WO2022169254A1 - 장내 미생물 또는 이로부터 유래된 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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WO2022169254A1
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prevotella histicola
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백인경
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국민대학교 산학협력단
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    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating sleep disorders, and/or a food composition for preventing or improving sleep disorders.
  • the size of the insomnia treatment market in the United States is about 2 trillion won, and recently, it has been growing by more than 20% every year.
  • the representative sleep disorder drug in the US is a product called Stilnox, which accounts for about 50% of the domestic sleeping pill market as well as the US.
  • sleeping pills are effective in short-term use, but long-term use of more than 4 weeks has problems of dependence and side effects. Therefore, interest in natural sleep aids that can replace sleeping pills is gradually increasing, and the market size is expanding.
  • there are more than 10 types of natural sleep aids most commonly used in the United States and European countries, and there are very limited reports of the effects of these sleeping aids on the treatment of insomnia through scientific studies.
  • Gut microbiota refers to microorganisms including bacteria, archaea, and fungi living in the human digestive tract, According to the above, it was confirmed that the intestinal microflora is mainly composed of the following three enterotypes: Prevotella, Bacteroides and Ruminococcus.
  • microorganisms of the genus Prevotella are mainly related to carbohydrates and monosaccharides, and Bacteroides is known to be related to proteins, amino acids and saturated fats. Furthermore, depending on the diet, one enterotype may predominate, and changing the diet results in a corresponding change in the number of species (Wu et al, "Linking Long-Term Dietary Patterns with Gut Microbial Enterotypes”. Science , 2011). A 2021 study found that childhood diet and exercise could significantly affect the overall composition and diversity of the microbiome in adulthood (Monica P. McNamara et al, "Early-life effects of juvenile Western diet and exercise on adult gut microbiome composition in mice", The Journal of Experimental Biology , 2021).
  • the present inventors made earnest efforts to discover a safer natural product-derived sleep aid. As a result, the present invention was completed by confirming that Prevotella histicola , one of human intestinal microbes, or a culture solution thereof, has an effect by increasing sleep time and decreasing elevation time and awakening time.
  • compositions for preventing, improving or treating sleep disorders comprising Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or fermented product as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for the prevention, improvement or treatment of sleep disorders comprising the extracellular vesicles derived from Prevotella histicola as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising administering to a subject a composition comprising Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or fermented product. have.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising administering to a subject a composition comprising an extracellular vesicle derived from Prevotella histicola .
  • Another object of the present invention is to provide a therapeutic use of Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or ferment.
  • Another object of the present invention is to provide a therapeutic use of the extracellular vesicles derived from Prevotella histicola .
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising the steps of:
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising the step of preparing an extracellular vesicle derived from a Prevotella histicola strain.
  • the present invention provides a composition for preventing, improving or treating sleep disorders comprising Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or fermented product as an active ingredient do.
  • the present invention provides a composition for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising the extracellular vesicles derived from Prevotella histicola as an active ingredient.
  • Prevotella histicola or “ Prevotella histicola strain” is an anaerobic and non-motile Gram-negative bacilli of the genus Prevotella, which is a strain of the human oral or gastrointestinal tract. It is a symbiotic strain in The Prevotella histicola or Prevotella histicola strain is not limited thereto, but is preferably a group consisting of accession numbers KCTC 15171, CCUG 55407, DSM 19854, JCM 15637, CCUG 60372, KCCM13103P, KCCM13104P and KCCM13105P. It is a Prevotella histicola of an accession number selected from.
  • KCTC is the Korean Collection for Type Cultures
  • CCUG is the Culture Collection University of Gothenburg
  • DSM is the DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
  • JCM is the Japan Collection of Microorganisms
  • KCCM is the Korean Microorganism Conservation Center. it means.
  • the Prevotella histicola is KCCM13103P ( Prevotella histicola KCOM 3796), KCCM13104P ( Prevotella histicola KCOM 4081) and KCCM13105P ( Prevotella histicola KCOM 4227) deposited with the Korea Microorganism Conservation Center on January 11, 2022. It is selected from the group consisting of.
  • Prevotella histicola contained in the composition according to the present invention may exist as live cells or dead cells, and may also exist in a dried or lyophilized form.
  • Forms of lactic acid bacteria suitable for inclusion in various compositions and methods of formulation are well known to those skilled in the art.
  • Prevotella histicola is a culture obtained by culturing in a known liquid medium or solid medium, or a fermented product obtained by culturing the strain and additional components together, or extracting the strain with an organic solvent. It may be formulated in the form of an extract, dissolving the cell membrane of the strain, or lysate (or lysate) processed by crushing or homogenization, but is not limited thereto.
  • the composition may be a composition comprising a Prevotella histicola strain existing as a live cell or a dead cell.
  • the composition may be a composition comprising a culture, lysate, extract or fermented product of a Prevotella histicola strain.
  • the composition may be a composition comprising an extracellular vesicle derived from Prevotella histicola , a culture, lysate, extract or ferment thereof.
  • Extracellular vesicles enable the exchange of substances (proteins, lipids, genetic materials) between cells, and function as a physiological/pathological mediator to transmit signals.
  • the extracellular vesicles are largely classified into exosomes and microvesicles. Exosomes vary in size depending on the origin of the organism, and are intraluminal vesicles generated by the endosomal membrane entering in the process of maturation of multi-vesicular endosomes. It is secreted when it binds to the cell surface. Microvesicles are 50-1000 nm in size, and are vesicles from which the plasma membrane protrudes and separates and is secreted out of the cell.
  • Each cell produces an extracellular ER differently according to the physiological state and secretes an extracellular ER with a specific lipid/protein/nucleic acid composition (Jaewook Lee (2019). Illumination on the cell biology of the extracellular ER. BRIC View 2019-R03 ).
  • extracellular vesicle is used to include the exosomes and microvesicles.
  • the exosomes or extracellular vesicles have various diameters within the range of about 1-1,000 nm, and the Prevotella histicola- derived exosomes preferably have a diameter of 10-800 nm, most preferably 10-600 nm. have
  • exosomes or extracellular vesicles contained in the composition of the present invention are contained in a large amount in the Prevotella histicola culture (eg, culture supernatant).
  • exosomes or extracellular vesicles are contained in a large amount in the Prevotella histicola culture (eg, culture supernatant), so that the purified exosomes or extracellular vesicles themselves are used as therapeutic agents, or Cultures, lysates, extracts or fermented products containing a large amount of exosomes or extracellular vesicles may be used as therapeutic agents.
  • Prevotella histicola culture eg, culture supernatant
  • the term “isolation” or “extract” refers to selectively extracting a desired substance (eg, exosome) in a biological sample (eg, Prevotella histicola culture). It includes both the process of obtaining (positive isolation) as well as the process of selectively removing impurities other than the desired material (negative isolation). Therefore, the term “separation” may be used synonymously with “obtain”, “extract”, and “purify”.
  • any method commonly used in the art may be used without limitation, for example, the commercialized exosome separation kit (eg, EXO-BB , ExoQuick ® -ULTRA, ExoQuick ® -TC , Capturem TM Exosome Isolation Kit, Total Exosome Isolation Kit, ExoTrap TM Exosome Isolation Spin Column Kit, Exo2DTM, etc.) centrifugation), separation by size (eg, ultrafiltration or vacuum filter), separation based on affinity for a particular substrate (eg, affinity chromatography) within a heterogeneous sample.
  • the commercialized exosome separation kit eg, EXO-BB , ExoQuick ® -ULTRA, ExoQuick ® -TC , Capturem TM Exosome Isolation Kit, Total Exosome Isolation Kit, ExoTrap TM Exosome Isolation Spin Column Kit, Exo2DTM, etc.
  • centrifugation separation by size (eg, ultrafiltration
  • the culture, lysate, extract or fermented product of the Prevotella histicola contains intracellular vesicles and intraluminal vesicles ( ILVs ) of the Prevotella histicola. , endosomes and/or multi-vesicular endosomes (MVEs).
  • ILVs intraluminal vesicles
  • MVEs multi-vesicular endosomes
  • the endoplasmic reticulum in the cell can be secreted into exosomes through binding to the plasma membrane of Prevotella histicola .
  • the Prevotella histicola culture, lysate, extract or fermented product of the Prevotella histicola includes microvesicles and/or exosomes. It may contain extracellular vesicles (EVs) of Kola .
  • EVs extracellular vesicles
  • the sleep disorder is at least one selected from the group consisting of insomnia, breathing-related sleep disorder, and circadian rhythm sleep disorder. will be.
  • the term “insomnia” refers to a case in which the days of not being able to sleep continue even though one wants to sleep, and thereby, daytime activities are disturbed.
  • the insomnia includes sleep onset insomnia, in which it is difficult to fall asleep, sleep maintenance insomnia, in which it is difficult to fall asleep with frequent waking during sleep, and sleep termination in which it is difficult to fall asleep by waking up early in the morning.
  • Insomnia is divided into three main types.
  • the term “breathing-related sleep disorder” refers to a case in which drowsiness or insomnia is induced due to a breathing disorder during sleep. Respiratory disorders cause regular breathing during sleep, or breathing stops for a while. The main symptom is excessive drowsiness, which is caused by the inability to get a good night's sleep due to frequent waking up in order to breathe normally during night sleep.
  • the breathing-related sleep disorders There are three major types of respiratory disorders in the breathing-related sleep disorders. The first is obstructive sleep apnea syndrome. to be. The second is central sleep apnea syndrome, which refers to a case in which breathing stops during sleep due to neurological disease or heart disease, although there is no airway obstruction. Finally, central alveolar hypoventilation syndrome is a phenomenon in which arterial oxygen levels are reduced due to impaired respiratory control.
  • the term “circadian rhythm sleep disorder” refers to a case in which drowsiness or insomnia is repeated due to a change in the sleep-wake cycle. That is, excessive drowsiness or insomnia is repeated and continued due to incongruity between the sleep-wake cycle required by the environment (eg, night shift, foreign travel, etc.) and the individual's circadian sleep-wake cycle.
  • the circadian rhythm sleep disorder is divided into four types.
  • the first type is the delayed sleep phase type, in which an individual's sleep-wake cycle is delayed more than socially required.
  • the second type is the advanced sleep phase type, which refers to a case in which a person falls asleep in the early evening and wakes up early in the morning and cannot sleep anymore, and is a common symptom in the elderly.
  • the third type is the jet lag type, in which the sleep-wake cycle required in a new time zone and the individual's sleep-wake cycle do not match due to foreign travel.
  • the fourth type is the shift work type, in which the sleep-wake cycle required by shift work and the individual's sleep-wake cycle do not match.
  • the prevention, improvement or treatment of the sleep disorder is by increasing the total sleep time.
  • the Prevotella histicola administration group of the present invention showed an increase in total sleep time (24 hours recorded) compared to Prevotella stercorea as a control group (FIG. 3) .
  • the prevention, improvement or treatment of the sleep disorder is by an increase in non-REM (NREM) sleep time.
  • NREM non-REM
  • the Prevotella histicola administration group of the present invention showed an increase in NREM sleep time compared to Prevotella stercorea as a control group (FIG. 4).
  • the prevention, improvement or treatment of the sleep disorder is by an increase in REM sleep time.
  • the Prevotella histicola administration group of the present invention showed an increase in REM sleep time compared to Prevotella stercorea as a control group (FIG. 5).
  • the prevention, improvement or treatment of the sleep disorder is due to a decrease in the time to rise.
  • the Prevotella histicola administration group of the present invention exhibited a more reduced overall elevation time compared to Prevotella stercorea as a control group (FIG. 6).
  • the prevention, improvement or treatment of the sleep disorder is by reducing the total wake-up time.
  • the Prevotella histicola- administered group of the present invention showed a result in which the overall awakening time was gradually reduced compared to Prevotella stercorea as a control group (FIG. 7).
  • the extracellular vesicles derived from the Prevotella histicola strain of the present invention exhibited increased total sleep time and decreased total wake time (FIG. 9).
  • the extracellular vesicles derived from the Prevotella histicola strain of the present invention exhibited increased NREM sleep time (FIG. 10).
  • the composition is a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a therapeutically effective amount of Prevotella histicola , a culture, lysate, extract or ferment thereof; Or the Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or fermented extracellular vesicles derived from; it provides a method for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising administering to a subject in need thereof .
  • the present invention provides for use in therapy of Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or ferment.
  • the therapeutic use is for the treatment of sleep disorders.
  • subject refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experiment, and preferably may be a human or animal in need of prevention, improvement and/or treatment of sleep disorders.
  • composition according to the present invention may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration for example, intravenous injection, transdermal administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravitreal injection, eye drop administration, intracerebroventricular injection, intrathecal injection (intrathecal injection), intraamniotic injection, intraarterial injection, intraarticular injection, intracardiac injection, intracavernous injection, intracerebral injection ( intracerebral injection, intracisternal injection, intracoronary injection, intracranial injection, intradural injection, epidural injection, intrahippocampal injection ), intranasal injection, intraosseous injection, intraperitoneal injection, intrapleural injection, intraspinal injection, intrathoracic injection, Intrathymic injection, intrauterine injection, intravaginal injection, intraventricular injection, intravesical injection, subconjunctival injection (su) bconjunctival injection), intratumoral injection, local injection, intraperitoneal injection, etc. can be administered.
  • intrathecal injection intraamniotic injection, intraarterial injection,
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not significantly stimulate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered component.
  • a pharmaceutically acceptable carrier in the present specification may be used by mixing one component or one or more components among saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and these components, Other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary to form an injection suitable for injection into tissues or organs.
  • a target organ-specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier so as to act specifically on the target organ. Suitable formulations known in the art may be those disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition of the present invention may further include a filler, an excipient, a disintegrant, a binder and a lubricant.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • administration means introducing the composition of the present invention to a subject by any suitable method, and the administration route of the composition of the present invention is administered through various routes, either oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue. can be
  • composition of the present invention may be administered by intramuscular injection or intraperitoneal injection during clinical administration.
  • a pharmacologically compatible buffer such as Hank's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer.
  • a pharmacologically compatible buffer such as Hank's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer.
  • an impermeable agent suitable for the barrier to be passed is used in the formulation.
  • Such impermeable agents are generally known in the art.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • an effective amount means an amount necessary to delay or completely stop the onset or progression of a specific disease to be treated, and the effective amount of Prevotella histicola contained in the pharmaceutical composition of the present invention is It means the amount required to achieve the prevention, improvement or therapeutic effect of sleep disorders. Accordingly, the effective amount is the type of disease, the severity of the disease, the type and content of other components contained in the composition, and the age, weight, general health status, sex and diet of the patient, administration time, administration route, treatment period, concurrent use It can be adjusted depending on various factors including the drug being used. It is apparent to those skilled in the art that a suitable total daily amount can be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend on the specific composition, age, weight, general health, and sex of the patient, including the type and extent of the response to be achieved and, if desired, whether other agents are used. and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, duration of treatment, drug used together with or concurrently with a specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • treatment refers to an approach for obtaining beneficial or desirable clinical results.
  • beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, alleviation of symptoms, reduction in the extent of disease, stabilization (ie, not exacerbation) of disease state, delay or reduction in rate of disease progression, disease state improvement or temporary relief and alleviation (partial or total), detectable or undetectable.
  • Treatment can also mean increasing survival as compared to the expected survival rate in the absence of treatment.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic measures.
  • Such treatments include the treatment required for the disorder being prevented as well as the disorder that has already occurred.
  • “Improving” or “alleviating” a disease means that the extent and/or undesirable clinical signs of the disease state are reduced and/or the time course of progression is slowed, compared to no treatment. means lengthening.
  • the composition of the present invention is a food composition.
  • Prevotella histicola contained in the food composition of the present invention its culture, lysate, extract or fermented product; Or Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or fermented extracellular vesicles derived from the above can be applied as it is all of the above.
  • the food composition may include a health functional food or a form of seasoning, beverage, bar, or the like.
  • the food composition comprising the strain as an active ingredient may include a beverage such as fermented milk.
  • the present invention provides a lactic acid bacteria starter for food fermentation consisting of Prevotella histicola or a culture thereof.
  • the food composition of the present invention may be prepared by using a phytologically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, a lubricant, and a lubricant. agent or flavoring agent, etc. may be used.
  • the food composition may be preferably formulated as a food composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
  • the active ingredient may be combined with an orally, non-toxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and color-developers may also be included in the mixture.
  • suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, tracacanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate. ate, sodium acetate, sodium chloride, and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methylcellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • acceptable pharmaceutical carriers which are sterile and biocompatible, include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • the food composition according to the present invention can be added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, vitamin complexes, and health supplements.
  • the food composition of the present invention may include ingredients commonly added during food production, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • examples of the above-mentioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; and polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agent natural flavoring agents [taumatine, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • stevia extract eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the present invention is Prevotella histicola , a culture, lysate, extract or ferment thereof; Or the Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or fermented extracellular vesicles derived from; provides a feed additive or feed containing as an active ingredient.
  • the composition When used as a feed additive, the composition may be 20 to 90% highly concentrated or may be prepared in powder or granular form.
  • the feed additives include organic acids such as citric acid, humic acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate), polyphenol, catechin, alpha-tocopherol, rosemary Extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, any one or more of natural antioxidants such as phytic acid may be further included.
  • the composition When used as a feed, the composition may be formulated in the form of a conventional feed, and may include common feed ingredients together.
  • the feed additive and feed include grains such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; plant protein feeds, such as feeds based on rape, soybean, and sunflower; animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Sugar and dairy products, for example, may further include dry ingredients made of various powdered milk and whey powder, and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • the feed additive may be administered alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additive can be easily administered to the animal as a top dressing, directly mixing them with animal feed, or in an oral formulation separate from the feed.
  • a food pharmaceutically acceptable edible carrier as is well known in the art to prepare an immediate release or sustained release formulation.
  • Such edible carriers may be solid or liquid, for example cornstarch, lactose, sucrose, soybean flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, a capsule, a powder, a troche or a sugar-containing tablet, or a top dressing in a microdispersed form.
  • the feed additive may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup or suspension, emulsion, or solution.
  • the feed additives and feed may contain auxiliary agents, for example, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, and the like.
  • the feed additive may be used by being added to animal feed by immersion, spraying, or mixing.
  • the feed or feed additive of the present invention can be applied to a number of animal diets including mammals, poultry and fish.
  • the mammal As the mammal, it can be used for pigs, cattle, sheep, goats, laboratory rodents, and laboratory rodents, as well as pets (eg, dogs, cats), etc., and as the poultry, chickens, turkeys, ducks, geese, pheasants, And it can be used for quail, etc., and can be used for trout as the fish, but is not limited thereto.
  • the feed or feed additive of the present invention may be applied to animal diet and used for animal growth, immune enhancement, and the like.
  • the amount of Prevotella histicola strain included in the composition according to the present invention may be about 10 6 to 10 12 cfu/ml based on one time, for example, 10 7 to 10 11 cfu/ml, 10 8 to 10 11 cfu/ml.
  • administering the strain it is preferable to administer it in a live state, and it can be killed or administered in an attenuated state before ingestion.
  • a sterilization process through a heat treatment process may be additionally performed.
  • the amount of strain required to have the minimum efficacy and the daily intake level may vary depending on the body or health of the ingester, but in general, it may be about 10 6 to 10 12 cfu/ml, for example, 10 7 to 10 11 cfu/ml , 10 8 to 10 11 cfu/ml.
  • the amount of extracellular vesicles derived from Prevotella histicola strain contained in the composition according to the present invention may be the amount of extracellular vesicles isolated from about 10 6 to 10 12 cfu/ml based on one time. , such as the amount of extracellular vesicles isolated from 10 7 to 10 11 cfu/ml, 10 8 to 10 11 cfu/ml.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising the steps of:
  • the manufacturing method may further comprise the step of (c) isolating the extracellular vesicles from the culture solution.
  • the present invention provides a method of preparing a composition for preventing, improving or treating sleep disorders, comprising the step of preparing an extracellular vesicle derived from a Prevotella histicola strain.
  • the present invention is Prevotella histicola , its culture, lysate, extract or ferment; Or the extracellular vesicles derived from Prevotella histicola ; provides a composition for the prevention, improvement or treatment of sleep disorders comprising as an active ingredient.
  • Prevotella histicola or extracellular vesicles comprising the composition of the present invention increase total sleep time, non-REM (NREM) sleep time and REM sleep time, as well as elevation time and It can be used as a safe drug for the prevention and treatment of sleep disorders due to the reduction of wake-up time.
  • NREM non-REM
  • Figure 2 shows a picture of the sleep EEG system.
  • Figure 6 shows the result of comparing the changed elevation time (24-hour recording) compared to the total elevation time (time taken to fall asleep) initially measured in the sleep EEG test.
  • FIG. 8 shows the results of examining changes in non-REM sleep time (recorded for 24 hours) in sleep EEG by dividing the groups into groups.
  • a sample of Prevotella stercorea a microorganism found in the human body and corresponding to the second highest proportion of the genus Prevotella
  • the representative strain Prevotella histicola KCTC 15171; CCUG 55407; DSM 19854; JCM 15637.
  • Prevotella histicola (CCUG 60372) samples from other strains were orally administered to Experimental Group 2
  • Prevotella histicola KCCM13103P in Experimental Group 3
  • KCCM13105P in Experimental Group 4
  • samples collected from the oral cavity of Koreans to Experimental Groups 3 and 4 were orally administered.
  • 1 ml of distilled water was orally administered at the same time (between 08:00 and 09:00) every day from 5 days before the start of sleep measurement.
  • the animal experiment using EV consisted of two groups of experimental groups and 4 animals were tested in each group.
  • experimental group 5 EV samples of the representative strain Prevotella histicola (KCTC 15171; CCUG 55407; DSM 19854; JCM 15637) were administered to experimental group 6.
  • EV samples of Prevotella histicola (KCCM13105P) collected from the oral cavity of Koreans were orally administered.
  • 1 ml of distilled water was orally administered at the same time (between 08:00 and 09:00) every day from 5 days before the start of sleep measurement.
  • 4.56 mg (the amount extracted from the number of live cells 1 X 10 9 cfu) was orally administered to the experimental group 5, and 2 mg was orally administered to the experimental group 6 daily.
  • EEG 2 channel electroencephalography
  • EMG 1 channel electromyography
  • the classification of sleep stages is divided into waking state (wake), non-REM sleep state (non-rapid eye movement, deep sleep state), and REM sleep state (rapid eye movement, light sleep state) and analyzed.
  • EEG acquisition conditions were set to sampling rate 200 Hz and preamplification gain 10, and channel acquisition conditions were set to gain 1 for EEG, filter Hz to 25, EMG to gain 1, and filter Hz to 100.
  • Sleep EEG results were obtained in all experimental white papers.
  • the initial sleep measurement values were measured for 1-2 days (measured values on 2 days were average values), and sleep measurements recorded on the 1st, 4th, and 7th days after microbial administration (measured in all groups) and sleep measurements (control group, experimental group 1, and experimental group 4 only) were used until day 1-3 after stopping the administration of microorganisms.
  • the comparison between the control group and the experimental group was performed by comparing the calculated value of how the sleep measurement value changed from the initial sleep measurement value (subsequent sleep measurement value - initial sleep measurement value).
  • the Mann-Whitney U Test a non-parametric statistical method, was used, and p ⁇ 0.05 was judged to be significant in a two-sided test.
  • the experimental group showed a gradual increase in sleep time compared to the initial sleep measurement value after administration of the microorganism, and the control group showed little change or a slight decrease in sleep time.
  • the control group it was found that on the 7th day of the administration of the microorganisms, the sleep time was increased by 1 hour or more in Experimental Group 1 and Experimental Group 3 (p ⁇ 0.05). Although it was not statistically significant in Experimental Group 2 and Experimental Group 4, it was found that the sleep time increased on the 7th day after administration of the microorganism compared to before administration.
  • non-REM sleep time which is a particularly deep sleep state. 4 shows the results of comparing the changed non-REM sleep time (24-hour recording) compared to the non-REM sleep time (24-hour recording) initially measured in the sleep EEG test.
  • the non-REM sleep time significantly increased (p ⁇ 0.05) on the 7th day of administration of the microorganism, and while other experimental groups showed an increase, the control group showed a slight decrease.
  • the non-REM sleep time increased by about 1 hour, indicating that the quality of sleep was significantly improved.
  • the REM sleep time showed an overall increase during the period of microbial administration, and in particular, the REM sleep time increased by about 30 minutes on the 4th and 7th days of the microbial administration in experimental group 1 compared to the control group (p ⁇ 0.05). This increase is considered to be a simultaneous increase in light sleep time in experimental group 1, in which the total sleep time itself increased the most.
  • Figure 6 shows the result of comparing the changed elevation time (24-hour recording) compared to the total elevation time (time taken to fall asleep) initially measured in the sleep EEG test. There was no significant difference, but compared to the control group, the overall elevation time was decreased in the experimental group 1, and it was found that when they started to fall asleep, they fell asleep about 25 minutes earlier. In addition, in Experimental Group 2 and Experimental Group 3, on the first day of microbial administration, on the 7th day of microbial administration in Experimental Group 4, the elevation time was further reduced compared to the control group.
  • 7 and 8 are a statistical test comparing the initial sleep measurement value in the sleep EEG, and the initial sleep measurement value by dividing the change in the sleep measurement value during and after cessation of administration of the microorganism into a control group and an experimental group (including only Experimental Group 1 and Experimental Group 4) show the results.
  • FIG. 7 shows the results of examining changes by dividing the initially measured sleep time and awakening time (recorded for 24 hours) into a control group, an experimental group 1, and an experimental group 4 in the sleep EEG.
  • the control group the total sleep time repeatedly decreased and increased from the first day of microbial administration to the 7th day and the third day after administration was stopped, but in the end, it was analyzed that there was no significant change because the initial measured sleep time and the last measured sleep time were almost the same.
  • Experimental Group 1 the sleep time increased from the first day of administration of the microorganisms, and it increased rapidly on the 4th and 7th days, and it was found that the increase trend was maintained until the 3rd day after the administration was stopped.
  • FIG. 8 shows the results of examining changes in non-REM sleep time (recorded for 24 hours) in sleep EEG by dividing the groups into groups.
  • the non-REM sleep time repeatedly decreased and increased from the first day to the 7th day after administration of the microorganisms and from the last day of stopping the administration, but in the end, the initial measured non-REM sleep time and the last measured non-REM sleep time were almost the same, so there was no significant change.
  • the sleep time increased from the first day of administration of the microorganisms, and it increased rapidly on the 7th day, and it was found that the increase trend was maintained until the 3rd day after the administration was stopped.
  • the non-REM sleep time increased until the 7th day of administration of the microorganisms, and the increase was similar to the results of Experimental Group 1, however, after discontinuation of administration, the results were maintained rather than increased.
  • Sleep EEG results were obtained in all experimental white papers.
  • the initial sleep measurement values were either 1-day (experimental group 6) or 2-day average values (experimental group 5), and sleep measurements recorded up to the 1st, 3rd, and 6th days after EV administration were used. Although there are limitations in terms of statistical significance due to the small number of experimental animals in the results, the trend of change was evident.
  • non-REM sleep time (recorded for 24 hours), which is a deep sleep state measured in sleep EEG.
  • the daytime sleep time increased from the first day of EV administration, it steadily increased until the 3rd and 6th days, and the non-REM sleep time increased by about 30 minutes in the experimental group 5 and 40 minutes in the experimental group 6, and the increased sleep time in FIG. The result was increased with deep sleep time.

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Abstract

본 발명은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 상기 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체;를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물이 포함하는 프레보텔라 히스티콜라 또는 세포밖 소포체는 총 수면시간, 비렘(Non-REM, NREM) 수면시간 및 렘(REM) 수면시간의 증가와 더불어, 입면시간 및 각성시간의 감소로 수면장애의 예방 및 치료를 위한 안전한 약물로 사용될 수 있다.

Description

장내 미생물 또는 이로부터 유래된 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 수면장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 및/또는 수면장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
미국의 불면증 치료제 시장 규모는 약 2조원에 달하고, 최근에는 매년 20% 이상의 성장률을 보이고 있다. 미국의 대표적인 수면장애 의약품은 스틸녹스라는 제품으로 미국뿐 아니라, 국내 수면제 시장의 약 50%의 시장 점유율을 나타내고 있다. 일반적으로 수면제는 단기적 사용시 효과가 좋지만, 4주 이상의 장기 복용은 의존성 및 부작용의 문제를 가지고 있고, 특히 불면증 유병률이 높은 노인에게는 복용 시 부작용의 주의가 요해진다. 따라서 수면제를 대체할 수 있는 천연 수면보조제에 대한 관심이 점차 높아져 그 시장 규모가 확대되어가고 있는 실정이다. 현재 미국과 유럽 국가에서 가장 흔히 사용되고 있는 천연 수면보조제가 10종 이상이 되는데, 불면증 치료에 대한 이들 수면보조제의 효과를 과학적 연구를 통해 보여준 보고는 매우 제한적이다. 미국의 소비자 보고서에 의하면 수면제를 이용한 사람들의 64%, 수면보조제를 이용한 사람들의 20%가 수면증진 효과를 경험한 것으로 나타나 실제로 수면보조제의 유용성이 매우 낮음을 알 수 있다. 국내의 경우, 현재 식품의약품안전처에서 인정한 수면증진 및 개선용 건강기능식품인 국내 천연 수면보조제 제품은 거의 전무한 실정이며, 관련 기능성 원료에 대한 연구도 제한적이다. 향후 노인 인구의 증가와 함께 의료비를 줄이면서 불면증을 해결하려고 하는 요구도가 높아질 것으로 예측되는데, 안전하고 저렴한 천연 수면증진 소재의 발굴이 요구된다.
장내 미생물(Gut microbiota, gut flora, 또는 microbiome)은 인간의 소화기관 내에서 살아가는 박테리아(bacteria), 고세균(archaea), 곰팡이균(fungi) 등을 포함하는 미생물을 의미하며, 다양한 연구 및 통계자료에 의하면 상기 장내 미생물은 주로 다음의 3가지 엔테로타입(enterotype)으로 구성되어 있음이 확인 되었다: 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데스(Bacteroides) 및 루미노코쿠스(Ruminococcus).
이중 프레보텔라 속 미생물은 주로 탄수화물 및 단당류와 관련이 있으며, 박테로이데스는 단백질, 아미노산 및 포화 지방과 관련이 있다고 알려져 있다. 또한, 식이요법에 따라 하나의 엔테로타입이 우세할 수 있으며, 식이 요법을 변경하면 종의 수에 상응하는 변화가 발생한다(Wu et al, "Linking Long-Term Dietary Patterns with Gut Microbial Enterotypes". Science, 2011). 2021년 연구에 따르면 어린 시절의 식단과 운동이 성인이 되었을 때 미생물군의 전체 구성과 다양성에 상당한 영향을 미칠 수 있다고 발표되었다(Monica P. McNamara et al, "Early-life effects of juvenile Western diet and exercise on adult gut microbiome composition in mice", The Journal of Experimental Biology, 2021).
따라서, 상기 식단 및 생활방식에 따라 변경된 장내 미생물의 구성 및 다양성이 어떠한 질병의 발생이나 진행과 연관되어 있는지를 확인하는 연구들이 증가되고 있다.
하지만, 아직까지 상기 장내 미생물과 인간을 포함한 포유류들에 있어서의 수면패턴 간 상관관계에 대한 연구, 혹은 상기 장내 미생물을 이용한 천연 수면보조제의 연구는 미흡한 실정이다. 이미 인체 내에 존재하는 상기 장내 미생물을 이용한 수면보조제가 개발될 경우, 오랜 시간 지속적인 효과를 나타내면서도 내성 없이 보다 안전한 수면을 제공할 수 있을 것이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 보다 안전한 천연물 유래의 수면 보조제를 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과 인간의 장내 미생물 중 하나인 프레보텔라 히스티콜라 또는 이의 배양액이 수면시간의 증가와 더불어, 입면시간 및 각성시간의 감소로 효능이 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물의 치료 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체의 치료 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다:
(a) 프레보텔라 히스티콜라 균주를 준비하는 단계; 및
(b) 상기 균주를 배양액에서 배양하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 프레보텔라 히스티콜라 균주 유래의 세포밖 소포체를 준비하는 단계를 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola), 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프레보텔라 히스티콜라" 또는 "프레보텔라 히스티콜라 균주"는 혐기성이며 운동성이 없는 그람 음성 간균(Gram-negative bacilli)인 프레보텔라 속 균주로서, 인간의 구강이나 위장관에 공생하는 균주이다. 상기 프레보텔라 히스티콜라 또는 프레보텔라 히스티콜라 균주는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 기탁번호 KCTC 15171, CCUG 55407, DSM 19854, JCM 15637, CCUG 60372, KCCM13103P, KCCM13104P 및 KCCM13105P로 구성된 군으로부터 선택되는 기탁번호의 프레보텔라 히스티콜라인 것이다.
상기 기탁번호와 관련하여, KCTC는 Korean Collection for Type Cultures, CCUG는 Culture Collection University of Gothenburg, DSM은 DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, JCM은 Japan Collection of Microorganisms, KCCM은 한국미생물보존센터를 의미한다.
상기 기탁번호 KCTC 15171의 프레보텔라 히스티콜라는 CCUG 55407, DSM 19854, JCM 15637와 동일한 균주로 알려져 있다.
보다 바람직하게는 상기 프레보텔라 히스티콜라는 2022년 1월 11일자로 한국미생물보존센터에 기탁된 KCCM13103P(Prevotella histicola KCOM 3796), KCCM13104P(Prevotella histicola KCOM 4081) 및 KCCM13105P(Prevotella histicola KCOM 4227)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 프레보텔라 히스티콜라는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 프레보텔라 히스티콜라는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 배양물이거나, 상기 균주와 추가의 성분을 함께 배양하여 수득한 발효물이거나, 상기 균주를 유기용매로 추출한 추출물, 상기 균주의 세포막을 용해시키거나, 파쇄 또는 균질화 처리한 용해물(또는 파쇄물) 등의 형태로 제제화할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 생균 또는 사균으로 존재하는 프레보텔라 히스티콜라균주를 포함하는 조성물일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은 프레보텔라 히스티콜라균주의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물을 포함하는 조성물일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물로부터 유래된(derived) 세포밖 소포체(Extracellular vesicle)를 포함하는 조성물일 수 있다.
세포밖 소포체(extracellular vesicles, EVs)는 세포 간의 물질(단백질, 지질, 유전물질) 교환을 가능하게 하며, 생리적/병리적으로 신호를 전달하는 매개체로서 기능한다. 세포밖 소포체는 크게 엑소좀(exosomes)과 마이크로베시클 (microvesicles)로 분류된다. 엑소좀은 생물의 기원에 따라 그 크기가 다양하며, 다중 소포 엔도좀(multi-vesicular endosomes)이 성숙하는 과정에서 엔도좀 막이 안쪽으로 들어와 생성된 내강 소낭(intraluminal vesicles)인데, 다중 소포 엔도좀이 세포 표면과 결합할 때 분비된다. 마이크로베시클은 크기가 50-1000 nm로, 원형질막(plasma membrane)이 바깥으로 솟아나와 분리되어 세포 밖으로 분비되는 소낭이다. 각 세포들은 생리적 상태에 따라 세포밖 소포체를 다르게 생성하고, 특정한 지질/단백질/핵산 조성을 갖는 세포밖 소포체를 분비한다(이재욱(2019). 세포밖 소포체의 세포 생물학에 대한 조명. BRIC View 2019-R03).
본 명세서에서 용어 "세포밖 소포체"는 상기 엑소좀(exosomes) 및 마이크로베시클 (microvesicles)을 포함하는 의미로 사용된다.
상기 엑소좀 또는 세포밖 소포체는 약 1-1,000 ㎚ 범위 내에서 다양한 직경을 가지며, 프레보텔라 히스티콜라 유래 엑소좀은 바람직하게는 10-800 ㎚, 가장 바람직하게는 10 내지 600 nm의 직경을 가진다.
본 발명의 조성물이 포함하는 엑소좀 또는 세포밖 소포체는 프레보텔라 히스티콜라 배양액(예를 들어, 배양 상등액) 내에 다량으로 포함되어 있다.
상기 엑소좀 또는 세포밖 소포체는 프레보텔라 히스티콜라 배양물(예를 들어, 배양 상등액) 내에 다량으로 포함되어 있어, 이를 분리하여 정제된 엑소좀 또는 세포밖 소포체 자체를 치료제로 활용하거나, 상기 엑소좀 또는 세포밖 소포체를 다량으로 포함하는 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물을 치료제로 활용할 수도 있다.
본 명세서에서 용어 “분리(isolation)” 또는 "추출(extract)"은 생물학적 시료(예를 들어, 프레보텔라 히스티콜라 배양물) 내에서 목적하는 물질(예를 들어, 엑소좀)을 선택적으로 수득하는 과정(positive isolation) 뿐 아니라 목적하는 물질 이외의 불순물을 선택적으로 제거하는 과정(negative isolation)을 모두 포함한다. 따라서 용어 “분리”는 “수득(obtain)”, “추출(extract)”, “정제(purify)”와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 엑소좀 또는 세포밖 소포체를 분리하는 과정은, 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 상용화된 엑소좀 분리키트(예를 들어, EXO-BB, ExoQuick® -ULTRA, ExoQuick®-TC, CapturemTM Exosome Isolation Kit, Total Exosome Isolation Kit, ExoTrapTM Exosome Isolation Spin Column Kit, Exo2DTM 등)를 활용하거나, 용액 내 성분들 간 비중 차이에 따른 분리(예를 들어 원심분리법), 크기에 따른 분리(예를 들어 한외여과 또는 진공 필터), 특정 기질에 대한 친화도에 기반한 분리(예를 들어 친화성 크로마토그래피)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 비균질 시료 내에서 목적 물질의 고유의 물성에 기반한 분리 방법으로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프레보텔라 히스티콜라의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물에는 상기 프레보텔라 히스티콜라의 세포내의 소포체(vesicles), 내강 소포체(intraluminal vesicles, ILVs), 엔도좀(endosomes) 및/또는 다중 소포 엔도좀(multi-vesicular endosomes, MVEs)을 포함할 수 있다.
상기 세포내의 소포체는 프레보텔라 히스티콜라의 원형질막(plasma membrane)과의 결합을 통해 엑소좀(exosomes)으로 분비될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프레보텔라 히스티콜라의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물에는 마이크로베시클(microvesicles) 및/또는 엑소좀(exosomes)을 포함하는 상기 프레보텔라 히스티콜라의 세포밖 소포체(Extracellular vesicles, EVs)를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수면장애는 불면증 (insomnia), 호흡관련 수면장애 (breathing-related sleep disorder) 및 일주기 리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorder)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이다.
본 명세서에서 용어 "불면증(insomnia)"은 잠을 자고 싶어도 잠을 이루지 못하는 날들이 지속되고 이로 인해 낮 동안의 활동에 장애를 받게 되는 경우를 의미한다.
상기 불면증은 그 양상에 따라 잠들기가 어려운 수면시작 불면증(sleep onset insomnia), 수면 중에 잠을 자주 깨며 다시 잠들기가 어려운 수면유지 불면증(sleep maintenance insomnia), 아침에 일찍 잠에서 깨어 잠을 이루지 못하는 수면종료 불면증(sleep terminal insomnia) 등 크게 3가지 유형으로 구분된다.
본 명세서에서 용어 "호흡 관련 수면장애(breathing-related sleep disorder)"는 수면 중의 호흡장애로 인하여 졸음이나 불면증이 유발되는 경우를 의미한다. 호흡장애로 인해 수면 중에 규칙적인 호흡이 어렵거나 한동안 호흡이 멈춰지는 현상이 나타나는데 이때 잠에서 깨어나게 된다. 주된 증상은 과도한 졸음으로 이러한 졸음은 야간수면 시에 정상적인 호흡을 하기 위해서 자주 잠에서 깨어나게 되어 숙면을 취하지 못하기 때문에 발생한다.
상기 호흡 관련 수면장애에서 나타나는 호흡장애는 크게 3가지 유형이 있는데, 그 첫째는 폐색성 수면 무호흡증(obstructive sleep apnea syndrome)으로 수면 도중에 기도가 막혀 무호흡이나 호흡저하가 반복적으로 나타나는 경우로서, 가장 흔한 유형이다. 둘째는 중추성 수면 무호흡증(central sleep apnea syndrome)으로서 기도의 막힘은 없으나 신경학적 질환이나 심장질환 등으로 인하여 수면 중에 호흡정지가 나타나는 경우를 말한다. 마지막으로 중추성 폐포 환기저하증(central alveolar hypoventilation syndrome)은 호흡조절기능의 손상으로 인해 동맥의 산소수준이 감소되는 현상이다.
본 명세서에서 용어 "일주기 리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorder)"는 수면-각성 주기의 변화로 인해 졸음이나 불면이 반복되는 경우를 의미한다. 즉 환경(예: 야간근무, 외국여행 등)에 의해 요구되는 수면-각성 주기와 개인의 일주기 수면-각성 주기의 부조화로 인하여 과도한 졸음이나 불면이 반복되고 지속되는 경우가 이에 해당한다.
상기 일주기 리듬 수면장애는 4가지 유형으로 구분된다. 첫째 유형은 지연된 수면위상형(delayed sleep phase type)으로서 개인의 수면-각성 주기가 사회적으로 요구되는 것보다 지연되어 있는 경우이다. 두 번째 유형은 전진된 수면위상형(advanced sleep phase type)으로 초저녁에 잠이 들어 이른 새벽에 깨서 더 이상 잠을 이루지 못하는 수면주기를 가진 경우를 의미하며, 노인들에게 흔한 증상이다. 세 번째 유형은 비행기 시차형(jet lag type)으로서 외국여행으로 인해 새로운 시간대에서 요구되는 수면-각성 주기와 개인의 수면-각성 주기가 불일치하는 경우이다. 네 번째 유형은 교대 근무형(shift work type)으로서 교대근무에 의해 요구되는 수면-각성 주기와 개인의 수면-각성 주기가 불일치하는 경우이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수면장애의 예방, 개선 또는 치료는 총 수면시간의 증가에 의한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 투여군은 대조군으로서 프레보텔라 스테르코레아 (Prevotella stercorea) 대비 총 수면시간(24시간 기록)의 증가를 나타내었다(도 3).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수면장애의 예방, 개선 또는 치료는 비렘(Non-REM, NREM) 수면시간의 증가에 의한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 투여군은 대조군으로서 프레보텔라 스테르코레아 대비 비렘 수면시간이 증가하는 양상을 나타내었다(도 4).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수면장애의 예방, 개선 또는 치료는 렘(REM) 수면시간의 증가에 의한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 투여군은 대조군으로서 프레보텔라 스테르코레아 대비 렘 수면시간이 증가하는 양상을 나타내었다(도 5).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수면장애의 예방, 개선 또는 치료는 입면시간의 감소에 의한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 투여군은 대조군으로서 프레보텔라 스테르코레아 대비 전반적으로 입면시간이 더 감소된 결과를 나타내었다(도 6).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수면장애의 예방, 개선 또는 치료는 총 각성시간의 감소에 의한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 투여군은 대조군으로서 프레보텔라 스테르코레아 대비 전반적으로 각성시간이 점차적으로 더 감소된 결과를 나타내었다(도 7).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 균주 유래 세포밖 소포체는 증가된 총 수면시간 및 감소된 총 각성시간을 나타내었다(도 9).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 프레보텔라 히스티콜라 균주 유래 세포밖 소포체는 증가된 비렘 수면시간을 나타내었다(도 10).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것이다.
또한, 본 발명은 치료상 유효량의 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 상기 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물로부터 유래된 세포밖 소포체;를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물의 치료 용도(for use in therapy)를 제공한다.
본 발명 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물로부터 유래된 세포밖 소포체의 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 치료 용도 수면장애의 치료 용도인 것이다.
여기에서 사용된 “대상체(subject)”는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 수면장애의 예방, 개선 및/또는 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물일 수 있다.
본 발명에 의한 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.
비경구로 투여하는 경우, 예컨대, 정맥 내 주입, 경피 투여, 피하 주입, 근육 내 주입, 유리체 내 주입(intravitreal injection), 점안 투여(eye drop administration), 뇌실 내 주입(intracerebroventricular injection), 척추강 내 주입(intrathecal injection), 양막 내 주입 (intraamniotic injection), 동맥 내 주입 (intraarterial injection), 관절강 내 주입 (intraarticular injection), 심장 내 주입 (intracardiac injection), 음경해면체 내 주입 (intracavernous injection), 뇌 내 주입 (intracerebral injection), 뇌수조 주입 (intracisternal injection), 관상 내 주입 (intracoronary injection), 두개 내 주입 (intracranial injection), 경막 내 주입 (intradural injection), 경막 외 주입 (epidural injection), 해마 내 주입 (intrahippocampal injection), 비강 내 주입 (intranasal injection), 골강 내 주입 (intraosseous injection), 복강 내 주입 (intraperitoneal injection), 흉강 내 주입 (intrapleural injection), 척수 내 주입 (intraspinal injection), 흉곽 내 주입 (intrathoracic injection), 흉선 내 주입 (intrathymic injection), 자궁 내 주입 (intrauterine injection), 질 내 주입 (intravaginal injection), 심실 내 주입 (intraventricular injection), 방광 내 주입 (intravesical injection), 결막 하 주입 (subconjunctival injection) , 종양 내 주입 (intratumoral injection), 국소 주입 및 복강 주입(intraperitoneal injection) 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어, “약제학적으로 허용가능한 담체”란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 본 명세서에서의 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조 제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합하여 사용할 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.
또한, 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 명세서에서, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 대상체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 조성물은 임상 투여시에 근육 정맥, 또는 복강 주사에 의해 투여될 수 있다.
주사를 위해서, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와 같은 약리학적으로 맞는 버퍼로 제형될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 프레보텔라 히스티콜라의 유효량은 수면장애의 예방, 개선 또는 치료 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "개선" 또는 “완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 식품 조성물인 것이다.
본 발명의 식품 조성물이 포함하는 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물로부터 유래된 세포밖 소포체는 앞서 기술한 모든 내용을 그대로 적용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 활용될 경우, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 조미료, 음료, 바 등의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 발효유 등의 음료를 포함할 수 있다. 이에, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라 또는 이의 배양물로 이루어지는 식품 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 식품학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 식품학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 식품학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 상기 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물로부터 유래된 세포밖 소포체;를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 사료를 제공한다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 식품학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 동물식이에 적용되어 동물의 성장, 면역 강화 등을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 균주의 양은 1회를 기준으로 약 106 내지 1012 cfu/ml일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/ml, 108 내지 1011 cfu/ml일 수 있다. 균주를 투여할 경우에는 생균 상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나 감쇄(attenuation) 상태로 투여할 수 있다. 또한, 배양 상등액 등을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 106 내지 1012 cfu/ml일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/ml, 108 내지 1011 cfu/ml일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 균주 유래 세포밖 소포체의 양은 1회를 기준으로 약 106 내지 1012 cfu/ml으로부터 분리된 세포밖 소포체의 양 일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/ml, 108 내지 1011 cfu/ml으로부터 분리된 세포밖 소포체의 양 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 수면장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 프레보텔라 히스티콜라 균주를 준비하는 단계; 및
(b) 상기 균주를 배양액에서 배양하는 단계.
본 발명의 바림직한 구현예에 따르면, 상기 제조방법은 (c) 상기 배양액으로부터 세포밖 소포체를 분리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라 균주 유래의 세포밖 소포체를 준비하는 단계를 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 상기 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체;를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(ii) 본 발명의 조성물이 포함하는 프레보텔라 히스티콜라 또는 세포밖 소포체는 총 수면시간, 비렘(Non-REM, NREM) 수면시간 및 렘(REM) 수면시간의 증가와 더불어, 입면시간 및 각성시간의 감소로 수면장애의 예방 및 치료를 위한 안전한 약물로 사용될 수 있다.
도 1은 전체 실험 과정 및 기간을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 수면뇌파검사 시스템의 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 수면뇌파검사에서 초기 측정된 수면시간(24 시간 기록)에 비해 변화된 수면시간(24시간 기록)을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 수면뇌파검사에서 초기 측정된 비렘 수면시간(24 시간 기록)에 비해 변화된 비렘 수면시간(24시간 기록)을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 수면뇌파검사에서 초기 측정된 렘 수면시간(24 시간 기록)에 비해 변화된 렘 수면시간을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 수면뇌파검사에서 초기 측정된 총 입면시간(잠들기까지 걸린 시간)에 비해 변화된 입면시간(24시간 기록)을 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 수면뇌파검사에서 초기 측정된 수면시간 및 각성시간(24 시간 기록)을 대조군, 실험군1, 실험군4로 나누어서 변화를 살펴본 결과를 나타낸다.
도 8은 수면뇌파검사에서 비렘 수면시간(24 시간 기록)을 군으로 나누어서 변화를 살펴본 결과를 나타낸다.
도 9는 수면뇌파검사에서 측정된 수면시간 및 각성시간(24시간 기록)의 변화를 살펴본 결과이다.
도 10은 수면뇌파검사에서 측정된 깊은 수면 상태인 비렘 수면시간(24시간 기록)의 변화를 살펴본 결과이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
연구재료 및 방법
1. 실험 동물
본 실험에서는 7주령인 Sprague-Dawley 종 백서를 사용하였다. 모든 동물은 일정한 온도(20-21℃)에서 1주일간 09:00~21:00의 명암주기에 적응시켰고 물과 식이는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
2. 생균주 투여 동물실험 설계
생균주를 이용한 동물실험은 대조군(n=5)과 4군의 실험군, 즉 실험군1(n=5), 실험군2(n=5), 실험군3(n=4), 실험군4(n=6)를 포함하여 실험 결과를 비교하였고, 전체 실험 과정 및 기간은 도 1에 나타난 바와 같다. 대조군에게는 Prevotella stercorea(인체에서 발견되는 미생물로, 프레보텔라 속에서 두 번째로 비율이 높은 종에 해당) 시료를, 실험군1에게는 대표 균주인 Prevotella histicola(KCTC 15171; CCUG 55407; DSM 19854; JCM 15637) 시료를, 실험군2에게는 기타 균주인 Prevotella histicola(CCUG 60372) 시료를, 실험군3과 실험군4에게는 한국인 구강에서 채취한 Prevotella histicola(실험군3은 KCCM13103P, 실험군4는 KCCM13105P) 시료를 경구 투여하였다. 경구투여에 적응시키기 위해 수면 측정 시작 5일 전부터 매일 동일한 시간(08시~09시 사이)에 증류수 1 ml를 경구 투여하였다. 대조군 및 실험군1과 실험군2에게는 배지 1 ml을 08~09시 사이에 2일 간 경구 투여하면서 미생물 투여 전 초기(baseline) 수면 측정을 2일 간 실시하였고, 이후 배지에 배양한 생균 시료를 투여하였다. 실험군3과 실험군4에게는 배지 없이 동결건조한 생균 시료를 준비하여 증류수에 희석하여 투여하였기 때문에, 증류수를 08~09시 사이에 경구 투여하면서 미생물 투여 전 초기(baseline) 수면 측정을 1-2일 간 실시하였다. 각 실험군에 사용된 미생물은 확인을 위해 유전자 분석(16S rDNA 시퀀싱)을 완료하였으며, 1일 투여 시료의 생균 수는 1 X 1010 cfu로 하였다.
3. 균주의 세포밖 소포체(extracellular vesicle: EV) 투여 동물실험 설계
EV를 이용한 동물실험은 실험군 2군으로 구성되어 각 군마다 4마리씩 실험한 결과로, 실험군5에게는 대표 균주인 Prevotella histicola(KCTC 15171; CCUG 55407; DSM 19854; JCM 15637)의 EV 시료를 실험군6에게는 한국인의 구강에서 채취한 Prevotella histicola(KCCM13105P)의 EV 시료를 경구 투여하였다. 경구투여에 적응시키기 위해 수면 측정 시작 5일 전부터 매일 동일한 시간(08시~09시 사이)에 증류수 1 ml을 경구 투여하였다. EV 시료 양은 실험군5에게는 4.56 mg(생균 수 1 X 109 cfu로부터 추출된 양)을, 실험군6에게는 2 mg을 매일 경구 투여하였다.
4. 수면뇌파 측정 방법
백서의 수면상태 분석을 위해 뇌파검사(Electroencephalography, EEG 2 channel)와 근전도 검사(Electromyography, EMG 1 channel)를 수행하였다(8239 Headmount, Pinnacle Technology Inc.). 검사를 위한 장치를 두개골에 이식하기 위해 수술을 진행하였는데, 그 방법은 다음과 같다. 깊은 마취상태(isoflurane 마취)를 유도하여 백서의 머리털을 전통 커터를 이용해 깎은 후 stereotaxic device에 머리를 고정시키고 메스를 이용해 두개골이 보이도록 두피와 피하 결합조직을 함께 절개하였다. 치과용 드릴을 이용하여 두개골 4부위에 구멍을 뚫은 후 EEG 측정을 위해 EEG 전극을 삽입하였고, EMG 측정을 위해 목 근육 2부위에 EMG 전극을 삽입한 후, 비 흡수성 실 및 치과용 아크릴을 이용하여 고정시켰다. 절개 부분을 봉합하고 소독한 후 3일 동안 복강 내로 항생제를 투여하여 수술로 인한 염증을 예방하였다. 수술 후 상처 부위를 세척하면서 최소 10일간의 회복 기간을 가진 후 수면뇌파 측정 실험이 시작되었다. EEG 및 EMG 기록은 오전 9시부터 시작하여 24시간 동안 지속적으로 진행되었다. 수면 단계의 분석을 위해 백서를 케이지에 넣고 preamplifier와 연결시키고, 수면 기록을 위해 Pinnacle technology Inc.의 3 channel EEG/EMG 시스템(Sirenia Sleep Pro, Pinnacle Technology, Oregon ST, USA)(도 2)을 이용하였다. 수면 단계 분류는 뇌파 및 근전도 파형의 진폭 값에 따라 각성 상태(wake) 및 비렘 수면상태(non-rapid eye movement, 깊은 수면 상태) 및 렘 수면상태(rapid eye movement, 얕은 수면 상태)로 구분하여 분석하였다. 뇌파 획득 조건은 sampling rate 200 Hz, preamplification gain 10으로 설정하였고, channel 획득 조건은 EEG는 gain 1, filter Hz는 25, EMG는 gain 1, filter Hz는 100으로 설정하였다.
연구결과
1. 생균주 투여 동물실험 결과
모든 실험 백서에서 수면뇌파검사 결과를 획득하였다. 초기 수면 측정값은 1-2일 간 측정한 값(2일 측정값은 평균값)을 사용하였고, 미생물 투여 후 1일 째, 4일 째, 7일 째 기록된 수면 측정값(모든 군에서 측정) 및 미생물 투여를 중단 후 1-3일 째까지의 수면 측정값(대조군, 실험군1 및 실험군4만 측정)을 사용하였다. 대조군과 실험군의 비교는 초기 수면 측정값에서 이후 수면 측정값이 어떻게 변화하였는지를 계산한 값(이후 수면 측정값 - 초기 수면 측정값)을 비교하였다. 통계적 검증은 비모수통계방법인 Mann-Whitney U Test를 사용하였고 양측검정에서 p<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
도 3은 수면뇌파검사에서 초기 측정된 수면시간(24 시간 기록)에 비해 변화된 수면시간(24시간 기록)을 비교한 결과를 나타낸다. 대체로 실험군은 미생물 투여 후 초기 수면 측정값에 비해 점차 수면시간이 증가하는 양상을, 대조군은 거의 변화가 없거나 수면시간이 다소 감소하는 양상을 나타냈다. 특히, 대조군에 비해 실험군1 및 실험군3에서 미생물 투여 7일 째에 투여 전보다 수면시간이 1시간 이상 증가된 것으로 나타났다(p<0.05). 실험군2와 실험군4에서도 통계적으로 유의하지는 않았지만 투여 전에 비해 미생물 투여 7일 째에 수면시간이 증가한 것으로 나타났다.
수면 질의 변화를 비교하기 위해 특히 깊은 수면 상태인 비렘 수면 시간을 분석 비교하였다. 도 4는 수면뇌파검사에서 초기 측정된 비렘 수면시간(24 시간 기록)에 비해 변화된 비렘 수면시간(24시간 기록)을 비교한 결과를 나타낸다. 실험군3에서 미생물 투여 7일 째 비렘 수면시간이 유의적으로 증가(p<0.05) 하였으며, 다른 실험군에서도 증가 양상을 나타낸 반면 대조군에서는 다소 감소하는 양상을 나타냈다. 특히 실험군3과 실험군1에서 미생물 투여 7일 째에 비렘 수면시간이 1시간 가량 증가된 것으로 나타나 수면의 질이 상당히 향상된 것으로 나타났다.
도 5는 수면뇌파검사에서 초기 측정된 렘 수면시간(24 시간 기록)에 비해 변화된 렘 수면시간을 비교한 결과를 나타낸다. 실험군에서 미생물 투여 기간에 렘 수면시간이 전반적으로 증가한 양상을 나타내었고, 특히 대조군에 비해 실험군1에서 미생물 투여 4일 및 7일 째에 렘 수면시간이 30분 가량 증가하였다(p<0.05). 이러한 증가는 총 수면시간 자체가 가장 많이 증가한 실험군1에서 얕은 수면시간도 동시에 증가한 것으로 여겨진다.
도 6은 수면뇌파검사에서 초기 측정된 총 입면시간(잠들기까지 걸린 시간)에 비해 변화된 입면시간(24시간 기록)을 비교한 결과를 나타낸다. 유의적인 차이는 없지만 대조군에 비해 실험군1에서 전반적으로 입면시간이 더 감소된 결과를 나타내 잠을 자기 시작하면 약 25분 가량 빨리 잠드는 것으로 나타났다. 그 외 실험군2와 실험군3에서 미생물 투여 첫째 날에, 실험군4에서는 미생물 투여 7일 째에 대조군에 비해 입면시간이 더 감소된 결과를 나타냈다.
도 7 및 8은 수면뇌파검사에서 초기 수면 측정값, 미생물 투여 동안 및 투여 중지 후 수면 측정값의 변화를 대조군 및 실험군(실험군1과 실험군4만 포함)으로 나누어서 초기 수면 측정값과 비교한 통계적 검정 결과를 나타낸다.
도 7은 수면뇌파검사에서 초기 측정된 수면시간 및 각성시간(24 시간 기록)을 대조군, 실험군1, 실험군4로 나누어서 변화를 살펴본 결과를 나타낸다. 대조군에서는 총 수면시간이 미생물 투여 첫날부터 7일 째 및 투여 중지 3일 째 날까지 감소 및 증가를 반복하지만 결국 초기 측정된 수면시간과 마지막 측정된 수면시간이 거의 비슷해 큰 변화가 없는 것으로 분석되었다. 하지만, 실험군1에서는 미생물 투여 1일 째부터 수면시간이 증가하면서 4일 및 7일 째 급격히 증가하였고 투여 중지 3일 째까지 증가 추이가 유지되는 것으로 나타났다. 실험군1에 비해 증가 정도는 작지만, 실험군4에서도 미생물 투여 7일 째에 수면시간이 증가하였고 투여 중지 2일 째까지 증가 추이가 유지되다가 3일째에는 다소 감소 경향을 나타냈다. 각성시간 결과에서도 대조군은 각성시간의 감소 및 증가를 반복하면서 큰 변화가 없는 것으로 분석되었지만, 실험군1에서는 꾸준히 각성시간이 감소하여 최대 111분 가량, 실험군4에서도 최대 42분 가량 감소하는 것으로 나타났다. 감소된 각성시간은 수면시간으로 바뀐 것으로 여겨진다.
도 8은 수면뇌파검사에서 비렘 수면시간(24 시간 기록)을 군으로 나누어서 변화를 살펴본 결과를 나타낸다. 대조군에서 비렘 수면시간은 미생물 투여 첫 날부터 7일 째 및 투여 중지 마지막 날까지 감소 및 증가를 반복하지만 결국 초기 측정된 비렘 수면시간과 마지막 측정된 비렘 수면시간이 거의 비슷해 큰 변화가 없는 것으로 분석되었다. 하지만, 실험군1에서는 미생물 투여 1일 째부터 수면시간이 증가하면서 7일 째 급격히 증가하였고 투여 중지 3일 째까지도 증가 추이가 유지되는 것으로 나타났다. 실험군4에서도 미생물 투여 7일 째까지 비렘 수면시간이 증가하였고 그 증가 정도는 실험군1 결과와 유사하게 나타났으며, 다만 투여 중지 후에는 증가 추이보다는 유지하는 결과를 나타냈다.
2. 균주의 세포밖 소포체(extracellular vesicle: EV) 투여 동물실험 결과
모든 실험 백서에서 수면뇌파검사 결과를 획득하였다. 초기 수면 측정값은 1일치(실험군6) 혹은 2일치 평균 값(실험군5)을 사용하였고, EV 투여 후 1일, 3일, 6일 째까지 기록된 수면 측정값을 사용하였다. 결과에서 적은 실험동물 수로 인해 통계적 유의성 측면에서 제한점이 있지만, 변화 추이가 분명히 나타났다.
도 9는 수면뇌파검사에서 측정된 수면시간 및 각성시간(24시간 기록)의 변화를 살펴본 결과이다. EV 투여 첫날부터 총 수면시간이 증가하면서 3일 및 6일 째까지 꾸준히 증가하여 실험군5의 경우 약 25분 가량, 실험군6의 경우 43분 가량 수면시간이 증가하였다. 반면 각성시간은 반대로 꾸준히 감소하여, 감소된 각성시간 만큼 수면시간으로 바뀐 것이 관찰되었다. 실험군6의 경우 EV 양이 실험군5에 비해 1/2 정도인 2 mg에 해당했으나 수면시간 증가 값은 1.7배 더 늘어난 결과를 나타냈다.
도 10은 수면뇌파검사에서 측정된 깊은 수면 상태인 비렘 수면시간(24시간 기록)의 변화를 살펴본 결과이다. EV 투여 첫날부터 주간 수면시간이 증가하면서 3일 및 6일 째까지 꾸준히 증가하여 실험군5의 경우 약 30분, 실험군6의 경우 40분 가량 비렘 수면시간이 늘어나, 도 9에서 증가된 수면시간은 온전히 깊은 수면시간으로 증가된 결과를 나타냈다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM13103P
수탁일자 : 20220111
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM13104P
수탁일자 : 20220111
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM13105P
수탁일자 : 20220111
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Claims (20)

  1. 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola), 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  2. 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola)로부터 유래된(derived) 세포밖 소포체(Extracellular vesicle);를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수면장애는 불면증 (insomnia), 호흡관련 수면장애 (breathing-related sleep disorder) 및 일주기 리듬 수면장애(circadian rhythm sleep disorder)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 불면증은 수면시작 불면증(sleep onset insomnia), 수면유지 불면증(sleep maintenance insomnia) 및 수면종료 불면증(sleep terminal insomnia) 으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 호흡관련 수면장애는 폐색성 수면 무호흡증(obstructive sleep apnea syndrome), 중추성 수면 무호흡증(central sleep apnea syndrome) 및 중추성 폐포 환기저하증(central alveolar hypoventilation syndrome) 으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 일주기 리듬 수면장애는 지연된 수면위상형(delayed sleep phase type), 전진된 수면위상형(advanced sleep phase type), 비행기 시차형(jet lag type) 및 교대 근무형(shift work type) 수면장애로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수면장애의 예방 또는 치료는 총 수면시간의 증가에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수면장애의 예방 또는 치료는 비렘(Non-REM, NREM) 수면시간의 증가에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수면장애의 예방 또는 치료는 렘(REM) 수면시간의 증가에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수면장애의 예방 또는 치료는 입면시간의 감소에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수면장애의 예방 또는 치료는 총 각성시간의 감소에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물에는 상기 프레보텔라 히스티콜라의 세포밖 소포체(Extracellular vesicle)가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 2 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 세포밖 소포체의 크기는 10 내지 600 nm인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 프레보텔라 히스티콜라는 기탁번호 KCTC 15171, CCUG 55407, DSM 19854, JCM 15637, CCUG 60372, KCCM13103P, KCCM13104P 및 KCCM13105P로 구성된 군으로부터 선택되는 기탁번호의 프레보텔라 히스티콜라인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 식품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 치료상 유효량의 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 상기 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체;를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료 방법.
  18. 프레보텔라 히스티콜라, 이의 배양물, 파쇄물, 추출물 또는 발효물; 또는 상기 프레보텔라 히스티콜라로부터 유래된 세포밖 소포체;의 치료 용도.
  19. (a) 프레보텔라 히스티콜라 균주를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 균주를 배양액에서 배양하는 단계;
    를 포함하는 수면장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
  20. 프레보텔라 히스티콜라 균주 유래의 세포밖 소포체를 준비하는 단계를 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
PCT/KR2022/001667 2021-02-03 2022-01-28 장내 미생물 또는 이로부터 유래된 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2022169254A1 (ko)

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