WO2022158440A1 - 薬物送達用組成物、その製造方法及びその用途 - Google Patents

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正樹 森
周司 赤井
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浩文 山本
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Definitions

  • the present invention relates to a drug delivery composition that has high accumulation in target tissues/organs and sufficiently reduced accumulation in normal organs, a method for producing the same, and uses thereof.
  • the calcium phosphate co-precipitation method is known as a non-viral nucleic acid introduction method into cells. Although this method has advantages such as low toxicity, non-immunogenicity, and simple operation, it has the disadvantage of low nucleic acid introduction efficiency and low expression efficiency.
  • the pH in the endosome is acidic (approximately pH 5.5)
  • the incorporated complex particles are exposed to changes in the external pH from around pH 7 to pH 5, thereby rapidly dissolving the complex particles and releasing the nucleic acid. release, resulting in high cell transduction efficiency.
  • the present inventors finely dispersed the average particle size to 50 nm or less by subjecting conventional carbonate apatite particles to ultrasonic treatment using an ultrasonic cleaner that is commonly used for cleaning test tubes and the like.
  • These microparticles markedly improve the efficiency of substance uptake into cells, and when intravenously administered to a tumor model mouse loaded with a drug having antitumor activity, the drug is efficiently delivered to the tumor tissue, while liposomes and Compared to atelocollagen, the accumulation in the liver and kidney is reduced, and we have succeeded in greatly improving the antitumor activity with a smaller amount of drug than before (Patent Document 2, Non-Patent Document 2).
  • sCA apatite
  • Non-Patent Document 2 since intravenous administration of sCA alone to cynomolgus monkeys caused liver dysfunction (Non-Patent Document 2), it was suggested that sCA still accumulates in normal organs such as the liver even when sCA is used. In addition, systems based on inorganic ions, typified by sCA, have a problem of low delivery efficiency of genes to lesions (Non-Patent Document 3).
  • DDS drug delivery system
  • An object of the present invention is to realize higher accumulation in lesions and reduction in accumulation in normal organs including the liver, thereby achieving a safe and effective therapeutic effect with a smaller amount of drug. It is to provide effective DDS technology.
  • the present inventors have found that drug introduction using sCA still accumulates not only in target tissues/organs (e.g., cancer lesions) but also in normal organs such as the liver, spleen, and lungs, with particularly high accumulation in the liver. (Fig. 7).
  • the present inventors focused on the fact that macroscopically micron-sized particles still exist even after particles with an average particle size of 50 nm or less account for the majority due to ultrasonic treatment (non Patent document 2). Therefore, intensive studies were conducted, including filtration of sCA particles, nanoparticle formation by laser, use of other crushing treatments, and polyethylene glycol (PEG) modification of the surface of sCA particles, but none of these methods can eliminate the residual giant particles. I didn't get it.
  • PEG polyethylene glycol
  • the present inventors did not pegylate the surface of the sCA particles, but incorporated PEG like a "nail" when the particles were formed, and combined it with a crushing treatment to achieve micronization.
  • MicroRNA (miR-34a) was loaded on sCA to which a PEG derivative was added at the time of particle formation, and the sonicated product was added to miR-34a-sensitive colon cancer cells. It showed the same level of cytotoxicity as conventional washed sCA.
  • the average particle diameter of the Covaris-treated particles measured by DLS was 650 nm, but when measured by AFM after being diluted 50 times, the fine particles were around 30 nm, and the volume of the particles measured by DLS accounted for the majority. Therefore, we thought that it would bring about the anti-tumor effect of nucleic acids, and verified it.
  • size fractionation into particles of 10 to 50 nm, 50 to 200 nm and 200 to 1000 nm was performed, and the amount of nucleic acid (MIRTX: Non-Patent Document 5) loaded in each fraction was measured.
  • MIRTX Non-Patent Document 5
  • fractions and conventional sCA were intravenously administered to nude mice subcutaneously transplanted with MIRTX-sensitive pancreatic cancer cells, the fraction of 200 to 1000 nm had a nucleic acid amount that was 1/8 of the amount of nucleic acid loaded on sCA. Nevertheless, it inhibited tumor growth significantly more than conventional sCA. On the other hand, fractions with smaller particle sizes did not exhibit tumor growth inhibitory effects. From the above, the present inventors demonstrated that the fraction of 200 to 1000 nm is the substance of the antitumor effect. A new DDS prepared in this way was named cNaD1 (controlled inorganic nanoparticle Drug 1 ).
  • Fluorescently labeled nucleic acids were loaded onto sCA or cNaD1 and administered intravenously to tumor-bearing mice, then the tumors and normal organs of the mice were excised, and fluorescence intensity was measured. At 1 dose, the tumor glowed in the same way as when sCA was administered, while the accumulation in normal organs including the liver was greatly reduced compared to sCA.
  • cNaD1 exhibited a therapeutic effect superior to that of sCA with a significantly smaller amount of nucleic acid than sCA
  • the present inventors used a PEG derivative with an average molecular weight of 2000 to incorporate the PEG derivative during particle formation.
  • a PEG derivative with an average molecular weight of 2,000 was used, it showed a single peak with an average particle size of 740 nm in DLS, without the need for ultrasonication or fractionation using a hollow fiber membrane. It could be used as a carrier for delivery.
  • cNaD2 particles prepared using a PEG derivative with an average molecular weight of 2000 were named cNaD2.
  • the PEG derivative used here is a derivative in which one end is methylated and the other end is added with an ester of carboxylic acid and N-hydroxysuccinimide (NHS), and has a property of being easily hydrolyzed.
  • the present inventors thought that the terminal 5-membered ring was unnecessary because the amount of nucleic acids in the particles increased as the hydrolysis progressed, and synthesized a PEG derivative with a free carboxylic acid terminal from monomethylated PEG. , was used to make particles and compare the nucleic acid loading with cNaD2. As a result, particles made with any of the synthesized monomethylmonocarboxylic acid PEGs could be loaded with nucleic acids equivalent to or greater than cNaD2. Fluorescence-labeled nucleic acids were mounted on particles made using PEG monomethylmonocarboxylate, and the accumulation in tumors and livers after administration to tumor-bearing mice was investigated. , and accumulation in the liver was markedly reduced. On the other hand, when ordinary PEG without a terminal carboxylic acid was used, tumor specificity was as low as or lower than that of sCA.
  • the PEG used for cNaD is preferably a PEG derivative having one or more carboxylic acids at the end.
  • these particles cNaD3 to cNaD6
  • these particles were loaded with fluorescent nucleic acids and intravenously administered to tumor-bearing mice, similar to cNaD1 and cNaD2, they showed excellent tumor accumulation and normal organs such as the liver. It was confirmed that the accumulation was reduced.
  • the inventors have completed the present invention based on these findings.
  • [Section 1] A composition containing carbonate apatite particles loaded with a drug, wherein the particles have an average particle size of greater than 500 nm and no greater than 1000 nm, and polyethylene glycol having one or more carboxylic acids or derivatives thereof or salts thereof at the ends.
  • PEG polyethylene glycol having one or more carboxylic acids or derivatives thereof or salts thereof at the ends.
  • PEG polyethylene glycol having one or more carboxylic acids or derivatives thereof or salts thereof at the ends.
  • a composition characterized in that primary particles are formed in the presence of a (PEG) derivative, and the PEG derivative is incorporated into the primary particles.
  • PEG polyethylene glycol having one or more carboxylic
  • a method for producing the composition according to item 1, comprising subjecting carbonated apatite particles loaded with a drug and a PEG derivative to ultrasonication using a single-point concentrated ultrasonic irradiation device.
  • Carbonated apatite particles loaded with a drug and a PEG derivative are prepared by mixing a first solution containing the drug and calcium ions, a second solution containing phosphate ions and bicarbonate ions, and the PEG derivative.
  • Item 9. The method of Item 9.
  • [Item 11] 11.
  • the method of claim 9 or 10 further comprising concentrating the composition of claim 1 using a hollow fiber membrane.
  • a composition for drug delivery comprising the composition according to any one of Items 1 to 8.
  • Item 13 Item 13.
  • [Item 14] 13 A drug delivery composition according to Item 12, wherein the drug has anti-inflammatory activity and the target tissue is an inflamed tissue.
  • a composition is provided.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in particle size due to ultrasonic treatment of carbonate apatite particles formed in the absence of a PEG derivative.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in particle size due to ultrasonic treatment of carbonate apatite particles formed in the presence of a PEG derivative (SUNBRIGHT ME-100CS).
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of the amount of PEG derivative (SUNBRIGHT ME-100CS) added on particle formation.
  • FIG. 3 shows the results of agarose gel electrophoresis for verifying nucleic acids in particles after sonication and wet crushing.
  • FIG. 4 shows that the cytotoxicity of miR-34a is equivalent regardless of the presence or absence of the addition of PEG derivatives, even if the sonication method is changed.
  • FIG. 10 is a diagram showing the measurement results of nucleic acid (MIRTX) loading of each size fraction of sCA-MIRTX and PCANP-MIRTX.
  • MIRTX is a microRNA having antitumor activity described in Non-Patent Document 5.
  • FIG. 4 shows the antitumor effects of MIRTX-loaded sCA and PCANP-MIRTX size fractions.
  • FIG. 2 shows the uptake of Alexa750-labeled NC (Negative Control) siRNA loaded on 200-1,000 nm size fractions of sCA and PCANP into tumors and normal organs.
  • FIG. 2 shows the particle size of PCANP (200-1000 nm).
  • FIG. 3 shows the therapeutic effect of miR-136 loaded on sCA and cNaD2 on colon cancer DLD1.
  • FIG. 2 shows the therapeutic effect of cNaD2-mounted microRNA on a large tumor (600 mm 3 ) prepared from colon cancer patient-derived PDX (patient derived xenograft).
  • FIG. 2 shows the therapeutic effect of cNaD2-mounted Sdc4 siRNA on cancer stem cell model cells prepared from pancreatic cancer Panc-1.
  • FIG. 1 shows nucleic acid accumulation in tumors 1 hour after administration of Alexa750-labeled NC siRNA loaded onto sCA or cNaD2 to tumor-bearing mice.
  • FIG. 1 shows nucleic acid accumulation in tumors 1 hour after administration of Alexa750-labeled NC siRNA loaded onto sCA or cNaD2 to tumor-bearing mice.
  • FIG. 4 shows nucleic acid accumulation in normal organs 4 hours after administration of Alexa750-labeled NC siRNA loaded onto sCA or cNaD2 to tumor-bearing mice.
  • FIG. 2 shows the particle size of cNaD2.
  • FIG. 3 shows a comparison of nucleic acid loadings of carbonate apatite particles (sCA-C1-Iris, sCA-C1-Hamari), cNaD2 and sCA prepared in the presence of PEG monomethylmonocarboxylate.
  • the upper row shows the amount of nucleic acid per amount of particles, and the lower row shows the amount of nucleic acid per amount of Ca.
  • PEG monomethyl monocarboxylate Handai-C1, Hamari-C1
  • sCA and sCA surface-modified PEG particles Pegylation
  • PEG monomethyl monocarboxylate Handai-C1, Hamari-C1
  • HO-PEG-OH HO-PEG-OH
  • sCA and sCA surface-modified PEG particles Pegylation
  • FIG. 16-1 is a diagram showing changes over time in FIG.
  • FIG. 16-3 is a diagram showing changes over time in FIG. 16-3.
  • FIG. 2 is a diagram showing the ratio ( ⁇ g/mg) of nucleic acids and calcium constituting sCA, PEG-modified particles of sCA (pegylation), and particles of cNAD3 to cNAD6.
  • Carbonate apatite particles (cNaD6) prepared in the presence of PEG dicarboxylate show the same accumulation in tumor and liver as carbonate apatite particles (cNaD3) prepared in the presence of monomethylmonocarboxylate PEG. be.
  • FIG. 3 shows the therapeutic effect of MIRTX loaded on cNaD3 against colon cancer DLD1.
  • FIG. 4 shows the uptake of Alexa750-labeled NC siRNA loaded on sCA, freshly prepared or lyophilized cNaD3 into mouse subcutaneous tumors and liver.
  • FIG. 4 shows nucleic acid accumulation in inflamed joints of the extremities 40 minutes after administration of Alexa750-labeled NC siRNA loaded onto sCA or cNaD1 to rheumatoid arthritis model mice.
  • FIG. 2 shows nucleic acid accumulation in the liver 45 minutes after administration of Alexa750-labeled NC siRNA loaded onto sCA or cNaD1 to rheumatoid arthritis model mice.
  • the present invention provides a composition containing carbonated apatite particles loaded with a drug, wherein the particles have an average particle diameter of more than 500 nm and 1000 nm or less, primary particles are formed in the presence of a PEG derivative, and the A composition (hereinafter also referred to as "the composition of the present invention") is provided, characterized in that a PEG derivative is incorporated into primary particles.
  • Carbonated apatite and carbonated apatite particles that can be used in the present invention are known.
  • Carbonic apatite has a chemical structure in which some of the hydroxyl groups (OH ⁇ ) of hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) are replaced with carbonate groups (CO 3 2 ⁇ ), and has the general formula It can be represented by Ca 10-m X m (PO 4 ) 6 (CO 3 ) 1-n Y n .
  • X may be any element as long as it can partially replace Ca in carbonate apatite, and examples thereof include Sr, Mn, and rare earth elements.
  • m is usually a positive number of 0 or more and 1 or less, preferably 0 or more and 0.1 or less, more preferably 0 or more and 0.01 or less, and still more preferably 0 or more and 0.001 or less.
  • Y is a unit capable of partially substituting CO 3 in carbonate apatite, and examples thereof include OH, F, and Cl.
  • n is usually a positive number of 0 or more and 0.1 or less, preferably 0 or more and 0.01 or less, more preferably 0 or more and 0.001 or less, still more preferably 0 or more and 0.0001 or less .
  • Carbonate apatite particles can be obtained according to a known method. For example, it can be obtained by preparing an aqueous solution containing calcium ions, phosphate ions and bicarbonate ions.
  • concentration of each ion in the aqueous solution is not particularly limited as long as carbonate apatite particles are formed, and can be appropriately set with reference to the following.
  • the calcium ion concentration in the aqueous solution is usually 0.1 mM or higher, preferably 0.5 mM or higher, and more preferably 1 mM or higher.
  • the upper limit of calcium ion concentration is usually 1 M or less, preferably 100 mM or less, more preferably 10 mM or less.
  • the phosphate ion concentration in the aqueous solution is usually 0.1 mM or higher, preferably 0.5 mM or higher, and more preferably 1 mM or higher.
  • the upper limit of the phosphate ion concentration is usually 1 M or less, preferably 100 mM or less, more preferably 10 mM or less.
  • the bicarbonate ion concentration in the aqueous solution is usually 1.0 mM or higher, preferably 5 mM or higher, and more preferably 10 mM or higher.
  • the upper limit of the bicarbonate ion concentration is usually 10 M or less, preferably 1 M or less, more preferably 100 mM or less.
  • the sources of calcium ions, phosphate ions, and bicarbonate ions are not particularly limited as long as they can supply these ions to the aqueous solution, but for example, salts of these ions can be added to the aqueous solution.
  • CaCl2 or CaCl2.2H2O can be used as a calcium ion source
  • NaH2PO4.2H2O can be used as a phosphate ion source
  • NaHCO3 can be used as a carbonate ion source.
  • the other substances can be added to the aqueous solution when forming the carbonated apatite particles.
  • the "other substances” include any drug and PEG derivatives described below.
  • the type of drug is not particularly limited, various physiologically active substances can be used when the carbonate apatite particles are used as carriers of substances to cells or living organisms.
  • the term "loaded” includes a state in which the carbonate apatite particles and the other substance are adhered to each other in an arbitrary manner to form a complex in a state in which the other substance can be transported.
  • Examples of the drug include nucleic acids such as DNA, RNA, antisense nucleic acids, siRNA, miRNA, and aptamers, enzymes, peptides or proteins, polypeptides such as various peptide hormones, various anticancer agents, and treatment of central nervous system diseases.
  • Drugs various antibiotics, drugs for peripheral nerve diseases, drugs for sensory organ diseases, drugs for cardiovascular diseases, drugs for respiratory system diseases, drugs for gastrointestinal diseases, hormone preparations, drugs for urogenital diseases, skin diseases
  • Examples include, but are not limited to, therapeutic drugs, dental and oral disease therapeutic drugs, vitamins, nutritional tonics, cell activators, anti-allergic drugs, anti-inflammatory drugs, and the like. These drugs may be used singly or in combination of two or more.
  • the drug when it is a nucleic acid, it may be DNA, RNA, or chimeric molecules thereof. Also, the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. Although the length of the nucleic acid is not particularly limited, small nucleic acid molecules such as antisense oligonucleotides (ASO), siRNA, miRNA, and aptamers are preferred.
  • ASO antisense oligonucleotides
  • siRNA siRNA
  • miRNA miRNA
  • aptamers are preferred.
  • the drug can include compounds with antitumor activity.
  • Cancer types that can be targeted by the compositions of the present invention are not particularly limited, and include any cancer.
  • it may be cancer derived from epithelial cells, but it may also be non-epithelial sarcoma or blood cancer.
  • gastrointestinal cancer e.g., esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, colon cancer (colon cancer, rectal cancer), liver cancer (hepatocellular carcinoma, bile duct cell cancer), gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, anal cancer
  • cancer of the urinary system e.g.
  • Examples of compounds having antitumor activity incorporated in the composition of the present invention include alkylated compounds such as cyclophosphamide hydrate, ifosfamide, thiotepa, busulfaran, melphalan, nimustine hydrochloride, ranimustine, dacalpazine, and temozolomide.
  • alkylated compounds such as cyclophosphamide hydrate, ifosfamide, thiotepa, busulfaran, melphalan, nimustine hydrochloride, ranimustine, dacalpazine, and temozolomide.
  • Antimetabolites such as methotrexate, pemetrexed sodium hydrate, fluorouracil, doxifluridine, capecitabine, tagafur, cytarabine, gemcitabine hydrochloride, fludarabine phosphate, nelarabine, cladribine, levofolinate calcium; doxorubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride, pralubicin, Antibiotics such as epirubicin hydrochloride, idarubicin hydrochloride, aclarubicin hydrochloride, amrubicin hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, mitomycin C, actinomycin D, bleomacin hydrochloride, pperomacin hydrochloride, dinostatin stimaramer, calicheamicin , vincristine sulfate, vinblastine sulfate, vindesine sulfate, paclitaxel, etc.;
  • platinum agents Irinotecan hydrochloride hydrate, topotecan hydrochloride, etoposide, topoisomerase inhibitors such as sobuzoxan, corticosteroids such as prednisolone and dexamethasone, thalidomide and its derivatives lenalidomide, protease inhibitor bortezomib, etc. but not limited to them.
  • a low-molecular-weight anticancer drug (eg, molecular weight of 1000 or less) can also be linked to a water-soluble polymer directly or via a hydrazone to form a high-molecular drug.
  • a water-soluble polymer is not particularly limited, examples thereof include polyhydroxypropylmethacrylamide (PHPMA), styrene/maleic acid copolymer, and the like.
  • compounds having antitumor activity include, for example, anti-EGFR antibody, anti-CD40 antibody, anti-CD33 antibody, anti-HER2 antibody, anti-VEGF antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody.
  • antibodies such as anti-CD20 antibodies or fragments thereof, and sensitive substances that are targets of photodynamic therapy (eg, polymeric zinc protoporphyrin (P-ZnPP) and albumin-binding indocyanine green (ICG)).
  • siRNA siRNA, shRNA, dsRNA, microRNA, antisense nucleic acid (antisense DNA, antisense RNA), stabilized artificial nucleic acid BNA, ribozyme, decoy nucleic acid, aptamer and the like.
  • miRNAs having an inhibitory effect on the proliferation of cancer stem cells e.g., hsa-miR-136-5p, hsa-miR-3065-3p, hsa-miR-4727-5p, hsa-miR-378g, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-608) (WO2018/181877); miR4689 having excellent therapeutic effect on colorectal cancer, especially colorectal cancer with mutations in the KRAS gene and miR4685-3p (WO2015/133522); miR-29b, which has been shown to have an antitumor effect against various cancers such as bile duct cancer, lung cancer, and acute leukemia; KLF5 involved in carcinogenesis, cell cycle control miR-4711-5p that suppresses the expression of important TFDP1 and MDM2 (WO2020/246380); siRNA against syndecan 4
  • nucleic acids are not limited to natural nucleic acids, as long as they have an activity equal to or greater than that of natural nucleic acids, and one or more nucleotides in the nucleotide sequence are substituted with other nucleotides, deleted/inserted or added. It may be a mutant nucleic acid containing.
  • variants of miR-29b can include nucleic acids disclosed in WO2015/133521.
  • the miRNA may be a mature miRNA, a hairpin precursor miRNA (pri-miRNA), or a pre-miRNA in which a part of the pri-miRNA is cleaved.
  • the siRNA may also be a mature siRNA or a hairpin precursor (shRNA).
  • the loop portion of pre-iRNA or shRNA may be substituted with an amino acid (eg, proline, glycine, lysine, phenylalanine, glutamic acid, glycylglycine) derivative linker developed by Bonac.
  • Nucleic acids mounted in the compositions of the present invention may be subjected to various modifications generally applied to nucleic acids, if necessary, in order to impart resistance to degradation by nucleases.
  • modifications include, for example, modification of the sugar chain moiety such as 2'-O methylation; modification of the base moiety; modification of the phosphate moiety such as phosphorothioate, amination, lower alkyl amination, and acetylation. mentioned.
  • the composition of the present invention can deliver a drug not only to tumor tissue but also to other disease sites, such as inflamed tissue, with high selectivity. Compounds with action can be mentioned.
  • Inflamed tissue to which the compositions of the present invention can target is not particularly limited and includes sites of inflammation in any inflammatory disease.
  • inflammatory diseases include various autoimmune diseases (rheumatoid arthritis, SLE, scleroderma, polymyositis, Sjögren's syndrome, ANCA-associated vasculitis, Behcet's disease, Kawasaki disease, mixed cryoglobulinemia, polymorphism).
  • Sclerosis Guillain-Barre syndrome, myasthenia, type 1 diabetes, Basedow's disease, Hashimoto's disease, Addison's disease, IPEX, APS type-II, autoimmune myocarditis, interstitial pneumonia, bronchial asthma, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, inflammatory bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis), psoriasis, atopic dermatitis, hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, polyarthritic type of idiopathic juvenile arthritis, etc.) can include, but are not limited to.
  • Compounds having anti-inflammatory activity are not particularly limited, and examples include steroidal anti-inflammatory drugs (e.g., hydrocortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone), non-steroidal anti-inflammatory drugs (e.g., aspirin, ethenzamide, diflunisal, loxoprofen, ibuprofen, diclofenac, indomethacin, COX-2 inhibitors), antirheumatic drugs (e.g., gold sodium thiomalate, penicillamine, lobenzarit, auranofin, bucillamine, actarit, salazosulfapyridine, mizoribine, methotrexate, leflunomide, tacrolimus) , infliximab, etanercept, adalimumab, tocilizumab, abatacept), etc., but any known anti-inflammatory drug or therapeutic drug for the above inflammatory diseases can
  • miR-29a and miR-29b can be mentioned as miRNAs having therapeutic activity against inflammatory bowel disease (WO2018/199121).
  • compositions of the invention loaded with CpG oligonucleotides can target cells infected with various pathogens.
  • Infected cells to which the compositions of the invention can target are not particularly limited and include cells infected with any pathogen, including, for example, influenza virus, avian influenza virus, parainfluenza virus, adenovirus, SARS virus, AIDS virus, cytomegalovirus, hepatitis virus, Japanese encephalitis virus, measles virus, rubella virus, varicella-zoster virus, poliovirus, papillomavirus, herpes virus, mumps virus, rotavirus, cholera virus, rabies virus, Ebola hemorrhagic fever, Marburg Viruses that cause viral hemorrhagic fevers such as disease, Lassa fever, and Crimean-Congo hemorrhagic fever; , Rickettsia, Salmonella, etc.; Fungi such as Cryptococcus Aspergillus;
  • pathogen including, for example, influenza virus, avian influenza virus, parainfluenza virus, adenovirus
  • composition of the present invention carries a CpG oligonucleotide and is used as a vaccine adjuvant
  • the composition can also carry an antigen protein or peptide derived from the pathogen as a drug and as an active ingredient.
  • the concentration of the drug in the aqueous solution used to prepare the carbonate apatite particles can be appropriately set according to the purpose of use.
  • a compound having antitumor activity when used as a drug, it can be used at a concentration of, for example, 10-1000 ⁇ M, 20-500 ⁇ M, or 40-200 ⁇ M.
  • a nucleic acid such as siRNA, it can be used at, for example, 0.1 to 1000 nM, 0.5 to 500 nM, or 1 to 200 nM.
  • the formation of primary particles of carbonate apatite is carried out in the presence of a PEG derivative, resulting in the incorporation of the PEG derivative into the primary particles.
  • the term "primary particles” refers to particles obtained by adding a drug and a PEG derivative to an aqueous solution containing calcium ions, phosphate ions and bicarbonate ions to form carbonate apatite particles. , the drug and the PEG derivative are loaded, but by subsequent treatment (e.g., sonication or size fractionation), the final form of the carbonate apatite particles contained in the composition of the present invention is transformed into the PEG derivative and its reaction product. (eg, hydrolyzate) may not be included.
  • the PEG derivative is not particularly limited as long as it has one or more carboxylic acids or derivatives thereof or salts thereof at the terminal, and examples thereof include PEG derivatives represented by the following general formula.
  • R 1 examples include a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, a C 1-3 alkyl group (eg, methyl group), a C 1-3 alkoxy group (eg, methoxy group), an amino group, —COOR 2 ), and the like.
  • R 2 examples include, in addition to a hydrogen atom, any substituent capable of forming an ester with a carboxylic acid (eg, NHS, p-nitrophenyl).
  • PEG derivatives and reactants thereof eg, hydrolysis product
  • COOR 2 is an ester derivative
  • R 2 is preferably a substituent that readily non-enzymatically hydrolyzes to form a free carboxylic acid or a salt thereof (eg, alkali metal salt, ammonium salt, etc.).
  • X 1 and X 2 include, for example, an oxygen atom, a nitrogen atom, —Y—CO(CH 2 ) m — (m is an integer of 1 to 3), a C 1-5 alkyl group, a single bond, etc.
  • Y is a single bond, C 1-3 alkyl group (eg, methyl group), C 1-3 alkoxy group (eg, methoxy group), amino group, oxygen atom, sulfur atom, C 1-3 alkylamino group ( Examples include ethylamino group), C 1-3 alkylthio groups (eg, ethylthio group), and the like, and the average particle size is larger than 500 nm during particle formation or after ultrasonic treatment if necessary. It is not limited to them as long as it can produce carbonate apatite particles of 1000 nm or less.
  • the PEG derivative may have a branched structure with R 1 as a linker and the above general formula as a structural unit.
  • the average molecular weight of the PEG derivative is not particularly limited, for example, the average molecular weight can be 1000-20000.
  • the PEG derivative may have an average molecular weight of 1000-15000. Therefore, in the above general formula, n can be any integer that can give the average molecular weight.
  • the PEG derivative may have an average molecular weight of about 2,000 to about 10,000. As used herein, "about 2000” means 1500 or more and less than 2500, and "about 10000” means 9500 or more and less than 10500.
  • the PEG derivative may have an average molecular weight of 1000-5000. If the molecular weight of the PEG derivative is within this range, carbonated apatite particles having an average particle size of more than 500 nm and less than or equal to 1000 nm can be obtained without ultrasonic treatment or size fractionation after primary particle formation. More preferably, the average molecular weight of the PEG derivative in this embodiment may be 1000-3000, more preferably about 2000.
  • the PEG derivative is a compound having one or more terminal carboxylic acids or salts thereof.
  • a drug e.g., nucleic acid
  • the use of PEG derivatives having one or more terminal carboxylic acids or salts thereof advantageously allows formation of carbonate apatite particles immediately after dissolution of the derivatives.
  • PEG derivatives used in the present invention include the following six types. 1. MeO(CH 2 CH 2 O) n —CO(CH 2 ) 2 COO—NHS (average molecular weight 10000) 2. MeO(CH 2 CH 2 O) n —CO(CH 2 ) 2 COO—NHS (average molecular weight 2000) 3. MeO(CH 2 CH 2 O) n —CO(CH 2 ) 2 COOH (average molecular weight 2000) 4. MeO( CH2CH2O ) n- ( CH2 ) 2NHCO ( CH2 ) 2COOH ( average molecular weight 2000) 5. MeO(CH 2 CH 2 O) n —CH 2 COOH (average molecular weight 2000) 6. HOOC(CH 2 ) 2 COO—(CH 2 CH 2 O) n —CO(CH 2 ) 2 COOH (average molecular weight 2000)
  • the concentration of the PEG derivative in the aqueous solution used for producing carbonated apatite particles can be, for example, 0.25-4 mg/ml, preferably 0.5-3 mg/ml, more preferably 1-2 mg/ml.
  • each ion source, drug, and PEG derivative is not particularly limited, and the aqueous solution may be prepared in any mixing order as long as the desired carbonated apatite particles are obtained.
  • the aqueous solution may be prepared in any mixing order as long as the desired carbonated apatite particles are obtained.
  • the third solution can be mixed simultaneously or sequentially to prepare an aqueous solution, but is not limited thereto.
  • the aqueous solution for producing the carbonated apatite particles may contain components other than the above-described ion sources and other substances as long as the carbonated apatite particles are formed.
  • Ca or CO 3 in the carbonate apatite may be partially replaced by adding fluoride ions, chloride ions, Sr, Mn, etc. into the above composition in an aqueous solution.
  • the amounts of fluorine ions, chloride ions, Sr, and Mn to be added are preferably within a range that does not significantly affect the pH solubility and particle size range of the formed composite particles.
  • an aqueous solution for producing carbonated apatite particles can be prepared using various media and buffers for cell culture.
  • the carbonated apatite particles can be obtained by adjusting the pH of the aqueous solution containing each of the above ions to within the range of 6.0 to 9.0 and allowing it to stand (incubate) for a certain period of time.
  • the pH of the aqueous solution when forming the carbonated apatite particles is preferably 7.0 or higher, more preferably 7.1 or higher, still more preferably 7.2 or higher, even more preferably 7.3 or higher, particularly It is preferably 7.4 or higher, most preferably 7.5 or higher.
  • the pH of the aqueous solution when forming carbonated apatite particles is preferably 8.5 or less, more preferably 8.0 or less.
  • the temperature condition of the aqueous solution when forming the carbonated apatite particles is not particularly limited as long as the carbonated apatite particles are formed.
  • the upper limit of the temperature condition is usually 80°C or lower, preferably 70°C or lower.
  • the incubation time of the aqueous solution for forming the carbonated apatite particles is not particularly limited as long as the carbonated apatite particles are formed. 60 minutes. The presence or absence of particle formation can be confirmed, for example, by observing under a microscope.
  • the average particle size of the carbonate apatite particles contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is greater than 500 nm and 1000 nm or less, but preferably 600 nm to 800 nm.
  • the average particle size can be measured by a dynamic scattering method (DLS) using a device known per se (eg, nanoparticle analyzer nanoPartica SZ-100V2 (manufactured by Horiba Ltd.), etc.).
  • the particle size distribution by DLS exhibits a single peak.
  • the incubation described above is followed by sonication and sizing.
  • the amount of the PEG derivative or its reactant contained in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it can generate carbonate apatite particles having an average particle size of more than 500 nm and 1000 nm or less. It is usually 0.5 to 2.5% by weight, preferably 1 to 2% by weight, and more preferably 1.2 to 1.8% by weight.
  • the average particle size is more than 500 nm and 1000 nm or less, preferably 600 nm to 800 nm.
  • Compositions containing certain subsets of carbonate apatite particles can be obtained.
  • Covaris uses a frequency that is completely different from that of a general sonicator, and by concentrating the ultrasonic energy generated from a dish-shaped ultrasonic wave generator into one pole and irradiating it, it efficiently emits high output and stable energy. It is a special sonicator that has the characteristics that it can be used for sample processing.
  • the ultrasonic irradiation conditions include, for example, Peak Incident Power (PIP): 250 W, Duty Factor (DF): 50%, Cycles per Burst (CPB): 200, Processing time: 1200 seconds, etc.
  • PIP Peak Incident Power
  • DF Duty Factor
  • CPB Cycles per Burst
  • Processing time 1200 seconds
  • the ultrasonic treatment can be performed in the presence of albumin (that is, albumin added to the dispersion containing the carbonate apatite particles). This is because by performing ultrasonic vibration treatment in an environment where albumin and carbonate apatite particles coexist, carbonate apatite particles having a finer particle size can be obtained, and reaggregation of particles can be suppressed. is.
  • albumin that is, albumin added to the dispersion containing the carbonate apatite particles
  • the amount of albumin to be added to the dispersion containing carbonate apatite particles is not particularly limited as long as the effect of miniaturization and/or inhibition of reaggregation is obtained. ⁇ 10 mg/ml, more preferably 0.1 to 5 mg/ml can be added.
  • Confirmation that a subset of carbonate apatite particles having an average particle size of more than 500 nm and 1000 nm or less was obtained by the above-described ultrasonic treatment was performed by measuring the particle size distribution by DLS and calculating the average particle size. Preferably, it can be carried out by confirming that the particle size distribution exhibits a single peak. It can also be carried out by observing and photographing the dispersion after ultrasonication using an atomic force microscope (AFM) to confirm whether a clear image of particles can be obtained.
  • AFM atomic force microscope
  • the dispersion liquid after ultrasonic treatment is diluted and analyzed using AFM, fine particles of about 30 nm can be confirmed when an appropriate concentration of PEG derivative is added.
  • contamination with such fine particles may reduce the amount of nucleic acid loaded and adversely affect highly selective drug delivery to target tissues. Therefore, by size-fractionating the particles in the dispersion, a subset of carbonate apatite particles having a target average particle size of more than 500 nm and not more than 1000 nm (the peak area of the particle size distribution measured by DLS) is concentrated. Purification is preferred.
  • a method for size fractionation for example, a method known per se such as ultrafiltration and gel filtration chromatography can be used, but preferably, a plurality of hollow fiber membranes can be used in combination.
  • NOF SUNBRIGHT registered trademark
  • ME-100CS which is a PEG derivative with an average molecular weight of 10,000
  • a peak region appeared between 200 and 1000 nm in the particle size distribution after ultrasonic treatment measured by DLS. Therefore, using hollow fiber membranes with pore sizes of 1000 nm and 200 nm, the former excludes particles larger than 1000 nm, and then passes through the latter to exclude particles smaller than 200 nm, thereby concentrating the fraction with a particle size of 200-1000 nm. ⁇ Can be refined.
  • the composition of the present invention obtained as described above has a remarkably increased drug-loading capacity per particle as compared with conventional sCA, which means that the drug can be delivered to target tissues such as tumors and inflamed tissues. is one of the reasons for increasing
  • the drug is a nucleic acid such as miRNA
  • composition of the present invention can be administered parenterally (for example, intravenous administration, arterial (internal administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration, etc.).
  • parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions containing antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, tonicity agents and the like.
  • aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the formulation can be enclosed in a container such as an ampoule or a vial in units of unit doses or multiple doses. It can also be lyophilized by a method known per se and stored in such a state that it can be dissolved or suspended in an appropriate sterile vehicle just before use.
  • the composition of the present invention Compared to conventional sCA, the composition of the present invention has higher accumulation in target tissues such as tumors and reduced accumulation in normal organs such as the liver, resulting in sufficient treatment with a smaller amount of drug. Since it is effective, it can be used as a composition for in vivo drug delivery to mammals including humans.
  • the content of carbonate apatite particles in the composition is, for example, 0.1 to 100% by weight of the total composition.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the purpose of administration, administration method, type of disease, severity, and condition of the subject (sex, age, body weight, etc.). When administered, it is, for example, 0.02 mg/kg or more and 5 mg/kg or less, preferably 0.1 mg/kg or more and 5 mg/kg or less.
  • composition of the present invention can be used to introduce drugs into cells in vitro. In that case, it can be carried out by adding the composition of the present invention to the culture medium of the cells of interest and culturing them.
  • Target cells are not particularly limited, and any cells such as bacteria, actinomycetes, yeast, fungi, plant cells, insect cells, and animal cells can be used.
  • Example 1 Creation of cNaD1 (controlled inorganic nanoparticle drug 1) and PCANP (PEG-dependent size-controlled carbonate apatite nanoparticle) (1) Preparation of carbonate apatite particles incorporating PEG derivatives 0.37 g of NaHCO 3 , 1 M NaH 2 PO 4.2H 2 O (90 ⁇ L) and 1 M CaCl 2 (180 ⁇ L) were added to dissolve.
  • carbonated apatite particles containing no PEG derivative were similarly prepared. After incubation for 30 minutes, the amount of particles (turbidity) in the liquid was visually observed. When the PEG derivative with an average molecular weight of 10,000 was added, particles were formed, although the amount of particles was slightly smaller than when the PEG derivative was not added. . On the other hand, when a PEG derivative with an average molecular weight of 2,000 was added, the particle size was clearly reduced. Therefore, in subsequent experiments, a PEG derivative with an average molecular weight of 10,000 was used, and the carbonate apatite particles were prepared with an incubation time of 60 minutes.
  • Negative control miRNA-loaded carbonate apatite particles were left untreated or subjected to Senjyo ultrasonic treatment or Covaris ultrasonic treatment to investigate changes in particle size.
  • the particle size was measured by the dynamic scattering method (DLS) using a nanoparticle analyzer (nanoPartica SZ-100V2) manufactured by Horiba, Ltd.
  • the untreated or ultrasonically treated particles were photographed directly without dilution with an atomic force microscope (AFM) (compact atomic force microscope NaioAFM manufactured by Nanosurf). The results are shown in Figures 1-1 and 1-2.
  • Particles were formed by varying the amount of PEG derivative added to 25 mL buffer (25, 50, 100 mg), and observed by AFM after Covaris treatment and 50-fold dilution. As a result, when 25 and 50 mg of PEG derivatives were added, the particle sizes were measured to be 34 and 28 nm, respectively (Fig. 2). Therefore, in subsequent experiments, PEG derivatives were added at a concentration of 50 mg/25 mL unless otherwise specified.
  • mPES modified polyethersulfone
  • Pore size 1 ⁇ m, surface area: 95 cm 2
  • Molecular weight cutoff 750 kD, surface area: 20 cm 2
  • Molecular weight cutoff 100 kD, surface area: 20 cm 2 1) using hollow fiber membranes to remove particles larger than 1,000 nm and then using 2) hollow fiber membranes to remove particles smaller than 200 nm, corresponding to the peak area of cNaD1 measured by DLS Particle fractions between 200 and 1,000 nm were obtained.
  • particles smaller than 200 nm are passed through the hollow fiber membrane of 3) to remove particles smaller than 50 nm to obtain a particle fraction of 50 to 200 nm, and particles smaller than 50 nm are passed through the hollow fiber membrane of 4).
  • a particle fraction of 10-50 nm was obtained by removing particles smaller than 10 nm by passing through a filter.
  • Particles in which cNaD1 is thus divided into different size fractions by hollow fiber membranes are sometimes called PEG-dependent size-controlled carbonate apatite nanoparticles (PCANPs).
  • the nucleic acid amount of sCA-MIRTX was 28.5 ⁇ g, whereas the nucleic acid amount of PCANP-MIRTX was 3.5 ⁇ g (approximately one-eighth that of sCA-MIRTX) in 200-1,000 nm-sized particles. Nucleic acids in 50-200 nm and 10-50 nm size particles were below the detection limit. Nucleic acid content was also estimated by agarose gel electrophoresis, confirming the same results.
  • MIRTX-sensitive pancreatic cancer cell panc1 was subcutaneously implanted in nude mice to form subcutaneous tumors (2 cells/mouse).
  • the following 6 groups were compared for antitumor effect.
  • the results are shown in FIG.
  • the PCANP-MIRTX (200-1000 nm) administration group had significantly smaller tumor weights on day 12 than the Control (non-administration) group, the sCA-miR NC administration group, and the sCA-MIRTX administration group (P values are ⁇ 0.01, ⁇ 0.01, ⁇ 0.05).
  • the sCA-MIRTX administration group had significantly smaller tumors than the non-administration group, but no significant difference was observed between sCA-miR NC and sCA-miR NC.
  • Neither the PCANP-MIRTX(50-200) administration group nor the PCANP-MIRTX(10-50) administration group showed a significant difference in tumor weight from the non-administration group and the sCA-miR NC administration group.
  • a Senjyo-treated sample (sCA) of carbonate apatite particles loaded with fluorescently labeled nucleic acids with Alexa750 in the absence of PEG derivatives and a sample (sCA) processed with carbonate apatite particles loaded with fluorescent nucleic acids in the presence of PEG derivatives (SUNBRIGHT ME-100CS)
  • Apatite particles were treated with Covaris and fractionated to a particle size of 200-1,000 nm (PCANP-MIRTX(200-1000)).
  • Cancer cells HT-29 were administered through the tail vein of mice implanted. After 4 hours, the tumor and normal organs were excised and the fluorescence intensity was measured by IVIS. The results are shown in FIG.
  • the fluorescent nucleic acid loaded on PCANP is one-eighth the amount of sCA (5 ⁇ g), and in tumors it glows in the same way as when the nucleic acid loaded on sCA (40 ⁇ g) is administered, whereas in normal tumors such as the liver The accumulation in organs was greatly attenuated compared to sCA.
  • Particle size measurement The particle size distribution of PCANP (200-1000) was measured by DLS (using MALVERN's zeta potential measuring device Zetasizer Nano-ZS type), and the maximum peak was 717.4 nm. A single peak with an average particle size of 664.6 nm was obtained (Fig. 8).
  • Example 2 Preparation of cNaD2 using a PEG derivative with a lower molecular weight
  • PCANP(200-1000) has a reduced particle amount and nucleic acid amount compared to conventional sCA ( Figure 5) shows that when administered intravenously to mice, it accumulates in tumor tissue at levels equal to or greater than sCA and exhibits superior antitumor activity compared to sCA, while its accumulation in normal tissues is markedly reduced compared to sCA. was found (Figs. 6 and 7). Carbonated apatite particles with such new functions are called cNaD1 (controlled inorganic nanoparticle drug 1 ).
  • Example 1 (1) when SUNBRIGHT ME-20CS (NOF Corporation) with an average molecular weight of 2,000 was used as the PEG derivative, the amount of carbonate apatite particles was significantly reduced. It was suggested that particles with properties similar to cNaD1 may be formed without the Therefore, we formed carbonate apatite particles cNaD2 loaded with nucleic acid in the presence of a PEG derivative (SUNBRIGHT ME-20CS), and evaluated its antitumor effect and tumor/normal organ accumulation.
  • SUNBRIGHT ME-20CS NOF Corporation
  • the amount of nucleic acid was 20 ⁇ g/dose for the sCA-administered group and 5 ⁇ g/dose for the cNaD2-administered group, on days 0, 2, 3, 5, 7, 9, 11, and 13, a total of 8 doses.
  • the results are shown in FIG.
  • the sCA-136 group showed no significant suppression of tumor growth despite administration of four times the amount of nucleic acid as in the cNaD2-136 group.
  • the tumor size and tumor weight were significantly reduced in the cNaD2-136 group, which received only 5 ⁇ g each time.
  • the amount of nucleic acid that has been shown to have an antitumor effect with sCA-miRNA and sCA-siRNA so far was 40-50 ⁇ g, so by using cNaD2, even a mere 5 ⁇ g of nucleic acid has an antitumor effect. That is epoch-making.
  • sCA-NC negative control miRNA
  • sCA-miRNA miR-136 or MIRTX
  • cNaD2-miRNA miR-136 or MIRTX
  • mice and 6 tumors were used without administration of siRNA.
  • a control group in which 20 ⁇ g/time of negative control siRNA loaded on sCA was intravenously injected in parallel was also set (3 mice, 6 tumors). The results are shown in FIG. cNaD2-Sdc4 siRNA markedly suppressed proliferation of supercancer stem cells.
  • Tumor/organ accumulation PDX patient derived xenograft
  • PDX patient derived xenograft
  • 25 ⁇ g of negative control siRNA (NC siRNA) labeled with Alexa750 was loaded onto sCA. It was injected intravenously via the tail vein.
  • N siRNA negative control siRNA
  • Alexa750-labeled NC siRNA were loaded on cNaD2 and injected intravenously.
  • IVIS was used to examine the accumulation of fluorescent nucleic acid in the tumor.
  • cNaD2 was used, even at a dose of 5 ⁇ g of nucleic acid, the tumor accumulation increased more than when 25 ⁇ g of sCA was administered.
  • nucleic acids in the blood is high, such as in the liver, so the accumulation of nucleic acids in normal organs was observed with IVIS 4 hours later.
  • sCA accumulated in the liver, lung, kidney, and spleen, but cNaD2 showed almost no nucleic acid accumulation (Fig. 12-2). Comparing the average radiative efficiencies, when the same 25 ⁇ g of nucleic acid was administered, sCA accumulated more than 10 times more than cNaD2 in the liver and more than 4 times more in the lung and spleen.
  • N siRNA negative control siRNA
  • CaCl 2 total amount of Ca: 5.8 mg
  • the nucleic acid load of cNaD2 increased with the passage of time after dissolution of the PEG derivative, and the amount of nucleic acid per amount of Ca (NA/Ca ratio) was particularly high two to three days after dissolution of the PEG derivative.
  • the PEG derivative solution As the PEG derivative solution, the PEG derivative was dissolved in water, and after 15 minutes, 1 day, and 2 days, the same experiment was performed using three different solutions, and particles were formed in the absence of the PEG derivative.
  • the case (sCA) and particle performance were compared.
  • Table 4 shows the results.
  • the nucleic acid loading of cNaD2 was remarkably higher than that of sCA, but the nucleic acid loading increased with time after dissolution of the PEG derivative, and the NA/Ca ratio was the highest two days after dissolution of the PEG derivative.
  • Example 3 Production of cNaD (cNaD3-cNaD6) Using PEG Derivatives with a Terminal Carboxylic Acid (1) Nucleic Acid Loading Capacity of Particles Using Monomethylmonocarboxylic Acid PEG
  • carboxylic acid and N - A PEG derivative having an ester with succinimide (NHS) was used, but the amount of nucleic acid in the PCANP2 particles formed increased with the passage of time after dissolution of the PEG derivative, indicating that the terminal ester was gradually hydrolyzed. , suggesting the possibility that the nucleic acid loading capacity of particles increases as the number of molecules with free carboxylic acids at their ends increases.
  • monomethylmonocarboxylic acid PEG (C1-Iris, C1-Hamari) has a nucleic acid-loading capacity equal to or greater than that of cNaD2, and can load significantly more nucleic acids than sCA.
  • Figures 15-1 and 15-2 show the results of administration with a constant amount of Ca (0.1 mg).
  • Particles prepared using monomethylmonocarboxylic acid PEG Handai-C1, Hamari-C1 showed about three times the accumulation of sCA (Fig. 15-1).
  • sCA monomethylmonocarboxylic acid
  • PEG monomethylmonocarboxylate nucleic acid accumulation was low (Fig. 15-2). Comparing the average radiation efficiencies, PEG monomethylmonocarboxylate accumulated less than one-fifth of sCA in the liver.
  • Table 5 shows the dosage in each group when the amount of Ca was kept constant. PEG monomethyl monocarboxylate gave a higher NA/Ca ratio and delivered more nucleic acid than sCA (Table 5).
  • Figures 16-1 to 16-4 show the results of administering a constant amount of nucleic acid (15 ⁇ g). Nucleic acid concentration was measured using NanoDrop, and IVIS was used to confirm that the amount of fluorescence contained inside the particles was equivalent before administration. Particles prepared using monomethyl monocarboxylic acid PEG (Handai-C1, Hamari-C1) showed more than twice the accumulation of sCA in tumors after 1 hour (Fig. 16-1). After 4 hours, all tumor accumulations were attenuated (Fig. 16-2).
  • cNaD4 CH3O ( CH2CH2O ) n- ( CH2 ) 2NHCO(CH2)2 - COOH ( average molecular weight 2000) 2 )
  • cNaD5 CH3O ( CH2CH2O ) n - CH2COOH (average molecular weight 2000)
  • cNaD6 HOOC( CH2 )2COO-( CH2CH2O ) n - CO( CH2 ) 2 - COOH (average molecular weight 2000))
  • the ratio of nucleic acid uptake to calcium in the particles is cNaD4 (amide bond exists between PEG and carboxyl group) and cNaD3 (ester bond exists between PEG and carboxyl group).
  • Particles (cNaD6) prepared using dicarboxylic acid PEG showed accumulation equivalent to cNaD3 (more than twice that of sCA), while sCA, Pegylation, and HO-PEG-OH groups showed accumulation in normal organs including the liver.
  • cNaD6 the accumulation of nucleic acids was as low as with cNaD3. Comparing the average radiative efficiencies, in the liver, PEG dicarboxylate showed accumulation less than one-fifth that of sCA, similar to PEG monomethylmonocarboxylate.
  • cNaD3 Carbonic apatite particles (cNaD3) loaded with MIRTX were prepared and administered to nude mice (4 mice, 2 tumors/mouse) subcutaneously implanted with MIRTX-sensitive colon cancer cells DLD1. Tumor effects were investigated. MIRTX-loaded cNaD3 was administered to mice through the tail vein on day 1 when the tumor size reached 60 mm 3 . A dose of 25 ⁇ g/dose of nucleic acid was administered on days 1, 3, 6, 8, 10, and 13 a total of 6 times. The results are shown in FIG. Significant reduction in tumor size was observed on day 15 in the cNaD3-MIRTX administration group compared to the non-administration group (Parent) (Fig. 19).
  • Example 4 Accumulation of PCANP in Inflamed Tissue Carbonic apatite particles loaded with a negative control siRNA (NC siRNA) labeled with Alexa750 in the presence of a PEG derivative (SUNBRIGHT ME-100CS) were treated with Covaris (cNaD1-Alexa750), and human It was intravenously injected into the tail vein of SKG mice (purchased from CLEA Japan) that spontaneously develop autoimmune arthritis that is immunopathologically very similar to rheumatoid arthritis. For comparison, sCA loaded with Alexa750-labeled NC siRNA was similarly administered. The accumulation of fluorescent nucleic acid in the inflamed joints of the extremities after 40 minutes and in the liver after 45 minutes was observed by IVIS.
  • NC siRNA negative control siRNA labeled with Alexa750 in the presence of a PEG derivative
  • Covaris cNaD1-Alexa750
  • Luminescence in the lower abdomen indicates retention of the fluorescent substance (Alexa750) in the urine in the bladder, and luminescence in the upper abdomen indicates accumulation of Alexa750 in the liver.
  • Example 5 Incorporation of PEG Derivatives into cNaD2 and cNaD3 X-ray diffraction (XRD) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT- IR) was used to analyze physical properties.
  • XRD X-ray diffraction
  • FT- IR Fourier transform infrared spectroscopy
  • EDTA.2Na.2H 2 O 100 mg
  • fumaric acid.2Na 10.0 mg
  • the weight of EDTA.2Na.2H 2 O in the 1 H NMR measurement sample was calculated.
  • 1 H NMR of each sample was measured, and the ratio of the integrated value of disodium fumarate and PEG was substituted into the prepared calibration curve to calculate the weight of PEG contained in the dried cNaD1.
  • the ratio of PEG contained in dried cNaD1 was 1.2-1.8% (w/w) (Table 6).
  • Example 6 Zeta potential of cNaD2 and cNaD3 sCA (with Senjyo ultrasonic treatment), cNaD2 and cNaD3 (none loaded with nucleic acid) prepared under the same conditions except for the presence or absence and type of PEG derivative was measured using a Zetasizer Plate reader. As a result, the zeta potential of all particles was around 0, but it shifted slightly positive when the PEG derivative was incorporated (Table 7).
  • the carbonate apatite particles of the present invention When administered in vivo, the carbonate apatite particles of the present invention have higher accumulation in lesions such as tumor tissues, and markedly reduced accumulation in liver and other normal organs. Therefore, it is extremely useful as a safe and effective drug delivery composition that exhibits desired therapeutic effects with a smaller amount of drug.

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Abstract

本発明は、病巣へのより高い集積性と、肝臓をはじめとする正常臓器への集積の低減化とを実現し、以て、より少ない薬物量で十分な治療効果を奏し得る安全かつ有効なＤＤＳ技術を提供する。具体的には、薬物を搭載してなる炭酸アパタイト粒子を含有する組成物であって、該粒子の平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下であり、末端に１以上のカルボン酸もしくはその誘導体又はその塩を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体の存在下で一次粒子が形成され、該一次粒子にＰＥＧ誘導体が取り込まれていることを特徴とする、組成物を提供する。

Description

薬物送達用組成物、その製造方法及びその用途
　本発明は、標的組織・臓器への高い集積性を有し、かつ正常臓器への集積が十分に低減された薬物送達用組成物、その製造方法及びその用途に関する。
　細胞への非ウイルス性の核酸導入法としてリン酸カルシウム共沈殿法が知られている。この方法は、低毒性・非免疫原性で、操作が簡便である等の利点を有するが、核酸の導入効率や発現効率の低さが欠点である。
　赤池らは、炭酸アパタイト（水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の水酸基の一部が炭酸基で置換された化学構造を有する）を担体として用いることで、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの核酸導入効率を向上させた（特許文献１、非特許文献１）。即ち、核酸と炭酸アパタイトから構成される複合体粒子をｐＨ８．０からｐＨ６．０に変化させた場合において、ｐＨ６．０に変化させてから所定時間内に、ｐＨ８．０において存在していた前記複合体粒子の少なくとも５０％が溶解する細胞導入剤を開示している。複合体粒子は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、エンドソームから細胞質へ放出される。エンドソーム内のｐＨは酸性（約ｐＨ５.５）であるため、取り込まれた複合体粒子は、ｐＨ７前後からｐＨ５といった外部ｐＨの変化にさらされることにより、複合体粒子は速やかに溶解して核酸を放出し、高い細胞導入効率が得られる。
　しかし、炭酸アパタイト粒子は凝集しやすく、マウスに静注するとすぐに血管塞栓を起こしてマウスが即死するため、ｉｎ　ｖｉｖｏ投与ができなかった。
　そこで、本発明者らは、試験管等の洗浄に通常用いられる超音波洗浄器を用いて、従来の炭酸アパタイト粒子に対して超音波処理を行うことで、平均粒子径を５０ｎｍ以下に細分散化することに成功し、動物への血管投与を可能にした。この微粒子は細胞への物質の取り込み効率を顕著に向上させるとともに、抗腫瘍活性を有する薬物を搭載して腫瘍モデルマウスに静脈内投与すると、腫瘍組織に効率よく該薬物を送達させる一方、リポソームやアテロコラーゲンと比べて肝臓や腎臓への集積が低減され、従来よりも少量の薬物により抗腫瘍活性を大きく向上させることに成功し（特許文献２、非特許文献２）、該炭酸アパタイト微粒子をスーパー炭酸アパタイト（ｓＣＡ）と命名した。本発明者らは、種々のｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡ等の治療活性を有する小ＲＮＡ分子やその他の薬物をｓＣＡ粒子に搭載し、動物にｉｎ　ｖｉｖｏ投与することにより、がんをはじめとする種々の疾患に対する治療効果を実証している（例えば、非特許文献３及び４等の総説、非特許文献５を参照）。
　しかしながら、カニクイザルへのｓＣＡ単独での静脈内投与により、肝機能異常が認められたことから（非特許文献２）、ｓＣＡを用いても肝臓等の正常臓器に依然として集積することが示唆された。またｓＣＡに代表される無機イオンをベースとしたシステムは遺伝子の病巣へのデリバリー効率が低いことが問題視されている（非特許文献３）。
　このように、ヒトへの医薬用途に安全に利用するためには、病巣へのより高い集積性と、肝臓をはじめとする正常臓器への集積の低減化を実現する薬物送達システム（ＤＤＳ）技術の開発が必須である。
特許第4536655号公報 特許第5436650号公報
Gene. 2006;376(1):87-94. PLoSOne. 2015 Mar 4;10(3):e0116022. doi: 10.1371/journal.pone.0116022. Cancers 2020, 12,1852;doi:10.3390/cancers12071852 Journal of Oncology Volume 200, Article ID 8029721, 14 pages https://doi.org/10.1155/2020/8029721 Mol Cancer Ther. 2018 May;17(5):977-987. doi: 10.1158/1535-7163.
　本発明の目的は、病巣へのより高い集積性と、肝臓をはじめとする正常臓器への集積の低減化とを実現し、以て、より少ない薬物量で十分な治療効果を奏し得る安全かつ有効なＤＤＳ技術を提供することである。
　本発明者らは、ｓＣＡを用いた薬物導入では、標的組織・臓器（例、がん病巣）だけでなく、正常臓器である肝臓、脾臓、肺などにも依然として集積し、特に肝臓は高い集積を示すことを見出した（図７）。本発明者らは、その原因として、超音波処理により平均粒子径が５０ｎｍ以下の粒子が多数を占めるようになった後も、肉眼的にミクロンサイズの粒子が依然として存在する点に着目した（非特許文献２）。そこで、ｓＣＡ粒子のろ過、レーザーによるナノ粒子化、別の破砕処理の使用、ｓＣＡ粒子表面のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾など、鋭意検討を重ねたが、いずれも巨大粒子の残存を解消するには至らなかった。
　次に、本発明者らは、ｓＣＡ粒子表面をＰＥＧ化するのではなく、粒子が形成する際に、ＰＥＧを「くぎ」のように取り込ませて、それに破砕処理を組み合わせることにより微粒子化を図ることを着想した。そこで、平均分子量が２０００のＰＥＧ誘導体と１００００のＰＥＧ誘導体を用いて、炭酸アパタイト作製時のバッファーに初めからＰＥＧ誘導体を添加したところ、前者では、ＰＥＧ誘導体なしの場合と比べて肉眼的にｓＣＡ粒子量（液体の混濁度）が少なくなったので、分子量１００００のＰＥＧ誘導体を用いて検討を行った。その結果、従来の水槽式超音波洗浄処理や湿式破砕処理では、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）観察では粒子が大きすぎて明瞭な像は得られなかったが、Ｃｏｖａｒｉｓと呼ばれる特殊超音波処理を用いた場合、ＡＦＭで粒子が明瞭に同定できる程度に分散化が達成され、動的散乱法（ＤＬＳ）でも単一のピークが得られ、平均粒子径は６５０ｎｍとなった。強力なＣｏｖａｒｉｓ超音波処理を加えても、粒子内の核酸は水槽式超音波洗浄処理の場合と同程度に分解されずに保全された。
　粒子形成時にＰＥＧ誘導体を添加したｓＣＡにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３４ａ）を搭載し超音波処理したものを、ｍｉＲ－３４ａ感受性の大腸癌細胞に添加したところ、Ｃｏｖａｒｉｓ処理したｓＣＡは、水槽式超音波洗浄処理した従来のｓＣＡと同程度の細胞障害性を示した。
　ＤＬＳで測定したＣｏｖａｒｉｓ処理粒子の平均粒子径は６５０ｎｍであったが、５０倍希釈してＡＦＭで測定すると微小な粒子は３０ｎｍ前後であり、ＤＬＳで測定したものが粒子の容積として大部分を占めたので、それが核酸の抗腫瘍効果をもたらすと考え、検証を行った。中空糸膜を用いて、１０～５０ｎｍ、５０～２００ｎｍ及び２００～１０００ｎｍの粒子にサイズ分画し、各画分に搭載された核酸（ＭＩＲＴＸ：非特許文献５）量を測定したところ、２００～１０００ｎｍの画分に従来のｓＣＡの８分の１量の核酸が存在し、それより小さい画分では検出限界以下であった。ＭＩＲＴＸ感受性の膵癌細胞を皮下移植したヌードマウスに各画分及び従来のｓＣＡをそれぞれ静脈内投与したところ、２００～１０００ｎｍの画分は、ｓＣＡに搭載された核酸量の８分の１の核酸量にもかかわらず、従来のｓＣＡよりも有意に腫瘍の増殖を抑制した。一方、それよりも小さい粒子径の画分は腫瘍増殖抑制効果を示さなかった。
　以上より、本発明者らは、２００～１０００ｎｍの画分が抗腫瘍効果の本体であることを実証した。また、このようにして作成した新しいＤＤＳをｃＮａＤ１（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｄｒｕｇ１）と命名した。
　蛍光標識した核酸をｓＣＡ又はｃＮａＤ１に搭載し、担癌マウスに静脈内投与した後にマウスの腫瘍と正常臓器を摘出し、蛍光強度を測定したところ、ｃＮａＤ１に搭載した蛍光核酸はｓＣＡの８分の１量で腫瘍ではｓＣＡを投与した場合と同じように光り、一方、肝臓をはじめとする正常臓器への集積はｓＣＡに比べて大きく低減された。
　ｃＮａＤ１がｓＣＡより顕著に少ない核酸量で、ｓＣＡよりも優れた治療効果を示したことから、本発明者らは、平均分子量２０００のＰＥＧ誘導体を用いて、粒子形成時にＰＥＧ誘導体を取り込ませた。その結果、驚くべきことに、平均分子量２０００のＰＥＧ誘導体を用いると、超音波処理や中空糸膜による分画処理を必要とせずに、ＤＬＳで平均粒子径７４０ｎｍの単一ピークを示し、そのまま薬物送達用担体として使用することができた。ｃＮａＤ１の場合と同様に、ｓＣＡよりも顕著に少ない投与量で有意に優れた抗腫瘍効果を奏し、一方、ｓＣＡと同等の高用量を投与しても、正常組織への集積はほとんど認められなかった。そこで、平均分子量２０００のＰＥＧ誘導体を用いて調製した粒子を、ｃＮａＤ２と命名した。
　次に、ｃＮａＤ２において、ＰＥＧ誘導体溶解からの時間経過による粒子性能を経時的に調べたところ、ＰＥＧ誘導体溶解から２、３日後に粒子形成を行った場合に、取り込んだＣａ量あたりの取り込んだ核酸量（ＮＡ／Ｃａ比）が最も高くなり、核酸搭載効率が向上することが明らかとなった。ここで用いたＰＥＧ誘導体は、一端がメチル化され、他端にカルボン酸とＮ－ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）とのエステルが付加された誘導体であり、加水分解されやすい性質を有する。本発明者らは、加水分解が進行するにつれて粒子中の核酸量が増加することから、末端の５員環は不要ではないかと考え、モノメチル化ＰＥＧから末端が遊離カルボン酸のＰＥＧ誘導体を合成し、これを用いて粒子を作成して核酸搭載量をｃＮａＤ２と比較した。その結果、合成したいずれのモノメチルモノカルボン酸ＰＥＧを用いて作った粒子も、ｃＮａＤ２と同等もしくはそれ以上の核酸を搭載することができた。モノメチルモノカルボン酸ＰＥＧを用いて作った粒子に蛍光標識した核酸を搭載して、担癌マウスへの投与によりの腫瘍及び肝臓への集積を調べたところ、ｓＣＡと比べて腫瘍への蓄積は顕著に増大し、肝臓への集積は顕著に低減された。一方、末端にカルボン酸を有しない通常のＰＥＧを用いた場合は、ｓＣＡと同等もしくはそれ以下の低い腫瘍特異性を示した。
　以上のことから、ｃＮａＤに用いるＰＥＧとしては、末端に１以上のカルボン酸を有するＰＥＧ誘導体が好ましいことが示唆されたので、本発明者らは、さらに４種のモノ－又はジカルボン酸ＰＥＧを調製して粒子を作成し、これら（ｃＮａＤ３～ｃＮａＤ６）に蛍光核酸を搭載させて担癌マウスに静脈内投与すると、ｃＮａＤ１やｃＮａＤ２と同様に優れた腫瘍集積性と肝臓をはじめとする正常臓器への集積が低減することを確認した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［項１］
　薬物を搭載してなる炭酸アパタイト粒子を含有する組成物であって、該粒子の平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下であり、末端に１以上のカルボン酸もしくはその誘導体又はその塩を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体の存在下で一次粒子が形成され、該一次粒子にＰＥＧ誘導体が取り込まれていることを特徴とする、組成物。
［項２］
　前記ＰＥＧ誘導体の平均分子量が１０００～２００００である、項１に記載の組成物。［項３］
　前記組成物が、前記ＰＥＧ誘導体及び／又はその反応物を含有する、項１又は２に記載の組成物。
［項４］
　前記ＰＥＧ誘導体の平均分子量が１０００～５０００である、項３に記載の組成物。
［項５］
　前記ＰＥＧ誘導体が末端に１以上のカルボン酸又はその塩を有する、項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
［項６］
　薬物が核酸である、項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
［項７］
　薬物が抗腫瘍活性を有する、項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
［項８］
　さらにアルブミンを含有する、項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
［項９］
　項１に記載の組成物の製造方法であって、薬物及びＰＥＧ誘導体を搭載してなる炭酸アパタイト粒子を、一点集中型超音波照射装置を用いて超音波処理することを含む、方法。
［項１０］
　薬物及びＰＥＧ誘導体を搭載してなる炭酸アパタイト粒子が、薬物及びカルシウムイオンを含む第１の溶液、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含む第２の溶液並びにＰＥＧ誘導体を混合することにより調製される、項９に記載の方法。
［項１１］
　中空糸膜を用いて、請求項１に記載の組成物を濃縮することをさらに含む、項９又は１０に記載の方法。
［項１２］
　項１～８のいずか１項に記載の組成物を含有してなる、薬物送達用組成物。
［項１３］
　薬物が抗腫瘍活性を有し、標的組織が腫瘍である、項１２に記載の薬物送達用組成物。
［項１４］
　薬物が抗炎症活性を有し、標的組織が炎症組織である、項１２に記載の薬物送達用組成物。
　本発明によれば、病巣へのより高い集積性を有し、かつ肝臓をはじめとする正常臓器への集積が低減され、より少ない薬物量で十分な治療効果を奏する安全かつ有効な薬物送達用組成物が提供される。
PEG誘導体の非存在下に粒子形成させた炭酸アパタイト粒子の超音波処理による粒子径の変化を示す図である。 PEG誘導体（SUNBRIGHT ME-100CS）の存在下に粒子形成させた炭酸アパタイト粒子の超音波処理による粒子径の変化を示す図である。 PEG誘導体（SUNBRIGHT ME-100CS）の添加量の粒子形成に及ぼす影響を示す図である。 超音波処理及び湿式破砕処理後の粒子中の核酸をアガロースゲル電気泳動で検証した結果を示す図である。 超音波処理の方法を変えてもmiR-34aによる細胞障害能はPEG誘導体の添加の有無にかかわらず同等であることを示す図である。 sCA-MIRTXとPCANP-MIRTXの各サイズ分画の核酸（MIRTX）搭載量の測定結果を示す図である。MIRTXは非特許文献５に記載の抗腫瘍活性を有するmicroRNAである。 MIRTXを搭載したsCAとPCANP-MIRTXの各サイズ分画による抗腫瘍効果を示す図である。 sCAとPCANPの200～1,000 nmのサイズ分画に搭載されたAlexa750標識NC(Negative Control) siRNAの腫瘍及び正常臓器への取り込みを示す図である。 PCANP (200-1000nm) の粒子サイズを示す図である。 大腸癌DLD1に対するsCA及びcNaD2に搭載されたmiR-136の治療効果を示す図である。 大腸癌患者由来PDX (patient derived xenograft) から作った大きな腫瘍 (600mm3) に対するcNaD2に搭載されたmicroRNAの治療効果を示す図である。 膵臓癌Panc-1から作製した癌幹細胞モデル細胞に対するcNaD2に搭載されたSdc4 siRNAの治療効果を示す図である。 Alexa750標識NC siRNAをsCA又はcNaD2に搭載して担癌マウスに投与してから1時間後の腫瘍への核酸の集積を示す図である。 Alexa750標識NC siRNAをsCA又はcNaD2に搭載して担癌マウスに投与してから4時間後の正常臓器への核酸の集積を示す図である。 cNaD2の粒子サイズを示す図である。 モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（sCA-C1-Iris, sCA-C1-Hamari）、cNaD2及びsCAの核酸搭載量の比較を示す図である。上段は粒子量あたりの核酸量、下段はCa量あたりの核酸量を示す。 モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（Handai-C1, Hamari-C1）、HO-PEG-OHの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子、sCA及びsCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）にAlexa750標識NC siRNAを搭載し、Ca量を一定（0.1 mg）にして担癌マウスに投与してから1時間後の腫瘍への核酸の集積を示す図である。 モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（Handai-C1, Hamari-C1）、HO-PEG-OHの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子、sCA及びsCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）にAlexa750標識NC siRNAを搭載し、Ca量を一定（0.1 mg）にして担癌マウスに投与してから4時間後の正常臓器への核酸の集積を示す図である。 モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（Handai-C1, Hamari-C1）、HO-PEG-OHの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子、sCA及びsCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）にAlexa750標識NC siRNAを搭載し、核酸量を一定（15 μg）にして担癌マウスに投与してから1時間後の腫瘍への核酸の集積を示す図である。 図１6－１の経時的変化を示す図である。モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（Handai-C1, Hamari-C1）、HO-PEG-OHの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子、sCA及びsCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）にAlexa750標識NC siRNAを搭載し、核酸量を一定（15 μg）にして担癌マウスに投与してから1時間後（左パネル）及び4時間後（右パネル）の腫瘍への核酸の集積を示す。 モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（Handai-C1, Hamari-C1）HO-PEG-OHの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子、sCA及びsCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）にAlexa750標識NC siRNAを搭載し、核酸量を一定（15 μg）にして担癌マウスに投与してから4時間後の正常臓器への核酸の集積を示す図である。 図１6－３の経時的変化を示す図である。モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（Handai-C1, Hamari-C1）、HO-PEG-OHの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子、sCA及びsCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）にAlexa750標識NC siRNAを搭載し、核酸量を一定（15 μg）にして担癌マウスに投与してから1時間後（左パネル）及び4時間後（右パネル）の正常臓器への核酸の集積を示す。 sCA、sCAの表面をPEG修飾した粒子（Pegylation）及びcNAD3～cNAD6の各粒子を構成する核酸とカルシウムの比率（μg/mg）を示す図である。 ジカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（cNaD6）は、モノメチルモノカルボン酸PEGの存在下で作製した炭酸アパタイト粒子（cNaD3）と同様の腫瘍、肝臓への集積を示すことを表す図である。Alexa750標識NC siRNAを搭載し、核酸量を一定（15 μg）にして担癌マウスに投与したときの核酸の集積を示す。 大腸癌DLD1に対するcNaD3に搭載されたMIRTXの治療効果を示す図である。 sCA、用時調製又は凍結乾燥保存したcNaD3に搭載されたAlexa750標識NC siRNAのマウス皮下腫瘍及び肝臓への取り込みを示す図である。 Alexa750標識NC siRNAをsCA又はcNaD１に搭載してリウマチモデルマウスに投与してから40分後の四肢の炎症関節への核酸の集積を示す図である。 Alexa750標識NC siRNAをsCA又はcNaD１に搭載してリウマチモデルマウスに投与してから45分後の肝臓への核酸の集積を示す図である。 sCA、cNaD2、cNaD3（sCA-C1-HAMARI, sCA-C2-Handai）及びPEG-OHを用いて作製した炭酸アパタイト粒子（sCA-SIGMA(-OH)）のX線回折解析の結果を示す図である。
　本発明は、薬物を搭載してなる炭酸アパタイト粒子を含有する組成物であって、該粒子の平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下であり、ＰＥＧ誘導体の存在下で一次粒子が形成され、該一次粒子にＰＥＧ誘導体が取り込まれていることを特徴とする、組成物（以下、「本発明の組成物」ともいう。）を提供する。
　本発明において使用できる炭酸アパタイト及び炭酸アパタイト粒子は公知である。炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の水酸基（ＯＨ-)の一部を炭酸基（ＣＯ３ ２-）にて置換した化学構造を有し、一般式Ｃａ１０－ｍＸｍ（ＰＯ４）６（ＣＯ３）１－ｎＹｎで表すことができる。ここで、Ｘは、炭酸アパタイトにおけるＣａを部分的に置換しうる元素であればよく、例えば、Ｓｒ、Ｍｎ、希土類元素等を挙げることができる。ｍは、通常０以上１以下の正数であり、好ましくは０以上０．１以下であり、より好ましくは０以上０．０１ 以下であり、更に好ましくは０以上０．００１以下である。Ｙは、炭酸アパタイトにおけるＣＯ３を部分的に置換しうる単位であり、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ等を例示することができる。ｎは、通常０以上０．１以下の正数であり、好ましくは０以上０．０１以下であり、より好ましくは０以上０．００１以下であり、更に好ましくは０以上０．０００１以下である。
　炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることが出来る。例えば、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する水溶液を調製することにより得ることが出来る。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
　水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常０．１ｍＭ以上であり、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１ｍＭ以上である。カルシウムイオン濃度の上限は、通常１Ｍ以下であり、好ましくは１００ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
　水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常０．１ｍＭ以上であり、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１ｍＭ以上である。リン酸イオン濃度の上限は、通常１Ｍ以下であり、好ましくは１００ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
　水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常１．０ｍＭ以上であり、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上である。炭酸水素イオン濃度の上限は通常１０Ｍ以下であり、好ましくは１Ｍ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下である。
　カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源は、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの塩を水溶液に添加することができる。具体的には、カルシウムイオン源としてＣａＣｌ２またはＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを用いることができ、リン酸イオン源としてＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを用いることができ、炭酸イオン源としてＮａＨＣＯ３を用いることができる。
　炭酸アパタイト粒子に他の物質を包含させる場合は、炭酸アパタイト粒子を形成する際に、他の物質を水溶液に添加することができる。当該「他の物質」として、任意の薬物及び後述のＰＥＧ誘導体が挙げられる。薬物の種類は特に制限されないが、炭酸アパタイト粒子を細胞又は生体への物質の運搬体として用いる場合は、種々の生理活性物質を用いることができる。本明細書において、「搭載」とは、他の物質を運搬可能な状態で炭酸アパタイト粒子と当該他の物質とが任意の態様で接着し、複合体化している状態を含む。従って、炭酸アパタイト粒子の内側だけでなく、外側に当該他の物質が接着した状態も、本発明における「搭載」に含まれる。また、本明細書において、炭酸アパタイト粒子と当該他の物質との関係について「取り込み」等の用語を用いる場合、「搭載」と実質的に同義である。
　上記薬物としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、sｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー等の核酸、酵素、ペプチド又はタンパク質、各種ペプチド性ホルモン等のポリペプチド、各種抗がん剤、中枢神経系疾患治療薬、各種抗生物質、末梢神経疾患治療薬、感覚器官疾患治療薬、循環器官疾患治療薬、呼吸器官系疾患治療薬、消化器官系疾患治療薬、ホルモン製剤、泌尿生殖器官疾患治療薬、外皮疾患治療薬、歯科口腔疾患治療薬、ビタミン剤、滋養強壮薬、細胞賦活化薬、抗アレルギー薬、抗炎症薬等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの薬物は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。薬物が核酸の場合、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、それらのキメラ分子であってもよい。また、核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸の長さに特に制限はないが、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、sｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー等の小核酸分子が挙げられる。
　好ましい一実施態様においては、該薬物として、抗腫瘍活性を有する化合物を挙げることができる。本発明の組成物が標的化し得るがん種は特に制限されず、任意のがんが挙げられる。例えば、上皮細胞由来の癌であり得るが、非上皮性の肉腫や血液がんであってもよい。より具体的には、例えば、消化器のがん（例えば、食道がん、胃がん、十二指腸がん、大腸がん（結腸がん、直腸がん）、肝がん（肝細胞がん、胆管細胞がん）、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、肛門がん）、泌尿器のがん（例えば、腎がん、尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣（睾丸）がん）、胸部のがん（例えば、乳がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん））、生殖器のがん（例えば、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がん）、卵巣がん、外陰がん、膣がん）、脳腫瘍、頭頸部のがん（例えば、上顎がん、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、甲状腺がん）、皮膚のがん（例えば、基底細胞がん、有棘細胞がん）、口腔がん、血液のがん（白血病、悪性リンパ腫）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、固形がん、より好ましくは大腸がん、膵臓がん、乳がん、食道がん、胃がん、前立腺がん等、より好ましくは大腸がん、膵臓がん等が挙げられる。
　本発明の組成物に搭載される抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤； メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤； ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ブレオマシイン塩酸塩、プペロマシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセル等の微小管阻害剤； アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤； イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤、プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド、サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド、プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブ等が挙げられるが、それらに限定されない。
　低分子量の抗がん剤（例、分子量１０００以下）は、直接又はヒドラゾン等を介して水溶性ポリマーに連結して高分子薬剤とすることもできる。水溶性ポリマーの種類は特に制限されないが、例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＰＨＰＭＡ）、スチレン・マレイン酸共重合体等が挙げられる。
　あるいは、抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＤ２０抗体等の抗体もしくはそのフラグメント、光線力学療法の標的となる感受性物質（例、ポリマー型ｚｉｎｃ　ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ（Ｐ－ＺｎＰＰ）やアルブミン結合型ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ　ｇｒｅｅｎ（ＩＣＧ））等が挙げられる。
　別の好ましい実施態様において、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンス核酸（アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、安定化人工核酸ＢＮＡ、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー等が挙げられる。
　より具体的には、癌幹細胞の増殖抑制効果を有する種々のｍｉＲＮＡ（例、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８）（ＷＯ２０１８／１８１８７７）；大腸癌、特にＫＲＡＳ遺伝子に変異の有する大腸癌に対して優れた治療効果を有するｍｉＲ４６８９及びｍｉＲ４６８５－３ｐ（ＷＯ２０１５／１３３５２２）；胆管癌、肺癌、急性白血病等の種々のがんに対して抗腫瘍効果が示されているｍｉＲ－２９ｂ；癌化に関与するＫＬＦ５、細胞周期の制御に重要なＴＦＤＰ１及びＭＤＭ２の発現を抑制すｍｉＲ－４７１１－５ｐ（ＷＯ２０２０／２４６３８０）；癌幹細胞で高発現するシンデカン４（ＳＤＣ４）に対するｓｉＲＮＡ（ＷＯ２０２００３６１８３）；がんワクチンアジュバントとして有効なＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくはＫ型又はＤ型ＣｐＧオリゴヌクレオチド、より好ましくはＫ型でＤ型の特性を合わせ持つＫ３型のＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＷＯ２０１８／０３０３３８）などが挙げられるが、それらに限定されず、抗腫瘍活性を有することが既知の任意の核酸を用いることができる。また、前記核酸は、天然の核酸だけでなく、天然の核酸と同等以上の活性を有する限り、そのヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されていたり、欠失・挿入又は付加を含む変異核酸であってもよい。例えば、ｍｉＲ－２９ｂの変異体として、ＷＯ２０１５／１３３５２１に開示される核酸を挙げることができる。
　ｍｉＲＮＡは、成熟型ｍｉＲＮＡであってもよく、またヘアピン型前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）や、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの一部が切断されたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡであってもよい。ｓｉＲＮＡも、成熟型ｓｉＲＮＡであってもよく、ヘアピン型の前駆体（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。また、ｐｒｅ－ｉＲＮＡやｓｈＲＮＡのループ部分がボナック社の開発したアミノ酸（例、プロリン、グリシン、リシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、グリシルグリシン）誘導体リンカーで置換されたものであってもよい。
　本発明の組成物に搭載される核酸は、ヌクレアーゼに対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；ホスホロチオエート化、アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
　本発明の組成物は、腫瘍組織だけでなく、他の疾患部位、例えば、炎症組織に対しても高い選択性をもって薬物を送達することができるので、該組成物に搭載する薬物として、抗炎症作用を有する化合物を挙げることができる。本発明の組成物が標的化し得る炎症組織は特に制限されず、任意の炎症性疾患における炎症部位が挙げられる。例えば、炎症性疾患として、各種の自己免疫疾患（関節リウマチ、ＳＬＥ、強皮症、多発性筋炎、シェーグレン症候群、ＡＮＣＡ関連性血管炎、ベーチェット病、川崎病、混合性クリオグロブリン血症、多発性硬化症、ギランバレー症候群、筋無力症、１型糖尿病、バセドウ病、橋本病、アジソン病、ＩＰＥＸ、ＡＰＳ　ｔｙｐｅ－ＩＩ、自己免疫性心筋炎、間質性肺炎、気管支喘息、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎、溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性若年性関節炎の多関節炎型等）等をあげることができるが、それらに限定されない。
　抗炎症作用を有する化合物としては特に制限されず、例えば、ステロイド系抗炎症薬（例、ヒドロコルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン）、非ステロイド性抗炎症薬（例、アスピリン、エテンザミド、ジフルニサル、ロキソプロフェン、イブプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、ＣＯＸ－２阻害薬）、抗リウマチ薬（例、金チオリンゴ酸ナトリウム、ペニシラミン、ロベンザリット、オーラノフィン、ブシラミン、アクタリット、サラゾスルファピリジン、ミゾリビン、メトトレキサート、レフルノミド、タクロリムス、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、トシリズマブ、アバタセプト）等が挙げられるが、既知の任意の抗炎症薬又は上記炎症性疾患に対する治療薬を用いることができる。
　好ましい一実施態様においては、炎症性腸疾患に対する治療活性を有するｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂを挙げることができる（ＷＯ２０１８／１９９１２１）。
　また、前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、がんワクチンアジュバントとしてだけでなく、種々の感染症に対するワクチンアジュバントとしても使用することができる。従って、別の実施態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを搭載する本発明の組成物は、種々の病原体に感染した細胞を標的とすることができる。本発明の組成物が標的化し得る感染細胞は特に制限されず、任意の病原体に感染した細胞が挙げられるが、例えば、例えば、インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＡＩＤＳウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、コレラウイルス、狂犬病ウイルス、エボラ出血熱、マールブルグ病、ラッサ熱、クリミア・コンゴ出血熱等のウイルス性出血熱の原因となるウイルス等；ジフテリア、破傷風、結核菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、ブドウ球菌、緑膿菌、百日咳菌、炭疽菌、リッケチア、サルモネラ等；クリプトコッカス・アスペルギルス等の真菌；マラリア原虫等の病原性生物等に感染した細胞を挙げることができる。
　本発明の組成物がＣｐＧオリゴヌクレオチドを搭載し、ワクチンアジュバントとして使用される場合、該組成物は、薬物として、さらに有効成分として、上記病原体由来の抗原タンパク質もしくはペプチドを搭載することもできる。
　炭酸アパタイト粒子の作製に用いる水溶液中の薬物の濃度は、その使用目的に応じて適宜設定することができる。薬物として、抗腫瘍活性を有する化合物を用いる場合は、例えば、１０～１０００μＭ、２０～５００μＭ、又は４０～２００μＭの濃度で用いることができる。ｓｉＲＮＡ等の核酸を用いる場合は、例えば、０．１～１０００ｎＭ、０．５～５００ｎＭ、又は１～２００ｎＭで用いることができる。
　本発明の組成物は、最終形態としてそれを含むか否かにかかわらず、炭酸アパタイトの一次粒子の形成がＰＥＧ誘導体の存在下で行われ、その結果、一次粒子に該ＰＥＧ誘導体が取り込まれることを特徴とする。ここで「一次粒子」とは、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する水溶液に、薬物及びＰＥＧ誘導体を添加して、炭酸アパタイトの粒子を形成させた際に得られる粒子を意味し、薬物及びＰＥＧ誘導体を搭載するが、その後の処理（例えば、超音波処理やサイズ分画）により、本発明の組成物中に含まれる最終形態としての炭酸アパタイト粒子は、ＰＥＧ誘導体やその反応物（例、加水分解産物）を含んでいなくともよい。
　前記ＰＥＧ誘導体は、末端に１以上のカルボン酸もしくはその誘導体又はその塩を有するものであれば特に制限されず、例えば、下記一般式で表されるＰＥＧ誘導体を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　Ｒ１としては、例えば、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、Ｃ１－３アルキル基（例、メチル基）、Ｃ１－３アルコキシ基（例、メトキシ基）、アミノ基、－ＣＯＯＲ２）等が挙げられるが、ＰＥＧ誘導体やその反応物（例、加水分解産物）が、粒子形成時や、必要に応じて超音波処理を行った後で、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子を生成させ得る限り、それらに限定されない。
　Ｒ２としては、例えば、水素原子の他、カルボン酸とエステルを形成し得る任意の置換基（例、ＮＨＳ、ｐ－ニトロフェニル）が挙げられるが、ＰＥＧ誘導体やその反応物（例、加水分解産物）が、粒子形成時や、必要に応じて超音波処理を行った後で、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子を生成させ得る限り、それらに限定されない。ＣＯＯＲ２がエステル誘導体の場合、Ｒ２としては、非酵素的に容易に加水分解して遊離のカルボン酸又はその塩（例、アルカリ金属塩、アンモニウム塩等）を生じる置換基であることが好ましい。
　Ｘ１及びＸ２としては、例えば、酸素原子、窒素原子、－Ｙ－ＣＯ（ＣＨ２）ｍ－（ｍは１～３の整数）、Ｃ１－５アルキル基、単結合等が挙げられ、
　Ｙとしては、単結合、Ｃ１－３アルキル基（例、メチル基）、Ｃ１－３アルコキシ基（例、メトキシ基）、アミノ基、酸素原子、硫黄原子、Ｃ１－３アルキルアミノ基（例、エチルアミノ基）、Ｃ１－３アルキルチオ基（例、エチルチオ基）等が挙げられるが、粒子形成時や、必要に応じて超音波処理を行った後で、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子を生成させ得る限り、それらに限定されない。
　あるいは、ＰＥＧ誘導体は、Ｒ１をリンカーとして、上記一般式を構成単位とする分岐鎖型の構造を有していてもよい。
　ＰＥＧ誘導体の分子量は特に制限されないが、例えば、平均分子量が１０００～２００００であり得る。好ましくは、ＰＥＧ誘導体の平均分子量は１０００～１５０００であり得る。従って、上記一般式において、ｎは当該平均分子量を与え得る任意の整数であり得る。特に好ましい一実施態様においては、ＰＥＧ誘導体の平均分子量は約２０００～約１００００であり得る。本明細書において「約２０００」とは、１５００以上２５００未満であることを意味し、「約１００００」とは、９５００以上１０５００未満であることを意味する。
　好ましい一実施態様においては、ＰＥＧ誘導体の平均分子量は１０００～５０００であり得る。ＰＥＧ誘導体の分子量が当該範囲にあれば、一次粒子の形成後に超音波処理やサイズ分画を行わずとも、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子を得ることができる。より好ましくは、本実施態様におけるＰＥＧ誘導体の平均分子量は１０００～３０００であり得、さらに好ましくは約２０００であり得る。
　別の好ましい実施態様においては、ＰＥＧ誘導体が末端に１以上のカルボン酸又はその塩を有する化合物である。上記一般式において、ＣＯＯＲ２がエステル誘導体であるＰＥＧ誘導体の場合、ＰＥＧ誘導体を溶解してから２、３日後に、炭酸アパタイト粒子を形成させると、粒子あたりもしくはＣａ量あたりの薬物（例、核酸）搭載量が最大となる。これは、ＰＥＧ誘導体が徐々に加水分解され、末端に遊離のカルボン酸を生じることで、核酸搭載量が増大するためである。従って、末端に１以上のカルボン酸又はその塩を有するＰＥＧ誘導体を使用することにより、該誘導体の溶解直後に炭酸アパタイト粒子の形成を行うことができ、有利である。
　特に好ましい実施態様において、本発明で使用されるＰＥＧ誘導体として、以下の６種を挙げることができる。
１．ＭeＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ－ＮＨＳ（平均分子量１００００）
２．ＭeＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯ－ＮＨＳ（平均分子量２０００）
３．ＭeＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ（平均分子量２０００）
４．ＭeＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ（平均分子量２０００）
５．ＭeＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２ＣＯＯＨ（平均分子量２０００）
６．ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２ＣＯＯ－(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ（平均分子量２０００）
　炭酸アパタイト粒子の作製に用いる水溶液中のＰＥＧ誘導体の濃度は、例えば、０．２５～４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５～３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１～２ｍｇ／ｍｌであり得る。
　各イオン供給源、薬物及びＰＥＧ誘導体の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び薬物を含有する第１の溶液を調製するとともに、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液並びにＰＥＧ誘導体を含有する第３の溶液を調製し、第１～第３の溶液を同時もしくは逐次混合して水溶液を調製することができるが、それらに限定されない。
　炭酸アパタイト粒子を作製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるＣａまたはＣＯ３を部分的に置換してもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎの添加量は、形成される複合体粒子のｐＨ溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を作製するための水溶液は、細胞培養用の各種培地やバッファーを利用して調製することもできる。
　炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のｐＨを６．０～９．０の範囲に調整し、一定時間放置（ インキュベート） することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨは、好ましくは７．０以上であり、より好ましくは７．１以上、更に好ましくは７．２以上あり、より更に好ましくは７．３以上、特に好ましくは７．４以上、最も好ましくは７．５以上である。一方、炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨは、好ましくは８．５以下であり、より好ましくは８．０以下である。
　炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常１０℃以上であり、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３７℃以上である。一方、温度条件の上限は通常８０℃以下であり、好ましくは７０℃以下である。
　炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液のインキュベート時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常１分～２４時間であり、好ましくは２分～２時間、より好ましくは３～６０分間である。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
　本発明の組成物中に含まれる炭酸アパタイト粒子の平均粒子径は、５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下であれば特に制限されないが、好ましくは、６００ｎｍ～８００ｎｍであり得る。平均粒子径は、自体公知の装置（例、ナノ粒子解析装置　ｎａｎｏＰａｒｔｉｃａ　ＳＺ－１００Ｖ２（堀場製作所製）等）を用いて、動的散乱法（ＤＬＳ）により測定することができる。ＤＬＳによる粒子径分布が単一ピークを示すことが好ましい。平均粒子径を上記範囲内になるように制御することにより、従来のｓＣＡよりも粒子あたりの薬物搭載量が増大し、ｓＣＡと比べて、腫瘍や炎症組織などの標的組織により高い集積性を有し、かつ肝臓をはじめとする正常臓器への集積が低減され、より少ない薬物量で十分な治療効果を示すという本発明の顕著な効果が得られる。
　ＰＥＧ誘導体として、平均分子量が１０００～５０００、好ましくは１０００～３０００、より好ましくは約２０００のＰＥＧ誘導体を使用する場合、上記のインキュベーションを実施することにより、一次粒子の形成後に超音波処理やサイズ分画を行わずとも、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である、好ましくは、６００ｎｍ～８００ｎｍである炭酸アパタイト粒子を得ることができる。
　従って、当該炭酸アパタイト粒子を含む本発明の組成物は、粒子形成時に使用したＰＥＧ誘導体又はその反応物（例、加水分解産物）を含有している。
　前記の実施態様において、本発明の組成物中に含有されるＰＥＧ誘導体又はその反応物の量は、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子を生成させ得る限り特に制限されないが、通常０．５～２．５重量％であり、好ましくは１～２重量％、より好ましくは１．２～１．８重量％であり得る。
　一方、ＰＥＧ誘導体として、平均分子量が５０００より大きなもの（例、平均分子量６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、１００００以上）を使用する場合、上記のインキュベーションを実施することにより形成される炭酸アパタイト粒子は、依然として平均粒子径が大きく（例えば、平均分子量１００００のＰＥＧ誘導体である日油製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ－１００ＣＳを用いた場合、ＤＬＳで測定した平均粒子径は２２００ｎｍ）、従来のｓＣＡ粒子作製に使用される水槽式超音波洗浄処理を実施しても、上記の本発明の炭酸アパタイト粒子の要件を満たさない。
　そこで、このような実施態様においては、Ｃｏｖａｒｉｓと呼ばれる一点集中型超音波照射装置を用いて超音波処理を行うことにより、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である、好ましくは、６００ｎｍ～８００ｎｍである炭酸アパタイト粒子のサブセットを含む組成物を得ることができる。
　Ｃｏｖａｒｉｓは、一般的なソニケーターとは全く異なる周波数を用い、ディッシュ状の超音波発生部より発生させた超音波エネルギーを一極に集中させて照射することで、高出力で安定したエネルギーを効率よくサンプル処理に利用できるという特徴を有する特殊な超音波処理装置である。当該装置として、例えば、エムエス機器株式会社のＣｏｖａｒｉｓ型　Ｓ２２０を用いることができる。また、超音波の照射条件としては、例えば、Ｐｅａｋ　Ｉｎｃｉｄｅｎｔ　Ｐｏｗｅｒ（ＰＩＰ）：２５０Ｗ、Ｄｕｔｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＤＦ）：５０％、Ｃｙｃｌｅｓ　ｐｅｒ　Ｂｕｒｓｔ（ＣＰＢ）：２００、処理時間：１２００秒等が挙げられるが、当業者であれば、製造者が提供する手引書に従って、適宜照射条件を変更することができる。
　超音波処理は、アルブミンの存在下（即ち、アルブミンを炭酸アパタイト粒子を含む分散液に添加した状態） で行うことができる。これは、アルブミンと炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有する炭酸アパタイト粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。
　炭酸アパタイト粒子を含む分散液中に添加するアルブミンの量は、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、０．０１～５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５～ １０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ程度添加することができる。
　上記の超音波処理により、平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子のサブセットが得られたことの確認は、ＤＬＳにより粒子径分布を測定し、平均粒子径を算出することにより、好ましくは粒子径分布が単一ピークを示すことを確認することにより行うことができる。また、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて、超音波処理後の分散液を観察・撮影し、明瞭な粒子の像が得られるかを確認することによっても行うことができる。
　超音波処理後の分散液を希釈してＡＦＭを用いて解析すると、適切な濃度のＰＥＧ誘導体を添加した場合、約３０ｎｍ程度の微小な粒子を確認することができる。このような微小な粒子の混入は、本発明の組成物を薬物送達用として用いた場合、核酸搭載量を低減させ、標的組織への選択性の高い薬物送達性に好ましくない影響を及ぼすおそれがあるので、分散液中の粒子をサイズ分画することで、目的とする平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子のサブセット（ＤＬＳで測定した粒子径分布のピーク領域）を濃縮・精製することが好ましい。サイズ分画の手法としては、例えば、限外ろ過やゲルろ過クロマトグラフィー等の自体公知の方法を用いることができるが、好ましくは、複数の中空糸膜を組み合わせて実施することができる。例えば、平均分子量１００００のＰＥＧ誘導体である日油製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ－１００ＣＳを用いた場合、ＤＬＳで測定した超音波処理後の粒子径分布では２００～１０００ｎｍの間でピーク領域が出現したので、孔径が１０００ｎｍと２００ｎｍの中空糸膜を用いて、前者で１０００ｎｍより大きな粒子を排除し、次いで、後者に通して２００ｎｍ未満を排除することで２００～１０００ｎｍの粒子径を有する画分を濃縮・精製することができる。
　上記のようにして得られる本発明の組成物は、従来のｓＣＡに比べて粒子あたりの薬物搭載能力が顕著に増大しており、そのことが腫瘍や炎症組織等の標的組織への薬物送達性をより高める一因となっている。本発明の組成物の薬物搭載能力は、例えば薬物がｍｉＲＮＡ等の核酸の場合、粒子（ＯＤ６００＝１）あたり、あるいはＣａ量（１ｍｇ）あたりの核酸搭載量（μｇ）として、通常１５０～５００、好ましくは２００～４００程度であり得る。
　本発明の組成物は、そのまま、あるいは、炭酸アパタイト粒子を遠心分離により沈殿させて、生体への投与に適した溶媒に再分散させることにより、非経口的な投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な医薬組成物として調製することができる。非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、自体公知の方法により凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
　本発明の組成物は、従来のｓＣＡと比べて、腫瘍などの標的組織により高い集積性を有し、かつ肝臓をはじめとする正常臓器への集積が低減され、より少ない薬物量で十分な治療効果を奏するので、ヒトを含む哺乳動物などへのｉｎ　ｖｉｖｏ薬物送達用組成物として用いることができる。該組成物中の炭酸アパタイト粒子の含有量は、例えば、組成物全体の０．１ないし１００重量％である。
　本発明の組成物の投与量は、投与の目的、投与方法、疾患の種類、重篤度、投与対象の状態（性別、年齢、体重など）によって異なるが、ｍｉＲＮＡ等の核酸を搭載させて全身投与する場合、例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ以上５ｍｇ／ｋｇ以下であり、０．１ｍｇ/ｋｇ以上５ｍｇ/ｋｇ以下が望ましい。
　また、本発明の組成物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞内に薬物を導入するために使用することができる。その場合、目的とする細胞の培地中に本発明の組成物を添加して培養することにより実施することができる。標的の細胞は特に制限されず、例えば、細菌、放線菌、酵母、カビ、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の任意を細胞に用いることができる。
　以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　cNaD1 (controlled inorganic nanoparticle drug 1) 及びPCANP (PEG-dependent size-controlled carbonate apatite nanoparticle）の創製
（１）PEG誘導体を取り込ませた炭酸アパタイト粒子の調製
　蒸留水100 mLに、0.37 gのNaHCO3、1 M NaH2PO4・2H2O (90μL) 及び1 M CaCl2(180 μL) を加えて溶解した。これに、式：CH3O-(CH2CH2O)n-CO(CH2)2COO-NHSで表される分子量の異なる2種のPEG誘導体（SUNBRIGHT ME-20CS (日油); 平均分子量2,000及びSUNBRIGHT ME-100CS (日油); 平均分子量10,000）のいずれかを200 mg加え、pH 7.5に調整した。50 mLのファルコンチューブに該バッファー溶液を25 mL分注し（以下、「25 mLバッファー」ともいう）、50 μgの核酸と1 M CaCl2(100 μL) を加えて、37℃でインキュベートした。比較のために、PEG誘導体を加えない炭酸アパタイト粒子を同様に調製した。
　30分間インキュベート後に、液体中の粒子量（混濁度）を肉眼的に観察したところ、平均分子量10,000のPEG誘導体を添加した場合は、添加しない場合より粒子量はやや少ないものの粒子は形成されていた。一方、平均分子量2,000のPEG誘導体を添加した場合は、明らかに粒子量が少なくなった。そこで、以後の実験では、平均分子量10,000のPEG誘導体を用いることとし、また、インキュベーション時間を60分間として炭酸アパタイト粒子を調製した。
（２）粒子の分散化処理の検討
　従来のsCA粒子作製に使用されている水槽式超音波洗浄処理、高出力な超音波エネルギーを効率よく照射することができる一点集中型超音波照射装置を用いた特殊超音波処理、並びに湿式微粒化装置を用いた湿式破砕処理を実施し、粒子の分散化の程度を比較した。
（２－１）超音波処理
　水槽式超音波洗浄処理（以下、「Senjyo」と略記する場合がある）は、株式会社エスエヌディの超音波洗浄機US-101を用いて行った。上記（１）のファルコンチューブを水槽内に留置し、発振周波数38 kHz, 出力80 Wの設定で10分間超音波処理を行った。
　特殊超音波処理（以下、「Covaris」と略記する場合がある）では、エムエス機器株式会社のCovaris型　S220を使用して、以下の照射条件にて超音波照射を行った。
　PIP：250 W
　DF：50％
　CPB：200
　処理時間：1200 sec
　Negative control miRNAを搭載した炭酸アパタイト粒子を、未処理のまま、あるいはSenjyo超音波処理又はCovaris超音波処理をして、粒子径の変化を調べた。粒子径の測定には堀場製作所のナノ粒子解析装置（nanoPartica SZ-100V2) を用い、動的散乱法（DLS）により行った。また、未処理又は超音波処理した粒子を、希釈せずにそのまま原子間力顕微鏡（Atomic force microscope：AFM）（コンパクト原子間力顕微鏡NaioAFM　Nanosurf製）で撮影した。それらの結果を図１－１及び１－２に示す。
　PEG誘導体を添加しなかった場合、従来のsCA粒子の超音波処理（Senjyo）では、平均粒子径は1980 nmと大きく、測定範囲外の粒子が多数存在した。一方、Covaris処理の場合は、粒子サイズのピークは複数ではあるが、平均粒子径は740 nmと他に比べて小さくなっており、測定範囲外の粒子は比較的少なかった（図１－１上）。
　しかし、いずれの場合もAFMで撮影するには粒子が大きく、明瞭な像は得られなかった
（図１－１下）。
　一方、PEG誘導体をはじめにバッファーに加えると、各群の粒子径はやや小さくなった（図１－２上）。特にCovaris処理を行った場合、AFMで粒子が明瞭に同定できるほどに分散化が達成された（図１－２下）。平均粒子径は650 nmとなり、そのピークも１つになった（図１－２上）。PEG誘導体（平均分子量10,000）の存在下で炭酸アパタイト粒子を形成させた後Covaris処理を行った粒子をcNaD1 (controlled inorganic nanoparticle drug 1)と称する場合がある。
　25 mLバッファーに添加するPEG誘導体の量を変動（25、50、100 mg）させてそれぞれ粒子を形成させ、Covaris処理後に50倍に希釈してAFMで観察した。その結果、PEG誘導体を25、50 mg添加したところ、粒子サイズはそれぞれ34、28 nmと測定された（図２）。そこで、以後の実験では、特にことわらない限り、PEG誘導体を50 mg/25 mLの濃度で添加することとした。
（２－２）湿式破砕処理
　湿式破砕処理は、スギノマシン社の湿式微粒化装置（スターバーストminimo）を用いて、表１に示す条件にて行った。粒子径の測定は、DLS（装置はMALVERN社のゼータ電位測定装置ゼータサイザーナノ Nano-ZS型を用いた）により実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　結果を表２に示す。DLSで解析した結果、湿式破砕処理後も依然として1000 nm以上の粒子が残存していた。さらに、処理後の粒子は黒く変色しており、粒子の衝突によって熱が70～80℃になることで、変性する可能性が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２－３）核酸量の評価
　次に、アガロースゲル電気泳動によって炭酸アパタイト粒子に搭載されたNegative control miRNAの量を調べた。結果を図３に示す。該miRNA単独では25 bp付近にバンドがみられた。PEG誘導体を添加して作製した炭酸アパタイト粒子をSenjyo超音波処理した場合と、Covaris処理した場合とでは、粒子内のmiRNA量は同等であった。一方、セラミックスボールを20～30回衝突させて湿式破砕処理した場合（Starburst）は、大幅に核酸のロスが生じた。
　Senjyo超音波処理後の保全された核酸のin vivoでの効果は証明されているので（Mol Cancer Ther. 2018 May;17(5):977-987. doi: 10.1158/1535-7163; Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Sep 7;12:658-671. doi: 10.1016/j.omtn.2018.07.007; PLoS One. 2015 May 13;10(5):e0127119. doi: 10.1371/journal.pone.0127119; Mol Cancer Ther. 2014 Apr;13(4):976-85. doi: 10.1158/1535-7163; Br J Cancer. 2020 Mar;122(7):1037-1049. doi: 10.1038/s41416-020-0758-1; Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Mar 10;4(3):e231. doi: 10.1038/mtna.2015.5; PLoS One. 2015 Mar 4;10(3):e0116022. doi: 10.1371/journal.pone.0116022; Front Immunol. 2018 Apr 18;9:783. doi: 10.3389/fimmu.2018.00783; Mol Cancer Ther. 2015. PMID: 25904505）、Covaris処理した粒子でも同様の効果が期待された。
（２－４）細胞障害性評価
　miR-34aを搭載した炭酸アパタイト粒子（sCA-miR34a）にSenjyo超音波処理又はCovaris超音波処理を行った。得られた粒子を大腸癌細胞HCT116の培地に添加してインキュベートし、48時間後及び72時間後に、Cell counting kit-8（Dojindo）を用いて細胞生存率を測定し、各粒子のin vitroでの細胞障害性を評価した。本実験では、25 mLバッファーにPEG誘導体（SUNBRIGHT ME-100CS）を添加しないサンプル（peg0）、50 mg添加したサンプル（peg50）及び100 mg添加したサンプル（peg100）を調製し、試験した。peg0をSenjyo処理したものが従来のsCA粒子に相当する。sCA-miR34aで処理しなかったHCT116細胞を100%として、各時間での細胞生存率を算出した。その結果、Covaris処理した粒子は、PEG誘導体の添加の有無・添加量にかかわらず、Senjyo処理した粒子と同等（細胞生存率が48時間で約80%、72時間で約60%）の細胞障害性を示した（図４）。
（３）DDSの本体の同定
（３－１）粒子のサイズによる分離
　上記（２－１）で示されたように、25 mLバッファーにPEG誘導体（平均分子量10,000）を添加し、Covaris超音波処理を行った炭酸アパタイト粒子（cNaD1）の、DLSで測定した平均粒子径は650 nmであったが、蒸留水で50倍希釈してAFMで測定すると、微小な粒子のサイズは28～34 nmであった。DLSで測定したものが粒子の容積として大部分を占め、核酸の抗腫瘍効果をもたらすと想定されたため、このことを実証すべく粒子のサイズ分画を行った。
　サイズ分画には、以下の4種の修飾ポリエーテルスルホン（mPES）中空糸膜（Spectrum LABS. COM製）を使用した。
　1) 孔サイズ：1 μm, 表面積：95 cm2
　2) 孔サイズ：0.2 micrometer, 表面積：28 cm2
　3) 分画分子量：750 kD, 表面積：20 cm2
　4) 分画分子量：100 kD, 表面積：20 cm2
　1) の中空糸膜を用いて1,000 nmより大きな粒子を除去し、次いで2) の中空糸膜を用いて200 nmより小さな粒子を除去することで、DLSで測定したcNaD1のピーク領域に相当する200～1,000 nmの粒子画分を得た。さらに、200 nmより小さな粒子を3) の中空糸膜に通して50 nmより小さな粒子を除去することで50～200 nmの粒子画分を得、50 nmより小さな粒子を4) の中空糸膜に通して10 nmより小さな粒子を除去することで10～50 nmの粒子画分を得た。このようにcNaD1を中空糸膜によって異なるサイズ分画に分けた粒子をPEG-dependent size-controlled carbonate apatite nanoparticle（PCANP）と称することがある。
（３－２）核酸量の評価
　PEG誘導体の非存在下にMIRTX（miR-29b-1-5pの完全相補鎖；Mol Cancer Ther. 2018 (上述)）を搭載した炭酸アパタイト粒子をSenjyo処理したサンプル（sCA-MIRTX）、並びにPEG誘導体（SUNBRIGHT ME-100CS）の存在下にMIRTXを搭載した炭酸アパタイト粒子をCovaris処理し、上記のようにして3つにサイズ分画した各サンプル（PCANP-MIRTX）の核酸量を、超微量分光光度計NanoDrop（Thermo Scientific社）を用いて測定した。結果を図５に示す。sCA-MIRTXの核酸量は28.5 μgであったのに対し、PCANP-MIRTXの核酸量は、200～1,000 nmサイズの粒子中に3.5 μg（sCA-MIRTXの約8分の1）であった。50～200 nm及び10～50 nmサイズの粒子中の核酸は検出限界以下であった。
　アガロースゲル電気泳動でも核酸量の推定を行い、同じ結果であることを確認した。
（３－２）in vivo機能評価
　MIRTX感受性の膵癌細胞panc1をヌードマウスの皮下に移植し、皮下腫瘍（2個/匹）を作った。以下の6群で抗腫瘍効果を比較検討した。
　1) Control（非投与）群：マウス3匹, 腫瘍6個
　2) sCA-miR NC（PEG誘導体の非存在下にnegative control miRNAを搭載した炭酸アパタイト粒子をSenjyo処理した粒子）投与群：マウス3匹, 腫瘍6個
　3) sCA-MIRTX投与群：マウス4匹, 腫瘍8個
　4) PCANP-MIRTX(200-1000)投与群：マウス4匹, 腫瘍8個
　5) PCANP-MIRTX(50-200)投与群：マウス3匹, 腫瘍6個
　6) PCANP-MIRTX(10-50)投与群：マウス3匹, 腫瘍6個
　sCA-miR NC及びsCA-MIRTX投与群では20 μg/回、PCANP-MIRTX(200-1000)投与群では2.5 μg/回、PCANP-MIRTX(50-200)及びPCANP-MIRTX(10-50)投与群では検出感度以下の核酸を、day0, 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10に計8回尾静脈より投与した。結果を図６に示す。
　PCANP-MIRTX(200-1000nm)投与群は、Control(非投与)群、sCA-miR NC投与群、sCA-MIRTX投与群に比べてday12における腫瘍重量が有意に小さくなった (P値はそれぞれ<0.01, <0.01, <0.05)。
　一方、sCA-MIRTX投与群は、非投与群に比べて有意に腫瘍が小さくなったが、sCA-miR NCとの間には有意差を認めなかった。
　PCANP-MIRTX(50-200)投与群、PCANP-MIRTX(10-50)投与群も、非投与群、sCA-miR NC投与群と腫瘍重量に有意な差は認めなかった。
　次に、PEG誘導体の非存在下にAlexa750で蛍光標識した核酸を搭載した炭酸アパタイト粒子をSenjyo処理したサンプル（sCA）と、PEG誘導体（SUNBRIGHT ME-100CS）の存在下に蛍光核酸を搭載した炭酸アパタイト粒子をCovaris処理し、200-1,000 nmの粒子サイズに分画したサンプル（PCANP-MIRTX(200-1000)）を、粒子作製の翌日に遠沈、生理食塩水に再懸濁して、それぞれ大腸癌細胞HT-29を移植したマウスの尾静脈から投与した。4時間後に腫瘍と正常臓器を摘出し、IVISで蛍光強度を測定した。結果を図７に示す。PCANPに搭載した蛍光核酸はsCAの8分の１の量（5 μg）で、腫瘍ではsCAに搭載した核酸（40 μg）を投与した場合と同じように光り、一方、肝臓をはじめとする正常臓器への集積はsCAと比べて大きく減弱した。
（４）粒子径の測定
　PCANP(200-1000)の粒子径分布をDLS（装置はMALVERN社のゼータ電位測定装置ゼータサイザーナノ Nano-ZS型を用いた）により測定したところ、最大ピーク 717.4 nm, 平均粒子径664.6 nmの単一ピークが得られた（図８）。
実施例２　より低分子量のPEG誘導体を用いたcNaD2の作製
　実施例１（３）において、PCANP(200-1000)は従来のsCAに比べて粒子量及び搭載する核酸量は低減しているものの（図５）、マウスに静脈内投与すると、腫瘍組織にsCAと同等以上に集積し、sCAより優れた抗腫瘍活性を発揮する一方、正常組織への集積はsCAに比べて顕著に減弱することが見出された（図６，７）。このような新しい機能を備えた炭酸アパタイト粒子をcNaD１（contｒolled inorganic nanoparticle drug１）と呼称する。実施例１（１）において、PEG誘導体として平均分子量2,000のSUNBRIGHT ME-20CS（日油）を用いた場合に、炭酸アパタイトの粒子量が顕著に少なくなったのは、Covaris処理やサイズ分画を行うことなく、cNaD1と同様の特性を有する粒子が形成される可能性が示唆された。そこで、PEG誘導体（SUNBRIGHT ME-20CS）の存在下に核酸を搭載した炭酸アパタイト粒子cNaD2を形成させ、その抗腫瘍効果と腫瘍／正常臓器集積性を評価した。
（１）cNaD2の調製
　PEG誘導体として、SUNBRIGHT ME-20CS（日油）を用い、実施例１（１）と同様にして炭酸アパタイト粒子を作製した。インキュベーションは37℃で60分間実施した。
（２）抗腫瘍効果
（２－１）大腸癌DLD1に対するmiR-136搭載したcNaD2の治療効果
　miR-136感受性の大腸癌細胞DLD1を用いてヌードマウスに皮下腫瘍を作製し、sCAとcNaD2の両者で抗腫瘍効果を比較検討した（マウスは3-5匹、腫瘍は4-5個）。腫瘍サイズが100 mm3となった時点をday 0として、negative control miRNAを搭載したsCA（sCA-NC）、miRNA-136を搭載したsCA（sCA-136）、miRNA-136を搭載したcNaD2（cNaD2-136）をヌードマウスの尾静脈から投与した。核酸量として、sCA投与群は20 μg/回、cNaD2投与群は5 μg/回を、day 0, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13に計8回投与した。結果を図９に示す。コントロール（sCA-NC）群と比べて、sCA-136群では、核酸量としてcNaD2-136群の４倍量を投与しているにもかかわらず、有意な腫瘍増殖の抑制がみられなかった。一方、毎回5 μgしか投与しなかったcNaD2-136群では有意に腫瘍サイズと腫瘍重量が小さくなった。これまでにsCA-miRNAやsCA-siRNAで抗腫瘍効果を認めてきた核酸量は40-50 μgであったことから、cNaD2を用いることで、僅か5 μgの核酸量でも抗腫瘍効果を認めたことは画期的である。
（２－２）大きな腫瘍に対するcNaD2-miRNAの治療効果
　大腸癌患者由来のPDX（patient derived xenograft）を用いてヌードマウスに大きな皮下腫瘍を作製し、sCAとcNaD2の両者で抗腫瘍効果を比較検討した。マウスはsCA-NC 3匹、sCA-miRNA 4匹、cNaD2 4匹を用意し、マウス1匹につき腫瘍を2か所移植した。腫瘍サイズが600 mm3とかなり大きくなった時点をday 0として、sCA-NC (negative control miRNA), sCA-miRNA (miR-136又はMIRTX), cNaD2-miRNA (miR-136又はMIRTX)をヌードマウスの尾静脈から投与した。核酸量として、いずれの群も20 μg/回を day 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8に計9回投与した。結果を図１０に示す。コントロール（sCA-NC）群と比べて、sCA-miRNA群では腫瘍増殖の抑制がみられなかったが、cNaD2-miRNA群ではsCA-miRNAと比べてday8, day9で有意に腫瘍体積の縮小を認めた。
（２－３）癌幹細胞モデル細胞に対するcNaD2-Sdc4 siRNAの治療効果
　膵癌細胞株Panc-1を基に１細胞からヌードマウスに皮下腫瘍を作ることのできるスーパー癌幹細胞（super Panc-1 CSC）を作製した。これをヌードマウスに移植し、腫瘍体積が70 mm3を超えた時点をday 0として、cNaD2に搭載したSyndecan-4（SDC4）に対するsiRNA（cNaD2-Sdc4 siRNA）を、20 μg/回の核酸量でday 0, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9に計9回尾静脈から投与した（マウス4匹、腫瘍8個）。コントロールとして、siRNAを投与しないスーパー癌幹細胞移植マウス3匹、腫瘍6個をおいた。また、sCAに搭載したnegative control siRNAを20 μg/回、並行して静注した対照群もおいた（マウス3匹、腫瘍6個）。結果を図１１に示す。cNaD2-Sdc4 siRNAはスーパー癌幹細胞の増殖を著しく抑制した。
（３）腫瘍／臓器集積性
　ヌードマウスに大腸癌患者由来のPDX(patient derived xenograft) を移植して皮下腫瘍を作成し、Alexa750で標識したnegative control siRNA（NC siRNA）25 μgをsCAに搭載して尾静脈から静注した。同様にcNaD2にAlexa750標識NC siRNAを、それぞれ5, 10, 25 μg搭載して静注した。1時間後にIVISを用いて蛍光核酸の腫瘍への集積を調べた。その結果、cNaD2を使うと5 μgの核酸量でもsCAで25 μgを投与した以上に腫瘍集積は高まり、sCAと同じ25 μgの核酸量では、cNaD2はsCAの5倍以上の腫瘍集積を示した（図１２－１）。
　尾静脈注射後1時間では、肝臓などで血中の核酸濃度が高く反映されるため、4時間後に正常臓器への核酸の集積をIVISで観察した。sCAでは肝臓をはじめ、肺、腎臓、脾臓に集積がみられたが、cNaD2ではほとんど核酸の集積はみられなかった（図１２－２）。平均放射効率を比較すると、同じ25 μgの核酸を投与した場合、肝臓ではsCAはcNaD2の10倍以上、肺と脾臓では4倍以上の集積を示した。
（４）粒子径の測定
　cNaD2の粒子径分布をDLS（装置はMALVERN社のゼータ電位測定装置ゼータサイザーナノ Nano-ZS型を用いた）により測定したところ、最大ピーク 793.4 nm, 平均粒子径740.0 nmの単一ピークが得られた（図１３）。
（５）PEG溶解後の時間が粒子の核酸搭載能力に及ぼす影響
　ｃNaD2において、PEG誘導体溶解からの時間経過による粒子性能を経時的に調べた。
　蒸留水300 mLに、1.11 gのNaHCO3、1 M NaH2PO4・2H2O (270 μL) 及び1 M CaCl2(540μL) を加えて溶解し、pH 7.4に調整した。50 mLのファルコンチューブに該バッファー溶液を25 mL分注し、0.1 mg/mLのPEG誘導体（SUNBRIGHT ME-20CS (日油)）を0.5 mL（50 μg）加えた。該PEG誘導体溶液として、PEG誘導体を水に溶解してから、5分後、1時間後、8時間後、1日後、2日後及び3日後の6通りの溶液を使用した。10 μg/μLのnegative control siRNA (NC siRNA)(53.2 μg) と1 M CaCl2 (100 μL)(Ca量は合計5.8 mg) を加えて攪拌し、37℃で60分間インキュベートした。比較のために、PEG誘導体を加えない炭酸アパタイト粒子（sCA）を同様に調製した。インキュベーション終了後、4℃、12,000 rpmで遠心処理し、上清を除去して生理食塩水（pH 8）0.5 mLで粒子を集め、Ca濃度、核酸濃度を測定した。結果を表３に示す。cNaD2の核酸搭載量はPEG誘導体溶解から時間が経過するほど高くなり、PEG誘導体溶解から2～3日後に、Ca量あたりの核酸量（NA/Ca比）は特に高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　PEG誘導体溶液として、PEG誘導体を水に溶解してから、15分後、1日後、2日後の3通りの溶液を使用して同様の実験を行い、PEG誘導体の非存在下で粒子形成させた場合（sCA）と粒子性能を比較した。結果を表４に示す。cNaD2はsCAと比べて核酸搭載量が顕著に高かったが、やはりPEG誘導体溶解から時間が経過するほど核酸搭載量は高くなり、特にPEG誘導体溶解から2日後でNA/Ca比は最も高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例３　末端がカルボン酸のPEG誘導体を用いたcNaD（cNaD3～cNaD6）の作製
（１）モノメチルモノカルボン酸PEGを用いた粒子の核酸搭載能
　実施例１及び２では、末端にカルボン酸とN-スクシンイミド（NHS）とのエステルを有するPEG誘導体を用いたが、PEG誘導体溶解から時間が経過するに従って形成するPCANP2粒子中の核酸量が増加することから、末端のエステルが徐々に加水分解されて、末端に遊離カルボン酸を有する分子が増えるほど粒子の核酸搭載能が増大する可能性が示唆される。
　そこで、市販のメトキシPEG-OH（2 kDa）に無水コハク酸を反応させて、SUNBRIGHT ME-20CS (日油) の加水分解産物と同一構造のモノメチルモノカルボン酸PEG（C1-Iris, C1-Hamari）を合成し(IrisやHamariはモノメチルモノカルボン酸PEGを製造した会社名を示す；以下同様)、実施例２（５）と同様にして粒子を形成させ（cNaD3と総称する、cNaD3：CH3O (CH2CH2O)n-CO(CH2)2COOH (平均分子量2000)）、その核酸搭載能をsCAやcNaD2と比較した。結果を図１４に示す。モノメチルモノカルボン酸PEG（C1-Iris, C1-Hamari）はcNaD2と同等以上の核酸搭載能を有し、sCAと比べて顕著に多い核酸を搭載できることが示された。
（２）モノメチルモノカルボン酸PEGを用いた粒子の腫瘍／正常臓器集積性
　モノメチルモノカルボン酸PEG（Handai-C1, Hamari-C1：cNaD3）を用いてAlexa750で標識したNC siRNAを搭載した粒子を作製し、大腸癌由来PDXを皮下移植したヌードマウスに尾静脈より投与した。比較のために、PEG誘導体の非存在下で粒子形成させたsCA、HO-PEG-OH（Sigma）を用いて粒子形成させたもの、並びにsCAの表面をPEG修飾したもの（Pegylation）を、同様に担癌マウスに投与した。各サンプルにつき、Ca濃度と核酸濃度を測定し、Ca量又は核酸量を揃えて投与を行った。1時間後に腫瘍への集積を、4時間後に正常臓器への集積をIVISで観察した。
　Ca量を一定（0.1 mg）にして投与した結果を図１５－１及び１５－２に示す。モノメチルモノカルボン酸PEG（Handai-C1, Hamari-C1）を用いて作製した粒子では、sCAの約3倍の集積を示した（図１５－１）。一方、sCAやPegylation、HO-PEG-OH群では肝臓をはじめとする正常臓器への集積がみられたが、モノメチルモノカルボン酸PEGでは核酸の集積は低かった（図１５－２）。平均放射効率を比較すると、肝臓ではモノメチルモノカルボン酸PEG はsCAの5分の1以下の集積を示した。Ca量を一定にした場合の各群の投与量を表５に示した。モノメチルモノカルボン酸PEGではsCAと比べてNA/Ca比が高く、より多くの核酸が投与された（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　次に、核酸量を一定（15 μg）にして投与した結果を図１６－１～１６－４に示す。核酸濃度はNanoDropを用いて測定し、投与前にIVISにより粒子内部に含まれる蛍光量が同等であることを確認した。
　モノメチルモノカルボン酸PEG（Handai-C1, Hamari-C1）を用いて作製した粒子では、1時間後に腫瘍においてsCAの2倍以上の集積を示した（図１６－１）。4時間後では腫瘍への集積はいずれも減弱した（図１６－２）。一方、sCAやPegylation、HO-PEG-OH群では4時間後に肝臓をはじめとする正常臓器への集積がみられたが、モノメチルモノカルボン酸PEGでは核酸の集積は低かった（図１６－３）。平均放射効率を比較すると、肝臓ではモノメチルモノカルボン酸PEGはsCAの10分の1以下の集積を示した。1時間後では、sCAやPegylation、HO-PEG-OH群では更に高い集積を示したが、モノメチルモノカルボン酸PEGでは核酸の集積は低かった（図１６－４）。
（３）cNaD4～cNaD6の作製
　末端にカルボン酸を有するPEG誘導体cNaD3の効果が示されたので、更に以下の3種の末端にモノカルボン酸またはジカルボン酸を有するPEG誘導体を用い、実施例１（１）と同様にして炭酸アパタイト粒子（cNaD4～cNaD6）を新たに作製した。
　1) cNaD4：CH3O (CH2CH2O)n-(CH2)2NHCO(CH2)2-COOH (平均分子量2000)
　2) cNaD5：CH3O (CH2CH2O)n-CH2COOH (平均分子量2000)
　3) cNaD6：HOOC(CH2)2COO-(CH2CH2O)n-CO(CH2)2-COOH (平均分子量2000)）
　粒子中のカルシウム量に対する核酸の取り込み量の比率（NA/Ca ratio）はcNaD4（PEGとカルボキシル基との間にアミド結合が存在）ではcNaD3（PEGとカルボキシル基との間にエステル結合が存在）と同レベルであった。cNaD5ではやや低減したが、それでもsCAの2倍程度であった。PEG両端にカルボキシル基を有するジカルボン酸PEG誘導体を用いて作ったcNaD6でも、cNaD3と同程度の高いNA/Ca ratioを達成した(図１７)。
（４）ジカルボン酸PEGを用いた粒子の腫瘍／正常臓器集積性
　ジカルボン酸PEGを用いてAlexa750で標識したNC siRNAを搭載した粒子を作製し、大腸癌由来PDXを皮下移植したヌードマウスに尾静脈より投与した。比較のために、cNaD3、PEG誘導体の非存在下で粒子形成させたsCA、HO-PEG-OH（Sigma）を用いて粒子形成させたもの、並びにsCAの表面をPEG修飾したもの（Pegylation）を、同様に担癌マウスに投与した。各サンプルにつき、Ca濃度と核酸濃度を測定し、核酸量を一定（15 μg）にして投与を行った。1時間後に腫瘍と正常臓器への集積をIVISで観察した。その結果を図１８に示す。
　ジカルボン酸PEGを用いて作製した粒子(cNaD6)では、cNaD3と同等（sCAの2倍以上）の集積を示した一方、sCAやPegylation、HO-PEG-OH群では肝臓をはじめとする正常臓器への集積がみられたが、cNaD6では核酸の集積はcNaD3と同様に低かった。平均放射効率を比較すると、肝臓では、ジカルボン酸PEGはモノメチルモノカルボン酸PEGと同様、sCAの5分の1以下の集積を示した。
（５）cNaD3の抗腫瘍活性
　MIRTXを搭載した炭酸アパタイト粒子（cNaD3）を作製し、MIRTX感受性の大腸癌細胞DLD1を皮下移植したヌードマウス（4匹、腫瘍2個/匹）に投与して抗腫瘍効果を検討した。腫瘍サイズが60 mm3となった時点をday 1として、MIRTXを搭載したcNaD3をマウスの尾静脈から投与した。核酸量として25 μg/回を、day 1, 3, 6, 8, 10, 13に計6回投与した。結果を図１９に示す。cNaD3-MIRTX投与群では、非投与群（Parent）と比べて、day 15に有意な腫瘍サイズの縮小が認められた（図１９）。
（６）凍結乾燥したcNaD3の腫瘍／肝臓集積性
　ヌードマウスに大腸癌患者由来のPDXを移植して皮下腫瘍を作製し、Alexa750で標識したnegative control siRNA（NC siRNA）25 μgをsCAに搭載して尾静脈から静注した。同様にcNaD3にAlexa750標識NC siRNAを25 μg搭載して静注した。cNaD3として、用時調製したものと、凍結乾燥して長期保存したものとを用いた。1時間後に腫瘍への集積を、4時間後に肝臓への集積をIVISで観察した。その結果、いずれの場合もcNaD3を使うとsCAと比べて顕著な腫瘍集積を示し、一方、肝臓への集積はほとんど見られなかった（図２０）。
実施例４　PCANPの炎症組織への集積
　PEG誘導体（SUNBRIGHT ME-100CS）の存在下にAlexa750で標識したnegative control siRNA（NC siRNA）を搭載した炭酸アパタイト粒子をCovaris処理し（cNaD1-Alexa750）、ヒト関節リウマチと免疫病理学的に酷似した自己免疫性関節炎を自然発症するSKGマウス（日本クレアより購入）に尾静脈から静注した。比較のために、sCAにAlexa750標識NC siRNAを搭載して同様に投与した。40分後に四肢の炎症関節、45分後に肝臓への蛍光核酸の集積をIVISで観察した。その結果、cNaD1を使うとsCAと比べて四肢の炎症関節への顕著な集積を示し（図２１－１）、一方、肝臓への集積はほとんど見られなかった（図２１－２）。下腹部の発光は膀胱内に尿中の蛍光物質（Alexa750）が貯留したものを示し、上腹部の発光はAlexa750の肝臓への集積を示す。
実施例５　cNaD2及びcNaD3へのPEG誘導体の取り込み
　cNaD2及び2種のcNaD3（sCA-C2-Handai, sCA-C1-HAMARI）について、X線回折法（XRD）とフーリエ変換赤外分光法（FT-IR）を用いて物性解析を行った。比較のために、sCA及びPEG-OH（Sigma社製）を用いて作製した粒子（sCA-SIGMA(-OH)）についても、同様に解析した。XRDにはBurker AXS社製のX線回折装置（D8 ADVANCE）を、FT-IRには同社製のFT-IRTENSOR IIをそれぞれ使用した。XRDの結果、cNaD2、cNaD3及びsCA-SIGMA(-OH)では、PEG由来のピークが検出され、粒子中にPEGが取り込まれていることが示唆された（図２２）。同様に、FT-IRでもcNaD2、cNaD3及びsCA-SIGMA(-OH)にPEG由来のピークが検出された。
　cNaD1中のPEG誘導体含量を1H NMRを用いて定量した。炭酸アパタイト5 mgと既知量のPEG誘導体とを混合し、フマル酸二ナトリウムを内部標準物質として用いて、各検体の1H NMRを測定し、フマル酸二ナトリウムとPEGの積分値の比から検量線（y = 22.58x；R2 = 0.9852）を作成した。次に、cNaD1をボルテックスでほぼ均一に懸濁し、1 mLずつ分注した。遠心分離後、上清を除去し、残渣を減圧乾燥（3 mmHg, 室温, 10-12時間）し、乾燥化cNaD1を得た。EDTA・2Na・2H2O (100 mg) とフマル酸・2Na (10.0 mg)を混合し、1.0 mLのD2Oに溶解した。この溶液の添加量から、1H NMR測定サンプル中のEDTA・2Na・2H2Oの重量を算出した。各検体の1H NMRを測定し、フマル酸二ナトリウムとPEGの積分値の比の数値を作成した検量線に代入して、乾燥化cNaD1中に含有されるPEG重量を算出した。その結果、乾燥化cNaD1中に含有されるPEGの比率は1.2～1.8%（w/w）であった（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例６　cNaD2及びcNaD3のゼータ電位
　PEG誘導体の有無・種類が異なる以外は同一の条件下で作製したsCA（但し、Senjyo超音波処理あり）、cNaD2及びcNaD3（いずれも核酸を搭載していない）について、Zetasizer Plate readerを用いてゼータ電位を測定した。その結果、いずれの粒子もゼータ電位は0付近であったが、PEG誘導体を取り込むとわずかに正にシフトした（表７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明の炭酸アパタイト粒子は、ｉｎ　ｖｉｖｏで投与した場合に、腫瘍組織等の病巣へのより高い集積性を有するとともに、肝臓をはじめとする正常臓器への集積が著明に低減される。そのため、より少ない薬物量で所望の治療効果を奏する安全かつ有効な薬物送達用組成物として極めて有用である。
　本出願は日本で出願された特願２０２１－００６７４７（出願日：２０２１年１月１９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (14)

  1. 　薬物を搭載してなる炭酸アパタイト粒子を含有する組成物であって、該粒子の平均粒子径が５００ｎｍより大きく１０００ｎｍ以下であり、末端に１以上のカルボン酸もしくはその誘導体又はその塩を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体の存在下で一次粒子が形成され、該一次粒子にＰＥＧ誘導体が取り込まれていることを特徴とする、組成物。
  2. 　前記ＰＥＧ誘導体の平均分子量が１０００～２００００である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記組成物が、前記ＰＥＧ誘導体及び／又はその反応物を含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　前記ＰＥＧ誘導体の平均分子量が１０００～５０００である、請求項３に記載の組成物。
  5. 　前記ＰＥＧ誘導体が末端に１以上のカルボン酸又はその塩を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 　薬物が核酸である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 　薬物が抗腫瘍活性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 　さらにアルブミンを含有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 　請求項１に記載の組成物の製造方法であって、薬物及びＰＥＧ誘導体を搭載してなる炭酸アパタイト粒子を、一点集中型超音波照射装置を用いて超音波処理することを含む、方法。
  10. 　薬物及びＰＥＧ誘導体を搭載してなる炭酸アパタイト粒子が、薬物及びカルシウムイオンを含む第１の溶液、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含む第２の溶液並びにＰＥＧ誘導体を混合することにより調製される、請求項９に記載の方法。
  11. 　中空糸膜を用いて、請求項１に記載の組成物を濃縮することをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　請求項１～８のいずか１項に記載の組成物を含有してなる、薬物送達用組成物。
  13. 　薬物が抗腫瘍活性を有し、標的組織が腫瘍である、請求項１２に記載の薬物送達用組成物。
  14. 　薬物が抗炎症活性を有し、標的組織が炎症組織である、請求項１２に記載の薬物送達用組成物。
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