WO2022162256A1 - Dispositivo modular para regeneración nerviosa y procedimiento de fabricación - Google Patents

Dispositivo modular para regeneración nerviosa y procedimiento de fabricación Download PDF

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WO2022162256A1
WO2022162256A1 PCT/ES2021/070861 ES2021070861W WO2022162256A1 WO 2022162256 A1 WO2022162256 A1 WO 2022162256A1 ES 2021070861 W ES2021070861 W ES 2021070861W WO 2022162256 A1 WO2022162256 A1 WO 2022162256A1
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microfilaments
modular
elementary
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modules
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PCT/ES2021/070861
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Manuel MONLEÓN PRADAS
Cristina MARTÍNEZ RAMOS
Laura RODRÍGUEZ DOBLADO
Fernando Gisbert Roca
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Universitat Politècnica De València
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    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Definitions

  • the object of the invention is a modular device for nerve regeneration, based on the union of elementary modules forming modular neurocables made up of glial support cells or glial cells and neurons inside cylindrical structures of natural and synthetic origin, for use in the regeneration of neural tracts of the central nervous system (CNS) or the peripheral nervous system (PNS).
  • CNS central nervous system
  • PNS peripheral nervous system
  • the loss of communication between the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS) is the cause of numerous disorders that compromise the quality of life of those affected. This loss of communication can be due to trauma, accidents, degenerative diseases, or other causes, such as birth problems. It can affect brain structures, such as the nigrostriatal tract in the case of Parkinson's disease, spinal cord, in the case of spinal cord injury, or nerves.
  • Allografts overcome several of the drawbacks of autografts, but require immunosuppression or decellularization to prevent immunological rejection, as well as surgical intervention, rehabilitation, and the use of anti-inflammatories. Also, don't have had satisfactory results when the lesions are greater than 2 cm in length.
  • Synthetic conduits have only been successfully used clinically for lesions smaller than 1 cm.
  • it is possible to find both cylindrical porous structures of collagen, whose ellipsoidal cavities have a preferential direction, as bundles of joined microfilaments of PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid) and PCL (polycaprolactone), simulating the subfascicular structure of the endoneurium although the most common is to use tubular ducts with one or more parallel through channels, which serve as a preferential path or guide the axons, or mixed systems of the above.However, especially in relation to CNS lesions , the solutions proposed to date have not been sufficiently successful.
  • Document WO2007090102A2 refers to structures that include, among their possible configurations, conduits with a polymeric sheath containing longitudinally aligned filaments inside, made up of aliphatic polyesters such as PLA (polylactic acid), which act as scaffolding and guides for the regeneration of great lengths of nervous tissue.
  • PLA polylactic acid
  • the structures are biohybrid in nature and may comprise, in addition to synthetic polymers, biomolecules useful for nerve regeneration, neural stem cells, Schwann cells and growth factors.
  • the duct can reach a length of up to 50 cm and is formed longitudinally as a single piece, which is manufactured using an electrospinning process. According to this procedure, a hollow polymeric structure with the required dimensions is first formed, which is subsequently filled with the fibers of the second polymeric material that are shaped to adapt to the size of the lumen of the duct prepared in the first step in which They are aligned longitudinally.
  • Document WO2013/154780 describes devices in the form of conduits for the repair of peripheral nerves that are capable of reconnecting the nervous tissue, covering lengths greater than 3 cm.
  • the conduits are made up of bioresorbable polymeric hollow tubular modules or segments to which neurons, Schwann cells, and growth factors can be added.
  • These ducts lack fibers in their lumen that act as a guide for axonal growth, or as a link between the segments.
  • the segments have different conductivity and their assembly along the longitudinal axis gives rise to a conduit in which an adequate electrical gradient and growth factors can be established to stimulate axonal propagation, and with it, the repair of the injury.
  • the manufacture of the ducts comprises the use of a cylindrical mold in which a low conductivity polymer is introduced, on top of which another high conductivity polymer is placed, joining both polymers.
  • This cylindrical or tubular material, and in which pores can be created, is removed from the mold, and nerve cells can be seeded at a later stage.
  • These tubes have an internal diameter of 1.5 mm and an external diameter of 1.8 mm. They are limited by a maximum regeneration length in SNPs of 20 mm. In addition, the internal diameter is greater than that of many ribs, and said diameter cannot be modulated, making it not compatible with any type of rib.
  • Document WO2018025186A1 describes a hollow tubular structure of silk fibroin for the regeneration of peripheral nerves.
  • the synthesis procedure carried out allows to generate an increase in the viscosity of the material without increasing the concentration of silk. This makes it possible to create tubes of variable length, up to 10 cm, with improved mechanical properties to be implanted in areas where they are exposed to compression forces, and where it is easier to create gradients of bioactive molecules.
  • the structure obtained may further comprise a conductive agent, biodegradable polymeric material, therapeutic agents, growth factors and cells, such as stem cells or Schwann cells (SCs).
  • a conductive agent such as a conductive agent, biodegradable polymeric material, therapeutic agents, growth factors and cells, such as stem cells or Schwann cells (SCs).
  • SCs Schwann cells Due to current limitations in the technique for treating and repairing damage to peripheral nerves and the CNS, new therapies require materials and factors, chemical or physical, that keep the implant active for several weeks. Therefore, new materials and methods are needed for the treatment of patients with lesions greater than or equal to 3 cm in length.
  • the modular device for nerve regeneration overcomes the drawbacks of the state of the art described, so that it allows progress in nerve regeneration in long neuronal tracts.
  • the device is useful for the regeneration of neural tracts of the central nervous system (CNS) or the peripheral nervous system (PNS).
  • CNS central nervous system
  • PNS peripheral nervous system
  • It is a "biohybrid” device, since it includes materials of natural and synthetic origin and is intended to house glial cells and/or neurons. It comprises an essentially cylindrical structure, made up of cylindrical elementary modules, of a combined (natural and synthetic) degradable and biocompatible material.
  • the elementary modules are hollow, comprising inside an orifice or lumen, inside which support glial cells (Schwann cells, oligodendrocytes) and axonal extensions of neurons are housed. From the union of one or more elementary modules, the cylindrical structure can reach a variable length between 0.6 cm and 90 cm approximately.
  • the device comprises one or more bundles of microfilaments, which can be parallel or branched, made up of parallel microfilaments, distributed throughout the lumen of the elementary modules. In this way, it is the microfilaments that hold the different elementary modules together.
  • the microfilaments serve as a support for adhesion and guidance during cell migration and the extension of axons, which can grow from end to end, in great lengths (tens of centimeters).
  • microfilaments are kept parallel to the longitudinal axis of the cylindrical structure thanks to their attachment to fixation and suture structures, formed by a flexible polymeric material, positioned in extreme elementary modules, through which both fastening and suturing are carried out. of the microfilaments as the subsequent suture of the device to the injured nerve.
  • the device may also comprise auxiliary fixing structures, for example, in the form of a ring and arranged in series, which are positioned in one or more of the inner lumens of the elementary modules.
  • auxiliary fixing structures help maintain the cylindrical shape of the microfilament bundles in an aqueous medium, preventing the microfibers from collapsing and joining each other.
  • Each of the elementary modules is made up of a porous material, in which a growth factor and/or drug release module can be incorporated for a controlled and localized release thereof.
  • the device may additionally comprise means for allowing electrical and/or magnetic stimulation of the biological structures.
  • the device may comprise a single cylindrical structure made up of a series of elementary modules arranged one after the other, inside which one or more bundles of microfilaments are arranged.
  • it may comprise a cylindrical structure which branches off into at least two cylindrical structures.
  • the beam also branches into two beams.
  • the device can comprise two or more cylindrical structures that run in parallel and that, when reaching a fork, start off in different directions.
  • the device may comprise a polymeric cylindrical sheath, which covers all the cylindrical structures.
  • the device comprises a portion of the extracorporeal cylindrical structure, it can be covered by a cylindrical sheath of an elastomeric polymer.
  • the device may comprise an extracorporeal pumping system that circulates biological fluids inside the sheath.
  • the device is adaptable to the thickness, length and number of beams.
  • it is intended to house cells, growth factors and drugs, among others.
  • Another object of the invention is a method for manufacturing the modular device for nerve regeneration, described above, and comprising the steps of: a) preparation of micro or nanoparticles loaded with bioactive molecules, b) provision of a mold with slots for the manufacture of the elementary modules, c) introduction of a polymeric material in the form of fiber in each of the slots of the mold with structures at the ends to facilitate the centering of the fiber in each slot, d) preparation of solutions, for example , of hyaluronic acid (HA), with the micro or nanoparticles of step a) and agitation, in the presence of a cross-linking agent, e) injection of the solutions into the grooves of the mold, obtaining a set of mold-solutions that cross-links in in situ, f) freezing of the template-solutions set, g) lyophilization of the template-solutions set obtaining the elementary modules of HA, h) extraction of the polymeric fiber ca, thus creating the lumen of the cylindrical structure in a centered position, i)
  • the device and procedure object of the present invention allow the manufacture of addressable structures for axonal regeneration of long length, of more than 10 cm, providing a more effective therapeutic alternative, and with fewer inconveniences and limitations than the use of autologous tissue graft or cadaveric allotment tissue.
  • the modular design of the device provides a series of advantages from the functional point of view and its manufacturing process, namely:
  • the free sections provided by the elementary modules of the device increase the exchange of nutrients and cells with the environment, allowing, on the one hand, a greater survival of the cells transplanted inside and, on the other, an increase in the metabolism necessary in the regeneration process.
  • the device of the invention will have various impacts:
  • the implantation of neurocables that release factors and drugs can solve the problem of cell repopulation, facilitating the reconstruction of long pathways and creating a favorable niche to facilitate axonal growth, encompassing a multitude of irreparable injuries today.
  • Figure 1. Shows a general view of the device.
  • Figure 2. Shows a partial longitudinal section of the device.
  • Figure 3. Shows a complete longitudinal section of the device.
  • Figure 4. Shows a cross section of the device without an auxiliary fixation structure (left) and with an auxiliary fixation structure (right).
  • Figure 5. Shows a detailed view of the ring of fibers and the fixing and suturing structure.
  • Figure 6. Shows a general view of a flat array of parallel microfilaments.
  • Figure 7. Shows a view of a device with nine modules in a curved position, without fastening at the ends.
  • Figure 8.- Shows a general view of an embodiment of an association of two devices.
  • Figure 9. Shows a section of three devices of different diameters, contained within a protective outer shell.
  • Figure 10.- Shows a view of an embodiment of the invention with a bifurcation of two cylindrical structures starting from a single cylindrical structure.
  • Figure 11.- Shows a view of an embodiment of the invention with a bifurcation of two cylindrical structures starting from two cylindrical structures.
  • Figure 12.- Shows a complete longitudinal section of the device with support cells inside after its culture in vitro.
  • Figure 13 Shows a complete longitudinal section of the device with support cells inside and a neuronal source at one end after its in vitro culture.
  • Figure 1 shows a general view of the device, which in this embodiment comprises a single modular structure (1), of variable length between 0.6 cm and 90 cm, the modular structure (1) consisting of elementary modules (2 ) cylindrical, made of a biodegradable and biocompatible natural and synthetic material.
  • the modular structure (1) comprises three elementary modules (2).
  • the elementary modules (2) are hollow, comprising inside a hole or lumen (3), inside which they are intended to be housed. supporting glial cells (Schwann cells, oligodendrocytes) and axonal processes of neurons.
  • Each elementary module (2) is a cylinder with dimensions between 0.5 cm and 2 cm in length, between 0.01 cm and 2 cm in internal diameter and between 0.05 cm and 3.5 cm in external diameter. From the union of one or more elementary modules (2) positioned in series or parallel, the modular cylindrical structure can reach a variable length between approximately 0.6 cm and 90 cm.
  • the elementary modules (2) can be made of different materials. It must be a biocompatible porous material that allows the exchange of fluids and nutrients between the internal and external part of the device. Furthermore, it is preferable that the material is bioabsorbable or biodegradable, in this way it is not necessary to remove the device surgically when the regenerative process is complete.
  • Suitable biocompatible materials for the elementary modules (2) include synthetic polyesters and natural polymers, forming a porous structure such as: hyaluronic acid (HA), cross-linked HA, cross-linked methacrylate HA, cross-linked chitosan, alginate, collagen, gelatin, agarose crosslinked, polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyethylene glycol, poly(glycerol sebacate), etc.
  • HA hyaluronic acid
  • PHA polylactic acid
  • PCL polycaprolactone
  • PEG polyethylene glycol
  • poly(glycerol sebacate) poly(glycerol sebacate)
  • the elementary modules (2) are manufactured by using a mold or by electrospinning techniques or by any other technique that allows this morphology.
  • each modular structure (1) is intended to viably house in the interior lumen (3) both support glial cells (Schwann cells, oligodendrocytes) and axonal extensions of neurons located at their ends, with neuronal connectivity end-to-end functionality of the device.
  • glial cells Rost cells, oligodendrocytes
  • axonal extensions of neurons located at their ends, with neuronal connectivity end-to-end functionality of the device.
  • the device comprises one or more bundles (4), which can be parallel, as is the case in figure 2, or branched, made up of microfilaments (5). parallel, distributed throughout the lumen (3) of the elementary modules (2), with a length between 0.6 cm and 90 cm and a diameter of each microfilament between 0.001 cm and 0.1 cm.
  • microfilaments (5) that hold the different elementary modules (2) together.
  • the microfilaments (5) serve as support for adhesion and guide during cell migration and axon extension, which can grow from end to end, in great lengths (tens of centimeters).
  • the microfilaments (5) drive axonal extension from end to end of the device, stimulated by the support cells sitting on the microfilaments (5).
  • Figure 3 shows a section of the bundles (4), in which it can be seen how the microfilaments (5) remain parallel to the longitudinal axis of the modular structure (1) thanks to their attachment to fixation and suture structures.
  • (6) made of a flexible polymeric material, positioned in some extreme elementary modules (2), through which both the fastening of the bundles (4) and the subsequent suturing of the device to the injured nerve are carried out.
  • the device may also comprise auxiliary fixation structures (7) in the form of rings arranged in series, and which are positioned in one or more of the lumens (3). ) interiors of the elementary modules (2), and which contribute to maintaining the cylindrical shape of the bundles (4) of microfilaments (5) in an aqueous medium, preventing them from collapsing by joining each other.
  • auxiliary fixation structures (7) in the form of rings arranged in series, and which are positioned in one or more of the lumens (3).
  • interiors of the elementary modules (2) and which contribute to maintaining the cylindrical shape of the bundles (4) of microfilaments (5) in an aqueous medium, preventing them from collapsing by joining each other.
  • auxiliary fixation structures (7) in the form of rings arranged in series, and which are positioned in one or more of the lumens (3).
  • interiors of the elementary modules (2) and which contribute to maintaining the cylindrical shape of the bundles (4) of microfilaments (5) in an aqueous medium, preventing them
  • FIG. 5 shows a more detailed view of the microfilaments (5) attached to the fixation and suture structures (6).
  • the microfilaments (5) can be made of different materials, preferably synthetic degradable polyesters (polylactic acid (PIA), polylactic-coglycolic acid (PLGA), poly- ⁇ -caprolactone (PCL), polypyrrole (PPy), carbon nanotubes (CNTs) , silk fibroin, poly(3,4-ethylenedioiithiophene) (PEDOT), polyaniline (PANI), etc.) or from carbon fibers or conductive metals such as gold or platinum, or a combination thereof.
  • synthetic degradable polyesters polylactic acid (PIA), polylactic-coglycolic acid (PLGA), poly- ⁇ -caprolactone (PCL), polypyrrole (PPy), carbon nanotubes (CNTs) , silk fibroin, poly(3,4-ethylenedioiithiophene) (PEDOT), polyaniline (PANI),
  • microfilaments (5) are arranged inside the interior lumen (3) or lumen of the elementary modules (2) of the modular structure(s) (1) can be variable: in the form of flat groups of parallel microfilaments (5) joined at the ends by a flexible polymeric material or in the form of cylindrical bundles of microfilaments (5) held at each end by rings of flexible polymeric material.
  • manufacturing procedures for parallel microfibers (5) joined at both ends are described: manufacturing procedures for parallel microfibers (5) joined at both ends.
  • microfilaments (5) which are shown in a detailed view in Figure 6, a certain number of microfilaments (5) (600 microfilaments (5)) are grouped and some are arranged in parallel. next to each other on a flat surface, such as a glass plate.
  • a flexible polymeric material dissolved below and above the microfilaments (5) is placed at both ends, which, when solidified, holds the filaments together in a flat and parallel arrangement.
  • microfilaments (5) in cylinder mode, like the one shown in Figure 2, these are first arranged in the form of flat arrays of parallel microfilaments (5), like those in Figure 6. , and are subsequently wound around a rod of suitable diameter in order to obtain the cylindrical shape without the microfilaments (5) losing their parallel arrangement.
  • a dissolved flexible polymeric material is then applied to form a ring of the desired length and allowed to dry. Once dry, the rod is extracted and the microfilament cylinder (5) is obtained.
  • the number of microfilaments (5) that make up the cylinder can vary depending on the diameter of the individual microfilaments (5) and the diameter of the bundle (4) of microfilaments (5) that is to be generated.
  • the cylindrical bundle of microfilaments (5) is inserted into the lumen (3) of the conduit, from end to end of the elementary module (2).
  • the microfilaments (5) are the element common to all the elementary modules (2), which are positioned one next to the other, with the microfilament bundle (5) passing through their lumens or holes (3).
  • the modular structures (1) made up of several elementary modules (2) have, at both ends, fixing and suturing structures (6) made of a flexible polymeric material that, in addition to maintaining the cylindrical arrangement of the bundle (4) of microfilaments (5 ), prevent excessive separation between elementary modules (2) and allow manipulation of the modular device (1) as a single entity.
  • a structure is positioned in the extreme elementary modules (2). of fixation and slightly conical suture of a flexible polymeric material, shown in detail in figure 5, to improve the introduction of the distal and proximal end of the injured nerve and facilitate the suture to said structure.
  • Modular manufacturing to span a long length as opposed to manufacturing a single duct spanning that long length, minimizes failures in the manufacturing process.
  • the modular design provides free sections along the entire length, which increase the adaptability of the total length to any curvature, by being able to move and rotate one with respect to the other to a certain extent, as reflected in Figure 7. That is, the flexural strength of the modular structures (1) is much lower than that of the same length obtained from a single piece, which makes it more flexible and adaptable to variable curvatures.
  • the device of the invention may comprise two or more modular structures (1) arranged in parallel, which in turn may comprise a plurality of bundles (4) of microfilaments (5) of variable diameter.
  • Each beam (4) extends continuously throughout the length of the device, so that a continuous internal architecture is generated (except for the areas between elementary modules (2)), longitudinal and aligned that promotes neural regeneration, and which in turn can be included within a protective outer shell (9), as shown in figure 9.
  • the device may comprise a cylindrical sheath (9), as shown in figure 9, which covers each of the bundles (4).
  • the cylindrical sheath (9) can be made of the same materials as the elementary modules (2): synthetic polyesters and natural polymers, forming a porous structure, such as: hyaluronic acid (HA), cross-linked HA, cross-linked methacrylate HA, cross-linked chitosan , alginate, collagen, gelatin, cross-linked agarose, polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyethylene glycol, poly(glycerol sebacate), etc., or it can be made of inert polymers such as silicone, polytetrafluoroethylene (PTFE, Teflon) or the polyacrylates.
  • the device may comprise a portion of extracorporeal modular structure (1), covered by a cylindrical sheath of an elastomeric polymer, such as silicone or polyacrylates.
  • the device comprises a connection to a extracorporeal pumping system that circulates biological fluids inside the sheath.
  • the internal architecture when there are several modular structures (1) increases the surface for the adhesion of the SCs that are part of the device.
  • This architecture makes it possible to contain many more SCs than the device with a single modular structure (1) (with a single bundle (4) of microfilaments (5) in its lumen (3)).
  • the greater number of SCs supposes an improvement of the regenerative process.
  • the internal architecture of several modular structures (1) may provide greater control over the direction of growth of different groups of regenerating nerve fibers.
  • a single nerve can contain thousands of nerve fibers or axons.
  • each axon or a group of axons can be guided during the regenerative process through an individual modular structure (1) or a group of modular structures (1).
  • a branch architecture can be created if desired.
  • two distinct groups of bundles (4) of internal microfilaments (5) may be provided within the internal lumen (3) of the device.
  • the bundle 4 of microfilaments 5 has a single proximal end for connection to the proximal nerve stump.
  • a second (distal) end specifically at an elementary bifurcation module (10), they are separated into two distinct groups of bundles (4), so as to provide two distinct distal ends of the device. Each of these ends connects to a separate branch of the distal nerve stump.
  • the device may comprise two modular structures (1) that run in parallel, and which, upon reaching elementary separation modules (11), divide in different directions.
  • a second object of the invention is the device manufacturing process, which is a modular and sequential process.
  • the corresponding number of elementary modules (2) is assembled passing inside the bundle (4) of continuous microfilaments (5) joined at the ends by fastening and suture structures (6).
  • the support glial cells (12) are seeded at different points inside each elementary module (2), and are cultured in vitro until they form a continuous lining of the inner face of the elementary modules (2), reaching continuity, as shown in figure 12.
  • neuronal sources (13) can be seeded at one end of the device and, where appropriate, at different points along its length. such as neuronal precursors, dorsal root ganglia explants, etc. The pool can then be cultured in vitro until the desired axonal extension is obtained.
  • Each of the elementary modules (2) is made up of a porous material that allows the incorporation of bioactive substances from one or more growth factor and/or drug release modules (8) for a controlled and localized release of the same, as shown in figure 1, either in the matrix of the elementary module (2), or encapsulated inside micro or nanofibrils, micro or nanoparticles, liposomes, or other methods of encapsulation of these substances.
  • Said particles or fibrils can be hydrophilic, like gelatin or hydrophobic, like PLA, or cross-linked gelatin, depending on the character of the molecule to be loaded on them, and variable sizes up to the order of tens of microns.
  • the device may additionally comprise means for electrical stimulation, such as one or more electrodes in contact or not with electroconductive microfilaments for electrical stimulation of the device, and may be housed both in the lumen (3) of the elementary module (2) and on its outside.
  • the device may comprise coils around it that allow magnetic stimulation of the device.
  • electroconductive microfilaments that form closed circuits also allows electrical stimulation of the device without the need to use electrodes.
  • a method for manufacturing the modular device for nerve regeneration comprising the steps of: a) preparation of micro or nanoparticles loaded with bioactive molecules, which may comprise different polymers, such as gelatin, hyaluronic acid, polylactic acid, polyglycolic acid, b) arrangement of a mold with slots to contain the cylindrical elementary modules (2), or ) introduction of a polymeric material in the form of fiber in each of the mold slots, with structures at the ends to facilitate the centering of the fiber in each slot d) preparation of solutions, for example, of hyaluronic acid (HA) , with the micro or nanoparticles of step a) and stirring, in the presence of an HA crosslinking agent, which can preferably be selected from the group consisting of divinylsulfone, ethers such as 1,6-hexanediol diglycidyl ether or polypropylene glycol diglycidyl ether , diepoxides such as 1,2,7,8-diepoxyo
  • bioactive molecules which
  • the crosslinking agent is divinyl sulphone.
  • injection of the solutions into the mold slots obtaining a template-solutions set that crosslinks in situ, f) freezing of the template-solutions set, g) lyophilization of the template-solutions set, obtaining microporous tubular matrices of HA, h) extraction of the polymeric fiber or fibers, thus creating the lumen (3) of the modular structure (1) in a centered position.
  • microfilaments (5) for example, of polylactic acid (PLA), attached at their ends to fixing structures and suture (6) made of flexible polymeric material, joining several elementary modules (2) until reaching a desired size (from a few millimeters to several centimeters), and k) when necessary, obtaining an external wrapper to protect the device in the external application live.
  • PVA polylactic acid
  • a polytetrafluoroethylene (PTFE) mold with 1.5 mm wide channels is used.
  • a 0.4 mm diameter fiber of a hydrophobic material, PCL is inserted into each channel using PTFE washers with a diameter to fit the mold channel to keep it centered, so that it serves as the negative of the internal diameter of the elemental module (2).
  • a 5% hyaluronic acid (HA) solution is prepared in the presence of 0.2M sodium hydroxide (NaOH) and excess divinyl sulfone (DVS) (in a DVS:HA molar ratio of monomer units of 9:10) as crosslinking agent. Said solution is injected into the channels of the PTFE mold. Once the solution gelled, the mold is placed in a Petri dish to prevent evaporation and cooled to -20°C.
  • NaOH sodium hydroxide
  • DVDS divinyl sulfone
  • the template-dissolution set is lyophilized for 24 h at 20 Pa and -80 °C to generate microporous HA matrices due to water sublimation.
  • the dry product is obtained, from which the polycaprolactone fiber (PCL) is extracted, thus creating the hollow internal lumen (3).
  • PCL polycaprolactone fiber
  • a device with 3 elemental modules (2) could cover a short lesion.
  • a device with 9 elementary modules (2) could cover a long lesion without the need for large nerve supplies, such as brachial plexus surgery or oncological surgery, even proposing the reconstruction of spinal cord connections avoiding scar areas or establishing new connections between the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS).
  • CNS central nervous system
  • PNS peripheral nervous system
  • microfilaments (5) For fixing the ends of the device, alternative arrangements of microfilaments (5) are proposed, such as the flat arrays of parallel microfilaments (5) of Figure 6, joined at the ends with a flexible polymeric material, or microfilament cylinders (5) held at each end by a ring of flexible polymeric material.
  • the device of the present invention is not limited only to nerve repair of the PNS but also to structures based on axonal tracts of the CNS such as the spinal cord, optic nerve and other tracts.
  • the free sections along the length greatly facilitate the exchange of nutrients and cells with the environment, thus enabling, on the one hand, greater survival of the cells transplanted inside, and, on the other hand, the greater speed of metabolism with the necessary environment in the regeneration process (both very difficult in a concept of a single long tubular structure, which does not have more openings than the two ends).
  • SCs Schwann cells
  • the elementary modules (2) house inside a bundle (4) of 120 PLA microfilaments of 10 ⁇ m diameter each.
  • the SCs are grown in flasks until confluence, at 37°C, 5% CO 2 , in a culture medium for SCs. All experiments are performed with cells at passage 4 to 6.
  • These supporting glial cells (12) are seeded at different points inside the modular structure (1) at a density of 27,000 cells/mm 2 with the help of a pipette. Wait 30 min before adding culture medium for SCs. After 5 days of in vitro culture, the SCs form a layer-like structure along the internal lumen (3) of each elementary module (2) continuously, and also grow on the bundle (4) of microfilaments (5) of PLA in the direction marked by them, even in the intermodular zones where the microfilaments are no longer covered by the elementary modules (2) of HA,
  • neuronal sources it is possible to use neuronal sources to study axonal growth in modular structures (1) in co-culture with supporting glial cell sources (12). For example, after 5-day culture of the SCs in the modular structure (1), an explant of dorsal root ganglion from neonatal rats can be seeded at one end of each modular structure (1) as a source of projecting neurons ( 13).
  • the whole is cultured in vitro for an additional 21 days, obtaining an axonal extension that covers the entire length of the modular structure (1), these axons even crossing the intermodular zones between different elementary modules (2).
  • the axonal extension was greater than in the devices in which there were no pre-seeded SCs, showing how this element is fundamental for a more efficient axonal growth.
  • the flat arrays of parallel microfilaments (5) or cylinders formed by PLA microfilaments (5) can be coated with an electroconductive polymer such as polypyrrole (PPy).
  • an electroconductive polymer such as polypyrrole (PPy).
  • Py polypyrrole
  • one of the different techniques that can be used is in situ polymerization.
  • each group of microfilaments (5) is placed inside a polypropylene tube with an aqueous solution of pyrrole monomer (Py) and sodium para-toluenesulfonate (pTS) that acts as a dopant, followed by the application of ultrasound to allow the group of microfilaments (5) to become saturated with the Py/pTS solution.
  • Py pyrrole monomer
  • pTS sodium para-toluenesulfonate
  • microfilament arrays (5) are incubated with shaking at 4°C. Then, an aqueous solution of ferric chloride (FeCl 3 ) is added and it is incubated with agitation at 4 °C to achieve oxidative polymerization and deposition of PPy on the PLA substrates. The PPy-coated substrates are washed with agitated deionized water and then with ultrasound in deionized water to remove all PPy residues not adhered to the microfilaments (5). Finally, the microfilament clusters (5) are dried in a fixed vacuum desiccator at 40 °C.
  • the modular structure (1) can be functionalized by loading one or several bioactive substances in each elementary module (2) with the same or different concentration. In this way, it is possible to create gradients of various types that favor regeneration. The creation of gradients in a non-modular structure could not be carried out as it had to be functionalized with one or more substances, but with the same concentration.
  • functionalized devices could be created with bioactive molecules in each elementary module (2) with the same or different concentration by incorporating them inside using microparticles of polylactic-coglycolic acid (PLGA) loaded with a growth factor that favors axonal extension, such as for example nerve growth factor (NGF) at a concentration of 10 ng/mL.
  • PLGA polylactic-coglycolic acid
  • NGF nerve growth factor
  • PLGA microparticles are prepared by the water-in-oil-in-watert (W/O/W) method.
  • An aqueous solution is prepared with the NFG and added to a solution of PLGA in dichloromethane, obtaining the first emulsion (W/O).
  • This emulsion is added dropwise to a solution of polyvinyl alcohol in an aqueous solution of sodium chloride, obtaining the second emulsion (W/O/W).
  • the W/O/W emulsion is stirred at room temperature to allow solvent evaporation and finally the microparticles are collected by centrifugation.
  • Elementary modules (2) can be designed with more or less porosity, with different chemical composition of the structural materials, with more or less loads of bioactive molecules or coating on their surface, with different cell types sown etc. so that there is a gradient between some elementary modules (2) and others when forming part of a device with a unique modular structure (1), giving this added functionality to the whole device.
  • Bioactive substances can be incorporated within the modular structure (1) by adding the drug to the polymer solution prior to injection into the mold if the drug is soluble in the selected solvent. This will result in dispersion of the drug throughout the modular structure (1) and each elemental module (2).
  • an emulsion of the drug and a solvent for the drug can be added to the polymer solution prior to injection, which results in the drug being retained in the pores of the modular structure (1).

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Abstract

Dispositivo modular para regeneración nerviosa que, a partir de una estructura híbrida a base de materiales de origen natural y/o sintético y una fuente celular de soporte glial (12), formada por uno o varios módulos elementales (2) cilindricos de longitud variable, con uno o varios haces paralelos (4) planos o tubulares de microfilamentos (5) situados en un lumen interior (3) de los módulos elementales cilindricos (2), y fijados en los extremos a unas estructuras de fijación y sutura (6). En el lumen (3), además de las células gliales de soporte (12), pueden crecer axones de extremo a extremo, en grandes longitudes (decenas de centímetros). El dispositivo se puede aplicar en el restablecimiento de conexiones neuronales en el sistema nervioso central y periférico, u otras aplicaciones en donde sean necesario un elemento de comunicación neural de gran longitud.

Description

DISPOSITIVO MODULAR PARA REGENERACIÓN NERVIOSA Y PROCEDIMIENTO DE FABRICACIÓN
D E S C R I P C I Ó N
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención es un dispositivo modular para regeneración nerviosa, basado en la unión de módulos elementales formando neurocables modulares constituidos por células gliales de soporte o células gliales y neuronas en el interior de estructuras cilindricas de origen natural y sintético, para su uso en la regeneración de tractos neurales del sistema nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periférico (SNP).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La pérdida de la comunicación entre el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP) es la causa de numerosos trastornos que comprometen la calidad de vida de los afectados. Esta pérdida de comunicación puede deberse a traumatismos, accidentes, enfermedades degenerativas, u otras causas, como problemas de nacimiento. Puede afectar a estructuras cerebrales, como el tracto nigroestriatal en el caso de la Enfermedad de Parkinson, medulares, en el caso de la lesión medular, o nerviosas.
Actualmente no existe una terapia clínica eficaz en el SNP para las lesiones nerviosas que comprometen longitudes de nervio superiores a los 2 cm. En lesiones menores se emplea el injerto de nervio, normalmente del propio paciente (autoinjerto), o de tejido de un donante humano cadáver (aloinjerto). Esta alternativa presenta las desventajas de necesitar de una incisión adicional, la pérdida de la función del nervio del donante, el desajuste de tamaño entre el nervio donante y el lesionado, y la disponibilidad limitada de nervio donante.
Los aloinjertos superan varios de los inconvenientes de los autoinjertos, pero requieren de inmunosupresión o descelularización para prevenir el rechazo inmunológico, así como de una intervención quirúrgica, rehabilitación y el uso de antiinflamatorios. Además, no han tenido resultados satisfactorios cuando las lesiones son superiores a los 2 cm de longitud.
Por ello, una alternativa prometedora ha sido la fabricación de estructuras poliméricas degradadles naturales y sintéticas como un nuevo medio para la reconstrucción y regeneración guiada ante estas lesiones.
Los conductos sintéticos solo han sido usados exitosamente de manera clínica para lesiones de menos de 1 cm. Así pues, se pueden encontrar tanto estructuras cilindricas porosas de colágeno, cuyas cavidades elipsoidales tienen una dirección preferencial, como haces de microfilamentos unidos de PLGA (poli(ácido láctico-co-glicólico) y PCL (policaprolactona), simulando la estructura subfascicular del endoneuro, aunque lo más habitual es usar conductos tubulares con uno o más canales pasantes paralelos, que sirvan de camino preferencial o guía a los axones, o bien sistemas mixtos de los anteriores. No obstante, sobre todo en lo referente a las lesiones en el SNC, las soluciones propuestas hasta la fecha no han resultado lo suficientemente exitosas.
El documento WO2007090102A2 hace referencia a estructuras que incluyen, entre sus posibles configuraciones, conductos con una envoltura polimérica que contienen en su interior filamentos alineados longitudinalmente, constituidos por poliésteres alifáticos como PLA (ácido poliláctico), que actúan como andamiaje y guías para la regeneración de grandes longitudes de tejido nervioso.
Las estructuras tienen carácter biohíbrido y pueden comprender, además de los polímeros sintéticos, biomoléculas útiles para la regeneración nerviosa, células madre neurales, células de Schwann y factores de crecimiento.
El conducto puede alcanzar una longitud de hasta 50 cm y está conformado longitudinalmente como una sola pieza, que se fabrica mediante un procedimiento de electrohilatura. De acuerdo con este procedimiento, primero se forma una estructura polimérica hueca con las dimensiones requeridas, la cual es rellenada posteriormente con las fibras del segundo material polimérico que se conforman para adaptarse al tamaño del lumen del conducto preparado en el primer paso en el que se disponen alineadas longitudinalmente. El documento WO2013/154780 describe unos dispositivos en forma de conductos para la reparación de nervios periféricos que son capaces de reconectar el tejido nervioso, cubriendo longitudes mayores de 3 cm. Los conductos están constituidos por módulos o segmentos tubulares huecos poliméricos y bioabsorbibles a los que pueden añadirse neuronas, células de Schwann y factores de crecimiento.
Estos conductos carecen de fibras en su lumen que actúen como guía del crecimiento axonal, o como elemento de unión entre los segmentos. Los segmentos presentan distinta conductividad y su ensamblaje a lo largo del eje longitudinal da lugar a un conducto en el que se puede establecer un gradiente eléctrico y de factores de crecimiento adecuado para estimular la propagación axonal, y con ello, la reparación de la lesión.
La fabricación de los conductos comprende el uso de un molde cilindrico en el que se introduce un polímero de baja conductividad sobre el que se dispone otro de alta conductividad, uniéndose ambos polímeros. Este material cilindrico o tubular, y en el que puede crearse poros, se retira del molde, pudiéndose sembrar en una etapa posterior las células nerviosas.
Estos conductos tienen un diámetro interno de 1,5 mm y externo de 1,8 mm. Están limitados por una longitud máxima de regeneración en SNP de 20 mm. Además, el diámetro interno es superior al de muchos nervios, no pudiéndose modular dicho diámetro, haciéndolo no compatible con cualquier tipo de nervio.
El documento WO2018025186A1 describe una estructura tubular hueca de fibroína de seda para la regeneración de nervios periféricos. El procedimiento de síntesis llevado a cabo permite generar un incremento de la viscosidad del material sin aumentar la concentración de seda. Esto permite crear tubos de longitud variable, de hasta 10 cm, con propiedades mecánicas mejoradas para ser implantados en zonas donde quedan expuestos a fuerzas de compresión, y en los que es más fácil crear gradientes de moléculas bioactivas.
La estructura obtenida puede comprender además un agente conductor, material polimérico biodegradable, agentes terapéuticos, factores de crecimiento y células, como células madre o células de Schwann (SCs). Debido a las limitaciones actuales en la técnica para el tratamiento y la reparación de daño en los nervios periféricos y en el SNC, las nuevas terapias necesitan materiales y factores, químicos o físicos, que mantengan activo el implante durante varias semanas. Por lo tanto, se necesitan nuevos materiales y métodos para el tratamiento de pacientes con lesiones de longitud igual o superior a los 3 cm.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El dispositivo modular para regeneración nerviosa, primer objeto de la presente invención, supera los inconvenientes del estado de la técnica descritos, de modo que permite avanzar en una regeneración nerviosa en tractos neuronales largos. El dispositivo es útil para la regeneración de tractos neurales del sistema nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periférico (SNP).
Se trata de un dispositivo de carácter “biohíbrido”, pues comprende materiales de origen natural y sintético y está destinado a albergar células gliales y/o neuronas. Comprende una estructura esencialmente cilindrica, constituida por unos módulos elementales cilindricos, de un material combinado (natural y sintético) degradable y biocompatible. Los módulos elementales son huecos, comprendiendo en su interior un orificio o lumen, en cuyo interior están destinadas a alojarse células gliales de soporte (células de Schwann, oligodendrocitos) y prolongaciones axonales de neuronas. A partir de la unión de uno o más módulos elementales, la estructura cilindrica puede alcanzar una longitud variable entre 0,6 cm y 90 cm aproximadamente.
Asimismo, y para servir de soporte a las células gliales y prolongaciones axonales de las neuronas, el dispositivo comprende uno o más haces de microfilamentos, que pueden ser paralelos o ramificados, constituidos por unos microfilamentos paralelos, distribuidos por el lumen de los módulos elementales. De esta manera, son los microfilamentos los que mantienen a los distintos módulos elementales unidos. Además, tal y como se ha indicado, los microfilamentos sirven de soporte para la adhesión y guía durante la migración de las células y la extensión de los axones, que pueden crecer de extremo a extremo, en grandes longitudes (decenas de centímetros). Estos microfilamentos se mantienen paralelos al eje longitudinal de la estructura cilindrica gracias a su unión a unas estructuras de fijación y sutura, formadas por un material polimérico flexible, posicionadas en unos módulos elementales extremos, a través de las cuales se lleva a cabo tanto la sujeción de los microfilamentos como la posterior sutura del dispositivo al nervio lesionado.
Asimismo, el dispositivo puede comprender también de unas estructuras de fijación auxiliares, por ejemplo, en forma de anilla y dispuestas en serie, que se posicionan en uno o más de los lúmenes interiores de los módulos elementales. Estas estructuras de fijación auxiliares contribuyen a mantener la forma cilindrica de los haces de microfilamentos en un medio acuoso, evitando que las microfibras colapsen uniéndose unas con otras.
Cada uno de los módulos elementales está formado por un material poroso, en el que puede incorporarse un módulo de liberación de factores de crecimiento y/o fármacos para una liberación controlada y localizada de los mismos. Además, el dispositivo puede comprender adicionalmente unos medios para permitir la estimulación eléctrica y/o magnética de las estructuras biológicas.
El dispositivo puede comprender una única estructura cilindrica constituida por una serie de módulos elementales dispuestos uno a continuación del otro, en cuyo interior se disponen uno o más haces de microfilamentos. Alternativamente, puede comprender una estructura cilindrica que se bifurca a su vez en al menos dos estructuras cilindricas. En este caso, el haz también se bifurca en dos haces. Además, el dispositivo puede comprender dos o más estructuras cilindricas que discurren en paralelo y que, al alcanzar una bifurcación, parten en direcciones distintas.
Cuando el dispositivo comprende varios haces en paralelo o ramificados, puede comprender una funda cilindrica polimérica, la cual recubre a todas las estructuras cilindricas.
Asimismo, si el dispositivo comprende una porción de la estructura cilindrica extracorpórea, puede ser recubierta por una funda cilindrica de un polímero elastómero. En este caso, el dispositivo puede comprender un sistema de bombeo extracorpóreo que haga circular fluidos biológicos en el interior de la funda. El dispositivo es adaptable al grosor, longitud y número de haces. Además, está destinado a albergar células, factores de crecimiento y fármacos, entre otros.
Es asimismo objeto de invención un procedimiento para la fabricación del dispositivo modular para la regeneración nerviosa, descrito anteriormente, y que comprende las etapas de: a) preparación de micro o nanopartícuias cargadas con moléculas bioactivas, b) disposición de un molde con ranuras para la fabricación de los módulos elementales, c) introducción de un material polimérico en forma de fibra en cada una de las ranuras del molde con unas estructuras en los extremos para facilitar el centrado de la fibra en cada ranura, d) preparación de disoluciones, por ejemplo, de ácido hialurónico (HA), con las micro o nanopartícuias de la etapa a) y agitación, en presencia de un agente de entrecruzamiento, e) inyección de las disoluciones en las ranuras del molde, obteniendo un conjunto molde- soluciones que reticula in situ, f) congelación del conjunto molde-soluciones, g) liofilización del conjunto molde-soluciones obteniendo los módulos elementales de HA, h) extracción de la fibra polimérica, creando así el lumen de la estructura cilindrica en posición centrada, i) hinchado de las estructuras cilindricas en agua destilada, j) inserción en el lumen de los microfilamentos, por ejemplo, de ácido poliláctico (PLA), unidos en sus extremos a las estructuras de fijación y sutura constituidas por material polimérico flexible, uniendo varios módulos elementales hasta alcanzar un tamaño deseado (desde pocos milímetros hasta varios centímetros), y k) cuando sea necesario, obtención de una envoltura externa para proteger el dispositivo en la aplicación ex vivo.
En resumen, el dispositivo y procedimiento objetos de la presente invención permiten la fabricación de unas estructuras direccionables para la regeneración axonal de larga longitud, de más de 10 cm, aportando una alternativa terapéutica más eficaz, y con menos inconvenientes y limitaciones que el empleo de injerto de tejido autólogo o alotejido cadavérico.
Además, el diseño modular del dispositivo proporciona una serie de ventajas desde el punto de vista funcional y de su procedimiento de fabricación, a saber:
La existencia de módulos elementales proporciona a lo largo de toda la estructura cilindrica secciones mecánicamente libres que incrementan la capacidad de adaptación de la estructura a cualquier curvatura, al poder moverse y rotar una respecto de la otra en una cierta medida.
Frente a una única estructura tubular larga, que no tiene más aberturas que los dos extremos, las secciones libres proporcionadas por lo módulos elementales del dispositivo incrementan el intercambio de nutrientes y células con el entorno, posibilitando, por una parte, una mayor supervivencia de las células trasplantadas en el interior y, por otra, un incremento del metabolismo necesario en el proceso de regeneración.
Se facilita la creación de gradientes de varios tipos a lo largo del dispositivo, que favorecen la regeneración. Así, por ejemplo, se pueden incorporar módulos elementales con distinta porosidad, composición química de los materiales estructurales, cargas de moléculas funcionales o recubrimientos.
Durante el procedimiento de fabricación basado en módulos elementales cortos disminuye la posibilidad de que se introduzcan defectos, con lo que se mejora el proceso respecto a la fabricación de conductos largos conformados en un único segmento.
El dispositivo de la invención tendrá diversos impactos:
- A nivel conceptual, la implantación de neurocables que liberen factores y fármacos puede resolver el problema de la repoblación celular, facilitando la reconstrucción de vías largas y creando un nicho propicio para facilitar el crecimiento axonal, abarcando multitud de lesiones irreparables hoy día.
Tecnológico, pues el desarrollo de biomateriales asociados a las células y otros sustratos supone una puesta a punto tecnológica orientada a la práctica clínica, revolucionando la cirugía nerviosa al liberarla de su dependencia de donantes o bancos de tejido cadavérico.
Social, pues supondría un avance en las terapias celulares repercutiendo en una mejora de funcionalidad en las personas afectadas.
Económico, ya que se abriría paso a nuevos productos sanitarios (nervios artificiales), reduciéndose los costes sanitarios por hospitalización, cirugías, rehabilitación, etc.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Figura 1.- Muestra una vista general del dispositivo.
Figura 2.- Muestra una sección longitudinal parcial del dispositivo.
Figura 3.- Muestra una sección longitudinal completa del dispositivo.
Figura 4.- Muestra sección transversal del dispositivo sin estructura de fijación auxiliar (izquierda) y con estructura de fijación auxiliar (derecha).
Figura 5.- Muestra una vista en detalle de la anilla de fibras y la estructura de fijación y sutura.
Figura 6.- Muestra una vista general de una agrupación plana de microfilamentos paralelos.
Figura 7.- Muestra una vista de un dispositivo con nueve módulos en posición curvada, sin fijación en los extremos. Figura 8.- Muestra una vista generai de una realización de una asociación de dos dispositivos.
Figura 9.- Muestra una sección de tres dispositivos de diferentes diámetros, contenidos dentro de una envoltura externa protectora.
Figura 10.- Muestra una vista de una realización de la invención con una bifurcación de dos estructuras cilindricas partiendo de una única estructura cilindrica.
Figura 11.- Muestra una vista de una realización de la invención con una bifurcación de dos estructuras cilindricas partiendo de dos estructuras cilindricas.
Figura 12.- Muestra una sección longitudinal completa del dispositivo con células de soporte en su interior tras su cultivo in vitro.
Figura 13.- Muestra una sección longitudinal completa del dispositivo con células de soporte en su interior y una fuente neuronal en un extremo tras su cultivo in vitro.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Se describe a continuación, con ayuda de las figuras 1 a 13, una realización preferente del dispositivo modular para regeneración nerviosa, así como de su procedimiento de fabricación.
En la figura 1 se muestra una vista general del dispositivo, que en esta realización comprende una única estructura modular (1), de longitud variable entre 0,6 cm y 90 cm, constituida la estructura modular (1) por unos módulos elementales (2) cilindricos, de un material natural y sintético degradable y biocompatible. En el caso de la figura 1, la estructura modular (1) comprende tres módulos elementales (2).
Tal y como aparece en la figura 2, que muestra una sección parcial de la estructura modular (1), los módulos elementales (2) son huecos, comprendiendo en su interior un orificio o lumen (3), en cuyo interior están destinadas a alojarse células gliales de soporte (células de Schwann, oligodendrocitos) y prolongaciones axonales de neuronas. Cada módulo elemental (2) es un cilindro de dimensiones entre 0,5 cm y 2 cm de longitud, entre 0,01 cm y 2 cm de diámetro interno y entre 0,05 cm y 3,5 cm de diámetro externo. A partir de la unión de uno o más módulos elementales (2) posicionados en serie o paralelamente, la estructura cilindrica modular puede alcanzar una longitud variable entre 0,6 cm y 90 cm aproximadamente.
Los módulos elementales (2) pueden estar fabricados de diferentes materiales. Debe ser un material poroso biocompatible que permita el intercambio de fluidos y nutrientes entre la parte interna y externa del dispositivo. Además, es preferible que el material sea bioabsorbible o biodegradable, de esta manera no es necesario retirar el dispositivo quirúrgicamente cuando el proceso regenerativo se ha completado.
Los materiales biocompatibles adecuados para los módulos elementales (2) incluyen poliésteres sintéticos y polímeros naturales, formando una estructura porosa como, por ejemplo: ácido hialurónico (HA), HA reticulado, HA metacrilado reticulado, quitosano reticulado, alginato, colágeno, gelatina, agarosa reticulada, ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), polietilenglicol, poly(glicerol sebacato), etc.
Los módulos elementales (2) son fabricados mediante el empleo de un molde o por técnicas de electrohilatura o por cualquier otra técnica que permita esa morfología.
Como se ha indicado, cada estructura modular (1) está destinada a albergar de manera viable en el lumen (3) interior tanto células gliales de soporte (células de Schwann, oligodendrocitos) como prolongaciones axonales de neuronas situadas en sus extremos, existiendo conectividad neuronal funcional de extremo a extremo del dispositivo.
Asimismo, y para servir de soporte a las células gliales y prolongaciones axonales, el dispositivo comprende uno o más haces (4), que pueden ser paralelos, como es el caso de la figura 2, o ramificados, constituidos por unos microfilamentos (5) paralelos, distribuidos por el lumen (3) de los módulos elementales (2), de longitud entre 0,6 cm y 90 cm y diámetro de cada microfilamento entre 0,001 cm y 0,1 cm.
De esta manera, son los microfilamentos (5) los que mantienen a los distintos módulos elementales (2) unidos. Además, los microfilamentos (5) sirven de soporte para la adhesión y guía durante la migración de las células y la extensión de los axones, que pueden crecer de extremo a extremo, en grandes longitudes (decenas de centímetros). Los microfilamentos (5) conducen la extensión axonal de extremo a extremo del dispositivo, estimulada por las células de soporte asentadas sobre los microfilamentos (5).
En la figura 3 se muestra una sección de los haces (4), en la que se observa cómo los microfilamentos (5) se mantienen paralelos al eje longitudinal de la estructura modular (1) gracias a su unión a unas estructuras de fijación y sutura (6), de un material polimérico flexible, posicionadas en unos módulos elementales (2) extremos, a través de las cuales se lleva a cabo tanto la sujeción de los haces (4) como la posterior sutura del dispositivo al nervio lesionado.
Como se muestra en la figura 2, y en detalle en la figura 4, el dispositivo puede comprender también unas estructuras de fijación auxiliar (7) en forma de anillas dispuestas en serie, y que se posicionan en uno o más de los lúmenes (3) interiores de los módulos elementales (2), y que contribuyen a mantener la forma cilindrica de los haces (4) de microfilamentos (5) en un medio acuoso, evitando que colapsen uniéndose unos a otros. Concretamente, en la parte izquierda de la figura 4 se muestra una sección de un módulo elemental (2) sin estructura de fijación auxiliar (7), y en la parte derecha una sección de un módulo elemental (2) con estructura de fijación auxiliar (7).
En la figura 5 se muestra una vista más en detalle de los microfilamentos (5) unidos a las estructuras de fijación y sutura (6). Los microfilamentos (5) pueden ser de distintos materiales, preferentemente poliésteres sintéticos degradables (ácido poliláctico (PIA), ácido poliláctico-coglicólico (PLGA), poli-ε-caprolactona (PCL), polipirrol (PPy), nanotubos de carbono (CNTs), fibroína de seda, poli(3,4-etilenodioiitiofeno) (PEDOT), polianilina (PANI), etc.) o de fibras de carbono o metales conductores como oro o platino, o una combinación de los mismos.
La manera en que los microfilamentos (5) se disponen dentro lumen (3) interior o lumen de los módulos elementales (2) de la o las estructuras modulares (1) puede ser variable: en forma de agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos unidos en los extremos por un material polimérico flexible o en forma de haces cilindros de microfilamentos (5) mantenidos en cada extremo por unas anillas de material polimérico flexible. Para una mejor comprensión de la invención, se describen a continuación los procedimientos de fabricación de las microfibras (5) paralelas unidas por ambos extremos.
Para obtener las agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos, que se muestran en una vista en detalle en la figura 6, se agrupa un número determinado de los microfilamentos (5) (600 microfilamentos (5)) y se disponen de forma paralela unos al lado de los otros sobre una superficie plana, como una placa de vidrio. Con el objetivo de mantener esta disposición, se sitúan a ambos extremos un material polimérico flexible disuelto por debajo y por encima de los microfilamentos (5), el cual al solidificarse mantiene unidos los filamentos en una disposición plana y paralela.
Para obtener un haz (4) de microfilamentos (5) en modo de cilindro, como el que aparece en la figura 2, éstos se disponen en primer lugar en forma de agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos, como los de la figura 6, y posteriormente se enrollan alrededor de una varilla de diámetro adecuado con el objetivo de obtener la forma cilindrica sin que los microfilamentos (5) pierdan su disposición paralela.
A continuación, se aplica un material polimérico flexible disuelto formando una anilla con la longitud deseada y se deja secar. Una vez seco, se extrae la varilla y se obtiene el cilindro de microfilamentos (5). El número de microfilamentos (5) que conforman el cilindro puede variar en función del diámetro de los microfilamentos (5) individuales y del diámetro del haz (4) de microfilamentos (5) que se quiera generar.
En el lumen (3) del conducto se inserta el haz cilindrico de microfilamentos (5), de extremo a extremo del módulo elemental (2). Los microfilamentos (5) son el elemento común a todos los módulos elementales (2), los cuales se posicionan uno al lado del otro, con el haz de microfilamentos (5) atravesando sus lúmenes u orificios (3).
Las estructuras modulares (1) compuestas de varios módulos elementales (2) tienen en ambos extremos finales unas estructuras de fijación y sutura (6) de un material polimérico flexible que, además de mantener la disposición cilindrica del haz (4) de microfilamentos (5), impiden la separación excesiva entre módulos elementales (2) y permiten la manipulación del dispositivo modular (1) como una única entidad.
En el caso de las estructuras modulares (1) de dimensiones mayores en cuanto a su diámetro interno, se posiciona en los módulos elementales (2) extremos una estructura de fijación y sutura ligeramente cónica de un material polimérico flexible, mostrada en detalle en la figura 5, para mejorar la introducción del extremo distal y proximal del nervio lesionado y facilitar la sutura a dicha estructura.
La fabricación modular para abarcar una gran longitud, frente a la fabricación de un único conducto que cubra esa gran longitud, minimiza los fallos en el proceso de fabricación. Además, el diseño modular proporciona a lo largo de toda la longitud secciones libres, que incrementan la capacidad de adaptación de la longitud total a cualquier curvatura, al poder moverse y rotar una respecto de la otra en una cierta medida, tal y como se refleja en la figura 7. Es decir, la resistencia a la flexión de las estructuras modulares (1) es mucho menor que la de la misma longitud obtenida de una sola pieza, lo cual la hace más flexible y adaptable a curvaturas variables.
Como se muestra en la figura 8, el dispositivo de la invención puede comprender dos o más estructuras modulares (1) dispuestas en paralelo, que a su vez pueden comprender una pluralidad de haces (4) de microfilamentos (5) de diámetro variables. Cada haz (4) se extiende de forma continua por toda la longitud del dispositivo, de forma que se genera una arquitectura interna continua (a excepción de las zonas entre módulos elementales (2)), longitudinal y alineada que promueve la regeneración neural, y que a su vez pueden estar incluidos dentro de una envoltura externa protectora (9), como se muestra en la figura 9.
Cuando el dispositivo comprende varios haces (4) en paralelo o ramificados, puede comprender una funda cilindrica (9), como muestra la figura 9, que recubre a cada uno de los haces (4). La funda cilindrica (9) puede ser de los mismos materiales que los módulos elementales (2): poliésteres sintéticos y polímeros naturales, formando una estructura porosa como, por ejemplo: ácido hialurónico (HA), HA reticulado, HA metacrilado reticulado, quitosano reticulado, alginato, colágeno, gelatina, agarosa reticulada, ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), polietilenglicol, poly(glicerol sebacato), etc., o puede ser de polímeros inertes como la silicona, politetrafluoroetileno (PTFE, teflón) o los poliacrilatos.
Asimismo, el dispositivo puede comprender una porción de estructura modular (1) extracorpórea, recubierta por una funda cilindrica de un polímero elastómero, como por ejemplo silicona o poliacrilatos. En este caso, el dispositivo comprende una conexión a un sistema de bombeo extracorpóreo que haga circular fluidos biológicos en el interior de la funda.
La arquitectura interna cuando hay varias estructuras modulares (1) aumenta la superficie para la adhesión de las SCs que forman parte del dispositivo. Esta arquitectura permite contener muchas más SCs que el dispositivo con una única estructura modular (1) (con un único haz (4) de microfilamentos (5) en su lumen (3)). El mayor número de SCs supone una mejora del proceso regenerativo.
La arquitectura interna de varias estructuras modulares (1) puede proporcionar un mayor control sobre la dirección del crecimiento de diferentes grupos de fibras nerviosas en regeneración. Un solo nervio puede contener miles de fibras nerviosas o axones. Mediante el uso de múltiples estructuras fibrilares internas, cada axón o un grupo de axones pueden ser guiados durante el proceso regenerativo a través de una estructura modular (1) individual o un grupo de estructuras modulares (1).
Además, como se detalla en la figura 10, se puede crear una arquitectura de ramificación si se desea. Por ejemplo, en el modelo simple de un nervio bifurcado, se pueden proporcionar dos grupos distintos de haces (4) de microfilamentos (5) internos dentro del lumen (3) interno del dispositivo.
Como se muestra en la figura 10, en un primer extremo del dispositivo (proximal), el haz (4) de microfilamentos (5) presenta un único extremo proximal para la conexión con el muñón del nervio proximal. En un segundo extremo (distal), concretamente en un módulo elemental de bifurcación (10), se separan en dos grupos distintos de haces (4), de modo que se proporcionan dos extremos distales distintos del dispositivo. Cada uno de estos extremos se conecta a una rama separada del muñón del nervio distal.
Alternativamente, como se refleja en la figura 11, el dispositivo puede comprender dos estructuras modulares (1) que discurren en paralelo, y que al llegar a unos módulos elementales de separación (11), se dividen hacia direcciones diferentes.
Por su parte, es un segundo objeto de invención el procedimiento de fabricación del dispositivo, que es un procedimiento modular y secuencial. Para conseguir la longitud deseada se ensambla el número correspondiente de módulos elementales (2) pasando por su interior el haz (4) de microfilamentos (5) continuos unidos en los extremos por estructuras de sujeción y sutura (6).
A continuación, se siembran en diferentes puntos del interior de cada módulo elemental (2) las células gliales de soporte (12), que son cultivadas in vitro hasta que forman un tapizado continuo de la cara interna de los módulos elementales (2), alcanzando continuidad, como muestra la figura 12.
Tal y como refleja la figura 13, tras el cultivo de las células gliales de soporte (12), se puede sembrar en un extremo del dispositivo y, en su caso, en diferentes puntos a lo largo de su longitud, fuentes neuronales (13) como precursores neuronales, explantes de ganglios de raíz dorsal, etc. A continuación, el conjunto puede ser cultivado in vitro hasta que se obtenga la prolongación axonal deseada.
Cada uno de los módulos elementales (2) está formado por un material poroso que permite la incorporación de sustancias bioactivas a partir de uno o más módulos de liberación de factores de crecimiento y/o fármacos (8) para una liberación controlada y localizada de los mismos, como se muestra en la figura 1, bien en la propia matriz del módulo elemental (2), o bien encapsuladas en el interior de micro o nanofibrillas, micro o nanopartículas, liposomas, u otros métodos de encapsulación de esas sustancias. Dichas partículas o fibrillas pueden tener carácter hidrófilo como la gelatina o hidrófobo como el PLA, o gelatina entrecruzada, en función del carácter de la molécula a cargar en ellas, y tamaños variables hasta el orden de decenas de mieras.
Además, el dispositivo puede comprender adicionalmente unos medios para la estimulación eléctrica, como uno o varios electrodos en contacto o no con microfilamentos electroconductores para la estimulación eléctrica del dispositivo, pudiendo ir alojados tanto en el lumen (3) del módulo elemental (2) como en su exterior. A su vez, el dispositivo puede comprender unas bobinas a su alrededor que permitan la estimulación magnética del mismo. Asimismo, el uso de microfilamentos electroconductores que forman circuitos cerrados también permite la estimulación eléctrica del dispositivo sin necesidad de utilizar electrodos.
Por lo tanto, es también objeto de invención un procedimiento para la fabricación del dispositivo modular para la regeneración nerviosa, descrito anteriormente, y que comprende las etapas de: a) preparación de micro o nanopartículas cargadas con moléculas bioactivas, que puede comprender diferentes polímeros, tal como gelatina, ácido hialuróinico, ácido poliláctico, ácido poliglicolico, b) disposición de un molde con ranuras para contener los módulos elementales (2) cilindricos, o) introducción de un material polimérico en forma de fibra en cada una de las ranuras del molde, con unas estructuras en los extremos para facilitar el centrado de la fibra en cada ranura d) preparación de disoluciones, por ejemplo, de ácido hialurónico (HA), con las micro o nanopartículas de la etapa a) y agitación, en presencia de un agente de entrecruzamiento del HA, que puede seleccionarse preferentemente del grupo que consiste en divinilsulfona, éteres tal como 1,6-hexanediol diglicidil éter o polipropilen glicol diglicidil éter, diepoxidos tal como 1,2,7,8-diepoxioctano o 1,3-butadieno diepoxido, y carbodiimidas solubles en agua. Preferiblemente, el agente de entrecruzamiento es la divinilsulfona. e) inyección de las disoluciones en las ranuras del molde, obteniendo un conjunto molde- soluciones que reticula in situ, f) congelación del conjunto molde-soluciones, g) liofilización del conjunto molde-soluciones obteniendo unas matrices tubulares microporosas de HA, h) extracción de la fibra o fibras poliméricas, creando así el lumen (3) de la estructura modular (1) en posición centrada. i) hinchado de las estructuras modulares (1) en agua destilada, j) inserción en el lumen (3) de unos microfilamentos (5), por ejemplo, de ácido poliláctico (PLA), unidos en sus extremos a unas estructuras de fijación y sutura (6) constituidas por material polimérico flexible, uniendo varios módulos elementales (2) hasta alcanzar un tamaño deseado (desde pocos milímetros hasta varios centímetros), y k) cuando sea necesario, obtención de una envoltura externa para proteger el dispositivo en la aplicación ex vivo.
EJEMPLOS
Se detalla a continuación el procedimiento de fabricación de un módulo elemental (2). Se utiliza un molde de politetrafluoroetileno (PTFE) con unos canales de 1,5 mm de ancho. En cada canal se introduce una fibra de 0,4 mm de diámetro de un material hidrófobo, PCL, usando arandelas de PTFE con un diámetro que se ajuste al canal del molde para mantenerla centrada, para que sirva de negativo del diámetro interno del módulo elemental (2).
Se prepara una solución de ácido hialurónico (HA) al 5% en presencia de hidróxido sódico (NaOH) al 0,2M y divinilsulfona (DVS) en exceso (en una relación molar DVS:HA de unidades de monómero de 9:10) como agente de entrecruzamiento. Dicha solución se inyecta en los canales del molde de PTFE. Una vez gelificada la solución, el molde se coloca en una placa Petri para evitar la evaporación y se enfría hasta -20°C.
Después, el conjunto de molde-disolución se liofiliza durante 24 h a 20 Pa y -80 °C para generar matrices microporosas de HA debido a la sublimación de agua. Se obtiene el producto seco, del que se extrae la fibra de policaprolactona (PCL), creando así el lumen (3) interno hueco. Finalmente, se hidratan y cortan a una longitud de 6 mm para conseguir los distintos módulos elementales (2) que conformarán las estructuras modulares (1).
A modo de ejemplo, para el ensamblaje en serie de 3 módulos elementales (2) de 6 mm de longitud, como en el dispositivo mostrado en las figuras 1-3, o de 9 módulos elementales (2) como es el caso de la figura 7, se insertan en el interior del lumen (3) 120 microfilamentos (5) de ácido poliláctico (PLA) de 10 pm de diámetro cada uno. Para ello, se alinean cada uno de los microfilamentos (5) para generar un haz (4) que pasa entre los módulos elementales (2). De esta manera se puede lograr el ensamblaje de “n” número de módulos elementales (2).
Un dispositivo con 3 módulos elementales (2) podría cubrir una lesión corta. Un dispositivo de 9 módulos elementales (2) podría cubrir una lesión larga sin necesidad de grandes aportes de nervio, como por ejemplo la cirugía del plexo braquial o la cirugía oncológica, incluso plantear la reconstrucción de conexiones medulares sorteando las zonas cicatriciales o establecer nuevas conexiones entre el sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periférico (SNP).
Para la fijación de los extremos del dispositivo se proponen disposiciones de microfilamentos (5) alternativos como las agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos de la figura 6, unidas en los extremos con un material polimérico flexible, o cilindros de microfilamentos (5) mantenidos en cada extremo por una anilla de material polimérico flexible.
El dispositivo de la presente invención no se limita sólo a la reparación de nervios del SNP sino también a estructuras basadas en tractos axonales del SNC como la médula espinal, el nervio óptico y otros tractos.
En el diseño modular del dispositivo, las secciones libres a lo largo de la longitud facilitan enormemente el intercambio de nutrientes y células con el entorno, posibilitando de esta manera, por una parte, la mayor supervivencia de las células trasplantadas en el interior, y, por otra parte, la mayor velocidad del metabolismo con el entorno necesario en el proceso de regeneración (ambas muy dificultadas en un concepto de estructura tubular larga única, que no tiene más aberturas que los dos extremos).
Por ejemplo, para el cultivo de células de Schwann (SCs) como fuente de células gliales de soporte (12) en el interior de la estructura modular (1) formada por 3 módulos elementales (2) de HA entrecruzado con DVS de 6 mm de longitud cada uno, con un diámetro interno de 400 μm de diámetro interno cada uno. Los módulos elementales (2) alojan en su interior un haz (4) de 120 microfilamentos de PLA de 10 μm de diámetro cada uno.
Se sanitiza y pre-acondiciona la estructura modular (1) formada por los módulos elementales (2) de HA, con su lumen (3) ocupado por 120 microfilamentos (5) de PLA de 10 μm cada uno en una cabina de flujo laminar, mediante dos lavados sucesivos con una disolución de etanol al 70%. Se lavan las muestras con disoluciones de etanol al 50% y al 30%. A continuación, se lavan con agua desionizada y se acondicionan con medio de cultivo antes de la siembra en los dispositivos modulares (1).
Por otro lado, se cultivan las SCs en flascones hasta confluencia, a 37°C, 5% CO2, en un medio de cultivo para SCs. Todos los experimentos se realizan con células en pase 4 a 6.
Estas células gliales de soporte (12) se siembran en diferentes puntos del interior de la estructura modular (1) a una densidad de 27.000 células/mm2 con la ayuda de una pipeta. Se espera 30 min antes de añadir medio de cultivo para SCs. Tras 5 días de cultivo in vitro de las SCs forman una estructura tipo capa a lo largo del lumen interno (3) de cada módulo elemental (2) de forma continua, y también crecen sobre el haz (4) de microfilamentos (5) de PLA en la dirección marcada por los mismos, incluso en las zonas intermodulares donde los microfilamentos dejan de estar cubiertos por los módulos elementales (2) de HA,
Además, es posible el uso de fuentes neuronales para estudiar el crecimiento axonal en las estructuras modulares (1) en co-cultivo con fuentes de células gliales de soporte (12). Por ejemplo, tras el cultivo de 5 días de las SCs en la estructura modular (1), se puede sembrar en un extremo de cada estructura modular (1) un explante de ganglio de raíz dorsal de ratas neonatales a modo de fuente neuronas proyectantes (13).
A continuación, el conjunto se cultiva in vitro durante 21 días adicionales, obteniéndose una extensión axonal que llega a cubrir toda la longitud de la estructura modular (1), incluso atravesando estos axones las zonas intermodulares entre distintos módulos elementales (2). La extensión axonal fue mayor que en los dispositivos en los cuales no había SCs pre-sembradas, viéndose como este elemento es fundamental para un crecimiento axonal más eficiente.
En las lesiones de gran longitud, la regeneración se ve dificultada por el gran lapso de tiempo que es necesario para la regeneración, la rápida aparición de una cicatriz glial y la falta de estímulos químicos y/o eléctricos. La estimulación eléctrica estimula la extensión axonal después de una lesión nerviosa.
Por ejemplo, las agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos o cilindros formados por microfilamentos (5) de PLA pueden recubrirse con un polímero electroconductor como es el polipirrol (PPy). Para ello, una de las diferentes técnicas que pueden emplearse es la polimerización in situ.
Como paso previo, las agrupaciones de microfilamentos (5) se sumergen en agua desionizada bajo compresión y aplicando un vacío fijo hasta que dejan de flotar con el objetivo de lograr la introducción de agua dentro de los espacios entre microfilamentos (5) con el fin de obtener un recubrimiento homogéneo de todos los microfilamentos (5), no solo de los más superficiales. A continuación, cada agrupación de microfilamentos (5) se coloca dentro de un tubo de polipropileno con una solución acuosa de monómero de pirrol (Py) y para-toluenosulfonato de sodio (pTS) que actúa de dopante, seguido de la aplicación de ultrasonidos para permitir que la agrupación de microfilamentos (5) se sature con ia solución de Py/pTS.
Las agrupaciones de microfilamentos (5) se incuban con agitación a 4 °C. Luego, se añade una solución acuosa de cloruro férrico (FeCl3) y se incuba con agitación a 4 °C para lograr una polimerización oxidativa y la deposición de PPy sobre ios sustratos de PLA. Los sustratos recubiertos con PPy se lavan con agua desionizada en agitación y, a continuación, con ultrasonidos en agua desionizada para eliminar todos los residuos de PPy no adheridos a los microfilamentos (5). Finalmente, las agrupaciones de microfilamentos (5) se secan en un desecador con vacío fijo a 40 °C.
Adicionalmente, se puede funcionalizar la estructura modular (1) cargando una o varias sustancias bioactivas en cada módulo elemental (2) con igual o diferente concentración. De esta forma, cabe la posibilidad de crear gradientes de varios tipos que favorezcan la regeneración. La creación de gradientes en una estructura no modular no se podría realizar al tener que funcionalizar con una o varias sustancias, pero con una misma concentración.
Por ejemplo, se podrían crear dispositivos funcionalizados con moléculas bioactivas en cada módulo elemental (2) con igual o diferente concentración incorporándolos en su interior mediante micropartículas de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) cargadas de un factor de crecimiento que favorezca la extensión axonal, como por ejemplo el factor de crecimiento nervioso (NGF) a una concentración de 10 ng/mL.
Se preparan las micropartículas de PLGA por el método water-in-oil-in-watert (W/O/W). Se prepara una solución acuosa con el NFG y se añade a una disolución de PLGA en diclorometano obteniendo la primera emulsión (W/O). Esta emulsión se añade por goteo en una disolución de polivinil alcohol en una solución acuosa de cloruro de sodio, obteniendo la segunda emulsión (W/O/W). La emulsión W/O/W se agita a temperatura ambiente para permitir la evaporación del solvente y finalmente las micropartículas se recolectan por centrifugación.
Se pueden diseñar módulos elementales (2) con más o menos porosidad, con diferente composición química de los materiales estructurales, con más o menos cargas de moléculas bioactivas o de recubrimiento de su superficie, con distintos tipos celulares sembrados, etc. de manera que exista un gradiente entre unos móduios elementales (2) y otros al formar parte de un dispositivo con una estructura modular (1) única, dando esta funcionalidad añadida al conjunto del dispositivo. Se pueden incorporar sustancias bioactivas dentro de la estructura modular (1) añadiendo el fármaco a la solución de polímero antes de la inyección en el molde si el fármaco es soluble en el disolvente seleccionado. Esto dará como resultado la dispersión del fármaco por toda la estructura modular (1) y cada módulo elemental (2). Como alternativa, se puede agregar una emulsión del fármaco y un disolvente del fármaco a la solución de polímero antes de la inyección, lo que da como resultado que el fármaco se retenga en los poros de la estructura modular (1).

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Dispositivo modular para regeneración nerviosa, que comprende: uno o más módulos elementales (2) esencialmente cilindricos, huecos y porosos, dispuestos unos a continuación de otros según una estructura modular (1) con un lumen (3) interior, uno o más haces (4) de microfilamentos (5) paralelos, dispuestos en el lumen
(3) de la estructura modular (1), destinados a servir de soporte a una componente celular de soporte axonal, y unas estructuras de fijación y sutura (6) posicionadas en unos módulos elementales extremos (2) y conectadas a los microfilamentos (5), destinadas a fijar los microfilamentos (5) en una posición deseada y a servir de plataformas donde proceder a suturar un nervio que se va a regenerar.
2.- El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente unas estructuras de fijación auxiliar (7) en forma de anillas dispuestas en el lumen (3) de la estructura modular (1) y a las que se fijan los microfilamentos (5), manteniéndolos paralelos.
3.- El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente uno o más módulos de liberación de factores de crecimiento y/o fármacos (8) embebidos o encapsulados para una liberación controlada y localizada en el interior de los módulos elementales (2).
4." El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente unos medios de estimulación eléctrica y/o magnética conectados a la estructura modular (1).
5.- El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende una primera estructura modular (1), al menos un módulo elemental de bifurcación (10) posicionado en un extremo de la primera estructura modular (1) y una segunda y una tercera estructuras modulares (1) conectadas al módulo elemental de bifurcación (10).
6.- El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende dos o más primeras estructuras modulares (1) paralelas, dos o más módulos elementales de separación (11) posicionados en un extremo de las primeras estructuras modulares (1) paralelas, y dos o más segundas estructuras modulares (1) paralelas conectadas a los módulos elementales de separación (11) dispuestas de forma no paralela.
7.- El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la estructura modular (1) comprende un haz (4) de microfilamentos (5) en el lumen (3), estando la estructura modular (1) cubierta por una funda cilindrica (9).
8.- El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende una porción de la estructura modular (1) extracorpóreo, recubierto por una funda cilindrica extracorpórea.
9." El dispositivo de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente una conexión a un sistema de bombeo de líquidos fisiológicos externo.
10.- El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los módulos elementales (2) son de un material natural y/o sintético, degradable y biocompatible.
11.- El dispositivo de la reivindicación 10, en el que los módulos elementales (2) son de un material biocompatible seleccionado entre poliésteres sintéticos y polímeros naturales.
12.- El dispositivo de la reivindicación 11, en el que los módulos elementales (2) son de un material seleccionado entre ácido hialurónico (HA), HA reticulado, HA metacrilado reticulado, quitosano reticulado, alginato, colágeno, gelatina, agarosa reticulada, ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), polietilenglicol y poly(glicerol sebacato).
13.- El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los microfilamentos (5) son de un material seleccionado entre poliéster sintético degradable, fibras de carbono, metales conductores y una combinación de los mismos.
14.- El dispositivo de la reivindicación 13, en el que los microfilamentos (5) son de un material seleccionado entre ácido poliláctico (PLA), ácido poliláctico-coglicólico (PLGA), poli-ε-caprolactona (PCL), polipirrol (PPy), nanotubos de carbono (CNTs), fibroína de seda, poli(3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT) y polianilina (PAÑI).
15.- Procedimiento de fabricación del dispositivo modular para la regeneración nerviosa de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de: preparación de micro o nanopartículas cargadas con moléculas bioactivas, disposición de un moide con ranuras para contener los módulos elementales (2), introducción de un material polimérico en forma de fibra en cada una de las ranuras del molde, con unas estructuras en los extremos para facilitar el centrado de la fibra en cada ranura, preparación de disoluciones, con las micro o nanoparticulas y agitación, en presencia de un agente de entrecruzamiento, inyección de las disoluciones en las ranuras del molde, obteniendo un conjunto molde-soluciones que reticula in situ, congelación del conjunto molde-soluciones, liofilización del conjunto molde-soluciones obteniendo los módulos elementales (2) que conforman la estructura modular (1), extracción de las fibras, creando así el lumen (3) de la estructura modular (1) en posición centrada, hinchado de las estructuras cilindricas en agua destilada, inserción en el lumen (3) de los microfilamentos (5), y opcionalmente, obtención de una envoltura externa (9) para proteger el dispositivo en la aplicación ex vivo.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007090102A2 (en) * 2006-01-27 2007-08-09 The Regents Of The University Of California Biomimetic scaffolds
WO2013154780A1 (en) * 2012-04-12 2013-10-17 Wake Forest University Health Sciences Design of a conduit for peripheral nerve replacement
ES2528192T3 (es) * 2001-08-02 2015-02-05 Collagen Matrix, Inc. Dispositivo de implante para reparación de nervios
WO2016097448A1 (es) * 2014-12-16 2016-06-23 Universitat Politècnica De València Biohíbrido para su uso en la regeneración de tractos neurales
WO2018025186A1 (en) * 2016-08-01 2018-02-08 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies A4Tec - Associação Nerve guidance conduits, methods of production and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2528192T3 (es) * 2001-08-02 2015-02-05 Collagen Matrix, Inc. Dispositivo de implante para reparación de nervios
WO2007090102A2 (en) * 2006-01-27 2007-08-09 The Regents Of The University Of California Biomimetic scaffolds
WO2013154780A1 (en) * 2012-04-12 2013-10-17 Wake Forest University Health Sciences Design of a conduit for peripheral nerve replacement
WO2016097448A1 (es) * 2014-12-16 2016-06-23 Universitat Politècnica De València Biohíbrido para su uso en la regeneración de tractos neurales
WO2018025186A1 (en) * 2016-08-01 2018-02-08 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies A4Tec - Associação Nerve guidance conduits, methods of production and uses thereof

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