WO2022168954A1 - ナチュラルチーズの製造方法 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0328—Enzymes other than milk clotting enzymes, e.g. lipase, beta-galactosidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
Definitions
- the present invention relates to a method for producing natural cheese.
- a lipase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of ester bonds in lipid substrates, resulting in the liberation of fatty acids.
- lipases are used to flavor and/or enhance the flavor of dairy products, and play an important role, inter alia, in the production of cheese.
- Lipase derived from ruminant animals such as kid, calf, or lamb has traditionally been used as the lipase used in cheese production. Ruminant-derived lipases have an excellent property of liberating short-chain fatty acids (particularly 4-carbon butyric acid) from milk fat, and this excellent property has long been used to generate and/or enhance the flavor of cheese. That is why.
- the present inventor thought that the ruminant-derived lipase traditionally used in the production of natural cheese could be replaced with a microbial lipase having short-chain fatty acid selectivity.
- a new problem has been encountered in that the short-chain fatty acid liberation ability is not sufficiently exhibited.
- the object of the present invention is to provide a technique for promoting the release of short-chain fatty acids in a technique for producing natural cheese using a lipase derived from microorganisms.
- An emulsifier is usually used to destroy fat globules, but emulsifiers cannot be used in the production of natural cheese due to the restriction of not using emulsifiers.
- the present inventors have found that the use of filamentous fungus-derived protease together with lipase facilitates the action of lipase and promotes the release of short-chain fatty acids.
- Section 1 A method for producing natural cheese, comprising a step of allowing milk to react with lipase derived from microorganisms and protease derived from filamentous fungi.
- Section 2. The production method according to item 1, wherein the microorganism-derived lipase comprises at least one of the following polypeptides (1) to (3): (1) A polypeptide consisting of an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 15, or an amino acid sequence obtained by removing the amino acid sequences at positions 1 to 15 from each of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 15, (2) One or several amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 15, or amino acid sequences obtained by removing the amino acid sequences at positions 1 to 15 from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1 to 15, respectively and (3) an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 15, or a SEQ ID NO: A polypeptide having a sequence
- Item 3. The production method according to Item 1 or 2, wherein the amount of the microorganism-derived lipase used is 1 LU or more per 1 g of milk fat in the milk. Section 4.
- Item 4. The production method according to any one of Items 1 to 3, wherein the amount of the filamentous fungus-derived protease used per 1 LU of the microorganism-derived lipase is 0.02 U or more.
- Item 5. Item 5.
- the production method according to any one of Items 1 to 4, wherein the amount of the filamentous fungus-derived protease used is 0.3 U or more per 1 g of milk protein in the milk.
- Item 6. Item 6.
- Item 5 The production method according to Item 5, wherein the amount of the filamentous fungus-derived protease used is 20 U or less per 1 g of milk protein in the milk.
- Item 7. The production method according to any one of Items 1 to 6, wherein the filamentous fungus-derived protease is an Aspergillus-derived protease.
- Item 8. A natural cheese containing a microorganism-derived lipase and a filamentous fungus-derived protease.
- Item 9. Short-chain fatty acid liberation promoter in natural cheese production using microorganism-derived lipase, including filamentous fungus-derived protease.
- Item 10. A method for producing a processed cheese product, comprising a step of producing natural cheese by the production method according to any one of items 1 to 7, and a step of processing the natural cheese.
- Item 11. A processed cheese product produced by the production method according to Item 10.
- a technique for promoting the release of short-chain fatty acids is provided in the technique for producing natural cheese using lipase derived from microorganisms.
- the free fatty acid composition in the natural cheese obtained in Test Example 1 is shown.
- the six bar graphs showing the liberation amount of each fatty acid show the liberation amounts in Comparative Example 1, Reference Example 1, Comparative Example 2, Example 1, Example 2 and Comparative Example 3 from left to right.
- the free fatty acid composition in the natural cheese obtained in Test Example 2 is shown.
- amino acid residues in the amino acid sequences are sometimes represented by one-letter abbreviations, except in the sequence listing. That is, glycine (Gly) is G, alanine (Ala) is A, valine (Val) is V, leucine (Leu) is L, isoleucine (Ile) is I, phenylalanine (Phe) is F, tyrosine (Tyr) is Y.
- Trp tryptophan
- Ser serine
- Thr threonine
- Thr cysteine
- Met methionine
- Aspartic acid Asp
- Glu glutamic acid
- N for asparagine (Asn)
- Q for glutamine
- K for lysine
- R for arginine
- H for histidine
- His histidine
- P proline
- amino acid sequences shown are N-terminal on the left end and C-terminal on the right end.
- nonpolar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
- Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
- Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
- Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
- substitution refers not only to the case of artificially introducing a substitution of amino acid residues, but also to the case of naturally introducing a substitution of amino acid residues, that is, the amino acid residues are originally different. Also included if In the present specification, substitution of amino acid residues may be artificial substitution or natural substitution, but artificial substitution is preferred.
- the method for producing natural cheese of the present invention is characterized by including a step of reacting milk with a microorganism-derived lipase and a filamentous fungus-derived protease.
- the method for producing the natural cheese of the present invention will be described in detail below.
- Natural cheese belongs to the class of milk curd ripened cheeses and does not contain emulsifiers. Natural cheeses may be soft cheeses, semi-hard cheeses (semi-hard cheeses), hard/ultra-hard cheeses (hard cheeses).
- milk used in the production of ordinary cheese is used without particular limitation.
- Specific examples of milk include cow's milk, goat's milk, buffalo milk, and sheep's milk. These milks may be used singly or in combination. Among these milks, cow's milk is preferred.
- microorganism-Derived Lipase used in the present invention includes both natural lipases found in microorganisms and artificially modified lipases based on the sequence of the natural lipase, as long as they have short-chain fatty acid selectivity. include.
- short-chain fatty acid selectivity means that among fatty acids released from lipids, the amount of released butyric acid with 4 carbon atoms is higher than each fatty acid with 5 or more carbon atoms (comparison on a molar basis).
- the "selectivity for short-chain fatty acids” uses 2 g of milk fat (those in which fat globules are destroyed and the milk fat is exposed) as a substrate, and a polypeptide (lipase) in an amount of 3 LU per 1 g of milk fat.
- C4 fatty acid is greater than that of each of the fatty acids C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18 and C18:1 (on a molar basis).
- the above-mentioned microorganism-derived lipase itself has the property of increasing the ability to release short-chain fatty acids, but only replacing the ruminant-derived lipase in the production of natural cheese does not have the property. Even if it cannot be exhibited, it can be used in combination with a filamentous fungus-derived protease to exhibit the property.
- microorganism-derived lipase used in the present invention include a lipase comprising at least one of the following polypeptides (1) to (3).
- polypeptides shown in (1) to (3) above have lipase activity and short-chain fatty acid selectivity.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has a basic backbone of wild-type lipase LIP1 (including a signal peptide) derived from Candida cylindracea, and 549 It is a known lipase mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting A for P, which is the 261st amino acid residue in the amino acid sequence consisting of amino acid residues.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 261st amino acid sequence consisting of 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting F for P, the amino acid residue at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 261st amino acid sequence consisting of 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting L for P, the amino acid residue at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 261st amino acid sequence consisting of 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting S for P, the amino acid residue at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 322nd amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting W for the amino acid residue L at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 360th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting L for F, which is an amino acid residue.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 380th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting I for the amino acid residue S at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 380th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting L for S, which is an amino acid residue.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 425th amino acid sequence consisting of 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting W for the amino acid residue L at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 428th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting F for the amino acid residue L at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 428th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting N for the amino acid residue L at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 429th amino acid sequence consisting of 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting F for the amino acid residue G at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 429th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting M for G, which is an amino acid residue.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 429th amino acid sequence consisting of 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting I for G, the amino acid residue at the position.
- the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 has the lipase LIP1 (including the signal peptide) as a basic skeleton, and the 549th amino acid sequence of the 549 amino acid residues of LIP1. It is a known lipase that has been mutated to have short-chain fatty acid selectivity by substituting F, which is an amino acid residue at the position of V.
- amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1-15 have extremely high sequence identity with each other.
- amino acid sequences of SEQ ID NOS: 12 and 14 have only one amino acid residue substituted, and the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 11 and 15 have no amino acid residue. Only two have been replaced.
- amino acid sequences at positions 1 to 15 form a signal peptide sequence, and these signal peptide sequences are completely identical.
- polypeptides of (1) consisting of amino acid sequences obtained by removing the amino acid sequences (signal peptide sequences) at positions 1 to 15 from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 15, respectively, are SEQ ID NOS: It is the mature sequence of the amino acid sequences shown in 1-15.
- polypeptides (2) and (3) above consist of an amino acid sequence based on the amino acid sequence of the polypeptide (1) above. Although the polypeptides of (2) and (3) have different amino acid sequences compared to the polypeptide of (1), they have the same lipase activity and short-chain fatty acid activity as the polypeptide of (1). and selectivity.
- the short-chain fatty acid selectivity of the polypeptides (2) and (3) is not particularly limited as long as it satisfies the short-chain fatty acid selectivity described above.
- the total amount of the free amount (molar basis) of C4 fatty acid obtained by subjecting and the ratio of the free amount of C4 fatty acid to the total amount is 0.8 to 1.2 times the ratio of the corresponding polypeptide of (1).
- the “corresponding polypeptide of (1)” refers to a polypeptide consisting of a reference amino acid sequence in the polypeptides of (2) and (3).
- the polypeptides of (2) and (3) are each "consisting of the substitution, addition, insertion or deletion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
- polypeptide having short-chain fatty acid selectivity and a polypeptide having a sequence identity of 70% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 and having short-chain fatty acid selectivity”, respectively
- the "polypeptide of (1) above” corresponding to the polypeptide of is "a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13".
- Amino acid differences in the polypeptide of (2) above may include only one type of difference (e.g., substitution) from among substitutions, additions, insertions, and deletions, and two or more types of differences (e.g., , substitutions and insertions).
- the number of amino acid differences may be 1 or several, for example 1 to 50, preferably 1 to 20, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1, 2, or 1.
- amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 15, or amino acids obtained by removing the amino acid sequences at positions 1 to 15 from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1 to 15, respectively The sequence identity to the sequence may be 70% or more, preferably 80% or more, 85% or more, or 90% or more, more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, or 98% or more, More preferably 99% or more, 99.4% or more, 99.6% or more, or 99.8% or more.
- sequence identity means BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)] bl2seq program (Tatiana Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol.Lett., Vol.174, p247-250, 1999).
- NCBI National Center for Biotechnology Information
- the parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
- amino acid residues at positions 224 (S), 356 (E), and 464 (H) in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 15 It is desirable not to introduce substitutions or deletions at these sites, as the groups are believed to contribute to lipase activity.
- the amino acid residues at positions 428 of SEQ ID NOs: 10 and 11, 429 of SEQ ID NOs: 12, 13, and 14, and 549 of SEQ ID NO: 15 are considered to contribute to substrate specificity.
- the amino acid sites to be substituted, added, inserted or deleted are considered to contribute to the site and substrate specificity that are thought to contribute to the above lipase activity. It is desirable that the site is other than the site where the lipase activity is obtained, and in the polypeptide of (3), the sequence identity is considered to contribute to the site and substrate specificity that are thought to contribute to the lipase activity. It is desirable to have sequence identity except for the site where the amino acid sites to be substituted, added, inserted or deleted are considered to contribute to the site and substrate specificity that are thought to contribute to the above lipase activity. It is desirable that the site is other than the site where the lipase activity is obtained, and in the polypeptide of (3), the sequence identity is considered to contribute to the site and substrate specificity that are thought to contribute to the lipase activity. It is desirable to have sequence identity except for the site where the
- amino acid substitutions to be introduced in the polypeptides of (2) and (3) include, for example, if the amino acid before substitution is a non-polar amino acid, substitution with another non-polar amino acid, uncharged amino acid before substitution If the amino acid before substitution is an acidic amino acid, substitution with another non-charged amino acid, if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, substitution with another acidic amino acid, and if the amino acid before substitution is a basic amino acid, another basic amino acid Substitution to is mentioned.
- polypeptides (1) to (3) above include not only polypeptides obtained by artificial substitution, but also polypeptides originally having such amino acid sequences.
- the amount of lipase derived from microorganisms to be used is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained. From the viewpoint of further enhancing the effect of promoting the liberation of short-chain fatty acids, the amount of microbial lipase used is preferably 1.4 LU or more, more preferably 2 LU or more, and even more preferably 2.5 LU per 1 g of milk fat in milk. Above, more preferably 3 LU or more, still more preferably 3.5 LU or more, and particularly preferably 4 LU or more. The upper limit of the amount of lipase derived from microorganisms to be used is not particularly limited.
- the lipase activity of the microorganism-derived lipase shall be measured by the lipase activity test method using tributyrin as a substrate. That is, in the present invention, 1 LU of lipase activity is defined as the amount of enzyme that causes an increase in butyric acid of 1 ⁇ mol per minute when an enzymatic reaction is performed using tributyrin as a substrate in a conventional manner.
- filamentous Fungus-Derived Protease The filamentous fungus-derived protease used in the present invention promotes the liberation of butyric acid, which is a short-chain fatty acid, compared to the use of the microorganism-derived lipase alone without the use of the filamentous fungus-derived protease.
- One of the mechanisms by which such an effect is obtained is probably that filamentous fungus-derived protease destroys fat globules, thereby facilitating the action of microorganism-derived lipase on milk fat.
- the filamentous fungus-derived protease used in the present invention is distinguished from the filamentous fungus-derived protease, which is an example of the milk-clotting enzyme, in that it does not have milk-clotting activity. In other words, milk-clotting enzymes are excluded from the filamentous fungus-derived proteases used in the present invention.
- filamentous fungus-derived proteases are not limited to serine proteases, metalloproteases, thiol proteases, and aspartic proteases (acidic proteases) in the classification based on the catalytic mechanism, but metalloproteases are preferred.
- the type of filamentous fungus-derived protease may be any of acidic protease, neutral protease, and alkaline protease according to the classification based on the optimum pH, but neutral protease is preferred.
- the filamentous fungus-derived protease is not particularly limited as long as it can obtain the desired effects of the present invention and can be used in foods.
- Specific examples of proteases derived from filamentous fungi include Aspergillus, Mucor, Neurospora, Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus, and Sucre Examples include proteases derived from the genus Sclerotinia and the like.
- One type of these filamentous fungus-derived proteases may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
- proteases derived from filamentous fungi proteases derived from the genus Aspergillus are preferred from the viewpoint of further enhancing the effect of promoting release of short-chain fatty acids.
- Aspergillus-derived proteases include Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus melleus, Aspergillus japonicus, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii, Aspergillus sojae, Aspergillus tamarii, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus Aspergillus aculeatus, Aspergillus candidus, Aspergillus flavus, Aspergillus saitoi, Aspergillus inuii, Aspergillus glaucus, Aspergillus glaucus Aspergillus caesiellus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus, Aspergillus fischerianus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus penicill
- Aspergillus-derived proteases may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
- Aspergillus-derived proteases Aspergillus oryzae-derived proteases are preferred from the viewpoint of further enhancing the short-chain fatty acid release promoting effect.
- a filamentous fungus-derived protease can be prepared by a known method.
- a protease derived from the genus Aspergillus it can be easily prepared by a method of koji-making Aspergillus spp. and separating the protease using a known means, a method using genetic recombination technology, or the like.
- proteases derived from filamentous fungi include protease M "Amano” (acid protease derived from Aspergillus oryzae), protease A "Amano” (neutral protease derived from Aspergillus oryzae), protease manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.
- a "Amano” 2SD neutral protease derived from Aspergillus oryzae
- Sumiteam MP alkaline protease derived from Aspergillus meleus
- Sumiteam FL-G alkaline protease derived from Aspergillus oryzae
- the filamentous fungus-derived protease preferably has a higher ratio of peptidase activity (exopeptidase activity) to protease activity (total protease activity).
- the amount of filamentous fungus-derived protease used is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, but for example, 0.3 U or more per 1 g of milk protein in the milk used as the material can be mentioned. From the viewpoint of further enhancing the effect of promoting the liberation of short-chain fatty acids, the amount of filamentous fungus-derived protease used is preferably 0.6 U or more, more preferably 0.7 U or more, and even more preferably 0.7 U or more per 1 g of milk protein in milk. 0.8 U or more, more preferably 0.9 U or more, 1.5 U or more, 2 U or more, 2.5 U or more, or 3 U or more.
- the upper limit of the amount of the filamentous fungus-derived protease used is not particularly limited, but may be, for example, 20 U or less per 1 g of milk protein in milk. Preferably 10 U or less, more preferably 5 U or less, still more preferably 3 U or less, still more preferably 2 U or less, even more preferably 1.5 U or less, and particularly preferably 1.2 U or less per 1 g of milk protein in milk. .
- the ratio of the amount of filamentous fungus-derived protease to the amount of microbial-derived lipase used is not particularly limited as long as the desired effects of the present invention can be obtained.
- the amount of protease used per 1 LU is, for example, 0.02 U or more, preferably 0.1 U or more, more preferably 0.15 U or more, still more preferably 0.8 U or more, still more preferably 2 U or more, and even more preferably 5 U or more. , 50 U or more, or 150 U or more.
- the upper limit of the range of the ratio of the amount of filamentous fungus-derived protease to the amount of microorganism-derived lipase used is not particularly limited, but may be, for example, 300 U or less or 200 U or less.
- the filamentous fungus-derived protease activity shall be measured by the Folin method using casein as a substrate. That is, in the present invention, an enzymatic reaction is performed by a conventional method using casein as a substrate, and the amount of enzyme that causes an increase in Folin's test solution coloring substances equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute is defined as 1 U of filamentous fungus-derived protease activity. .
- Milk- clotting enzyme In the present invention, a milk-clotting enzyme is used in addition to the enzymes described above.
- known milk-clotting enzymes can be used without particular limitation.
- the amount of milk-clotting enzyme used can be appropriately selected by a person skilled in the art from the usual amount used when curdling milk in the process of producing natural cheese.
- Procedures, reaction conditions, etc., and other steps Specific procedures in the method for producing natural cheese of the present invention include lactic acid fermentation of milk, coagulation precipitation (curdling) of casein molecules by milk-clotting enzymes, and protease derived from filamentous fungi. and release of short-chain fatty acids by microorganism-derived lipase may be performed in a timely manner.
- the timing of adding the filamentous fungus-derived protease and the microorganism-derived lipase used in the present invention to milk is not particularly limited as long as the desired effects of the present invention can be obtained.
- the filamentous fungus-derived protease and the microbial-derived lipase are added before the addition of the milk-clotting enzyme. is preferably added to the
- the filamentous fungus-derived protease and the microorganism-derived lipase may be added simultaneously or in stages.
- the order of addition of the filamentous fungus-derived protease and the microorganism-derived lipase is not particularly limited. can be added.
- the addition of lactic acid bacteria for lactic acid fermentation can be performed at any time, preferably at any stage before the addition of the milk-clotting enzyme.
- the temperature at which the filamentous fungus-derived protease, microbial-derived lipase, and milk-clotting enzyme are added is not particularly limited as long as the desired effects of the present invention can be obtained. 25 to 40°C is preferred.
- the time (ripening period) for acting the filamentous fungus-derived protease and the microorganism-derived lipase can be set according to the type of natural cheese, but from the viewpoint of further increasing the amount of short-chain fatty acids released, preferably 1 month or more, more preferably 2 months or more, and still more preferably 2.5 months or more.
- the method for producing natural cheese of the present invention can appropriately include any steps that are normally performed in the production of natural cheese.
- Other steps include a sterilization step, a heating step, a cooling step, a pH adjustment step, a hot water kneading step, a salting step, a molding step, a saturated saline immersion step, a drying step, and/or a sealed packaging step. be done. These steps can be easily selected by those skilled in the art according to the type of natural cheese.
- Natural cheese contains the microorganism-derived lipase and filamentous fungus-derived protease used in the production as residual components.
- the natural cheese of the present invention can be produced by the method described in "1. Method for producing natural cheese" above.
- the natural cheese of the present invention contains a large amount of short-chain fatty acids (butyric acid) compared to natural cheese produced in the same manner except that the filamentous fungus-derived protease is not used.
- the specific content of short-chain fatty acid (butyric acid) may vary depending on the type of cheese (moisture content) and the amounts of lipase derived from microorganisms and protease derived from filamentous fungi used, but is, for example, 0.8 ⁇ mol/g or more. , preferably 4 ⁇ mol/g or more.
- the specific content of the short-chain fatty acid (butyric acid) is preferably 6 ⁇ mol/g or more, more preferably 8 ⁇ mol/g or more, still more preferably 10 ⁇ mol/g or more, and more preferably 10 ⁇ mol/g or more. More preferably, it is 11 ⁇ mol/g or more.
- the natural cheese of the present invention may be eaten as natural cheese itself, or may be used as a material for processed cheese.
- Processed cheese is prepared by heating and melting natural cheese, emulsifiers (citrates, phosphates, etc.), additives (oils, preservatives, seasonings, thickening stabilizers, gelling agents, pH It can be produced by appropriately blending a modifier, perfume, etc.).
- the natural cheese of the present invention can also be used as a material for processed foods other than processed cheese.
- Short-Chain Fatty Acid Release Accelerator in Natural cheese Production As described above, in the production method of the present invention using a microorganism-derived lipase, a filamentous fungus-derived protease can enhance the release-promoting effect of short-chain fatty acids. Therefore, the present invention further provides short-chain fatty acid release accelerators in the production of natural cheese using lipases derived from microorganisms, including proteases derived from filamentous fungi.
- the short-chain fatty acid release-enhancing agent of the present invention may contain other food-acceptable ingredients in addition to each enzyme.
- Such other ingredients include excipients, disintegrants, preservatives, preservatives, stabilizers, vitamins, minerals, sweeteners, seasonings and the like.
- Protease A “Amano” 2SD (hereinafter referred to as “PR-A2SD”): filamentous fungus Aspergillus oryzae (A.oryzae)-derived protease (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) - Protin SD-NY10 (hereinafter referred to as "SD-NY10"): Bacillus amyloliquefaciens-derived protease (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) ⁇ Lipase> ⁇ Italase C: animal-derived lipase (manufactured by DSM Food Specialties) - G429M: a lipase corresponding to a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequences at positions 1 to 15 are removed from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13
- Methods for measuring the activity values of protease and lipase are as follows.
- the amount of enzyme that causes an increase in Folin's test solution coloring substance equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute was defined as 1 unit (1 U).
- the amount of enzyme that causes an increase in butyric acid of 1.0 ⁇ mol per minute was taken as 1 unit (1 LU).
- Test example 1 225 kg (500 lb) of milk (milk fat 2.9% by weight, milk protein 3.3% by weight) was heat-sterilized at 73° C. for 19 seconds and used as the material. The pasteurized milk was cooled to 34.4° C., 11.4 g of lactic acid bacteria (DSM CP-121) were added and stirred for about 1 hour until the pH dropped to 6.45. Next, 14.3 g of rennet (DSM Maxiren XDS BF; recombinant rennet in which a bovine-derived chymosin gene was expressed in yeast) was added, stirring was stopped, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. After confirming the formation of the curd, the curd was cut into cubes and heated to 41° C.
- DSM CP-121 lactic acid bacteria
- Test example 2 3.8 L of commercial milk (3.5% by weight of milk fat, 3% by weight of milk protein) was heated to 34° C., and 1 g of mesophilic lactic acid bacteria (Mesophilic Direct Set Cheese Culture (C101)) and thermophilic lactic acid bacteria (Thermophilic Direct Set 1 g of Cheese Culture (C201)) and the enzymes shown in Table 2 were added. After stirring for 30 minutes, 0.24 g of rennet (DSM Maxiren XDS BF) was added and allowed to stand for 35 minutes. Upon confirmation of curd formation, the curd was roughly chopped and warmed to 41° C. over 30 minutes with stirring. After the pH had dropped to 5.9, the whey and curds were separated.
- mesophilic lactic acid bacteria Mesophilic Direct Set Cheese Culture (C101)
- thermophilic lactic acid bacteria Thermophilic Direct Set 1 g of Cheese Culture (C201)
- rennet DSM Maxiren XDS BF
- a short-chain fatty acid represents butyric acid having 4 carbon atoms.
- Table 2 shows the results. +++: The flavor derived from short-chain fatty acids is felt strongly ++: The flavor derived from short-chain fatty acids is felt +: The flavor derived from short-chain fatty acids is felt weakly -: The flavor derived from short-chain fatty acids is not felt
- the degree of change in the shape after aging based on the shape of the natural cheese before aging is used as a shape retention index, and based on the following criteria: evaluated.
- Table 2 shows the results. ⁇ : The shape did not change (the shape was maintained) ⁇ : The change in shape was slightly crushed (the shape was almost maintained) ⁇ : A change in shape was observed to the extent that it was slightly crushed (the shape was somehow maintained) ⁇ : The change in shape was severe (the shape could not be maintained)
- Example 5 and 6 for Examples 3 and 4
- Example 4 for Example 3, for Example 5 In Example 6
- the amount of released short-chain fatty acids increased, but in Example 5 in which the added amount of protease derived from filamentous fungi was suppressed, remarkably excellent shape retention was observed.
- SEQ ID NO: 1 is the P261A variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 2 is the P261F variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 3 is the P261L variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 4 is the P261S variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 5 is the L322W variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 6 is the F360L variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 7 is the S380I variant of lipase LIP1 containing the signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO:8 is the S380L variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO:9 is the L425W variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 10 is the L428F variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 11 is the L428N variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 12 is the G429F variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 13 is the G429M variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 14 is the G429I variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
- SEQ ID NO: 15 is the V549F variant of lipase LIP1 containing a signal peptide from Candida cylindracea.
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Abstract
本発明の目的は、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズの製造技術において、短鎖脂肪酸の遊離を促進する技術を提供することである。乳汁に、微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを作用させる工程を含む、ナチュラルチーズの製造方法により、短鎖脂肪酸の遊離を促進することができる。
Description
本発明は、ナチュラルチーズの製造方法に関する。
リパーゼは脂質基質中のエステル結合の加水分解を触媒する酵素であり、脂肪酸の遊離をもたらす。乳業用途において、リパーゼは乳製品の風味生成及び／又は風味増強に利用されており、とりわけチーズの製造において重要な役割を果たしている。
チーズの製造に用いられるリパーゼとしては、伝統的に、仔ヤギ、仔牛又は仔羊等の反芻動物由来のリパーゼが用いられてきた。反芻動物由来のリパーゼは、乳脂肪から短鎖脂肪酸（特に炭素数４の酪酸）を遊離する特性に優れており、この優れた特性が、チーズの風味生成及び／又は風味増強に長く利用されてきた所以である。
一方で、食品加工で利用する酵素製剤へのコーシャ品質又はハラール品質の要求のため、動物由来リパーゼの代替品に対する強い産業的要求がある。この要求に応えるべく、微生物由来酵素の利用(例えば特許文献１)及び組換え酵素の利用（例えば特許文献２)等が提案されている。また、特定の用途への適用のために、リパーゼを遺伝子工学的に改変する試みもあり（例えば特許文献３～５）、短鎖脂肪酸の遊離能が低い特定の微生物由来リパーゼに対して、短鎖脂肪酸の遊離能を高めることで短鎖脂肪酸選択性を付与する変異を導入したリパーゼも提案されている（特許文献６及び７）。
本発明者は、ナチュラルチーズの製造において伝統的に使用されている反芻動物由来リパーゼを、短鎖脂肪酸選択性を有する微生物由来リパーゼに代替できると考えた。しかしながら、ナチュラルチーズの製造に当該微生物由来リパーゼを用いても、予測に反し、短鎖脂肪酸の遊離能が十分に発揮されないという新たな課題に直面した。
そこで本発明は、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズの製造技術において、短鎖脂肪酸の遊離を促進する技術を提供することを目的とする。
本発明者は、ナチュラルチーズの製造に微生物由来リパーゼを用いても短鎖脂肪酸の遊離能が発揮されない原因が、リパーゼが脂肪球へ反応できない環境にあると考えた。脂肪球の破壊には乳化剤を用いることが通常であるが、ナチュラルチーズの製造においては乳化剤を用いないという制約が伴うことから、乳化剤を用いることができない。そこで、本発明者が鋭意検討した結果、リパーゼと共に糸状菌由来プロテアーゼを併用することで、リパーゼが作用しやすくなり短鎖脂肪酸の遊離が促進されることを見出した。
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 乳汁に、微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを作用させる工程を含む、ナチュラルチーズの製造方法。
項２． 前記微生物由来リパーゼが、下記（１）～（３）に示す少なくともいずれかのポリペプチドからなる、項１に記載の製造方法：
（１）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド。
項３． 前記微生物由来リパーゼの使用量が、前記乳汁中の乳脂肪１ｇ当たり１ＬＵ以上である、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 前記微生物由来リパーゼ１ＬＵ当たりの前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が０．０２Ｕ以上である、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
項５． 前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が、前記乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり０．３Ｕ以上である、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
項６． 前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が、前記乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり２０Ｕ以下である、項５に記載の製造方法。
項７． 前記糸状菌由来プロテアーゼがアスペルギルス属由来プロテアーゼである、項１～６のいずれかに記載の製造方法。
項８． 微生物由来リパーゼと、糸状菌由来プロテアーゼとを含む、ナチュラルチーズ。
項９． 糸状菌由来プロテアーゼを含む、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズ製造における短鎖脂肪酸遊離促進剤。
項１０． 項１～７のいずれかに記載の製造方法によりナチュラルチーズを製造する工程と、前記ナチュラルチーズを加工する工程と、を含む、チーズ加工品の製造方法。
項１１． 項１０に記載の製造方法によって製造される、チーズ加工品。
項１． 乳汁に、微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを作用させる工程を含む、ナチュラルチーズの製造方法。
項２． 前記微生物由来リパーゼが、下記（１）～（３）に示す少なくともいずれかのポリペプチドからなる、項１に記載の製造方法：
（１）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド。
項３． 前記微生物由来リパーゼの使用量が、前記乳汁中の乳脂肪１ｇ当たり１ＬＵ以上である、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 前記微生物由来リパーゼ１ＬＵ当たりの前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が０．０２Ｕ以上である、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
項５． 前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が、前記乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり０．３Ｕ以上である、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
項６． 前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が、前記乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり２０Ｕ以下である、項５に記載の製造方法。
項７． 前記糸状菌由来プロテアーゼがアスペルギルス属由来プロテアーゼである、項１～６のいずれかに記載の製造方法。
項８． 微生物由来リパーゼと、糸状菌由来プロテアーゼとを含む、ナチュラルチーズ。
項９． 糸状菌由来プロテアーゼを含む、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズ製造における短鎖脂肪酸遊離促進剤。
項１０． 項１～７のいずれかに記載の製造方法によりナチュラルチーズを製造する工程と、前記ナチュラルチーズを加工する工程と、を含む、チーズ加工品の製造方法。
項１１． 項１０に記載の製造方法によって製造される、チーズ加工品。
本発明によれば、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズの製造技術において、短鎖脂肪酸の遊離を促進する技術が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
１．ナチュラルチーズの製造方法
本発明のナチュラルチーズの製造方法は、乳汁に、微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを作用させる工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のナチュラルチーズの製造方法について詳述する。
本発明のナチュラルチーズの製造方法は、乳汁に、微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを作用させる工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のナチュラルチーズの製造方法について詳述する。
１－１．ナチュラルチーズ
本発明において、ナチュラルチーズは、乳汁のカードを熟成させたチーズの類に属するものであり、乳化剤を含まない。ナチュラルチーズは、軟質チーズ、半硬質チーズ（セミハードチーズ）、硬質／超硬質チーズ（ハードチーズ）のいずれであってもよい。
本発明において、ナチュラルチーズは、乳汁のカードを熟成させたチーズの類に属するものであり、乳化剤を含まない。ナチュラルチーズは、軟質チーズ、半硬質チーズ（セミハードチーズ）、硬質／超硬質チーズ（ハードチーズ）のいずれであってもよい。
１－２．乳汁
乳汁の種類としては、通常のチーズの製造に用いられる乳汁が特に限定無く用いられる。具体的な乳汁としては、牛乳、山羊乳、水牛乳、羊乳等が挙げられる。これらの乳汁は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの乳汁の中でも、好ましくは牛乳が挙げられる。
乳汁の種類としては、通常のチーズの製造に用いられる乳汁が特に限定無く用いられる。具体的な乳汁としては、牛乳、山羊乳、水牛乳、羊乳等が挙げられる。これらの乳汁は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの乳汁の中でも、好ましくは牛乳が挙げられる。
１－３．微生物由来リパーゼ
本発明で用いられる微生物由来リパーゼには、短鎖脂肪酸選択性を有する限りにおいて、微生物において見出される天然リパーゼ及び前記天然リパーゼの配列を基本骨格として人為的に改変したリパーゼのいずれをも含む。
本発明で用いられる微生物由来リパーゼには、短鎖脂肪酸選択性を有する限りにおいて、微生物において見出される天然リパーゼ及び前記天然リパーゼの配列を基本骨格として人為的に改変したリパーゼのいずれをも含む。
本発明において、「短鎖脂肪酸選択性」とは、脂質から遊離させる脂肪酸のうち、炭素数５以上の脂肪酸それぞれに比べて、炭素数４の酪酸の遊離量を高く（モル基準での対比）する特性をいう。具体的には、「短鎖脂肪酸選択性」は、乳脂肪（脂肪球を破壊し、乳脂肪が露出した状態のもの）２ｇを基質とし、ポリペプチド（リパーゼ）を乳脂肪１ｇ当たり３ＬＵの量で４０℃で３０分作用させる条件に供した後、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸の遊離量を測定した場合に、Ｃ４の脂肪酸（酪酸）の遊離量が、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸それぞれの遊離量よりも大きい（モル基準での対比）ことで確認することができる。
本発明の製造方法においては、上記の微生物由来リパーゼが、それ自体、短鎖脂肪酸の遊離能を高める特性を有していながら、ナチュラルチーズの製造において反芻動物由来リパーゼを代替えしただけでは当該特性を発揮することができなくても、糸状菌由来プロテアーゼと併用されることで、当該特性を発揮させることが可能になる。
本発明で用いられる微生物由来リパーゼの具体例としては、下記（１）～（３）に示す少なくともいずれかのポリペプチドからなるリパーゼが挙げられる。
（１）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド。
（１）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド。
前記（１）～（３）に示すポリペプチドは、リパーゼ活性と短鎖脂肪酸選択性とを有する。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来の野生型リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第２６１位アミノ酸残基であるＰがＡに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第２６１位アミノ酸残基であるＰがＦに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第２６１位アミノ酸残基であるＰがＬに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第２６１位アミノ酸残基であるＰがＳに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第３２２位アミノ酸残基であるＬがＷに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第３６０位アミノ酸残基であるＦがＬに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第３８０位アミノ酸残基であるＳがＩに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第３８０位アミノ酸残基であるＳがＬに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第４２５位アミノ酸残基であるＬがＷに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第４２８位アミノ酸残基であるＬがＦに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第４２８位アミノ酸残基であるＬがＮに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第４２９位アミノ酸残基であるＧがＦに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第４２９位アミノ酸残基であるＧがＭに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第４２９位アミノ酸残基であるＧがＩに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上記リパーゼＬＩＰ１（シグナルペプチドを含む）を基本骨格とし、ＬＩＰ１の５４９アミノ酸残基からなるアミノ酸配列の第５４９位アミノ酸残基であるＶがＦに置換することによって短鎖脂肪酸選択性を具備するように変異した公知のリパーゼである。
配列番号１～１５に示すアミノ酸配列は、互いに配列同一性が極めて高い。例えば、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して、配列番号１２及び１４のアミノ酸配列はアミノ酸残基が１個置換されたのみであり、配列番号１～１１及び１５のアミノ酸配列はアミノ酸残基が２個置換されたのみである。配列番号１～１５に示すアミノ酸配列は、いずれも、１～１５位のアミノ酸配列がシグナルペプチド配列をなし、それらのシグナルペプチド配列は完全に一致する。
前記（１）のポリペプチドのうち、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列）が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列の成熟配列である。
前記（２）及び（３）のポリペプチドは、前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列を基本骨格とするアミノ酸配列からなる。前記（２）及び（３）のポリペプチドは、前記（１）のポリペプチドと比較して、アミノ酸配列に相違がみられるものの、前記（１）のポリペプチドと同様にリパーゼ活性と短鎖脂肪酸選択性とを有している。
前記（２）及び（３）のポリペプチドの短鎖脂肪酸選択性については、上述の短鎖脂肪酸選択性を満たす限りにおいて特に限定されないが、短鎖脂肪酸選択性の程度の一例としては、ポリペプチドを上記の条件に供して得られるＣ４の脂肪酸の遊離量（モル基準）と、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸それぞれの遊離量（モル基準）の総量と、を測定した場合における、前記総量に対するＣ４の脂肪酸の遊離量の比率が、対応する前記（１）のポリペプチドについての前記比率の０．８～１．２倍となる程度が挙げられる。なお、「対応する前記（１）のポリペプチド」とは、前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて基準となるアミノ酸配列からなるポリペプチドを指す。一例を挙げると、前記（２）及び（３）のポリペプチドが、それぞれ「配列番号１３に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド」及び「配列番号１３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド」である場合、それぞれのポリペプチドに「対応する前記（１）のポリペプチド」は、「配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド」である。
前記（２）のポリペプチドにおけるアミノ酸の相違は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の相違（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の相違（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（２）のポリペプチドにおいて、アミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～５０個、好ましくは１～２０個、１～１０個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
また、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、８５％以上又は９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、９９．４％以上、９９．６％以上、又は９９．８％以上が挙げられる。
ここで、前記（３）のポリペプチドにおいて、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列における第２２４位（Ｓ）、第３５６位（Ｅ）、及び第４６４位（Ｈ）のアミノ酸残基は、リパーゼ活性に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。また、配列番号１、２、３、４の第２６１位、配列番号５の第３２２位、配列番号６の第３６０位、配列番号７、８の第３８０位、配列番号９の第４２５位、配列番号１０、１１の第４２８位、配列番号１２、１３、１４の第４２９位、配列番号１５の第５４９位のアミノ酸残基は基質特異性に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。つまり、前記（２）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸の部位は、上記のリパーゼ活性に寄与していると考えられる部位及び基質特異性に寄与していると考えられる部位以外の部位であることが望ましく、前記（３）のポリペプチドにおいて、上記配列同一性は、上記のリパーゼ活性に寄与していると考えられる部位及び基質特異性に寄与していると考えられる部位を除いた部分における配列同一性であることが望ましい。
前記（２）及び（３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入されている場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、（２）及び（３）のポリペプチドにおいて導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
なお、前記（１）～（３）のポリペプチドには、人為的に置換して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を元々有するポリペプチドも含まれる。
微生物由来リパーゼの使用量としては本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、材料に用いた乳汁中の乳脂肪１ｇ当たり１ＬＵ以上が挙げられる。短鎖脂肪酸の遊離促進効果をより一層高める観点から、微生物由来リパーゼの使用量としては、乳汁中の乳脂肪１ｇ当たり、好ましくは１．４ＬＵ以上、より好ましくは２ＬＵ以上、さらに好ましくは２．５ＬＵ以上、一層好ましくは３ＬＵ以上、より一層好ましくは３．５ＬＵ以上、特に好ましくは４ＬＵ以上が挙げられる。微生物由来リパーゼの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば乳汁中の乳脂肪１ｇ当たり、２０ＬＵ以下、１０ＬＵ以下、８ＬＵ以下、５ＬＵ以下、又は４．５ＬＵ以下が挙げられる。
なお、微生物由来リパーゼのリパーゼ活性は、トリブチリンを基質として、リパーゼ活性試験法により測定されるものとする。すなわち、本発明においては、トリブチリンを基質として常法により酵素反応を行い、１分間に１μｍｏｌの酪酸の増加をもたらす酵素量を、１ＬＵのリパーゼ活性と定義する。
１－４．糸状菌由来プロテアーゼ
本発明で用いられる糸状菌由来プロテアーゼは、糸状菌由来プロテアーゼを併用せず微生物由来リパーゼを単独で用いた場合に比べ、短鎖脂肪酸である酪酸の遊離を促進する。このような効果が得られるメカニズムの１つとしては、おそらく、糸状菌由来プロテアーゼが脂肪球を破壊することで、乳脂肪に対して微生物由来リパーゼを作用し易くしているものと考えられる。
本発明で用いられる糸状菌由来プロテアーゼは、糸状菌由来プロテアーゼを併用せず微生物由来リパーゼを単独で用いた場合に比べ、短鎖脂肪酸である酪酸の遊離を促進する。このような効果が得られるメカニズムの１つとしては、おそらく、糸状菌由来プロテアーゼが脂肪球を破壊することで、乳脂肪に対して微生物由来リパーゼを作用し易くしているものと考えられる。
なお、本発明で用いられる糸状菌由来プロテアーゼは、凝乳活性を有しない点で、凝乳酵素の一例である糸状菌由来プロテアーゼとは区別される。つまり、本発明で用いられる糸状菌由来プロテアーゼからは、凝乳酵素は除外される。
糸状菌由来プロテアーゼの種類としては、触媒機構に基づく分類では、セリンプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、及びアスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）を問わないが、好ましくは金属プロテアーゼが挙げられる。また、糸状菌由来プロテアーゼの種類としては、至適ｐＨに基づく分類では、酸性プロテアーゼ、及び中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼを問わないが、好ましくは中性プロテアーゼが挙げられる。
糸状菌由来プロテアーゼは、本発明の所望の効果を得られ且つ食品に用いることができるものであれば特に限定されない。糸状菌由来プロテアーゼの具体例としては、アスペルギルス（Aspergillus）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポーラ（Neurospora）属、ペニシリウム（Penicillium）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、及びスクレロティニア（Sclerotinia）属等に由来するプロテアーゼが挙げられる。これらの糸状菌由来プロテアーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの糸状菌由来プロテアーゼの中でも、短鎖脂肪酸の遊離促進効果をより一層高める観点から、好ましくはアスペルギルス属由来プロテアーゼが挙げられる。
アスペルギルス属由来プロテアーゼの具体例としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガ（Aspergillus niger）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ソーエ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・ファチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アクレタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・キャンディダス（Aspergillus candidus）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・イヌイ（Aspergillus inuii）、アスペルギルス・グラカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルス・セシェルス（Aspergillus caesiellus）、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルス・デフレクタス（Aspergillus deflectus）、アスペルギルス・フィシャリアヌス（Aspergillus fischerianus）、アスペルギルス・パラシティクス（Aspergillus parasiticus）、アスペルギルス・ペニシロイデス（Aspergillus penicilloides）、アスペルギルス・レストリクタス（Aspergillus restrictus）、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）、アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）等に由来するプロテアーゼが挙げられる。これらのアスペルギルス属由来プロテアーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのアスペルギルス属由来プロテアーゼの中でも、短鎖脂肪酸の遊離促進効果をより一層高める観点から、好ましくはアスペルギルス・オリゼ由来プロテアーゼが挙げられる。
糸状菌由来プロテアーゼは、公知の方法により調製することができる。一例として、アスペルギルス属由来のプロテアーゼを調製する場合、アスペルギルス属菌を製麹し、プロテアーゼを公知の手段を用いて分離する方法、及び遺伝子組み換え技術を用いる方法等によって容易に調製することができる。また、糸状菌由来プロテアーゼとして、市販品を用いてもよい。市販品の糸状菌由来のプロテアーゼとしては、天野エンザイム株式会社製の、プロテアーゼＭ「アマノ」（アスペルギルス・オリゼ由来の酸性プロテアーゼ）、プロテアーゼＡ「アマノ」（アスペルギルス・オリゼ由来の中性プロテアーゼ）、プロテアーゼＡ「アマノ」２ＳＤ（アスペルギルス・オリゼ由来の中性プロテアーゼ）；新日本化学工業株式会社の、スミチームＭＰ（アスペルギルス・メレウス由来のアルカリ性プロテアーゼ）、スミチームＦＬ－Ｇ（アスペルギルス・オリゼ由来のアルカリ性プロテアーゼ）等が挙げられる。
糸状菌由来プロテアーゼは、短鎖脂肪酸の遊離促進効果をより一層高める観点から、プロテアーゼ活性（全プロテアーゼ活性）に対するペプチダーゼ活性（エキソペプチダーゼ活性）の比率が多いほど好ましい。
糸状菌由来プロテアーゼの使用量としては本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、材料に用いた乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり０．３Ｕ以上が挙げられる。短鎖脂肪酸の遊離促進効果をより一層高める観点から、糸状菌由来プロテアーゼの使用量としては、乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり、好ましくは０．６Ｕ以上、より好ましくは０．７Ｕ以上、さらに好ましくは０．８Ｕ以上、一層好ましくは０．９Ｕ以上、１．５Ｕ以上、２Ｕ以上、２．５Ｕ以上又は３Ｕ以上が挙げられる。糸状菌由来プロテアーゼの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり、２０Ｕ以下が挙げられ、得られるナチュラルチーズの保形性を向上させる観点から、材料に用いた乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり、好ましくは１０Ｕ以下、より好ましくは５Ｕ以下、さらに好ましくは３Ｕ以下、一層好ましくは２Ｕ以下、より一層好ましくは１．５Ｕ以下、特に好ましくは１．２Ｕ以下が挙げられる。
微生物由来リパーゼの使用量に対する糸状菌由来プロテアーゼの使用量の比率については本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、短鎖脂肪酸の遊離促進効果をより一層高める観点から、微生物由来リパーゼ１ＬＵ当たりのプロテアーゼの使用量として、例えば０．０２Ｕ以上、好ましくは０．１Ｕ以上、より好ましくは０．１５Ｕ以上、さらに好ましくは０．８Ｕ以上、一層好ましくは２Ｕ以上、より一層好ましくは５Ｕ以上、５０Ｕ以上、又は１５０Ｕ以上が挙げられる。微生物由来リパーゼの使用量に対する糸状菌由来プロテアーゼの使用量の比率の範囲の上限としては特に限定されないが、例えば３００Ｕ以下又は２００Ｕ以下が挙げられる。
なお、糸状菌由来プロテアーゼ活性は、カゼインを基質として、フォリン法により測定されるものとする。すなわち、本発明においては、カゼインを基質として常法により酵素反応を行い、１分間にチロシン１μｇに相当するフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を、１Ｕの糸状菌由来プロテアーゼ活性と定義する。
１－５．凝乳酵素
本発明では、上記の酵素に加え、凝乳酵素が用いられる。凝乳酵素としては、公知の凝乳酵素を特に制限なく用いることができ、例えば、仔ヤギ、仔牛又は仔羊等の哺乳期間の反芻動物由来レンネット；酵母、担子菌、糸状菌、細菌等の微生物由来レンネット；遺伝子組み換えレンネット（遺伝子組み換えキモシン）；イチジクのフィシン、パパイヤのパパイン、パイナップルのブロメラインの植物由来レンネットが挙げられる。
本発明では、上記の酵素に加え、凝乳酵素が用いられる。凝乳酵素としては、公知の凝乳酵素を特に制限なく用いることができ、例えば、仔ヤギ、仔牛又は仔羊等の哺乳期間の反芻動物由来レンネット；酵母、担子菌、糸状菌、細菌等の微生物由来レンネット；遺伝子組み換えレンネット（遺伝子組み換えキモシン）；イチジクのフィシン、パパイヤのパパイン、パイナップルのブロメラインの植物由来レンネットが挙げられる。
凝乳酵素の使用量としては、ナチュラルチーズの製造工程において凝乳する場合に用いられる通常の量を、当業者が適宜選択することができる。
１－６．手順及び反応条件等、並びに他の工程
本発明のナチュラルチーズの製造方法における具体的な手順は、乳汁の乳酸発酵と、凝乳酵素によるカゼイン分子の凝固沈殿（カード化）と、糸状菌由来プロテアーゼ及び微生物由来リパーゼによる短鎖脂肪酸遊離とが適時に行われるように設定されればよい。
本発明のナチュラルチーズの製造方法における具体的な手順は、乳汁の乳酸発酵と、凝乳酵素によるカゼイン分子の凝固沈殿（カード化）と、糸状菌由来プロテアーゼ及び微生物由来リパーゼによる短鎖脂肪酸遊離とが適時に行われるように設定されればよい。
本発明で用いられる糸状菌由来プロテアーゼと微生物由来リパーゼの乳汁への添加時期は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されない。例えば、乳汁の保温前又は保温中；乳汁の乳酸発酵前、乳酸発酵中又は乳酸発酵後；凝乳酵素の添加前、添加時又は添加後等が挙げられる。乳汁中の乳脂肪と糸状菌由来プロテアーゼ及び微生物由来リパーゼとの接触の効率を向上させてナチュラルチーズの製造効率を向上させる観点から、糸状菌由来プロテアーゼ及び微生物由来リパーゼは、凝乳酵素の添加前に添加されることが好ましい。
糸状菌由来プロテアーゼと微生物由来リパーゼとは、同時に添加してもよいし、段階的に添加してもよい。糸状菌由来プロテアーゼと微生物由来リパーゼとを段階的に添加する場合、糸状菌由来プロテアーゼと微生物由来リパーゼとの添加順は特に限定されないが、一例として、糸状菌プロテアーゼを添加し、その後、微生物由来リパーゼを添加することができる。
なお、乳酸発酵のための乳酸菌の添加は任意のタイミングで行うことができ、好ましくは、凝乳酵素の添加前の任意の段階で添加することができる。
糸状菌由来プロテアーゼ、微生物由来リパーゼ、及び凝乳酵素の添加時の温度は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、０～８０℃、好ましくは１０～６０℃、さらに好ましくは２５～４０℃が挙げられる。また、糸状菌由来プロテアーゼ及び微生物由来リパーゼを作用させる時間（熟成期間）としては、ナチュラルチーズの種類に応じて設定することができるが、短鎖脂肪酸の遊離量をより一層高める観点から、好ましくは１か月以上、より好ましくは２カ月以上、さらに好ましくは２．５カ月以上が挙げられる。
本発明のナチュラルチーズの製造方法では、上記の工程の他、通常のナチュラルチーズの製造において行われる任意の工程を適宜含むことができる。他の工程としては、殺菌工程、加熱工程、冷却工程、ｐＨ調整工程、湯中混練工程、加塩工程、成型工程、飽和食塩水への浸漬工程、乾燥工程、及び／又は密封包装工程等が挙げられる。これらの工程は、ナチュラルチーズの種類等に応じて当業者が容易に選択することができる。
２．ナチュラルチーズ
本発明のナチュラルチーズは、製造の際に用いた上記微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを残存成分として含む。本発明のナチュラルチーズは、上記「１．ナチュラルチーズの製造方法」に記載の方法により製造することができる。
本発明のナチュラルチーズは、製造の際に用いた上記微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを残存成分として含む。本発明のナチュラルチーズは、上記「１．ナチュラルチーズの製造方法」に記載の方法により製造することができる。
本発明のナチュラルチーズは、上記糸状菌由来プロテアーゼを用いないことを除いて同様に製造されたナチュラルチーズに比して、短鎖脂肪酸（酪酸）を多く含有する。短鎖脂肪酸（酪酸）の具体的な含有量については、チーズの種類（水分量）、並びに用いた微生物由来リパーゼ及び糸状菌由来プロテアーゼの量にもより異なりうるが、例えば０．８μｍｏｌ／ｇ以上、好ましくは４μｍｏｌ／ｇ以上が挙げられる。ナチュラルチーズのフレーバーをより一層増強する観点から、短鎖脂肪酸（酪酸）の具体的な含有量として、好ましくは６μｍｏｌ／ｇ以上、より好ましくは８μｍｏｌ／ｇ以上、一層好ましくは１０μｍｏｌ／ｇ以上、より一層好ましくは１１μｍｏｌ／ｇ以上が挙げられる。
本発明のナチュラルチーズは、それ自体ナチュラルチーズとして食されるものであってもよいし、プロセスチーズの材料として用いられるものであってもよい。プロセスチーズは、公知の方法に基づいて、ナチュラルチーズの加熱溶融、乳化剤（クエン酸塩、リン酸塩等）、添加物（油、保存料、調味料、増粘安定剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤、香料等）の配合等を適宜行うことで製造することができる。さらに、本発明のナチュラルチーズは、プロセスチーズ以外の加工食品の材料として用いることもできる。
３．ナチュラルチーズ製造における短鎖脂肪酸遊離促進剤
上述したように、微生物由来リパーゼを用いる本発明の製造方法において、糸状菌由来プロテアーゼは、短鎖脂肪酸の遊離促進効果を高めることができる。従って、本発明は、更に、糸状菌由来プロテアーゼを含む、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズ製造における短鎖脂肪酸遊離促進剤も提供する。
上述したように、微生物由来リパーゼを用いる本発明の製造方法において、糸状菌由来プロテアーゼは、短鎖脂肪酸の遊離促進効果を高めることができる。従って、本発明は、更に、糸状菌由来プロテアーゼを含む、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズ製造における短鎖脂肪酸遊離促進剤も提供する。
本発明の短鎖脂肪酸遊離促進剤において、各酵素の詳細及び使用方法等については、上記「１．ナチュラルチーズの製造方法」で述べた通りである。
また、本発明の短鎖脂肪酸遊離促進剤は、各酵素の他に、食品学的に許容される他の成分を含んでもよい。当該他の成分としては、賦形剤、崩壊剤、防腐剤、保存料、安定剤、ビタミン、ミネラル、甘味料、調味料等が挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
使用酵素
＜プロテアーゼ＞
・プロテアーゼＡ「アマノ」２ＳＤ（以下において、「ＰＲ－Ａ２ＳＤ」と記載する。）：糸状菌アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）由来プロテアーゼ（天野エンザイム株式会社製）
・プロチンＳＤ－ＮＹ１０（以下において、「ＳＤ－ＮＹ１０」と記載する。）：細菌バシラス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）由来プロテアーゼ（天野エンザイム株式会社製）
＜リパーゼ＞
・ＩｔａｌａｓｅＣ：動物由来リパーゼ（ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社製）
・Ｇ４２９Ｍ：配列番号１３に示すアミノ酸配列から第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに該当するリパーゼ
＜プロテアーゼ＞
・プロテアーゼＡ「アマノ」２ＳＤ（以下において、「ＰＲ－Ａ２ＳＤ」と記載する。）：糸状菌アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）由来プロテアーゼ（天野エンザイム株式会社製）
・プロチンＳＤ－ＮＹ１０（以下において、「ＳＤ－ＮＹ１０」と記載する。）：細菌バシラス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）由来プロテアーゼ（天野エンザイム株式会社製）
＜リパーゼ＞
・ＩｔａｌａｓｅＣ：動物由来リパーゼ（ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社製）
・Ｇ４２９Ｍ：配列番号１３に示すアミノ酸配列から第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチドに該当するリパーゼ
活性値測定方法
プロテアーゼ及びリパーゼの活性値の測定方法は、次の通りである。
プロテアーゼ及びリパーゼの活性値の測定方法は、次の通りである。
＜プロテアーゼ活性＞
０．６％（ｖ／ｗ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０［ＰＲＳＤ－ＮＹ１０の場合］又はｐＨ６．０［ＰＲ－Ａ２ＳＤの場合］）５ｍＬを、３７℃で１０分間加温した後、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを加えて振り混ぜた。この液を３７℃で１０分間放置した後、トリクロロ酢酸試液（１．８％トリクロロ酢酸、１．８％酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含むトリクロロ酢酸［ＰＲＳＤ－ＮＹ１０の場合］又は０．４４ｍｏｌ／Ｌ［ＰＲ－Ａ２ＳＤの場合］）５ｍＬを加えて振り混ぜ、再び３７℃で３０分間放置し、ろ過した。初めのろ液３ｍＬを除き、次のろ液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加えて振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。この液（酵素反応液）につき、水を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度ＡＴを測定した。
０．６％（ｖ／ｗ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０［ＰＲＳＤ－ＮＹ１０の場合］又はｐＨ６．０［ＰＲ－Ａ２ＳＤの場合］）５ｍＬを、３７℃で１０分間加温した後、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを加えて振り混ぜた。この液を３７℃で１０分間放置した後、トリクロロ酢酸試液（１．８％トリクロロ酢酸、１．８％酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含むトリクロロ酢酸［ＰＲＳＤ－ＮＹ１０の場合］又は０．４４ｍｏｌ／Ｌ［ＰＲ－Ａ２ＳＤの場合］）５ｍＬを加えて振り混ぜ、再び３７℃で３０分間放置し、ろ過した。初めのろ液３ｍＬを除き、次のろ液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加えて振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。この液（酵素反応液）につき、水を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度ＡＴを測定した。
別に、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを量り、トリクロロ酢酸試液（１．８％トリクロロ酢酸、１．８％酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含むトリクロロ酢酸［ＰＲＳＤ－ＮＹ１０の場合］又は０．４４ｍｏｌ／Ｌ［ＰＲ－Ａ２ＳＤの場合］）５ｍＬを加えて振り混ぜた後、０．６％（ｖ／ｗ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０［ＰＲＳＤ－ＮＹ１０の場合］又はｐＨ６．０［ＰＲ－Ａ２ＳＤの場合］）５ｍＬを加えて振り混ぜ、３７℃で３０分間放置したことを除いて上述の酵素反応液と同様に操作した液（ブランク）について、吸光度ＡＢを測定した。
１分間にチロシン１μｇに相当するフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
１ｍｇ／ｍＬチロシン標準原液（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸中）１ｍＬ，２ｍＬ，３ｍＬ及び４ｍＬを量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加え、１００ｍＬとした。それぞれの液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加えて振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。これらの液につき、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液２ｍＬを量り上記と同様に操作して得た液を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を測定した。縦軸に吸光度Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を、横軸にそれぞれの液２ｍＬ中のチロシン量（μｇ）をとり、検量線を作成し、吸光度差１に対するチロシン量（μｇ）を求めた。
＜リパーゼ活性＞
０．６ｇ/ｄＬアラビアゴム溶液（グリセリン含有）７０ｍＬ、トリブチリン２２．３ｍＬ及び水３２９ｍＬを乳化器に入れ、１４，５００±３００ｍｉｎ-1の条件で１５分間(回転：５分間×３回、停止：５分間×２回)乳化し、トリブチリン基質液とした。一方、適当量のリパーゼを量り、冷水を用いて希釈し、試料溶液とした。平底試験管にトリブチリン基質液３０ｍＬを正確に量り、３０±０．５℃で１５分間放置した。放置後、ｐＨ電極を浸し、攪拌した。(以降において、操作中は連続攪拌した。)この液を０．０５ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム液（定量用）を用いてｐＨ７．００±０．０５に調整した。ｐＨ調整後、直ちに試料溶液２ｍＬを正確に加え反応を開始した。反応開始後、ｐＨ７．００±０．０５を保持するよう直ちに０．０５ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム液（定量用）の滴下を開始し、反応開始から正確に５分間滴下を続ける間、１分毎に滴定量（Ｖ１～Ｖ５（ｍＬ））を記録した。
０．６ｇ/ｄＬアラビアゴム溶液（グリセリン含有）７０ｍＬ、トリブチリン２２．３ｍＬ及び水３２９ｍＬを乳化器に入れ、１４，５００±３００ｍｉｎ-1の条件で１５分間(回転：５分間×３回、停止：５分間×２回)乳化し、トリブチリン基質液とした。一方、適当量のリパーゼを量り、冷水を用いて希釈し、試料溶液とした。平底試験管にトリブチリン基質液３０ｍＬを正確に量り、３０±０．５℃で１５分間放置した。放置後、ｐＨ電極を浸し、攪拌した。(以降において、操作中は連続攪拌した。)この液を０．０５ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム液（定量用）を用いてｐＨ７．００±０．０５に調整した。ｐＨ調整後、直ちに試料溶液２ｍＬを正確に加え反応を開始した。反応開始後、ｐＨ７．００±０．０５を保持するよう直ちに０．０５ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム液（定量用）の滴下を開始し、反応開始から正確に５分間滴下を続ける間、１分毎に滴定量（Ｖ１～Ｖ５（ｍＬ））を記録した。
１分間に１．０μｍｏｌの酪酸の増加をもたらす酵素量を１単位（1ＬＵ）とした。
短鎖脂肪酸選択性の確認
乳脂肪（脂肪球を乳化剤により破壊し、乳脂肪が露出した状態のもの）２ｇを基質とし、ＩｔａｌａｓｅＣ又はＧ４２９Ｍを、乳脂肪１ｇ当たり３ＬＵの量で４０℃で３０分作用させる条件に供した後、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸の遊離量を測定した。その結果、Ｃ４の脂肪酸（酪酸）の遊離量が、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸それぞれの遊離量よりも大きい（モル基準での対比）ことを確認した。
乳脂肪（脂肪球を乳化剤により破壊し、乳脂肪が露出した状態のもの）２ｇを基質とし、ＩｔａｌａｓｅＣ又はＧ４２９Ｍを、乳脂肪１ｇ当たり３ＬＵの量で４０℃で３０分作用させる条件に供した後、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸の遊離量を測定した。その結果、Ｃ４の脂肪酸（酪酸）の遊離量が、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８及びＣ１８：１の脂肪酸それぞれの遊離量よりも大きい（モル基準での対比）ことを確認した。
試験例１
牛乳（乳脂肪２．９重量％、乳タンパク３．３重量％）２２５ｋｇ（５００ｌｂ）を、７３℃、１９秒間加熱殺菌したものを材料に用いた。殺菌した牛乳を３４．４℃まで冷却し、乳酸菌（ＤＳＭ ＣＰ－１２１）を１１．４ｇ添加し、ｐＨ６．４５に低下するまで約１時間撹拌した。次にレンネット（ＤＳＭ Ｍａｘｉｒｅｎ ＸＤＳ ＢＦ；ウシ由来キモシン遺伝子を酵母にて発現させた組み換えレンネット）を１４．３ｇ添加し、撹拌を止めて３０分静置した。カードの形成を確認し、カードをキューブ状に切って撹拌しながら４１℃まで加温した後、ホエイとカードとを分離した。カード２０ｇに、表１に示す酵素を添加してよく混ぜた後、６５℃まで加熱して成型し、容器に移して８℃で熟成させた。熟成３か月後に得られたナチュラルチーズ（セミハードタイプのプロボローネチーズ）について次の操作に従って遊離脂肪酸の分析を行った。
牛乳（乳脂肪２．９重量％、乳タンパク３．３重量％）２２５ｋｇ（５００ｌｂ）を、７３℃、１９秒間加熱殺菌したものを材料に用いた。殺菌した牛乳を３４．４℃まで冷却し、乳酸菌（ＤＳＭ ＣＰ－１２１）を１１．４ｇ添加し、ｐＨ６．４５に低下するまで約１時間撹拌した。次にレンネット（ＤＳＭ Ｍａｘｉｒｅｎ ＸＤＳ ＢＦ；ウシ由来キモシン遺伝子を酵母にて発現させた組み換えレンネット）を１４．３ｇ添加し、撹拌を止めて３０分静置した。カードの形成を確認し、カードをキューブ状に切って撹拌しながら４１℃まで加温した後、ホエイとカードとを分離した。カード２０ｇに、表１に示す酵素を添加してよく混ぜた後、６５℃まで加熱して成型し、容器に移して８℃で熟成させた。熟成３か月後に得られたナチュラルチーズ（セミハードタイプのプロボローネチーズ）について次の操作に従って遊離脂肪酸の分析を行った。
サンプル（ナチュラルチーズ）５ｇと０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５ｍＬとをよく混合してスラリーを作成し、スラリー１ｇ、２．５Ｍ硫酸０．０５ｍＬ、０．１Ｍペラルゴン酸（Ｃ９，内部標準）０．０５ｍＬ、及びクロロホルム２．５ｍＬをボルテックスで混合し、遊離脂肪酸を抽出した。遠心分離（７，０００ｒｐｍ，１０分）を行ってクロロホルム相を回収し、ガスクロマトグラフィ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、カラム：ＣＰ－Ｗａｘ５８）で遊離脂肪酸組成の分析を行った。結果を表１及び図１に示す。
表１に示す通り、ナチュラルチーズの製造に動物由来のリパーゼを用いた場合（参考例１）には短鎖脂肪酸（炭素数４の酪酸）が十分に遊離したが、微生物由来リパーゼを用いた場合（比較例２）には、リパーゼを用いなかった場合（比較例１）程度しか短鎖脂肪酸が確認できなかった。一方で、微生物由来リパーゼに糸状菌由来のプロテアーゼを併用した場合（実施例１、２）、比較例２に比べて遊離した短鎖脂肪酸量が増加し、その効果は、糸状菌由来のプロテアーゼの添加量に依存して増強された。なお、糸状菌由来のプロテアーゼの代わりに細菌由来のプロテアーゼを用いた場合には、短鎖脂肪酸量を増加させる効果は認められなかった（比較例３）。
試験例２
市販牛乳（乳脂肪３．５重量％、乳タンパク３重量％）３．８Ｌを３４℃に加温し、中温性乳酸菌（Ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｔ Ｃｈｅｅｓｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｃ１０１））１ｇ及び好熱性乳酸菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｔ Ｃｈｅｅｓｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｃ２０１））１ｇと、表２に示す酵素とを添加した。３０分撹拌後、レンネット（ＤＳＭ Ｍａｘｉｒｅｎ ＸＤＳ ＢＦ）０．２４ｇを添加し、３５分間静置した。カードの形成を確認して、カードを粗く切り、撹拌しながら３０分かけて４１℃まで加温した。ｐＨが５．９まで低下した後、ホエイとカードとを分離した。回収したカードを３８℃で１時間浸漬した後、カードをキューブ状に切り、さらにｐＨが５．２に低下したのを確認して食塩１１．８ｇとよく混合した。続いてカードを７０℃の熱水中で十分にストレッチが出てくるまで処理した後、熱水中から取り出して成型し、冷水中に３０分浸漬させた。さらに１０℃の飽和食塩水に一晩浸漬した後、取り出したチーズを２時間室温で乾燥させ、密封包装して８℃で熟成させた。熟成３か月後に得られたナチュラルチーズ（セミハードタイプのプロボローネチーズ）について試験例１と同様にして遊離脂肪酸の分析を行った。結果を表２及び図２に示す。
市販牛乳（乳脂肪３．５重量％、乳タンパク３重量％）３．８Ｌを３４℃に加温し、中温性乳酸菌（Ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｔ Ｃｈｅｅｓｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｃ１０１））１ｇ及び好熱性乳酸菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｔ Ｃｈｅｅｓｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｃ２０１））１ｇと、表２に示す酵素とを添加した。３０分撹拌後、レンネット（ＤＳＭ Ｍａｘｉｒｅｎ ＸＤＳ ＢＦ）０．２４ｇを添加し、３５分間静置した。カードの形成を確認して、カードを粗く切り、撹拌しながら３０分かけて４１℃まで加温した。ｐＨが５．９まで低下した後、ホエイとカードとを分離した。回収したカードを３８℃で１時間浸漬した後、カードをキューブ状に切り、さらにｐＨが５．２に低下したのを確認して食塩１１．８ｇとよく混合した。続いてカードを７０℃の熱水中で十分にストレッチが出てくるまで処理した後、熱水中から取り出して成型し、冷水中に３０分浸漬させた。さらに１０℃の飽和食塩水に一晩浸漬した後、取り出したチーズを２時間室温で乾燥させ、密封包装して８℃で熟成させた。熟成３か月後に得られたナチュラルチーズ（セミハードタイプのプロボローネチーズ）について試験例１と同様にして遊離脂肪酸の分析を行った。結果を表２及び図２に示す。
また、得られたナチュラルチーズのフレーバーについて、以下の基準に基づいて官能評価した。短鎖脂肪酸とは炭素数４の酪酸を表す。結果を表２に示す。
＋＋＋：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが強く感じられる
＋＋：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが感じられる
＋：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが弱く感じられる
－：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが感じられない
＋＋＋：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが強く感じられる
＋＋：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが感じられる
＋：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが弱く感じられる
－：短鎖脂肪酸由来のフレーバーが感じられない
さらに、得られたナチュラルチーズの保形性について、熟成前のナチュラルチーズの形状を基準とした場合の熟成後の形状がどの程度変化したかを保形性の指標とし、以下の基準に基づいて評価した。結果を表２に示す。
◎：形状が変化しなかった（形状が保てていた）
〇：形状の変化がわずかに潰れる程度であった（形状はほとんど保てていた）
△：形状の変化が少し潰れる程度に認められた（形状はなんとか保てていた）
×：形状の変化が激しかった（形状は保てなかった）
◎：形状が変化しなかった（形状が保てていた）
〇：形状の変化がわずかに潰れる程度であった（形状はほとんど保てていた）
△：形状の変化が少し潰れる程度に認められた（形状はなんとか保てていた）
×：形状の変化が激しかった（形状は保てなかった）
表２から明らかなとおり、微生物由来リパーゼに糸状菌由来のプロテアーゼを併用した場合（実施例３～６）において、短鎖脂肪酸由来のフレーバーを感じることができ、特に実施例５、６で、当該フレーバーを顕著に感じることができた。なお、データに示していないが、糸状菌由来プロテアーゼを用いないことを除いて実施例３～６と同様の工程を行って製造したナチュラルチーズにおいては、短鎖脂肪酸由来のフレーバーが感じられなかった。また、微生物由来リパーゼの添加量が多いほど（実施例３、４に対する実施例５、６）、及び糸状菌由来のプロテアーゼの添加量が多いほど（実施例３に対する実施例４、実施例５に対する実施例６）、短鎖脂肪酸の遊離量は増加するが、糸状菌由来のプロテアーゼの添加量が抑えられた実施例５で、顕著に優れた保形性が認められた。
配列番号１は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ａ変異体である。
配列番号２は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ｆ変異体である。
配列番号３は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ｌ変異体である。
配列番号４は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ｓ変異体である。
配列番号５は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ３２２Ｗ変異体である。
配列番号６は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｆ３６０Ｌ変異体である。
配列番号７は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｓ３８０Ｉ変異体である。
配列番号８は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｓ３８０Ｌ変異体である。
配列番号９は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ４２５Ｗ変異体である。
配列番号１０は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ４２８Ｆ変異体である。
配列番号１１は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ４２８Ｎ変異体である。
配列番号１２は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｇ４２９Ｆ変異体である。
配列番号１３は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｇ４２９Ｍ変異体である。
配列番号１４は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｇ４２９Ｉ変異体である。
配列番号１５は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｖ５４９Ｆ変異体である。
配列番号２は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ｆ変異体である。
配列番号３は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ｌ変異体である。
配列番号４は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｐ２６１Ｓ変異体である。
配列番号５は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ３２２Ｗ変異体である。
配列番号６は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｆ３６０Ｌ変異体である。
配列番号７は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｓ３８０Ｉ変異体である。
配列番号８は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｓ３８０Ｌ変異体である。
配列番号９は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ４２５Ｗ変異体である。
配列番号１０は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ４２８Ｆ変異体である。
配列番号１１は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｌ４２８Ｎ変異体である。
配列番号１２は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｇ４２９Ｆ変異体である。
配列番号１３は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｇ４２９Ｍ変異体である。
配列番号１４は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｇ４２９Ｉ変異体である。
配列番号１５は、カンジダ・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）由来のシグナルペプチドを含むリパーゼＬＩＰ１の、Ｖ５４９Ｆ変異体である。
Claims (11)
- 乳汁に、微生物由来リパーゼと糸状菌由来プロテアーゼとを作用させる工程を含む、ナチュラルチーズの製造方法。
- 前記微生物由来リパーゼが、下記（１）～（３）に示す少なくともいずれかのポリペプチドからなる、請求項１に記載の製造方法：
（１）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列それぞれから第１～１５位のアミノ酸配列が除去されたアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、短鎖脂肪酸選択性を有するポリペプチド。 - 前記微生物由来リパーゼの使用量が、前記乳汁中の乳脂肪１ｇ当たり１ＬＵ以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 前記微生物由来リパーゼ１ＬＵ当たりの前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が０．０２Ｕ以上である、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
- 前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が、前記乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり０．３Ｕ以上である、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
- 前記糸状菌由来プロテアーゼの使用量が、前記乳汁中の乳タンパク質１ｇ当たり２０Ｕ以下である、請求項５に記載の製造方法。
- 前記糸状菌由来プロテアーゼがアスペルギルス属由来プロテアーゼである、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
- 微生物由来リパーゼと、糸状菌由来プロテアーゼとを含む、ナチュラルチーズ。
- 糸状菌由来プロテアーゼを含む、微生物由来リパーゼを用いるナチュラルチーズ製造における短鎖脂肪酸遊離促進剤。
- 請求項１～７のいずれかに記載の製造方法によりナチュラルチーズを製造する工程と、
前記ナチュラルチーズを加工する工程と、を含む、チーズ加工品の製造方法。 - 請求項１０に記載の製造方法によって製造される、チーズ加工品。
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