present invention
  • amyloid beta or H 2 O 2 alone was also tested.
  • Cell viability was measured by the ATP luminescence analysis method described in Example 3, and cell viability percent (%) was determined through three experiments. The results are shown in FIGS. 3 and 4 .
  • both of the test substances of the present invention showed a neuroprotective effect against oxidative stress in H 2 O 2 -induced SH-SY5Y cells.
  • the cell viability (%) at 20 ⁇ M concentration and at 20 ⁇ M and 10 ⁇ M concentration when Diaportheone A2 was pretreated. They showed a statistically significant difference (*: p ⁇ 0.05) to confirm their neuroprotective effect.
  • Example 1 the two test substances of Example 1, Diaportheone A1 and Diaportheone A2, were pretreated with Diaportheone A2 at 20 ⁇ M and 10 ⁇ M concentrations in amyloid beta-induced SH-SY5Y cells pretreated with Diaportheone A2.
  • the neuroprotective effect was confirmed by showing a statistically significant difference (*: p ⁇ 0.05) for cell viability (%) compared to cells treated with only amyloid beta at a concentration of 20 ⁇ M.
  • ROS levels are a mechanistic consideration as a biochemical marker for oxidative stress. ROS levels were measured using ROS-sensitive H 2 DCFDA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) staining as described below.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • the SH-SY5Y cells After stabilization of the SH-SY5Y cells cultured in the method of Example 2 for 24 hours, when oxidative stress was applied to the cells (with oxidative stress), the SH-SY5Y cells (2 ⁇ 10 4 cells/well) were treated with 2 After pretreatment with the test substance of Example 1 for hours, 100 ⁇ M of H 2 O 2 was incubated for an additional 4 hours. In the case of control cells to which oxidative stress was not applied to the cells (no oxidative stress), the test substance of Example 1 of the present invention was treated and the cells were cultured for 6 hours. Thereafter, the cells were treated with 25 ⁇ M of H 2 DCFDA and further cultured for 2 hours at 37° C. while blocking light.
  • Fluorescence intensity (Ex: 495 nm; Em: 520 nm) was measured in a microplate reader.
  • the ROS level was measured in triplicate and calculated as the percentage (100%) of control cells not treated with the test substance of the present invention.
  • the data in the graph represents the mean ⁇ SD of the values repeated three times, and * indicates a significant difference ( p ⁇ 0.05) with cells treated only with H 2 O 2 .
  • the results are shown in FIGS. 5 and 6 .
  • the mitochondrial membrane potential was measured to determine the possible mechanism of action of the neuroprotective effect of the two test substances according to Example 1.
  • Analysis of mitochondrial membrane potential (MMP, ⁇ m) was performed using a tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRE) staining method according to the manufacturer's protocol as previously known (Alvari ⁇ o et al., 2019). became After acclimatization of SH-SY5Y cells (2 ⁇ 10 4 cells/well) for 24 hours, the cells were pretreated with two test substances of Example 1 for 2 hours, and 5 ⁇ M amyloid beta 1 for 24 hours. -42 was incubated. Then, 1 ⁇ M of TMRE staining solution was added and incubated at 37° C. for 30 minutes.
  • Example 1 As shown in FIG. 7 , as a result of analyzing the mitochondrial membrane potential using a tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRE) staining kit, the two test substances of Example 1 compared to cells treated with A ⁇ alone were amyloid beta-induced SH at a concentration of 20 ⁇ M. -It was confirmed that the mitochondrial membrane potential of SY5Y cells was significantly increased ( p ⁇ 0.05).
  • TMRE tetramethylrhodamine, methyl ester
  • Diaportheone A1 and Diaportheone A2 of the present invention have an effect of preventing mitochondrial dysfunction by inhibiting the loss of mitochondrial membrane potential, thereby protecting neurons.
  • the present inventors confirmed that the two compounds of the present invention, Diaportheone A1 and A2, exhibit neuroprotective efficacy without neurotoxicity, as seen in the above Examples, and have a preventive and therapeutic effect on degenerative neurological diseases such as Alzheimer's disease did.
  • the two test substances prepared in Example 1 of the present invention namely Diaportheone A1 and A2, aggregation of amyloid beta (A ⁇ ) through the thioflavin T (ThT) analysis of Example 4 and the MDS analysis of Example 5. It was confirmed to inhibit and directly inhibit the production of amyloid beta oligomers.
  • Both H 2 O 2 and A ⁇ -induced neuroblastoma SH-SY5Y cells showed an increase in cell viability, which is a result proving that the two test substances of Example 1 have a neuroprotective effect (see Example 6).
  • Both of the test substances of Example 1 decreased the level of ROS, a biochemical marker for oxidative stress, and mitochondrial dysfunction in damaged SH-SY5Y cells (see Examples 7 and 8).
  • the pharmaceutical composition comprising Diaportheone A1, A2, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a combination thereof of the present invention as an active ingredient is A ⁇ , ROS, mitochondrial membrane potential due to oxidative damage It can be usefully used for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease by protecting nerve cells from damage to nerve cells due to degradation.

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Abstract

본 발명은 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 경우, 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)의 응집을 억제하고, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 감소시키며, 미토콘드리아 막 전위의 손실을 감소시킴으로써, 산화 스트레스에 대한 신경보호 효과가 있어, 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 발명은 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제고유번호 1711115820에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "개인기초연구(과기정통부)(R＆D)", 연구과제명은 "한국형 알츠하이머병 관련 돌연변이의 병인적 메커니즘 및 바이오마커의 multi variate 분석과 신약 개발 위한 한국형 세포와 동물 모델 개발 연구”, 주관기관은 가천대학교, 연구기간은 2020.03.01.-2023.02.28.이다.
본 특허출원은 2021년 02월 16일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0020749호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본원에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 천연물에서의 신약 발견에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이며, 또한 상기 약제학적 조성물은 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 사용된다.
크로몬(Chromone)은 벤조아닐화된 γ-피론 헤테로고리 화합물(benzoannelated γ-pyrone heterocyclic compound)로 자연에 널리 분포되어 있다. 천연물과 크로몬 구조를 갖는 합성물 모두에서 상당수의 화합물이 항염증성, 항균제, 항종양, 항당뇨, 항알레르기, 이뇨제, 저혈당, 지질 저하, 항산화 등 다양한 약리학적 특성을 보인다. 이들의 구조적 다양성과 합성 접근성 덕분에 크로몬 스캐폴드(scaffold)를 가진 화합물은 유기 합성에서 탁월한 표적이며 약물 발견과 의약 화학에서 중요한 역할을 한다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 노인들 사이에서 가장 흔한 신경 퇴행성 질환으로 기억력 상실, 치매 및 지속적인 인지 저하를 특징으로 한다. 전 세계적으로 4,700만 명의 노인이 알츠하이머병을 앓고 있으며, 2050년에는 1억 1,300만 명으로 늘어날 것으로 추정된다. 알츠하이머병의 발병 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않은 유전적 및 생화학적 요인의 복잡하고 상호 연결된 네트워크를 포함한다. 비정상적인 아밀로이드 베타(Amyloid beta, Aβ), 산화 스트레스 및 신경 염증은 AD와 관련된 병리학적 특성 중 일부이다. 알츠하이머병에 대한 치료법은 아직 없지만, 발명의 조기 단계에서의 전략적 치료가 유익한 것으로 입증되었다. 현재 미국 FDA가 알츠하이머병과 관련된 증상의 진행을 최소화하기 위해 승인한 약은 5개뿐이다. 이들은 아세틸 콜린에스테라제(acetyl cholinesterase) 억제제인 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), NMDA 수용체 길항제 메만틴(memantine)을 포함하는 천연 제품 기반 화합물이다. 이러한 약물은 알츠하이머병의 증상에 대한 증상 완화를 제공하지만 질병 진행 및 예방에 유의한 효과를 보이진 않는다. 따라서 대체 치료 또는 치료법을 찾는 데에는 어려움이 있다.
Diaportheone A1 및 Diaportheone A2는 천연물 Diaportheone A의 합성 유사체이다. 이러한 거울상 이성질체 화합물은 Diaportheone A의 전체 합성 과정에서의 중간 화합물이다. Diaportheone A1 및 Diaportheone A2는 99% ee(enantiomeric excess, 거울상 이성질체 과잉) 이상에서 얻어져 분리되었으며 X선 결정학에 의해 절대 배열이 결정되었다(Tan et al., 2019). 문헌 검색에 따르면 Diaportheone A1 및 A2의 구조와 관련된 분자 표적은 없다.
본 발명자들은 알츠하이머병의 증상 완화, 질병 진행 억제, 예방 및 치료에 유의한 효과를 제공하는 신약을 천연물에서 탐색 및 발굴하여 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 크로몬(chromone) 구조를 갖는 두 이성질체인 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2가 활성산소종(ROS) 감소 및 미토콘드리아 막 전위 손실의 감소와 같은 신경보호 효과와 아밀로이드 베타(Aβ)의 응집을 억제하는 항-아밀로이드 생성 효과를 가지는 화합물임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 Diaportheone A1은 하기 화학식 1로 표기되고, 상기 Diaportheone A2는 하기 화학식 2로 표기되는 것인, 약제학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022002211-appb-I000001
, 및
[화학식 2]
Figure PCTKR2022002211-appb-I000002
.
본 발명자들은 알츠하이머병의 증상 완화, 질병 진행 억제, 예방 및 치료에 유의한 효과를 제공하는 신약을 천연물에서 탐색 및 발굴하여 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 크로몬(chromone) 구조를 갖는 두 이성질체인 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2가 활성산소종(ROS) 감소 및 미토콘드리아 막 전위 손실의 감소와 같은 신경보호 효과와 아밀로이드 베타(Aβ)의 응집을 억제하는 항-아밀로이드 생성 효과를 가지는 화합물임을 규명하였다.
본 명세서의 화합물, "Diaportheone A"는 IUPAC 명칭이"1,8-dihydroxy-2,3-dihydro-1H-cyclopenta[b]chromen-9-one"으로도 알려진 크로몬(chromone) 구조를 가진 천연물로서, 다음의 화학식 3으로 표기되는 화합물을 의미한다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2022002211-appb-I000003
.
본 명세서의 화합물, "Diaportheone B"는 IUPAC 명칭이 "(1S,3aR,9aS)-1,8-dihydroxy-2,3,3a,9a-tetrahydro-1H-cyclopenta[b]chromen-9-one"으로도 알려진 크로몬(chromone) 구조를 가진 천연물로서, 다음의 화학식 4로 표기되는 화합물을 의미한다:
[화학식 4]
Figure PCTKR2022002211-appb-I000004
.
본 명세서에서 Diaportheone A 및 B는 열대 식물인 판다누스 아마릴리폴리우스(Pandanus amaryllifolius)의 내생 진균(endophytic fungi)인 Diaporthe sp. P133으로부터 분리되거나 본 발명이 속하는 분야에 공지된 방법(Tan et al., 2019; 및 Bungihan et al., 2011 참조)에 의해 합성될 수 있다. 또한, 본 명세서의 Diaportheone A 및 B는 포유동물에서 일반적으로 결핵을 일으키는 병원성 균주, 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 성장을 각각 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 100.9 μM 및 3.5 μM에서 억제하는 항-결핵 활성을 갖는다고 공지되어 있다(Bungihan et al., 2011 참조).
본 발명의 화합물, "Diaportheone A1"은 본 명세서의 천연물 Diaportheone A의 합성 유사체이고 Diaportheone A의 8번 탄소에 연결된 하이드록시기(hydroxyl group)가 메톡시기(methoxy group)로 치환된 구조를 가지며 1번 탄소의 절대 배열이 S인 화합물로서, Diaportheone A2와 거울상 이성질체 관계에 있는, 다음의 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022002211-appb-I000005
.
본 발명의 Diaportheone A1의 IUPAC 명칭은 다음과 같다: S-1-hydroxy-8-methoxy-2,3-dihydrocyclopenta[b]chromen-9(1H)-one.
본 발명의 Diaportheone A1은 본 발명이 속하는 분야에 공지된 방법(Tan et al., 2019 참조)을 참조하여 합성되거나 정제될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Diaportheone A1은 적어도 50% ee(enantiomeric excess, 거울상 이성질체 과잉), 적어도 55% ee, 적어도 60% ee, 적어도 65% ee, 적어도 70% ee, 적어도 75% ee, 적어도 80% ee, 적어도 85% ee, 적어도 90% ee, 적어도 95% ee, 적어도 96% ee, 적어도 97% ee, 적어도 98% ee, 또는 적어도 99% ee의 광학 활성을 갖는다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Diaportheone A1은 95% ee 이상의 광학 활성을 갖는다. 본 발명의 보다 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Diaportheone A1은 99% ee 이상의 광학 활성을 갖는다.
본 명세서의 용어, "거울상 이성질체 과잉(enantiomeric excess, ee)", "거울상 이성질체 과잉율", "거울상 이성질체 초과량", 또는 "거울상 이성질체 초과율"은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 의미를 갖는 것으로, 한 거울상 이성질체와 다른 한쪽 거울상 이성질체의 몰분율 차이의 절대값을 의미하며, 본 명세서에서는 거울상 이성질체 과잉(ee)을 백분율로 나타낸 퍼센트 거울상 이성질체 과잉(% ee)으로 표현될 수 있다.
예를 들어, 혼합물에서 S형 이성질체의 광학적 순도가 99% ee 이상인 경우, 혼합물에 S형 이성질체가 99.5% 이상으로, R형 이성질체가 0.5% 미만으로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명의 화합물, "Diaportheone A2"는 본 명세서의 천연물 Diaportheone A의 합성 유사체이고 Diaportheone A의 8번 탄소에 연결된 하이드록시기(hydroxyl group)가 메톡시기(methoxy group)로 치환된 구조를 가지며 1번 탄소의 절대 배열이 R인 화합물로서, Diaportheone A1과 거울상 이성질체 관계에 있는, 다음의 화학식 2로 표시되는 화합물을 의미한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2022002211-appb-I000006
.
본 발명의 Diaportheone A2의 IUPAC 명칭은 다음과 같다: R-1-hydroxy-8-methoxy-2,3-dihydrocyclopenta[b]chromen-9(1H)-one.
본 발명의 Diaportheone A2는 본 발명이 속하는 분야에 공지된 방법(Tan et al., 2018 참조)을 참조하여 합성되거나 정제될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Diaportheone A2는 적어도 50% ee, 적어도 55% ee, 적어도 60% ee, 적어도 65% ee, 적어도 70% ee, 적어도 75% ee, 적어도 80% ee, 적어도 85% ee, 적어도 90% ee, 적어도 95% ee, 적어도 96% ee, 적어도 97% ee, 적어도 98% ee, 또는 적어도 99% ee의 광학 활성을 갖는다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Diaportheone A1은 95% ee 이상의 광학 활성을 갖는다. 본 발명의 보다 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Diaportheone A1은 99% ee 이상의 광학 활성을 갖는다.
본 명세서의 표현 "본 발명의 화합물", "본 발명의 두 화합물", 또는 "본 발명의 두 거울상 이성질체 화합물"은 본 발명의 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 의미하고, 이를 포함하는 약제학적 조성물도 포함하는 의미이다.
본 발명의 용어, "이들의 약제학적으로 허용 가능한 염"이란, 소망하는 약리학적 효과, 즉 아밀로이드 베타(Aβ) 응집 억제와 같은 알츠하이머병의 예방 또는 치료 효과, 활성산소종(ROS) 감소 및 미토콘드리아 막 전위 손실의 감소와 같은 신경보호 효과를 가지는 본 발명의 화합물 Diaportheone A1 또는 Diaportheone A2의 염을 의미한다. 이러한 염은 염화수소, 브로민화수소, 아이오딘화수소 등의 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트, 운데카노에이트 등의 유기산을 이용하여 형성될 수 있다.
본 발명의 표현, "유효성분으로 포함하는"이란, 본 발명의 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염의 약리학적 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미하며, 약물의 전달, 안정화 및 제제화를 위하여 다양한 성분이 부가적으로 첨가될 수 있는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명의 용어, "신경보호(neuroprotection)"는 신경세포 또는 신경 조직의 구조 및/또는 기능의 상대적 보전을 의미하며, 신경독성으로부터 보호 효과가 있는 것을 포함하는 의미이다. 본 발명의 용어, "신경독성(neurotoxicity)"은 생물학적, 화학적, 또는 물리적 제제의 노출에 의한 신경계의 구조 또는 기능에 미치는 직접적 또는 간접적인 악영향을 의미한다.
본 발명의 용어, "퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease) 또는 신경퇴행성 질환"은 중추신경계 또는 말초신경계의 구조 또는 기능의 점진적인 손실 또는 퇴행을 특징으로 하는 질병을 의미한다.
본 명세서의 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서의 용어 "치료"는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것으로 본 발명의 유효성분인 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염과 약리학적으로 양립할 수 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 담체에는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 부형제, 안정제, 희석제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제, 안정제 또는 희석제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내(intravenous) 주입, 피하(subcutaneous) 주입, 근육(intramuscular) 주입, 복강(intraperitoneal) 주입, 경피(percutaneous) 투여, 뇌내(intracerebral) 주입, 척수내(intraspinal) 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)의 응집을 억제한다.
본 발명의 용어, "아밀로이드 베타(Amyloid beta, Aβ)"는 APP(amyloid precursor protein)로부터 유래된 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명의 아밀로이드 베타(Amyloid beta, Aβ)는 본 발명이 속하는 분야에 공지된 적어도 하나 이상의 아밀로이드 베타 종(amyloid beta species)을 포함하고, 예를 들어 Aβ1-40, Aβ1-42, Aβ1-43 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)의 올리고머 생성을 저해한다.
본 발명의 용어 "Aβ의 올리고머(oligomer)"는 아밀로이드 베타(Aβ) 모노머(monomer) 자체가 서로 집적되어 형성된 가용성(soluble) 응집물을 의미하며, 본 발명의 Aβ 올리고머는 다이머(dimer), 트라이머(trimer), 테트라머(tetramer), 펜타머(pentamer) 및 데카머(decamer)에서 ADDL(Aβ-derived diffusible ligand), 도데카머(dodecamer) 및 Aβ*56에 이르는 다양한 구조를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)의 피브릴 생성을 저해한다.
본 발명의 용어 "Aβ의 피브릴(fibril)"은 아밀로이드 베타의 올리고머가 집적된 난용성(insoluble) 응집물을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 감소시킨다.
본 발명의 용어, "활성산소종(ROS)"은 산소를 포함하고 세포에서 다른 분자와 쉽게 반응하는 불안정한 분자 종류를 의미한다. 세포 내에 활성산소종이 축적되면, DNA, RNA, 단백질 등이 손상되어 세포가 사멸할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 활성산소종은 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 과산화물(peroxide), 초과산화물(superoxide, O2 -), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 알콕시 라디칼(alkoxy radical, RO·), 퍼옥시 라디칼(peroxy radical, ROO·), 유기 하이드로퍼옥사이드(organic hydroperoxide, ROOH), 일중항산소(singlet oxygen, 1O2) 및 알파-산소(alpha-oxygen, α-O)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 아밀로이드 베타 또는 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, ΔΨm) 손실을 감소시킨다.
본 발명의 용어, "미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, ΔΨm)"는 산화적 인산화에서 에너지 저장 과정에 필수적인 양성자 펌프에 의해 생성되는 전위를 의미한다. 본 발명의 미토콘드리아 막 전위는 본 발명이 속하는 분야에 널리 알려진 통상적인 방법, 예를 들어, Rhodamine B hexyl ester, MitoTracker Red CMXRos, Rhodamine 6G, DiS-C3(3), HRB & HR101, TMRE(tetramethylrhodamine, methyl ester) 염색 방법 등을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "산화 스트레스(oxidative stress)"는 세포 및 조직에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생산 및 축적과 이러한 활성 산물을 해독하는 생물학적 시스템의 능력 사이의 불균형에 의해 유발되는 현상을 의미한다.
본 발명의 용어, "세포 생존율(cell viability)"은 세포 집단 내에서 살아있는 및/또는 건강한 세포의 비율을 의미한다. 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 통상적인 방법으로 세포 생존율을 측정 및/또는 계산할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 세포 생존율은 ATP 발광 검정(ATP luminescence assay) 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 용어, "미토콘드리아 기능장애(mitochondrial dysfunction)"는 정상적인 미토콘드리아의 생물학적 기능의 상실을 의미하며, 전자전달계(electron transport chain)의 효율 상실, ATP와 같은 고-에너지 분자의 합성 감소, 활성산소종(reactive oxygen species)의 생산 증가, 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential)의 손실, 미토콘드리아 단편화(mitochondrial fragmentation), 미토콘드리아 DNA의 돌연변이 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 아밀로이드 베타 또는 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아 기능장애를 감소시킨다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's diseases), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 허혈성 뇌손상(ischemic brain injury), 뇌염(encephalitis), 뇌수막염(meningitis), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 퇴행성 신경질환은 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 증가와 같은 산화 스트레스에 의한 신경세포의 구조 또는 기능의 손실, 또는 신경세포 사멸을 특징으로 하는 질병을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)"이란 대뇌 피질, 해마 등의 뇌 영역에서 아밀로이드 베타(Aβ) 침착으로 인해 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)가 형성되고, 단백질 타우(tau)가 미세소관(microtubule)에 결합하여 신경원섬유 엉킴(neurofibrillary tangle)이 형성되는, 점진적인 기억력의 상실, 인지 능력의 감소, 및 치매를 수반하는 퇴행성 신경질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "파킨슨병(Parkinson's diseases, PD)"이란 뇌 흑질(substantia nigra)의 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)가 점차 소실되고, 안정 시 떨림(tremor), 서동증(bradykinesia), 강직(rigidity) 등의 운동성 장애와 치매 등의 인지 기능 장애가 장기간에 걸쳐 서서히 진행되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "헌팅턴병(Huntington's disease, HD)"이란, 염색체 4번 단완(4p16.3)에 위치한 헌팅턴 유전자에 CAG 반복서열이 비정상적으로 증가되는 돌연변이에 의해 발병되어 상염색체 우성으로 유전되고, 무도증(chorea), 정신증(psychosis) 및 치매(dementia)를 수반하는 퇴행성 신경질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)"이란, 루게릭병(Lou Gehrig's disease)으로도 알려져 있으며, 대뇌 피질, 뇌간 및 척수의 운동 신경세포가 점진적으로 소실되고 수의근 제어를 잃게 되는 퇴행성 신경질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "다발성 경화증(Multiple sclerosis)"이란, 중추신경계에서 신경세포의 수초(myelin sheath)가 벗겨져 신경 신호 전도에 이상이 생기고 신경세포가 사멸하는 탈수초성 질환(demyelinating disease)을 의미한다.
본 발명의 용어, "허혈성 뇌손상(ischemic brain injury)"이란, 뇌혈류가 정지 또는 감소되어 뇌의 기능이 저하되거나 신경세포의 사멸이 유발되는 상태를 의미한다.
본 발명의 용어, "뇌염(encephalitis)"이란, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 또는 기생충의 감염으로 인한 뇌의 염증성 질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "뇌수막염(meningitis)"이란, 바이러스 또는 세균의 감염에 의해 뇌수막(meninges)에 염증이 발생하는 질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome, GBS)"이란, 말초신경계가 면역계에 의해 퇴화되어 근육이 약해지는 증상을 나타내는 급성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP)이라고도 알려진 질환을 의미한다.
본 발명의 용어, "외상성 뇌손상(traumatic brain injury, TBI)"이란, 머리에 물리적 충격을 주거나 머리를 관통하는 손상으로 발생할 수 있는 뇌의 정상적인 기능의 감소 또는 소실된 상태를 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다른 일 양태에 따른 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 인지 장애(cognitive disorder), 치매(dementia), 루이소체치매(Lewy body dementia) 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's diseases), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 허혈성 뇌손상(ischemic brain injury), 뇌염(encephalitis), 뇌수막염(meningitis), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 또는 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 대상체(subject)는 포유동물이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 포유동물은 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 마우스, 랫트, 기니피그, 토끼, 비-인간 영장류(non-human primate) 및 인간을 포함하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 비-인간 영장류는 원원류(prosimians), 구세계 원숭이(old world monkeys), 신세계 원숭이(new world monkeys), 또는 유인원(anthropoid)이다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다른 일 양태에 따른 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경 보호 방법을 제공한다.
본 발명의 상술한 퇴행성 신경질환의 치료 방법 및 신경 보호 방법은 상술한 다른 일 양태에 따른 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 투여함으로써 이루어지므로, 중복되는 내용을 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 이용하는 경우, 아밀로이드 베타 응집을 방지하고, 활성산소종을 감소시키며 미토콘드리아 막 전위의 손실을 감소시켜 산화 스트레스를 감소시킬 수 있어, 유의한 신경보호 효과가 있고, 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 ATP 발광 방법(ATP luminescence assay)을 사용하여 측정한 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2에 대한 신경모세포종 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율 퍼센트(% cell viability) 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 아밀로이드 베타 1-42(Aβ1-42)만 처리한 음성 대조군(negative control, No drug)과 Aβ1-42에 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2를 처리한 실험군에 대한 MDS(multimer detection system) 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 세포 생존율 퍼센트(% cell viability)의 분석을 통한 H2O2-유도 SH-SY5Y 세포에 미치는 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2의 신경보호 효과를 나타낸다.
도 4는 세포 생존율 퍼센트(% cell viability)의 분석을 통한 아밀로이드 베타 1-42(Aβ1-42)-유도 SH-SY5Y 세포에 미치는 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2의 신경보호 효과를 나타낸다.
도 5는 H2O2-유도 SH-SY5Y 세포에서의 Diaportheone A1의 ROS 수준 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 H2O2-유도 SH-SY5Y 세포에서의 Diaportheone A2의 ROS 수준 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 Aβ1-42-유도 SH-SY5Y 세포에서의 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2의 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, ΔΨm) 분석 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. Diaportheone A1 및 Diaportheone A2의 합성
이전에 보고된 방법(Tan, M.A. et al., 2019)을 참조하여 본 발명의 두 거울상 이성질체인 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2를 합성하였다. 보다 상세하게는 Diaportheone A1 및 A2는 Diaportheone A의 전체 합성에서 라세미 혼합물인 합성 중간체로 제조되었다(4 단계, 전체 수율 56%). 합성은 97% 수율로 BCl3를 사용하여 상업적으로 입수 가능한 메틸-2,6-디메톡시벤조에이트(methyl-2,6-dimethoxybenzoate)의 모노-디메틸화로부터 개시되었다. 모노-디메틸화된 벤조에이트 생성물은 소듐 메틸설파닐메타이드(sodium methylsulfinylmethide)를 사용하여 황색 결정으로서 67.2% 수율의 β-케토설폭사이드(β-ketosulfoxide)로 전환되었다(5당량 NaH/25당량 DMSO, 70℃, 1시간). 37% 숙신알데히드(succinaldehyde) 및 촉매량의 메틸 피페리딘(methyl piperidine)과 함께 β-케토설폭사이드를 처리함으로써 원-팟 고리화(one-pot cyclization) 및 in situ 열 신-제거(thermal syn-elimination)를 통해 86% 수율로 diaportheone A1 및 A2의 라세미 혼합물 얻었다. 라세미 혼합물은 Chiralpak IG 컬럼을 이용하여 분취(preparative) SFC 방법으로 분리되었다. 두 거울상 이성질체 모두 99% ee 초과를 나타내었고 각각의 절대 배열은 X-선 결정학에 의해 분명하게 결정되었다(Tan MA et al., 2019).
상기에서 얻은 Diaportheone A1 및 A2를 EtOH(에탄올), MeOH(메탄올), EtOAc(에틸 아세테이트), CHCl3, CH2Cl2, 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용매에 용해하여 저장 용액(stock solution)을 제조하였고, 최종 농도가 1 μM, 10 μM, 20 μM 및 50 μM이 되도록 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 용액으로 희석하여 이하의 실시예에서 시험물질로 사용하였다. 용매만을 포함하는 조성물을 대조군으로 사용하였다.
실시예 2. SH-SY5Y 세포 배양(cell culture) 방법
신경모세포종 SH-SY5Y 세포(neuroblastoma, ATCC CRL-2266)는 10% FBS, 1% 카나마이신(kanamycin) 및 1% 항생제-항균제(antibiotic-antimycotic)가 보충된 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었고, 일주일에 2회 계대 배양되었다. 이하의 실시예에서는 실시예 2의 방법으로 배양된 SH-SY5Y 세포가 80% 내지 90%의 세포밀집도(cell confluency)에 도달한 시점에서 실험을 수행하였다.
실시예 3. 본 발명의 시험물질 2종 자체의 세포독성 확인
신경보호 실험에 적용될 수 있는 적절한 농도를 결정하기 위해 ATP 발광 분석을 사용하여 SH-SY5Y 세포에서 본 발명의 시험물질 2종 자체의 세포독성을 확인하였다.
세포 생존율(cell viability)은 다음과 같은 ATP 발광 분석(ATP luminescence assay)을 통해 측정되고 분석되었다. 2 Х 104 세포/well의 SH-SY5Y 세포를 96-웰 플레이트에서 계대 배양한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포에 24시간 동안 상술한 실시예 1의 시험물질을 처리하였다. 배지(media)를 제거하고, 세포를 PBS로 세척(washing)한 뒤, 새로운 배지를 첨가하고, 추가로 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, CellTiter-Glo® luminescent 시약을 첨가하고 발광을 다중-플레이트 판독기(multi-plate reader)에서 확인하였다. 데이터를 분석하고 세포 생존율 퍼센트(%)를 대조군에 비교하였다. 세포 생존율 퍼센트(%)는 3번의 실험을 반복한 값의 평균 ± SD(standard deviation)로 표현되었고, 대조 세포의 값을 사용하여 정규화하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 시험물질 2종, Diaportheone A1 및 Diaportheone A2는 SH-SY5Y 세포에서 50 μM 농도까지 독성이 없는 것으로 나타났다. 따라서, 이하의 실시예에서는 1 μM, 10 μM 및 20 μM 농도를 적용하여 신경보호 실험을 수행하였다.
실시예 4. 아밀로이드 베타(Aβ) 응집의 억제 효과
본 발명의 시험물질 2종이 아밀로이드 베타 1-42의 응집을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT) 분석을 수행하였다.
티오플라빈 T 분석은 다음과 같이 수행하였다. PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 아밀로이드 베타(Aβ1-42, AggreSureTM)를 384-웰 플레이트(384-well plate)에서 37℃로 24시간 동안 상술한 실시예 1의 시험물질 또는 페놀 레드(phenol red, 양성 대조군)와 함께 혹은 함께하지 않고 배양하였다. ThT 용액(Sigma Aldrich)을 첨가하고 추가로 15분 동안 배양하였다. 형광 신호(excitation wavelength(Ex, 여기 파장): 450 nm; emission wavelength(Em, 방사 파장): 510 nm)는 마이크로-플레이트 판독기(PerkinElmer Victor-3® micro-plate reader)를 사용하여 측정되었다. 실험의 결과로 diaportheone A1 및 A2의 아밀로이드-베타 응집 억제율(%)을 아래 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, ThT 분석 결과, 양성 대조군인 페놀 레드의 아밀로이드 베타 응집 억제율 65.78% ± 2.97(50 μM)과 비교하여 실시예 1의 diaportheone A1은 80.41% ± 1.4(50 μM), diaportheone A2는 73.68% ± 1.7(50 μM)로 아밀로이드 베타 응집 억제율을 나타내 유의한 차이(p <0.05)가 있었다.
구분 아밀로이드-베타 응집 억제율(%)
Diaportheone A1 (50 μM) 80.41% ± 1.40
Diaportheone A1 (5 μM) 34.75% ± 2.50
Diaportheone A2 (50 μM) 73.68% ± 1.70
Diaportheone A2 (5 μM) 35.21% ± 2.80
페놀 레드 (50 μM)(양성 대조군) 65.78% ± 2.97
상기 결과로부터, 본 발명자들은 본 발명의 시험물질 2종이 아밀로이드 베타의 응집을 억제하는 효과를 확인하였다.
실시예 5. 아밀로이드 베타(Aβ) 올리고머 생성의 저해 효과
본 발명의 시험물질 2종이 아밀로이드 베타 1-42 올리고머의 생성을 저해할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 MDS(Multimer Detection System) 분석을 수행하였다.
MDS 분석 방법은 다음과 같다. 모노머(monomer) 상태의 Aβ와 실시예 1에 따른 시험물질 2종을 마이크로플레이트(microplate)에 첨가하여 상온에서 인큐베이션(incubation)하였다. 시간에 따른 Aβ 올리고머(oligomer)의 생성 증가를 모니터링하기 위하여 0시간, 2시간 및 4시간에 혼합물을 옮겨서 -80℃에 보관하였다. Aβ를 타겟으로 하는 6E10 항체를 플레이트에 코팅(coating)한 뒤에 BSA(bovine serum albumin)가 포함된 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 처리하였다. 시간별로 얼려 두었던 Aβ와 약물 혼합물을 Aβ 올리고머를 검출하기 위하여, 6E10 항체와 중복되는 Aβ 에피톱(epitope)을 인식하여 이에 부착하는 HRP 컨쥬게이션 된 WO2 항체(horseradish peroxidase conjugated WO2 antibody)를 처리하였다. TMB(tetramethylbenzidine) Solution을 첨가하여 30분 동안 반응한 뒤 Stop Solution을 넣어 반응을 종결시켰다. 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 통해 흡광도를 측정하여 Aβ 올리고머의 값을 비교하였다. MDS 데이터는 2번의 실험을 반복한 값의 평균으로 나타내었다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, MDS 분석 결과, 아밀로이드 베타 1-42만 처리한 음성 대조군은 4시간대에서 1.963 ± 0.219의 올리고머 신호(oligomer signal)를 나타냈다. 실시예 1에 따른 Diaportheone A1의 올리고머 신호는 1.697 ± 0.026이었으며, Diaportheone A2의 올리고머 신호는 1.433 ± 0.067로 나타났다.
상기 결과로부터, 본 발명자들은 본 발명의 시험물질 2종이 아밀로이드 베타 1-42 올리고머의 생성을 직접적으로 저해함을 확인하였다.
실시예 6. Aβ 또는 H2O2에 대한 신경세포 보호 효과 - 세포 생존율
본 발명의 시험물질 2종의 신경보호 가능성은 Aβ 또는 H2O2로 SH-SY5Y 세포를 손상시킴으로써 확인하였다. 실시예 2와 같은 방법으로 신경아세포종 SH-SY5Y 세포를 준비하여, 준비된 신경모세포종 SH-SY5Y 세포(neuroblastoma SH-SY5Y cell, ATCC CRL-2266)를 2 Х 104 세포/well로 계대 배양하고 24시간 동안 배양하였다. 안정화시킨 후, 세포는 아밀로이드 베타 1-42(5 μM) 또는 H2O2(100 μM)와 함께 배양하기 전에 6시간 동안 본 발명의 화합물로 전처리하였다. 용매 대조군(본 발명의 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포), 아밀로이드 베타 또는 H2O2 단독, 및 본 발명의 시험물질만 처리한 실험군 또한 실험하였다. 세포생존율은 실시예 3에 기재된 ATP 발광 분석 방법으로 측정하였고, 세포 생존율 퍼센트(%)는 세 번의 실험을 통해 결정되었다. 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
1) H2O2-유도 세포 손상에 대한 신경 보호 효과
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 시험물질 2종, Diaportheone A1 및 Diaportheone A2 모두 H2O2-유도 SH-SY5Y 세포에서 산화 스트레스에 대한 신경보호 효과를 보였다. H2O2 단독 처리군과 비교할 때, H2O2를 처리한 세포에 Diaportheone A1을 전처리한 경우 20 μM 농도에서, Diaportheone A2를 전처리한 경우 20 μM 및 10 μM 농도에서 세포 생존율(%)에 대한 통계적으로 유의한 차이(*: p <0.05)를 나타내 이들의 신경보호 효과를 확인하였다.
2) Aβ-유도 세포 손상에 대한 신경 보호 효과
도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 시험물질 2종, Diaportheone A1 및 Diaportheone A2는 아밀로이드 베타-유도 SH-SY5Y 세포에서 Diaportheone A1를 전처리한 경우 20 μM 및 10 μM 농도에서, Diaportheone A2를 전처리한 경우 20 μM 농도에서 아밀로이드 베타만 처리된 세포에 비해 세포 생존율(%)에 대한 통계적으로 유의한 차이(*: p <0.05)를 나타내 이들의 신경보호 효과를 확인하였다.
실시예 7. 신경세포 보호 기작의 확인 - 활성 산소종의 생산 저해
실시예 1에 따른 시험물질 2종이 보이는 신경보호 효과의 가능한 작용 기작을 결정하기 위해 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 수준을 측정하였다. ROS 수준은 산화 스트레스에 대한 생화학적 마커로서 메커니즘적인 고려사항이다. ROS 수준은 아래에 기재한 바와 같이 ROS-민감성 H2DCFDA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) 염색법을 사용하여 측정하였다.
활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)의 측정은 이전에 보고된 대로 H2DCFDA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) 염색 방법을 사용하여 수행되었다(Gonzalez-Sarrias et al., 2016; 및 Peρalver et al., 2020 참조).
실시예 2의 방법으로 배양한 SH-SY5Y 세포의 24시간 안정화 후, 산화 스트레스를 세포에 가한 경우(산화 스트레스 있음, with oxidative stress), SH-SY5Y 세포(2 Х 104 세포/well)를 2시간 동안 실시예 1의 시험물질로 전처리한 후 100 μM의 H2O2로 추가 4시간 동안 배양하였다. 산화 스트레스를 세포에 가하지 않은 대조 세포의 경우(산화 스트레스 없음, no oxidative stress), 본 발명의 실시예 1의 시험물질을 처리하여 세포를 6시간 동안 배양하였다. 이후 상기 세포에 25 μM의 H2DCFDA로 처리하고 37℃에서 빛을 차단시킨 채 2시간 동안 추가 배양하였다. 형광 강도(Ex: 495 nm; Em: 520 nm)는 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)에서 측정되었다. ROS 수준은 3회 반복 측정되었으며, 본 발명의 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포의 백분율(100%)로 계산되었다. 그래프의 데이터는 세 번 반복 시행한 값의 평균 ± SD를 나타내며, * 표시는 H2O2만을 처리한 세포와의 유의미한 차이(p <0.05)를 보이는 것을 의미한다. 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 각각 나타낸 바와 같이, 본 발명의 시험물질 2종, Diaportheone A1 및 Diaportheone A2를 처리한 실험군에서 H2O2만을 처리한 세포 대비 20 μM 농도에서 H2O2-유도 SH-SY5Y 세포에서의 세포 내 활성산소종(ROS) 수준이 감소하였음을 확인하였다.
상기 결과로부터 본 발명의 시험물질 2종은 H2O2-처리 SH-SY5Y 세포에서 ROS 생성을 감소시킴으로써 신경세포 보호 효능을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 8. 신경세포 보호 기작의 확인 - 미토콘드리아의 막 전위 손실의 억제
실시예 1에 따른 시험물질 2종이 보이는 신경보호 효과의 가능한 작용 기작을 결정하기 위해 미토콘드리아 막 전위를 측정하였다. 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm)의 분석은 이전에 공지된 바(Alvariρo et al., 2019)와 같이 제조업체의 프로토콜에 따라 TMRE(tetramethylrhodamine, methyl ester) 염색 방법을 사용하여 수행되었다. SH-SY5Y 세포(2 Х 104 세포/well)를 24시간 동안 순응화(acclimatization) 한 후, 세포를 2시간 동안 실시예 1의 시험물질 2종으로 전처리하여 24시간 동안 5 μM의 아밀로이드 베타 1-42와 함께 인큐베이션 하였다. 이후 1 μM의 TMRE 염색 용액을 첨가하고 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 형광 강도(Ex: 549 nm; Em: 575 nm)를 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)에서 확인하였다. ΔΨm은 3회 반복 측정하였으며 본 발명의 화합물을 처리하지 않은 대조군 세포의 백분율(100%)로 계산되었다. 그래프의 * 표시는 Aβ가 처리된 세포와 비교할 때, p <0.05인 경우를 의미하며, 데이터는 세 번 반복 시행한 값의 평균 ± SD를 나타낸다. 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, TMRE(tetramethylrhodamine, methyl ester) 염색 키트를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 분석한 결과, Aβ만을 처리한 세포 대비 실시예 1의 시험물질 2종이 20 μM 농도에서 아밀로이드 베타-유도 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 막 전위를 유의하게 증가시켰음(p <0.05)을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 결과로부터 본 발명의 Diaportheone A1 및 Diaportheone A2가 미토콘드리아 막 전위의 손실을 억제함으로써 미토콘드리아의 기능장애를 예방하여 신경세포를 보호하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
통계 분석
달리 언급되지 않는 한, 본 발명에 따른 실시예의 데이터는 최소 3회 반복 실험값의 평균 ± SD(standard deviation)로 계산되었다. 통계 분석은 Levene의 테스트와 Tukey의 HSD(honestly significant difference) 테스트를 사용한 일원분산분석(one-way ANOVA)에 의해 결정되었다. * p <0.05에서 통계적 유의성을 갖는 것으로 나타냈다.
결론
본 발명자들은 상기 실시예에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 두 화합물 Diaportheone A1 및 A2가 신경독성을 나타내지 않으면서도 신경보호 효능을 나타내어, 알츠하이머병 등의 퇴행성 신경질환에 대한 예방 및 치료 효과를 가지고 있다는 것을 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 실시예 1에서 제조한 시험물질 2종, 즉 Diaportheone A1 및 A2는 실시예 4의 티오플라빈 T(ThT) 분석과 실시예 5의 MDS 분석을 통해 아밀로이드 베타(Aβ)의 응집을 억제하고 아밀로이드 베타 올리고머의 생성을 직접적으로 저해하는 것으로 확인되었다. H2O2 및 Aβ 유발 신경모세포종 SH-SY5Y 세포에서 모두 세포 생존율 증가를 보였으며, 이는 실시예 1의 시험물질 2종이 신경보호 효과를 가진다는 것을 입증하는 결과이다(실시예 6 참조). 실시예 1의 시험물질 2종 모두 손상된 SH-SY5Y 세포에서 산화 스트레스에 대한 생화학적 마커인 ROS 수준과 미토콘드리아 기능장애를 감소시켰다(실시예 7 및 8 참조). 따라서, 상기 결과들로부터 본 발명의 Diaportheone A1, A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 Aβ, ROS, 산화적 손상에 의한 미토콘드리아의 막 전위 저하로 인한 신경세포 손상으로부터 신경세포를 보호함으로써 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 신경보호에 의한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 Diaportheone A1은 하기 화학식 1로 표기되고, 상기 Diaportheone A2는 하기 화학식 2로 표기되는 것인, 약제학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022002211-appb-I000007
    , 및
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022002211-appb-I000008
    .
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)의 응집을 억제하는 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)의 올리고머 생성을 저해하는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 감소시키는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 활성산소종은 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 과산화물(peroxide), 초과산화물(superoxide, O2 -), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 알콕시 라디칼(alkoxy radical, RO·), 퍼옥시 라디칼(peroxy radical, ROO·), 유기 하이드로퍼옥사이드(organic hydroperoxide, ROOH), 일중항산소(singlet oxygen, 1O2) 및 알파-산소(alpha-oxygen, α-O)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 또는 산화 스트레스에 의한 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, ΔΨm) 손실을 감소시키는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증, 허혈성 뇌손상, 뇌염, 뇌수막염, 길랑-바레 증후군 및 외상성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약제학적 조성물.
  8. Diaportheone A1, Diaportheone A2, 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료 방법.
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