ES2818424A1

ES2818424A1 - Dispositivo modular para regeneracion nerviosa y procedimiento de fabricacion

Info

Publication number: ES2818424A1
Application number: ES202130065A
Authority: ES
Inventors: Pradas Manuel Monleon; Ramos Cristina Martinez; Doblado Laura Rodriguez; Roca Fernando Gisbert
Original assignee: Universidad Politecnica de Valencia
Current assignee: Universidad Politecnica de Valencia
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2021-04-12
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: ES2818424B2; WO2022162256A1

Abstract

Dispositivo modular para regeneración nerviosa y procedimiento de fabricación. Dispositivo modular para regeneración nerviosa que, a partir de una estructura híbrida a base de materiales de origen natural y/o sintético y una fuente celular de soporte glial (12), formada por uno o varios módulos elementales (2) cilíndricos de longitud variable, con uno o varios haces paralelos (4) planos o tubulares de microfilamentos (5) situados en un lumen interior (3) de los módulos elementales cilíndricos (2), y fijados en los extremos a unas estructuras de fijación y sutura (6). En el lumen (3), además de las células gliales de soporte (12), pueden crecer axones de extremo a extremo, en grandes longitudes (decenas de centímetros). El dispositivo se puede aplicar en el restablecimiento de conexiones neuronales en el sistema nervioso central y periférico, u otras aplicaciones en donde sean necesario un elemento de comunicación neural de gran longitud.

Description

DESCRIPCIÓN

DISPOSITIVO MODULAR PARA REGENERACIÓN NERVIOSA Y PROCEDIMIENTO

DE FABRICACIÓN

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención es un dispositivo modular para regeneración nerviosa, basado en la unión de módulos elementales formando neurocables modulares constituidos por células gliales de soporte o células gliales y neuronas en el interior de estructuras cilíndricas de origen natural y sintético, para su uso en la regeneración de tractos neurales del sistema nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periférico (SNP).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La pérdida de la comunicación entre el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP) es la causa de numerosos trastornos que comprometen la calidad de vida de los afectados. Esta pérdida de comunicación puede deberse a traumatismos, accidentes, enfermedades degenerativas, u otras causas, como problemas de nacimiento. Puede afectar a estructuras cerebrales, como el tracto nigroestriatal en el caso de la Enfermedad de Parkinson, medulares, en el caso de la lesión medular, o nerviosas.

Actualmente no existe una terapia clínica eficaz en el SNP para las lesiones nerviosas que comprometen longitudes de nervio superiores a los 2 cm. En lesiones menores se emplea el injerto de nervio, normalmente del propio paciente (autoinjerto), o de tejido de un donante humano cadáver (aloinjerto). Esta alternativa presenta las desventajas de necesitar de una incisión adicional, la pérdida de la función del nervio del donante, el desajuste de tamaño entre el nervio donante y el lesionado, y la disponibilidad limitada de nervio donante.

Los aloinjertos superan varios de los inconvenientes de los autoinjertos, pero requieren de inmunosupresión o descelularización para prevenir el rechazo inmunológico, así como de una intervención quirúrgica, rehabilitación y el uso de antiinflamatorios. Además, no han tenido resultados satisfactorios cuando las lesiones son superiores a los 2 cm de longitud.

Por ello, una alternativa prometedora ha sido la fabricación de estructuras poliméricas degradables naturales y sintéticas como un nuevo medio para la reconstrucción y regeneración guiada ante estas lesiones.

Los conductos sintéticos solo han sido usados exitosamente de manera clínica para lesiones de menos de 1 cm. Así pues, se pueden encontrar tanto estructuras cilíndricas porosas de colágeno, cuyas cavidades elipsoidales tienen una dirección preferencial, como haces de microfilamentos unidos de PLGA (poli(ácido láctico-co-glicólico) y PCL (policaprolactona), simulando la estructura subfascicular del endoneuro, aunque lo más habitual es usar conductos tubulares con uno o más canales pasantes paralelos, que sirvan de camino preferencial o guía a los axones, o bien sistemas mixtos de los anteriores. No obstante, sobre todo en lo referente a las lesiones en el SNC, las soluciones propuestas hasta la fecha no han resultado lo suficientemente exitosas.

El documento WO2007090102A2 hace referencia a estructuras que incluyen, entre sus posibles configuraciones, conductos con una envoltura polimérica que contienen en su interior filamentos alineados longitudinalmente, constituidos por poliésteres alifáticos como PLA (ácido poliláctico), que actúan como andamiaje y guías para la regeneración de grandes longitudes de tejido nervioso.

Las estructuras tienen carácter biohíbrido y pueden comprender, además de los polímeros sintéticos, biomoléculas útiles para la regeneración nerviosa, células madre neurales, células de Schwann y factores de crecimiento.

El conducto puede alcanzar una longitud de hasta 50 cm y está conformado longitudinalmente como una sola pieza, que se fabrica mediante un procedimiento de electrohilatura. De acuerdo con este procedimiento, primero se forma una estructura polimérica hueca con las dimensiones requeridas, la cual es rellenada posteriormente con las fibras del segundo material polimérico que se conforman para adaptarse al tamaño del lumen del conducto preparado en el primer paso en el que se disponen alineadas longitudinalmente.

El documento WO2013/154780 describe unos dispositivos en forma de conductos para la reparación de nervios periféricos que son capaces de reconectar el tejido nervioso, cubriendo longitudes mayores de 3 cm. Los conductos están constituidos por módulos o segmentos tubulares huecos poliméricos y bioabsorbibles a los que pueden añadirse neuronas, células de Schwann y factores de crecimiento.

Estos conductos carecen de fibras en su lumen que actúen como guía del crecimiento axonal, o como elemento de unión entre los segmentos. Los segmentos presentan distinta conductividad y su ensamblaje a lo largo del eje longitudinal da lugar a un conducto en el que se puede establecer un gradiente eléctrico y de factores de crecimiento adecuado para estimular la propagación axonal, y con ello, la reparación de la lesión.

La fabricación de los conductos comprende el uso de un molde cilíndrico en el que se introduce un polímero de baja conductividad sobre el que se dispone otro de alta conductividad, uniéndose ambos polímeros. Este material cilíndrico o tubular, y en el que puede crearse poros, se retira del molde, pudiéndose sembrar en una etapa posterior las células nerviosas.

Estos conductos tienen un diámetro interno de 1,5 mm y externo de 1,8 mm. Están limitados por una longitud máxima de regeneración en SNP de 20 mm. Además, el diámetro interno es superior al de muchos nervios, no pudiéndose modular dicho diámetro, haciéndolo no compatible con cualquier tipo de nervio.

El documento WO2018025186A1 describe una estructura tubular hueca de fibroína de seda para la regeneración de nervios periféricos. El procedimiento de síntesis llevado a cabo permite generar un incremento de la viscosidad del material sin aumentar la concentración de seda. Esto permite crear tubos de longitud variable, de hasta 10 cm, con propiedades mecánicas mejoradas para ser implantados en zonas donde quedan expuestos a fuerzas de compresión, y en los que es más fácil crear gradientes de moléculas bioactivas.

La estructura obtenida puede comprender además un agente conductor, material polimérico biodegradable, agentes terapéuticos, factores de crecimiento y células, como células madre o células de Schwann (SCs).

Debido a las limitaciones actuales en la técnica para el tratamiento y la reparación de daño en los nervios periféricos y en el SNC, las nuevas terapias necesitan materiales y factores, químicos o físicos, que mantengan activo el implante durante varias semanas. Por lo tanto, se necesitan nuevos materiales y métodos para el tratamiento de pacientes con lesiones de longitud igual o superior a los 3 cm.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El dispositivo modular para regeneración nerviosa, primer objeto de la presente invención, supera los inconvenientes del estado de la técnica descritos, de modo que permite avanzar en una regeneración nerviosa en tractos neuronales largos. El dispositivo es útil para la regeneración de tractos neurales del sistema nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periférico (SNP).

Se trata de un dispositivo de carácter “biohíbrido”, pues comprende materiales de origen natural y sintético y está destinado a albergar células gliales y/o neuronas. Comprende una estructura esencialmente cilíndrica, constituida por unos módulos elementales cilíndricos, de un material combinado (natural y sintético) degradable y biocompatible. Los módulos elementales son huecos, comprendiendo en su interior un orificio o lumen, en cuyo interior están destinadas a alojarse células gliales de soporte (células de Schwann, oligodendrocitos) y prolongaciones axonales de neuronas. A partir de la unión de uno o más módulos elementales, la estructura cilíndrica puede alcanzar una longitud variable entre 0,6 cm y 90 cm aproximadamente.

Asimismo, y para servir de soporte a las células gliales y prolongaciones axonales de las neuronas, el dispositivo comprende uno o más haces de microfilamentos, que pueden ser paralelos o ramificados, constituidos por unos microfilamentos paralelos, distribuidos por el lumen de los módulos elementales. De esta manera, son los microfilamentos los que mantienen a los distintos módulos elementales unidos. Además, tal y como se ha indicado, los microfilamentos sirven de soporte para la adhesión y guía durante la migración de las células y la extensión de los axones, que pueden crecer de extremo a extremo, en grandes longitudes (decenas de centímetros).

Estos microfilamentos se mantienen paralelos al eje longitudinal de la estructura cilíndrica gracias a su unión a unas estructuras de fijación y sutura, formadas por un material polimérico flexible, posicionadas en unos módulos elementales extremos, a través de las cuales se lleva a cabo tanto la sujeción de los microfilamentos como la posterior sutura del dispositivo al nervio lesionado.

Asimismo, el dispositivo puede comprender también de unas estructuras de fijación auxiliares, por ejemplo, en forma de anilla y dispuestas en serie, que se posicionan en uno o más de los lúmenes interiores de los módulos elementales. Estas estructuras de fijación auxiliares contribuyen a mantener la forma cilíndrica de los haces de microfilamentos en un medio acuoso, evitando que las microfibras colapsen uniéndose unas con otras.

Cada uno de los módulos elementales está formado por un material poroso, en el que puede incorporarse un módulo de liberación de factores de crecimiento y/o fármacos para una liberación controlada y localizada de los mismos. Además, el dispositivo puede comprender adicionalmente unos medios para permitir la estimulación eléctrica y/o magnética de las estructuras biológicas.

El dispositivo puede comprender una única estructura cilíndrica constituida por una serie de módulos elementales dispuestos uno a continuación del otro, en cuyo interior se disponen uno o más haces de microfilamentos. Alternativamente, puede comprender una estructura cilíndrica que se bifurca a su vez en al menos dos estructuras cilíndricas. En este caso, el haz también se bifurca en dos haces. Además, el dispositivo puede comprender dos o más estructuras cilíndricas que discurren en paralelo y que, al alcanzar una bifurcación, parten en direcciones distintas.

Cuando el dispositivo comprende varios haces en paralelo o ramificados, puede comprender una funda cilíndrica polimérica, la cual recubre a todas las estructuras cilíndricas.

Asimismo, si el dispositivo comprende una porción de la estructura cilíndrica extracorpórea, puede ser recubierta por una funda cilíndrica de un polímero elastómero. En este caso, el dispositivo puede comprender un sistema de bombeo extracorpóreo que haga circular fluidos biológicos en el interior de la funda.

El dispositivo es adaptable al grosor, longitud y número de haces. Además, está destinado a albergar células, factores de crecimiento y fármacos, entre otros.

Es asimismo objeto de invención un procedimiento para la fabricación del dispositivo modular para la regeneración nerviosa, descrito anteriormente, y que comprende las etapas de:

a) preparación de micro o nanopartículas cargadas con moléculas bioactivas,

b) disposición de un molde con ranuras para la fabricación de los módulos elementales, c) introducción de un material polimérico en forma de fibra en cada una de las ranuras del molde con unas estructuras en los extremos para facilitar el centrado de la fibra en cada ranura,

d) preparación de disoluciones, por ejemplo, de ácido hialurónico (HA), con las micro o nanopartículas de la etapa a) y agitación, en presencia de un agente de entrecruzamiento,

e) inyección de las disoluciones en las ranuras del molde, obteniendo un conjunto moldesoluciones que reticula in situ,

f) congelación del conjunto molde-soluciones,

g) liofilización del conjunto molde-soluciones obteniendo los módulos elementales de HA, h) extracción de la fibra polimérica, creando así el lumen de la estructura cilíndrica en posición centrada,

i) hinchado de las estructuras cilíndricas en agua destilada,

j) inserción en el lumen de los microfilamentos, por ejemplo, de ácido poliláctico (PLA), unidos en sus extremos a las estructuras de fijación y sutura constituidas por material polimérico flexible, uniendo varios módulos elementales hasta alcanzar un tamaño deseado (desde pocos milímetros hasta varios centímetros), y

k) cuando sea necesario, obtención de una envoltura externa para proteger el dispositivo en la aplicación ex vivo.

En resumen, el dispositivo y procedimiento objetos de la presente invención permiten la fabricación de unas estructuras direccionables para la regeneración axonal de larga longitud, de más de 10 cm, aportando una alternativa terapéutica más eficaz, y con menos inconvenientes y limitaciones que el empleo de injerto de tejido autólogo o alotejido cadavérico.

Además, el diseño modular del dispositivo proporciona una serie de ventajas desde el punto de vista funcional y de su procedimiento de fabricación, a saber:

- La existencia de módulos elementales proporciona a lo largo de toda la estructura cilíndrica secciones mecánicamente libres que incrementan la capacidad de adaptación de la estructura a cualquier curvatura, al poder moverse y rotar una respecto de la otra en una cierta medida.

- Frente a una única estructura tubular larga, que no tiene más aberturas que los dos extremos, las secciones libres proporcionadas por lo módulos elementales del dispositivo incrementan el intercambio de nutrientes y células con el entorno, posibilitando, por una parte, una mayor supervivencia de las células trasplantadas en el interior y, por otra, un incremento del metabolismo necesario en el proceso de regeneración.

- Se facilita la creación de gradientes de varios tipos a lo largo del dispositivo, que favorecen la regeneración. Así, por ejemplo, se pueden incorporar módulos elementales con distinta porosidad, composición química de los materiales estructurales, cargas de moléculas funcionales o recubrimientos.

- Durante el procedimiento de fabricación basado en módulos elementales cortos disminuye la posibilidad de que se introduzcan defectos, con lo que se mejora el proceso respecto a la fabricación de conductos largos conformados en un único segmento.

El dispositivo de la invención tendrá diversos impactos:

- A nivel conceptual, la implantación de neurocables que liberen factores y fármacos puede resolver el problema de la repoblación celular, facilitando la reconstrucción de vías largas y creando un nicho propicio para facilitar el crecimiento axonal, abarcando multitud de lesiones irreparables hoy día.

- Tecnológico, pues el desarrollo de biomateriales asociados a las células y otros sustratos supone una puesta a punto tecnológica orientada a la práctica clínica, revolucionando la cirugía nerviosa al liberarla de su dependencia de donantes o bancos de tejido cadavérico.

- Social, pues supondría un avance en las terapias celulares repercutiendo en una mejora de funcionalidad en las personas afectadas.

- Económico, ya que se abriría paso a nuevos productos sanitarios (nervios artificiales), reduciéndose los costes sanitarios por hospitalización, cirugías, rehabilitación, etc.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1.- Muestra una vista general del dispositivo.

Figura 2.- Muestra una sección longitudinal parcial del dispositivo.

Figura 3.- Muestra una sección longitudinal completa del dispositivo.

Figura 4.- Muestra sección transversal del dispositivo sin estructura de fijación auxiliar (izquierda) y con estructura de fijación auxiliar (derecha).

Figura 5.- Muestra una vista en detalle de la anilla de fibras y la estructura de fijación y sutura.

Figura 6.- Muestra una vista general de una agrupación plana de microfilamentos paralelos.

Figura 7.- Muestra una vista de un dispositivo con nueve módulos en posición curvada, sin fijación en los extremos.

Figura 8.- Muestra una vista general de una realización de una asociación de dos dispositivos.

Figura 9.- Muestra una sección de tres dispositivos de diferentes diámetros, contenidos dentro de una envoltura externa protectora.

Figura 10.- Muestra una vista de una realización de la invención con una bifurcación de dos estructuras cilíndricas partiendo de una única estructura cilíndrica.

Figura 11.- Muestra una vista de una realización de la invención con una bifurcación de dos estructuras cilíndricas partiendo de dos estructuras cilíndricas.

Figura 12.- Muestra una sección longitudinal completa del dispositivo con células de soporte en su interior tras su cultivo in vitro.

Figura 13.- Muestra una sección longitudinal completa del dispositivo con células de soporte en su interior y una fuente neuronal en un extremo tras su cultivo in vitro.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Se describe a continuación, con ayuda de las figuras 1 a 13, una realización preferente del dispositivo modular para regeneración nerviosa, así como de su procedimiento de fabricación.

En la figura 1 se muestra una vista general del dispositivo, que en esta realización comprende una única estructura modular (1), de longitud variable entre 0,6 cm y 90 cm, constituida la estructura modular (1) por unos módulos elementales (2) cilíndricos, de un material natural y sintético degradable y biocompatible. En el caso de la figura 1, la estructura modular (1) comprende tres módulos elementales (2).

Tal y como aparece en la figura 2, que muestra una sección parcial de la estructura modular (1), los módulos elementales (2) son huecos, comprendiendo en su interior un orificio o lumen (3), en cuyo interior están destinadas a alojarse células gliales de soporte (células de Schwann, oligodendrocitos) y prolongaciones axonales de neuronas.

Cada módulo elemental (2) es un cilindro de dimensiones entre 0,5 cm y 2 cm de longitud, entre 0,01 cm y 2 cm de diámetro interno y entre 0,05 cm y 3,5 cm de diámetro externo. A partir de la unión de uno o más módulos elementales (2) posicionados en serie o paralelamente, la estructura cilíndrica modular puede alcanzar una longitud variable entre 0,6 cm y 90 cm aproximadamente.

Los módulos elementales (2) pueden estar fabricados de diferentes materiales. Debe ser un material poroso biocompatible que permita el intercambio de fluidos y nutrientes entre la parte interna y externa del dispositivo. Además, es preferible que el material sea bioabsorbible o biodegradable, de esta manera no es necesario retirar el dispositivo quirúrgicamente cuando el proceso regenerativo se ha completado.

Los materiales biocompatibles adecuados para los módulos elementales (2) incluyen poliésteres sintéticos y polímeros naturales, formando una estructura porosa como, por ejemplo: ácido hialurónico (HA), HA reticulado, HA metacrilado reticulado, quitosano reticulado, alginato, colágeno, gelatina, agarosa reticulada, ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), polietilenglicol, poly(glicerol sebacato), etc.

Los módulos elementales (2) son fabricados mediante el empleo de un molde o por técnicas de electrohilatura o por cualquier otra técnica que permita esa morfología.

Como se ha indicado, cada estructura modular (1) está destinada a albergar de manera viable en el lumen (3) interior tanto células gliales de soporte (células de Schwann, oligodendrocitos) como prolongaciones axonales de neuronas situadas en sus extremos, existiendo conectividad neuronal funcional de extremo a extremo del dispositivo.

Asimismo, y para servir de soporte a las células gliales y prolongaciones axonales, el dispositivo comprende uno o más haces (4), que pueden ser paralelos, como es el caso de la figura 2, o ramificados, constituidos por unos microfilamentos (5) paralelos, distribuidos por el lumen (3) de los módulos elementales (2), de longitud entre 0,6 cm y 90 cm y diámetro de cada microfilamento entre 0,001 cm y 0,1 cm.

De esta manera, son los microfilamentos (5) los que mantienen a los distintos módulos elementales (2) unidos. Además, los microfilamentos (5) sirven de soporte para la adhesión y guía durante la migración de las células y la extensión de los axones, que pueden crecer de extremo a extremo, en grandes longitudes (decenas de centímetros). Los microfilamentos (5) conducen la extensión axonal de extremo a extremo del dispositivo, estimulada por las células de soporte asentadas sobre los microfilamentos (5).

En la figura 3 se muestra una sección de los haces (4), en la que se observa cómo los microfilamentos (5) se mantienen paralelos al eje longitudinal de la estructura modular (1) gracias a su unión a unas estructuras de fijación y sutura (6), de un material polimérico flexible, posicionadas en unos módulos elementales (2) extremos, a través de las cuales se lleva a cabo tanto la sujeción de los haces (4) como la posterior sutura del dispositivo al nervio lesionado.

Como se muestra en la figura 2, y en detalle en la figura 4, el dispositivo puede comprender también unas estructuras de fijación auxiliar (7) en forma de anillas dispuestas en serie, y que se posicionan en uno o más de los lúmenes (3) interiores de los módulos elementales (2), y que contribuyen a mantener la forma cilíndrica de los haces (4) de microfilamentos (5) en un medio acuoso, evitando que colapsen uniéndose unos a otros. Concretamente, en la parte izquierda de la figura 4 se muestra una sección de un módulo elemental (2) sin estructura de fijación auxiliar (7), y en la parte derecha una sección de un módulo elemental (2) con estructura de fijación auxiliar (7).

En la figura 5 se muestra una vista más en detalle de los microfilamentos (5) unidos a las estructuras de fijación y sutura (6). Los microfilamentos (5) pueden ser de distintos materiales, preferentemente poliésteres sintéticos degradables (ácido poliláctico (PLA), ácido poliláctico-coglicólico (PLGA), poli-£-caprolactona (PCL), polipirrol (PPy), nanotubos de carbono (CNTs), fibroína de seda, poli(3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT), polianilina (PANI), etc.) o de fibras de carbono o metales conductores como oro o platino, o una combinación de los mismos.

La manera en que los microfilamentos (5) se disponen dentro lumen (3) interior o lumen de los módulos elementales (2) de la o las estructuras modulares (1) puede ser variable: en forma de agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos unidos en los extremos por un material polimérico flexible o en forma de haces cilindros de microfilamentos (5) mantenidos en cada extremo por unas anillas de material polimérico flexible. Para una mejor comprensión de la invención, se describen a continuación los procedimientos de fabricación de las microfibras (5) paralelas unidas por ambos extremos.

Para obtener las agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos, que se muestran en una vista en detalle en la figura 6, se agrupa un número determinado de los microfilamentos (5) (600 microfilamentos (5)) y se disponen de forma paralela unos al lado de los otros sobre una superficie plana, como una placa de vidrio. Con el objetivo de mantener esta disposición, se sitúan a ambos extremos un material polimérico flexible disuelto por debajo y por encima de los microfilamentos (5), el cual al solidificarse mantiene unidos los filamentos en una disposición plana y paralela.

Para obtener un haz (4) de microfilamentos (5) en modo de cilindro, como el que aparece en la figura 2, éstos se disponen en primer lugar en forma de agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos, como los de la figura 6, y posteriormente se enrollan alrededor de una varilla de diámetro adecuado con el objetivo de obtener la forma cilíndrica sin que los microfilamentos (5) pierdan su disposición paralela.

A continuación, se aplica un material polimérico flexible disuelto formando una anilla con la longitud deseada y se deja secar. Una vez seco, se extrae la varilla y se obtiene el cilindro de microfilamentos (5). El número de microfilamentos (5) que conforman el cilindro puede variar en función del diámetro de los microfilamentos (5) individuales y del diámetro del haz (4) de microfilamentos (5) que se quiera generar.

En el lumen (3) del conducto se inserta el haz cilíndrico de microfilamentos (5), de extremo a extremo del módulo elemental (2). Los microfilamentos (5) son el elemento común a todos los módulos elementales (2), los cuales se posicionan uno al lado del otro, con el haz de microfilamentos (5) atravesando sus lúmenes u orificios (3).

Las estructuras modulares (1) compuestas de varios módulos elementales (2) tienen en ambos extremos finales unas estructuras de fijación y sutura (6) de un material polimérico flexible que, además de mantener la disposición cilíndrica del haz (4) de microfilamentos (5), impiden la separación excesiva entre módulos elementales (2) y permiten la manipulación del dispositivo modular (1) como una única entidad.

En el caso de las estructuras modulares (1) de dimensiones mayores en cuanto a su diámetro interno, se posiciona en los módulos elementales (2) extremos una estructura de fijación y sutura ligeramente cónica de un material polimérico flexible, mostrada en detalle en la figura 5, para mejorar la introducción del extremo distal y proximal del nervio lesionado y facilitar la sutura a dicha estructura.

La fabricación modular para abarcar una gran longitud, frente a la fabricación de un único conducto que cubra esa gran longitud, minimiza los fallos en el proceso de fabricación. Además, el diseño modular proporciona a lo largo de toda la longitud secciones libres, que incrementan la capacidad de adaptación de la longitud total a cualquier curvatura, al poder moverse y rotar una respecto de la otra en una cierta medida, tal y como se refleja en la figura 7. Es decir, la resistencia a la flexión de las estructuras modulares (1) es mucho menor que la de la misma longitud obtenida de una sola pieza, lo cual la hace más flexible y adaptable a curvaturas variables.

Como se muestra en la figura 8, el dispositivo de la invención puede comprender dos o más estructuras modulares (1) dispuestas en paralelo, que a su vez pueden comprender una pluralidad de haces (4) de microfilamentos (5) de diámetro variables. Cada haz (4) se extiende de forma continua por toda la longitud del dispositivo, de forma que se genera una arquitectura interna continua (a excepción de las zonas entre módulos elementales (2)), longitudinal y alineada que promueve la regeneración neural, y que a su vez pueden estar incluidos dentro de una envoltura externa protectora (9), como se muestra en la figura 9.

Cuando el dispositivo comprende varios haces (4) en paralelo o ramificados, puede comprender una funda cilíndrica (9), como muestra la figura 9, que recubre a cada uno de los haces (4). La funda cilíndrica (9) puede ser de los mismos materiales que los módulos elementales (2): poliésteres sintéticos y polímeros naturales, formando una estructura porosa como, por ejemplo: ácido hialurónico (HA), HA reticulado, HA metacrilado reticulado, quitosano reticulado, alginato, colágeno, gelatina, agarosa reticulada, ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), polietilenglicol, poly(glicerol sebacato), etc., o puede ser de polímeros inertes como la silicona, politetrafluoroetileno (PTFE, teflón) o los poliacrilatos.

Asimismo, el dispositivo puede comprender una porción de estructura modular (1) extracorpórea, recubierta por una funda cilíndrica de un polímero elastómero, como por ejemplo silicona o poliacrilatos. En este caso, el dispositivo comprende una conexión a un sistema de bombeo extracorpóreo que haga circular fluidos biológicos en el interior de la funda.

La arquitectura interna cuando hay varias estructuras modulares (1) aumenta la superficie para la adhesión de las SCs que forman parte del dispositivo. Esta arquitectura permite contener muchas más SCs que el dispositivo con una única estructura modular (1) (con un único haz (4) de microfilamentos (5) en su lumen (3)). El mayor número de SCs supone una mejora del proceso regenerativo.

La arquitectura interna de varias estructuras modulares (1) puede proporcionar un mayor control sobre la dirección del crecimiento de diferentes grupos de fibras nerviosas en regeneración. Un solo nervio puede contener miles de fibras nerviosas o axones. Mediante el uso de múltiples estructuras fibrilares internas, cada axón o un grupo de axones pueden ser guiados durante el proceso regenerativo a través de una estructura modular (1) individual o un grupo de estructuras modulares (1).

Además, como se detalla en la figura 10, se puede crear una arquitectura de ramificación si se desea. Por ejemplo, en el modelo simple de un nervio bifurcado, se pueden proporcionar dos grupos distintos de haces (4) de microfilamentos (5) internos dentro del lumen (3) interno del dispositivo.

Como se muestra en la figura 10, en un primer extremo del dispositivo (proximal), el haz (4) de microfilamentos (5) presenta un único extremo proximal para la conexión con el muñón del nervio proximal. En un segundo extremo (distal), concretamente en un módulo elemental de bifurcación (10), se separan en dos grupos distintos de haces (4), de modo que se proporcionan dos extremos distales distintos del dispositivo. Cada uno de estos extremos se conecta a una rama separada del muñón del nervio distal.

Alternativamente, como se refleja en la figura 11, el dispositivo puede comprender dos estructuras modulares (1) que discurren en paralelo, y que al llegar a unos módulos elementales de separación (11), se dividen hacia direcciones diferentes.

Por su parte, es un segundo objeto de invención el procedimiento de fabricación del dispositivo, que es un procedimiento modular y secuencial. Para conseguir la longitud deseada se ensambla el número correspondiente de módulos elementales (2) pasando por su interior el haz (4) de microfilamentos (5) continuos unidos en los extremos por estructuras de sujeción y sutura (6).

A continuación, se siembran en diferentes puntos del interior de cada módulo elemental (2) las células gliales de soporte (12), que son cultivadas in vitro hasta que forman un tapizado continuo de la cara interna de los módulos elementales (2), alcanzando continuidad, como muestra la figura 12.

Tal y como refleja la figura 13, tras el cultivo de las células gliales de soporte (12), se puede sembrar en un extremo del dispositivo y, en su caso, en diferentes puntos a lo largo de su longitud, fuentes neuronales (13) como precursores neuronales, explantes de ganglios de raíz dorsal, etc. A continuación, el conjunto puede ser cultivado in vitro hasta que se obtenga la prolongación axonal deseada.

Cada uno de los módulos elementales (2) está formado por un material poroso que permite la incorporación de sustancias bioactivas a partir de uno o más módulos de liberación de factores de crecimiento y/o fármacos (8) para una liberación controlada y localizada de los mismos, como se muestra en la figura 1, bien en la propia matriz del módulo elemental (2), o bien encapsuladas en el interior de micro o nanofibrillas, micro o nanopartículas, liposomas, u otros métodos de encapsulación de esas sustancias. Dichas partículas o fibrillas pueden tener carácter hidrófilo como la gelatina o hidrófobo como el PLA, o gelatina entrecruzada, en función del carácter de la molécula a cargar en ellas, y tamaños variables hasta el orden de decenas de micras.

Además, el dispositivo puede comprender adicionalmente unos medios para la estimulación eléctrica, como uno o varios electrodos en contacto o no con microfilamentos electroconductores para la estimulación eléctrica del dispositivo, pudiendo ir alojados tanto en el lumen (3) del módulo elemental (2) como en su exterior. A su vez, el dispositivo puede comprender unas bobinas a su alrededor que permitan la estimulación magnética del mismo. Asimismo, el uso de microfilamentos electroconductores que forman circuitos cerrados también permite la estimulación eléctrica del dispositivo sin necesidad de utilizar electrodos.

Por lo tanto, es también objeto de invención un procedimiento para la fabricación del dispositivo modular para la regeneración nerviosa, descrito anteriormente, y que comprende las etapas de:

a) preparación de micro o nanopartículas cargadas con moléculas bioactivas, que puede comprender diferentes polímeros, tal como gelatina, ácido hialuróinico, ácido poliláctico, ácido poliglicolico,

b) disposición de un molde con ranuras para contener los módulos elementales (2) cilíndricos,

c) introducción de un material polimérico en forma de fibra en cada una de las ranuras del molde, con unas estructuras en los extremos para facilitar el centrado de la fibra en cada ranura

d) preparación de disoluciones, por ejemplo, de ácido hialurónico (HA), con las micro o nanopartículas de la etapa a) y agitación, en presencia de un agente de entrecruzamiento del HA, que puede seleccionarse preferentemente del grupo que consiste en divinilsulfona, éteres tal como 1,6-hexanediol diglicidil éter o polipropilen glicol diglicidil éter, diepoxidos tal como 1,2,7,8-diepoxioctano o 1,3-butadieno diepoxido, y carbodiimidas solubles en agua. Preferiblemente, el agente de entrecruzamiento es la divinilsulfona.

f) congelación del conjunto molde-soluciones,

g) liofilización del conjunto molde-soluciones obteniendo unas matrices tubulares microporosas de HA,

h) extracción de la fibra o fibras poliméricas, creando así el lumen (3) de la estructura modular (1) en posición centrada.

i) hinchado de las estructuras modulares (1) en agua destilada,

j) inserción en el lumen (3) de unos microfilamentos (5), por ejemplo, de ácido poliláctico (PLA), unidos en sus extremos a unas estructuras de fijación y sutura (6) constituidas por material polimérico flexible, uniendo varios módulos elementales (2) hasta alcanzar un tamaño deseado (desde pocos milímetros hasta varios centímetros), y

EJEMPLOS

Se detalla a continuación el procedimiento de fabricación de un módulo elemental (2). Se utiliza un molde de politetrafluoroetileno (PTFE) con unos canales de 1,5 mm de ancho. En cada canal se introduce una fibra de 0,4 mm de diámetro de un material hidrófobo, PCL, usando arandelas de PTFE con un diámetro que se ajuste al canal del molde para mantenerla centrada, para que sirva de negativo del diámetro interno del módulo elemental (2).

Se prepara una solución de ácido hialurónico (HA) al 5% en presencia de hidróxido sódico (NaOH) al 0,2M y divinilsulfona (DVS) en exceso (en una relación molar DVS:HA de unidades de monómero de 9:10) como agente de entrecruzamiento. Dicha solución se inyecta en los canales del molde de PTFE. Una vez gelificada la solución, el molde se coloca en una placa Petri para evitar la evaporación y se enfría hasta -20°C.

Después, el conjunto de molde-disolución se liofiliza durante 24 h a 20 Pa y -80 °C para generar matrices microporosas de HA debido a la sublimación de agua. Se obtiene el producto seco, del que se extrae la fibra de policaprolactona (PCL), creando así el lumen (3) interno hueco. Finalmente, se hidratan y cortan a una longitud de 6 mm para conseguir los distintos módulos elementales (2) que conformarán las estructuras modulares (1).

A modo de ejemplo, para el ensamblaje en serie de 3 módulos elementales (2) de 6 mm de longitud, como en el dispositivo mostrado en las figuras 1-3, o de 9 módulos elementales (2) como es el caso de la figura 7, se insertan en el interior del lumen (3) 120 microfilamentos (5) de ácido poliláctico (PLA) de 10 ^m de diámetro cada uno. Para ello, se alinean cada uno de los microfilamentos (5) para generar un haz (4) que pasa entre los módulos elementales (2). De esta manera se puede lograr el ensamblaje de "n” número de módulos elementales (2).

Un dispositivo con 3 módulos elementales (2) podría cubrir una lesión corta. Un dispositivo de 9 módulos elementales (2) podría cubrir una lesión larga sin necesidad de grandes aportes de nervio, como por ejemplo la cirugía del plexo braquial o la cirugía oncológica, incluso plantear la reconstrucción de conexiones medulares sorteando las zonas cicatriciales o establecer nuevas conexiones entre el sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periférico (SNP).

Para la fijación de los extremos del dispositivo se proponen disposiciones de microfilamentos (5) alternativos como las agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos de la figura 6, unidas en los extremos con un material polimérico flexible, o cilindros de microfilamentos (5) mantenidos en cada extremo por una anilla de material polimérico flexible.

El dispositivo de la presente invención no se limita sólo a la reparación de nervios del SNP sino también a estructuras basadas en tractos axonales del SNC como la médula espinal, el nervio óptico y otros tractos.

En el diseño modular del dispositivo, las secciones libres a lo largo de la longitud facilitan enormemente el intercambio de nutrientes y células con el entorno, posibilitando de esta manera, por una parte, la mayor supervivencia de las células trasplantadas en el interior, y, por otra parte, la mayor velocidad del metabolismo con el entorno necesario en el proceso de regeneración (ambas muy dificultadas en un concepto de estructura tubular larga única, que no tiene más aberturas que los dos extremos).

Por ejemplo, para el cultivo de células de Schwann (SCs) como fuente de células gliales de soporte (12) en el interior de la estructura modular (1) formada por 3 módulos elementales (2) de HA entrecruzado con DVS de 6 mm de longitud cada uno, con un diámetro interno de 400 .^m de diámetro interno cada uno. Los módulos elementales (2) alojan en su interior un haz (4) de 120 microfilamentos de PLA de 10 .^m de diámetro cada uno.

Se sanitiza y pre-acondiciona la estructura modular (1) formada por los módulos elementales (2) de HA, con su lumen (3) ocupado por 120 microfilamentos (5) de PLA de 10 .^m cada uno en una cabina de flujo laminar, mediante dos lavados sucesivos con una disolución de etanol al 70%. Se lavan las muestras con disoluciones de etanol al 50% y al 30%. A continuación, se lavan con agua desionizada y se acondicionan con medio de cultivo antes de la siembra en los dispositivos modulares (1).

Por otro lado, se cultivan las SCs en flascones hasta confluencia, a 37°C, 5% CO², en un medio de cultivo para SCs. Todos los experimentos se realizan con células en pase 4 a 6.

Estas células gliales de soporte (12) se siembran en diferentes puntos del interior de la estructura modular (1) a una densidad de 27.000 células/mm2 con la ayuda de una pipeta. Se espera 30 min antes de añadir medio de cultivo para SCs.

Tras 5 días de cultivo in vitro de las SCs forman una estructura tipo capa a lo largo del lumen interno (3) de cada módulo elemental (2) de forma continua, y también crecen sobre el haz (4) de microfilamentos (5) de PLA en la dirección marcada por los mismos, incluso en las zonas intermodulares donde los microfilamentos dejan de estar cubiertos por los módulos elementales (2) de HA.

Además, es posible el uso de fuentes neuronales para estudiar el crecimiento axonal en las estructuras modulares (1) en co-cultivo con fuentes de células gliales de soporte (12). Por ejemplo, tras el cultivo de 5 días de las SCs en la estructura modular (1), se puede sembrar en un extremo de cada estructura modular (1) un explante de ganglio de raíz dorsal de ratas neonatales a modo de fuente neuronas proyectantes (13).

A continuación, el conjunto se cultiva in vitro durante 21 días adicionales, obteniéndose una extensión axonal que llega a cubrir toda la longitud de la estructura modular (1), incluso atravesando estos axones las zonas intermodulares entre distintos módulos elementales (2). La extensión axonal fue mayor que en los dispositivos en los cuales no había SCs pre-sembradas, viéndose como este elemento es fundamental para un crecimiento axonal más eficiente.

En las lesiones de gran longitud, la regeneración se ve dificultada por el gran lapso de tiempo que es necesario para la regeneración, la rápida aparición de una cicatriz glial y la falta de estímulos químicos y/o eléctricos. La estimulación eléctrica estimula la extensión axonal después de una lesión nerviosa.

Por ejemplo, las agrupaciones planas de microfilamentos (5) paralelos o cilindros formados por microfilamentos (5) de PLA pueden recubrirse con un polímero electroconductor como es el polipirrol (PPy). Para ello, una de las diferentes técnicas que pueden emplearse es la polimerización in situ.

Como paso previo, las agrupaciones de microfilamentos (5) se sumergen en agua desionizada bajo compresión y aplicando un vacío fijo hasta que dejan de flotar con el objetivo de lograr la introducción de agua dentro de los espacios entre microfilamentos (5) con el fin de obtener un recubrimiento homogéneo de todos los microfilamentos (5), no solo de los más superficiales. A continuación, cada agrupación de microfilamentos (5) se coloca dentro de un tubo de polipropileno con una solución acuosa de monómero de pirrol (Py) y para-toluenosulfonato de sodio (pTS) que actúa de dopante, seguido de la aplicación de ultrasonidos para permitir que la agrupación de microfilamentos (5) se sature con la solución de Py/pTS.

Las agrupaciones de microfilamentos (5) se incuban con agitación a 4 °C. Luego, se añade una solución acuosa de cloruro férrico (FeCh) y se incuba con agitación a 4 °C para lograr una polimerización oxidativa y la deposición de PPy sobre los sustratos de PLA. Los sustratos recubiertos con PPy se lavan con agua desionizada en agitación y, a continuación, con ultrasonidos en agua desionizada para eliminar todos los residuos de PPy no adheridos a los microfilamentos (5). Finalmente, las agrupaciones de microfilamentos (5) se secan en un desecador con vacío fijo a 40 °C.

Adicionalmente, se puede funcionalizar la estructura modular (1) cargando una o varias sustancias bioactivas en cada módulo elemental (2) con igual o diferente concentración. De esta forma, cabe la posibilidad de crear gradientes de varios tipos que favorezcan la regeneración. La creación de gradientes en una estructura no modular no se podría realizar al tener que funcionalizar con una o varias sustancias, pero con una misma concentración.

Por ejemplo, se podrían crear dispositivos funcionalizados con moléculas bioactivas en cada módulo elemental (2) con igual o diferente concentración incorporándolos en su interior mediante micropartículas de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) cargadas de un factor de crecimiento que favorezca la extensión axonal, como por ejemplo el factor de crecimiento nervioso (NGF) a una concentración de 10 ng/mL.

Se preparan las micropartículas de PLGA por el método water-in-oil-in-watert (W/O/W). Se prepara una solución acuosa con el NFG y se añade a una disolución de PLGA en diclorometano obteniendo la primera emulsión (W/O). Esta emulsión se añade por goteo en una disolución de polivinil alcohol en una solución acuosa de cloruro de sodio, obteniendo la segunda emulsión (W/O/W). La emulsión W/O/W se agita a temperatura ambiente para permitir la evaporación del solvente y finalmente las micropartículas se recolectan por centrifugación.

Se pueden diseñar módulos elementales (2) con más o menos porosidad, con diferente composición química de los materiales estructurales, con más o menos cargas de moléculas bioactivas o de recubrimiento de su superficie, con distintos tipos celulares sembrados, etc. de manera que exista un gradiente entre unos módulos elementales (2) y otros al formar parte de un dispositivo con una estructura modular (1) única, dando esta funcionalidad añadida al conjunto del dispositivo.

Se pueden incorporar sustancias bioactivas dentro de la estructura modular (1) añadiendo el fármaco a la solución de polímero antes de la inyección en el molde si el fármaco es soluble en el disolvente seleccionado. Esto dará como resultado la dispersión del fármaco por toda la estructura modular (1) y cada módulo elemental (2). Como alternativa, se puede agregar una emulsión del fármaco y un disolvente del fármaco a la solución de polímero antes de la inyección, lo que da como resultado que el fármaco se retenga en los poros de la estructura modular (1).

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Dispositivo modular para regeneración nerviosa, que comprende:

- uno o más módulos elementales (2) esencialmente cilíndricos, huecos y porosos, dispuestos unos a continuación de otros según una estructura modular (1) con un lumen (3) interior,

- uno o más haces (4) de microfilamentos (5) paralelos, dispuestos en el lumen (3) de la estructura modular (1), destinados a servir de soporte a una componente celular de soporte axonal, y

- unas estructuras de fijación y sutura (6) posicionadas en unos módulos elementales extremos (2) y conectadas a los microfilamentos (5), destinadas a fijar los microfilamentos (5) en una posición deseada y a servir de plataformas donde proceder a suturar un nervio que se va a regenerar.

2. - El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente unas estructuras de fijación auxiliar (7) en forma de anillas dispuestas en el lumen (3) de la estructura modular (1) y a las que se fijan los microfilamentos (5), manteniéndolos paralelos.

3. - El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente uno o más módulos de liberación de factores de crecimiento y/o fármacos (8) embebidos o encapsulados para una liberación controlada y localizada en el interior de los módulos elementales (2).

4. - El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente unos medios de estimulación eléctrica y/o magnética conectados a la estructura modular (1).

5. - El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende una primera estructura modular (1), al menos un módulo elemental de bifurcación (10) posicionado en un extremo de la primera estructura modular (1) y una segunda y una tercera estructuras modulares (1) conectadas al módulo elemental de bifurcación (10).

6. - El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende dos o más primeras estructuras modulares (1) paralelas, dos o más módulos elementales de separación (11) posicionados en un extremo de las primeras estructuras modulares (1) paralelas, y dos o más segundas estructuras modulares (1) paralelas conectadas a los módulos elementales de separación (11) dispuestas de forma no paralela.

7. - El dispositivo de la reivindicación 1, en el que la estructura modular (1) comprende un haz (4) de microfilamentos (5) en el lumen (3), estando la estructura modular (1) cubierta por una funda cilíndrica (9).

8. - El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende una porción de la estructura modular (1) extracorpóreo, recubierto por una funda cilíndrica extracorpórea.

9. - El dispositivo de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente una conexión a un sistema de bombeo de líquidos fisiológicos externo.

10. - El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los módulos elementales (2) son de un material natural y/o sintético, degradable y biocompatible.

11. - El dispositivo de la reivindicación 10, en el que los módulos elementales (2) son de un material biocompatible seleccionado entre poliésteres sintéticos y polímeros naturales.

12. - El dispositivo de la reivindicación 11, en el que los módulos elementales (2) son de un material seleccionado entre ácido hialurónico (HA), HA reticulado, HA metacrilado reticulado, quitosano reticulado, alginato, colágeno, gelatina, agarosa reticulada, ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), polietilenglicol y poly(glicerol sebacato).

13. - El dispositivo de la reivindicación 1, en el que los microfilamentos (5) son de un material seleccionado entre poliéster sintético degradable, fibras de carbono, metales conductores y una combinación de los mismos.

14. - El dispositivo de la reivindicación 13, en el que los microfilamentos (5) son de un material seleccionado entre ácido poliláctico (PLA), ácido poliláctico-coglicólico (PLGA), poli-£-caprolactona (PCL), polipirrol (PPy), nanotubos de carbono (CNTs), fibroína de seda, poli(3,4-etilenodioxitiofeno) (PEDOT) y polianilina (PANI).

15. - Procedimiento de fabricación del dispositivo modular para la regeneración nerviosa de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de:

- preparación de micro o nanopartículas cargadas con moléculas bioactivas, - disposición de un molde con ranuras para contener los módulos elementales (2), - introducción de un material polimérico en forma de fibra en cada una de las ranuras del molde, con unas estructuras en los extremos para facilitar el centrado de la fibra en cada ranura,

- preparación de disoluciones, con las micro o nanopartículas y agitación, en presencia de un agente de entrecruzamiento,

- inyección de las disoluciones en las ranuras del molde, obteniendo un conjunto molde-soluciones que reticula in situ,

- congelación del conjunto molde-soluciones,

- liofilización del conjunto molde-soluciones obteniendo los módulos elementales (2) que conforman la estructura modular (1),

- extracción de las fibras, creando así el lumen (3) de la estructura modular (1) en posición centrada,

- hinchado de las estructuras cilíndricas en agua destilada,

- inserción en el lumen (3) de los microfilamentos (5), y

- opcionalmente, obtención de una envoltura externa (9) para proteger el dispositivo en la aplicación ex vivo.