WO2022157365A1 - Verfahren zum reinigen und anreichern von proteinen, nukleinsäuren oder viren unter verwendung eines wässrigen zwei-phasen-systems - Google Patents

Verfahren zum reinigen und anreichern von proteinen, nukleinsäuren oder viren unter verwendung eines wässrigen zwei-phasen-systems Download PDF

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WO2022157365A1
WO2022157365A1 PCT/EP2022/051503 EP2022051503W WO2022157365A1 WO 2022157365 A1 WO2022157365 A1 WO 2022157365A1 EP 2022051503 W EP2022051503 W EP 2022051503W WO 2022157365 A1 WO2022157365 A1 WO 2022157365A1
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heavy
electrical conductivity
probe
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PCT/EP2022/051503
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Michael Christian RICHTER
Frederik RUDOLPH
Axel Schmidt
Jochen Strube
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D17/00—Separation of liquids, not provided for elsewhere, e.g. by thermal diffusion
    • B01D17/12—Auxiliary equipment particularly adapted for use with liquid-separating apparatus, e.g. control circuits
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D—SEPARATION
    • B01D17/00—Separation of liquids, not provided for elsewhere, e.g. by thermal diffusion
    • B01D17/02—Separation of non-miscible liquids
    • B01D17/04—Breaking emulsions
    • B01D17/047—Breaking emulsions with separation aids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/04—Solvent extraction of solutions which are liquid
    • B01D11/0492—Applications, solvents used

Definitions

  • the present invention relates to methods for purifying and enriching immunoglobulins or other proteins; or plasmid DNA, genomic DNA, RNA or other nucleic acids; or viruses using an aqueous two-phase system.
  • Biomolecules such as proteins are of increasing importance in a variety of applications, for example as medicines, diagnostics, food additives, detergents, research reagents and the like. Obtaining it from natural sources is not enough, so biotechnological production methods are used. This regularly requires the processing and purification of the protein obtained.
  • proteins used in biopharmaceuticals such as therapeutic antibodies
  • process-dependent impurities such as host cells, components of the host cells, e.g. proteins (host cell proteins, "host cell proteins", HCP) and nucleic acids that result from the cell culture itself or from the processing, such as salts or detached chromatography ligands
  • Product-dependent contaminants may be present, such as molecular variants of the product with deviating properties, e.g Way present in cell culture.
  • the monoclonal antibody production is based on a so-called batch platform method [1, 2]. This method is divided into upstream and downstream processing.
  • the manufacture of the recom- Binant target protein is based on cell cultivation in bioreactors during upstream processing.
  • the aim of the subsequent further processing is to isolate the target proteins from the minor components, such as host cell proteins (HCPs), host cell DNA, media components, viruses and endotoxins, using various unit operations such as centrifugation, filtration and chromatography.
  • This platform process includes fed-batch suspension cultivation of mammalian cells in bioreactors up to a volume of 20,000 L, centrifugation and depth filtration as cell harvest, protein A affinity chromatography as capture (separation step), cation exchange chromatography (CIEX) as intermediate purification and hydrophobic interaction chromatography ( HIC) as an ultra-fine cleaning step. Additionally, orthogonal low pH virus inactivation steps and virus filtration are performed to minimize immunogenicity. Following protein A affinity chromatography and due to the low pH for virus inactivation, diafiltration must be performed to load the subsequent CIEX.
  • the current status of plasmid DNA (pDNA) production is also based on a batch platform process.
  • the pDNA is produced intracellularly in the E. coli system.
  • the fermentation solution is centrifuged for harvesting.
  • the wet cell paste (WCP) obtained in this way is first resuspended in the lysis process, then broken down with an alkaline solution and neutralized by adding a potassium acetate buffer system.
  • proteins and other secondary components are flocculated, supported by the sodium dodecyl sulfate (SDS) used.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the resulting flocs are partially separated by flotation and the solution is drawn off through several fixed-bed layers at the bottom of the apparatus and roughly clarified. Further steps in the work-up include diafiltration, concentration by ultrafiltration, precipitation with ammonium sulfate or other salts and two or more chromatography steps [3].
  • the downstream bottleneck is the neutralizate collection vessel. With an increase in throughput and/or scale-up, the separation and clarification of the neutralizate difficult due to the high biomass load and simultaneous flocculation in the high volumes that occur.
  • telomeres There are also process-dependent impurities in pDNA production, such as host cells, components of the host cells, e.g. proteins (host cell proteins, "host cell proteins", HCP), nucleic acids such as RNA and genomic DNA, endotoxins, membrane fragments and the like, which are produced by the host cell originate themselves and are released in the fermentation or during alkaline digestion. Salts or detached chromatography ligands or substances that are necessary for the work-up, such as sodium dodecyl sulfate (SDS), result from the work-up.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • product-dependent impurities such as isoforms, topoisomers and Oligomers of the pDNA with deviating properties are present.
  • product-dependent impurities are contaminants, ie materials of a chemical, biochemical or microbiological nature which are undesirably present in the fermentation broth.
  • the production of viruses for gene and cell therapy is also similar to the previous processes , into an upstream u nd a downstream process divided.
  • the upstream process includes the cultivation of the cells responsible for production and the transfection required for this.
  • viruses produced today can be divided into the group of adenoviruses (average size 90 nm, non-enveloped), adeno-associated viruses (average size 20 nm, non-enveloped) and retro- and lentiviruses (average size 90-120 nm, wrapped).
  • the presence of an additional lipid envelope in retroviruses and lentiviruses results in lower stability, which can reduce the overall yield after purification by up to 70%.
  • the downstream procedure includes the steps of cell harvesting and cell lysis in the case of a non-secreted product. Even in the case of secretion, cell lysis is often performed to liberate non-secreted product and thus maximize overall yield. Following these steps, the virus coexists with a variety of contaminants.
  • pDNA vector used for the transfection
  • intracellular components such as genomic DNA and host cell proteins.
  • a combination of cell harvesting and aqueous two-phase extraction is recommended, analogous to the explanations for the pDNA process. In this way, the otherwise mostly necessary step of a time-consuming and difficult to scale density gradient centrifugation can be replaced.
  • the further purification steps up to the final product include, for example, dia- and ultrafiltration for buffer exchange and concentration increase, as well as chromatography (size exclusion, affinity, ion exchange, hydrophobicity) [4].
  • a well-known alternative to the mentioned adsorption- and filtration-based techniques is the gentle extraction of biomolecules, such as proteins, nucleic acids, cells, etc., using aqueous two-phase extraction (ATPE) [3],
  • An aqueous two-phase system (ATPS, Aqueous Two-Phase System), also referred to here for short as a two-phase system, means an aqueous solution with, for example, two immiscible polymers or a polymer and an inorganic or organic salt.
  • Aqueous Two-Phase System also referred to here for short as a two-phase system, means an aqueous solution with, for example, two immiscible polymers or a polymer and an inorganic or organic salt.
  • two phases are formed in the system. Due to the different biophysical properties of the phases, one can achieve that the biomolecules are distributed in one of the two phases. The concentration and purification of the target molecule can thus be achieved in one process step. Multi-stage ATPS extractions can also be carried out for higher purity of the target molecule.
  • ATPS aqueous two-phase system
  • the polymer/salt two-phase systems are of particular interest.
  • Polyethylene glycols (PEG) with molar masses between 200 and 4000 g/mol are often used as the polymer.
  • Examples of commonly used salts are sodium and potassium phosphates and citrates.
  • the anion is more responsible than the cation for the phase formation and the material properties.
  • a polymer such as PEG will accumulate in the upper light phase and the salt(s) will accumulate in the lower heavy phase.
  • the miscibility gap increases as the molecular weight of the polymer increases. Part of the process development is to identify the optimal system for the given process task.
  • the aqueous two-phase system therefore serves to purify or enrich a biomolecule in that after the aqueous two-phase system (ATPS) has been mixed, the biomolecule accumulates in one of the two aqueous phases, in particular is essentially there, and the undesired impurities accumulate in the other phase, the opposite phase, in particular are essentially located there, so that by separating the opposite phase containing the impurities, the biomolecule has a significantly reduced proportion or a proportion reduced to a minimum of impurities in one phase is obtained.
  • phase contact occurs when one phase is dispersed within the other.
  • each of the two phases can be dispersed in the other.
  • This phase contact enables mass transfer, which can be carried out in one or more stages.
  • the phases are usually separated in a separator or a mixer-separator.
  • Single-stage mixer-separators are usually used in single-stage operation, while several mixer-separators connected in series can also work in so-called batteries in counter-current or cross-current operation.
  • the most common extraction devices that work in countercurrent mode are columns. In the case of liquid phases with an extremely small difference in density, the earth's gravitational field alone is not sufficient to separate the phases in a reasonable time.
  • centrifuges which accelerate the liquid-liquid separation by applying centrifugal force by rotating the centrifuge bowl. These also enable the separation of mixtures with an extremely low density difference (Ap less than 30 g/m 3 ) in an acceptable time [6],
  • the method comprises the following steps: a. providing a cell culture or cell culture supernatant containing the target protein; b. Transferring the cell culture or the cell culture supernatant into an aqueous two-phase system by adding a polymer and at least one salt or two polymers in a suitable concentration; c. Mixing of the two-phase system to produce a dispersion; i.e. separation of heavy and light phases in a centrifugal extractor; e. Recovery of the target protein from the light phase.
  • a method for the selective purification and enrichment of plasmid DNA using an aqueous two-phase system is known, for example, from Frerix, A. et al. [8] became known.
  • the procedure is characterized as follows: • The alkaline cell lysis, precipitation after neutralization and extraction using a two-phase system (ATPS) with simultaneous clarification of the lysate takes place in one tank (one pot approach);
  • Two-phase system consisting of: PEG/salt (potassium phosphate and potassium citrate);
  • an aqueous two-phase extraction as in the present invention, as a cell harvesting method, it is necessary for the measurement technology to meet the requirements for detecting a phase interface or an additionally formed intermediate phase. Even detecting the two phases poses a problem, since they have similar properties. An additional problem arises with the formation of an intermediate phase, which is an emulsion layer of cells, agglomerates and bioparticles that can foul the metrology or affect the measurements.
  • a phase interface is the boundary between two immiscible liquids.
  • the liquids are deposited on top of each other due to differences in density.
  • An additional intermediate phase i.e. a third phase, can also form from the two immiscible phases, so that there are then two phase interfaces.
  • a detection of the phase interface ⁇ ) or intermediate phase is useful if you only want to subtract one of the two main phases, for example if the target molecule is only present in one phase.
  • the phase interface(s) or the intermediate phase can be seen in the transparent separators used for separation. The precise detection of this phase interface(s) or intermediate phase is essential for a smooth separation process.
  • a float switch is a mechanical/optical measurement method that can use buoyancy to measure levels, but can also be used to detect layers between two phases. The weight of the switch must be adjusted to the heavier liquid. Since the switch is a passive part, it does not have a self-checking mechanism, which means that regular checks are necessary. The switch is also impaired in its functionality by solids or liquids that are too viscous.
  • a sight glass as a mechanical/optical measuring device can be used to continuously measure the liquid level, whereby it is also possible to record the phase interface between two liquids.
  • the sight glass is connected to the tank so that if the intermediate layer is moved too far, it is no longer covered by the sight glass. Solids can contaminate the glass, making visual detection impossible.
  • Another mechanical/optical gauge is a positive displacement level gauge, which is placed in the liquid and experiences a buoyant force depending on the liquid level.
  • a displacer is connected to a spring, for example.
  • the measurement result is highly dependent on the calibration at process conditions and accumulation of solids can falsify the measurement.
  • a magnetostrictive measuring device which uses an electromechanical measuring method
  • the interaction between two magnets is measured.
  • One magnet is in the float, the other in a guide tube.
  • the float is free to move up and down in its chamber as the level changes.
  • a small current pulse reaches the float's magnetic field, causing the float to rotate and emitting a sound wave that can be measured.
  • Another gauge uses an electromechanical method of capacitive measurement, in which an electrode is mounted in the tank.
  • a tank wall or a reference electrode is used as the second electrode. If the liquid level increases, the material between the two electrodes changes, so that the capacitance of the capacitor changes.
  • Disadvantages of this measuring system are that changes in the dielectric constant of the medium lead to errors.
  • a reference electrode must also be installed for tanks with non-conductive materials, which makes calibration difficult.
  • the dielectric constant of the liquids must be large enough for an interlayer measurement to be able to detect them, and the upper medium must not be conductive for some measuring devices.
  • phase contact electronic gauges based on guided radar a high frequency radar pulse is guided along a probe. If the impulse hits a media surface hits, some of the pulses are sent back and recorded and evaluated by the device. The time that elapses between sending and receiving is a direct measure of the level of the liquid.
  • the problem with this measurement method is that the medium with the lower dielectric constant, which must not change and should have a value below 10, must be at the top; the dielectric constants of both phases must have a detectable difference, the top layer must be thick enough to be detected, and the presence of an emulsion layer can introduce measurement errors.
  • Differential pressure sensors are also known as electronic measuring devices with phase contact, which can measure an intermediate layer between two phases with different densities.
  • the pressure difference is a direct measure of the level.
  • the fill level In order to detect an intermediate layer, the fill level must have a certain height.
  • the pressure difference must be large enough, which is achieved either by a high density difference or a large apparatus structure. Density changes and a temperature dependence of the density of the liquids lead to errors.
  • phase contact electronic gauges use ultrasound, which emits ultrasonic waves into the tank. This signal is sent back by liquids, which, due to the time difference, enables level determination and also interlayer detection.
  • liquids which, due to the time difference, enables level determination and also interlayer detection.
  • solids in the liquid will cause the ultrasonic waves to be scattered, reducing the detected signal.
  • the detectability depends heavily on the properties of the solids, since the signal can disappear completely if the proportions are too high. Gases trapped in the liquid are also a problem as they also weaken the signal.
  • Known electronic measuring devices without phase contact are based on a nuclear measurement in which the attenuation of gamma radiation is recorded.
  • the weakening depends on the density of the medium. This method can also be used to detect intermediate layers.
  • the measuring units are relatively expensive and require regular checks to ensure safety. Furthermore, excessive changes in density and contamination on the tank wall can lead to errors.
  • DE 199 23 901 A1 [10] relates to a method for the controlled addition of emulsion breakers to a process tank, in particular to a separation tank filled with gas, oil, water and sand, using a sensor with vertical spatial resolution to detect an emulsion layer and a sensor signal is routed to a feed controller in order to dose the amount of emulsion breaker to be fed in as a function of the sensor signal.
  • Capacitive filling level sensors or gamma-ray density profile sensors are particularly suitable as sensors.
  • KR 101 143 889 B1 [11] discloses an automatically locking fractionated hopper to improve processability by installing an electrical conductivity sensor and automatically locking the hopper based on electrical signals.
  • the hopper has a receptacle, an electrical conductivity sensor, a controller, and a solenoid valve.
  • US Pat. No. 3,220,930 A discloses a device in which an emulsion of crude oils is broken up by adding a chemical additive (so-called demulsifier). This serves to separate the water contained in the crude oil.
  • demulsifier a chemical additive
  • a demulsifier in a tank, resulting in an oil phase, an oil/water intermediate phase and a water phase, each with different densities and different electrical properties.
  • the demulsifier is, for example, Tretolite, Nalco 538, sodium hydroxide, sodium silicate or mixtures of these.
  • An electrical probe 16 is placed at the interface between the upper phase and the intermediate phase, and a probe for determining the density is placed at the interface between the intermediate phase and the lower phase.
  • the electrical probe 16 is used to control the valve 22 with which the amount of demulsifier added is controlled.
  • the addition of a solid additive in the form of the demulsifier in the separation apparatus makes it difficult to control the two-phase system, since the phases are first created and to varying degrees - depending on the amount of demulsifier - can be simulated. Controlling and controlling simultaneously with an electrical probe and a density probe is very complex and confusing. There is no aqueous two-phase system in which all phases have water as the solvent.
  • EP 1 059 105 A2 [13] relates to a device and a method, in particular for separating water from a solvent mixture from textile cleaning.
  • a combination of at least one gravity separator and, upstream of this, at least one coalescence separator is provided, with a feed line of the gravity separator being connected to the outlet of the coalescence separator.
  • the volume of the water droplets is increased in the coalescence separator, which is filled with an open-pore, solvent-resistant foam.
  • a sensor 10 is provided in the gravity separator, which, when a maximum height for the middle phase B is exceeded, emits a signal to a valve 12 and a pump 13 in order to return the solution to the coalescence separator.
  • Another sensor 21 is provided in the lower part of the gravity separator.
  • phase C If the liquid level of phase C exceeds the sensor 21, the drain valve 20 is actuated accordingly. Both sensors are used to measure conductivity or turbidity. It is a classic recycling process that cleans a waste product that would otherwise have to be disposed of. The water is separated off so that the solvent mixture can be used again. It is a very complex separation process. There is no aqueous two-phase system in which all phases have water as the solvent.
  • EP 1 762 616 A1 [14] describes a method for removing single-stranded nucleic acids from double-stranded nucleic acids by the following steps:
  • step (c) setting conditions in the mixture according to step (b) which lead to a reversible denaturation of a specific double-stranded nucleic acid or multiple specific double-stranded nucleic acids, with another nucleic acid or multiple other nucleic acids being irreversibly denatured;
  • step (d) further adding buffer and a polymer component to the mixture of step (c);
  • step (e) incubating the mixture according to step (d) for a period of time sufficient to form an aqueous two-phase system with an upper and a lower phase;
  • the present invention is therefore based on the object to avoid the disadvantages of the prior art and to provide a method for cleaning and enriching proteins, nucleic acids or viruses using an aqueous two-phase system that reliably detects the two phases and their transition in the form of the phase interface or an optionally present intermediate phase (here also called intermediate layer) with two phase interfaces.
  • the method should also enable the phases to be separated from one another, with the target molecule being concentrated in one phase in the form of a protein, a nucleic acid or a virus.
  • the method should also be applicable continuously. Large-scale industrial use of the process should also be possible.
  • water is present as a solvent in all phases, so that it is completely unexpected that the measurement of the electrical conductivity can serve as a parameter to distinguish between the individual water phases even in aqueous two-phase systems.
  • An organic solvent is generally not present in the aqueous two-phase systems of the invention.
  • the method allows not only to determine the presence of the two phases and to distinguish them, but also to determine and record the exact position of the phase interface or any intermediate phase between the phases to be separated, which allows the separate extraction of the individual phases from each other is significantly facilitated and simplified.
  • the present invention therefore provides a method for conductivity-based regulation and control of the position of the phase interface(s), which is used for phase separation and separate removal of the phases from a separating device.
  • the object described above is therefore achieved according to the invention by providing a method for purifying and enriching a target product selected from
  • immunoglobulins or other proteins are immunoglobulins or other proteins.
  • plasmid DNA genomic DNA, RNA or other nucleic acids; or viruses, comprising the following steps: a. providing a starting solution containing the target product; b. Converting the starting solution into an aqueous two-phase system by adding at least one polymer and at least one salt in a suitable concentration, or by adding at least two polymers in a suitable concentration; c. Mixing of the aqueous two-phase system to obtain a mass transfer, so that the target product is enriched in the light or heavy phase; i.e. allowing the phases to separate in a separator into a light phase, a heavy phase and, if an intermediate phase is present, an intermediate phase; e.
  • the present invention therefore provides a target product concentration and separation and at the same time a depletion of impurities with the aid of an aqueous two-phase system.
  • steps a. to g. According to the invention, the conventional use of separators, in particular centrifugators, filtration and chromatography is completely dispensed with.
  • the method is used for purifying and concentrating a target product, using a cell culture, a cell supernatant or a cell lysate containing the target product as the starting solution.
  • the method of the present invention is used for cell harvesting and/or isolating the target product from the cells, the cell culture and/or the cell lysate.
  • the method according to the invention can therefore be used both for separating off the cells and for processing the product produced by the cells, the cells having already been separated off. That is, the cells can either be removed beforehand or only during the present method.
  • the turbidity can also be measured.
  • the subject of the invention is also an apparatus for carrying out the method of the invention, comprising a separator for separating the phases; at least one outlet in the separator; at least one probe for measuring electrical conductivity and/or at least one probe for measuring turbidity in at least one of the phases in the separator; one or more extraction device(s) and/or means for regulating and/or controlling the extraction quantity, extraction speed(s) and/or the extraction duration of the light phase, the heavy phase and, if present, the intermediate phase, based on the measured values electrical conductivity (for the electrical conductivity probe(s)) or based on turbidity readings (for the turbidity probe(s)) in at least one phase.
  • a sampling device is, for example, a dip tube, the structure and function of which will be explained in detail below.
  • the invention also relates to the use of the method or the device according to the invention for adjusting the position of the phases in a separator and separate removal of the phases from a separator on the basis of the measured electrical conductivity values of the phases (for the probe(s) for measuring the electrical conductivity) and/or based on the measured turbidity values of the phases (for the probe(s) for measuring turbidity).
  • FIG. 1 through 22 are schematic representations of exemplary embodiments of the present disclosure. In detail shows:
  • FIG. 1 is a schematic sectional side view of an exemplary embodiment of a separation device according to the invention, showing the course of an extraction of a batch at 3 instants of separation with a probe for measuring the electrical conductivity of the phases, plotted against time;
  • Figure 2 is a schematic sectional side view of an exemplary embodiment of a separator according to the invention, showing a continuous extraction with two probes for measuring the electrical conductivity of the phases;
  • Figure 3 is a schematic sectional side view of an exemplary embodiment of a separator according to the invention, showing a continuous extraction with two probes for measuring the electrical conductivity of the phases, at a different time from Figure 2;
  • Figure 4 is a schematic sectional side view of another exemplary embodiment of a separator according to the invention, showing a continuous extraction with two probes for measuring the electrical conductivity of the phases;
  • FIG. 5 shows a cross-section of a further exemplary embodiment according to the invention of a separation device with 4 probes in a radial arrangement (left) and a side view thereof (right);
  • Figure 6 is a cross-section of another exemplary embodiment of a separator according to the present invention having 4 probes in a radial arrangement with horizontal distribution (left) and a side view thereof (right);
  • Figure 7a Representation of the start-up of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase phosphate system based on the measured electrical conductivity in [mS / cm] for the heavy phase with a first probe, plotted over time in [s];
  • Figure 7b Representation of the start-up of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in the aqueous two-phase phosphate system of Figure 7a based on the measured electrical conductivity in [mS / cm] for the light phase with a second probe, plotted against the time in [s];
  • FIG. 8 Course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase phosphate system, shown using the electrical conductivity profiles measured with two probes in [mS/cm], each for the light and heavy phase over time in [s];
  • Figure 9 a Course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase citrate system, shown on the basis of the electrical conductivity profile measured with a first probe in [mS/cm] for the heavy phase, plotted over time in [s];
  • FIG. 10 course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the process, a single-phase system being introduced into the separator instead of a two-phase system
  • FIG. 11 course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method, the water content of the two-phase system being varied and the disruptive system being present in the separation device from the start;
  • FIG. 12 course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method, wherein the polymer content of the two-phase system is varied and the interfering system is present in the separation device from the start;
  • FIG. 13 course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method, wherein the buffer salt content of the two-phase system is varied and the interfering system is present in the separation device from the start;
  • Figure 15 is a bar graph showing cell counts in [10 5 cells/mL] of the cell culture employed in Example 5.1 and light phase cell counts at various time points during the process;
  • Figure 18 is a bar graph showing cell counts in [10 5 cells/mL] of the cell culture used in Examples 5.2 and 5.3, and light and heavy phase cell counts at various times during the process;
  • FIG. 19A Course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase phosphate system with cell culture, shown on the basis of the electrical conductivity profiles measured with two probes in [mS / cm], each for the light and heavy phase , plotted against time in [s];
  • FIG. 19B Course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase phosphate system with cell culture, illustrated by the height setting of the dip tube in [cm] in the separator, which correlates with the conductivity values of FIG. 19A;
  • Figure 21 is a bar graph showing the yield and concentration for plasmid DNA of the method described in Example 6;
  • FIG. 22 Course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase citrate system using two pumps, illustrated by the pump flows during the method;
  • FIG. 23 Course of a continuous extraction of an exemplary embodiment of the method according to the invention in a separator in an aqueous two-phase system using a probe for measuring the turbidity values.
  • Purifying and enriching is understood here to mean that undesired components, such as contamination or impurities, in particular host cell proteins (HCPs), host cell DNA (DNA), media components, viruses and endotoxins and the like, can be depleted and the purity of the target product can be improved by the procedure increases.
  • HCPs host cell proteins
  • DNA host cell DNA
  • media components viruses and endotoxins and the like
  • enriching also includes concentration, whereby “concentration” in this context means that the target product in step g. is obtained in a higher concentration (mass/volume) compared to step a.
  • Conductivity is to be understood here as electrical conductivity.
  • measurement of the electrical conductivity of a phase or similar wording is given, it means This means that the electrical conductivity at certain positions in this phase is measured using one or more conductivity measuring devices, such as probes.
  • conductivity probe means a probe that measures electrical conductivity.
  • electrical conductivity of the light/heavy phase or similar expressions should be understood as not actually measuring the electrical conductivity of the light, heavy or intermediate phase, but measuring the electrical conductivity at certain predefined points or suitable positions in the separator .
  • the predefined locations or suitable positions are the locations in the separation device at which one or more conductivity measuring devices, in particular one or more probes, measure the electrical conductivity.
  • the "turbidity”, also known as turbidity, of a transparent liquid is an optical impression caused by small particles that have a refractive index that differs from the carrier medium or show absorption.
  • the turbidity of a liquid is determined optically and measured with the help of an electronic evaluation.
  • the wavelength of the measuring radiation is, for example, in the infrared range at 860 nm (according to ISO 7027).
  • the turbidity can also be measured with a white light lamp (e.g. tungsten lamp) between 400 and 600 nm (EPA 180.1).
  • a white light lamp e.g. tungsten lamp
  • transmitted light the weakening of the transmitted light radiation
  • scattered light the sideways scattering of the light radiation
  • FAU Force Attenuation Units; transmitted light measurement; angle 0°; according to the requirements of the ISO 7027 standard.
  • Turbidity can be measured by various measuring devices; these are turbidity measuring devices, in particular turbidity probes.
  • Turbidity probes then measure, for example, the light scatter (sideways scatter) or are transmitted light probes that measure the weakening of the transmitted light radiation.
  • the measurement signal or the measurement unit is the absorption here.
  • the wavelength of the measurement radiation can vary. For example, commercially available turbidity probes can be used.
  • light phase probe refers to the probe that is immersed in the light phase and measures the electrical conductivity there. This probe is thus assigned to the light phase.
  • the "measurement of the electrical conductivity of the light phase” thus means the measurement of the electrical conductivity with the probe that is assigned to the light phase.
  • heavy phase probe or similar terms refer to the probe that is immersed in the heavy phase and measures the electrical conductivity there. This probe is thus assigned to the heavy phase.
  • the "measurement of the electrical conductivity of the heavy phase” thus indicates the measurement of the electrical conductivity with the probe, which is assigned to the heavy phase.
  • a probe is inserted "at a suitable position" in the separator means that the heavy phase probe is also immersed in it and the light phase probe is immersed in it, so that the respective probe has the electrical conductivity of the assigned phase can be measured.
  • the probe measures the electrical conductivity at the predefined point where it is placed in the phase.
  • “Regulation and/or control” of a parameter means the control and correction and/or regulation of the parameter.
  • phase interface(s) means that either there is no intermediate phase, then only the light and heavy phases are present in the separator and there is a phase interface between them. Or else there is an intermediate phase, then there is an interface between the intermediate phase and the light phase and an interface between the intermediate phase and the heavy phase.
  • phase interface(s) therefore includes both variants.
  • continuous means that one or more flows of material flow into the separation device and one or more flows of material flow out of the separation device.
  • the sum of the inflowing material flows is equal to the sum of the outflowing material flows. If a process or a process step is carried out continuously, it takes place without interruption.
  • discontinuous means that work is not carried out continuously.
  • a quantity limited by the capacity of the separation device a batch or batch
  • the product can be removed all at once after the process has ended.
  • individual products can first be manufactured (batch), then stored and later processed.
  • polymer(s) are understood here to mean polymeric compounds that can form an aqueous two-phase system and/or can be used in an aqueous two-phase system, but as far as possible do not adversely affect the target product.
  • salt(s) means those salts that can form an aqueous two-phase system together with a polymer(s) and/or can be used in an aqueous two-phase system, but the target product not adversely affect it as much as possible.
  • salts for example, inorganic or organic salts, in particular buffer salts.
  • the process of the invention can be carried out continuously or batchwise.
  • each step is carried out continuously and immediately (continuously) follows the next step.
  • the process can also be carried out discontinuously.
  • the process can be discontinuous overall, for example when it is carried out batchwise, or one or more steps of the process can be discontinuous.
  • Continuous and discontinuous (non-continuous) steps can also be combined in the process of the invention.
  • a method step can comprise continuous and discontinuous partial steps.
  • steps a) to g) or steps b) to g) or steps c) to g) or steps d) to g) are carried out continuously or discontinuously.
  • steps a) to f) or steps b) to f) or steps c) to f) or steps d) to f) are carried out continuously or discontinuously.
  • the term "in continuous operation" as used herein means that at least steps d., e. and f., which are carried out in the separating device, each take place continuously and there is also no interruption between these steps, ie the sub-process d. to f. is carried out continuously overall.
  • the inventive method for purifying and enriching a target product is for any type of protein, especially immunoglobulins, or for any type of nucleic acid such as plasmid DNA, genomic DNA, RNA, or any type of virus such as adenoviruses, A-deno -associated viruses and retroviruses and lentiviruses, or other viruses not mentioned here.
  • a starting solution containing the target product is first provided.
  • This can be any type of starting solution as long as it can be converted into an aqueous two-phase system.
  • starting solution is to be understood as broadly as possible and includes not only true solutions, but any type of homogeneous or heterogeneous mixture with which a liquid-liquid phase separation can be carried out. Dispersions should be included here.
  • the starting solution is therefore a liquid-containing mixture of the components to be separated, which are dissolved or dispersed in water in the aqueous two-phase system.
  • the starting solution can therefore be a true solution or a dispersion and can also contain solid components such as cells, cell fragments or precipitates dispersed in the solvent.
  • the starting solution can be a cell culture, a cell supernatant or a cell lysate containing the target product (for example antibodies, viruses, mRNA).
  • the starting solution is a cell lysate which is produced by alkaline lysis of the cells and contains plasmid DNA.
  • the cells can be prokaryotic or eukaryotic cells, in particular fungi, yeasts, bacteria such as E. coli.
  • step b converted into an aqueous two-phase system (ATPS), i.e. an aqueous two-phase system is produced with the starting solution.
  • ATPS aqueous two-phase system
  • the production of the aqueous two-phase system can be carried out continuously, batchwise or semi-continuously.
  • the two-phase system can be produced continuously.
  • a batch of the two-phase system can also be produced and then further processed.
  • aqueous two-phase system At least one polymer and at least one salt are added in a suitable concentration to the starting solution, or at least two polymers are added in a suitable concentration to the starting solution.
  • the term "in a suitable concentration” means that such a concentration is used that an aqueous two-phase system is formed. This concentration depends on the starting materials used and is known to the person skilled in the art from the prior art or can be determined by a few preliminary experiments.
  • the aqueous two-phase system is not particularly restricted according to the invention, provided that a combination of polymer(s)/polymer(s) or polymer(s)/salt(s) is used.
  • water is used as the solvent. That is, the solvent in all phases is water; an organic solvent is not present.
  • polyethylene glycols PEG with different molecular weights and dextran are used as a polymer(s)/polymer(s) combination.
  • Dextrans can be used dissolved in aqueous solution with different molecular weights.
  • the combination of polymer(s)/polymer(s) is selected, for example, from polyethylene glycol (PEG)Zpolyethylene glycol (PEG), such as PEG 400/PEG 8000, PEG400/PEG2000, polyethylene glycol (PEG)Zdextran.
  • PEG polyethylene glycol
  • Other phase-forming polymers such as polyethylene glycols (PEG) are polypropylene glycols (PPG), dextrans, PEG-PPG-PEG copolymer (EO-PO) and the like.
  • the phase-forming polymers can be used with different molecular weights.
  • polymer(s)/salt(s) for example, polyethylene glycols (PEG) with different molecular weights and various salts such as phosphate salts, ammonium salts, potassium salts, acetate salts, sodium salts or citrate salts are used, for example ammonium sulphate, potassium citrate, sodium citrate, potassium acetate, sodium acetate, ammonium acetate , potassium phosphate.
  • PEG polyethylene glycols
  • salts such as phosphate salts, ammonium salts, potassium salts, acetate salts, sodium salts or citrate salts
  • ammonium sulphate potassium citrate, sodium citrate, potassium acetate, sodium acetate, ammonium acetate , potassium phosphate.
  • salts can also be used at the same time.
  • Other salts known in the art which can form an aqueous two-phase system together with a polymer(s) can also be used.
  • the polymer(s)/salt(s) combination is selected from polyethylene glycol(s) (PEG)Zphosphate salt(s) and optionally other salts.
  • PEG polyethylene glycol
  • an aqueous two-phase system comprising at least one polymer and at least one phosphate salt is also referred to as a “two-phase phosphate system”.
  • the polymer(s)/salt(s) combination is selected from polyethylene glycol(s) (PEG)Zcitrate salt(s) and optionally further salts.
  • PEG polyethylene glycol
  • an aqueous two-phase system comprising at least one polymer and at least one citrate salt is also referred to as a “two-phase citrate system”.
  • the combination of polymer(s)/salt(s) is selected from polyethylene glycol(s), (PEG)Zammonium salt(s) and optionally further salts.
  • an aqueous two-phase system comprising at least one polymer and at least one ammonium salt is also referred to as a “two-phase ammonium system”.
  • phase-forming polymers can also be used for the polymer(s)/salt(s) combination, for example selected from polyethylene glycol cols (PEG), polypropylene glycols (PPG), PEG-PPG-PEG copolymer (EOPO), and the like.
  • PEG polyethylene glycol cols
  • PPG polypropylene glycols
  • EOPO PEG-PPG-PEG copolymer
  • the phase-forming polymers can be used with different molecular weights.
  • the polymer used for the aqueous two-phase system is polyethylene glycol with a molecular weight between 200 and 8000 g/mol. In one embodiment, the polymer used is polyethylene glycol with a molecular weight between 200 and 6000 g/mol or between 200 and 4000 g/mol. Molecular weights other than those specifically disclosed for polyethylene glycol can also be used.
  • the polymer or polymers such as polyethylene glycol
  • the phosphate salts used are, for example, sodium and potassium phosphates and alkali metal hydrogen phosphates, such as sodium mono- or dihydrogen phosphate or potassium mono- or dihydrogen phosphate, and many others. Other useful salts are known to those skilled in the art. One or more phosphate salts can be present at the same time.
  • citrate salts used are, for example, sodium and potassium citrates and many others. Citric acid can also be used. One or more citrate salts can be present at the same time.
  • ammonium salts used are, for example, ammonium sulfate, ammonium chloride and many others. One or more ammonium salts can be present at the same time.
  • salts such as sodium chloride, potassium chloride, acetate, tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris).
  • Acetic acid can also be used.
  • Biomolecule-stabilizing components such as amino acids (e.g. L-arginine), or sugars (e.g. sorbitol) or additives such as polysorbates can also be added to the two-phase system to prevent the target molecule from precipitating at high polymer or salt concentrations or to protect product loss.
  • amino acids e.g. L-arginine
  • sugars e.g. sorbitol
  • additives such as polysorbates
  • a phase ratio of the phase containing the target product to the opposite phase of >1.1 is used.
  • the phase ratio can be a volume ratio (volume/volume) or mass ratio (wt/wt). This can improve the separation of the protein, the nucleic acid or the virus.
  • the density ratio of light and heavy phase in the two-phase system used is at least 1.06. Accordingly, the ratio of the density of the heavy phases to the density of the light phase is 1.06 or greater (for the heavy phase) to 1 (for the light phase). This means a density difference of at least 6% between the two phases, ie there can also be a very small density difference between the two phases and the phases can still be separated without problems. Such a density ratio is advantageous in view of a short process time.
  • aqueous two-phase extraction requires two immiscible phases to separate the target product and impurities, with one of the phases enriching the target product, in particular essentially containing it, and the opposite phase enriching the impurities, in particular essentially containing them, it is expedient to select an appropriate aqueous two-phase system depending on the target product and the impurities it contains.
  • the person skilled in the art can do this in accordance with the state of the art and his specialist knowledge using a few preliminary tests.
  • step b After converting the starting solution into an aqueous two-phase system (ATPS) in step b. takes place in step c. mixing the resulting aqueous two-phase system.
  • the aqueous two-phase system is mixed to obtain a mass transfer in which the target product is enriched in the light or the heavy phase, and in particular is essentially only in one of the phases.
  • the expression that the target product "concentrates in the light or heavy phase” means that about 50% or more, or about 60% or more, or about 70% or more, or about 80% or more, or about 85% or more, or about 90% or more, or about 95% or more, or about 98% or more of target product in one phase.
  • about 40% or more or about 45% or more of the target product can also be sufficient if this accumulates in one phase. This is particularly important when dealing with expensive or very valuable target products.
  • the mixing of the aqueous two-phase system in step c. is carried out while maintaining a mass transfer, in particular a sufficient mass transfer.
  • a mass transfer is not sufficient if the target product does not accumulate in the light or heavy phase, as already defined.
  • a suitable or sufficient mass transfer can be determined, for example, by preliminary tests or by analyzing the concentration of the target product in the individual phases after mixing.
  • the mass transfer therefore results from the different distribution in the phases.
  • a mass transfer has taken place, ie that the target product has concentrated in one of the phases.
  • the person skilled in the art can determine this, for example, by means of simple preliminary tests. These are, for example, settling attempts with defined energy inputs in a reaction vessel (batch mode).
  • the exchange of substances can therefore be influenced in particular by the energy input during mixing.
  • the phase separation behavior of the aqueous two-phase system used and the content of the target product in the phases are also determined.
  • the energy input during mixing is varied and the separation time for the formation of the phases is determined.
  • the end of phase formation is usually when the height of the interface between the light phase and the heavy phase in the reaction vessel no longer changes.
  • the energy input can be determined, for example, via a specific stirrer speed in the selected experimental setup (defined type of stirrer and defined reaction vessel (height/diameter)).
  • a determined energy input for the mass transfer of the target component in a specific aqueous two-phase system can then be adjusted accordingly, for example for different extraction vessels, process formats (batch and continuous phase separation) as well as stirrer types and structures (active or stationary energy input).
  • influencing factors such as temperature, concentration of target product and by-products (e.g. host cell proteins, number of cells) can be used in the preliminary tests or settling tests to optimize the energy input for each two-phase system.
  • concentration of target product and by-products e.g. host cell proteins, number of cells
  • step c. under different conditions (among others: temperature, residence time, stirrer speed, energy input, construction of the mixer during active mixing, construction of a static mixer, flow rate etc. in the static mixer during static mixing) directly in the device in which the method of the invention is carried out, established and the best conditions for mass transfer determined according to the invention.
  • the method is, for example, under different conditions in step c. carried out and the content of the various ingredients determined in the settled and separate phases: e.g. content of the target product in the target phase and optionally in the other phases.
  • chromatographic methods such as reversed-phase HPLC and other HPLC methods (anion exchanger, cation exchanger, HIC (Hxdrophobic Interaction Chromatography), affinity chromatography (protein A and other ligands that can specifically bind the target product)), nano-HPLC , UHPLC, electrophoretic methods such as, inter alia, SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis), methods based on antibody binding such as ELISA, Western blot etc., fluorometric or spectroscopic methods for proteins which provide corresponding spectroscopic and fluorometric signals, and all others State-of-the-Art Methods for the analysis of target products such as proteins and nucleic acids, in particular quantitative analysis.
  • the content of nucleic acids, in particular plasmid DNA (pDNA) in the target phase can be determined, inter alia, by cation exchange HPLC, nano-HPLC and UHPLC methods, spectroscopically using chromogenic assays, agarose gel electrophoresis, capillary electrophoresis and the like.
  • host cell proteins can be determined by SDS-PAGE or ELISA and DNA and RNA by methods commonly used and accepted in the pharmaceutical industry.
  • step d In order to be able to determine a mass transfer, one compares the content of the target product and/or the undesired impurities in the starting solution from step a. of the process according to the invention with the content of the target product and/or the undesired impurities in the individual separated phases in step d. An enrichment or depletion of the target product or the undesired impurities in the respective phases is then determined. Content is the proportion, amount or concentration of the target product or impurities in each phase. A change in the content of the target product and/or impurities by comparing the starting solution of step a. with one, two or all separated phases in step d. therefore indicates a mass transfer.
  • Mass transfer can take place through active and/or static mixing.
  • active mixing the aqueous two-phase system (ATPS) is mixed using moving parts, such as an active stirrer.
  • Active agitators are, for example, rotating agitators or agitators with a different effective motion.
  • the static mixing takes place without the aid of moving parts, for example in a static mixer.
  • Known static mixer types are, for example, Kenics mixers, which consist of metal sheets twisted through 180° with each helix offset by 90°; or Sulzer SMV mixers, made up of corrugated lamellae that guide the streams in such a way that they cross one another.
  • a mass transfer in particular a sufficient mass transfer during mixing, can be achieved, for example, by the energy input or power input during mixing and/or also the duration or residence time over which mixing takes place. This depends on the individual case. In experiments with cell cultures, it was found that the deturbidity of the light phase could be avoided if a power input of more than 30 kW/m 3 and a residence time of more than 5 minutes were used during mixing. These values given as examples could serve as a guide for the person skilled in the art. The person skilled in the art can determine a suitable procedure using a few preliminary tests, with each material system leading to different values.
  • the phases must be mixed in order to redistribute the target product into the desired phase.
  • Thorough mixing of the aqueous two-phase system makes sense in order to obtain the highest possible yield of the target product.
  • Mixing can be recognized, for example, by the fact that the phase containing the product is continuous, i.e. does not form droplets, and the opposite phase is disperse, i.e. forms droplets.
  • Inadequate mixing can lead to an incorrect phase composition or contamination of the target phase with the opposite phase, which results in reduced product purity or it is no longer possible to separate the target product.
  • An example of insufficient mixing with an incorrect phase composition is explained in the exemplary embodiments.
  • step d the phases are allowed to separate in a separator into a light phase, a heavy phase and optionally an intermediate phase. This can be done continuously or discontinuously.
  • the separating device can be any type of separating device known to those skilled in the art that is suitable for liquid-liquid phase separation, such as a separator or mixer-separator.
  • the continuous process In the case of the continuous process, this is carried out in such a way that the liquid is fed in and removed in such a way that a separation into the individual phases and their separate removal takes place continuously.
  • a batch is placed in the separator, the phases are allowed to separate and the phases are then separated by means of separate removal from the separator.
  • the phases can also be allowed to separate directly in the device in which the aqueous two-phase system (ATPS) is mixed through. After the end of mixing, the phases are awaited to separate.
  • the device in which the aqueous two-phase system (ATPS) is thoroughly mixed can therefore also subsequently be used as a separating device. It is also possible to switch between discontinuous and continuous operation.
  • the upper phase in the aqueous two-phase system is the light phase and the lower phase is the heavy phase.
  • the target product can be in the light or heavy phase; this depends on the properties of the respective target product and the selected aqueous two-phase system.
  • the demixing can also be carried out semi-continuously. This means that the continuous process is briefly interrupted and the demixing in step d. is not carried out continuously, but is initially awaited. This can lead to a better formation of the phase interface(s) and therefore facilitate the later separation of the phases.
  • the process is semi-continuous, i.e. the otherwise continuous process is interrupted.
  • the cell lysate is prepared as the starting solution via alkaline lysis and subsequent neutralization, for example with a citrate salt.
  • the salt buffer such as citrate
  • the salt buffer required for the aqueous two-phase extraction (ATPE) is therefore already available and the two-phase system can be produced and used immediately.
  • a suitable duration of the lysis is maintained and only then the continuous procedure is resumed.
  • the neutralization that is subsequently required is carried out with the salt buffer (in this example: citrate) that is also required for the aqueous two-phase extraction (ATPE).
  • the salt buffer in this example: citrate
  • Aqueous two-phase extraction APTE
  • the alkaline lysis, the neutralization, the transfer to an aqueous two-phase system, the separation and the separate removal of the phases are carried out continuously for the purification and concentration, in particular the concentration of plasmid DNA .
  • the procedure can also be as follows: the alkaline lysis takes place continuously or discontinuously and the conversion into an aqueous two-phase system takes place continuously or discontinuously or in batches, for example also in each case with alternating cycles.
  • 2 separating devices could be used alternately with continuous and discontinuous operation, or 2 separating devices could be used connected in series.
  • step e a continuous measurement of the electrical conductivity in the separation device is carried out. This can serve to monitor the course of the phase segregation. However, the electrical conductivity is used in particular to determine the position of the two phases and the phase interface or, if an intermediate phase is present, the position of the intermediate phase and the two phase interfaces.
  • a cell suspension or a cell lysate is used as the starting solution, ie a dispersion of bioparticles comprising the target product, as well as cells, cell fragments and medium
  • a mixed phase is formed that is made up of bioparticles, but usually no longer contains the target product.
  • This mixed phase is also referred to here as an “intermediate phase”, ie a phase that is present between the two phases to be separated.
  • the intermediate phase can, for example, be a mixture of a proportion of the heavy phase in the form of non-coalesced droplets and cells bound in between. The formation and size of the intermediate phase essentially depends on the cells.
  • the intermediate phase can also consist of a precipitate which is formed, for example, when plasmid DNA is obtained by the alkaline lysis of cells during neutralization.
  • This precipitate contains, for example, precipitated potassium dodecyl sulfate (K-SDS), proteins, cell components, genomic DNA, RNA and the like.
  • K-SDS precipitated potassium dodecyl sulfate
  • phase separation is made more difficult by the formation of an intermediate phase.
  • the intermediate phase could spread completely uncontrolled up to an existing lower and/or upper device outlet without a level control. Without monitoring or the possibility of detection, the removal of the phases can therefore not be monitored and controlled.
  • Electrical conductivity was chosen as the material parameter to be measured for reliable phase detection for the present invention, since it was found that the differences between these in the two phases of an aqueous two-phase system (ATPS) are large enough to be able to be detected.
  • the polymer or the polymer phase has a low electrical conductivity and the salt or the salt-rich phase has a high electrical conductivity. Since only two phases are formed in a polymer/salt ATPS with sufficiently high concentrations of polymer or salt (> binodals), there is always a sufficient difference in the electrical conductivities of the light and heavy phases. In a similar way, correspondingly suitable polymer/polymer systems can also be used.
  • the measuring principle is suitable for determining the position of the individual phases or phase interface(s) based on the measurement of the electrical conductivity, and is independent of the distribution of the target product and the impurities, since the conductivity difference of the phases to be separated is largely are not influenced by the target product and impurities.
  • a controlled phase separation according to the invention, whether with or without an intermediate phase, using the continuously measured electrical conductivity values increases the yield of the process and the product purity and quality finally obtained.
  • the continuous measurement of the electrical conductivity of the phases in the separator is carried out with one or more conductivity meters in the form of one, two, three or more probes. That is, depending on the embodiment, one, two or more probes can be used simultaneously in the separating device.
  • Conductivity probes are known to those skilled in the art.
  • a probe measures the electrical conductivity at the lower end in the usual way using measuring contacts. Exemplary conductivity probes are 4-pin conductivity probes with 4 metal contacts. Other conductivity probes are also possible.
  • the probe(s) is (are) built into or embedded in the separating device, for example with the help of built-in components, and connected to a central electronic data acquisition and control system.
  • Just one probe can be enough to measure the electrical conductivity in the separator. For example, if a batch extraction is performed, only one conductivity probe can be used. This is arranged, for example, in the outlet of the separating device.
  • the outlet is an opening in the lower part of the separation device and may be connected to or comprise a withdrawal device for controlled outlet, for example selected from a valve, a flow regulator, a hose clamp, a hose, a pipe or a nozzle and the like or can also have any other design.
  • the conductivity probe which is mounted, for example, in the lower area of the separating device, such as near the floor, in the outlet, in particular in a hose, pipe, socket or the like connected to the outlet, but in front of a valve or a hose pinch clamp or the like of the separating device, then detects the exiting phase based on their respective electrical conductivity during the emptying of the separator, so that the phases are separated from each other in a simple manner and can be collected in separate collection containers.
  • one or more probes are used to continuously measure the electrical conductivity of the heavy phase and one or more probes are used at different positions in the separation device to continuously measure the electrical conductivity of the light phase. It can be advantageous if more than one probe is used, since this allows the detection of the position of the phases and interfaces and their regulation to take place more precisely and is thus improved. For example, one probe can continuously measure the heavy phase electrical conductivity and one probe can continuously measure the light phase electrical conductivity.
  • one outlet each for the heavy phase can be located in the lower part of the separator (lower outlet). and a light phase outlet may be provided in the upper part of the separator (upper outlet).
  • Each of the two probes can then be assigned to an outlet, for example. With the probe assigned to the respective phase, it can then be detected whether the corresponding phase is still located on the probe and thus in the vicinity of the respective outlet, or whether the phase interface has already risen or fallen so far that the opposite phase is at the probe and is therefore close to the outlet through which it should not flow.
  • the probe positions are then chosen, for example, such that - regardless of the distribution of the target product in the upper or lower phase - the probe for the light phase (upper phase) is positioned lower than the upper outlet. This can be used to detect an excessive increase in the heavy phase (lower phase) with the electrical conductivity values before it is drawn off via the upper outlet.
  • the probe for the heavy phase (lower phase) is conveniently placed higher than the lower outlet. This can be used to detect an excessive drop in the light phase (upper phase) with the electrical conductivity values before it is drained via the lower outlet.
  • the probe for the light phase is positioned lower than the upper outlet in the separator and the probe for the heavy phase is positioned higher in the separator than the lower outlet.
  • the probes it is not necessary for the probes to be positioned in the vicinity of the respective outlet, for example directly above or directly below the respective outlet; rather, the respective height of the probes in the separating device relative to the outlets plays a role. Since the liquid level in the separator is the same everywhere, “below an outlet” means that the probe is not at the same level as the outlet, but is placed below the level of the outflow opening of the outlet. Similarly, “above an outlet” means that the probe is not at the same level as the outlet, but is placed above the level of the outlet's orifice. For example, the level of the liquid and the outlet under consideration is therefore important.
  • the probe(s) for the light phase are placed higher than the probe 1) for the heavy phase, which is usually the case since the light phase is always above the heavy phase.
  • the light phase probe(s) are located below the top outlet but higher than the heavy phase probe(s).
  • each of the two conductivity probes which continuously measure the electrical conductivity, directly indicates the approach of the other phase or the intermediate phase by changing the conductivity value and therefore an exit of the other or intermediate phase wrong outlet can be prevented. Regardless of whether the target product is in the light or heavy phase, by avoiding taking a phase and/or the intermediate phase at the wrong outlet, product loss can be avoided.
  • more than 2 conductivity probes can also be provided in the separating device.
  • 3, 4, 5, 6, or more probes may be present in the separator at one time.
  • a higher number of probes can be advantageous for a more precise determination of the position of the individual phases and the phase interfaces.
  • two, three, four or more probes are each inserted and inserted into an insertion opening in the wall of the separator, the insertion openings having an arrangement selected from: an axial arranging the insertion openings, wherein the insertion openings are arranged on a straight connecting line; a radial arrangement of the insertion openings, the insertion openings being arranged in an arc of a circle; or a radially offset arrangement of the insertion openings, the insertion openings being arranged in an arc of a circle and additionally shifted in a preferred direction.
  • the arrangements described are of particular advantage.
  • the embodiments described are advantageous in particular when a larger amount of biomass is present and it is also unclear how large the intermediate phase will be. This makes it possible, in particular, to better cover gaps between the individual probes, for example even when the phase boundaries shift during the process.
  • a large number of probes enables the dip tube to be positioned better, so that the phase separation can be optimized as a result.
  • the insertion openings for the probes in the wall of the separator can be in an axial arrangement, i.e. a connecting line between the individual insertion openings would give a straight line or axis and a linear arrangement would result.
  • the insertion openings for the probes in the wall of the separating device can also be in a radial arrangement.
  • these would be distributed at the same or different distances from one another on an imaginary arc of a circle, for example on the round circumference of the separating device.
  • a radial arrangement of the insertion openings and thus also of the probes present in the insertion openings is advantageous since such a distribution enables a particularly advantageous detection and control of the individual phases and thus faster and more robust detection, regulation and control of the method.
  • the insertion openings for the probes and thus naturally also the probes present in the insertion openings can also be present in the wall of the separating device in a radially offset arrangement.
  • the insertion openings and the probes are distributed on an arc of a circle at the same or different distances from one another and are also shifted to the same or different extents in a preferred direction, for example the longitudinal axis of the separating device.
  • a radially offset arrangement of the probes also leads to improved detection of the phases and faster and more robust process regulation and control.
  • the number and arrangement or position of the probes in the separation device must be selected in each individual case and depends in particular on the target product and the impurities present as well as the aqueous two-phase system used, and can also depend on whether an intermediate phase forms or not.
  • the position of the two phases and their phase interfaces or alternatively the position of the two phases and an intermediate phase and its two phase interfaces can be determined according to the invention.
  • Table 1 gives exemplary electrical conductivities of the light phase, heavy phase and intermediate phase in an aqueous two-phase citrate system and an aqueous two-phase phosphate system with and without cells:
  • Table 1 Exemplary electrical conductivities in an aqueous two-phase citrate system and an aqueous two-phase phosphate system with and without cells na not available, an intermediate phase does not occur, for example when the target component or impurities (eg HCP, host cell DNA) precipitate in large quantities.
  • the precipitation of the components from the solution can occur, for example, with high salt contents, high polymer contents, corresponding pH values in the selected aqueous two-phase system for sensitive components.
  • each phase has its own range of electrical conductivity.
  • the exemplary values for electrical conductivity given in Table 1 can serve as setpoint ranges for the aqueous two-phase systems (ATPSs) used.
  • the electrical conductivity range for the light phase may be in a target range of 10-25 mS/cm and for the heavy phase in a target range of 60-80 mS/cm .
  • the set value range for the electrical conductivity for the light phase of an aqueous two-phase citrate system can be 5-15 mS/cm and for the heavy phase 30-50 mS/cm.
  • the range of values for the electrical conductivity in the individual phases should not actually be changed by the presence of cells in the individual phases. In the presence of cells, however, an intermediate phase can occur, the electrical conductivity of which is in the range of 40-50 mS/cm in a two-phase phosphate system and in the range of 30-40 mS/cm in a two-phase citrate system.
  • the target values given in Table 1 depend on the respective polymer (the respective polymers), the salt (the salts used) and the respective concentration, so that these target value ranges are primarily only for orientation and also differ significantly in individual cases the specified areas can differ.
  • the presence of conductivity-reducing bioparticles e.g. cells
  • the light phase setpoint range can be monitored and controlled as follows:
  • the setpoint range is the range expected for the light phase.
  • the setpoint range for a light phase in an aqueous two-phase phosphate system is 10-25 mS/cm as given in Table 1. That is, the probe in the light phase measures an electrical conductivity in the range of 10 to 25 mS/cm at the position at which it is located.
  • the probe in the light phase starts the higher electrical conductivity of an intermediate phase of 40- 50 mS/cm or even the heavy phase of 60-80 mS/cm.
  • the intermediate phase and possibly also the heavy phase therefore begin to build up in the separator.
  • the heavy phase and/or intermediate phase is therefore removed from the separator, ie it is continuously For example, the removal rate of the heavy phase is increased during continuous operation. This continues until the phase interface moves downwards and the measured conductivity of the light phase is again within the setpoint range.
  • the removal rate of the light phase from the separating device can also be reduced or stopped entirely, in which case, for example, the upper outlet can be throttled or closed.
  • the setpoint range for the heavy phase can be monitored and controlled as follows:
  • the setpoint range is the range expected for the heavy phase.
  • the setpoint range for a heavy phase in an aqueous two-phase phosphate system is 60-80 mS/cm. This means that the probe in the heavy phase measures an electrical conductivity in the range of 60 to 80 mS/cm. If the electrical conductivity measurement now shows that this range is undershot, i.e.
  • the probe starts in the heavy phase, the lower electrical conductivity of an intermediate phase of 40-50 mS /cm or even the light phase of 10-25 mS/cm.
  • the light phase or intermediate phase therefore approaches the position of the heavy phase probe.
  • the removal rate of the heavy phase from the separating device can be reduced, for example. Alternatively, the removal of the heavy phase can be stopped altogether.
  • the removal of the phases from the separating device can be controlled and monitored by the removal quantity, removal speed and/or removal duration, in which case the removal of a phase can also be interrupted completely. Measures and devices for this are familiar to a person skilled in the art.
  • the removal of the phases can be controlled and monitored by gravity or using positive or negative pressure, for example vacuum. Positive or negative pressure or vacuum can be generated in any way.
  • One or more pumps can also be used. Examples of extraction devices for changing the extraction quantity are valves, flow limiters, hose pinch clamps and the like, which can also be used to completely end or interrupt the extraction of a phase.
  • Removal devices for changing the removal speed are, for example, pumps. Measures and devices other than those described are also possible.
  • a dip tube can also be used as an additional outlet for a phase. This embodiment of the invention will be explained in detail later.
  • both the decrease and the increase in the individual phases and the phase interfaces in the separating device can therefore be monitored and controlled.
  • the increase in the phases can be caused by a build-up of one or more phases or by the continuous supply of further aqueous two-phase system to be separated.
  • the subsidence of the phases can be traced back to the extraction of the phases.
  • an equilibrium is established between the phases fed in and discharged, with monitoring of the electrical conductivity being used for this purpose.
  • a very flexible monitoring and control system is therefore provided, which can intervene directly in the event of phase (volume) changes in the separating device and also works reliably in the case of continuous extraction.
  • the phases are then separated on the basis of the measured electrical conductivity by removing the phases from the separating device.
  • the phases can be separated continuously or discontinuously by removing the respective phases from the separation device using the measured electrical conductivity.
  • the expression "removal of the respective phase based on the measured electrical conductivity" means that the respective phase to be separated can be identified based on or by its measured electrical conductivity values at one or more positions in the phase in question and can therefore be selectively removed from the separation device.
  • the extraction of the phase is therefore monitored by measuring the electrical conductivity.
  • the present invention therefore combines the known height of the measurement position and the conductivity information from one or more probes to actively control the phase boundary in the separation device.
  • an outlet is provided in the separating device and at least one of the phases is removed from the separating device through the outlet according to step f. by gravity or using positive or negative pressure, in which case a pump can be used.
  • a pump can be used.
  • This can be the case, for example, with a discontinuously operated system. For example, if only one batch of material is to be separated via an aqueous two-phase extraction, there may be only one outlet, which may be provided in the lower part of the separator.
  • outlets in the separator there can also be at least 2 outlets in the separator; this can be the case, for example, in a continuously operated system. There can also be three or more outlets in the separator.
  • outlets can be provided, an upper outlet arranged in the upper part of the separator and a lower one Outlet located in the lower part of the separator.
  • An outlet is an opening through which the liquid exits. This can have any configuration.
  • the outlet can be closable continuously or in stages, for example by a valve, a flow limiter or a hose pinch clamp and the like.
  • an upper outlet is provided in the separator for removing the light phase from the separator using gravity or positive or negative pressure, it also being possible to use a pump to generate positive or negative pressure; and a bottom outlet is provided in the separator for removing the heavy phase from the separator using gravity or positive or negative pressure, which may also include the use of a positive or negative pressure pump. This will be explained in detail later.
  • a phase is removed according to step f. in continuous operation through a height-adjustable dip tube that has an opening that is immersed in the phase to be removed, the dip tube being connected to a lower outlet in such a way that the opening in the dip tube allows the phase to drain to the outlet under gravity; or the dip tube has an opening (192) through which the withdrawal of the phase is carried out using positive pressure or negative pressure generated with or without a pump or a pump.
  • an outlet can be designed in such a way that it represents a height-adjustable dip tube, with an opening for removing a phase being provided in the dip tube.
  • a “dip tube” is understood to mean a tube that is inserted into the separating device from above and liquid of one phase can flow off or be drawn off through an opening in the dip tube.
  • the tube is immersed in the relevant phase in such a way that the phase can be removed from the separating device with the opening in the immersion tube. This can be done either passively, with the phase escaping by gravity, or this can be done actively, with pressure, in particular negative pressure, being applied to the dip tube or the relevant phase being pumped out by a pump which is connected to the dip tube.
  • the dip tube is used to adjust the phase position(s) and position(s) of the phase interface(s).
  • the dip tube therefore represents an outlet present in the separating device.
  • the continuous or discontinuous removal of the phases in the separating device according to step f. can be carried out here via a height-adjustable dip tube and thus a height-adjustable opening in the dip tube.
  • the dip tube can be used to withdraw the light phase, heavy phase or intermediate phase.
  • the dip tube can be used continuously or discontinuously. A semi-continuous mode of operation is also possible, in which case continuous sections and discontinuous sections can alternate.
  • the dip tube can be used, for example, to maintain a continuous process, with the adjusted equilibrium of the supplied and removed phase(s) in the separating device also being maintained by using the dip tube.
  • the dip tube can also be used to eliminate temporary disturbances, for example the accumulation of one of the phases in the separator, and then ensures that the accumulated phase is drained off.
  • the dip tube is immersed in one of the two or three phases in the separator, whereby the opening in the dip tube allows that phase to be removed through the opening. Drainage can be done simply by gravity; then the dip tube with opening is a kind of overflow valve. However, the phase can also be actively removed through the opening in the immersion tube, for example using positive or negative pressure or vacuum. A pump can also be used.
  • the dip tube operates in continuous operation using gravity as an overflow valve, it is convenient when removing the light phase through the dip tube if a lower outlet in the separator is opened. When removing the heavy phase through the dip tube, it is expedient if an upper outlet in the separator is opened.
  • the opening in the dip tube can be permanently open; a closure for the opening, such as a cap or valve, could also be provided.
  • the height adjustability of the dip tube means that the dip tube can be moved up and down in the separator and thus be immersed in one of the two or three phases, so that one of the phases is selectively removed with the dip tube.
  • the dip tube can be moved up and down during extraction in order to react to changes in the phases, for example so that the opening in the dip tube does not leave the phase and only the desired phase is extracted through the existing opening.
  • “Raising up” or “moving up” the dip tube is used interchangeably and means that while the dip tube is in operation, it is repositioned or readjusted upwards to keep the dip tube in phase from which it is designed to take phase liquid and such the phase liquid can still be removed.
  • the dip tube can also be fully raised or raised. Then its opening is, for example, above the liquid level or its opening is raised so far that no more liquid can flow out of it. For example, the full ramp-up of the dip tube may occur at the beginning of the extraction process and be performed at the end of the extraction process.
  • “Lowering” or “moving down” the dip tube is used interchangeably and means that while the dip tube is in operation, it is positioned or readjusted downwards so- with the dip tube remaining in the phase from which it is to draw phase liquid and phase liquid can still be drawn.
  • the control of the height adjustment of the immersion tube can be carried out directly via the measured values of the electrical conductivity.
  • the immersion tube is usually constantly in use. If disturbances occur in continuous operation, the operation of the dip tube can be interrupted or the dip tube can also be used first to allow the phase interface(s) or the level to rise or fall. In particular, at the beginning of the extraction process (start-up) and at the end of the extraction process (shutdown), the dip tube is usually not in operation, i.e. no liquid is removed through the opening in the dip tube.
  • phase interface position By removing one or more phases, a targeted lowering of the phase interface position and thus of course also the phase positions can be carried out.
  • the target product can be in the light or heavy phase.
  • the dip tube can be used to remove the phase with or without the target product from the separation device.
  • any intermediate phase that may be present can also be removed from the separating device with the dip tube. If one of the phases and the intermediate phase are to be removed at the same time, for example because the target product is in the other phase, two phases could also be removed from the separating device simultaneously with the dip tube. For this purpose, the opening of the dip tube could be positioned at the phase interface.
  • the immersion tube is constructed from an inner tube that includes an opening and the inner tube is surrounded by an outer tube in the form of a jacket tube or overtube.
  • the outer tube is fixed and cannot be moved, whereas the inner tube can be moved up and down.
  • the overtube can also be designed to be movable.
  • the over tube like the inner tube, can be made of any material as long as it does not adversely affect the liquids to be sampled. For example, stainless steel, plastic or glass are possible.
  • the over-tube has an upper end and a lower end that define the length of the over-tube.
  • the length of the cover tube is generally freely selectable. Depending on which phase is taken should be, the length of the outer tube can be selected.
  • a cover tube extending from top to bottom or also a cover tube extending from bottom to top can be used.
  • the lower end of the overtube extends (seen from above) into the heavy phase or, if present, into the intermediate phase, depending on which of the phases is to be removed.
  • the dip tube therefore comprises an overtube extending from top to bottom, the upper end of which is above the light phase and the lower end of which is in the heavy phase.
  • the lower end of the overtube is conveniently located below the heavy phase in the separator, i.e. the overtube is below the separator, in particular under or on the lower wall of the separator, for example the outside or inside of the bottom of the separator, and extends into the interior of the separator.
  • the top of the overtube extends (seen from below) into the light phase or, if present, into the intermediate phase, depending on which of the phases is to be sampled.
  • the dip tube comprises an overtube extending from bottom to top, the upper end of which is located below the heavy phase and the upper end of which is located in the light phase.
  • the height-adjustable immersion tube is therefore formed from a height-adjustable inner tube and an outer tube, it being possible for the outer tube to extend from top to bottom or from bottom to top.
  • the inner tube has an opening for removing the appropriate phase.
  • the diameter of the outer tube is larger than the diameter of the inner tube, so that a gap is formed between the inner tube and the outer tube.
  • the inner tube is therefore surrounded by the outer tube, so that an intermediate space is formed between the inner tube and the outer tube.
  • the dip tube can be connected to the lower outlet in such a way that the phase can flow off under gravity to the outlet through the opening in the dip tube.
  • the overtube in the separator is shorter than the inner tube because the inner tube runs the full height of the separator extends.
  • the inner tube is then only partially inside the outer tube and can be moved up and down there.
  • the opening of the inner tube is only moved within the outer tube.
  • the outer tube is a suction tube and it is longer than the inner tube in the separator.
  • the inner tube is entirely inside the outer tube and can be moved up and down there.
  • the opening of the inner tube is only moved within the outer tube.
  • All embodiments of the immersion tube with an outer tube have in common that in each case the outer tube is formed in such a way that it protrudes beyond the opening of the inner tube.
  • the opening of the inner tube is thus inside the outer tube.
  • the length of the overtube can be varied depending on which phase is to be removed. How far the outer tube protrudes beyond the opening of the inner tube depends on the individual case and can be determined and adjusted by a person skilled in the art in a few tests.
  • the diameter of the over tube is set larger than the diameter of the inner tube so that a clearance is formed between the inner tube and the over tube.
  • the phase into which the outer tube extends flows into this space and can reach the opening in the inner tube from where the phase liquid can then exit.
  • the phase liquid therefore does not reach the opening in the inner tube directly, but only via the intermediate space, so that the overtube represents an inlet protection.
  • the heavy phase rises in the intermediate space and only then reaches the opening in the inner tube. Since the outer tube extends beyond the opening of the inner tube, this ensures that a phase present above the lower end of the outer tube, here: the intermediate phase and the light phase, cannot easily reach the opening.
  • the intermediate phase rises up in the intermediate space and only then reaches the opening in the inner tube. Since the outer tube extends beyond the opening of the inner tube, this ensures that a phase present above the lower end of the outer tube, here: the light phase, cannot easily reach the opening.
  • the overtube In the case of the overtube extending from bottom to top, which reaches, for example, into the light phase, the light phase flows into the space between the inner and overtube by gravity in and only then reaches the opening in the inner tube. Since the outer tube extends beyond the opening of the inner tube, this ensures that a phase present below the upper end of the outer tube, here: the intermediate phase and the heavy phase, cannot easily reach the opening. The overtube therefore lengthens the path of the unwanted phase(s) to port.
  • the intermediate phase flows by gravity into the intermediate space, which fills up, and only then reaches the opening in the inner tube. Since the outer tube extends beyond the opening of the inner tube, this ensures that a phase present below the upper end of the outer tube, here: the heavy phase, cannot easily reach the opening.
  • the different variants of the outer tube can each be combined with the embodiments of the inner tube, with a suitable design being able to be selected depending on which phase is to be removed and depending on where the target product is located.
  • the diameter of the overtube is only significant insofar as the diameter of the overtube is greater than the diameter of the innertube.
  • the diameters of the outer tube and inner tube are therefore selected depending on the embodiment.
  • the respective diameters of the inner tube and outer tube and thus the size of the gap formed are not of great importance, since the phase liquid will rise in the gap or flow into it when the outer tube is immersed in the phase.
  • the desired speed of the inflow of the phase liquid into the space by varying the distance between the inner and outer tube in order to set a suitable size for the space for each application can be optimized, for example, by a few preliminary tests.
  • the diameter of the outer tube and thus the distance from the inner tube can therefore be chosen arbitrarily and can be selected by a person skilled in the art for the respective application. This is, for example: (for DN50) 10 mm for the inner pipe and 20 mm for the outer pipe or (for DN150): 35 mm for the inner pipe and 60 mm for the outer pipe.
  • extension tube is rigid and not movable, it is advisable to determine before starting the extraction which phase is to be extracted with the immersion tube, since the length of the extension tube determines which phase it is immersed in and the extension tube does not easily do so during operation can be exchanged.
  • the overtube is designed to be movable, it can also be changed in length during extraction if this becomes necessary.
  • the outer tube therefore protrudes beyond the opening in the inner tube, so that the outer tube serves as additional inlet protection, so that only the phase into which the outer tube extends can enter the space between the inner and and outer tube can flow in and only this phase can escape from the opening in the inner tube.
  • the length of the overtube and its diameter is selected such that the access of suspended matter, flakes and other solid or semi-solid components from the phase in which the overtube is immersed is prevented from entering the opening in the inner tube of the dip tube.
  • the outer tube thus allows liquid to enter the opening of the inner tube, but shields the opening from suspended matter and larger components. This has the advantage that unwanted components such as suspended matter, flakes and the like are held back by the overtube and thus do not get into the opening to block it.
  • the dip tube acts as an overflow valve, i.e. the phase liquid can flow out of the opening under gravity.
  • the dip tube is connected to the lower outlet with or without a cover tube in such a way that liquid can only flow out through the lower outlet through the opening in the dip tube, but liquid cannot flow directly out of the separating device into the lower outlet.
  • the dip tube is connected to the lower outlet in such a way that there is a liquid-tight connection, but the dip tube can still be moved up and down without affecting the connection to the outlet.
  • Such compounds are known to those skilled in the art and do not need to be explained in detail.
  • the dip tube is in operation when liquid is withdrawn or withdrawn from the separator through the opening of the dip tube.
  • the dip tube is not in operation when no liquid is withdrawn or withdrawn from the separator through the opening in the dip tube.
  • step e measured electrical conductivity values used to control the immersion depth of the height-adjustable immersion tube through the immersion tube.
  • continuously measuring the electrical conductivities in the separation device can therefore be used to control the height-adjustable dip tube and to regulate its height or immersion depth depending on the position of the phase interface and/or the phases, so that the desired phase can be removed through the opening in the dip tube.
  • This can be done in real time, so that the height adjustment of the dip tube is automatic depending on the measured values for the electrical conductivity and thus the position of the respective phase and the position of the phase interface(s).
  • the outflow speed in the dip tube can also be varied by adjusting the height, since the deeper the opening of the dip tube is in the respective phase, the faster the phase runs off due to gravity, since the hydrostatic pressure is higher.
  • the dip tube can therefore be used in a continuous process and used there continuously. However, it can also only be used temporarily and then during continuous operation eliminate the faults that occur due to the accumulating phase over a limited period of use.
  • the dip tube is then reinserted whenever the fault develops and this is repeated until the procedure is terminated.
  • the dip tube would then be used intermittently.
  • the respective phases flow out of the upper and possibly lower outlet of the separation device, for example driven by and according to the flow of the aqueous two-phase system (ATPS) into the separation device, out of the separation device.
  • the dip tube can then serve as a liquid balance.
  • the removal of the phases and thus also the general upward or downward shifting of the phase interface(s) in the separating device is monitored in the present invention using the continuously measured values for the electrical conductivity by one or more probes.
  • the present invention therefore links the known height of the measurement position of the one or more probes and the conductivity information of the one or more probes in order to be able to determine, actively control and regulate the phase interfaces ⁇ ) in the separating device in continuous operation.
  • the phase interface(s) can be readjusted upwards or downwards.
  • This can be done, for example, by varying the feed quantity and/or feed rate of the incoming two-phase system (ATPS) (which was produced with the starting solution) to the separation device and/or the withdrawal quantity, withdrawal rate and/or withdrawal duration of light phase/ heavy phase/intermediate phase from the separating device can be varied, whereby the removal of a phase can also be completely interrupted.
  • ATPS aqueous two-phase system
  • this can be done by increasing or decreasing the heavy phase extraction rate; the light phase extraction rate is increased or decreased; the withdrawal rate for the heavy phase is increased or decreased; the extraction rate for the light phase is increased or decreased; increase or decrease the collection time for the severe phase; the light phase collection time is increased or decreased; the collection of the light or heavy phase is interrupted; the feed amount of the aqueous two-phase system flowing into the separator, with or without the target product, is increased or decreased; the feed rate of the aqueous two-phase system (ATPS) flowing into the separation device, with or without target product, is increased or reduced and/or the dip tube is used to drain or suck off a phase and, if necessary, is repositioned upwards or downwards.
  • the aqueous two-phase system AVS
  • the supply quantity and supply speed or removal quantity and removal speed are related to one another, so that, for example, the flow rate (volume per period of time or quantity per time) can also be increased or reduced.
  • Varying the feed quantity/feed rate of the incoming aqueous two-phase system without the target product represents, for example, a rinsing solution that can be used in particular at the end of the extraction to displace the light phase or the heavy phase from the separation device.
  • One or more extraction devices and/or means for regulating and/or controlling the extraction quantity, extraction speed and/or extraction duration of light phase/heavy phase/intermediate phase from the separation device can be used in the separation device based on the measured values of the electrical conductivity values.
  • These are known to those skilled in the art, except for the use of a dip tube, and include, for example, the use of gravity in connection with one or more outlets and the dip tube: for example, allowing the heavy phase to flow off at the lower outlet of the separator or using the dip tube as an additional outlet, which then acts as an overflow valve;
  • overpressure in connection with an inlet, whereby the strength of the overpressure can be controlled (the driving force for the outflow of the phase(s) here is overpressure): for example feeding the aqueous two-phase system under pressure into the separator;
  • a negative pressure in connection with one or more outlets and the dip tube whereby the strength of the negative pressure can be regulated (the driving force for the outflow of the phase(s) is negative pressure here): for example at one or more outlets to draw off the light and/or or severe phase; or with the dip tube as an additional outlet, which then acts as a suction tube and sucks off one of the phases; the use of one or more pumps in connection with one or more outlets and the dip tube, the pumping speed of which can be controlled (the driving force for the outflow of the phase(s) is negative pressure here): for example for the supply of the two-phase system to the separating device and/or removal at one or more outlets and/or through the dip tube; and/or the use of extraction devices in connection with one or more outlets, which can regulate and/or control the cross-section of one or more outlets of the separation device, such as adjustable valves, adjustable flow restrictors, adjustable hose clamps, adjustable stopcocks and the like (whereby the driving force for the effluent from
  • “Regulation and/or control of the extraction quantity, extraction speed and/or extraction duration” of the phases is understood as influencing the variation of the quantity, duration and/or speed of the liquid exiting from the at least one outlet or the dip tube. It includes the control and correction and/or regulation of the amount, speed or duration of the leaking liquid.
  • a height-adjustable dip tube with an opening for removing a phase using gravity (the driving force for the outflow of the phase(s)) can be used.
  • the height of the opening in the separating device can be varied, as already described in detail.
  • the height of the opening of the dip tube in the separating device can be adjusted continuously or in steps. Likewise, the removal from the separating device can also be stopped completely if the opening of the dip tube is set above the level of the light phase or the level of the phase liquid present in the intermediate space. Due to gravity and hydrostatic pressure, the rate of removal from the separating device is higher the deeper the opening of the dip tube is in the separating device.
  • the one or more pumps used according to the invention can regulate the withdrawal speed continuously or in steps. Likewise, the removal rate can be regulated and/or controlled by switching the pump on and off (on/off regulation). Pumps can be feed pumps for conveying liquids or vacuum pumps that generate a pressure difference.
  • Negative pressure can be created, for example, by compressing air.
  • the strength of the negative pressure, which is applied to one or more outlets of the separating device, can also be set continuously or in steps, or there is an on/off control.
  • a vacuum can also be generated with a pump.
  • the valves, flow regulators, hose clamps, stopcocks and the like are also infinitely or incrementally adjustable so that removal from the separator can be infinitely or incrementally controlled. However, the valves, flow regulators, hose clamps, stopcocks can also regulate and/or control the outflow from the separation device by being fully opened or closed.
  • the heavy phase can be removed or withdrawn from the separating device via the dip tube, and the amount removed and/or the rate of removal of the light phase at an outlet can be regulated and/or controlled by a pump.
  • the phases can be withdrawn from the separator continuously or discontinuously, the driving forces for the outflow of the phase liquid from the separator being: gravity; one or more pumps;
  • the driving force for the outflow of the individual phases from the separator is also the inflow of the aqueous two-phase system (ATPS) into the separator.
  • aqueous two-phase system aqueous two-phase system
  • the amount of inflowing aqueous two-phase system (ATPS) the sum of the amounts of outflowing light, heavy and optionally intermediate phase from the separator.
  • the phase interface(s) should actually be constant in the middle of the separation device. Fluctuations, disturbances and the like can now result in the phase interface(s) shifting(s). In this case, a regulation is then made.
  • the rate of withdrawal of one or both phases and optionally the intermediate phase from the separator is regulated by: the height of the opening of a dip tube; a pump whose pumping speed can be controlled;
  • the strength of the negative pressure being adjustable; one or more sampling devices capable of regulating and/or controlling the cross-section of one or both outlets of the separation device, such as controllable valves, controllable flow restrictors, controllable hose pinch clamps, controllable stopcocks and the like.
  • the withdrawal speed of the liquid for example the light and/or heavy phase, is regulated or controlled by the set pump speed.
  • pumps are used that allow low mechanical stress. This has the advantage that unwanted shearing forces in the phases are avoided and the process is therefore also suitable for such target products.
  • the electrical conductivity values measured can thus be used to regulate and/or control the extraction quantity, extraction speed and/or extraction duration of one or more phases, whereby the extraction of a phase can also be completely interrupted, for example by the extraction devices and/or described here. or medium. In this way, the position of the phases and thus the phase interface(s) in the separating device can be influenced in a targeted manner.
  • the above statements on the position of the probe/outlet can also be relevant here: i.e. the opening in the dip tube is nothing more than an outlet in the separator.
  • the opening of the dip tube for removing the heavy phase is arranged lower than the probe(s) in the heavy phase, i.e. the position at which the probe measures the electrical conductivity is then above the position where the opening of the dip tube is located in the separator. In this way, it is possible to detect an excessive drop in the light phase (upper phase) and/or, if applicable, the intermediate phase with the electrical conductivity values before it flows out through the opening of the dip tube.
  • the opening of the dip tube for sampling the light phase is placed higher than the probe(s) in the light phase, i.e. the Position where the probe measures electrical conductivity is below the position where the dip tube opening is in the separator. It is thus possible to detect an excessive increase in the heavy phase (lower phase) and/or, if applicable, the intermediate phase with the electrical conductivity values before it is drawn off through the opening of the dip tube.
  • the lower end of the cover tube for removing the heavy phase can be located deeper than the probe ⁇ ) in the heavy phase ( located), ie the position at which the probe measures the electrical conductivity is above the position where the lower end of the overtube is in the Separator is located.
  • an excessive drop in the light phase (upper phase) and/or possibly the intermediate phase can be detected with the electrical conductivity values before they penetrate into the space between the inner tube and the outer tube and flow out through the opening of the immersion tube.
  • the upper end of the overtube for removing the light phase when using a dip tube with an overtube extending from bottom to top, when removing the light phase through the opening of the dip tube, the upper end of the overtube for removing the light phase can be higher than the probe ⁇ ) in the light phase (i.e. the position where the probe measures electrical conductivity is below the position where the top of the overtube is in the separator. In this way, an excessive increase in the heavy phase (lower phase) and/or the intermediate phase can be detected with the electrical conductivity values before they penetrate the space between the inner tube and the outer tube and flow out through the opening of the immersion tube.
  • the present invention therefore links the known height of the measurement position and the conductivity information of one or more probes to actively control the phase boundary in the separation device.
  • a horizontal separating device such as a separator
  • a dip tube for example in the form of a discharge tube or overflow valve
  • the phase boundary surface(s) would be readjusted upwards or downwards by automatically moving the dip tube to remove one of the phases repositioned up or down.
  • the regulation and control method described can therefore serve to ensure that one phase is only withdrawn via one outlet at a time, e.g. the light phase only via the upper outlet and the heavy phase only via the lower one Outlet of the separating device or via the opening of the immersion tube with or without an overtube. Furthermore, the regulation and control method can be used to carry out a targeted raising or lowering of the phase interface(s). This is particularly advantageous during a continuous extraction, as this prevents individual phases from damming up or falling off.
  • the turbidity can also be measured and used as described for the electrical conductivity.
  • the regulation and control process can be performed manually, automatically or using software.
  • the targeted increase in the phase interface position(s) in the separating device can be advantageous. This can be done, for example, for the complete emptying of the separator at the end of a continuous extraction, since otherwise a large part of a phase might remain in the separator and could not be recovered. For example in the case of For the valuable target products, it can be useful if the separation device is completely emptied of residues.
  • a rinsing solution for example composed of the heavy phase or light phase or another suitable solution, is added.
  • the proportion of the heavy phase in the separating device can then be increased in such a way that the light phase is displaced upwards and can thus be easily removed through the outlet arranged at the top.
  • the proportion of the light phase in the separating device can be increased by adding an appropriate flushing solution in such a way that the heavy phase is displaced downwards and can thus be easily removed through the outlet located below.
  • the light phase can be displaced upwards in the separator by raising the dip tube which had removed the heavy phase and therefore no longer removing the heavy phase.
  • the heavy phase accumulates and thus pushes the light phase upwards, which can then be easily removed from the outlet.
  • the heavy phase can be displaced down the separator by raising the dip tube that had removed light phase and therefore no longer removing light phase. As a result, the light phase accumulates and thus presses the heavy phase down, which can then be easily removed from the outlet.
  • a “targeted reduction or increase” means that this can be monitored in real time with the continuously measured conductivity values and controlled externally using the measures already explained in detail.
  • the desired phase with the target product is then in step g. receive.
  • the method of the invention can be carried out without intermediate steps, so that the individual steps a. to g. connect to each other.
  • the method according to the invention can also be part of an industrial-scale method.
  • the method according to the invention can be integrated on an industrial scale as automated cell harvesting and purification (capture step) in the processing of, for example, a monoclonal antibody as the target product.
  • a cell culture is then cultivated in a bioreactor, which produces the target product.
  • the aqueous two-phase extraction carried out according to the method of the invention in order to purify and enrich the target product accordingly. Further purification steps for the target product could follow in a third process step.
  • the invention also relates to a method for producing plasmid DNA, a plasmid DNA being provided; this is transformed in a microorganism selected from eukaryotes and prokaryotes, multiplied there and then obtained by alkaline lysis; the method of the present invention is carried out; then the plasmid DNA obtained is further purified, optionally modified and optionally formulated.
  • the method according to the invention can therefore also be used in the production of plasmid DNA on an industrial scale.
  • the plasmid DNA is produced intracellularly in a microorganism, such as in a eukaryotic or a prokaryotic organism, for example in yeast, in particular in a bacterium, for example in E. coli.
  • the microorganism is transformed with the plasmid DNA to be produced and the transformed microorganism is cultivated under conditions which lead to an increase in the amount of plasmid DNA in the culture broth.
  • the lysate is transferred to an aqueous two-phase system (ATPS).
  • a light and a heavy phase form and an intermediate phase, the precipitate of cell components, proteins, genomic DNA, RNA precipitated potassium dodecyl sulfate (and other impurities.
  • the aqueous two-phase extraction (ATPE) according to the present invention, the Plasmid DNA purified and enriched in the heavy phase.
  • the alkaline lysis and the immediately following aqueous two-phase extraction (ATPE) can be carried out continuously and automatically.
  • aqueous two-phase extraction in the processing of the heavy phase include, for example, diafiltration, concentration by ultrafiltration, precipitation with ammonium sulfate or other salts and/or two or more chromatography steps [3], for example anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography,
  • the plasmid DNA can be converted into a certain concentrations be concentrated and ultradiafiltered against a formulation buffer. Thereafter, the plasmid DNA can be further formulated.
  • the two aqueous phases with or without an intermediate phase, being reliably detected by continuous measurement(s) of the electrical conductivity at a suitable position or positions in the separation device.
  • Reliable detection of the level of the phase interface is necessary in order to provide a robust automation method.
  • the method according to the invention is also suitable for an industrial scale. Large scale production with separator volumes in excess of 1 m 3 is possible.
  • the different turbidity of the different phases can also be measured.
  • the electrical conductivity and/or turbidity can be measured continuously in at least one of the phases in the separation device.
  • the invention is then directed to a method of purifying and concentrating a target product selected
  • immunoglobulins or other proteins are immunoglobulins or other proteins.
  • plasmid DNA genomic DNA, RNA or other nucleic acids; or viruses, comprising the following steps: a. providing a starting solution containing the target product; b. Converting the starting solution into an aqueous two-phase system by adding at least one polymer and at least one salt in a suitable concentration, or by adding at least two polymers in a suitable concentration; c. Mixing of the aqueous two-phase system to obtain a mass transfer, so that the target product is enriched in the light phase or in the heavy phase; i.e. allowing the phases to separate in a separator into a light phase, a heavy phase and, if an intermediate phase is present, an intermediate phase; e.
  • the turbidity can be measured with one or more turbidity measuring devices that protrude into the separation device in the form of one, two, three or more turbidity probes.
  • the continuous measurement of the turbidity in at least one of the phases in the separator can be carried out with one or more turbidity measuring devices in the form of one, two, three or more probes, in particular for continuously measuring the turbidity of the heavy at least one probe and for continuously measuring the turbidity of the light phase at least one probe at a suitable position in the separator.
  • the turbidity is measured optically and can be carried out with transmitted light measurement or scattered light measurement.
  • a transmitted light measurement is preferably carried out.
  • the turbidity is measured in the unit FAU (Formazin Attenuation Units).
  • FAU Form Attenuation Units
  • NTU FTU
  • the difference in measured turbidity values is preferably about 100 FAU between the different phases in order to be able to distinguish the different phases from each other. In individual cases, however, lower values are also possible.
  • the electrical conductivity or also only the turbidity can be measured in a separating device.
  • a combination of measuring the electrical conductivity and measuring the turbidity is used in a separating device according to the invention.
  • FIG. 1 is a schematic side view in section of an exemplary embodiment of a separator 10 according to the invention, showing the course of an extraction of a batch (batch extraction) at 3 times of separation with a probe 60 for measuring the electrical conductivity of the phases, plotted against time , represents.
  • the separating device 10 is a stirred tank. This can be of any suitable shape and size and constructed of any suitable material. For example, a single-use bag container can also be used.
  • the separator 10 includes a stirrer, here a stirrer shaft with a propeller stirrer 15, the is driven by a motor 25. Other stirring devices are possible or can also be omitted depending on the application.
  • the production and mixing of the aqueous two-phase system can take place in this separating device 10 or outside of the separating device 10 and the resulting aqueous two-phase system (ATPS) can then be transferred to the separating device 10 .
  • An outlet 50 is located at the bottom of separator 10. Mounted in outlet 50 is a probe 60 which measures the electrical conductivity of the liquid flowing past. In the diagram below the 3 separation devices, the electrical conductivity measured continuously by the probe 60 in [mS/cm] of the respective phases is plotted over time in [s].
  • the separating device 10 in the illustration on the left in FIG. 1 is already filled with all 3 phases. Accordingly, a starting solution has already been provided (step a.), which is converted into an aqueous two-phase system in the separating device 10 by adding at least one polymer and at least one salt, or at least two polymers, each in a suitable concentration (step b .) And mixed accordingly with the aid of the stirrer 15 (step c.).
  • the target product is a protein that accumulates in the light phase, in particular that it is essentially present in it.
  • the phases obtained after the subsequent separation of the phases (step d.) are illustrated in the left-hand image of FIG.
  • the top phase 20 is the light phase containing the protein, the intermediate phase 30 and the lower heavy phase 40 contain undesirable components in the form of impurities and the like.
  • FIG. 1 illustrate the course of the aqueous two-phase extraction of an exemplary protein (steps e., f. and g.) in an exemplary aqueous two-phase system for a discontinuous or batchwise extraction in three stages :
  • the figure on the left shows all three phases 20 , 30 , 40 in the separating device 10 after the phases have separated, with the heavy phase 40 being discharged from the outlet 50 .
  • the graph below the 3 separators 10 shows the electrical conductivity values measured by the probe 60 during the extraction.
  • the graph indicates a high electrical conductivity for the heavy phase 40 measured by the probe 60, which remains constant for practically the entire time that the heavy phase 40 is discharged from the separator.
  • the heavy phase 40 can therefore be clearly assigned via its electrical conductivity and can thus be distinguished from the other phases 30, 20 and thus separated exactly.
  • the heavy phase 40 has already been separated off and the intermediate phase 30 is now being discharged from the outlet 50.
  • the diagram below now shows an average electrical conductivity for the intermediate phase 30. Even when the intermediate phase 30 is drained from the separating device 10, the electrical conductivity measured with the probe 60 is almost constant over time.
  • the intermediate phase 30 shows different electrical conductivities than the light phase 20 or the heavy phase 40, so that the phases 20, 30, 40 can be precisely separated from one another on the basis of the continuously measured conductivity.
  • the intermediate phase 30 has already been separated and what now remains in the separation device 10 is the light phase 20 which contains the target protein.
  • a discharge of the light phase 20 from the outlet 50 indicates in the lower graph on the right a low electrical conductivity for the light phase 20 measured with the probe 60, which is almost constant throughout the discharge of the light phase 20 from the outlet 50 remains.
  • the separate draining of the phases can therefore be controlled by measuring the electrical conductivity:
  • the target product is in the light phase 20
  • the heavy phase 40 and the intermediate phase 30 are drained first and, if necessary, discarded.
  • a valve for example, which is provided below or after the probe 60 (not shown), is automatically closed immediately.
  • a line to a collecting vessel or the like for the light phase 20 can be connected to the lower outlet 50 after or below the valve, the valve can be opened again and the light phase 20 can be obtained in this way.
  • a valve may be used to switch the flow from separator 10 from a line through which heavy phase 40 and intermediate phase 30 are drained to another line leading to a light phase 20 receiver or the like. This line can also lead the light phase 20 directly to further processing, which can then take place continuously, batchwise or discontinuously.
  • a phase detection with only a single probe 60 is possible, whereby a phase separation can be carried out while the separating device 10 is being emptied, based on the continuously measured electrical conductivity.
  • Figure 2 shows a schematic side view in section of an exemplary embodiment of a separation device 100 according to the invention, which represents a continuous extraction with two probes (160.1, 160.2) for measuring the electrical conductivity of the phases.
  • the starting solution is a cell culture. This has already been converted into an aqueous two-phase system by adding at least one polymer and at least one salt, or by adding at least two polymers, each in a suitable concentration (step b.) and appropriately mixed (step c.).
  • the target product to be purified and enriched can be a protein, a nucleic acid or a virus. In the example shown, the target product is a protein that is mostly in the light phase. However, a protein or a nucleic acid can also be purified and enriched which, after the phases have been mixed and separated, is enriched in the heavy phase, for example, and in particular is essentially present in the heavy phase.
  • the mixed, aqueous two-phase system containing the target protein is transferred to the separation device 100 .
  • the phases are then separated in the separator (step d.).
  • the result is an upper light phase 120 in which the target product has accumulated, in particular essentially present there, for example in the form of a protein, an intermediate phase 130 and a lower heavy phase 140 in which the undesired components have accumulated, in particular these essentially have.
  • Separator 100 can be of any shape and size to perform phase separation.
  • the separator 100 is a type of lay-on separator having three outlets 150.1, 150.2 and 150.3. Other shapes for separator 100 are possible.
  • Two probes 160.1 and 160.2 are provided in the separating device 100 in order to measure the electrical conductivity of one phase in each case.
  • the probe 160.1 is immersed in the heavy phase 140 and therefore measures the electrical conductivity of the heavy phase 140 in this position.
  • the probe 160.2 is immersed in the light phase 120 and therefore measures the electrical conductivity of the light phase 120 in this position.
  • the probes 160.1 and 160.2 are each located in insertion openings 157.1 and 157.2, which are arranged axially in the wall 155 of the separating device 100 such that an axial arrangement results.
  • the insertion openings 157.1 and 157.2 and thus also the probes 160.1 and 160.2 present therein are arranged in the wall 155 of the separating device 100 in such a way that they lie on a straight connecting line. In Figure 2, the straight connecting line runs in the wall 155 of the separating device 100. Other embodiments are also possible.
  • the electrical conductivities measured with the probes 160.1 and 160.2 are shown schematically in a diagram 200 above FIG.
  • the probe 160.1 continuously measures the electrical conductivity of the heavy phase 140, indicated in the curve 140a.
  • the probe 160.2 continuously measures the electrical conductivity of the light phase 120, which is indicated in the curve 120a.
  • the curves 120a and 140a in diagram 200 show almost constant values for the electrical conductivity over time, i.e. the two probes 160.1 and 160.2 are each in the phases which can be clearly assigned via their electrical conductivities.
  • the right-hand diagram shows the measured turbidity of the phases, plotted against time.
  • the turbidity is measured with a turbidity sensor in Formazin Attenuation Units (FAU).
  • FAU Formazin Attenuation Units
  • the curve 140b shows a high level of turbidity in the heavy phase 140 since the heavy phase 140 originates from a cell culture and therefore contains components which cause the high level of turbidity.
  • the light phase 120b shows a slight turbidity. Due to the high degree of turbidity, phase separation is therefore practically impossible with the measuring devices described in the prior art.
  • the separator 100 is designed for continuous operation.
  • the upper outlet 150.2 is used to remove the light phase 120, the lower outlet 150.1 or 150.3 to remove the heavy phase 140 and also the intermediate phase 130.
  • the target product is here in the light phase 120.
  • the dip tube 180 is provided as an additional outlet.
  • it is made up of an outer tube in the form of a jacket tube or outer tube 183 and an inner tube 181 .
  • the outer tube 183 has an upper end above the separating device 100 and extends with its lower end 183a into the phase that is to be removed, here: the heavy phase 140.
  • the outer tube 183 is not movable in the embodiment shown, for example, the inner tube 181 but already. However, the overtube 183 could also be designed to be movable.
  • the diameter of the overtube 183 is greater than the diameter of the inner tube 181, so that the overtube 183 surrounds the inner tube 181 and only in an upper section of the inner tube 181.
  • the opening 182 In this upper section of the Inner tube 181 is the opening 182 so that the outer tube extends beyond the opening 182 also.
  • the extension tube 183 therefore only surrounds the height-adjustable inner tube 181 in an upper section, the length of the extension tube 183 being selected such that the extension tube 183 projects beyond the opening 182 of the inner tube 181 .
  • the opening 182 of the inner tube 181 is shielded from direct ingress of liquid, here the heavy phase 140, from the separating device 100.
  • the inner tube 181 is only surrounded by the overtube 183 in the upper portion where the opening 182 is located, but not in the lower portion of the inner tube 181 , so that the inner tube 181 is partially exposed in the heavy phase 140 .
  • the overtube 183 and the inner tube 181 form a space into which the liquid of the phase in which the lower end 183a of the overtube 183 is immersed rises (not shown) and then can exit through the opening 182 in the inner tube 181 .
  • the opening 182 in the inner tube 181 is moved up and down as follows: The opening 182 can be positioned by moving up and down such that the phase liquid rising in the intermediate space can flow off. If the opening 182 is positioned higher, the phase liquid can no longer flow out through the opening 182 and the dip tube 180 is inoperative. In addition the position of the orifice 182 decides how fast the phase liquid flows out due to the hydrostatic pressure.
  • phase liquid here: heavy phase 140
  • the phase liquid must therefore first flow into the space between inner tube 181 and outer tube 183 before it reaches opening 182 in inner tube 181 (solid arrows in Figure 2 pointing to opening 182) and then flow out through this can (dotted arrow in the inner tube 181 in Figure 2).
  • the opening 182 in the inner tube 181 is shielded and protected by the outer tube 183 .
  • the phase 140 to be removed rises into the space between the inner tube 181 and the outer tube 183 and only then reaches the opening 182. A direct access of the liquid to the opening 182 is thereby prevented.
  • the cover tube 183 thus increases the certainty that only the desired phase 140 can actually flow out.
  • the length of the outer tube 183 and its diameter i.e. in particular the size of the space between the inner tube 181 and the outer tube 183, can be selected in such a way that the access of suspended matter, flakes and other solid and semi-solid components to the opening 182 can be prevented, so that no clogging of the opening 182 or the inner tube 181 occurs.
  • dip tube 180 Other designs of the dip tube 180 are also possible.
  • the inner tube 181 of the dip tube 180 is connected to the outlet 150.1 in a liquid-tight manner, the inner tube 181, however, remaining movable.
  • the immersion tube 180 is thus still adjustable in height.
  • the ability to adjust or change the height is represented by the arrow 189 in FIG.
  • the height adjustability relates only to the inner tube 181 , more precisely the opening 182 in the inner tube 181 , which can be raised and lowered as required.
  • the heavy phase 140 penetrates into the intermediate space between the outer tube 183 and the inner tube 181, rises up there and specifically up to the opening 182 in the inner tube 181, where the liquid can then flow out of the separating device 100 into the outlet 150.1.
  • the arrows at the opening 182 symbolize the flow of the heavy phase 140 into this intermediate space up to the opening 182 and the dotted arrow in the inner tube 181 symbolizes the outflow of this heavy phase 140 through the inner tube 181 downwards and out to the outlet 150.1.
  • the inner tube 181 is therefore directly connected to the outlet 150.1.
  • Other embodiments are also possible.
  • the heavy phase 140 is drained off only with the aid of gravity.
  • the end 183a of the overtube 183 is in the heavy phase 140 so that only the heavy phase 140 enters the gap and can drain out of the opening 182 .
  • the light phase probe 160.2 120 is positioned lower in the separator 100 than the top outlet 150.2. This is useful in order to first measure the electrical conductivity and confirm that only light phase 120 is present and only then light phase 120 exiting the top outlet 150.2.
  • the probe 160.1 for the heavy phase 140 is arranged lower in Figure 2 than the lower end 183a of the overtube 183. However, it can also be advantageous if the probe 160.1 in the heavy phase 140 is higher than the lower end 183a of the overtube 183. In this way, an excessive drop in the light phase 120 and/or intermediate phase 130 can be detected with the electrical conductivity values before these rise into the space between the inner tube 181 and the outer tube 183 and flow out through the opening 182 of the immersion tube 180 .
  • the electrical conductivities of the phases 120 and 140 are continuously measured according to step e. of the method according to the invention to control the height-adjustable dip tube 180 in such a way and to regulate its height or immersion depth and possibly also the duration of the removal depending on the position of the phases or their phase interfaces in such a way that the heavy Phase 140 can flow off.
  • a controller 135 is used to automatically control the height adjustment of the immersion tube 180 as a function of the measured values for the electrical conductivity.
  • the control of the height-adjustable immersion tube 180 works as follows: the respective probes 160.1 and 160.2 are assigned target value ranges for the electrical conductivities of the phases, which result from the aqueous two-phase system used. As can be seen from Table 1 above, for example, an aqueous two-phase phosphate system has electrical conductivities in the range of 10-25 mS/cm for the light phase, for the intermediate phase: 40-50 mS/cm and for the heavy phase: 60- 80mS/cm. These setpoint ranges are used to determine and control where each phase is located in separator 100 with respect to end 183a of overtube 183 .
  • the inner tube 181 of the dip tube 183 is connected to the bottom outlet 150.1 in the separator 100 to allow heavy phase 140 to drain.
  • the heavy phase 140 can now be continuously removed with the dip tube 180 in FIG. Since the end 183a of the overtube 183 is in the heavy phase 140, the heavy phase 140 rises into the space between inner tube 181 and outer tube 183.
  • heavy phase 140 flows continuously through opening 182 of inner tube 181 in continuous operation and leaves separating device 100 the outlet 150.1.
  • the aqueous two-phase system (ATPS) 110 continuously flows into the separator 100 and the light phase 120 continuously flows out of the separator 100 via the upper outlet 150.2.
  • ATPS aqueous two-phase system
  • phase interface(s)/intermediate phase 130 shifts up or down during continuous operation, which is regularly the case, the inner tube 181 of the dip tube 180 and thus the opening 182 can be adjusted, whereby the removal rate of the heavy phase 140 from of the separating device 100 can be controlled:
  • the electrical conductivity of the probe 160.1 of the heavy phase 140 decreases.
  • the opening 182 of the inner tube 181 is moved upwards. There is then a lower hydrostatic pressure and the rate of withdrawal of the heavy phase 140 decreases.
  • the removal of the heavy phase 140 with the dip tube 180 could also be stopped entirely, for example by the opening 182 being placed above the liquid level in the separating device 100 .
  • the heavy phase 140 would then accumulate again and the phase interface(s)/intermediate phase 130 would rise again. Then the opening 182 of the inner tube
  • the opening 182 of the inner tube 181 can be shifted downwards. A higher hydrostatic pressure results. The rate of extraction of the heavy phase 140 increases. As a result, the phase interface(s)/intermediate phase 130 sinks again. After that, the opening
  • the dip tube 180 (more specifically, the inner tube 181) is constantly moving up and down during continuous operation, which corresponds to a typical zigzag movement.
  • the dip tube 180 is used continuously.
  • the opening 182 of the inner tube 181 is only moved up and down within the overtube 183 in order to utilize the inflow protection of the overtube 183 .
  • the dip tube 180 can also be used discontinuously.
  • an equilibrium can be established in that light phase 120 flows continuously out of the upper outlet 150.2 and heavy phase 140 out of the outlet 150.3.
  • the dip tube 180 can be used to compensate for the disturbances.
  • the dip tube 180 can be present with or without an overtube 183 .
  • a phase is not continuously removed through the dip tube 180, but only in the event of a fault.
  • the dip tube 180 is again connected to the outlet 150.1 at the bottom of the separator 100.
  • the immersion pipe 180 is moved from the starting position, for example above the liquid level of the light phase 120 or above the liquid level in the intermediate space, for example into the heavy phase 140, so that this, in addition to the outflow from the Outlet 150.3 can also leak out of the opening 182 in the dip tube 180.
  • the outflow quantity and speed of the heavy phase 140 from the separating device 100 thus increases overall and the phase interface(s)/intermediate phase 130 decreases again.
  • the opening 182 of the dip tube 180 can be moved up again to the starting position, for example above the level of the light phase 120 or simply above the liquid level in the intermediate space.
  • the dip tube 180 can only be moved upwards in the heavy phase 140 and less heavy phase 130 then flows out and the phase interface(s)/intermediate phase 130 rises again.
  • the over-tube 183 may or may not be variable in length. If the length of the over-tube 183 is not variable in operation, it is convenient to select the appropriate length of the over-tube 183 before beginning the extraction. Depending on the desired embodiment, the overtube 183 can then be selected in the appropriate size and dimensioned in such a way that it extends into the relevant phase. If a variable-length overtube 183 is used, its length can be suitably changed during operation. A person skilled in the art can easily implement this.
  • the overtube 183 prevents in particular the entry of undesired phase(s) (here: intermediate phase 130 and/or light phase 120), provided the phase interface(s) does not drop too far.
  • the dip tube 180 is therefore used in continuous operation of the separation device 100 either in a continuous or discontinuous manner to restore the equilibrium between the input and output phases.
  • the height-adjustable immersion tube 180 with the overtube 183 extending from top to bottom therefore serves as an outlet for the heavy phase 140.
  • the target product here: a protein
  • a protein is obtained in the embodiment shown in FIG. 2 in the light phase 120, which is removed through the outlet 150.2 (step g. of the method).
  • the overtube 183 could also reach from the bottom up (not shown) instead of from the top down and then reach into the light phase 120, with all other components in FIG. 2 being able to be adopted identically.
  • the dip tube would serve as the light phase outlet 120 .
  • the light phase 120 first flows into the space between the inner tube 181 and the outer tube and the intermediate phase fills up from bottom to top with only light phase 120 until it arrives at the opening 182 in the inner tube 181 and can then flow out into the outlet 150.1.
  • the probe 160.2 were placed in the light phase 120 lower than the top of the bottom-up overtube. This could detect an excessive increase in the heavy phase 140 (lower phase) and/or, if applicable, the intermediate phase 130 with the electrical conductivity values before they could flow into the space between the inner tube 181 and the outer tube and reach the opening 182 of the immersion tube.
  • An overtube (not shown) extending from bottom to top would prevent the entry of undesired phase (here: intermediate phase and/or heavy phase), as long as the phase interface(s) does not rise too far.
  • FIG. 3 is a schematic sectional side view of another exemplary embodiment of a separation device 100 according to the invention, which shows a continuous extraction with two probes (160.1, 160.2) for measuring the electrical conductivity of the phases at a different point in time than FIG.
  • FIG. 3 shows how a large part of the light phase 120, which would otherwise be in the separation direction 100 would stop, can be recovered.
  • the remaining light phase 120 is displaced upwards by rinsing (flushing) with a rinsing solution 115, for example with a portion of the aqueous two-phase system used.
  • the targeted increase or raising of the liquid level in the separating device 100 is achieved, for example, by adding more heavy phase 140 to the separating device 100, so that the light phase 120 is pushed upwards and can thus be easily removed through the outlet 150.2.
  • the displacement of the light phase 120 can also be achieved in a continuous extraction by the dip tube 180 being raised, as a result no more heavy phase 140 is removed and this accumulates in the separating device 100 and thereby the light phase 120 is displaced upwards.
  • heavy phase 140 could also be displaced downwards.
  • the displacement of the phase interface if no intermediate phase is present or - as in the example shown - if an intermediate phase is present, the displacement of the entire intermediate phase 130 and heavy phase 140 in the separating device 100 upwards is again based on the continuously measured values for the electrical conductivity the 2 probes 160.1 and 160.2 are monitored.
  • phase interface between the upper and lower phase or also any intermediate phase present (and thus also the two phases) downwards can also be expedient to purposefully shift the phase interface between the upper and lower phase or also any intermediate phase present (and thus also the two phases) downwards.
  • this is achieved, for example, by deliberately draining or removing the corresponding phase(s).
  • insertion openings 157.1 and 157.2 are provided in the wall 155 of the separating device 100, with the probe 160.1 being in the insertion opening 157.1 and the probe 160.2 being in the insertion opening 157.2.
  • the insertion openings 157.1 and 157.2 and thus also the probes 160.1 and 160.2 are arranged axially in the wall 155 of the separating device, i.e. the insertion openings 157.1 and 157.2 are arranged in the wall 155 of the separating device 100 in such a way that they lie on a straight connecting line.
  • the straight connecting line runs in the wall 155 of the separating device 100.
  • FIG. 4 shows a schematic side view in section of an exemplary embodiment of a separation device 100 according to the invention, which represents a continuous extraction with two probes (160.1 160.2) for measuring the electrical conductivity of the phases.
  • the dip tube 190 is shown in a different variant than in FIGS.
  • the immersion tube 190 has an opening 192 at the end of the inner tube 191 and an overtube 193. Unlike in FIGS. 2 and 3, the immersion tube 190 is not connected to the lower outlet 150.1.
  • the overtube 193 has advantages, since in the example shown it only allows the access of the heavy phase 140 to the opening 192 .
  • the outer tube 193 can extend as far down as possible, almost to the bottom of the separating device 100, so that even if the phase boundary surface(s) sinks briefly, light phase 120 and / or intermediate phase 130 arrives.
  • the end 193a of the overtube 193 is located in the heavy phase 140.
  • the position of the opening 192 then only plays a role for the removal speed.
  • the arrows in FIG. 4 symbolize how the heavy phase 140 first flows into the space between the inner tube 191 and the outer tube 193 and is then sucked into the opening 192.
  • the dotted arrow in inner tube 191 of dip tube 190 indicates the direction of flow of liquid in inner tube 191 leading to an upper outlet (not shown).
  • light phase 120 runs out at the top outlet 150.2 and the heavy phase 140 is drawn off through the dip tube 190, for example by a pump (not shown) or by applying a vacuum.
  • the pump or the vacuum is set so that the sum of the outflow volume of the light phase 120 and the heavy phase 140 and, if necessary, the intermediate phase 130 is set to be just as large as the volume of the inflowing two-phase system (ATPS) 110 .
  • ATPS inflowing two-phase system
  • phase interface(s)/intermediate phase 130 increases, the pump speed or the negative pressure can be increased and more heavy phase 140 is drawn off.
  • the phase interface(s)/intermediate phase 130 sinks again until the probe 160.2 for the light phase 120 again indicates the electrical conductivity in the setpoint range.
  • the pump speed or the negative pressure on the dip tube 190 can then be set back to the initial speed, for example.
  • the arrows in FIG. 4 symbolize how the heavy phase 140 first flows into the intermediate space and is then sucked out through the opening 192 .
  • the dotted arrow in inner tube 191 of dip tube 190 indicates the direction of flow of liquid in inner tube 191 leading to an upper outlet (not shown).
  • the dip tube 190 operates continuously.
  • the dip tube 190 can also be used discontinuously in order to temporarily draw off light phase 120, intermediate phase 130 or heavy phase 140 depending on the position of the phase interface(s).
  • the dip tube 190 can also be used discontinuously in order to temporarily draw off light phase 120, intermediate phase 130 or heavy phase 140 depending on the position of the phase interface(s).
  • the light phase 120 flows out of the upper outlet 150.2 and the heavy phase 140 continuously out of the separator 100 via the lower outlet 150.1.
  • the continuous inflow of the aqueous two-phase system (ATPS) 110 into the separation device 100 can also play a role in the outflow behavior at the outlets 150.1 and 150.2.
  • the opening 192 of the dip tube 190 then does not dip into any of the phases, for example.
  • the opening 192 of the dip tube 190 is moved into the heavy phase 140 (the dip tube 190 is shut down) and heavy Phase 140 may be additionally pumped/suctioned (e.g. using a pump creating a vacuum) until the value measured by the conductivity probe 160.2 in the light phase 120 is again within the setpoint range. Then the dip tube 190 can be put back into the starting position and the pump can be switched off.
  • the dip tube 190 can be adjusted to the light phase 120 (the dip tube is raised and repositioned ) and the light phase 120 is pumped out (e.g. sucked off with a vacuum generated by a pump) until the value that the conductivity probe 160.1 measures in the heavy phase 140 is again within the setpoint range.
  • the dip tube 190 can then return to its original position and the pump can be switched off.
  • the immersion tube 190 does not always have to be in the starting position after the fault has been eliminated. It is also sufficient here if the pump is switched off / the vacuum is removed.
  • an overtube 193 is therefore used, which extends from top to bottom.
  • the overtube could also extend from bottom to top, in which case the immersion tube could then serve as an outlet for the light phase 120. Except for the overtube, FIG. 4 would then be identical.
  • An overtube extending from bottom to top is advantageous since only light phase 120 would flow into the space between inner tube 191 and overtube, making it difficult for intermediate phase 130 or heavy phase 140 to reach opening 192 in inner tube 191.
  • the overtube were to extend from the bottom up and into the light phase 120 to extract the light phase 120 with the opening 192 in the inner tube 191, it would be convenient if the probe 160.2 in the light phase 120 would be placed lower than the top of the overtube. This could be used to detect an excessive increase in the heavy phase 140 (lower phase) and/or, if applicable, the intermediate phase with the electrical conductivity values before they could flow into the space between the inner tube 191 and the outer tube and reach the opening 192 of the immersion tube.
  • An overtube (not shown) extending from bottom to top would therefore prevent the entry of undesired phase (here: intermediate phase 130 and/or heavy phase 140), provided the phase interface ⁇ ) does not rise too far.
  • FIG. 5 shows a cross section of an exemplary embodiment according to the invention of a separating device 100 with 4 insertion openings 158.1, 158.2, 158.3, 158.4, each of which has 4 probes
  • 4 probes 162.1, 162.2, 162.3 and 162.4 are shown in 4 insertion openings 158.1, 158.2, 158.3, 158.4, which are to be used in the separating device 100.
  • On the left side of Figure 5 is a side view in section of a separating device 100 with a light phase 120, an intermediate phase 130 and a heavy phase 140 is shown, the 4 insertion openings 158.1, 158.2, 158.3, 158.4, in which one of the probes 162.1, 162.2, 162.3 and 162.4 are arranged in a radial arrangement in the outer wall 155 of the separating device 100.
  • the 162.1 probe is intended for measuring the electrical conductivity of the heavy phase 140
  • a side view of the 4 insertion openings 158.1, 158.2, 158.3, 158.4 with the 4 probes 162.1, 162.2, 162.3 and 162.4 of the separating device 100 is shown on the right-hand side of FIG.
  • This arrangement is in view of more accurate determination and more reliable detection of the position of the individual phases based on the measured conductivity values and therefore enables faster and more robust detection, regulation and control of the process.
  • FIG. 6 also shows a cross section of an exemplary embodiment according to the invention of a separating device 100 with the 4 probes 163.1, 163.2, 163.3 and 163.4 in 4 insertion openings 159.1, 159.2, 159.3, 159.4.
  • the 4 insertion openings 159.1, 159.2, 159.3, 159.4 are shown in a radial arrangement with horizontal distribution (left) and a side view thereof (right).
  • a radially offset arrangement of the insertion openings 159.1, 159.2, 159.3, 159.4 also leads to more reliable detection of the individual phases and thus faster and more robust process regulation and control.
  • the one or more probes shown for measuring the electrical conductivity can also be replaced by probes for measuring the turbidity.
  • only probes for measuring the electrical conductivity can be used in the separation device.
  • only probes for measuring the turbidity can also be used in the separating device.
  • a combination of probes for measuring the electrical conductivity and probes for measuring the turbidity can also be provided in the separating device.
  • a separator is filled with an aqueous two-phase system as a separating device and the electrical conductivities or turbidity of the phases at the positions of the probes are recorded over time.
  • the tests are carried out with a separator filling volume of 920 ml and 470 ml.
  • Aqueous two-phase phosphate, two-phase citrate and two-phase ammonium systems from the starting materials polymer/salt/water are examined.
  • a polymer-rich, light phase and a salt-rich, heavy phase form.
  • the phase-forming components or separate phases are placed in containers from which appropriate pumps convey the components. Before the liquids enter the separator, the liquids pass through a mass flow meter and reach a static mixer.
  • the liquid mixture runs into the separator where the specific phases settle.
  • the light phase can be taken off at an outlet at the top. If a dip tube is used, this can, for example, remove the heavy phase through an opening in the form of an overflow valve.
  • Two conductivity probes protrude into the separator to monitor the respective phase levels. The electrical conductivities are recorded and recorded using a device manager for data acquisition and control. In the experiments in which a cell culture was used as the starting material to be separated, a turbidity probe was also used, which was placed within the feed stream.
  • this immersion tube is used with an overtube.
  • DN35 and DN50 separator represent laboratory scale and DN150 (80L scale) is already pilot scale, i.e. a larger scale that allows the production of larger quantities of products.
  • Geometrically similar separators are used for each of the three scales examined. Unless explicitly stated otherwise, static mixing elements (Kenics type) are used for phase mixing. Mixing sections that are geometrically similar but adapted to the throughput are used for the different scales. The flow rates are monitored using a mass flow meter. The electrical conductivity is measured at suitable height positions using two conductivity measuring probes. The most important components and specifications of the test setup for carrying out the continuous extraction tests in the test facilities are listed in Table 2 below.
  • the phase-forming components and a cell culture are first conveyed into a static mixing section. Due to the mixing and the simultaneous presence of both aqueous phases, a mass transfer of the target product and secondary components takes place. Likewise, the constant mixing achieves a dispersion of bioparticles in one of the phases, resulting in an intermediate phase which binds bioparticles between its two phase interfaces, but which no longer contains the target product.
  • the separator After passing through the mixing section, the separator follows immediately, which is constructed as shown in FIG.
  • the incoming mixture separates into a light and a heavy phase along the direction of flow.
  • a characteristic intermediate phase is formed, which represents a dispersion of the heavy phase stabilized by the bioparticles.
  • the heavy phase and the intermediate phase are continuously removed from the separator by the targeted height adjustment of the immersion tube, which has an opening and therefore acts like an overflow valve.
  • the light phase flows out of the upper light phase outlet above a critical level. All phases are collected in vessels.
  • the "raised" state of the lower leg means that the height of the lower leg is readjusted, namely upwards.
  • the opening is, for example, above the liquid level in the separating device or the opening is so wide ramped up so that no more liquid can flow out of it.
  • the immersion tube is then out of order. This is explained in detail in each of the examples.
  • the “down” state of the fork tube means that the height of the fork tube is being readjusted, namely downwards.
  • the fork tube operates during both ramp up and ramp down unless otherwise noted.
  • the experimental setup on the pilot scale as described in Example 5.4, basically corresponds to the information given above for the laboratory scale.
  • the experimental setup on the pilot scale differs from that on the laboratory scale with regard to the pumps, mass flow meters, static mixing sections and the size of the actual separator listed in Table 2.
  • Tests on the susceptibility of the process to failure are also carried out.
  • the interference tests are carried out in order to determine the extent to which the detection of the phase interface(s) using the conductivity probes is suitable for drawing conclusions about the set system.
  • varying systems were examined during start-up and in continuous operation after start-up with an aqueous two-phase phosphate system in the separators.
  • the start-up is the period of time during which the phases settle in the separator and before and during the phases separate and are removed from the separator.
  • a disruptive system here is a system that is either single-phase instead of the two-phase system or has a composition that deviates from the usual composition in that one component of the aqueous two-phase system is used with 10% more or 10% less .
  • the cell culture is replaced by deionized water.
  • Example 1 describes the start of a continuous extraction in a separator using an aqueous two-phase phosphate system.
  • the start of the extraction is also referred to as start-up, i.e. the phases settle out but are not yet removed.
  • the aqueous two-phase phosphate system is structured as follows:
  • Table 1 Mass fractions of aqueous two-phase phosphate system
  • the finished and prepared specific phases of the two-phase phosphate system are fed into the separator.
  • a total mass flow of 100 g/min was set, with the light phase being conveyed at 60 g/min and the heavy phase at 40 g/min in order to correspond to the phase ratio of the system used.
  • the separate phases were therefore combined so that the two-phase system can be characterized precisely.
  • the experiment therefore serves to illustrate the measurement of electrical conductivity.
  • a preliminary test can be designed in this way in order to determine in advance the electrical conductivities to be expected.
  • the first probe e.g. probe 160.1 in Figure 2
  • the second probe e.g. probe 160.2 in Figure 2
  • the separator used here has a volume of 920 ml. The start-up behavior is recorded until a light phase drips out of the upper outlet for the first time.
  • FIG. 7a shows the electrical conductivity values measured by the first probe during start-up, with the first probe (e.g. probe 160.1 in FIG. 2) being intended to record the heavy phase.
  • An envelope curve is shown in FIG. 7a, comprising the upper and lower limits of the mean values with the respective standard deviations. Means and standard deviations represent at least duplicates.
  • the start-up of the method is plotted over time using the measured electrical conductivity for the first probe and divided into sections I, II and III.
  • section I from about 0 to 200 s, the light phase is initially detected by the first probe at the beginning of the start-up.
  • the probe With increasing fluidity of the two-phase system flowing into the separator, the probe then increasingly dips into the heavy phase in section II of the curve at about 200 to about 400 s, i.e. the values for the electrical conductivity increase steadily.
  • section III of the curve only the heavy phase is then detected by the first probe.
  • FIG. 7b the measured electrical conductivity values of the second probe (eg probe 160.2 in FIG. 2) are plotted against time in [s] during the start-up, with the second probe recording the light phase.
  • FIG. 7b again shows an envelope curve comprising the upper and lower limits of the mean values with the respective standard deviations. Means and standard deviations represent at least duplicates.
  • the curve of Figure 7b shows the electrical conductivity of the second probe over time. As soon as the upper light phase reaches the probe, an almost constant electrical conductivity is measured, which shows that the light phase is almost constant at the probe measurement location.
  • Example 2 Example 2:
  • Example 2 describes the course of a continuous extraction in a separator using an aqueous two-phase phosphate system and the measured electrical conductivities of two probes, as shown in FIG. 2, for example, are explained.
  • FIG. 8 shows the measured values of the two probes in two curves K1 and K2.
  • the first probe e.g. probe 160.1 in FIG. 2 measures the electrical conductivity [mS/cm] of the heavy phase over time [s], shown in curve K1.
  • the second probe e.g. probe 160.2 in Figure 2 measures the electrical conductivity [mS/cm] of the light phase over time [s], shown in curve K2.
  • composition of the aqueous two-phase phosphate system is as described in Example 1.
  • the method is divided into three sections, start-up from 0 to approximately 980 s, continuous operation from approximately 980 s to approximately 4580 s and shutdown from approximately 4580 s.
  • Continuous operation is only shown for an exemplary period of time and of course it is also possible for significantly longer; for example, a continuous operation can be performed for several hours or longer.
  • the target conductivity range for the heavy phase (indicated as “Target Conductivity” in Figure 8) at the top of Figure 8
  • the target conductivity range for the light phase (indicated as “Target Conductivity” in Figure 8 ), below in Figure 8, each indicated as a range with dashed upper and lower limits.
  • the corresponding phase is present in the setpoint ranges for the respective electrical conductivities. Leaving the setpoint range means that the probe is no longer immersed in the corresponding phase. If the conductivity setpoint range is left, it must be readjusted. This takes place through the dip tube 180 shown in FIG. 2 with an opening 182 and with an overtube 183. In Example 2, the dip tube is used to remove heavy phase.
  • the feed line is connected to the separator and the start-up of the process begins (0 to about 980 s).
  • the first conductivity probe detects for the first time a light phase (in curve K1, the first increase in electrical conductivity), which after about e minutes reaches the second probe (in curve K2, the first increase in electrical conductivity). From 7.5 minutes the conductivity reading of the first probe begins to rise to the maximum of about 62 mS/cm at 15 minutes (curve K1). After 9 minutes, the light phase is drained off at the top of the outlet for the first time. After 13.5 minutes, the immersion tube is used for the first time and is lowered to collect the heavy subtract phase. In Example 2, the dip tube therefore acts as a type of overflow valve, which is used to let off the heavy phase in a targeted manner.
  • the lowering of the dip tube is represented in FIG. 8 by an asterisk and the raising of the dip tube is symbolized by an asterisk in a circle.
  • the opening of the inner tube is moved up and down here.
  • the raising and lowering of the dip tube is indicated simultaneously in both curves K1 and K2, since this can affect both curves to a different extent.
  • the immersion tube is therefore not moved differently in the two curves K1 and K2, but an up or down movement of the immersion tube is indicated simultaneously in both curves K1 and K2.
  • the dip tube was run up after 18 minutes to determine the change in conductivity in both curves K1 and K2. This means that the dip tube is raised until it can no longer take any liquid. It was found that the measured conductivity value of the second probe (curve K2) increases significantly, while the first probe (curve K1) hardly measures any change. This confirms that the first probe in continuous operation hangs directly in the heavy phase and reflects the conductivity of this.
  • Example 3 describes the course of a continuous extraction in a separator in an aqueous two-phase citrate system and the measured electrical conductivities of two probes are shown in FIG. 9a and FIG. 9b.
  • the aqueous two-phase citrate system is structured as follows:
  • FIG. 9a the electrical conductivities in [mS/cm] of the heavy phase are plotted over time [s], which the first probe (eg probe 160.1 in FIG. 2) measures.
  • FIG. 9b plots the electrical conductivities in [mS/cm] of the light phase over time [s], which the second probe (eg probe 160.2 in FIG. 2) measures.
  • FIG. 9a shows the measured electrical conductivity values of the first probe, which are measured in the heavy phase, during start-up and also during continuous operation thereafter.
  • FIG. 9a again shows an envelope curve comprising the upper and lower limits of the mean values with the respective standard deviations. Means and standard deviations represent at least duplicates.
  • the measurement curve in FIG. 9a which shows the course of the recorded conductivity measurement values of the first probe that is intended to detect the heavy phase, can again be subdivided into sections I, II and III.
  • section I from about 0 to about 110 s, the light phase is initially detected by the first probe.
  • the probe With increasing volume of the two-phase system filled in the separator, the probe then increasingly dips into the heavy phase in section II in the curve between about 110 s and about 300 s, i.e. the values for the electrical conductivity increase steadily.
  • section III of the curve from about 300 s the heavy phase is then detected by the first probe.
  • the dip tube is raised again (the dip tube stops removing heavy phase), so that the heavy phase accumulates and thereby as much as possible light phase and thus product are displaced from the separator. This is also shown, for example, in FIG. 8 at about 4580 s, where the dip tube is raised. This procedure of increasing the yield of light phase by replacing the light phase with additional heavy phase is described in detail above in FIG.
  • FIG. 9b the course of the measured electrical conductivity values of the second probe (eg probe 160.2 in FIG. 2), which is intended to detect the light phase, is plotted against time in [s] during start-up and subsequent continuous operation.
  • FIG. 9b again shows an envelope curve comprising the upper and lower limits of the mean values with the respective standard deviations. Means and standard deviations represent at least duplicates.
  • the curve of Figure 9b thus shows the measured electrical conductivity values of the second probe over time. As soon as the second conductivity probe is immersed in the liquid, the conductivity reading jumps to around 8 mS/cm.
  • the measured value increases slowly, as soon as a conductivity of 10 mS/cm is reached, the measured value increases almost linearly to a maximum value.
  • the significant increase can be explained by the fact that as soon as a light phase escaped from the upper outlet, the immersion tube was not shut down directly. As a result, the heavy phase builds up, which the second probe indicates by an increase in the conductivity reading.
  • the dip tube is then shut down (indicated by the asterisk in the curve).
  • the electrical conductivity has risen to slightly above 20 mS/cm and has therefore left the setpoint range for the electrical conductivity values of the light phase of aqueous two-phase citrate systems in the range of 5-15 mS/cm. In other words, the heavy phase is approaching the second probe.
  • the dip tube is therefore lowered (asterisk in the curve in Figure 9b) and from this point on heavy phase flows out through the dip tube, as a result of which the heavy phase in the separator decreases.
  • the light phase also sinks, so that the second probe is again in a pure light phase.
  • FIG. 9b shows that the electrical conductivity values dropping to approximately 10 mS/cm.
  • an almost constant electrical conductivity is measured, which shows that the light phase is almost constant at the location of the probe measurement. With a measured value of around 10 mS/cm, the second probe therefore detects a pure, light phase here.
  • the dip tube in the embodiment with an overtube, the opening of which is in the inner tube can be operated like an overflow valve, as is described in FIGS. 2 and 3, for example.
  • the liquid is drained by gravity.
  • the dip tube with its opening can also suck off the heavy phase, as explained in FIG. This does not change the actual procedure.
  • the dip tube is raised after about 1000 s (indicated by the asterisk in the circle in FIG. 9b). This means that the dip tube is no longer in operation, allowing the heavy phase to build up again. This causes the conductivity reading to increase again until it reaches the heavy phase value. This also shows the large differences in the electrical conductivities of the heavy phase (citrate system, heavy phase: 30-50 mS/cm, see Table 1) compared to the light phase (citrate system, light phase: 5-15 mS/cm, see table). 1). Once the second measuring probe indicates the conductivity reading of the heavy phase, the test is ended because a further increase in the heavy phase can no longer be detected.
  • a single-phase system is fed into the separator.
  • This single-phase system is also referred to as a disturbance system.
  • FIG. 10 shows the measured conductivity values from example 4.1.
  • Curve K1 gives the electrical conductivity values of the first probe measuring the heavy phase.
  • Curve K2 gives the electrical conductivity values of the second probe, which measures the light phase.
  • the start-up with a two-phase phosphate system takes place in the customary manner.
  • the disruptive system is introduced into the separator at (S1.1).
  • the conductivity of the probe for the heavy phase (curve K1) drops.
  • the drop in conductivity down to a value of 60 mS/cm can be explained by the adjustment of the dip tube (not shown), which here again functions as an overflow valve.
  • the dip tube was then no longer adjusted in this test and was kept at a constant setting, which is used with a normal two-phase phosphate system.
  • the conductivity value then falls almost linearly to 40 mS/cm and then drops at a slower rate to 25 mS/cm.
  • the renewed introduction of interference system at (S1 .2) in the separator does not lead to any major changes.
  • the conductivity of the second probe, shown in curve K2 slowly increases from 20 mS/cm to 30 mS/cm.
  • Example 4.2 the water content of the heavy and light phases is varied.
  • An aqueous two-phase phosphate system is used in continuous operation.
  • the values recorded for the conductivities are plotted against time in [s] in FIG.
  • the electrical conductivities of the heavy phase are measured with the first probe and the light phase with the second probe.
  • Two experiments were carried out: In the first experiment with a two-phase phosphate system, which has a water content of -10% by weight compared to a two-phase phosphate system with the correct amount of water, and in the second test with a two-phase phosphate system containing a water content of +10% by weight compared to a two-phase phosphate system with the correct amount of water. Table 3 below gives the amounts used.
  • Example 4.3 the polymer content of the polyethylene glycol (PEG) is varied in the heavy and light phases.
  • An aqueous two-phase phosphate system is used. It is worked in continuous operation.
  • the values recorded for the conductivities are plotted against time in [s] in FIG.
  • Two experiments were carried out: in the first experiment with a two-phase phosphate system containing a polymer content of -10% by weight compared to a two-phase phosphate system with the correct amount of polymer, and in the second experiment with a two-phase -Phosphate system containing a polymer content of +10% by weight compared to a two-phase phosphate system with the correct amount of polymer.
  • Example 4.4 the buffer salt in the form of the phosphate salt of an aqueous two-phase phosphate system is varied in the heavy and light phases. It is worked in continuous operation.
  • the values recorded for the conductivities are plotted against time in [s] in FIG.
  • the electrical conductivities of the heavy phase are measured with the first probe and the light phase with the second probe.
  • Two experiments were carried out: in the first experiment with a two-phase phosphate system containing a buffer salt content of -10% by weight compared to a two-phase phosphate system with the correct amount of buffer salt, and in the second experiment with a two -Phase phosphate system containing a buffer salt content of +10% by weight compared to a two-phase phosphate system with the correct amount of buffer.
  • the measuring principle can be used to of the conductivity profile can detect even small deviations from the target state.
  • the measurement is also reliable over longer process times (>3 hours) (as will also be proven below) and thus enables optimal efficiency in the separation of light and heavy phases, whereby the yield of the process is maximized.
  • the electrical conductivities of the heavy and light phase change when bioparticles are present and that the intermediate phase and heavy phase formed can also have electrical conductivity values that differ from the conductivities to be expected.
  • the intermediate phase is a mixture of heavy phase in dispersed form together with cells. Both the intermediate phase and the heavy phase can in part have a significantly reduced electrical conductivity than would be expected, which is due to the presence of cells and other conductivity-lowering bioparticles is returned.
  • Example 5 it is shown how the detection of electrical conductivity can be used to separate the target product in the target phase (in this example the light phase) from the counter phase (in this example the heavy phase) and the interphase with cells.
  • Example 5.1 the detection of electrical conductivity can be used to separate the target product in the target phase (in this example the light phase) from the counter phase (in this example the heavy phase) and the interphase with cells.
  • Example 5.1 describes a continuous extraction according to the measuring principle of the method according to the invention in a separator with cell culture.
  • the experiment is used for orientation and illustration of the measuring principle and was carried out on a laboratory scale.
  • a two-phase citrate system was used to purify and concentrate the target product, here an antibody, from a cell culture.
  • the weight of phase-forming components and cell culture as well as the set mass fractions are summarized in Table 6:
  • the aqueous two-phase citrate system which is structured as shown in Table 6, has already been suitably mixed so that the components of the cell culture have been divided between the phases.
  • the target product accumulates in the light phase in example 5.1.
  • the mixture is then conveyed into a separator using a pump with a mass flow rate of 28 g/min. At this flow rate, it takes approximately 17 minutes for the light phase, comprising the target product in the form of antibodies, to exit the top spout.
  • the test overview for Example 5.1 is given in Table 7 below.
  • Table 7 Test overview for example 5.1
  • the recorded electrical conductivities of Example 5.1 using two probes, a heavy phase probe (eg probe 160.1 in Figure 2) and a light phase probe (eg probe 160.2 in Figure 2), are in Figure 14 versus time plotted in [s].
  • the process can be divided into three sections: start-up from 0 to around 810 s, continuous operation from around 810 s to 4680 s and shutdown from around 4680 s.
  • the typical course can be seen when driving off.
  • the first deeper-lying probe, which is intended to detect the heavy phase first indicates the light phase with a value for the electrical conductivity of around 8 mS/cm and then rises almost constantly to 15 mS/cm (curve K1). At 15 mS/cm, a kink in the slope can be seen.
  • the intermediate phase with the cells is detected.
  • the intermediate phase is denoted by Z in Figure 14 and the arrows indicate its detection.
  • the second probe shows a similar course when starting (curve K2).
  • the electrical conductivity suddenly jumps to 8 mS/cm.
  • light phase is detected for the first time.
  • the electrical conductivity does not increase so much until it turns into an almost linear increase.
  • the intermediate phase Z with the cells is detected.
  • the second probe reaches a conductivity value of 17 mS/cm, the dip tube is shut down (asterisk in Figure 14) and a continuous process is set. A difference in the electrical conductivities between the phases of 5 mS/cm can be seen.
  • the heavy phase has a significantly lower conductivity than expected. This is probably due to the presence of cells and other conductivity-lowering bioparticles.
  • the dip tube is then raised completely (asterisk in a circle in FIG. 14) in order to prevent the intermediate phase from being no longer detectable due to a further sinking of the heavy phase.
  • the ramp down therefore begins with the full rise of the dip tube at about 4680s (asterisk in circle in Figure 14), causing conductivity readings to rise rapidly.
  • a kink can be seen again in the second probe (curve K2).
  • the intermediate phase Z with cells is detected; this is indicated in Figure 14 with arrows to Z (Z means intermediate phase).
  • the values for the electrical conductivity of the interphase with cells are not in the range of 30-40 mS/cm. This is attributed to the presence of cells and other conductivity-lowering bioparticles.
  • the values for the electrical conductivity then rise to over 20 mS/cm. Eventually, the electrical conductivities of the two probes quickly approach the same value.
  • the conductivity reading of the second probe drops immediately to the electrical conductivity of the pure light phase (5 to 15 mS/cm). Electrical conductivity can thus be used to localize the interphase in this system.
  • the first probe did not detect a pure heavy phase in continuous operation, the electrical conductivity of which should be in the range of 30 to 50 mS/cm, the electrical conductivity values from the start-up can nevertheless be used to determine which measured value for the electrical conductivity belongs to the intermediate phase.
  • the conductivity reading of the intermediate phase Z can be recorded in the first plateau after detection of the light phase LP. In the intermediate phase, which turns into the heavy phase here, there is a conductivity gradient, which means that the beginning of the intermediate phase can be well estimated using the recorded electrical conductivity value.
  • FIG. 15 shows the cell count in [10 5 cells/mL] of the cell culture used in Example 5.1 and the cell count of the light phase obtained during the process (curve K2) which contains the target product. It can be seen that the light phase obtained always contains constantly fewer cells than in the cell culture. The reduced cell count can also be observed in the light phase recovered after extraction (Light Phase Pool in Figure 15).
  • the product phase (light phase) can be clearly identified by measuring the electrical conductivities and constantly separated from the other phases by continuous extraction.
  • the antibodies are in the example 5.1. Separated light phase enriched and in purified form. The cells could be depleted by 1.4 log steps.
  • Example 5.2 describes a continuous extraction according to the measuring principle of the present method in a separator using a cell culture. The experiment is only for orientation and illustration of the measuring principle and was carried out on a laboratory scale. A two-phase phosphate system was used to purify and concentrate the target product, here antibodies, from a cell culture. The weight of phase-forming components and cell culture as well as the set mass fractions are summarized in Table 8:
  • Table 8 Weight and mass fractions
  • the aqueous two-phase phosphate system which is structured as shown in Table 8, has already been suitably mixed in a static mixer, so that the components of the cell culture are divided between the phases.
  • the target product here: antibody
  • the mixture is then conveyed into a separator via a pump with a total mass flow of 50.7 g/min.
  • the educts are placed in beakers and pumped into the static mixer and then into the separator using gear pumps. The light and the heavy phase are collected.
  • Example 5.2 An experimental overview of Example 5.2 is given in Table 9 below.
  • Example 5.2 The recorded electrical conductivities of Example 5.2 using two probes, a heavy phase probe (e.g. probe 160.1 in Figure 2) and a light phase probe (e.g. probe 160.1 in Figure 2), are in Figure 16 versus time plotted in [s].
  • a heavy phase probe e.g. probe 160.1 in Figure 2
  • a light phase probe e.g. probe 160.1 in Figure 2
  • curve K1 shows the measured values for the electrical conductivity of the first probe, which is intended to detect the heavy phase
  • curve K2 shows the measured values for the electrical conductivity of the second probe, which is intended to detect the light phase.
  • the measured values of the electrical conductivity of the first probe in curve K1 increase rapidly from 0 mS/cm to 16 mS/cm during start-up.
  • the conductivity curves of the two probes intersect at 19 mS/cm.
  • the measured value for the electrical conductivity of the first probe in curve K1 then increases almost linearly to a value of 65 mS/cm.
  • the curve flattens out.
  • the dip tube is shut down (asterisk in curve K1 in Figure 16), then continuously withdraws heavy phase and a continuous process is thereby established.
  • the conductivity reading of the first probe varies between 63.2 mS/cm and 69.3 mS/cm for the heavy phase. This represents the continuous operation of the process.
  • the dip tube is raised (asterisk in circle in curve K1 in Figure 16) and stops removing heavy phase.
  • the electrical conductivity values of the first probe then asymptotically approach a value of 77 mS/cm.
  • the probe initially detects a value of 17 mS/cm. This then increases to 20 mS/cm. This value is constantly detected for a short time and then increases to 25 mS/cm.
  • the dip tube is shut down (asterisk in curve K2 in Figure 16) and the dip tube begins to withdraw the heavy phase. This can be done by gravity, with the opening present in the dip tube, ie in the inner tube, being brought into a position such that the heavy phase flows out. The dip tube then works like an overflow valve.
  • the heavy phase can also be sucked off through the dip tube. Both alternatives are equally suitable and can be used to remove the heavy phase.
  • the use of the immersion tube can be recognized by the drop in electrical conductivity in curve K2.
  • the electrical conductivities measured by the second probe fall almost steadily throughout continuous operation until a value of 22 mS/cm is reached at the end.
  • the electrical conductivity then increases to almost 25 mS/cm.
  • the dip tube is then raised (asterisk in a circle in curve K2 in Figure 16) and therefore stops removing heavy phase; the measured conductivities of the second probe then increase almost linearly (curve K2) until the measured value of the first probe is reached (curve K1).
  • the aqueous two-phase system is mixed to obtain a mass transfer, so that the target product has accumulated and is essentially only in one of the phases, namely in the expected phase and the impurities have accumulated and are essentially in opposite phase.
  • Example 5.1. The electrical conductivities of the heavy phase in Example 5.1. are in the range of the pure heavy phase (without cells), as was obtained in example 4.2 (FIG. 11) in one of the experiments when investigating the susceptibility of the process to failure and varying the water content. This conductivity is comparable to the conductivity of a cell-free phase with product. Thus, an intermediate phase of non-coalesced heavy phase and cells did not form here. This undesirable effect is used here as a negative example.
  • Example 5.2. does not represent an example according to the invention, since mixing with mass transfer, as indicated in the teaching of the method according to the invention, was not carried out here.
  • the measuring principle still works according to the method according to the invention, i.e. the heavy phase and the light phase could be identified and separated from one another by their electrical conductivities.
  • the fault here lies in the lack of thorough mixing, which can easily be avoided.
  • Example 5.2 was repeated and the two phases were again transferred to the separator. However, the volume flow is reduced from 50.7 g/min to 25 g/min. This is intended to increase the residence time in the static mixers in order to achieve greater mixing. 810 ml light phase and 310 ml heavy phase are pumped into the separator. Reference is made to Table 8 for the weight of phase-forming components and cell culture and the adjusted mass fractions. An experimental overview of Example 5.3 is given in Table 10 below.
  • Example 5.3 The recorded electrical conductivities of Example 5.3 using two probes, a heavy phase probe (e.g. probe 160.1 in Figure 2) and a light phase probe (e.g. probe 160.2 in Figure 2), are in Figure 17 versus time plotted in [s].
  • a heavy phase probe e.g. probe 160.1 in Figure 2
  • a light phase probe e.g. probe 160.2 in Figure 2
  • the first probe therefore actually detects the intermediate phase (in the present case heavy phase with cells) with an electrical conductivity in the range of 40-50 mS/cm from about 40 mS/cm. Since no heavy phase was measured at 60-80 mS/cm, it is assumed that the entire heavy phase has passed into the intermediate phase or that the conductivity probe only measures the intermediate phase. In this example, the intermediate phase therefore corresponds to the heavy phase.
  • FIG. 18 shows the cell number in [10 6 cells/mL] of the cell culture used in reference example 5.2 and example 5.3 (11.1*10 6 cells/ml) and the cell number of the light phase obtained during the process, which is said to contain the target product , shown in a bar chart.
  • the light phase of reference example 5.2. shows no depletion of cells in FIG. 18 (left side of FIG. 18).
  • the electrical conductivity of the heavy phase obtained in reference example 5.2 shows this insufficient separation by the conductivity value of 60-70 mS/cm, since this corresponds to the pure heavy phase without cells.
  • “Pool” in Figure 18 denotes the phase obtained after extraction.
  • Example 5.3 on the right-hand side of Figure 18, it can be seen that the light phase, in which the product is present, consistently contains fewer cells than the cell culture at any time point during the extraction process. The reduced cell count can also be observed throughout the light phase after extraction is complete. The successful separation of the cells can again be seen from the electrical conductivity of the heavy phase. With a conductivity range of 40-50 mS/cm, this shows a significantly reduced electrical conductivity, which suggests the presence of cells and other conductivity-lowering bioparticles.
  • Example 5.3 shows that the antibodies in the separated light phase of Example 5.3 are enriched and in a purified form.
  • the method according to the invention therefore enables the product phase (light phase) to be constantly separated from the heavy phase via the continuous extraction with the aid of conductivity measurement/interphase control.
  • Example 5.4 shows how the height or immersion depth of the immersion tube is automatically set depending on the conductivity values determined for 2 probes.
  • An aqueous two-phase phosphate system is used in continuous operation.
  • the target product is in the light phase and the dip tube in the embodiment with an overtube, which extends into the heavy phase, is intended to remove the heavy phase and intermediate phase from the separator.
  • FIG. 19 shows the two electrical conductivity profiles of the two probes (FIG. 19A) and the automated height adjustment for an immersion tube (FIG. 19B) for an extraction process.
  • Curve K1 in Figure 19A indicates the electrical conductivities measured by the first probe in the heavy phase
  • curve K2 in Figure 19A indicates the electrical conductivities measured by the second probe in the light phase.
  • FIGS. 19A and 19B are each plotted against the process time in [min].
  • Figure 19B shows the raising and lowering of the dip tube based on the position of the orifice in the dip tube which acts as a spill valve.
  • the height indications in Figure 19B therefore represent the position of the spill valve, at the height of the orifice where the liquid drains.
  • the dip tube is in its home position (along the x-axis in Figure 19B) at height 0 cm.
  • the dip tube is therefore in the up state and does not extract any phase from the separator.
  • the dip tube is then lowered to about 1.5 cm and then raised again to the starting position (height 0 cm) after about 32 minutes.
  • the automated control shown compensates for the deviation of the measured value for electrical conductivity from the setpoint by adjusting the position of the immersion tube, i.e. the position of the opening in the immersion tube.
  • the light phase represented by the electrical conductivity values of curve K2 has the typical conductivity of 20-30 mS/cm in this system throughout the entire experiment.
  • the first probe in curve K1 first measures the electrical conductivity values for the light phase as the separator is being filled (up to around 25 minutes).
  • the first probe (curve K1) measures the electrical conductivity values of the pure heavy phase (60-80 mS/cm).
  • the dip tube is ramped down to dump heavy phase until the intermediate phase (mainly heavy phase with cells in the present case) is detected with a lower electrical conductivity in the range of 40-50 mS/cm.
  • the automatic adjustment of the height or immersion depth of the immersion tube therefore specifically regulates the position of the intermediate phase in the separator. If no intermediate phase should be present, the phase interface between the heavy and light phase is correspondingly lowered in the separator.
  • Example 6 describes continuous separator tests with cell lysate from an E. coli fermentation.
  • the cell lysate is obtained via an alkaline lysis, the subsequent neutralization is carried out with the salt buffer also required for the aqueous two-phase extraction (ATPE) (in this example: citrate).
  • the salt buffer also required for the aqueous two-phase extraction (ATPE) (in this example: citrate). It is advantageous that the amount of salt required for the APTE can already be added completely in the lysis step.
  • the targeting component in example 6 is plasmid DNA (pDNA) instead of a monoclonal antibody.
  • pDNA plasmid DNA
  • this system shows a distribution of the target component in the heavy phase, i.e. the plasmid DNA is enriched in the heavy phase after mixing with sufficient mass transfer, which should be separated from the rest.
  • the intermediate phase is a mixture of non-coalesced droplets, precipitates bound in between and disrupted E. coli cells.
  • the two-phase system used uses a polyethylene glycol instead of polyethylene glycol with an average molecular weight of 400 g/mol (PEG400) for two-phase formation with an average molecular mass of 1450 g/mol (PEG1450).
  • a polymer-rich, light phase and a salt-rich, heavy phase form.
  • Target and secondary components are distributed in this multi-phase system in such a way that the target product has accumulated in the heavy phase and is essentially present in it, and the undesired components have accumulated in the intermediate and light phase and are essentially present in them.
  • Example 12 For the continuous extraction carried out in Example 6 according to the method according to the invention, a two-phase citrate system is used in order to purify and enrich the target product, in this case plasmid DNA, from a cell culture.
  • the weight of phase-forming components and cell culture as well as the set mass fractions are summarized in Table 12: Table 12: Weight and mass fractions for example 6
  • the aqueous two-phase citrate system has already been suitably mixed in a static mixer so that the components are divided between the phases.
  • the target product accumulates in the heavy phase.
  • the aqueous two-phase citrate system is pumped into the separator with a mass flow rate of 60 g/min. At this flow rate, it takes about 10 minutes for the light phase to emerge from the top of the spout.
  • the measured electrical conductivities of Example 6 are plotted in FIG. 20 against the process time in [min].
  • the first probe (curve K1) first shows the electrical conductivity values for the light phase with about 5-10 mS/cm.
  • the curve K1 then rises almost constantly up to about 40 mS/cm.
  • the slope flattens out.
  • the intermediate phase with biomass/cell lysate is detected.
  • the second probe (curve K2) shows a similar course when starting.
  • the electrical conductivity suddenly jumps to 10 mS/cm.
  • light phase is detected for the first time. From minute 35 it can be seen that the measured values for the electrical conductivity differ from those in Examples 5.1 to 5.4.
  • the intermediate phase with the cells is detected in curve K2.
  • the dip tube is lowered (not shown), which is used again as an overflow valve.
  • the light phase and intermediate phase are removed with the dip tube.
  • the electrical conductivity which is measured at the second probe (curve K2), begins to decrease because the position of the intermediate phase in the separator decreases due to the change in the immersion tube position, and the light phase (without biomass and heavy phase droplets) is thus detected .
  • the ranges given in Table 1 for the electrical conductivities are only for orientation and can also lie in different ranges, as in the present example.
  • the target value range for the electrical conductivities for the heavy phase is from around 40 mS/cm, for the light phase from around 10 mS/cm and for the intermediate phase from around 25 mS/cm.
  • this is not a problem, since the composition of the individual phases can be determined by analyzing them.
  • the phases can be separated in a simple manner in the present example, since the difference in electrical conductivity between the heavy phase on the one hand and the intermediate phase and light phase on the other hand is relatively large and the target product is present in the heavy phase.
  • the yield of the method described in Example 6 is shown in FIG. 21 and is 2.43 mg pDNAZ g WCP (wet cell paste) and is therefore in the range of 2-3 mg/g typical for pDNA processes.
  • the aqueous two-phase system (ATPS) used leads to an expected increase in concentration by a factor of 3 (batch experiment). This change in concentration, which is influenced by the two-phase extraction (ATPE), could also be achieved in the continuous process with the system used. It was thus also possible to show in example 6 that there are no losses of heavy target phase due to the controlled position of the intermediate phase in the separator.
  • a continuous extraction is therefore carried out according to the method according to the invention using a two-phase citrate system in order to purify and enrich the target product, in this case plasmid DNA, from a cell culture.
  • the target product is essentially in the heavy phase.
  • the weight of phase-forming components and cell culture as well as the set mass fractions are summarized in Table 14:
  • Table 14 Weight and mass fractions for example 7
  • the cell lysate solution used in Example 7 has already been neutralized with citrate buffer (35% by weight, pH 6.0).
  • the ratio of non-neutralized cell lysate and buffer is about 1.6 (cell lysate: citrate buffer).
  • Example 7 In contrast to Example 6, where the removal of the heavy phase is controlled by adjusting the height of a dip tube with an opening that acts as an overflow valve, in Example 7 the heavy phase is actively pumped out of the separator. The light phase is also conveyed out of the separator via a second pump.
  • the delivery speed of the "heavy phase” pump is throttled. If, in turn, the electrical conductivity of the second probe for measuring the electrical conductivity of the light phase (curve M2) rises above a predefined limit value, the conveying speed of the "heavy phase” pump is increased.
  • FIG. 22 summarizes the pump flows during the process.
  • Extraction of a batch with a starting solution for purification and concentration of virus capsids in an aqueous two-phase system in the separator The extraction is carried out as described in FIG.
  • Two separation tests with virus capsids of the adeno-associated viruses (AAV) from a cell culture are carried out as an example.
  • the target component is concentrated once in the upper light phase (example 8.1) and once in the lower heavy phase (example 8.2).
  • a virus capsid of an adeno-associated virus is used for the target component instead of a monoclonal antibody or plasmid DNA.
  • a polyethylene glycol with an average molecular weight of 8000 g/mol and an ammonium sulfate buffer (see example 8.2) are also used.
  • Example 8.1 produces a distribution of the target component in the light phase, i.e. the virus capsids are enriched after mixing with sufficient mass transfer in the light phase, in particular essentially in this phase, which is to be separated from the rest.
  • polyethylene glycol with an average molecular mass of 400 g/mol (PEG400) and a phosphate buffer are used for two-phase formation.
  • PEG400 polyethylene glycol with an average molecular mass of 400 g/mol
  • a polymer-rich, light phase and a salt-rich, heavy phase form.
  • the components are distributed in this multi-phase system in such a way that the target product, here: adeno-associated viruses, is enriched in the light phase, in particular essentially present there, and undesired components are enriched in the heavy phase, in particular essentially present in this .
  • Table 16 Weight and mass fractions for example 8.1
  • the aqueous two-phase phosphate system is mixed in a suitable manner in the separation vessel so that the components can be divided between the phases.
  • the target product accumulates in the light phase in Example 8.1 at a conductivity of 6.24 mS/cm.
  • the conductivity of the heavy phase is 78.7 mS/cm.
  • Example 8.2 generates a distribution of the target component in the heavy phase, i.e. the virus capsids are enriched after mixing with sufficient mass transfer in the heavy phase, in particular essentially in this phase, which is to be separated from the rest.
  • the two-phase system used uses polyethylene glycol with an average molecular mass of 8000 g/mol (PEG8000) and ammonium sulphate buffer to form two phases. Similar to the previous examples, a polymer-rich, light phase and a salt-rich, heavy phase form.
  • the components are distributed in this multi-phase system in such a way that the target product, here: adeno-associated viruses, is enriched in the heavy phase, in particular essentially present in this phase, and undesired components are enriched in the light phase, in particular essentially in this phase.
  • the weight of phase-forming components and cell culture and the set mass fractions are summarized in Table 17.
  • the virus solution had an initial concentration of 2.17x 10 A 9 capsids/ml.
  • Table 17 Weight and mass fractions for example 8.2
  • the aqueous two-phase ammonium system is suitably mixed in the separator so that the components are divided between the phases.
  • the target product accumulates in the lower heavy phase in example 8.2.
  • the conductivity of the lower heavy phase is 175.2 mS/cm.
  • the conductivity of the upper light phase is 10.4 mS/cm.
  • the virus solution had an initial concentration of 2.17 ⁇ 10 A 9 capsids/ml.
  • the capsids were able to accumulate completely in the target phases. No virus capsid could be determined in the opposite phase.
  • virus-containing solutions could also be separated by means of conductivity detection and transfer to separation vessels in continuous operation (see Table 18) Table 18:
  • FIG. 23 shows the recording of the measurement over time in order to illustrate the measurement principle in detail.
  • LP means light phase
  • SP means heavy phase
  • IP means intermediate phase.
  • the free areas marked by vertical lines in Figure 23 between the measurement of the light phase, heavy phase and intermediate phase represent the transitions in which the individual probe is switched, i.e. switched up or down.
  • the measurement of the turbidity in the light phase (LP) is started. After 9 minutes the position of the probe is moved down so that the turbidity of the heavy phase (SP) can be measured. This process can be repeated as often as you like, so that the properties of two or three phases can be recorded at short intervals with just one probe. There is high (strong) turbidity in the upper area of FIG. 23, and low turbidity in the lower area. The light phase LP therefore shows high turbidity, whereas the heavy phase SP shows low turbidity. Overlapping turbidity properties are evident in the intermediate phase IP.
  • FIG. 23 therefore serves for orientation and illustration of the measuring principle.
  • turbidity is also a suitable indicator for distinguishing between two or three phases.
  • a separation of the phases, based on the turbidity measurement with one or more probes, can therefore easily be carried out over a suitable period of time.
  • plasmid DNA genomic DNA, RNA or other nucleic acids; or viruses, comprising the following steps: a. providing a starting solution containing the target product; b. Converting the starting solution into an aqueous two-phase system by adding at least one polymer and at least one salt in a suitable concentration, or by adding at least two polymers in a suitable concentration; c. Mixing of the aqueous two-phase system while maintaining a sufficient mass transfer, so that the target product accumulates in the light phase (20, 120) or in the heavy phase (40, 140); i.e.
  • a separator (10, 100) allowing the phases to separate in a separator (10, 100) into a light phase (20, 120), a heavy phase (40, 140) and, if an intermediate phase is present, an intermediate phase (30, 130); e. continuous measurement in at least one of the phases in the separating device (10, 100) to determine the position of the two phases (20, 120, 40, 140) and the phase interface or, if an intermediate phase (30, 130) is present, the position of the intermediate phase (30 , 130) and the two phase interfaces; f. removing the light phase (20, 120), the heavy phase (40, 140) and, if an intermediate phase (30, 130) is present, the intermediate phase from the separating device (10, 100) based on the measured electrical conductivity of at least one of the phases ; and G. Winning the phase with the target product.
  • an outlet (50) is provided in the separator (10) and removing the phases (10, 20, 30) from the separator (10) through the outlet (50) according to step f. is performed by gravity or using positive or negative pressure generated with or without a pump or a pump; or providing an upper outlet (150.2) in the separator (100) and removing the light phase (120) from the upper outlet (150.2) of the separator (100) using gravity or positive or negative pressure generated with or without a pump, or a pump, and a lower outlet (150.1) is provided in the separator (100) and the heavy phase (140) is removed from a lower outlet (150.1) of the separator (100) using gravity or of positive pressure or negative pressure, generated with or without a pump, or a pump from the separating device (100).
  • the height-adjustable immersion tube (180, 190) is used with an overtube (183, 193) extending from top to bottom, the immersion tube (180, 190) from a height-adjustable inner tube (181, 191) which has an opening (182, 192) for removing one of the phases, and an overtube (183, 193) extending from top to bottom, and the length of the overtube (183) is formed an upper end located above the light phase (120) and a lower end (183a, 193a), the diameter of the outer tube (183, 193) being set larger than the diameter of the inner tube (181, 191), so that an intermediate space is formed between the inner tube (181, 191) and the outer tube (183, 193), and the length of the overtube (183) is selected such that the overtube (183, 193) projects beyond the opening (182, 192) of the inner tube (181, 191) and the lower end (183a, 193a) of the overtube (183, 193) is immersed
  • the height-adjustable immersion tube (180, 190) is used with an overtube extending from bottom to top, the height-adjustable immersion tube consisting of a height-adjustable inner tube (181, 191), having an opening (182,192) for withdrawal of one of the phases, and an overtube extending from bottom to top, and the length of the overtube is defined by a lower end located below the heavy phase (140) and an upper End is set, the diameter of the overtube is set larger than the diameter of the inner tube, so that a gap between the inner tube (181, 191) and overtube is formed, and the length of the overtube is chosen so that the overtube over the opening ( 182, 192) of the inner tube (181, 191) and the upper end of the outer tube into the light phase (120) or, if present, into the intermediate phase ( 130) is immersed so that the liquid of the phase in which the upper end of the overtube is immersed flows into the intermediate space and can exit through the
  • a value for the electrical conductivity results, which is compared with a target value range for the electrical conductivity of the heavy phase and, if the target value range is undershot, the less heavy phase ( 140) is removed, with the removal quantity, removal speed and/or removal duration for the heavy phase (140) being regulated in such a way that the measured conductivity of the light phase (120) is again within the setpoint range.
  • the electrical conductivity values are used to vary the position of the phases and phase interface(s) in continuous operation by controlling and controlling one or more of the following measures: the extraction rate for the heavy phase is increased or decreased; the light phase extraction rate is increased or decreased; the withdrawal rate for the heavy phase is increased or decreased; the extraction rate for the light phase is increased or decreased; increase or decrease the collection time for the severe phase; the light phase collection time is increased or decreased; the collection of the light or heavy phase is interrupted; the feed rate of the aqueous two-phase system flowing into the separator (100) is increased or decreased, with or without the target product, the aqueous two-phase system without the target product being a rinse solution; the feed rate of the aqueous two-phase system flowing into the separation device, with or without target product, is increased or decreased, the aqueous two-phase system without target product being a rinse solution; and/or the dip tube is raised or lowered for draining or suction of one or two phases and
  • Sampling devices for controlled draining or interrupting the sampling of the phases at the outlet selected from infinitely variable valves with different degrees of opening, controllable hose pinch clamps, controllable stopcocks or controllable flow limiters.
  • the insertion openings in the wall (155) of the separating device (100) and inserted, the insertion openings (157.1, 157.2, 158.1, 158.2, 158.3, 158.4, 159.1, 159.2, 159.3, 159.4) having an arrangement that is selected from : an axial arrangement of the insertion openings (157.1, 157.2), the insertion openings (157.1, 157.2) being arranged on a straight connecting line; a radial arrangement of the insertion openings (158.1, 158.2, 158.3, 158.4), the insertion openings (158.1, 158.2, 158.3, 158.4) being arranged in a circular arc; or a radially offset arrangement of the insertion openings (159.1, 159.2, 159.3, 159.4), the insertion openings (159.1, 159.2, 159.3, 159.4) being arranged in an arc of a circle and additionally shifted in a preferred direction.
  • Device for carrying out the method according to one of sentences 1 to 16, comprising a separating device (10, 100) for separating the phases; at least one outlet (50, 150.1, 150.2) in the separating device (10, 100); at least one probe (60, 160.1, 160.2, 162.1, 162.2, 162.3, 162.4, 163.1, 163.2, 163.3, 163.4) for measuring the electrical conductivity in at least one of the phases in the separation device (10, 100); one or more extraction device(s) and/or means for regulating and/or controlling the extraction quantity, extraction speed and/or extraction duration of the light phase (20, 120), the heavy phase (40, 140) and, if present, the intermediate phase (30, 130) based on measurements of electrical conductivity in at least one phase.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes, ausgewählt aus - Immunglobulinen oder anderen Proteinen; oder - Plasmid-DNA, genomischer DNA, RNA oder anderen Nukleinsäuren oder Viren, wobei zum Einstellen der Lage der Phasen in einer Trennvorrichtung (10, 100) und Abtrennen der Phasen die gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte und/oder die gemessenen Trübungswerte der Phasen eingesetzt werden. Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens sowie die Verwendung hiervon.

Description

VERFAHREN ZUM REINIGEN UND ANREICHERN VON PROTEINEN, NUKLEINSÄUREN ODER VIREN UNTER VERWENDUNG EINES WÄSSRIGEN ZWEI-PHASEN¬
SYSTEMS
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Reinigen und Anreichern von Immunglobulinen oder anderen Proteinen; oder Plasmid-DNA, genomischer DNA, RNA oder anderen Nukleinsäuren; oder Viren unter Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems.
STAND DER TECHNIK
Biomoleküle, wie Proteine, haben wachsende Bedeutung in einer Vielzahl von Anwendungen, beispielsweise als Medikamente, Diagnostika, Zusatzstoffe in Nahrungsmitteln, Waschmitteln, als Forschungsreagenzien und dergleichen. Die Gewinnung aus natürlichen Quellen reicht nicht aus, so dass biotechnologische Produktionsmethoden eingesetzt werden. Hierbei ist regelmäßig die Aufarbeitung und Reinigung des erhaltenen Proteins erforderlich.
Für Proteine, die in Biopharmazeutika zum Einsatz kommen, wie z.B. therapeutische Antikörper, ist nicht nur die Produktausbeute, sondern auch die Abtrennung von Verunreinigungen wichtig. Es gibt hierbei prozessabhängige Verunreinigungen, wie Wirtszellen, Komponenten der Wirtszellen, z.B. Proteine (Wirtszellproteine, „Host cell proteins", HCP) und Nukleinsäuren, die aus der Zellkultur selbst oder aus der Aufarbeitung resultieren, wie etwa Salze oder abgelöste Chromatographie-Liganden. Zudem können produktabhängige Verunreinigungen vorliegen, wie beispielweise molekulare Varianten des Produkts mit abweichenden Eigenschaften, z.B. verkürzte Formen, Vorläufer, hydrolytische Abbauprodukte, oder modifizierte Formen, wie Polymere und Aggregate. Weitere Verunreinigungen sind Kontaminanten, d.h. Materialien chemischer, biochemischer oder mikrobiologischer Natur, die in unerwünschter Weise in der Zellkultur vorliegen.
Verunreinigungen in Biopharmazeutika sind nicht akzeptabel, da diese unerwünschte Nebenwirkungen bewirken können, wie allergische Reaktionen oder unerwünschte Immunreaktionen, die sogar bis zu einem lebensbedrohenden anaphylaktischen Schock führen könnten. Daher besteht ein Bedarf an geeigneten Reinigungsverfahren, mit denen die unerwünschten Verunreinigungen auf ein unbedenkliches Mindestmaß reduziert werden können.
Die monoklonale Antikörperherstellung, wie diese aktuell im Stand der Technik beschrieben wird, basiert auf einem sogenannten Batch-Plattform-Verfahren [1 ,2], Dieses Verfahren gliedert sich in die vor- und nachgelagerte Verarbeitung (engl. up- and downstream processing). Die Herstellung des rekom- binanten Zielproteins basiert auf der Zellkultivierung in Bioreaktoren während der Upstream- Verarbeitung. Ziel der anschließenden Weiterverarbeitung ist es, die Zielproteine von den Nebenkomponenten, wie Wirtszellproteinen (HCPs), Wirtszell-DNA, Medienkomponenten, Viren und Endotoxinen, unter Verwendung verschiedener Unit-Operationen, wie Zentrifugation, Filtration und Chromatographie, zu isolieren.
Dieser Plattformprozess umfasst die Fed-Batch-Suspensionskultivierung von Säugetierzellen in Bioreaktoren bis zu einem Volumen von 20.000 L, Zentrifugation und Tiefenfiltration als Zellernte, Pro- tein-A-Affinitätschromatographie als Capture (Auftrennungsschritt), Kationenaustauschchromatographie (CIEX) als Zwischenreinigung und hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) als Feinstreinigungsschritt. Zusätzlich werden orthogonale Virusinaktivierungsschritte mit niedrigem pH-Wert und Virusfiltration zur Minimierung der Immunogenität durchgeführt. Im Anschluss an die Protein-A- Affinitäts-Chromatographie und aufgrund des niedrigen pH-Werts zur Virusinaktivierung muss eine Diafiltration durchgeführt werden, um die folgende CIEX zu laden.
Mit Blick auf die etablierten Plattformprozesse stoßen die chromatographischen Schritte jedoch aufgrund steigender Produktkonzentrationen durch vorgeschaltete Prozessoptimierung (d.h. Cell Engineering, Medien- und Prozessparameteroptimierung) an ihre Kapazitätsgrenze. Diese Einschränkung ist allgemein als Downstream-Engpass (engl. bottleneck) bekannt. Mit zunehmender Produktkonzentration sinken die spezifischen Kosten (€/kg) der vor- und nachgelagerten Verarbeitung. Mit höheren Produktkonzentrationen erreicht der plattformabgewandte Prozess jedoch sein Effizienzoptimum. Eine noch stärkere Erhöhung der Produktkonzentration führt zu einer deutlichen Verlagerung der Herstellungskosten (COGs, Cost of goods) von der vorgelagerten zur nachgelagerten Verarbeitung.
Es besteht daher ein Bedarf für ein geeignetes Reinigungsverfahren, das in einfacher Weise und möglichst wirtschaftlich durchführbar ist.
Der aktuelle Stand der Plasmid-DNA (pDNA)-Herstellung basiert ebenfalls auf einem Batch plattform- prozess. Während der Fermentation wird die pDNA intrazellulär im E. coli-System produziert. In der Regel erfolgt zur Ernte eine Zentrifugation der Fermentationslösung. Die so gewonnene nasse Zellmasse (engl. Wet cell paste, WCP) wird im Lyseverfahren zunächst resuspendiert, anschließend mit einer alkalischen Lösung aufgeschlossen und durch Zugabe eines Kaliumacetat-Puffersystems neutralisiert. Im Neutralisationsschritt kommt es zur Ausflockung von Proteinen und anderer Nebenkomponenten, unterstützt durch das verwendete Natrium-Dodecylsulfat (SDS). Das Neutralisat wird in einem Auffangbehälter gesammelt. Dort werden die entstandenen Flocken teils durch Flotation abgetrennt und am Apparateboden die Lösung durch mehrere Festbettschichten abgezogen und grob geklärt. Weitere Schritte in der Aufarbeitung umfassen eine Diafiltration, Aufkonzentrierung durch Ultrafiltration, eine Fällung durch Ammoniumsulfat oder andere Salze und zwei oder mehr Chromatographie-Schritte [3], Im derzeitigen Verfahren ist der Downstream-Engpass das Auffanggefäß des Neutralisats. Bei einer Durchsatzerhöhung und/oder Maßstabsvergrößerung sind die Trennung und Klärung des Neutralisats durch die hohe Biomassebeladung und gleichzeitige Flockenbildung bei den anfallenden hohen Volumina schwierig.
Es besteht daher auch in diesem Fall ein Bedarf für ein geeignetes Reinigungsverfahren. Da die Stabilität der pDNA während dieser ersten Prozessschritte, wie oben beschrieben, noch gering ist, wäre eine robuste, zeitnahe und einfache Isolierung der pDNA erwünscht sowie eine verbesserte Abtrennung von Verunreinigungen, was die pDNA stabilisiert.
Es entstehen auch bei der pDNA -Herstellung prozessabhängige Verunreinigungen, wie Wirtszellen, Komponenten der Wirtszellen, z.B. Proteine (Wirtszellproteine, „Host cell proteins", HCP), Nukleinsäuren, wie RNA und genomische DNA, Endotoxine, Membranbruchstücke und dergleichen, die von der Wirtszelle selbst stammen und in der Fermentation oder beim alkalischen Aufschluss freigesetzt werden. Aus der Aufarbeitung resultieren etwa Salze oder abgelöste Chromatographie- Liganden oder für die Aufarbeitung nötige zugesetzte Substanzen, wie Natrium-Dodecylsulfat (SDS). Zudem können produktabhängige Verunreinigungen, wie Isoformen, Topoisomere und Oligomere der pDNA mit abweichenden Eigenschaften vorliegen. Weitere Verunreinigungen sind Kontami- nanten, d.h. Materialien chemischer, biochemischer oder mikrobiologischer Natur, die in unerwünschter Weise in der Fermentationsbrühe vorliegen. Auch die Produktion von Viren für die Gen- und Zelltherapie wird, wie die vorherigen Prozesse, in ein Upstream- und ein Downstream-Verfahren unterteilt. Das Upstream-Verfahren umfasst die Kultivierung der für die Produktion verantwortlichen Zellen sowie die hierfür notwendige Transfektion. Der Großteil der heutzutage produzierten Viren lassen sich der Gruppe der Adenoviren (durchschnittlich 90 nm groß, nicht umhüllt), der Adeno-assoziierten Viren (durchschnittlich 20 nm groß, nicht umhüllt) und der Retro- und Lentiviren (durchschnittlich 90-120 nm groß, umhüllt) zuordnen. Das Vorhandensein einer zusätzlichen Lipidhülle bei den Retro- und Lentiviren bedingt eine geringere Stabilität, wodurch die Gesamtausbeute nach Aufreinigung um bis zu 70% sinken kann. Das Downstream-Verfahren umfasst die Schritte der Zellernte und Zelllyse im Falle eines nicht-sekretierten Produkts. Auch bei Sekretion wird häufig eine Zelllyse durchgeführt, um nicht sekretiertes Produkt freizulegen und die Gesamtausbeute so zu maximieren. Im Anschluss dieser Schritte liegt der Virus neben einer Vielzahl von Verunreinigungen vor. Neben Medienkomponenten aus der Zellkultur, liegen meist signifikante Mengen des für die Transfektion genutzten Vektors (meist pDNA) vor. Im Falle einer Zelllyse werden ebenso intrazelluläre Bestandteile freigesetzt, wie genomische DNA und Wirtszellproteine. Um das Produkt möglichst schnell zu stabilisieren und von einem Großteil der Nebenkomponenten zu isolieren, bietet sich analog den Ausführungen zum pDNA-Prozess eine Kombination aus Zellernte-Zlyse und wässriger Zweiphasenextraktion an. Hierdurch kann auch der ansonsten meist notwendige Schritt einer zeitaufwendigen und schwer skalierbaren Dichtegradientenzentrifugation ersetzt werden. Die weiteren Schritte der Aufreinigung bis zum finalen Produkt, umfassen beispielweise Dia- und Ultrafiltrationen zum Puffertausch und zur Konzentrationserhöhung, sowie Chromatographien (Größenausschluss, Affinität, lonenaustausch, Hydrophobizität) [4], Es besteht daher auch in diesem Fall ein Bedarf für ein geeignetes Reinigungsverfahren. Eine bekannte Alternative zu den erwähnten adsorptions- und filtrationsbasierten Techniken ist die schonende Extraktion von Biomolekülen, wie Proteinen, Nukleinsäuren, Zellen, etc., mittels wässriger Zwei-Phasen-Extraktion (engl. Aqueous Two Phase Extraction, ATPE) [3],
Unter einem wässrigen Zwei-Phasen-System (ATPS, Aqueous Two Phase System), hier auch kurz als Zwei-Phasen-System bezeichnet, versteht man eine wässrige Lösung mit zum Beispiel zwei unmischbaren Polymeren oder einem Polymer und einem anorganischen oder organischen Salz. Nach der Mischung der genannten Komponenten kommt es zur Ausbildung von zwei Phasen im System. Aufgrund unterschiedlicher biophysikalischer Eigenschaften der Phasen, kann man erreichen, dass eine Verteilung der Biomoleküle in eine der beiden Phasen erfolgt. Das Aufkonzentrieren und Aufreinigen des Zielmoleküls kann so in einem Prozessschritt erreicht werden. Für eine höhere Reinheit des Zielmoleküls können auch mehrstufige ATPS-Extraktionen durchgeführt werden.
Die Bildung eines ATPS (wässriges Zwei-Phasen-System) wird daher durch die Kombination bestimmter phasenbildender Komponenten in geeigneten Konzentrationen erreicht. Bekannte Systeme werden auf Basis folgender Kombinationen erhalten:
Polymer/Polymer
Polymer/Salz
Alkohol/Salz
Ionische Flüssigkeiten.
Für biotechnologische Verwendungen sind insbesondere die Zwei-Phasen-Systeme (ATPS) von Polymer/Salz von Interesse. Als Polymer werden häufig Polyethylenglykole (PEG) mit Molmassen zwischen 200 und 4000 g/mol verwendet. Häufig verwendete Salze sind beispielweise Natrium- und Kaliumphosphate und -citrate. Das Anion ist gegenüber dem Kation dominierend verantwortlich für die Phasenbildung und die Stoffeigenschaften. Ein Polymer, wie PEG, reichert sich in der oberen leichten Phase an und das oder die Salze reichern sich in der unteren schweren Phase an. Die Mischungslücke wird mit zunehmendem Molgewicht des Polymers größer. Ein Teil der Prozessentwicklung ist, das optimale System für die vorgegebene Prozessaufgabe zu identifizieren.
Im Prinzip dient das wässrige Zwei-Phasen-System (ATPS) daher dazu, ein Biomolekül dadurch zu reinigen oder anzureichern, dass nach dem Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) das Biomolekül sich in einer der beiden wässrigen Phasen anreichert, insbesondere sich dort im Wesentlichen befindet, und die unerwünschten Verunreinigungen sich in der anderen Phase, der Gegenphase, anreichern, insbesondere sich dort im Wesentlichen befinden, so dass durch Abtrennen der die Verunreinigungen enthaltenden Gegenphase das Biomolekül mit einem deutlich reduzierten Anteil oder auf ein Minimum herabgesetzten Anteil an Verunreinigungen in einer Phase erhalten wird.
Beim wässrigen Zwei-Phasen-System (ATPS) ist zu beachten, dass sich die Phasen langsamer trennen als übliche wässrig/organische Systeme und durch die niedrigen Grenzflächenspannungen und Dichtedifferenzen leicht Emulsionen erzeugt werden [5], Auch die teilweise hohen Viskositäten (bis 40 mPas) von Polyethylenglykol-(PEG)-reichen Phasen, die langsameren Stofftransfer und schlechtes Absetzverhalten bewirken, erschweren eine Prozessvorhersage.
In allen Vorrichtungen zur Flüssig-Flüssig-Extraktion tritt ein Phasenkontakt auf, wenn eine Phase in der anderen dispergiert vorliegt. Hierbei kann jede der beiden Phasen in der anderen dispergiert sein. Dieser Phasenkontakt ermöglicht den Stoffaustausch, der in einer oder mehreren Stufen durchgeführt werden kann. Die Trennung der Phasen erfolgt üblicherweise in einem Abscheider oder einem Mischer-Abscheider. Einstufige Mischer-Abscheider werden in der Regel im einstufigen Betrieb eingesetzt, während mehrere in Reihe geschaltete Mischer-Abscheider auch in sogenannten Batterien im Gegenstrom- oder Kreuzstrombetrieb arbeiten können. Die gebräuchlichsten Extraktionsgeräte, die im Gegenstrommodus arbeiten, sind Kolonnen. Bei flüssigen Phasen mit extrem geringem Dichteunterschied reicht das Erdschwerefeld allein nicht aus, um die Phasen in einer angemessenen Zeit zu trennen. Dann werden Zentrifugen eingesetzt, die die Flüssig-Flüssig-Trennung durch die Anwendung von Zentrifugalkraft durch Drehung der Zentrifugentrommel beschleunigen. Diese ermöglichen auch die Trennung von Gemischen mit extrem geringer Dichtedifferenz (Ap kleiner als 30 g/m3) in akzeptabler Zeit [6],
Ein bekanntes Verfahren zur selektiven Reinigung und Anreicherung von Immunglobulinen oder anderen Proteinen mittels eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Anwendung von Zentrifugalkraft ist beispielweise aus der WO 2014/135420 A1 [7] bekannt. Das Verfahren umfasst gemäß einer Ausführungsform folgende Schritte: a. Bereitstellen einer Zellkultur oder eines Zellkulturüberstandes, die das Zielprotein enthält; b. Überführung der Zellkultur oder des Zellkulturüberstandes in ein wässriges Zwei-Phasen-System durch Zugabe eines Polymers und mindestens eines Salzes, oder zweier Polymere in geeigneter Konzentration; c. Durchmischung des Zweiphasensystems zur Erzeugung einer Dispersion; d. Abtrennung von schwerer und leichter Phase in einem Zentrifugalextraktor; e. Gewinnung des Zielproteins aus der leichten Phase.
Die Trennung unter Verwendung einer Zentrifuge ist nachteilig, da große Behälter verwendet werden müssen und viel Lösungsmittel eingesetzt werden muss, was hinsichtlich der schlechteren Handhabbarkeit als auch wirtschaftlicher Gesichtspunkte nachteilig ist. Im Gegensatz zur Offenbarung der WO 2014/135420 A1 [7] ist es für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich, einen Zentrifugalextraktor einzusetzen.
Ein Verfahren zur selektiven Reinigung und Anreicherung von Plasmid-DNA mittels eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems ist beispielweise aus Frerix, A. et al. [8] bekannt geworden. Das Verfahren ist folgendermaßen charakterisiert: • Die alkalische Zellyse, die Ausfällung nach Neutralisation sowie die Extraktion mittels Zwei- Phasen-System (ATPS) mit gleichzeitiger Klärung des Lysates findet in einem Tank statt (one pot approach);
• Zwei-Phasen-System (ATPS), bestehend aus: PEG/Salz (Kaliumphasphat und Kalium-Citrat);
• Starke Anreicherung der Plasmid-DNA in der schweren Phase (bottom phase);
• Genomische DNA, RNA in der leichten Phase (top phase) und/oder der Zwischenphase (interphase).
Um eine wässrige Zwei-Phasen-Extraktion, wie in der vorliegenden Erfindung, als Zellernteverfahren einsetzen zu können, ist es erforderlich, dass die Messtechnik die Anforderungen an eine Detektion einer Phasengrenzfläche oder eine zusätzlich gebildete Zwischenphase erfüllt. Bereits eine Detektion der beiden Phasen stellt ein Problem dar, da diese ähnliche Eigenschaften besitzen. Ein zusätzliches Problem ergibt sich bei Bildung einer Zwischenphase, die eine Emulsionsschicht aus Zellen, Agglomeraten und Biopartikeln darstellt, die die Messtechnik verschmutzen oder die Messungen beeinflussen können.
Bei einer Phasengrenzfläche handelt es sich um die Grenze zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten. Die Flüssigkeiten lagern sich dabei aufgrund von Dichteunterschieden übereinander ab. Aus den beiden nicht mischbaren Phasen kann sich auch eine zusätzliche Zwischenphase, d.h. eine dritte Phase, bilden, so dass dann zwei Phasengrenzflächen vorliegen. Eine Erfassung der Phasengrenzfläche^) oder Zwischenphase ist dann sinnvoll, wenn man nur eine der beiden Hauptphasen abziehen möchte, wenn beispielweise das Zielmolekül nur in einer Phase vorliegt. Typischerweise sind die Phasengrenzfläche(n) oder die Zwischenphase in den zur Abtrennung eingesetzten transparenten Abscheidern erkennbar. Das genaue Erfassen dieser Phasengrenzfläche(n) oder Zwischenphase ist dabei essentiell für einen reibungslosen Ablauf der Trennung. Zum einen wird gewährleistet, dass sich die Qualität des Produkts nicht ändert und zum anderen wird die Prozesseffizienz gesteigert, indem Abschaltungen weniger häufig stattfinden müssen und die Kapazität der Anlagen voll genutzt werden kann. Optimal für eine exakte Trennung wäre es, ein genaues Profil der Phasen über die Höhe (Position der leichten Phase, der schweren Phase, der Zwischenphase und der Phasengrenzfläche(n)) insbesondere an kritischen Stellen, bereitzustellen, um dem Anwender genaue Informationen für die Trennung zu geben.
Für die Phasengrenzflächen-Detektion sind zahlreiche Messgeräte auf dem Markt erhältlich. Diese lassen sich nach ihren allgemeinen Messprinzipien und nach dem Modus der Messung einteilen: Dies sind mechanisch/optische Messgeräte (bspw. Schwimmschalter, Sichtgläser, Verdränger), elektromechanische Messgeräte (bspw. magnetorestriktive oder kapazitive Detektoren), elektronische Messgeräte mit Phasenkontakt (bspw. Radar, Differenzdruck, Ultraschall) oder elektronische Messgeräte ohne Phasenkontakt (bspw. nukleare Messung). Einige dieser sollen nachfolgend kurz erläutert und deren Nachteile beschrieben werden: Bei einem Schwimmschalter handelt es sich um eine mechanisch/optische Messmethode, die mithilfe der Auftriebskraft Füllstände messen kann, die aber auch verwendet werden kann, um Zwischenschichten zwischen zwei Phasen zu erkennen. Das Gewicht des Schalters muss hierbei an die schwerere Flüssigkeit angepasst werden. Da es sich bei dem Schalter um ein passives Teil handelt, besitzt dieser keinen Mechanismus zur Selbstkontrolle, wodurch regelmäßige Kontrollen notwendig sind. Der Schalter wird zudem durch Feststoffe oder zu viskose Flüssigkeiten in seiner Funktionsweise beeinträchtigt.
Ein Sichtglas als mechanisch/optisches Messgerät kann verwendet werden, um den Flüssigkeitsstand kontinuierlich zu messen, wobei auch eine Erfassung der Phasengrenzfläche zwischen zwei Flüssigkeiten möglich ist. Das Sichtglas ist mit dem Tank verbunden, so dass bei einer zu weiten Verschiebung der Zwischenschicht, diese vom Sichtglas nicht mehr erfasst wird. Feststoffe können das Glas verschmutzen, wodurch eine visuelle Erkennung nicht mehr möglich ist.
Ein weiteres mechanisch/optisches Messgerät ist ein Verdränger-Füllstandsmessgerät, das in die Flüssigkeit gegeben wird und je nach Flüssigkeitsstand eine Auftriebskraft erfährt. In einer einfachen Ausführung wird ein Verdränger (Displacer) beispielweise mit einer Feder verbunden. Jedoch hängt das Messergebnis stark von der Kalibrierung bei Prozessbedingungen ab und eine Ansammlung von Feststoffen kann zur Verfälschung der Messung führen.
Bei einem magnetorestriktiven Messgerät, das ein elektromechanisches Messverfahren einsetzt, wird die Interaktion zwischen zwei Magneten gemessen. Ein Magnet ist im Schwimmer, der andere in einem Führungsrohr. Der Schwimmer kann sich in seiner Kammer frei nach oben und unten bewegen, sobald der Füllstand sich ändert. Ein kleiner Stromimpuls erreicht das Magnetfeld des Schwimmers, wodurch der Schwimmer sich dreht und eine Schallwelle emittiert wird, die gemessen werden kann. Meistens ist außen an die Kammer ein Indikator montiert, damit man sehen kann, wo der Schwimmer ist. Da die Position des Schwimmers detektiert wird, führen Dichteänderungen zu Fehlern. Weiterhin können Feststoffe dazu führen, dass der Schwimmer stecken bleibt.
Ein anderes Messgerät verwendet ein elektromechanisches Verfahren zur kapazitiven Messung, bei dem eine Elektrode im Tank montiert wird. Als zweite Elektrode wird eine Tankwand verwendet oder eine Referenzelektrode. Erhöht sich der Flüssigkeitsstand so ändert sich das Material zwischen den beiden Elektroden, so dass sich die Kapazität des Kondensators verändert. Nachteile dieses Messsystems sind, dass Veränderungen der Dielektrizitätszahl des Mediums zu Fehlern führen. Bei Tanks mit nicht leitenden Materialien muss zusätzlich eine Referenzelektrode installiert werden, wodurch die Kalibrierung schwierig ist. Weiterhin muss die Dielektrizitätskonstante der Flüssigkeiten bei einer Zwischenschicht-Messung groß genug sein, um diese zu erfassen und das obere Medium darf bei einigen Messeinrichtungen nicht leitfähig sein.
Bei elektronischen Messgeräten mit Phasenkontakt, die auf geführtem Radar basieren, wird ein hochfrequenter Radarimpuls einer Sonde entlang geführt. Wenn der Impuls auf eine Medienoberfläche trifft, wird ein Teil der Impulse zurückgesendet und vom Gerät erfasst und ausgewertet. Die Zeit die zwischen Senden und Empfangen vergeht, ist ein direktes Maß für die Höhe der Flüssigkeit. Problematisch an diesem Messverfahren ist, dass das Medium mit der geringeren Dielektrizitätskonstante, die sich nicht verändern darf und einen Wert unter 10 haben soll, oben sein muss; die Dielektrizitätskonstanten beider Phasen müssen einen erfassbaren Unterschied haben, die obere Schicht muss dick genug sein, um erfasst werden zu können und eine vorhandene Emulsionsschicht kann zu Messfehlern führen.
Als elektronische Messgeräte mit Phasenkontakt sind auch Differenzdrucksensoren bekannt, die eine Zwischenschicht zwischen zwei Phasen mit unterschiedlicher Dichte messen können. Der Druckunterschied ist ein direktes Maß für den Füllstand. Um eine Zwischenschicht zu erfassen, muss der Füllstand eine bestimmte Höhe aufweisen. Der Druckunterschied muss zudem groß genug sein, was entweder durch einen hohen Dichteunterschied oder einen großen apparativen Aufbau erreicht wird. Dichteänderungen und eine Temperaturabhängigkeit der Dichte der Flüssigkeiten führen zu Fehlern.
Weitere elektronische Messgeräte mit Phasenkontakt arbeiten mit Ultraschall, wobei Ultraschallwellen in den Tank emittiert werden. Dieses Signal wird von Flüssigkeiten zurückgesendet, wodurch aufgrund des Zeitunterschieds eine Ermittlung der Füllstandhöhe und auch eine Zwischenschicht-Erfassung möglich ist. Feststoffe in der Flüssigkeit führen jedoch dazu, dass die Ultraschallwellen gestreut werden, wodurch das detektierte Signal abnimmt. Die Detektierbarkeit hängt dabei stark von den Eigenschaften der Feststoffe ab, da bei zu hohen Anteilen, das Signal vollständig verschwinden kann. Weiterhin sind Gase, die in der Flüssigkeit eingefangen sind, ein Problem, da diese das Signal ebenfalls abschwächen.
Bekannte elektronische Messgeräte ohne Phasenkontakt basieren auf einer nuklearen Messung, bei der die Schwächung von Gammastrahlung erfasst wird. Dabei ist die Schwächung abhängig von der Dichte des Mediums. Mithilfe dieser Methode lassen sich auch Zwischenschichten erfassen. Allerdings sind die Messeinheiten relativ teuer und erfordern regelmäßige Kontrollen, um die Sicherheit zu garantieren. Weiterhin können zu große Dichteänderungen und Verunreinigungen an der Tankwand zu Fehlern führen.
Die zahlreichen Nachteile der oben geschilderten bekannten Messgeräte zeigen, dass diese eigentlich nicht für die Erfassung von einer oder auch zwei Phasengrenzflächen bei Vorliegen einer Zwischenphase in einem wässrigen Zwei-Phasen-System geeignet sind. Zum Teil sind die üblichen Messtechniken auch gar nicht anwendbar, wie beispielweise eine Detektion durch einen starken Abfall der Kapazität (meistens die organische Phase), die in den wässrigen Zwei-Phasen-Systemen aufgrund des Fehlens einer organischen Phase nicht möglich ist. Auch stoßen diese Messgeräte bei großtechnischer Produktion zum Teil an ihre Grenzen, wobei zum Beispiel bei einem Sichtglas in einem Abscheider aufgrund der großen erforderlichen Durchmesser (DN600 - 1000) trotz der Verwendung eines transparenten Abscheiders aus Glas aufgrund der zunehmenden Trübung kein zuverlässiges Erkennen durch Sichten mehr möglich ist. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass ein geeigneter Parameter zum Unterscheiden der Phasen bei wässrigen Zwei-Phasen-Systemen die elektrische Leitfähigkeit darstellt. Hierzu muss jedoch eine Technik entwickelt und eingesetzt werden, die es ermöglicht, die elektrischen Leitfähigkeiten beider Phasen zuverlässig zu unterscheiden.
Aus dem Stand der Technik gemäß der DE 44 00 397 A1 [9] ist ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer oder mehrerer Phasen, die neben einer Hauptphase vorliegen, bekannt geworden, wobei das Einleiten der Hauptphase in ein Trenngefäß und dann das Messen der Leitfähigkeit am Boden und/oder an der Spitze des Trenngefäßes erfolgt. Die Messung der Leitfähigkeit wird hierbei erst nach Trennung in die einzelnen Phasen durchgeführt, wobei nur ganz oben und ganz unten im Trenngefäß gemessen wird. Die Messung der Leitfähigkeit dient dabei ausschließlich zum Zwecke des Nachweises, dass mehrere Phasen vorliegen; die Leitfähigkeit wird nicht zur Trennung der Phasen und deren getrennter Entnahme aus einer Trennvorrichtung herangezogen.
Die DE 199 23 901 A1 [10] bezieht sich auf ein Verfahren zur kontrollierten Zugabe von Emulsionsbrechern in einen Prozesstank, insbesondere in einen mit Gas, Öl, Wasser und Sand gefüllten Separationstank, wobei mittels eines Sensors mit vertikaler Ortsauflösung eine Emulsionsschicht detektiert und ein Sensorsignal an eine Zufuhrsteuerung geleitet wird, um die Menge an zuzuführendem Emulsionsbrecher in Abhängigkeit des Sensorsignals dosiert zuzugeben. Als Sensoren sind insbesondere kapazitive Füllstandsensoren oder Gammastrahlen-Dichteprofilsensoren geeignet.
Die KR 101 143 889 B1 [11] offenbart einen automatisch verriegelnden fraktionierten Trichter, um die Verarbeitbarkeit zu verbessern, indem ein elektrischer Leitfähigkeitssensor installiert und der Trichter automatisch auf der Grundlage von elektrischen Signalen verriegelt wird. Der Trichter weist ein Aufnahmeteil, einen elektrischen Leitfähigkeitssensor, eine Steuerung und ein Magnetventil auf.
Weiterhin wird in der US 3 220 930 A [12] eine Vorrichtung offenbart, in der eine Emulsion von Rohölen durch Zugabe eines chemischen Additivs (sog. Demulgator) gebrochen wird. Diese dient zum Abtrennen des im Rohöl enthaltenen Wassers. Hierzu wird in einem Tank eine wasserhaltige Rohöl- Emulsion mit einem Demulgator versetzt, so dass eine Öl-Phase, eine Öl/Wasser-Zwischen phase und eine Wasser-Phase resultieren, die jeweils verschiedene Dichten und verschiedene elektrische Eigenschaften haben. Der Demulgator ist beispielsweise Tretolite, Nalco 538, Natriumhydroxid, Natriumsilikat oder Mischungen dieser. Eine elektrische Sonde 16 wird an der Grenzfläche zwischen oberer Phase und Zwischenphase eingesetzt und eine Sonde zur Bestimmung der Dichte wird an der Grenzfläche zwischen der Zwischenphase und der unteren Phase platziert. Die elektrische Sonde 16 dient dazu das Ventil 22 zu steuern, mit dem die Zugabemenge des Demulgators kontrolliert wird. Hierbei wird nur zwischen 2 Zuständen unterschieden: Wenn die elektrische Sonde 16 Kontakt mit der Öl/Wasser-Phase hat, fließt Strom, wenn diese Kontakt mit der Öl-Phase hat, dann fließt kein Strom. Die Zugabe eines festen Zusatzstoffs in Form des Demulgators in die Trennapparatur erschwert die Steuerung des Zwei-Phasen-Systems, da die Phasen erst erzeugt und in unterschiedlichem Maße - je nach Demulgator-Menge - nachgebildet werden. Die Steuerung und Kontrolle gleichzeitig mit einer elektrischen Sonde und einer Dichte-Sonde ist sehr komplex und unübersichtlich. Es liegt kein wässeriges Zwei-Phasen-System vor, in dem alle Phasen Wasser als Lösungsmittel aufweisen.
Die EP 1 059 105 A2 [13] bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren insbesondere zur Abtrennung von Wasser aus einem Lösemittelgemisch aus der Textilreinigung. Es wird eine Kombination aus mindestens einem Schwerkraftabscheider und, stromaufwärts zu diesem, mindestens einem Koa- leszenzabscheider vorgesehen, wobei eine Zuleitung des Schwerkraftabscheiders mit dem Auslass des Koaleszenzabscheiders verbunden ist. Im Koaleszenzabscheider, der mit einem offenporigen lösemittelbeständigen Schaum gefüllt ist, wird das Volumen der Wassertröpfchen vergrößert. Im Schwerkraftabscheider ist ein Sensor 10 vorgesehen, der bei Übersteigen eines Höhenmaximums für die mittlere Phase B ein Signal an ein Ventil 12 und eine Pumpe 13 abgibt, um die Lösung wieder zum Koaleszenzabscheider zurückzuführen. Im unteren Teil des Schwerkraftabscheiders ist ein weiterer Sensor 21 vorgesehen. Übersteigt der Flüssigkeitsspiegel der Phase C den Sensor 21 , so wird das Ablassventil 20 entsprechend angesteuert. Beide Sensoren dienen zur Leitfähigkeitsmessung oder Trübungsmessung. Es handelt sich um ein klassisches Recyclingverfahren, bei dem ein Abfallprodukt gereinigt wird, das ansonsten entsorgt werden müsste. Das Wasser wird abgetrennt, um das Lösungsmittelgemisch wieder einsetzen zu können. Es handelt sich um ein sehr komplexes Trennverfahren. Es liegt kein wässeriges Zwei-Phasen-System vor, in dem alle Phasen Wasser als Lösungsmittel aufweisen.
In der EP 1 762 616 A1 [14] wird ein Verfahren zum Entfernen einzelsträngiger Nukleinsäuren von doppelsträngigen Nukleinsäuren durch die folgenden Schritte beschrieben:
(a) Zurverfügungstellen eines Gemischs enthaltend vollständig und/oder teilweise doppelsträngi- ge Nukleinsäuren sowie gegebenenfalls einzelsträngige Nukleinsäuren;
(b) Resuspendieren des unter Punkt (a) genannten Gemischs in einem wäßrigen, niedermolaren Puffersystem mit niedriger lonenstärke und geringer Pufferwirkung;
(c) Einstellen von Bedingungen in dem Gemisch gemäß Schritt (b), die zu einer reversiblen Denaturierung von einer bestimmten doppelsträngigen Nukleinsäure oder mehrerer bestimmter doppel- strängiger Nukleinsäuren führen, wobei eine andere Nukleinsäure oder mehrere andere Nukleinsäuren irreversibel denaturiert werden;
(d) weitere Zugabe von Puffer und einer Polymerkomponente zu dem Gemisch gemäß Schritt (c);
(e) Inkubation des Gemischs gemäß Schritt (d) für einen Zeitraum, der ausreicht, ein wäßriges Zwei-Phasensystem mit einer Ober- und einer Unterphase auszubilden; und
(f) Entfernen der Einzelstrang-Nukleinsäure enthaltenden Ober- sowie Interphase und Auffangen der Doppelstrang-Nukleinsäure aus der Unterphase. Gemäß den Beispielen 1 bis 3 wird stets eine Zentrifugation zur Trennung von Ober- und Unterphase eingesetzt. Für das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird keine Zentrifugation, insbesondere Zentrifugalextraktion, eingesetzt, da diese in nachteiliger Weise das Verfahren unterbricht. Die Trennung unter Verwendung einer Zentrifuge setzt zudem die Verwendung großer Behälter voraus, wobei eine große Menge an Lösungsmittel eingesetzt werden muss. Dies bedeutet eine schlechtere Handhabbarkeit sowie wirtschaftliche Nachteile. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile aus dem Stand der Technik zu vermeiden und ein Verfahren zum Reinigen und Anreichern von Proteinen, Nukleinsäuren oder Viren unter Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems bereitzustellen, das zuverlässig die Detektion der beiden Phasen und deren Übergang in Form der Phasengrenzfläche oder einer optional vorhandenen Zwischenphase (hier auch Zwischenschicht genannt) mit zwei Phasengrenzflächen erlaubt. Das Verfahren soll auch die Trennung der Phasen voneinander ermöglichen, wobei das Zielmolekül in Form eines Proteins, einer Nukleinsäure oder eines Virus in einer Phase angereichert wird. Das Verfahren soll auch kontinuierlich anwendbar sein. Ein großindustrieller Einsatz des Verfahrens soll ebenfalls möglich sein.
Es wurde nun in überraschender Weise festgestellt, dass in einem wässrigen Zwei-Phasen-System die gemessene elektrische Leitfähigkeit in einer Trennvorrichtung dazu dienen kann, die vorhandenen Phasen voneinander zu unterscheiden, so dass die Trennung der Phasen erleichtert wird. Dies ist überraschend, weil im gesamten Stand der Technik stets nur organische Lösungsmittel/Wasser- Systeme in Verbindung mit der Messung der elektrischen Leitfähigkeit zum Einsatz kommen. Dies liegt daran, dass organische Lösungsmittel den elektrischen Strom nicht leiten, so dass nur zwischen 2 Zuständen unterschieden werden muss, um die Phasen zu identifizieren: kein Strom fließt bedeutet ein organisches Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch liegt vor; Strom fließt bedeutet Wasser oder ein Wasser/Lösungsmittel wird gemessen. Erfindungsgemäß liegt demgegenüber jedoch in allen Phasen Wasser als Lösungsmittel vor, so dass es völlig unerwartet ist, dass die Messung der elektrischen Leitfähigkeit als Parameter dienen kann, um auch bei wässrigen Zwei-Phasen-Systemen zwischen den einzelnen Wasserphasen zu unterscheiden. Ein organisches Lösungsmittel liegt in den wässrigen Zwei-Phasen-Systemen der Erfindung regelmäßig nicht vor.
Gemäß einer Ausführungsform ermöglicht das Verfahren nicht nur das Bestimmen des Vorhandenseins der beiden Phasen und die Unterscheidung dieser, sondern auch die Ermittlung und Erfassung der genauen Position der Phasengrenzfläche oder einer eventuell vorhandenen Zwischenphase zwischen den zu trennenden Phasen, wodurch die getrennte Entnahme der einzelnen Phasen voneinander deutlich erleichtert und vereinfacht wird. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur leitfähigkeitsbasierten Regelung und Kontrolle der Lage der Phasengrenzfläche(n) zur Verfügung, das zur Phasentrennung und der getrennten Entnahme der Phasen aus einer Trennvorrichtung eingesetzt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die zuvor geschilderte Aufgabe wird daher erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes, ausgewählt aus
Immunglobulinen oder anderen Proteinen; oder
Plasmid-DNA, genomischer DNA, RNA oder anderen Nukleinsäuren; oder Viren, umfassend die folgenden Schritte: a. Bereitstellen einer Ausgangslösung, die das Zielprodukt enthält; b. Überführen der Ausgangslösung in ein wässriges Zwei-Phasen-System durch Zugeben mindestens eines Polymers und mindestens eines Salzes in geeigneter Konzentration, oder durch Zugeben mindestens zweier Polymere in geeigneter Konzentration; c. Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Erhalt eines Stoffaustauschs, so dass sich das Zielprodukt in der leichten oder schweren Phase anreichert; d. Entmischen lassen der Phasen in einer Trennvorrichtung in eine leichte Phase, eine schwere Phase und sofern eine Zwischenphase vorhanden ist eine Zwischenphase; e. kontinuierliches Messen der elektrischen Leitfähigkeit in mindestens einer der Phasen, insbesondere in der leichten und/oder schweren Phase, in der Trennvorrichtung zum Bestimmen der Position der beiden Phasen und der Phasengrenzfläche oder bei Vorliegen einer Zwischenphase der Position der Zwischenphase und der zwei Phasengrenzflächen; f. Entnehmen der Phasen aus der Trennvorrichtung anhand der kontinuierlich gemessenen elektrischen Leitfähigkeit mindestens einer der Phasen in Schritt e., insbesondere der leichten und/oder schweren Phase; und g. Gewinnen der Phase mit dem Zielprodukt.
Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Zielproduktanreicherung und -abtrennung und gleichzeitig eine Abreicherung von Verunreinigungen mit Hilfe eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems zur Verfügung. Bei den Schritten a. bis g. der Erfindung wird vollständig auf den herkömmlichen Einsatz von Separatoren, insbesondere Zentrifugatoren, Filtration und Chromatographie verzichtet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes verwendet, wobei als Ausgangslösung eine Zellkultur, ein Zellüberstand oder ein Zelllysat verwendet wird, worin das Zielprodukt enthalten ist. In diesem Fall dient das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Zellernte und/oder der Isolation des Zielproduktes aus den Zellen, der Zellkultur und/oder dem Zellysat. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher sowohl zum Abtrennen der Zellen eingesetzt werden als auch dafür, das von den Zellen erzeugte Produkt aufzuarbeiten, wobei die Zellen bereits abgetrennt wurden. D.h. die Zellen können entweder bereits vorher entfernt werden, oder erst während des vorliegenden Verfahrens.
Anstelle oder zusätzlich zur elektrischen Leitfähigkeit kann auch die Trübung gemessen werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung, umfassend eine Trennvorrichtung zum Trennen der Phasen; mindestens einen Auslass in der Trennvorrichtung; mindestens eine Sonde zum Messen der elektrischen Leitfähigkeit und/oder mindestens eine Sonde zum Messen der Trübung in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung; eine oder mehrere Entnahme-Vorrichtung(en) und/oder Mittel zur Regelung und/oder Steuerung der Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigeit(en) und/oder der Entnahmedauer der leichten Phase, der schweren Phase und, sofern vorhanden, der Zwischenphase, basierend auf den Messwerten der elektrischen Leitfähigkeit (für die Sonde(n) zum Messen der elektrischen Leitfähigkeit) oder basierend auf den Messwerten der Trübung (für die Sonde(n) zum Messen der Trübung) in mindestens einer Phase.
Eine Entnahme-Vorrichtung ist beispielsweise ein Tauchrohr, dessen Aufbau und Funktion noch im Einzelnen erläutert wird.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Einstellen der Lage der Phasen in einer Trennvorrichtung und getrennten Entnahme der Phasen aus einer Trennvorrichtung anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte der Phasen (für die Sonde(n) zum Messen der elektrischen Leitfähigkeit) und/oder anhand der gemessenen Trübungswerte der Phasen (für die Sonde(n) zum Messen der Trübung).
Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Offenbarung werden in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung angegeben und teilweise dem Fachmann im Stand der Technik ohne Weiteres aus der Beschreibung offensichtlich oder durch Umsetzung der Offenbarung, wie hier beschrieben, in die Praxis erkannt werden, einschließlich der detaillierten Beschreibung, die folgt, der Ansprüche, genauso wie der beigefügten Zeichnungen. Die Ansprüche, die nachfolgend angegeben sind, bilden einen Teil dieser Beschreibung und sind direkt und durch Bezugnahme hier einbezogen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Figuren 1 bis 22 sind schematische Darstellungen von beispielhaften Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung. Im Einzelnen zeigt:
Figur 1 eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung, die den Verlauf einer Extraktion einer Charge zu 3 Zeitpunkten der Trennung mit einer Sonde zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen, aufgetragen über die Zeit, darstellt;
Figur 2 eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung, die eine kontinuierliche Extraktion mit zwei Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen darstellt;
Figur 3 eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung, die eine kontinuierliche Extraktion mit zwei Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen zu einem anderen Zeitpunkt als Figur 2 darstellt; Figur 4 eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer weiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung, die eine kontinuierliche Extraktion mit zwei Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen darstellt;
Figur 5 einen Querschnitt einer weiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung mit 4 Sonden in einer radialen Anordnung (links) und eine Seitenansicht hiervon (rechts);
Figur 6 einen Querschnitt einerweiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung mit 4 Sonden in einer radialen Anordnung mit horizontaler Verteilung (links) und eine Seitenansicht hiervon (rechts);
Figur 7a Darstellung des Anfahrens einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei- Phasen-Phosphatsystem anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit in [mS/cm] für die schwere Phase mit einer ersten Sonde, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 7b Darstellung des Anfahrens einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in dem wässrigen Zwei- Phasen-Phosphatsystem von Figur 7a anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit in [mS/cm] für die leichte Phase mit einer zweiten Sonde, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 8 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem, dargestellt anhand der mit zwei Sonden gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofile in [mS/cm], jeweils für die leichte und die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 9a Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem, dargestellt anhand des mit einer ersten Sonde gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofils in [mS/cm] für die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 9b Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in dem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem von Figur 9a, dargestellt anhand des mit einer zweiten Sonde gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofils in [mS/cm] für die leichte Phase, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 10 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens, wobei anstelle eines Zwei-Phasen-Systems ein einphasiges System in den Abscheider gegeben wird; Figur 11 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens, wobei der Wassergehalt des Zwei-Phasen-Systems variiert wird und das Störsystem von Beginn an in der Trennvorrichtung vorliegt;
Figur 12 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens, wobei der Polymergehalt des Zwei-Phasen-Systems variiert wird und das Störsystem von Beginn an in der Trennvorrichtung vorliegt;
Figur 13 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften Ausführungsform des Verfahrens, wobei der Puffersalzgehalt des Zwei-Phasen-Systems variiert wird und das Störsystem von Beginn an in der Trennvorrichtung vorliegt;
Figur 14 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem mit Zellkultur, dargestellt anhand der mit zwei Sonden gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofile in [mS/cm], jeweils für die leichte und die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 15 ein Balkendiagramm, das die Zellzahl in [105 Zellen/mL] der in Beispiel 5.1 eingesetzten Zellkultur sowie die Zellzahlen der leichten Phase zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verfahrens, darstellt;
Figur 16 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen- P h os p hatsystem mit Zellkultur, dargestellt anhand der mit zwei Sonden gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofile in [mS/cm] jeweils für die leichte und die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [sj;
Figur 17 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem mit Zellkultur, dargestellt anhand der mit zwei Sonden gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofile in [mS/cm], jeweils für die leichte und die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [sj;
Figur 18 ein Balkendiagramm, das die Zellzahl in [105 Zellen/mL] der in den Beispielen 5.2 und 5.3 eingesetzten Zellkultur sowie die Zellzahlen der leichten und schweren Phase zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verfahrens, darstellt;
Figur 19A Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem mit Zellkultur, dargestellt anhand der mit zwei Sonden gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofile in [mS/cm], jeweils für die leichte und die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [s]; Figur 19B Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem mit Zellkultur, dargestellt anhand der Höheneinstellung des Tauchrohrs in [cm] im Abscheider, die mit den Leitfähigkeitswerten von Figur 19A korreliert;
Figur 20 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem mit Zelllysat, dargestellt anhand der mit zwei Sonden gemessenen elektrischen Leitfähigkeitsprofile in [mS/cm], jeweils für die leichte und die schwere Phase, aufgetragen über die Zeit in [s];
Figur 21 ein Balkendiagramm, das die Ausbeute und Konzentration für Plasmid-DNA des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens darstellt;
Figur 22 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem unter Verwendung von zwei Pumpen, dargestellt anhand der Pumpenströme während des Verfahrens; und
Figur 23 Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-System unter Verwendung einer Sonde zur Messung der Trübungswerte.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DEFINITION VON ALLGEMEINEN BEGRIFFEN
Begriffen, die hier nicht speziell definiert sind, sollte die Bedeutung gegeben werden, die ein Fachmann im Stand der Technik im Licht der Offenbarung und des Kontexts diesen geben würde.
Unter „Reinigen und Anreichern" wird hier verstanden, dass unerwünschte Komponenten, wie Kontaminationen oder Verunreinigungen, insbesondere Wirtszellproteine (HCPs), Wirtszell-DNA (DNA), Medienkomponenten, Viren und Endotoxine und dergleichen, abgereichert werden können und die Reinheit des Zielproduktes durch das Verfahren zunimmt.
Der Begriff „Anreichern“ umfasst auch ein Aufkonzentrieren, wobei unter „Aufkonzentrieren" in diesem Zusammenhang zu verstehen ist, dass das Zielprodukt in Schritt g. in einer höheren Konzentration (Masse/Volumen) im Vergleich zu Schritt a. erhalten wird.
Unter „Leitfähigkeit“ soll hier die elektrische Leitfähigkeit verstanden werden. Wenn die „Messung der elektrischen Leitfähigkeit einer Phase“ oder eine ähnliche Formulierung angegeben wird, so bedeutet dies, dass die elektrische Leitfähigkeit an bestimmten Positionen in dieser Phase unter Verwendung eines oder mehrerer Leitfähigkeitsmessgeräte, wie Sonden, gemessen wird.
Unter dem Begriff „Leitfähigkeitssonde“, wie hier verwendet, soll eine Sonde verstanden werden, die die elektrische Leitfähigkeit misst.
Der Ausdruck „elektrische Leitfähigkeit der leichten/schweren Phase“ oder ähnliche Ausdrücke sollen so verstanden werden, dass eigentlich nicht die elektrische Leitfähigkeit der leichten, schweren oder Zwischenphase gemessen wird, sondern die elektrische Leitfähigkeit an bestimmten vordefinierten Stellen oder geeigneten Positionen in der Trennvorrichtung gemessen wird. Die vordefinierten Stellen oder geeigneten Positionen sind die Orte in der Trennvorrichtung, an denen ein oder mehrere Leitfähigkeitsmessgeräte, insbesondere ein oder mehrere Sonden, die elektrische Leitfähigkeit messen.
Die „Trübung“, auch Turbidität, einer transparenten Flüssigkeit ist ein optischer Eindruck, der durch kleine Partikel entsteht, die einen vom Trägermedium abweichenden Brechungsindex aufweisen oder eine Absorption zeigen. Die Trübung einer Flüssigkeit wird optisch ermittelt und mit Hilfe einer elektronischen Auswertung gemessen. Die Wellenlänge der Messstrahlung liegt beispielweise im Infrarotbereich bei 860 nm (gemäß ISO 7027). Alternativ kann man die Trübung auch mit einer Weißlichtlampe (z.B. Wolframlampe) zwischen 400 und 600 nm messen (EPA 180.1). Dem Fachmann ist die Messung der Trübung aus dem Stand der Technik bekannt, so dass dieser ohne Weiteres eine geeignete Messstrahlung auswählen und einsetzen kann. Man unterscheidet zwei Messverfahren: Die Schwächung der durchgehenden Lichtstrahlung (sogenanntes Durchlicht) und die Seitwärtsstreuung der Lichtstrahlung (sogenanntes Streulicht). Um gemessene Trübungswerte vergleichen zu können, wurde die Trübungsstandardflüssigkeit Formazin geschaffen, so dass sich alle Trübungseinheiten praktisch auf deren Verdünnung beziehen. Eine gebräuchliche Trübungseinheit ist FAU (Formazine Attenuation Units; Durchlichtmessung; Winkel 0°; gemäß den Vorschriften der Norm ISO 7027). Die Trübung kann durch verschiedene Messgeräte gemessen werden; dies sind Trübungsmessgeräte, insbesondere Trübungssonden. Trübungssonden messen dann beispielweise die Lichtstreuung (Seitwärtsstreuung) oder sind Durchlichtsonden, die die Schwächung der durchgehenden Lichtstrahlung messen. Das Messsignal bzw. die Messeinheit ist hier die Absorption. Die Wellenlänge der Messstrahlung kann dabei variieren. Beispielweise können im Handel erhältliche Trübungssonden zum Einsatz kommen.
Der Begriff „Sonde für die leichte Phase“ oder ähnliche Begriffe, bezeichnet die Sonde, die in die leichte Phase eintaucht und dort die elektrische Leitfähigkeit misst. Diese Sonde wird damit der leichten Phase zugeordnet. Die „Messung der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase“ bedeutet damit die Messung der elektrischen Leitfähigkeit mit der Sonde, die der leichten Phase zugeordnet wird.
Der Begriff „Sonde für die schwere Phase“ oder ähnliche Begriffe, bezeichnen die Sonde, die in die schwere Phase eintaucht und dort die elektrische Leitfähigkeit misst. Diese Sonde wird damit der schweren Phase zugeordnet. Die „Messung der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase“ be- deutet damit die Messung der elektrischen Leitfähigkeit mit der Sonde, die der schweren Phase zugeordnet wird.
Der Ausdruck, dass eine Sonde „an einer geeigneten Position“ in der Trennvorrichtung eingesetzt wird, bedeutet, dass die Sonde für die schwere Phase auch in diese eintaucht und die Sonde für die leichte Phase in diese eintaucht, so dass die jeweilige Sonde die elektrische Leitfähigkeit der zugeordneten Phase messen kann. Die Sonde misst die elektrische Leitfähigkeit an der vordefinierten Stelle, wo diese in der Phase platziert wurde.
Unter „Regelung und/oder Steuerung“ eines Parameters wird die Kontrolle und Korrektur und/oder Regulierung des Parameters verstanden.
Das „Entmischen lassen“ bedeutet, dass sich die wässrigen Phasen des Zwei-Phasen-Systems von selbst trennen. Hierzu ist die Schwerkraft ausreichend.
Der Ausdruck „Phasengrenzfläche(n)“ bedeutet, dass entweder keine Zwischenphase vorhanden ist, dann liegen nur die leichte und die schwere Phase in der Trennvorrichtung vor und zwischen diesen befindet sich eine Phasengrenzfläche. Oder aber es ist eine Zwischenphase vorhanden, dann gibt es eine Phasengrenzfläche zwischen der Zwischenphase und der leichten Phase und eine Phasengrenzfläche zwischen der Zwischenphase und der schweren Phase. Der Ausdruck „Phasengrenzfläche(n)“ umfasst daher beide Varianten.
Der Begriff „kontinuierlich“ bedeutet, dass ein oder mehrere Materialflüsse in die Trennvorrichtung hinein und ein oder mehrere Materialflüsse aus der Trennvorrichtung herausströmen. Dabei ist in der Regel die Summe der einströmenden Materialflüsse gleich der Summe der ausströmenden Materialflüsse. Wenn ein Verfahren oder ein Verfahrensschritt kontinuierlich durchgeführt wird, so erfolgt die- ses/dieser ohne Unterbrechung.
Der Begriff „diskontinuierlich“ bedeutet, dass nicht kontinuierlich gearbeitet wird. Es kann beispielsweise eine durch das Fassungsvermögen der Trennvorrichtung begrenzte Menge (eine Charge oder ein Ansatz) zugeführt und das Produkt nach Abschluss des Verfahrens auf einmal entnommen werden. Beispielweise können auch einzelne Produkte zunächst hergestellt (Batch), dann gelagert und später weiterverarbeitet werden.
Der Begriff „semi-kontinuierlich“ bedeutet, dass kontinuierliche und diskontinuierliche Vorgänge vorliegen. Wenn ein Verfahren semi-kontinuierlich ist, so wird das Verfahren nur teilweise kontinuierlich durchgeführt. Dies bedeutet, dass das kontinuierliche Verfahren unterbrochen wird. Diese Verfahrensweise kann dann auch als diskontinuierlich aufgefasst werden. Wenn ein Verfahrensschritt semikontinuierlich erfolgt, so umfasst dieser Schritt kontinuierliche und nichtkontinuierliche Teilschritte. Unter “Polymer(e)” werden hier derartige polymere Verbindungen verstanden, die ein wässriges Zwei- Phasen-System ausbilden können und/oder in einem wässrigen Zwei-Phasen-System zum Einsatz kommen können, aber das Zielprodukt möglichst nicht nachteilig beeinflussen.
Unter dem Begriff “Salz(e)“ versteht man solche Salze, die ein wässriges Zwei-Phasen-System zusammen mit einem Polymer(Polymeren) ausbilden können und/oder in einem wässrigen Zwei- Phasen-System zum Einsatz kommen können, aber das Zielprodukt möglichst nicht nachteilig beeinflussen. Dies sind beispielweise anorganische oder organische Salze, insbesondere Puffersalze.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Das Verfahren der Erfindung mit seinen unterschiedlichen Ausführungsformen soll nachfolgend im Einzelnen erläutert werden.
Generell kann das Verfahren der Erfindung kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Wenn das Verfahren kontinuierlich durchgeführt wird, wird jeder Schritt kontinuierlich durchgeführt und schließt sich unmittelbar (kontinuierlich) an den nächsten Schritt an.
Es können auch nur einzelne Verfahrensschritte kontinuierlich durchgeführt werden.
Das Verfahren kann auch diskontinuierlich durchgeführt werden. Das Verfahren kann insgesamt diskontinuierlich sein, beispielweise bei einer chargenweisen Durchführung oder ein oder mehrere Schritte des Verfahrens können diskontinuierlich erfolgen.
Im Verfahren der Erfindung können auch kontinuierlich und diskontinuierlich (nicht kontinuierlich) durchgeführte Schritte kombiniert werden.
Ein Verfahrensschritt kann kontinuierliche und diskontinuierliche Teilschritte umfassen.
Gemäß einer Ausführungsform werden die Schritte a) bis g) oder die Schritte b) bis g) oder die Schritte c) bis g) oder die Schritte d) bis g) kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt.
Gemäß einerweiteren Ausführungsform werden die Schritte a) bis f) oder die Schritte b) bis f) oder die Schritte c) bis f) oder die Schritte d) bis f) kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt.
Der Begriff „im kontinuierlichen Betrieb“ wie dieser hier verwendet wird, bedeutet, dass zumindest die Schritte d., e. und f., die in der Trennvorrichtung durchgeführt werden, jeweils kontinuierlich erfolgen und auch zwischen diesen Schritten keine Unterbrechung erfolgt, d.h. das Teilverfahren d. bis f. insgesamt kontinuierlich durchgeführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes ist für jede Art von Protein, insbesondere Immunglobuline, oder für jede Art von Nukleinsäure, wie beispielweise Plasmid-DNA, genomische DNA, RNA, oder jede Art von Viren, wie beispielsweise Adenoviren, A- deno-assoziierte Viren und Retro- und Lentiviren, oder auch andere hier nicht genannte Viren geeignet.
In Schritt a. des Verfahrens der Erfindung wird zunächst eine Ausgangslösung, die das Zielprodukt enthält, bereitgestellt. Dies kann jede Art von Ausgangslösung darstellen, sofern diese in ein wässriges Zwei-Phasen-System überführt werden kann.
Der Begriff „Ausgangslösung“ ist in diesem Zusammenhang möglichst breit zu verstehen und umfasst nicht nur echte Lösungen, sondern jede Art eines homogenen oder auch heterogenen Gemischs, mit dem eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung durchgeführt werden kann. Dispersionen sollen hierbei mitumfasst sein. Die Ausgangslösung stellt daher eine Flüssigkeits-haltige Mischung der zu trennenden Komponenten dar, die im wässrigen Zwei-Phasen-System in Wasser gelöst oder dispergiert vorliegen. Die Ausgangslösung kann daher eine echte Lösung oder auch eine Dispersion sein und kann auch feste Bestandteile, wie z.B. Zellen, Zellfragmente oder Präzipitate im Lösungsmittel dispergiert, aufweisen.
Die Ausgangslösung kann eine Zellkultur, ein Zellüberstand oder auch ein Zelllysat darstellen, worin das Zielprodukt (beispielsweise Antikörper, Viren, mRNA) enthalten ist. In einer Ausführungsform ist die Ausgangslösung ein Zelllysat, welches durch alkalische Lyse der Zellen hergestellt wird und Plas- mid-DNA enthält. Dabei können die Zellen prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, insbesondere Pilze, Hefen, Bakterien, wie E. coli.
Die Ausgangslösung wird in Schritt b. in ein wässriges Zwei-Phasen-System (ATPS) überführt, d.h. es wird mit der Ausgangslösung ein wässriges Zwei-Phasen-System hergestellt.
Die Herstellung des wässrigen Zwei-Phasen-Systems kann kontinuierlich, diskontinuierlich oder semikontinuierlich durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Zwei-Phasen-System kontinuierlich hergestellt werden. Es kann auch eine Charge des Zwei-Phasen-Systems hergestellt und diese dann weiterverarbeitet werden.
Zur Herstellung eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems werden mindestens ein Polymer und mindestens ein Salz in geeigneter Konzentration zur Ausgangslösung zugegeben oder es werden mindestens zwei Polymere in geeigneter Konzentration zur Ausgangslösung zugegeben. Der Begriff „in geeigneter Konzentration“ bedeutet, dass eine derartige Konzentration eingesetzt wird, dass ein wässriges Zwei-Phasen-System gebildet wird. Diese Konzentration hängt von den verwendeten Ausgangsmaterialien ab und ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt oder ist durch wenige orientierende Versuche feststellbar. Das wässrige Zwei-Phasen-System ist erfindungsgemäß nicht besonders beschränkt, sofern eine Kombination aus Polymer(en)/Polymer(en) oder Polymer(en)/Salz(en) eingesetzt wird. Selbstverständlich wird als Lösungsmittel Wasser verwendet. D.h. das Lösungsmittel in allen Phasen ist Wasser; ein organisches Lösungsmittel liegt nicht vor.
Als Kombination Polymer(e)/Polymer(e) kommen beispielweise Polyethylenglykole (PEG) mit unterschiedlichem Molekulargewicht und Dextran zum Einsatz. Dextrane können mit unterschiedlichen Molekulargewichten in wässriger Lösung gelöst eingesetzt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Kombination Polymer(e)/Polymer(e) beispielsweise ausgewählt aus Polyethylenglykol (PEG)ZPolyethylenglykol (PEG), wie PEG 400/PEG 8000, PEG400/PEG2000, Polyethylenglykol (PEG)ZDextran. Weitere phasenbildende Polymere, wie Polyethylenglykole (PEG) sind Polypropylenglykole (PPG), Dextrane, PEG-PPG-PEG-Copolymer (EO- PO) und dergleichen. Die phasenbildenden Polymere können mit verschiedenen Molekulargewichten eingesetzt werden.
Als Kombination Polymer(e)/Salz(e) werden beispielweise Polyethylenglykole (PEG) mit unterschiedlichem Molekulargewicht und verschiedene Salze, wie Phosphatsalze, Ammoniumsalze, Kaliumsalze, Acetatsalze, Natriumsalze oder Citratsalze verwendet, beispielsweise Ammoniumsulphat, Kaliumcitrat, Natriumcitrat, Kaliumacetat, Natriumacetat, Ammoniumacetat, Kaliumphosphat. Dabei können auch mehrere Salze (Kombinationen) gleichzeitig verwendet werden. Es können auch andere im Stand der Technik bekannten Salze verwendet werden, die ein wässriges Zwei-Phasen-System zusammen mit einem Polymer(Polymeren) ausbilden können.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Kombination Polymer(e)/Salz(e) ausgewählt aus Polyethylenglykol(en) (PEG)ZPhosphatsalz(en) und gegebenenfalls weiteren Salzen. In der vorliegenden Erfindung wird ein wässriges Zwei-Phasen-System, umfassend mindestens ein Polymer und mindestens ein Phosphatsalz, auch als „Zwei-Phasen-Phosphatsystem“ bezeichnet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Kombination Polymer(e)/Salz(e) ausgewählt aus Polyethylenglykol(en) (PEG)ZCitratsalz(en) und gegebenenfalls weiteren Salzen. In der vorliegenden Erfindung wird ein wässriges Zwei-Phasen-System, umfassend mindestens ein Polymer und mindestens ein Citratsalz, auch als „Zwei-Phasen-Citratsystem“ bezeichnet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Kombination Polymer(e)/Salz(e) ausgewählt aus Polyethylenglykol(en) (PEG)ZAmmoniumsalz(en) und gegebenenfalls weiteren Salzen. In der vorliegenden Erfindung wird ein wässriges Zwei-Phasen-System, umfassend mindestens ein Polymer und mindestens ein Ammoniumsalz, auch als „Zwei-Phasen-Ammoniumsystem“ bezeichnet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung können für die Kombination Polymer(e)/Salz(e) auch andere phasenbildende Polymere verwendet werden, beispielsweise ausgewählt aus Polyethylengly- kole (PEG), Polypropylenglykole (PPG), PEG-PPG-PEG-Copolymer (EOPO) und dergleichen. Die phasenbildenden Polymere können mit verschiedenen Molekulargewichten eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird für das wässrige Zwei-Phasen-System als Polymer Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 8000 g/Mol eingesetzt. In einer Ausführungsform wird als Polymer Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 6000 g/Mol oder zwischen 200 und 4000 g/Mol eingesetzt. Andere als die spezifisch offenbarten Molekulargewichte für Polyethylenglykol können ebenfalls zum Einsatz kommen.
Das oder die Polymere, wie Polyethylenglykol, können beispielweise in einer Konzentration von 5 bis 35 Gewichts-%, bezogen auf die Gesamtmenge an wässrigem Zwei-Phasen-System, verwendet werden.
Die eingesetzten Phosphatsalze sind beispielweise Natrium- und Kaliumphosphate und Alkalihydrogenphosphate, wie Natriummono- oder -dihydrogenphosphat oder Kaliummono- oder - dihydrogenphosphat, und viele andere mehr. Andere verwendbare Salze sind dem Fachmann bekannt. Es können gleichzeitig ein oder mehrere Phosphatsalze vorhanden sein.
Die verwendeten Citratsalze sind beispielweise Natrium- und Kaliumcitrate und viele andere. Es kann auch Zitronensäure zum Einsatz kommen. Es können gleichzeitig ein oder mehrere Citratsalze vorliegen.
Die verwendeten Ammoniumsalze sind beispielweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und viele andere. Es können gleichzeitig ein oder mehrere Ammoniumsalze vorliegen.
Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, wenn in der Polymer/Salz-Kombination weitere Salze vorhanden sind, wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Acetate, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris). Es kann auch Essigsäuresäure zum Einsatz kommen.
In das Zwei-Phasen-System können auch Biomolekül-stabilisierende Komponenten, wie Amminosäu- ren (z.B. L-Arginin), oder Zucker (z.B. Sorbitol) oder Additive, wie Polysorbate zugegeben werden, um das Zielmolekül bei hohen Polymer- oder Salzkonzentrationen vor Ausfällung bzw. Produktverlust zu schützen.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn mit der Ausgangslösung ein Zwei-Phasen-System hergestellt wird, bei dem ein Phasenverhältnis von der Phase, enthaltend das Zielprodukt, zur Gegenphase von > 1 ,1 eingesetzt wird. Beispielsweise ist ein Verhältnis (Volumen/Volumen) von Phase zu Gegenphase = 1 ,11 oder größer (für die Phase) zu 1 ,0 (für die Gegenphase) vorteilhaft. Das Phasenverhältnis kann ein Volumenverhältnis (Volumen/Volumen) oder Massenverhältnis (Gew./Gew.) sein. Die Abtrennung des Proteins, der Nukleinsäure oder des Virus kann dadurch verbessert werden. Gemäß einerweiteren Ausführungsform beträgt das Dichteverhältnis von leichter und schwerer Phase im eingesetzten Zwei-Phasen-System mindestens 1 ,06. Demnach liegt das Verhältnis der Dichte der schweren Phasen zur Dichte der leichten Phase bei 1 ,06 oder größer (für die schwere Phase) zu 1 (für die leichte Phase). Dies bedeutet einen Dichteunterschied von mindestens 6% zwischen beiden Phasen, d.h. es kann auch ein sehr geringer Dichteunterschied beider Phasen vorliegen und dennoch kann eine Trennung der Phasen ohne Probleme durchgeführt werden. Ein derartiges Dichteverhältnis ist im Hinblick auf eine kurze Verfahrenszeit vorteilhaft.
Da die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion (ATPE) zur Trennung von Zielprodukt und Verunreinigungen zwei nicht mischbare Phasen erfordert, wobei eine der Phasen das Zielprodukt anreichert, insbesondere dieses im Wesentlichen enthält, und die Gegenphase die Verunreinigungen anreichert, insbesondere diese im Wesentlichen enthält, ist es zweckmäßig je nach Zielprodukt und enthaltenen Verunreinigungen ein entsprechendes wässriges Zwei-Phasen-System auszuwählen. Dies kann der Fachmann entsprechend dem Stand der Technik und seines Fachwissens anhand weniger orientierender Versuche tun.
Nach dem Überführen der Ausgangslösung in ein wässriges Zwei-Phasen-System (ATPS) in Schritt b. erfolgt in Schritt c. das Durchmischen des erhaltenen wässrigen Zwei-Phasen-Systems. Das Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems wird unter Erhalt eines Stoffaustauschs durchgeführt, bei dem sich das Zielprodukt in der leichten oder der schweren Phase anreichert, sich insbesondere im Wesentlichen nur noch in einer der Phasen befindet. Der Ausdruck, dass sich das Zielprodukt „in der leichten oder schweren Phase anreichert“, bedeutet, dass etwa 50 % oder mehr oder etwa 60% oder mehr oder etwa 70% oder mehr oder etwa 80% oder mehr oder etwa 85% oder mehr oder etwa 90% oder mehr oder etwa 95% oder mehr oder etwa 98% oder mehr an Zielprodukt in einer Phase vorliegen. Bei instabilen oder leicht ausfallenden Produkten können aber auch bereits etwa 40 % oder mehr oder etwa 45% oder mehr an Zielprodukt ausreichend sein, wenn sich dieses in einer Phase anreichert. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn es sich um teure oder sehr wertvolle Zielprodukte handelt.
Das Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems in Schritt c. wird unter Erhalt eines Stoffaustauschs, insbesondere eines ausreichenden Stoffaustauschs, durchgeführt. Ein Stoffaustausch ist dann nicht ausreichend, wenn sich das Zielprodukt nicht, wie bereits definiert, in der leichten oder schweren Phase anreichert. Ein geeigneter bzw. ausreichender Stoffaustausch kann beispielweise durch Vorversuche oder anhand von Analysen der Konzentration des Zielproduktes in den einzelnen Phasen nach dem Durchmischen bestimmt werden.
Der Stoffaustausch ergibt sich daher durch die unterschiedliche Verteilung in den Phasen. Es gibt verschiedene Möglichkeiten für den Fachmann, um festzustellen, dass ein Stoffaustausch stattgefunden hat, d.h. dass sich das Zielprodukt in einer der Phasen konzentriert hat. Dies kann der Fachmann beispielweise durch einfache Vorversuche feststellen. Dies sind beispielweise Absetzversuche bei definierten Energieeinträgen in einem Reaktionsgefäß (Batch-Modus). Der Stoffaustausch kann daher insbesondere durch den Energieeintrag beim Durchmischen beeinflusst werden. Dabei werden auch das Phasentrennverhalten des verwendeten wässrigen Zwei-Phasen-Systems und der Gehalt des Zielprodukts in den Phasen bestimmt.
Zur Untersuchung des Phasentrennverhaltens wird z.B. der Energieeintrag beim Durchmischen variiert und die Trennzeit zur Ausbildung der Phasen ermittelt. Das Ende der Phasenausbildung ist dabei in der Regel dann, wenn sich die Höhe der Grenzfläche von leichter Phase/schwerer Phase im Reaktionsgefäß nicht mehr verändert. Um festzustellen, ob die Zielkomponente in die Zielphase teilweise, hauptsächlich oder vollständig übergegangen ist und der verwendete Energieeintrag zu einem Stoffaustausch führt, kann in den ausgebildeten Phasen der Gehalt sowie die Prozessausbeute der Zielkomponente ermittelt werden.
Der Energieeintrag kann beispielweise über eine bestimmte Rührerdrehzahl in dem gewählten Experimentaufbau (definierter Typ Rührer und definiertes Reaktionsgefäß (Höhe/Durchmesser)) ermittelt werden. Ein ermittelter Energieeintrag für den Stoffaustausch der Zielkomponente in einem bestimmten wässrigen Zwei-Phasen-Systemen kann dann beispielweise für unterschiedliche Extraktionsbehälter, Prozessformate (Batch und kontinuierliche Phasentrennung) sowie Rührer-Typen und Aufbauten (aktiver oder stationärer Energieeintrag) entsprechend angepasst werden.
Weitere Einflussfaktoren, wie z.B. Temperatur, Konzentration an Zielprodukt und Nebenprodukten (wie z.B. Wirtszellproteine, Zellzahl), können bei den Vorversuchen bzw. Absetzversuchen zur Optimierung des Energieeintrags für jedes Zwei-Phasen-System herangezogen werden.
Auch besteht die Möglichkeit, dass der Stoffaustausch in Schritt c. unter unterschiedlichen Bedingungen (unter anderen: Temperatur, Verweilzeit, Rührerdrehzahl, Energieeintrag, Aufbau des Mischers beim aktiven Durchmischen, Aufbau eines statischen Mischers, Durchflussrate etc. im statischen Mischer beim statischen Durchmischen) direkt in der Vorrichtung in der das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird, festgestellt und die besten Bedingungen für einen Stoffaustausch gemäß der Erfindung bestimmt werden. Dazu wird das Verfahren beispielsweise unter verschiedenen Bedingungen in Schritt c. durchgeführt und in den abgesetzten und getrennten Phasen der Gehalt der verschiedenen Inhaltsstoffe bestimmt: z.B.: Gehalt des Zielproduktes in der Zielphase und optional in den anderen Phasen.
Dies kann durch unterschiedliche Methoden des Standes der Technik bestimmt werden. Beispielsweise seien unter anderem genannt: Chromatographische Methoden, wie Reversed Phase-HPLC und andere HPLC Methoden (Anionentauscher, Kationentauscher, HIC (Hxdrophobic Interaction Chromatography), Affinitätschromatographie (Protein A und andere Liganden, die das Zielprodukt spezifisch binden können)), nano-HPLC, UHPLC, elektrophoretische Methoden, wie unter anderem SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektophorese), auf Antikörper-Bindung beruhende Methoden, wie ELISA, Western- Blot etc., fluorometrische oder spektroskopische Methoden für Proteine, die entsprechende spektroskopische und fluorometrische Signale liefern, und alle anderen Methoden des Standes der Technik für die Analyse von Zielprodukten, wie Proteine und Nukleinsäuren, insbesondere die quantitative Analyse.
Der Gehalt an Nukleinsäuren, insbesondere Plasmid-DNA (pDNA) in der Zielphase kann unter anderem durch Kationentauscher-HPLC, -nano-HPLC und -UHPLC-Methoden, spektroskopisch mittels chromogenen Assays, Agarosegelelektrophorese, Kapillarelektrophorese und dergleichen bestimmt werden.
Auch besteht die Möglichkeit, den Gehalt an nicht in der Zielphase erwünschten Verunreinigungen sowohl in der Zielphase als auch der bzw. den anderen Phasen durch Methoden des Standes der Technik zu bestimmten. Zum Beispiel können Host Cell-Proteine durch SDS-Page oder ELISA und DNA und RNA durch die in der Pharmaindustrie üblichen und anerkannten Methoden bestimmt werden. Ebenso gibt es für die Bestimmung des Gehaltes weiterer Verunreinigungen in den verschiedenen Phasen, die man teilweise mittels ATPE abtrennen will diverse Methoden des Standes der Technik: Chromogene Tests und LAL (Limulus Amebocyten Lysat - Test) für Endotoxine, Kationentau- scher-HPLC für die Bestimmung der unterschiedlichen pDNA Isoformen in den einzelnen Phasen, quantitative Bestimmungsmethoden für host-DNA, RNA, Host Cell Proteine, Lipide, Endotoxine, Viren- und Virenbestandteile etc.
Um einen Stoffaustausch feststellen zu können, vergleicht man den Gehalt des Zielproduktes und / oder der unerwünschten Verunreinigungen in der Ausgangslösung von Schritt a. des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Gehalt des Zielproduktes und / oder der unerwünschten Verunreinigungen in den einzelnen entmischten Phasen in Schritt d. Dabei wird dann eine Anreichung oder Abreicherung des Zielprodukts bzw. der unerwünschten Verunreinigungen in den jeweiligen Phasen festgestellt. Der Gehalt ist der Anteil, die Menge oder Konzentration des Zielprodukts oder der Verunreinigungen in den jeweiligen Phasen. Eine Veränderung des Gehalts des Zielprodukts und/oder der Verunreinigungen durch Vergleich der Ausgangslösung von Schritt a. mit einer, zwei oder allen entmischten Phasen in Schritt d. zeigt daher einen Stoffaustausch an.
Ein Stoffaustausch kann durch aktives und/oder statisches Durchmischen erfolgen. Beim aktiven Durchmischen wird das wässrige Zwei-Phasen-System (ATPS) mittels beweglicher Teile, beispielsweise eines aktiven Rührwerks, durchmischt. Aktive Rührwerke sind beispielsweise rotierende Rührer oder Rührer mit anderer Wirkungsbewegung. Das statische Durchmischen erfolgt ohne Zuhilfenahme von beweglichen Teilen, beispielsweise in einem statischen Mischer. Bekannte statische Mischertypen sind beispielweise Kenics-Mischer, die aus um 180° verdrillten Blechen mit jeder Wendel um 90° versetzt, bestehen; oder Sulzer SMV-Mischer, aufgebaut aus geriffelten Lamellen, die die Ströme so leiten, dass sie sich kreuzen. Ein Stoffaustausch, insbesondere ein ausreichender Stoffaustausch beim Durchmischen kann beispielweise durch den Energieeintrag bzw. Leistungseintrag beim Durchmischen und/oder auch die Dauer bzw. Verweilzeit, über die gemischt wird, erreicht werden. Dies hängt vom jeweiligen Einzelfall ab. In Versuchen mit Zellkulturen wurde festgestellt, dass die Enttrübung der leichten Phase vermieden werden konnte, wenn beim Durchmischen ein Leistungseintrag von mehr als 30 kW/m3 und eine Verweilzeit von mehr als 5 Minuten eingesetzt wurden. Diese beispielhaft angeführten Werte könnten für den Fachmann als Orientierungshilfe dienen. Der Fachmann kann ein geeignetes Vorgehen anhand weniger orientierender Versuche bestimmen, wobei jedes Stoffsystem zu anderen Werten führt.
Ein Durchmischen der Phasen ist in jedem Fall erforderlich, um die Umverteilung des Zielprodukts in die gewünschte Phase zu erreichen. Ein Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems, wodurch ein Stoffaustausch erfolgt, ist sinnvoll, um eine möglichst hohe Ausbeute des Zielprodukts zu erhalten. Eine Durchmischung kann man beispielweise daran erkennen, dass die produktenthaltende Phase kontinuierlich ist, d.h. keine Tropfen bildet, und die Gegenphase dispers ist, d.h. Tropfen ausbildet. Eine unzureichende Durchmischung kann zu einer falschen Phasenzusammensetzung oder einer Verunreinigung der Zielphase mit der Gegenphase führen, wodurch eine verminderte Produktreinheit resultiert oder eine Abtrennung des Zielprodukts nicht mehr möglich ist. Ein Beispiel für eine unzureichende Durchmischung mit falscher Phasenzusammensetzung wird bei den Ausführungsbeispielen erläutert.
In Schritt d. folgt das Entmischen lassen der Phasen in einer Trennvorrichtung in eine leichte Phase, eine schwere Phase und gegebenenfalls eine Zwischenphase. Dies kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen.
Die Trennvorrichtung kann dabei jede dem Fachmann bekannte Art von Trennvorrichtung darstellen, die zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung geeignet ist, wie beispielweise ein Abscheider oder Mischer- Abscheider.
Beim kontinuierlichen Verfahren wird dies so durchgeführt, dass das Zu- und Abführen der Flüssigkeit so erfolgt, dass eine Trennung in die einzelnen Phasen und deren getrennte Entnahme kontinuierlich stattfindet. Bei einem diskontinuierlichen Verfahren wird eine Charge in die Trennvorrichtung gegeben, das Entmischen lassen der Phasen abgewartet und dann eine Abtrennung der Phasen mittels getrennter Entnahme aus der Trennvorrichtung durchgeführt. Das Entmischen lassen der Phasen kann bei einem diskontinuierlichen Verfahren auch direkt in der Vorrichtung, in der die Durchmischung des wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) erfolgt, durchgeführt werden. Dabei wird nach Beendigung des Durchmischens das Entmischen der Phasen abgewartet. Die Vorrichtung, in der die Durchmischung des wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) erfolgt, kann somit auch anschließend als Trennvorrichtung verwendet werden. Es kann auch zwischen diskontinuierlicher und kontinuierlicher Arbeitsweise gewechselt werden.
Die obere Phase im wässrigen Zwei-Phasen-System ist die leichte Phase und die untere Phase ist die schwere Phase. Das Zielprodukt kann sich in der leichtender der schweren Phase befinden; dies hängt von den Eigenschaften des jeweiligen Zielprodukts und dem gewählten wässrigen Zwei- Phasen-System ab. Gemäß einer Ausführungsform kann das Entmischen lassen auch semi-kontinuierlich durchgeführt werden. Dies bedeutet, dass das kontinuierliche Verfahren kurzzeitig unterbrochen und das Entmischen lassen in Schritt d. nicht kontinuierlich durchgeführt wird, sondern zunächst abgewartet wird. Dies kann zu einer besseren Ausbildung der Phasengrenzfläche(n) führen und daher die spätere Trennung der Phasen erleichtern.
Bei Bereitstellung der Ausgangslösung in Schritt a. kann es ebenfalls vorteilhaft sein, wenn hier semikontinuierlich gearbeitet wird, d.h. eine Unterbrechung des ansonsten kontinuierlichen Verfahrens erfolgt. Wenn beispielweise Plasmid-DNA als Zielprodukt gereinigt und angereichert werden soll, wird das Zelllysat als Ausgangslösung über eine alkalische Lyse und anschließende Neutralisation, beispielsweise mit Citratsalz, hergestellt. Der für die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion (ATPE) notwendige Salzpuffer (wie Citrat) ist damit bereits vorhanden und das Zwei-Phasen-System kann unmittelbar hergestellt und eingesetzt werden. Um jedoch eine genaue Steuerung der Lyse vorzunehmen, kann es zweckmäßig sein, wenn dies nicht kontinuierlich durchgeführt wird, sondern vielmehr eine geeignete Dauer der Lyse eingehalten und erst anschließend die kontinuierliche Verfahrensweise wieder aufgenommen wird. Die im Anschluss notwendige Neutralisation erfolgt mit dem für die wässrige Zwei- Phasen-Extraktion (ATPE) ebenfalls notwendigen Salzpuffer (in diesem Beispiel: Citrat). Vorteilhaft ist, dass damit die für die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion (APTE) notwenige Salzmenge bereits im Ly- seschritt vollständig zugegeben werden kann.
Es kann jedoch auch vorteilhaft sein, wenn für das Reinigen und Anreichern, insbesondere Aufkonzentrieren von Plasmid-DNA die alkalische Lyse, die Neutralisation, das Überführen in ein wässriges Zwei-Phasen-System, das Entmischen lassen und die getrennte Entnahme der Phasen kontinuierlich durchgeführt werden.
Beispielsweise kann auch wie folgt vorgegangen werden: Die alkalische Lyse erfolgt kontinuierlich oder diskontinuierlich und das Überführen in ein wässriges Zwei-Phasen-System erfolgt kontinuierlich oder diskontinuierlich bzw. chargenweise, beispielsweise auch jeweils mit wechselnden Zyklen. So könnten beispielsweise 2 Trennvorrichtungen wechselweise mit kontinuierlichem und diskontinuierlichem Betrieb zum Einsatz kommen oder 2 T rennvorrichtungen könnten hintereinander geschaltet zum Einsatz kommen.
In Schritt e. wird ein kontinuierliches Messen der elektrischen Leitfähigkeit in der Trennvorrichtung durchgeführt. Dies kann zur Kontrolle des Verlaufs des Entmischen lassens der Phasen dienen. Die elektrische Leitfähigkeit wird jedoch insbesondere zum Bestimmen der Position der beiden Phasen und der Phasengrenzfläche oder, bei Vorliegen einer Zwischenphase, der Position der Zwischenphase und der zwei Phasengrenzflächen herangezogen.
Wenn als Ausgangslösung eine Zellsuspension oder ein Zelllysat eingesetzt wird, d.h. eine Dispersion aus Biopartikeln, umfassend das Zielprodukt, sowie Zellen, Zellenbruchstücke und Medium, ist es häufig der Fall, dass eine Mischphase gebildet wird, die aus Biopartikeln aufgebaut ist, die jedoch üblicherweise das Zielprodukt nicht mehr enthält. Diese Mischphase wird hier auch als „Zwischenphase“ bezeichnet, d.h. eine Phase die zwischen den beiden zu trennenden Phasen vorliegt. Die Zwischenphase kann beispielweise eine Mischung aus einem Anteil der schweren Phase in Form nicht- koaleszierter Tropfen und dazwischen gebundenen Zellen darstellen. Die Bildung und Größe der Zwischenphase ist im Wesentlichen von den Zellen abhängig. Die Zwischenphase kann auch aus Präzipitat bestehen, welches beispielsweise bei der Gewinnung von Plasmid-DNA durch die alkalischen Lyse von Zellen bei der Neutralisation entsteht. Dieses Präzipitat enthält beispielweise ausgefälltes Kalium- dodecylsulfat (K-SDS), Proteine, Zellbestandteile, genomische DNA, RNA und dergleichen.
Es liegt auf der Hand, dass die Phasentrennung durch die Bildung einer Zwischenphase erschwert wird. Die Zwischenphase könnte sich während einer kontinuierlichen Phasentrennung in der Trennvorrichtung ohne eine Füllstandsregelung völlig unkontrolliert bis zu einem vorhandenen unteren und/oder oberen Vorrichtungsauslass ausbreiten. Ohne Überwachung oder Detektionsmöglichkeit kann die Entnahme der Phasen daher nicht kontrolliert und gesteuert werden.
Als zu messender Stoffparameter für eine zuverlässige Phasendetektion wurde für die vorliegende Erfindung die elektrische Leitfähigkeit gewählt, da festgestellt wurde, dass die Unterschiede dieser in den beiden Phasen eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) groß genug sind, um erfasst werden zu können. Beispielweise hat im Polymer/Salz-System das Polymer bzw. die Polymer-Phase eine geringe elektrische Leitfähigkeit und das Salz bzw. die salzreiche Phase hat eine hohe elektrische Leitfähigkeit. Da in einem Polymer/Salz-ATPS nur zwei Phasen bei ausreichend hoher Konzentrationen an Polymer oder Salz entstehen (> Binodale), liegt immer ein ausreichender Unterschied der elektrischen Leitfähigkeiten von leichter und schwerer Phase vor. In ähnlicher Weise können auch entsprechend geeignete Polymer/Polymer-Systeme zum Einsatz kommen.
Da bislang keine Messtechnik existiert, die die Anforderungen an die Detektion einer Phasengrenzfläche oder Zwischenphase eines wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) erfüllt, musste zunächst ein Konzept entwickelt werden, um die elektrische Leitfähigkeit in geeigneter Weise zu bestimmen.
Daher wurde basierend auf Stoffeigenschaftsmessungen ein Leitfähigkeit-basiertes Messprinzip entwickelt, das experimentell an idealen und realen Gemischen erprobt wurde, wobei das Zielprodukt entweder in der oberen oder der unteren Phase vorliegen kann. Wie sich herausgestellt hat, ist das Messprinzip geeignet, auf Basis der Messung der elektrischen Leitfähigkeit die Lage der einzelnen Phasen bzw. Phasengrenzfläche(n) zu bestimmen, und unabhängig von der Verteilung des Zielprodukts und den Verunreinigungen, da die Leitfähigkeitsdifferenz der zu trennenden Phasen größtenteils nicht vom Zielprodukt und den Verunreinigungen beeinflusst werden.
Eine erfindungsgemäße kontrollierte Phasentrennung, egal ob mit oder ohne Zwischenphase, unter Verwendung der kontinuierlich gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte, erhöht die Ausbeute des Verfahrens sowie die schließlich erhaltene Produkt-Reinheit und -Qualität. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen in der Trennvorrichtung mit einem oder mehreren Leitfähigkeitsmessgeräten in Form von einer, zwei, drei oder mehr Sonden durchgeführt. D.h. je nach Ausführungsform können ein, zwei oder auch mehrere Sonden gleichzeitig in der Trennvorrichtung zum Einsatz kommen. Leitfähigkeitssonden sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Eine Sonde misst am unteren Ende in üblicher Weise mittels Messkontakten die elektrische Leitfähigkeit. Beispielhafte Leitfähigkeitssonden sind 4-polige Leitfähigkeitssonden mit 4 Metallkontakten. Andere Leitfähigkeitssonden sind ebenfalls möglich.
Die Sonde(n) wird (werden) beispielsweise mithilfe von Einbauten in die Trennvorrichtung eingebaut oder eingelassen und an eine zentrale Messwerterfassungs- und Steuerungselektronik angeschlossen.
Bereits eine Sonde kann ausreichen, um die elektrische Leitfähigkeit in der Trennvorrichtung zu messen. Wenn eine chargenweise Extraktion (Batch-Extraktion) durchgeführt wird, kann beispielweise nur eine Leitfähigkeitssonde eingesetzt werden. Diese ist zum Beispiel im Auslass der Trennvorrichtung angeordnet. Der Auslass ist eine Öffnung im unteren Teil der Trennvorrichtung und kann mit einer Entnahme-Vorrichtung zum kontrollierten Auslassen verbunden sein oder diese aufweisen, beispielweise ausgewählt aus einem Ventil, einem Durchflussregler, einer Schlauchquetschklemme, einem Schlauch, einem Rohr oder einem Stutzen und dergleichen oder kann auch eine beliebige andere Ausgestaltung haben. Die Leitfähigkeitssonde, die beispielweise im unteren Bereich der Trennvorrichtung, wie in Bodennähe, im Auslass, insbesondere in einem mit dem Auslass verbundenen Schlauch, Rohr, Stutzen oder dergleichen, aber vor einem Ventil oder einer Schlauchquetschklemme oder ähnlichem der Trennvorrichtung montiert ist, detektiert dann die austretende Phase anhand ihrer jeweiligen elektrischen Leitfähigkeit während der Entleerung der Trennvorrichtung, so dass die Phasen in einfacher Weise voneinander getrennt werden und in getrennten Auffangbehältern gesammelt werden können.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden zur kontinuierlichen Messung der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase eine oder mehrere Sonden und zur kontinuierlichen Messung der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase eine oder mehrere Sonden an verschiedenen Positionen in der Trennvorrichtung eingesetzt. Es kann vorteilhaft sein, wenn mehr als eine Sonde zum Einsatz kommt, da hierdurch die Detektion der Lage der Phasen und Grenzflächen und deren Regelung exakter erfolgen kann und damit verbessert wird. Beispielweise kann eine Sonde kontinuierlich die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase und eine Sonde kontinuierlich die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase messen.
Wenn zwei Sonden zum Einsatz kommen und eine kontinuierliche Extraktion durchgeführt wird, ist es vorteilhaft, die Position der beiden Sonden in geeigneter Weise zu wählen. In der Trennvorrichtung kann jeweils ein Auslass für die schwere Phase im unteren Teil der Trennvorrichtung (unterer Auslass) und ein Auslass für die leichte Phase im oberen Teil der Trennvorrichtung (oberer Auslass) vorgesehen sein. Jede der beiden Sonden kann dann beispielweise jeweils einem Auslass zugeordnet werden. Mit der der jeweiligen Phase zugeordneten Sonde kann dann detektiert werden, ob sich an der Sonde und damit in der Nähe des jeweiligen Auslasses noch die entsprechende Phase befindet, oder ob die Phasengrenzfläche schon soweit aufgestiegen bzw. abgesunken ist, so dass sich die Gegenphase an der Sonde und damit in der Nähe des Auslasses befindet, durch den diese nicht abfließen soll.
Die Sondenpositionen werden dann beispielweise derart gewählt, dass - unabhängig von der Verteilung des Zielproduktes in der oberen oder unteren Phase - die Sonde für die leichte Phase (obere Phase) tiefer als der obere Auslass positioniert wird. Damit kann man ein zu hohes Ansteigen der schweren Phase (untere Phase) mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese über den oberen Auslass abgezogen wird. Die Sonde für die schwere Phase (untere Phase) wird zweckmäßigerweise höher als der untere Auslass angeordnet. Damit kann man ein zu starkes Absinken der leichten Phase (oberen Phase) mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese über den unteren Ablauf abgelassen wird.
Gemäß einer Ausführungsform ist es daher vorteilhaft, wenn die Sonde für die leichte Phase in der Trennvorrichtung tiefer als der obere Auslass positioniert wird und die Sonde für die schwere Phase in der Trennvorrichtung höher als der untere Auslass angeordnet wird.
Es ist hierbei nicht erforderlich, dass die Sonden in der Nähe des jeweiligen Auslasses positioniert werden, also beispielweise unmittelbar über oder unmittelbar unter dem jeweiligen Auslass, vielmehr spielt die jeweilige Höhe der Sonden in der Trennvorrichtung relativ zu den Auslässen eine Rolle. Da die Flüssigkeitshöhe in der Trennvorrichtung überall gleich hoch ist, bedeutet „unter einem Auslass“, dass die Sonde sich nicht auf demselben Höhenniveau wie der Auslass befindet, sondern unterhalb der Höhe der Ausfließöffnung des Auslasses angeordnet wird. In gleicher Weise bedeutet „über einem Auslass“, dass die Sonde sich nicht auf demselben Höhenniveau wie der Auslass befindet, sondern oberhalb der Höhe der Ausfließöffnung des Auslasses angeordnet wird. Von Bedeutung ist daher beispielweise das Höhenniveau der Flüssigkeit und des betrachteten Auslasses.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Sonde(n) für die leichte Phase höher als die Sonde^) für die schwere Phase angeordnet, was regelmäßig der Fall ist, da sich die leichte Phase stets oberhalb der schweren Phase befindet. Mit anderen Worten ist es vorteilhaft, wenn die Sonde(n) für die leichte Phase unter dem oberen Auslass aber höher als die Sonde(n) für die schwere Phase angeordnet werden.
Vorteilhaft an einer derartigen Positionierung von zwei Sonden in der Trennvorrichtung ist, dass jede der beiden Leitfähigkeitssonden, die die elektrische Leitfähigkeit kontinuierlich messen, durch Veränderung des Leitfähigkeitswerts unmittelbar das Herannahen der anderen Phase bzw. der Zwischenphase anzeigt und daher ein Austreten der anderen oder Zwischenphase am falschen Auslass ver- hindert werden kann. Unabhängig davon, ob sich das Zielprodukt in der leichten oder schweren Phase befindet, kann durch Verhindern des Entnehmens einer Phase und/oder der Zwischenphase am falschen Auslass ein Produktverlust vermieden werden.
Wie bereits erwähnt, können auch mehr als 2 Leitfähigkeitssonden in der Trennvorrichtung vorgesehen werden. Beispielweise können 3, 4, 5, 6, oder mehr Sonden gleichzeitig in der Trennvorrichtung vorhanden sein. Eine höhere Anzahl an Sonden kann für eine genauere Erfassung der Lage der einzelnen Phasen und der Phasengrenzflächen vorteilhaft sein.
Es hat sich herausgestellt, dass bei Verwendung von zwei, drei oder mehr Sonden unterschiedliche Positionen von Vorteil sein können.
Gemäß einer Ausführungsform werden zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen in der Trennvorrichtung zwei, drei, vier oder mehr Sonden jeweils in eine Einführöffnung in der Wand der Trennvorrichtung eingeführt und eingesetzt, wobei die Einführöffnungen eine Anordnung aufweisen, die ausgewählt wird aus: einer axialen Anordnung der Einführöffnungen, wobei die Einführöffnungen auf einer geraden Verbindungslinie angeordnet werden; einer radialen Anordnung der Einführöffnungen, wobei die Einführöffnungen in einem Kreisbogen, angeordnet werden; oder einer radial versetzten Anordnung der Einführöffnungen, wobei die Einführöffnungen in einem Kreisbogen und zusätzlich in eine Vorzugsrichtung verschoben, angeordnet werden.
Die beschriebenen Anordnungen sind von besonderem Vorteil. Insbesondere wenn eine größere Menge an Biomasse vorhanden ist und auch unklar ist, wie groß die Zwischenphase sich ausbildet, sind die beschriebenen Ausführungsformen von Vorteil. Hierdurch gelingt es insbesondere Zwischenräume zwischen den einzelnen Sonden besser abzudecken, beispielweise auch dann, wenn sich die Phasengrenzen während des Verfahrens verschieben. Auch kann man bei mehreren Sonden, insbesondere bei den beschriebenen Anordnungen flexibler agieren. Zudem ermöglicht eine Vielzahl von Sonden, dass das Tauchrohr besser positioniert werden kann, so dass hierdurch die Phasentrennung optimiert werden kann.
Gemäß einer Ausführungsform können daher die Einführöffnungen für die Sonden in der Wand der Trennvorrichtung in einer axialen Anordnung vorliegen, d.h. eine Verbindungslinie zwischen den einzelnen Einführöffnungen würde eine gerade Linie oder Achse ergeben und eine lineare Anordnung würde resultieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die Einführöffnungen für die Sonden in der Wand der Trennvorrichtung auch in einer radialen Anordnung vorliegen. Bei einer radialen Anordnung der Einführöffnungen für die Sonden wären diese in gleichem oder unterschiedlichem Abstand zueinander auf einem gedachten Kreisbogen beispielweise auf dem runden Umfang der Trennvorrichtung verteilt. Eine radiale Anordnung der Einführöffnungen und damit auch der in den Einführöffnungen vorliegenden Sonden ist vorteilhaft, da eine derartige Verteilung eine besonders vorteilhafte Erfassung und Kontrolle der einzelnen Phasen ermöglicht und damit eine schnellere und robustere Detektion, Regelung und Kontrolle des Verfahrens erfolgen kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die Einführöffnungen für die Sonden und damit natürlich auch die in den Einführöffnungen vorliegenden Sonden in der Wand der Trennvorrichtung auch in einer radial versetzten Anordnung vorliegen. Dies bedeutet, dass sich die Einführöffnungen und die Sonden in gleichem oder unterschiedlichem Abstand zueinander auf einem Kreisbogen verteilt befinden und zudem in eine Vorzugsrichtung, beispielweise der Längsachse der Trennvorrichtung in gleichem oder unterschiedlichem Maße verschoben sind. Eine radial versetze Anordnung der Sonden führt ebenfalls zu einer verbesserten Detektion der Phasen und schnelleren und robusteren Verfahrensregelung und -kontrolle.
Es können auch gemischte Anordnungen eingesetzt werden, wobei eine oder mehrere Einführöffnungen für die Sonden und damit auch die Sonden teilweise radial und teilweise axial angeordnet werden. Andere Anordnungen für die Einführöffnungen der Sonden als die oben beschriebenen sind ebenfalls möglich.
Die Zahl und Anordnung oder Position der Sonden in der Trennvorrichtung ist in jedem Einzellfall auszuwählen und hängt insbesondere vom Zielprodukt und den vorhandenen Verunreinigungen sowie dem verwendeten wässrigen Zwei-Phasen-System ab, und kann zudem davon abhängen, ob sich eine Zwischenphase bildet oder nicht.
Basierend auf der kontinuierlich gemessenen elektrischen Leitfähigkeit kann erfindungsgemäß die Position der beiden Phasen und deren Phasengrenzfläche oder alternativ die Position der beiden Phasen und einer Zwischenphase und deren zwei Phasengrenzflächen bestimmt werden. Um genau zu bestimmen, wo die Phasen in der Trennvorrichtung vorliegen, orientiert man sich beispielweise an sogenannten Sollwerten. Diese sind entweder bereits bekannt oder man kann diese ohne weiteres in Vorversuchen bestimmen.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind beispielhafte elektrische Leitfähigkeiten von leichter Phase, schwerer Phase und Zwischenphase bei einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem und einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem mit und ohne Zellen angegeben:
Tabelle 1 : Beispielhafte elektrische Leitfähigkeiten bei einem wässrigen Zwei-Phasen- Citratsystem und einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem mit und ohne Zellen
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n.a nicht verfügbar, eine Zwischenphase tritt nicht auf, beispielweise wenn die Zielkomponente oder Verunreinigungen (z.B. HCP, Wirtszell-DNA) in großen Mengen ausfallen. Das Ausfallen der Komponenten aus der Lösung, kann beispielweise bei hohen Salzgehalten, hohen Polymergehalten, entsprechenden pH-Werten im gewählten wässrigen Zwei-Phasen-System für sensible Komponenten auftreten.
Wie aus obiger Tabelle 1 ersehen werden kann, hat jede Phase ihren eigenen Bereich für die elektrische Leitfähigkeit. Die in Tabelle 1 angegebenen beispielhaften Werte für die elektrische Leitfähigkeit können als Sollwert-Bereiche für die verwendeten wässrigen Zwei-Phasen-Systeme (ATPSs) dienen. Beispielweise kann bei einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem der Bereich für die elektrische Leitfähigkeit bei der leichten Phase in einem Sollwert-Bereich von 10-25 mS/cm liegen und für die schwere Phase in einem Sollwert-Bereich von 60-80 mS/cm. Der Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit für die leichte Phase eines wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystems kann beispielweise bei 5-15 mS/cm liegen und der schweren Phase bei 30-50 mS/cm.
Die Wertebereiche für die elektrische Leitfähigkeit in den einzelnen Phasen sollten durch das Vorhandensein von Zellen in den einzelnen Phasen eigentlich nicht verändert werden. Bei Vorliegen von Zellen kann jedoch eine Zwischenphase auftreten, deren elektrische Leitfähigkeit in einem Zwei- Phasen-Phosphatsystem im Bereich von 40-50 mS/cm und im Zwei-Phasen-Citratsystem im Bereich von 30-40 mS/cm liegt.
Die in Tabelle 1 angegeben Leitfähigkeitsbereiche belegen, dass zwischen den einzelnen Phasen in einem wässrigen Zwei-Phasen-System ein ausreichend großer Unterschied vorliegt, um die jeweiligen Phasen anhand ihrer elektrischen Leitfähigkeitswerte eindeutig bestimmen zu können, so dass eine Phasentrennung aufgrund der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit möglich ist.
Die in Tabelle 1 angegebenen Sollwerte hängen vom jeweiligen Polymer (den jeweiligen Polymeren), dem verwendeten Salz (den verwendeten Salzen) und der jeweiligen Konzentration ab, so dass diese Sollwert-Bereiche in erster Linie nur zur Orientierung dienen und sich im Einzelfall auch deutlich von den angegebenen Bereichen unterscheiden können. Insbesondere das Vorliegen von leitfähigkeitssenkenden Biopartikeln (wie z.B. Zellen) kann dazu führen, dass eine deutlich reduzierte elektrische Leitfähigkeit, als zu erwarten wäre, vorliegt.
Für den Fachmann ist es ohne weiteres möglich, ein Zwei-Phasen-System auszuwählen, dass für die Reinigung und Anreicherung eines gewünschten Zielprodukts geeignet ist. Vorteilhafterweise liegt zwischen der abzutrennenden Phase mit dem Zielprodukt und der Gegenphase oder zwischen der abzutrennenden Phase mit dem Zielprodukt und der Zwischenphase ein feststellbarer Unterschied hinsichtlich der Leitfähigkeitswerte vor.
Gemäß einer Ausführungsform sind die Unterschiede der elektrischen Leitfähigkeiten von den zu trennenden Phasen beispielsweise größer als das 10fache, größer als das 9fache, größer als das 8fache, größer als das 7fache, größer als das 6fache, größer als das 5fache, größer als das 4fache oder größer als das 3fache der Messgenauigkeit der Leitfähigkeit des Leitfähigkeits-Messgerätes. Wenn beispielweise die elektrische Leitfähigkeit der oberen Phase 10 mS/cm beträgt und hierfür ein Fehler für die Messgenauigkeit von 0,15 mS/cm resultiert, so bedeutet das 10fache der Messgenauigkeit 10 x 0,15 mS/cm = 1 ,5 mS/cm. Der Unterschied der elektrischen Leitfähigkeiten zwischen leichter Phase und schwerer Phase wäre daher in diesem Fall größer als 1 ,5 mS/cm.
Ein derartig geringer Unterschied bei der elektrischen Leitfähigkeit zwischen leichter und schwerer Phase kann bei Polymer/Polymer-Phasensystemen (ATPS) vorliegen.
Bei Polymer/Salz-Systemen (ATPS) kann man als Faustregel einen Unterschied für die elektrischen Leitfähigkeiten zwischen leichter und schwerer Phase von mehr als 2 mS/cm angeben. Ein derartiger Unterschied liegt aber in sämtlichen bekannten Polymer/Salz-ATPS-Systemen regelmäßig vor, da die Polymer-Phase mit einer geringen Leitfähigkeit und die salzreiche Phase mit einer hohen Leitfähigkeit der zwei Phasen durch die hohen Konzentrationen von Polymer bzw. Salz entstehen, so dass stets ein ausreichender Unterschied der elektrischen Leitfähigkeiten beider Phasen erhalten wird.
Um zu bestimmen, wo die jeweiligen Phasen in der Trennvorrichtung vorliegen, kann wie folgt vorgegangen werden:
Gemäß einer Ausführungsform kann in einem kontinuierlichen System der Sollwert-Bereich für die leichte Phase wie folgt überwacht und angesteuert werden:
Das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase in der Trennvorrichtung ergibt einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit. Dieser Wert wird mit einem Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit verglichen. Der Sollwert-Bereich ist derjenige Bereich, der für die leichte Phase zu erwarten ist. Der Sollwert-Bereich bei einer leichten Phase in einem wässrigen Zwei-Phasen- P h os p hatsystem beträgt beispielweise 10-25 mS/cm, wie in Tabelle 1 angegeben. D.h. die Sonde in der leichten Phase misst an der Position, an der sich diese befindet, eine elektrische Leitfähigkeit im Bereich von 10 bis 25 mS/cm. Wenn die Messung der elektrischen Leitfähigkeit nun ergibt, dass dieser Bereich überschritten wird, d.h. die elektrische Leitfähigkeit über 25 mS/cm oder sogar deutlich darüber liegt, bedeutet dies, dass die Sonde in der leichten Phase beginnt die höhere elektrische Leitfähigkeit einer Zwischenphase von 40-50 mS/cm oder sogar der schweren Phase von 60-80 mS/cm zu messen. Die Zwischenphase und möglicherweise auch schwere Phase beginnen sich daher in der Trennvorrichtung aufzustauen. Damit die Sonde wieder in der leichten Phase vorliegt, wird daher schwere Phase und/oder Zwischenphase aus der Trennvorrichtung entnommen, d.h. es wird im konti- nuierlichen Betrieb beispielweise die Entnahmegeschwindigkeit der schweren Phase erhöht. Dies geschieht so lange, bis sich die Phasengrenzfläche nach unten bewegt und damit die gemessene Leitfähigkeit der leichten Phase wieder im Sollwert-Bereich liegt. Ebenso kann auch die Entnahmegeschwindigkeit der leichten Phase aus der Trennvorrichtung vermindert werden oder ganz gestoppt werden, wobei beispielweise der obere Auslass gedrosselt oder geschlossen werden kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann in einem kontinuierlichen System der Sollwert-Bereich für die schwere Phase wie folgt überwacht und angesteuert werden:
Das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase in der Trennvorrichtung ergibt einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit. Dieser Wert wird mit einem Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit verglichen. Der Sollwert-Bereich ist derjenige Bereich, der für die schwere Phase zu erwarten ist. Der Sollwert-Bereich bei einer schweren Phase in einem wässrigen Zwei- Phasen-Phosphatsystem beträgt beispielweise 60-80 mS/cm. D.h. die Sonde in der schweren Phase misst eine elektrische Leitfähigkeit im Bereich von 60 bis 80 mS/cm. Wenn die Messung der elektrischen Leitfähigkeit nun ergibt, dass dieser Bereich unterschritten wird, d.h. unter 60 mS/cm oder sogar deutlich darunter liegt, bedeutet dies, dass die Sonde in der schweren Phase beginnt, die niedrigere elektrische Leitfähigkeit einer Zwischenphase von 40-50 mS/cm oder sogar der leichten Phase von 10-25 mS/cm zu messen. Die leichte Phase oder Zwischenphase nähert sich daher der Position der Sonde für die schwere Phase. Damit die Phasengrenzfläche steigt und die Sonde wieder in der schweren Phase vorliegt, kann beispielweise die Entnahmegeschwindigkeit der schweren Phase aus der Trennvorrichtung verringert werden. Alternativ kann die Entnahme der schweren Phase gänzlich gestoppt werden.
Es besteht auch die Möglichkeit, zusätzliches Zwei-Phasen-System zuzugeben, d.h. die Durchflussmenge an zugeführtem Zwei-Phasen-System zu erhöhen, wodurch der Flüssigkeitsspiegel in der Trennvorrichtung wieder ansteigt. Dies geschieht so lange, bis die gemessene Leitfähigkeit der schweren Phase wieder im Sollwert-Bereich liegt.
Die Steuerung und Kontrolle der Entnahme der Phasen aus der Trennvorrichtung kann durch die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer erfolgen, wobei die Entnahme einer Phase auch ganz unterbrochen werden kann. Dem Fachmann im Stand der Technik sind Maßnahmen und Vorrichtungen hierfür geläufig. Beispielweise kann die Steuerung und Kontrolle der Entnahme der Phasen durch Schwerkraft oder unter Verwendung von Über- oder Unterdrück, beispielweise Vakuum, erfolgen. Über- oder Unterdrück bzw. Vakuum können in beliebiger Weise erzeugt werden. Es können auch eine oder mehrere Pumpen zum Einsatz kommen. Entnahme-Vorrichtungen zur Änderung der Entnahmemenge sind beispielweise Ventile, Durchflussbegrenzer, Schlauchquetschklemmen und dergleichen, die auch zum vollständigen Beenden oder Unterbrechen der Entnahme einer Phase eingesetzt werden können. Entnahme-Vorrichtungen zur Änderung der Entnahmegeschwindigkeit sind beispielweise Pumpen. Andere als die beschriebenen Maßnahmen und Vorrichtungen sind ebenfalls möglich. Zusätzlich kann auch ein Tauchrohr als zusätzlicher Auslass für eine Phase eingesetzt werden. Diese Ausführungsform der Erfindung wird noch im Einzelnen erläutert werden.
Durch Messung der elektrischen Leitfähigkeiten der Phasen kann daher sowohl das Absinken als auch Ansteigen der einzelnen Phasen und der Phasengrenzflächen in der Trennvorrichtung überwacht und gesteuert werden. Das Ansteigen der Phasen kann durch ein Aufstauen von ein oder mehreren Phasen oder durch die kontinuierliche Zufuhr von weiterem zu trennendem wässrigen Zwei- Phasen-System herrühren. Das Absinken der Phasen kann auf die Entnahme der Phasen zurückgehen. Im kontinuierlichen Verfahren wird daher ein Gleichgewicht zwischen zugeführten und abgeführten Phasen eingestellt, wobei hierzu die Überwachung der elektrischen Leitfähigkeit eingesetzt wird. Es wird daher ein sehr flexibles Kontroll- und Steuersystem bereitgestellt, das bei Pha- sen(volumen)änderungen in der Trennvorrichtung unmittelbar eingreifen kann und auch bei einer kontinuierlichen Extraktion zuverlässig arbeitet.
In Schritt f. erfolgt dann das Trennen der Phasen anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit durch Entnehmen der Phasen aus der Trennvorrichtung. Das Abtrennen der Phasen kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durch Entnehmen der jeweiligen Phasen aus der Trennvorrichtung anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit erfolgen. Der Ausdruck “Entnehmen der jeweiligen Phase anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit“ bedeutet, dass die jeweilige abzutrennende Phase basierend auf oder durch ihre gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte an einer oder mehreren Positionen in der betreffenden Phase identifiziert und daher aus der Trennvorrichtung gezielt entnommen werden kann. Die Entnahme der Phase wird daher durch die Messung der elektrischen Leitfähigkeit überwacht. Die vorliegende Erfindung verknüpft daher die bekannte Höhe der Messposition sowie die Leitfähigkeitsinformationen einer oder mehrerer Sonden zum aktiven Steuern der Phasengrenze in der Trennvorrichtung.
Gemäß einer Ausführungsform wird in der Trennvorrichtung ein Auslass vorgesehen und das Entnehmen zumindest einer der Phasen aus der Trennvorrichtung durch den Auslass gemäß Schritt f. durch Schwerkraft oder unter Verwendung von Über- oder Unterdrück durchgeführt, wobei eine Pumpe zum Einsatz kommen kann. Dies kann beispielsweise bei einem diskontinuierlich betriebenen System der Fall sein. Wenn nur eine Charge an Material über eine wässrige Zwei-Phasen-Extraktion aufgetrennt werden soll, kann beispielsweise nur ein Auslass vorliegen, der im unteren Teil der Trennvorrichtung vorgesehen sein kann.
Es können auch mindestens 2 Auslässe in der Trennvorrichtung vorliegen; dies kann beispielweise bei einem kontinuierlich betriebenen System der Fall sein. Es können auch drei oder mehr Auslässe in der Trennvorrichtung vorliegen.
In einem kontinuierlichen Verfahren können gemäß einer Ausführungsform 2 Auslässe vorgesehen werden, ein oberer Auslass, der im oberen Teil der Trennvorrichtung angeordnet ist, und ein unterer Auslass der im unteren Teil der Trennvorrichtung angeordnet ist. Ein Auslass ist eine Öffnung, durch welche die Flüssigkeit austritt. Dieser kann beliebig ausgestaltet sein. Der Auslass kann stufenlos oder in Stufen verschliessbar sein, beispielsweise durch ein Ventil, einen Durchflussbegrenzer oder eine Schlauchquetschklemme und dergleichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird in der Trennvorrichtung ein oberer Auslass zum Entnehmen der leichten Phase aus der Trennvorrichtung unter Verwendung von Schwerkraft oder von Überdruck oder Unterdrück vorgesehen, wobei auch eine Pumpe zur Erzeugung von Über- oder Unterdrück zum Einsatz kommen kann; und in der Trennvorrichtung wird ein unterer Auslass zum Entnehmen der schweren Phase aus der Trennvorrichtung unter Verwendung von Schwerkraft oder von Überdruck oder Unterdrück vorgesehen, wobei auch eine Pumpe zur Erzeugung von Über- oder Unterdrück zum Einsatz kommen kann. Dies wird noch im Einzelnen erläutert.
Gemäß einer Ausführungsform erfolgt das Entfernen einer Phase gemäß Schritt f. im kontinuierlichen Betrieb durch ein höhenverstellbares Tauchrohr, das eine Öffnung aufweist, die in die zu entnehmende Phase eingetaucht wird, wobei das Tauchrohr mit einem unteren Auslass derart verbunden wird, dass durch die Öffnung im Tauchrohr die Phase unter Schwerkraft zum Auslass abfließen kann; oder das Tauchrohr eine Öffnung (192) aufweist, durch die das Entnehmen der Phase unter Verwendung von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung kann ein Auslass derart ausgestaltet sein, dass dieser ein höhenverstellbares Tauchrohr darstellt, wobei im Tauchrohr eine Öffnung zum Entnehmen einer Phase vorgesehen wird. Unter einem „Tauchrohr“ wird ein Rohr verstanden, das in die Trennvorrichtung von oben eingeführt wird und durch eine im Tauchrohr vorliegende Öffnung Flüssigkeit einer Phase abfließen oder abgezogen werden kann. Das Rohr taucht derart in die betreffende Phase ein, dass die Phase mit der Öffnung im Tauchrohr aus der Trennvorrichtung entnommen werden kann. Dies kann entweder passiv geschehen, indem die Phase durch Schwerkraft austritt, oder dies kann aktiv erfolgen, indem Druck, insbesondere Unterdrück, an das Tauchrohr angelegt wird oder die entsprechende Phase durch eine Pumpe, die am Tauchrohr angeschlossen ist, abgepumpt wird. Das Tauchrohr dient zur Einstellung der Phasenposition(en) und Position(en) der Phasengrenzfläche(n).
Das Tauchrohr stellt daher einen in der Trennvorrichtung vorliegenden Auslass dar. Das kontinuierliche oder auch diskontinuierliche Entnehmen der Phasen in der Trennvorrichtung gemäß Schritt f. kann hierbei über ein höhenverstellbares Tauchrohr und damit einer höhenverstellbaren Öffnung im Tauchrohr durchgeführt werden.
Das Tauchrohr kann zum Entnehmen der leichten Phase, der schweren Phase oder der Zwischenphase eingesetzt werden. Das Tauchrohr kann kontinuierlich oder diskontinuierlich eingesetzt werden. Auch eine semi-kontinuierliche Arbeitsweise ist möglich, wobei kontinuierliche Abschnitte und diskontinuierliche Abschnitte sich abwechseln können.
Das Tauchrohr kann beispielweise zur Beibehaltung eines kontinuierlichen Verfahrens eingesetzt werden, wobei das eingestellte Gleichgewicht von zugeführter und abgeführter Phase(n) in der Trennvorrichtung auch durch Einsatz des Tauchrohrs aufrechterhalten wird. Das Tauchrohr kann auch zur Beseitigung von vorübergehenden Störungen, beispielsweise das Anstauen einer der Phasen in der Trennvorrichtung, eingesetzt werden und sorgt dann für ein Abfließen lassen der angestauten Phase.
Das Tauchrohr taucht in der Trennvorrichtung in eine der zwei oder drei Phasen ein, wodurch die im Tauchrohr vorhandene Öffnung es ermöglicht, dass diese Phase durch die Öffnung entnommen werden kann. Das Abfließen kann einfach durch Schwerkraft erfolgen; dann ist das Tauchrohr mit Öffnung eine Art Überlaufventil. Die Phase kann durch die Öffnung im Tauchrohr aber auch aktiv entnommen werden, zum Beispiel unter Einsatz von Über- oder Unterdrück bzw. Vakuum. Es kann auch eine Pumpe eingesetzt werden. Wenn das Tauchrohr unter Verwendung von Schwerkraft als Überlaufventil im kontinuierlichen Betrieb arbeitet, ist es bei Entnahme der leichten Phase durch das Tauchrohr zweckmäßig, wenn ein unterer Auslass in der Trennvorrichtung geöffnet wird. Bei Entnahme der schweren Phase durch das Tauchrohr ist es zweckmäßig, wenn ein oberer Auslass in der Trennvorrichtung geöffnet wird.
Die Öffnung im Tauchrohr kann permanent offen sein; es könnte auch ein Verschluss für die Öffnung, wie ein Deckel oder Ventil, vorgesehen werden.
Die Höhenverstellbarkeit des Tauchrohrs bedeutet, dass das Tauchrohr in der Trennvorrichtung nach oben und unten bewegt werden kann und so in eine der zwei oder drei Phasen eingetaucht werden kann, so dass gezielt eine der Phasen mit dem Tauchrohr entnommen wird. Zusätzlich kann das Tauchrohr während der Extraktion herauf und herunter bewegt werden, um auf Veränderungen der Phasen zu reagieren, damit beispielsweise die Öffnung im Tauchrohr die Phase nicht verlässt und durch die vorhandene Öffnung nur die gewünschte Phase entnommen wird.
Das „Hochfahren“ oder „Hochbewegen“ des Tauchrohrs wird synonym verwendet und bedeutet, dass das Tauchrohr, während es in Betrieb ist, nach oben nachpositioniert oder nachjustiert wird, damit das Tauchrohr in der Phase bleibt, aus der es Phasenflüssigkeit entnehmen soll, und so die Phasenflüssigkeit nach wie vor entnommen werden kann. Das Tauchrohr kann auch vollständig hochgefahren oder hochbewegt werden. Dann befindet sich dessen Öffnung beispielweise oberhalb des Flüssigkeitsspiegels oder dessen Öffnung ist so weit hochgefahren bis keine Flüssigkeit mehr aus dieser ausströmen kann. Das vollkommene Hochfahren des Tauchrohrs kann beispielweise zu Beginn des Extraktionsverfahrens der Fall sein und zum Ende des Extraktionsverfahrens durchgeführt werden.
Das „Herunterfahren“ oder „Herunterbewegen“ des Tauchrohrs wird synonym verwendet und bedeutet, dass das Tauchrohr, während es in Betrieb ist, nach unten positioniert oder nachjustiert wird, da- mit das Tauchrohr in der Phase bleibt, aus der es Phasenflüssigkeit entnehmen soll, und die Phasenflüssigkeit nach wie vor entnommen werden kann.
Der Ausdruck, dass „das Tauchrohr nach oben oder unten nachpositioniert oder nachjustiert wird“, bedeutet, dass das Tauchrohr aufgrund einer Änderung der Phasengrenzfläche(n) in der Trennvorrichtung dabei ist die betreffende Phase zu verlassen, so dass die Höhe bzw. Eintauchtiefe des Tauchrohrs entsprechend angepasst werden muss, um nach wie vor oder wieder in die betreffende Phase einzutauchen, damit diese abfließen oder abgezogen werden kann.
Die Steuerung der Höhenverstellung des Tauchrohrs, zum Beispiel mit Hilfe eines Schrittmotors, kann dabei unmittelbar über die gemessenen Werte der elektrischen Leitfähigkeit erfolgen. Im kontinuierlichen Betrieb ist das Tauchrohr in der Regel ständig im Einsatz. Wenn Störungen im kontinuierlichen Betrieb auftreten, kann der Betrieb des Tauchrohrs unterbrochen werden oder das Tauchrohr kann auch erst zum Einsatz kommen, um die Phasengrenzfläche(n) oder den Füllstand ansteigen oder absinken zu lassen. Insbesondere zu Beginn des Extraktionsverfahrens (Anfahren) und zum Ende des Extraktionsverfahrens (Abfahren) ist das Tauchrohr in der Regel nicht in Betrieb, d.h. es wird keine Flüssigkeit mit der Öffnung im Tauchrohr entnommen.
Es kann somit durch Entnahme einer oder mehrerer Phasen ein gezieltes Absenken der Phasengrenzflächenposition und damit natürlich auch der Phasenpositionen durchgeführt werden.
Das Zielprodukt kann sich in der leichten oder schweren Phase befinden. Je nach Ausführungsform kann das Tauchrohr dafür eingesetzt werden, die Phase mit oder ohne Zielprodukt aus der Trennvorrichtung zu entnehmen.
Es kann mit dem Tauchrohr auch eine eventuell vorhandene Zwischenphase aus der Trennvorrichtung entnommen werden. Wenn gleichzeitig eine der Phasen und die Zwischenphase entnommen werden sollen, beispielweise weil sich das Zielprodukt in der anderen Phase befindet, könnten auch zwei Phasen gleichzeitig mit dem Tauchrohr aus der Trennvorrichtung entnommen werden. Die Öffnung des Tauchrohrs könnte hierzu an der Phasengrenzfläche positioniert werden.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn das Tauchrohr aus einem Innenrohr aufgebaut ist, das eine Öffnung umfasst, und das Innenrohr von einem Außenrohr in Form eines Hüllrohrs oder Überrohrs umgeben wird. Das Überrohr ist beispielsweise fest installiert und nicht beweglich, wohingegen das Innenrohr nach oben und unten beweglich ist. Das Überrohr kann aber auch beweglich ausgebildet sein. Das Überrohr wie auch das Innenrohr kann aus einem beliebigen Material gefertigt sein, solange es die Flüssigkeiten, die entnommen werden sollen, nicht nachteilig beeinflusst. Beispielweise sind rostfreier Stahl, Kunststoff oder Glas möglich.
Das Überrohr weist ein oberes Ende und ein unteres Ende auf, welche die Länge des Überrohrs definieren. Die Länge des Überrohrs ist generell beliebig wählbar. Je nachdem welche Phase entnommen werden soll, kann die Länge des Überrohrs gewählt werden. Zudem kann ein sich von oben nach unten erstreckendes Überrohr oder auch ein sich von unten nach oben erstreckendes Überrohr zum Einsatz kommen.
Bei einem Tauchrohr mit einem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr ist es zweckmäßig, wenn mit diesem die schwere oder, sofern vorhanden, die Zwischenphase entnommen wird. In diesem Fall befindet sich das obere Ende des Überrohrs zweckmäßigerweise oberhalb der leichten Phase, insbesondere oberhalb des Flüssigkeitsspiegels (= der Flüssigkeitsspiegel der leichten Phase) in der Trennvorrichtung, d.h. das Überrohr ist oberhalb der Trennvorrichtung, insbesondere über oder an der oberen Wand der Trennvorrichtung, beispielweise der Außen- oder Innenseite der Wand, angebracht und reicht ins Innere der Trennvorrichtung. Das untere Ende des Überrohrs reicht (von oben gesehen) in die schwere Phase oder sofern vorhanden in die Zwischenphase, je nachdem welche der Phasen entnommen werden soll.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Tauchrohr daher ein sich von oben nach unten erstreckendes Überrohr, dessen oberes Ende sich oberhalb der leichten Phase befindet und deren unteres Ende sich in der schweren Phase befindet.
Bei einem Tauchrohr mit einem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr ist es zweckmäßig, wenn mit diesem die leichte oder, sofern vorhanden, die Zwischenphase entnommen wird. In diesem Fall befindet sich das untere Ende des Überrohrs zweckmäßigerweise unterhalb der schweren Phase in der Trennvorrichtung, d.h. das Überrohr ist unterhalb der Trennvorrichtung, insbesondere unter oder an der unteren Wand der Trennvorrichtung, beispielweise der Außen- oder Innenseite des Bodens der Trennvorrichtung, angebracht und reicht ins Innere der Trennvorrichtung hinein. Das obere Ende des Überrohrs reicht (von unten gesehen) in die leichte Phase oder, sofern vorhanden, in die Zwischenphase, je nachdem welche der Phasen entnommen werden soll.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Tauchrohr daher ein sich von unten nach oben erstreckendes Überrohr, dessen oberes Ende sich unterhalb der schweren Phase befindet und deren oberes Ende sich in der leichten Phase befindet.
In einer Ausführungsform ist das höhenverstellbare Tauchrohr daher aus einem höhenverstellbaren Innenrohr und einem Überrohr ausgebildet, wobei das Überrohr sich von oben nach unten oder von unten nach oben erstrecken kann. Das Innenrohr weist eine Öffnung zur Entnahme der entsprechenden Phase auf. Der Durchmesser des Überrohrs ist größer als der Durchmesser des Innenrohrs, so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr und Überrohr gebildet wird. Das Innenrohr wird daher vom Überrohr umgeben, so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr und Überrohr ausgebildet wird.
Das Tauchrohr kann in einer Ausführungsform mit dem unteren Auslass derart verbunden werden, dass durch die Öffnung im Tauchrohr die Phase unter Schwerkraft zum Auslass abfließen kann. Wenn das Tauchrohr nun mit Innenrohr und Überrohr als Überlaufventil eingesetzt wird und sich das Innenrohr von oberhalb des Flüssigkeitsspiegels der leichten Phase bis in den unteren Auslass erstreckt, ist das Überrohr in der Trennvorrichtung kürzer als das Innenrohr, da sich das Innenrohr über die gesamte Höhe der Trennvorrichtung erstreckt. Das Innenrohr befindet sich dann nur teilweise innerhalb des Überrohrs und kann dort herauf- und herunterbewegt werden. Vorteilhafterweise wird die Öffnung des Innenrohrs nur innerhalb des Überrohrs bewegt.
Wenn das Tauchrohr mit Innenrohr und Überrohr so eingesetzt wird, dass aktiv die Phase entnommen wird, beispielweise durch Anlegen von Unterdrück an das Innenrohr, dann ist das Überrohr ein Saugrohr und es ist in der Trennvorrichtung länger als das Innenrohr. Das Innenrohr befindet sich gänzlich innerhalb des Überrohrs und kann dort herauf- und herunterbewegt werden. Vorteilhafterweise wird die Öffnung des Innenrohrs nur innerhalb des Überrohrs bewegt.
Sämtlichen Ausführungsformen des Tauchrohrs mit Überrohr ist gemeinsam, dass in jedem Fall das Überrohr so gebildet wird, dass es über die Öffnung des Innenrohrs hinausragt. Die Öffnung des Innenrohrs befindet sich somit innerhalb des Überrohrs. Die Länge des Überrohrs kann hierbei je nachdem, welche Phase entnommen werden soll, variiert werden. Wie weit das Überrohr über die Öffnung des Innenrohrs hinausragt, hängt vom Einzelfall ab und kann vom Fachmann in wenigen Versuchen ermittelt und eingestellt werden.
Der Durchmesser des Überrohrs wird größer eingestellt als der Durchmesser des Innenrohrs, so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr und Überrohr gebildet wird. In diesen Zwischenraum strömt die Phase, in die das Überrohr reicht, hinein und kann vom Zwischenraum zur Öffnung im Innenrohr gelangen, wo die Phasenflüssigkeit dann austreten kann. Die Phasenflüssigkeit gelangt daher nicht direkt zur Öffnung im Innenrohr, sondern nur über den Zwischenraum, so dass das Überrohr einen Zulaufschutz darstellt.
Beim dem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr, das beispielweise in die schwere Phase reicht, steigt die schwere Phase im Zwischenraum hoch und gelangt erst dann zur Öffnung im Innenrohr. Da sich das Überrohr über die Öffnung des Innenrohrs hinaus erstreckt, wird damit sichergestellt, dass sich eine oberhalb des unteren Endes des Überrohrs vorliegende Phase, hier: die Zwischenphase und die leichte Phase, nicht ohne weiteres zur Öffnung gelangen können.
Beim dem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr, das beispielweise in die Zwischenphase reicht, steigt die Zwischenphase im Zwischenraum hoch und gelangt erst dann zur Öffnung im Innenrohr. Da sich das Überrohr über die Öffnung des Innenrohrs hinaus erstreckt, wird damit sichergestellt, dass sich eine oberhalb des unteren Endes des Überrohrs vorliegende Phase, hier: die leichte Phase, nicht ohne weiteres zur Öffnung gelangen kann.
Beim dem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr, das beispielweise in die leichte Phase reicht, fließt die leichte Phase durch Schwerkraft in den Zwischenraum zwischen Innen- und Überrohr hinein und gelangt erst dann zur Öffnung im Innenrohr. Da sich das Überrohr über die Öffnung des Innenrohrs hinaus erstreckt, wird damit sichergestellt, dass sich eine unterhalb des oberen Endes des Überrohrs vorliegende Phase, hier: die Zwischenphase und die schwere Phase, nicht ohne weiteres zur Öffnung gelangen können. Das Überrohr verlängert daher den Weg der unerwünschten Phase(n) zu Öffnung.
Beim dem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr, das beispielweise in die Zwischenphase reicht, fließt die Zwischenphase durch Schwerkraft in den Zwischenraum hinein, der sich füllt, und gelangt erst dann zur Öffnung im Innenrohr. Da sich das Überrohr über die Öffnung des Innenrohrs hinaus erstreckt, wird damit sichergestellt, dass sich eine unterhalb des oberen Endes des Überrohrs vorliegende Phase, hier: die schwere Phase, nicht ohne weiteres zur Öffnung gelangen kann.
Die verschiedenen Varianten des Überrohrs können jeweils mit den Ausführungsformen des Innenrohrs kombiniert werden, wobei je nachdem welche Phase entnommen werden soll und je nachdem wo sich das Zielprodukt befindet, eine geeignete Ausführung gewählt werden kann.
Der Durchmesser des Überrohrs ist nur insofern von Bedeutung, als der Durchmesser des Überrohrs größer ist als der Durchmesser des Innenrohrs. Die Durchmesser von Überrohr und Innenrohr werden daher je nach Ausführungsform ausgewählt. Die jeweiligen Durchmesser von Innenrohr und Überrohr und damit die Größe des gebildeten Zwischenraums spielen keine große Rolle, da die Phasenflüssigkeit bei Eintauchen des Überrohrs in die Phase in jedem Fall im Zwischenraum hochsteigen wird bzw. in diesen hineinfließen wird. Die gewünschte Geschwindigkeit des Einströmens der Phasenflüssigkeit in den Zwischenraum, indem der Abstand zwischen Innen- und Überrohr variiert wird, um eine geeignete Größe für den Zwischenraum zu jedem Anwendungsfall einzustellen, kann beispielweise durch wenige orientierende Versuche optimiert werden.
Der Durchmesser des Überrohres und damit der Abstand zum Innenrohr kann daher beliebig gewählt werden und vom Fachmann im Stand der Technik für den jeweiligen Anwendungsfall ausgewählt werden. Dieser beträgt beispielsweise: (für DN50) 10 mm für das Innenrohr und 20 mm für das Überrohr oder (für DN150): 35 mm für das Innenrohr und 60 mm für das Überrohr.
Wenn das Überrohr nicht beweglich, sondern starr ausgebildet wird, ist es zweckmäßig vor Beginn der Extraktion festzulegen, welche Phase mit dem Tauchrohr entnommen werden soll, da die Länge des Überrohrs bestimmt, in welche Phase dieses eintaucht und das Überrohr während des Betriebs nicht ohne weiters ausgetauscht werden kann.
Wenn das Überrohr beweglich ausgebildet wird, kann diese auch während der Extraktion in der Länge verändert werden, wenn dies erforderlich wird.
Das Überrohr überragt daher die Öffnung im Innenrohr, so dass das Überrohr als zusätzlicher Zulaufschutz dient, damit nur die Phase, in die das Überrohr reicht, in den Zwischenraum zwischen Innen- und Überrohr einströmen kann und nur diese Phase auch aus der Öffnung im Innenrohr austreten kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Länge des Überrohrs und dessen Durchmesser derart gewählt, dass der Zutritt von Schwebstoffen, Flocken und anderen festen oder halbfesten Bestandteilen aus der Phase, in die das Überrohr eintaucht, zur Öffnung im Innenrohr des Tauchrohrs verhindert wird. Das Überrohr ermöglicht damit den Zutritt von Flüssigkeit zur Öffnung des Innenrohrs, schirmt die Öffnung aber gegen Schwebstoffe und größere Bestandteil ab. Dies hat den Vorteil, dass hierdurch unerwünschte Komponenten, wie beispielsweise Schwebstoffe, Flocken und dergleichen durch das Überrohr zurückgehalten werden, und so nicht in die Öffnung gelangen, um diese zu verstopfen.
Gemäß einer Ausführungsform fungiert das Tauchrohr sowohl mit als auch ohne Überrohr als Überlaufventil, d.h. die Phasenflüssigkeit kann aus der Öffnung unter Schwerkraft ausfließen. Das Tauchrohr ist in dieser Ausführungsform mit oder ohne Überrohr mit dem unteren Auslass derart verbunden, dass nur durch die Öffnung im Tauchrohr Flüssigkeit durch den unteren Auslass ausfließen kann, aber nicht direkt aus der Trennvorrichtung Flüssigkeit in den unteren Auslass strömen kann. Das Tauchrohr ist derart mit dem unteren Auslass verbunden, dass eine flüssigkeitsdichte Verbindung vorliegt, bei der das Tauchrohr aber noch hoch- und herunterbewegt werden kann, ohne die Verbindung mit dem Auslass zu beeinträchtigen. Derartige Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und müssen nicht im Einzelnen erläutert werden.
Das Tauchrohr befindet sich dann in Betrieb, wenn Flüssigkeit aus der Trennvorrichtung durch die Öffnung des Tauchrohrs entnommen oder abgezogen wird. Das Tauchrohr befindet sich dann nicht in Betrieb, wenn keine Flüssigkeit aus der Trennvorrichtung durch die Öffnung im Tauchrohr entnommen oder abgezogen wird.
Aufgrund der Beweglichkeit des Innenrohrs, könnte dieses auch aus dem Überrohr hinausbewegt werden; hierdurch würden die Vorteile des Überrohrs jedoch nicht mehr vorliegen, so dass dies vermieden wird. Einzelheiten zum Überrohr werden bei den Figuren 2 bis 4 nochmals erläutert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die in Schritt e. gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte dazu eingesetzt, die Eintauchtiefe des höhenverstellbaren Tauchrohrs durch das Tauchrohr zu steuern.
In einem kontinuierlichen Extraktionsverfahren kann das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeiten in der Trennvorrichtung, wie in Schritt e. beschrieben, daher dazu verwendet werden, das höhenverstellbare Tauchrohr anzusteuern und dessen Höhe bzw. Eintauchtiefe in Abhängigkeit von der Lage der Phasengrenzfläche und/oder der Phasen zu regulieren, so dass durch die im Tauchrohr vorhandene Öffnung die gewünschte Phase entnommen werden kann. Dies kann in Echtzeit erfolgen, so dass die Höhenverstellung des Tauchrohrs automatisch in Abhängigkeit von den gemessenen Werten für die elektrische Leitfähigkeit und damit der Position der jeweiligen Phase und der Position der Phasengrenzfläche(n) erfolgt. Zudem kann die Auslaufgeschwindigkeit im Tauchrohr auch durch die Höheneinstellung variiert werden, da je tiefer die Öffnung des Tauchrohres in der jeweiligen Phase steht, desto schneller die Phase durch Schwerkraft abläuft, da der hydrostatische Druck höher ist.
Das Tauchrohr kann daher im kontinuierlichen Verfahren zum Einsatz kommen und dort kontinuierlich eingesetzt werden. Es kann aber auch nur jeweils vorübergehend zum Einsatz kommen und dann während des kontinuierlichen Betriebs die auftretenden Störungen durch sich anstauende Phase über eine begrenzte Einsatzdauer beseitigen. Das Tauchrohr wird dann immer wieder eingesetzt, wenn sich die Störung ausbildet und dies wird so lange wiederholt, bis das Verfahren beendet wird. Das Tauchrohr würde dann diskontinuierlich eingesetzt werden. Dabei fließen die jeweiligen Phasen aus dem oberen und gegebenenfalls unteren Auslass der Trennvorrichtung, beispielweise angetrieben durch das und gemäß dem Einfließen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) in die Trennvorrichtung, aus der Trennvorrichtung heraus. Das Tauchrohr kann dann als Flüssigkeitsausgleich dienen.
Beispielweise können auch 2 untere Auslässe in der Trennvorrichtung vorhanden sein: einer ist mit dem Tauchrohr verbunden, über den anderen kann die schwere Phase aus der Trennvorrichtung gewonnen werden.
Die Entnahme der Phasen und damit auch die generelle Verschiebung der Phasengrenzfläche(n) in der Trennvorrichtung nach oben oder unten, wird in der vorliegenden Erfindung anhand der kontinuierlich gemessenen Werte für die elektrische Leitfähigkeit durch ein oder mehrere Sonden überwacht. Die vorliegende Erfindung verknüpft daher die bekannte Höhe der Messposition der ein oder mehreren Sonden und die Leitfähigkeitsinformationen der ein oder mehreren Sonden, um die Phasengrenzflächen^) in der Trennvorrichtung im kontinuierlichen Betrieb zu bestimmen, aktiv anzusteuern und regeln zu können. Somit kann (können) die Phasengrenzfläche(n) nach oben oder unten nachgeregelt werden. Dies kann ganz allgemein erfolgen durch Kontrolle und Steuerung des zur Trennvorrichtung zulaufenden wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) und/oder der aus der Trennvorrichtung ablaufenden Phasen (das sind Flüssigkeiten, Suspensionen, Präzipitate und dergleichen, in Form der leichten, schweren und Zwischenphase). Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Zuführmenge und/oder Zuführgeschwindigkeit des zulaufenden Zwei-Phasen-Systems (ATPS) (das mit der Ausgangslösung hergestellt wurde) zur Trennvorrichtung variiert werden und/oder die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer von leichter Phase/schwerer Pha- se/Zwischenphase aus der Trennvorrichtung variiert werden, wobei die Entnahme einer Phase auch ganz unterbrochen werden kann. Dies kann im Einzelnen durchgeführt werden, indem die Entnahmegeschwindigkeit für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmegeschwindigkeit für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmemenge für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmemenge für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmedauer für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmedauer für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahme der leichten oder schweren Phase unterbrochen wird; die Zuführmenge des in die Trennvorrichtung einströmenden wässrigen Zwei-Phasen- Systems, mit oder ohne das Zielprodukt, erhöht oder verringert wird; die Zuführgeschwindigkeit des in die Trennvorrichtung einströmendem wässrigen Zwei- Phasen-Systems (ATPS), mit oder ohne Zielprodukt, erhöht oder verringert wird und/oder das Tauchrohr zum Abfließen lassen oder Absaugen einer Phase eingesetzt wird und gegebenenfalls nach oben oder unten nachpositioniert wird.
Die Zuführmenge und Zuführgeschwindigkeit bzw. Entnahmemenge und Entnahmegeschwindigkeit hängen miteinander zusammen, so dass beispielweise auch die Durchflussmenge (Volumen pro Zeitspanne oder Menge pro Zeit) erhöht oder verringert werden kann.
Das Variieren der Zuführmenge/Zuführgeschwindigkeit des zulaufenden wässrigen Zwei-Phasen- Systems ohne das Zielprodukt stellt beispielsweise eine Spüllösung dar, die insbesondere am Ende der Extraktion zum Einsatz kommen kann, um die leichte Phase oder die schwere Phase aus der Trennvorrichtung zu verdrängen.
Die oben geschilderten einzelnen Maßnahmen können auch miteinander kombiniert werden. Dies gehört - bis auf das hier beschriebene Tauchrohr - zum Wissen des Fachmanns.
Bei der Trennvorrichtung können eine oder mehrere Entnahmevorrichtungen und/oder Mittel zur Regelung und/oder Steuerung der Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer von leichter Phase/schwerer Phase/Zwischenphase aus der Trennvorrichtung anhand der Messwerte der elektrischen Leitfähigkeitswerte eingesetzt werden. Diese sind dem Fachmann im Stand der Technik, bis auf die Verwendung eines Tauchrohrs, bekannt und umfassen beispielsweise die Verwendung von Schwerkraft in Zusammenhang mit einem oder mehreren Auslässen sowie dem Tauchrohr: beispielsweise Abfließen lassen der schweren Phase am unteren Auslass der Trennvorrichtung oder Verwendung des Tauchrohrs als zusätzlichem Auslass, das dann als Überlaufventil fungiert;
Anlegen von Überdruck in Zusammenhang mit einem Einlass, wobei die Stärke des Überdruckes geregelt werden kann (treibende Kraft für das Ausfließen der Phase(n) ist hier Überdruck): beispielweise Zufuhr des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Druck in die Trennvorrichtung;
Anlegen eines Unterdruckes in Zusammenhang mit einem oder mehreren Auslässen sowie dem Tauchrohr, wobei die Stärke des Unterdruckes geregelt werden kann (treibende Kraft für das Ausfließen der Phase(n) ist hier Unterdrück): beispielweise an einem oder mehreren Auslässen zum Abziehen der leichten und/oder schweren Phase; oder mit dem Tauchrohr als zusätzlichem Auslass, dass dann als Saugrohr fungiert und eine der Phasen absaugt; die Verwendung von ein oder mehreren Pumpen in Zusammenhang mit einem oder mehreren Auslässen sowie dem Tauchrohr, wobei deren Pumpgeschwindigkeit geregelt werden kann (treibende Kraft für das Ausfließen der Phase(n) ist hier Unterdrück): beispielweise für die Zufuhr des Zwei-Phasen-Systems zur Trennvorrichtung und/oder die Entnahme an einem oder mehreren Auslässen und/oder durch das Tauchrohr; und/oder die Verwendung von Entnahme-Vorrichtungen in Zusammenhang mit einem oder mehreren Auslässen, die den Querschnitt eines oder mehrerer Auslässe der Trennvorrichtung regeln und/oder steuern kann, wie regelbare Ventile, regelbare Durchflussbegrenzer, regelbare Schlauchquetschklemmen, regelbare Absperrhähne und dergleichen (dabei kann die treibende Kraft für den Ausfluss aus der Trennvorrichtung die Schwerkraft sein), jeweils an einem oder mehreren Auslässen der Trennvorrichtung, beispielsweise zum kontrollierten Ablassen oder Unterbrechen der Entnahme der Phasen an einem oder mehreren Auslässen.
Unter „Regelung und/oder Steuerung der Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer“ der Phasen wird die Beeinflussung der Variation der Menge, Dauer und/oder der Geschwindigkeit der aus dem mindestens einen Auslass oder dem Tauchrohr austretenden Flüssigkeit verstanden. Es umfasst die Kontrolle und Korrektur und/oder Regulierung der Menge, Geschwindigkeit bzw. Dauer der austretenden Flüssigkeit.
In einer Ausführungsform kann beispielweise anhand der Messwerte der elektrischen Leitfähigkeitswerte ein höhenverstellbares Tauchrohr mit Öffnung zum Entnehmen einer Phase unter Verwendung von Schwerkraft (treibende Kraft für das Ausfließen der Phase(n)) eingesetzt werden. Dabei kann die Höhe der Öffnung in der Trennvorrichtung variiert werden, wie bereits im Einzelnen geschildert.
Die Höhe der Öffnung des Tauchrohres in der Trennvorrichtung kann stufenlos oder in Schritten verstellt werden. Ebenso kann die Entnahme aus der Trennvorrichtung auch komplett gestoppt werden, wenn die Öffnung des Tauchrohres über die Höhe der leichten Phase oder die Höhe der im Zwischenraum vorliegenden Phasenflüssigkeit eingestellt wird. Die Entnahmegeschwindigkeit aus der Trennvorrichtung ist hierbei aufgrund der Schwerkraft und des hydrostatischen Druckes umso höher je tiefer sich die Öffnung des Tauchrohres in der Trennvorrichtung befindet.
Die gemäß der Erfindung verwendeten ein oder mehreren Pumpen können die Entnahmegeschwindigkeit stufenlos oder schrittweise regeln. Ebenso kann eine Regelung und/oder Steuerung der Entnahmegeschwindigkeit durch Ein- und Ausschalten der Pumpe erfolgen (On-/Off-Regelung). Als Pumpen können Förderpumpen zum Fördern von Flüssigkeiten sein oder Vakuumpumpen, die einen Druckunterschied erzeugen.
Unterdrück kann beispielweise durch Komprimierung von Luft erzeugt werden. Die Stärke des Unterdruckes, welcher an einem oder mehreren Auslässen der Trennvorrichtung angelegt wird, kann ebenso stufenlos oder schrittweise eingestellt werden oder es erfolgt eine On-/Off-Regelung. Ein Unterdrück kann auch mit einer Pumpe erzeugt werden. Die Ventile, Durchflussregler, Schlauchquetschklemmen, Absperrhähne und dergleichen sind ebenfalls stufenlos oder schrittweise einstellbar, so dass die Entnahme aus der Trennvorrichtung stufenlos oder schrittweise geregelt werden kann. Die Ventile, Durchflussregler, Schlauchquetschklemmen, Absperrhähne können aber auch den Ausfluss aus der Trennvorrichtung durch vollständiges Öffnen oder Schließen regeln und/oder steuern.
Diese hier genannten Entnahme-Vorrichtungen und Mittel, einschließlich des oben beschriebenen Tauchrohrs, durch die die Entnahmemenge, Entnahmedauer und/oder die Entnahmegeschwindigkeit der Phasen aus der Trennvorrichtung gesteuert und/oder geregelt werden können, können auch kombiniert werden, wie der Fachmann ohne weiteres verstehen wird.
So kann beispielsweise die schwere Phase über das Tauchrohr aus der Trennvorrichtung entnommen oder abgezogen werden und die Entnahmemenge und/oder die Entnahmegeschwindigkeit der leichten Phase an einem Auslass kann durch eine Pumpe geregelt und/oder gesteuert werden.
Ganz allgemein kann das Entnehmen der Phasen aus der Trennvorrichtung kontinuierlich als auch diskontinuierlich erfolgen, wobei die Triebkraft für das Ausströmen der Phasenflüssigkeit aus der Trennvorrichtung sind: die Schwerkraft; ein oder mehrere Pumpen;
Ansaugen.
Beim kontinuierlichen Verfahren ist darüber hinaus die treibende Kraft für das Ausströmen der einzelnen Phasen aus der Trennvorrichtung auch das Einfließen lassen des wässrigen Zwei-Phasen- Systems (ATPS) in die Trennvorrichtung. Diese hat einen Einfluss auf die Entnahmegeschwindigkeiten der leichten und schweren Phase und gegebenenfalls der Zwischenphase aus der Trennvorrichtung. Im Gleichgewicht ist die Menge des einströmenden wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) = der Summe der Mengen der ausströmenden leichten, schweren und gegebenenfalls Zwischenphase aus der Trennvorrichtung. Im Gleichgewicht sollte(n) dadurch auch die Phasengrenzfläche(n) eigentlich konstant in der Mitte der Trennvorrichtung sein. Durch Schwankungen, Störungen und dergleichen kann es nun dazu kommen dass sich die Phasengrenzfläche(n) verschiebt(en). In diesem Fall wird dann eine Regelung vorgenommen.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Entnahmemenge einer oder beider Phasen und gegebenenfalls der Zwischenphase aus der Trennvorrichtung geregelt durch: die Höhe der Öffnung eines Tauchrohres; eine Pumpe, deren Pumpgeschwindigkeit geregelt werden kann;
Anlegen eines Unterdruckes, wobei die Stärke des Unterdruckes geregelt werden kann; ein oder mehrere Entnahme-Vorrichtungen, die den Querschnitt eines oder beider Auslässe der Trennvorrichtung regeln und/oder steuern kann, wie regelbare Ventile, regelbare Durchflussbegrenzer, regelbare Schlauchquetschklemmen, regelbare Absperrhähne und dergleichen. Neben den bereits geschilderten Maßnahmen und Vorrichtungen zur Steuerung und Kontrolle der Entnahmegeschwindigkeit bzw. -menge, wird in einer Ausführungsform durch die eingestellte Pumpengeschwindigkeit die Abzugsgeschwindigkeit der Flüssigkeit, beispielweise der leichten und/oder schweren Phase, geregelt bzw. gesteuert. Für bestimmte besonders empfindliche Zielprodukte kann es vorteilhaft sein, wenn Pumpen zum Einsatz kommen, die eine geringe mechanische Beanspruchung ermöglichen. Dies hat den Vorteil, dass unerwünschte Scherkräfte in den Phasen vermieden werden und so das Verfahren auch für derartige Zielprodukte geeignet ist.
Die in Schritt e. gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte können somit dazu eingesetzt werden, die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer einer oder mehrerer Phasen zu regeln und/oder zu steuern, wobei die Entnahme einer Phase auch ganz unterbrochen werden kann, beispielsweise durch die hier beschriebenen Entnahme-Vorrichtungen und/oder Mittel. Hierdurch kann gezielt auf die Position der Phasen und damit der Phasengrenzfläche(n) in der Trennvorrichtung Einfluss genommen werden.
Für die Position der Leitfähigkeitssonden im Hinblick auf die Position der Öffnung im höhenverstellbaren Tauchrohr können obige Ausführungen zur Position von Sonde/Auslass hier ebenfalls relevant sein: D.h. die Öffnung im Tauchrohr ist nichts anderes als ein Auslass in der Trennvorrichtung.
Wenn das Tauchrohr in der Ausführungsform ohne Überrohr in die schwere Phase eintaucht, um diese zu entnehmen, so kann es zweckmäßig sein, wenn die Öffnung des Tauchrohrs zum Entnehmen der schweren Phase tiefer als die Sonde(n) in der schweren Phase angeordnet werden, d.h. die Position, bei der die Sonde die elektrische Leitfähigkeit misst, befindet sich dann oberhalb der Position, wo sich die Öffnung des Tauchrohrs in der Trennvorrichtung befindet. Damit kann man ein zu starkes Absinken der leichten Phase (oberen Phase) und/oder gegebenenfalls der Zwischenphase mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese über die Öffnung des Tauchrohrs abfließt.
Wenn das Tauchrohr in der Ausführungsform ohne Überrohr in die leichte Phase eintaucht, um diese zu entnehmen, so ist es zweckmäßig, wenn die Öffnung des Tauchrohrs zum Entnehmen der leichten Phase höher als die Sonde(n) in der leichten Phase angeordnet werden, d.h. die Position, bei der die Sonde die elektrische Leitfähigkeit misst, befindet sich unterhalb der Position, wo sich die Öffnung des Tauchrohrs in der Trennvorrichtung befindet. Damit kann man ein zu hohes Ansteigen der schweren Phase (untere Phase) und/oder gegebenenfalls der Zwischenphase mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese über die Öffnung des Tauchrohrs abgezogen wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann bei Verwendung eines Tauchrohrs mit sich von oben nach unten erstreckendem Überrohr bei der Entnahme der schweren Phase durch die Öffnung des Innenrohrs das untere Ende des Überrohrs zum Entnehmen der schweren Phase tiefer als die Sonde^) in der schweren Phase befindet (befinden), d.h. die Position, bei der die Sonde die elektrische Leitfähigkeit misst, befindet sich oberhalb der Position, wo sich das untere Ende des Überrohrs in der Trennvorrichtung befindet. Damit kann man ein zu starkes Absinken der leichten Phase (oberen Phase) und/oder gegebenenfalls der Zwischenphase mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese in den Zwischenraum zwischen Innenrohr und Überrohr eindringen und über die Öffnung des Tauchrohrs abfließen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann bei Verwendung eines Tauchrohrs mit sich von unten nach oben erstreckendem Überrohr bei der Entnahme der leichten Phase durch die Öffnung des Tauchrohres das obere Ende des Überrohrs zum Entnehmen der leichten Phase höher als die Sonde^) in der leichten Phase befindet (befinden), d.h. die Position, bei der die Sonde die elektrische Leitfähigkeit misst, befindet sich unterhalb der Position, wo sich das obere Ende des Überrohrs in der Trennvorrichtung befindet. Damit kann man ein zu hohes Ansteigen der schweren Phase (untere Phase) und/oder gegebenenfalls der Zwischenphase mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese in den Zwischenraum zwischen Innenrohr und Überrohr eindringen und über die Öffnung des Tauchrohrs abfließen.
Die vorliegende Erfindung verknüpft daher die bekannte Höhe der Messposition und die Leitfähigkeitsinformationen einer oder mehrerer Sonden zum aktiven Steuern der Phasengrenze in der Trennvorrichtung. In einer möglichen Ausführung würde(n) im Falle einer liegenden Trennvorrichtung, wie einem Abscheider, mit Tauchrohr, beispielweise in Form eines Abzugsrohrs oder Überlaufventils, die Phasengrenzfläche(n) nach oben oder unten nachgeregelt werden, indem das Tauchrohr zum Entnehmen einer der Phase automatisch nach oben oder unten nachpositioniert wird.
Das geschilderte Regulierungs- und Kontrollverfahren, basierend auf den gemessenen Leitfähigkeitswerten, kann daher dazu dienen, sicherzustellen, dass jeweils eine Phase nur über jeweils einen Auslass gezielt entnommen wird, z.B. die leichte Phase nur über den oberen Auslass und die schwere Phase nur über den unteren Auslass der Trennvorrichtung bzw. über die Öffnung des Tauchrohres mit oder ohne Überrohr. Weiterhin kann das Regulierungs- und Kontrollverfahren eingesetzt werden, um ein gezieltes Anheben oder Absenken der Phasengrenzfläche(n) vorzunehmen. Dies ist während einer kontinuierlichen Extraktion besonders vorteilhaft, da hierdurch ein Aufstauen oder Abfallen einzelner Phasen vermieden wird.
Zusätzlich oder alternativ zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit kann auch die Trübung gemessen und wie für die elektrische Leitfähigkeit beschrieben eingesetzt werden.
Das Regulierungs- und Kontrollverfahren kann manuell, automatisch oder unter Verwendung von Software durchgeführt werden.
Zudem kann das gezielte Erhöhen der Phasengrenzflächenposition(en) in der Trennvorrichtung vorteilhaft sein. Dies kann beispielweise für die vollständige Entleerung der Trennvorrichtung am Ende einer kontinuierlichen Extraktion erfolgen, da ansonsten ein Großteil einer Phase möglicherweise in der Trennvorrichtung verbleiben würde und nicht gewonnen werden könnte. Beispielweise bei beson- ders wertvollen Zielprodukten kann es zweckmäßig sein, wenn eine vollständige Restentleerung der Trennvorrichtung durchgeführt wird.
Um eine möglichst vollständige Rückgewinnung der Phase und daher Restentleerung der Trennvorrichtung zu ermöglich, wird eine Spüllösung, beispielweise zusammengesetzt aus der schweren Phase oder leichten Phase oder einer anderen geeigneten Lösung, zugesetzt.
Beispielweise kann durch Zugabe von entsprechender Spüllösung dann der Anteil der schweren Phase in der Trennvorrichtung dann so erhöht werden, dass die leichte Phase nach oben verdrängt wird und so durch den oben angeordneten Auslass in einfacher Weise entnommen werden kann. Alternativ kann durch Zugabe von entsprechender Spüllösung der Anteil der leichten Phase in der Trennvorrichtung so erhöht werden, dass die schwere Phase nach unten verdrängt wird und so durch den unten angeordneten Auslass in einfacher Weise entnommen werden kann.
In einer anderen Ausführungsform kann die leichte Phase in der Trennvorrichtung nach oben verdrängt werden, indem das Tauchrohr, das schwere Phase entnommen hatte, hochgefahren wird und daher keine schwere Phase mehr entnommen wird. Dadurch staut sich die schwere Phase auf und drückt die leichte Phase damit nach oben, die dann in einfacher Weise aus dem Auslass entnommen werden kann.
In noch einer anderen Ausführungsform kann die schwere Phase in der Trennvorrichtung nach unten verdrängt werden, indem das Tauchrohr, das leichte Phase entnommen hatte, hochgefahren wird und daher keine leichte Phase mehr entnommen wird. Dadurch staut sich die leichte Phase auf und drückt die schwere Phase damit nach unten, die dann in einfacher Weise aus dem Auslass entnommen werden kann.
Ein „gezieltes Absenken oder Erhöhen“ bedeutet, dass dies mit den kontinuierlich gemessenen Leitfähigkeitswerten in Echtzeit überwacht und durch die bereits im Einzelnen erläuterten Maßnahmen von außen entsprechend gesteuert werden kann.
Die gewünschte Phase mit dem Zielprodukt wird dann in Schritt g. erhalten.
Das Verfahren der Erfindung kann ohne Zwischenschritte durchgeführt werden, so dass sich die einzelnen Schritte a. bis g. jeweils aneinander anschließen.
Es versteht sich von selbst, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch Teil eines großtechnischen Verfahrens sein kann. Beispielweise kann das erfindungsgemäße Verfahren als automatisierte Zellernte und Aufreinigung (Capture-Schritt) in der Aufarbeitung, beispielweise eines monoklonalen Antikörpers als Zielprodukt, in großtechnischem Maßstab integriert werden. In einem ersten Verfahrensabschnitt, einem Up-Stream-Verfahren, wird dann eine Zellkultur in einem Bioreaktor kultiviert, die das Zielprodukt erzeugt. In einem zweiten Verfahrensabschnitt wird die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt, um das Zielprodukt entsprechend zu reinigen und anzureichern. In einem dritten Verfahrensabschnitt könnten sich weitere Reinigungsschritte für das Zielprodukt anschließen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA, wobei eine Plasmid-DNA bereitgestellt wird; diese in einem Mikroorganismus, ausgewählt aus Eukaryonten und Prokaryonten, transformiert, dort vermehrt und anschließend durch alkalische Lyse gewonnen wird; das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird; anschließend die gewonnene Plasmid-DNA weiter aufgereinigt, gegebenenfalls modifiziert und gegebenenfalls formuliert wird.
In einer Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren daher auch in der Herstellung von Plasmid-DNA in großtechnischem Maßstab angewendet werden. Dabei wird die Plasmid-DNA intrazellulär in einem Mikroorganismus, wie in einem eukaryotischen oder einem prokaryotischen Organismus, beispielweise in Hefe, insbesondere in einem Bakterium, beispielsweise in E. coli hergestellt. Dabei wird der Mikroorganismus mit der herzustellenden Plasmid-DNA transformiert und der transformierte Mikroorganismus unter Bedingungen kultiviert, die zu einer Vermehrung der Plasmid-DNA- Menge in der Kulturbrühe führen. Nach Abtrennung der Biomasse (Mikroorganismen die Plasmid-DNA enthaltend) und deren alkalischer Lyse mit anschließender Neutralisation wird das Lysat in ein wässriges Zwei-Phasen-System (ATPS) überführt. Dabei bilden sich eine leichte und eine schwere Phase aus und eine Zwischenphase, die Präzipitat aus Zellbestandteilen, Proteinen, genomischer DNA, RNA präzipitiertem Kaliumdodecylsulfat (und weitere Verunreinigungen enthält. Durch die wässrige Zwei- Phasen-Extraktion (ATPE) gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Plasmid-DNA aufgereinigt und in der schweren Phase angereichert. Die alkalische Lyse und die sich sofort anschließende wässrige Zwei-Phasen-Extraktion (ATPE) können kontinuierlich und automatisiert erfolgen. Weitere sich an die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion (ATPE) anschließende Schritte in der Aufarbeitung der schweren Phase umfassen beispielsweise Diafiltration, Aufkonzentrierung durch Ultrafiltration, eine Fällung durch Ammoniumsulfat oder andere Salze und/oder zwei oder mehr Chromatographie-Schritte [3], beispielsweise Anionenaustauschchromatiographie und Hydrophobie Interaction Chromatographie. In weiteren Schritten kann die Plasmid-DNA zu einer bestimmten Konzentration aufkonzentriert werden und gegen einen Formulierungspuffer ultradiafiltriert werden. Danach kann die Plasmid-DNA noch weiter formuliert werden.
Erfindungsgemäß gelingt es daher, auch eine automatisierte Phasentrennung durchzuführen, wobei eine zuverlässige Detektion der beiden wässrigen Phasen, ohne oder mit Zwischenphase, durch kontinuierliche Messung(en) der elektrischen Leitfähigkeit an geeigneter Position oder geeigneten Positionen in der Trennvorrichtung durchgeführt wird. Eine zuverlässige Detektion des Phasengrenzflächenstands, wie dies erfindungsgemäß erreicht wird, ist notwendig, um ein robustes Automatisierungsverfahren bereitzustellen. Durch Automatisierung der Phasentrennung, basierend auf den konti- nuierlich gemessenen Leitfähigkeitswerten, kann somit ein zuverlässig arbeitendes System geschaffen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch für einen großtechnischen Maßstab. Eine großtechnische Produktion mit Trennvorrichtungsvolumina von mehr als 1 m3 ist möglich.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann anstelle oder zusätzlich zur elektrischen Leitfähigkeit auch die unterschiedliche Trübung der verschiedenen Phasen gemessen werden. Beispielweise kann kontinuierlich die elektrische Leitfähigkeit und/oder Trübung in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung gemessen werden.
Die Erfindung richtet sich dann auf ein Verfahren zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes, ausgewählt aus
Immunglobulinen oder anderen Proteinen; oder
Plasmid-DNA, genomischer DNA, RNA oder anderen Nukleinsäuren; oder Viren, umfassend die folgenden Schritte: a. Bereitstellen einer Ausgangslösung, die das Zielprodukt enthält; b. Überführen der Ausgangslösung in ein wässriges Zwei-Phasen-System durch Zugeben mindestens eines Polymers und mindestens eines Salzes in geeigneter Konzentration, oder durch Zugeben mindestens zweier Polymere in geeigneter Konzentration; c. Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Erhalt eines Stoffaustauschs, so dass sich das Zielprodukt in der leichten Phase oder in der schweren Phase anreichert; d. Entmischen lassen der Phasen in einer Trennvorrichtung in eine leichte Phase, eine schwere Phase und, sofern eine Zwischenphase vorhanden ist, eine Zwischenphase; e. kontinuierliches Messen der elektrischen Leitfähigkeit und/oder Trübung in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung zum Bestimmen der Position der beiden Phasen und der Phasengrenzfläche oder bei Vorliegen einer Zwischenphase der Position der Zwischenphase und der zwei Phasengrenzflächen; f. Entnehmen jeweils der leichten Phase, der schweren Phase und bei Vorliegen einer Zwischenphase der Zwischenphase aus der Trennvorrichtung anhand der kontinuierlich gemessenen Leitfähigkeit und/oder Trübung mindestens einer der Phasen in Schritt e.; und g. Gewinnen der Phase mit dem Zielprodukt.
Die Trübung kann mit einem oder mehreren Trübungsmessgeräten, die in die Trennvorrichtung hineinragen in Form von einer, zwei, drei oder mehr Trübungssonden gemessen werden.
Beispielweise kann das kontinuierliche Messen der Trübung in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung mit einem oder mehreren Trübungmessgeräten in Form von einer, zwei, drei oder mehr Sonden durchgeführt wird, insbesondere zum kontinuierlichen Messen der Trübung der schwe- ren Phase mindestens eine Sonde und zum kontinuierlichen Messen der Trübung der leichten Phase mindestens eine Sonde an geeigneter Position in der Trennvorrichtung eingesetzt wird.
Die Trübung wird auf optischem Wege gemessen und kann mit Durchlichtmessung oder Streulichtmessung durchgeführt werden. Erfindungsgemäß erfolgt bevorzugt eine Durchlichtmessung.
Die Messung der Trübung erfolgt vorliegend in der Einheit FAU (Formazin Attenuation Units). Es sind aber auch andere Einheiten für die Trübung bekannt geworden (NTU, FTU), die verwendet werden könnten. Als Faustregel kann man angeben, dass der Unterschied der gemessenen Trübungswerte bevorzugt etwa 100 FAU zwischen den verschiedenen Phasen beträgt, um die verschiedenen Phasen voneinander unterscheiden zu können. In Einzelfällen sind jedoch auch niedrigere Werte möglich.
In der vorliegenden Offenbarung sollen sämtliche Ausführungen auch für die alternative oder zusätzliche Messung der Trübung gelten. Mit anderen Worten kann der Begriff .elektrische Leitfähigkeit' oder vergleichbare Begriffe in der Gesamtoffenbarung jeweils durch den Begriff .Trübung' ersetzt werden oder mit dem Begriff .Trübung' ergänzt werden. „Alternativ oder zusätzlich“ bedeutet, dass die elektrische Leitfähigkeit und/oder die Trübung gemessen werden.
Erfindungsgemäß kann in einer Trennvorrichtung nur die elektrische Leitfähigkeit oder auch nur die Trübung gemessen werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass eine Kombination aus Messung der elektrischen Leitfähigkeit und Messung der Trübung in einer Trennvorrichtung erfindungsgemäß eingesetzt wird.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen im Einzelnen erläutert und veranschaulicht, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken. Hierbei wird detailliert auf verschiedene Ausführungsformen der Offenbarung Bezug genommen, die in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht sind. Wo immer möglich, werden die gleichen oder ähnliche Bezugszeichen und Symbole durchweg in den Zeichnungen verwendet, um auf gleiche oder ähnliche Teile zu verweisen. Die verschiedenen in der Zeichnung dargestellten Elemente sind nur repräsentativ und nicht notwendigerweise im Maßstab gezeichnet. Die Zeichnungen sollen nur beispielhaft Ausführungsformen der Offenbarung der Erfindung veranschaulichen, und ein Fachmann im Stand der Technik wird ohne weiteres erkennen, wo die Zeichnungen vereinfacht wurden, um die Schlüsselaspekte der Offenbarung zu veranschaulichen.
In Figur 1 ist eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung 10, die den Verlauf einer Extraktion einer Charge (Batch- Extraktion) zu 3 Zeitpunkten der Trennung mit einer Sonde 60 zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen, aufgetragen über die Zeit, darstellt. Im gezeigten Beispiel ist die Trennvorrichtung 10 ein Rührkessel. Dieser kann jede geeignete Form und Größe aufweisen und aus einem geeigneten Material aufgebaut sein. Beispielweise kann auch ein Single-Use-Bag-Gefäß eingesetzt werden. Die Trennvorrichtung 10 umfasst einen Rührer, hier eine Rührwelle mit einem Propeller-Rührer 15, der durch einen Motor 25 angetrieben wird. Andere Rührvorrichtungen sind möglich oder können auch je nach Anwendungsfall weggelassen werden. Die Herstellung und Durchmischung des wässrigen Zwei- Phasen-Systems (ATPS) kann in dieser Trennvorrichtung 10 oder auch außerhalb der Trennvorrichtung 10 erfolgen und das erhaltene wässrige Zwei-Phasen-System (ATPS) kann dann in die Trennvorrichtung 10 überführt werden. Ein Auslass 50 befindet sich am Boden der Trennvorrichtung 10. Im Auslass 50 ist eine Sonde 60 angebracht, die die elektrische Leitfähigkeit der vorbeiströmenden Flüssigkeit misst. Im Schaubild unter den 3 Trennvorrichtungen ist die von der Sonde 60 kontinuierlich gemessene elektrische Leitfähigkeit in [mS/cm] der jeweiligen Phasen über die Zeit in [s] aufgetragen.
Die Trennvorrichtung 10 in der linken Abbildung von Figur 1 ist bereits mit allen 3 Phasen befüllt. Es wurde demnach bereits eine Ausgangslösung bereitgestellt (Schritt a.), diese in der Trennvorrichtung 10 durch Zugeben mindestens eines Polymers und mindestens eines Salzes, oder mindestens zweier Polymere, jeweils in geeigneter Konzentration, in ein wässriges Zwei-Phasen-System überführt (Schritt b.) und mit Hilfe des Rührers 15 entsprechend durchmischt (Schritt c.). Im gezeigten Beispielfall ist das Zielprodukt ein Protein, das sich in der leichten Phase anreichert, insbesondere im Wesentlichen in dieser vorliegt. Die nach dem anschließenden Entmischen lassen der Phasen erhaltenen Phasen (Schritt d.) sind in der linken Abbildung von Figur 1 veranschaulicht. Die oberste Phase 20 ist die leichte Phase, die das Protein enthält, die Zwischenphase 30 und die untere schwere Phase 40 enthalten unerwünschte Komponenten in Form von Verunreinigungen und dergleichen.
Die drei gezeigten Abbildungen von Figur 1 veranschaulichen den Verlauf der wässrigen Zwei- Phasen-Extraktion eines beispielhaften Proteins (Schritte e., f. und g.) in einem exemplarischen wässrigen Zwei-Phasen-System für eine diskontinuierliche bzw. chargenweise Extraktion in drei Stufen:
Die linke Abbildung zeigt alle drei Phasen 20, 30, 40 in der Trennvorrichtung 10 nach erfolgter Entmischung der Phasen, wobei die schwere Phase 40 aus dem Auslass 50 ausgelassen wird. Das Schaubild unterhalb der 3 Trennvorrichtungen 10 zeigt die elektrischen Leitfähigkeitswerte, gemessen durch die Sonde 60 im Verlauf der Extraktion. Für die Trennvorrichtung 10 in der linken Abbildung zeigt das Schaubild eine mit der Sonde 60 gemessene hohe elektrische Leitfähigkeit für die schwere Phase 40 an, die praktisch über die gesamte Zeit, in der die schwere Phase 40 aus der Trennvorrichtung abgelassen wird, konstant bleibt. Die schwere Phase 40 kann daher eindeutig über ihre elektrische Leitfähigkeit zugeordnet werden und so von den anderen Phasen 30, 20 unterschieden und so exakt abgetrennt werden.
In der mittleren Abbildung von Figur 1 wurde die schwere Phase 40 bereits abgetrennt und es wird nun die Zwischenphase 30 aus dem Auslass 50 abgelassen. Das untere Schaubild zeigt nun eine mittlere elektrische Leitfähigkeit für die Zwischenphase 30. Auch bei Ablassen der Zwischenphase 30 aus der Trennvorrichtung 10 ist die mit der Sonde 60 gemessene elektrische Leitfähigkeit über die Zeit nahezu konstant. Die Zwischenphase 30 zeigt andere elektrische Leitfähigkeiten als die leichte Phase 20 oder die schwere Phase 40, so dass anhand der kontinuierlich gemessenen Leitfähigkeit eine genaue Trennung der Phasen 20, 30, 40 voneinander erfolgen kann. In der rechten Abbildung von Figur 1 wurde die Zwischenphase 30 bereits abgetrennt und es bleibt nun noch die leichte Phase 20 in der Trennvorrichtung 10, die das Zielprotein enthält. Ein Ablassen der leichten Phase 20 aus dem Auslass 50 zeigt im unteren Schaubild auf der rechten Seite eine mit der Sonde 60 gemessene niedrige elektrische Leitfähigkeit für die leichte Phase 20 an, die während des gesamten Auslaufen lassens der leichten Phase 20 aus dem Auslass 50 nahezu konstant bleibt. Man gewinnt dadurch das Zielprotein in der leichten Phase 20 ohne die Verunreinigungen.
Das getrennte Ablassen der Phasen kann daher anhand der Messung der elektrischen Leitfähigkeit gesteuert werden: In diesem Beispielfall, bei dem sich das Zielprodukt in der leichten Phase 20 befindet, werden zuerst die schwere Phase 40 und die Zwischenphase 30 abgelassen und gegebenenfalls verworfen. Sobald die Leitfähigkeit nach Ablassen der Zwischenphase 30 unter einen bestimmten Schwellenwert (Sollwert-Bereich) fällt, wird beispielsweise automatisch ein Ventil, das unterhalb bzw. nach der Sonde 60 vorgesehen wird (nicht gezeigt), sofort geschlossen. Am unteren Auslass 50 kann nach bzw. unterhalb des Ventils eine Leitung zu einem Auffanggefäß oder dergleichen für die leichte Phase 20 angeschlossen, das Ventil wieder geöffnet und die leichte Phase 20 so gewonnen werden. Alternativ kann mittels eines Ventils der Fluss aus der Trennvorrichtung 10 von einer Leitung, durch die die schwere Phase 40 und die Zwischenphase 30 abgeleitet werden, zu einer anderen Leitung umgeschaltet werden, die zu einem Auffanggefäß oder dergleichen für die leichte Phase 20 führt. Diese Leitung kann die leichte Phase 20 auch unmittelbar zur weiteren Aufarbeitung führen, die dann kontinuierlich, chargenweise bzw. diskontinuierlich erfolgen kann.
Für eine diskontinuierliche bzw. chargenweise Extraktion in einer Trennvorrichtung 10 gemäß Figur 1 ist daher eine Phasendetektion mit nur einer einzelnen Sonde 60 möglich, wobei hierdurch eine Phasentrennung während der Entleerung der Trennvorrichtung 10, basierend auf der kontinuierlich gemessenen elektrischen Leitfähigkeit, durchgeführt werden kann.
Figur 2 zeigt eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung 100, die eine kontinuierliche Extraktion mit zwei Sonden (160.1 , 160.2) zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen darstellt.
Es wurde bereits eine Ausgangslösung bereitgestellt (Schritt a.). Im gezeigten Beispielfall handelt es sich bei der Ausgangslösung um eine Zellkultur. Diese wurde bereits durch Zugeben mindestens eines Polymers und mindestens eines Salzes, oder durch Zugeben mindestens zweier Polymere, jeweils in geeigneter Konzentration, in ein wässriges Zwei-Phasen-System überführt (Schritt b.) und entsprechend durchmischt (Schritt c.). Das zu reinigende und anzureichernde Zielprodukt kann ein Protein, eine Nukleinsäure oder ein Virus sein. Im gezeigten Beispielfall ist das Zielprodukt ein Protein, das sich zum Großteil in der leichten Phase befindet. Es kann aber auch ein Protein oder eine Nukleinsäure gereinigt und angereichert werden, das/die sich nach dem Durchmischen und Entmischen der Phasen beispielweise in der schweren Phase anreichert, insbesondere im Wesentlichen in der schweren Phase vorliegt. In der gezeigten beispielhaften Ausführungsform der Erfindung wird das durchmischte, wässrige Zwei- Phasen-System, enthaltend das Zielprotein, in die Trennvorrichtung 100 überführt. In der Trennvorrichtung werden die Phasen dann entmischt (Schritt d.). Es resultiert eine obere leichte Phase 120, in der sich das Zielprodukt angereichert hat, insbesondere im Wesentlichen in dieser vorliegt, beispielweise in Form eines Proteins, eine Zwischenphase 130 und eine untere schwere Phase 140, in der sich die unerwünschten Komponenten angereichert haben, insbesondere diese im Wesentlichen aufweisen.
Die Trennvorrichtung 100 kann eine beliebige Form und Größe haben, um die Phasentrennung durchzuführen. In der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform ist die Trennvorrichtung 100 eine Art auf der Seite liegender Abscheider, der drei Auslässe 150.1 , 150.2 und 150.3 aufweist. Andere Formen für die Trennvorrichtung 100 sind möglich.
In der Trennvorrichtung 100 sind zwei Sonden 160.1 und 160.2 vorgesehen, um die elektrische Leitfähigkeit jeweils einer Phase zu messen. Die Sonde 160.1 taucht in die schwere Phase 140 ein und misst daher die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase 140 in dieser Position. Die Sonde 160.2 taucht in die leichte Phase 120 ein und misst daher die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase 120 in dieser Position. Die Sonden 160.1 und 160.2 befinden sich jeweils in Einführöffnungen 157.1 und 157.2, die derart axial in der Wand 155 der Trennvorrichtung 100 angeordnet sind, so dass eine axiale Anordnung resultiert. Die Einführöffnungen 157.1 und 157.2 und damit auch die darin vorliegenden Sonden 160.1 und 160.2 sind in der Wand 155 der Trennvorrichtung 100 so angeordnet, dass diese auf einer geraden Verbindungslinie liegen. In Figur 2 verläuft die gerade Verbindungslinie in der Wand 155 der Trennvorrichtung 100. Andere Ausführungsformen sind ebenfalls möglich.
Die mit den Sonden 160.1 und 160.2 gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten werden in einem Schaubild 200 oberhalb von Figur 2 schematisch dargestellt. So misst die Sonde 160.1 kontinuierlich die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase 140, die in der Kurve 140a angegeben wird. Die Sonde 160.2 misst kontinuierlich die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase 120, die in der Kurve 120a angegeben wird.
Die Kurven 120a und 140a in Schaubild 200 zeigen nahezu konstante Werte für die elektrische Leitfähigkeit im Verlauf der Zeit, d.h. die beiden Sonden 160.1 und 160.2 befinden sich jeweils in den Phasen, die eindeutig über ihre elektrischen Leitfähigkeiten zugeordnet werden können.
Neben den gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten im linken Diagramm des Schaubilds 200 wird im rechten Diagramm die gemessene Trübung der Phasen, aufgetragen gegen die Zeit, dargestellt. Die Trübung wird mit einem Trübungssensor in Formazin Attenuation Units (FAU) gemessen. Die Kurve 140b zeigt eine hohe Trübung der schweren Phase 140, da die schwere Phase 140 aus einer Zellkultur stammt und daher Komponenten enthält, die die starke Trübung bewirken. Die leichte Phase 120b weist eine geringe Trübung auf. Eine Phasentrennung ist aufgrund der hohen Trübung daher durch die im Stand der Technik geschilderten Messgeräte praktisch nicht möglich.
Die Trennvorrichtung 100 ist für eine kontinuierliche Betriebsweise ausgelegt. Es kann daher in stetem Fluss (kontinuierlich) die zu trennende Lösung 110 (= das wässrige Zwei-Phasen-System (ATPS)) zugeführt und die voneinander getrennten Phasen 120, 130 und 140 können jeweils kontinuierlich abgeführt werden. Der obere Auslass 150.2 dient zum Entnehmen der leichten Phase 120, der untere Auslass 150.1 bzw. 150.3 zum Entnehmen der schweren Phase 140 und auch der Zwischenphase 130. Das Zielprodukt befindet sich hier in der leichten Phase 120.
Gemäß dieser beispielhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Tauchrohr 180 als zusätzlicher Auslass vorgesehen. Es ist im gezeigten Ausführungsbeispiel aus einem Außenrohr in Form eines Hüllrohrs oder Überrohrs 183 und einem Innenrohr 181 aufgebaut. Im Innenrohr 181 befindet sich eine Öffnung 182.
Das Überrohr 183 weist ein oberes Ende oberhalb der Trennvorrichtung 100 auf und reicht mit seinem unteren Ende 183a in die Phase hinein, die entnommen werden soll, hier: die schwere Phase 140. Das Überrohr 183 ist in der gezeigten Ausführungsform beispielsweise nicht beweglich, das Innenrohr 181 aber schon. Das Überrohr 183 könnte aber auch beweglich ausgestaltet sein.
In der gezeigten Ausführungsform von Figur 2 ist gezeigt, dass der Durchmesser des Überrohrs 183 größer ist als der Durchmesser des Innenrohrs 181 , so dass das Überrohr 183 das Innenrohr 181 umgibt und zwar nur in einem oberen Abschnitt des Innenrohrs 181. In diesem oberen Abschnitt des Innenrohrs 181 befindet sich die Öffnung 182, so dass sich das Überrohr über die Öffnung 182 hinaus erstreckt. Das Überrohr 183 umgibt das höhenverstellbare Innenrohr 181 daher nur in einem oberen Abschnitt, wobei die Länge des Überrohrs 183 derart ausgewählt wird, dass das Überrohr 183 über die Öffnung 182 des Innenrohrs 181 hinausragt.
Hierdurch wird die Öffnung 182 des Innenrohrs 181 vor einem direkten Flüssigkeitszutritt, hier die schwere Phase 140, aus der Trennvorrichtung 100 abgeschirmt. Das Innenrohr 181 ist nur im oberen Abschnitt vom Überrohr 183 umgeben, dort wo sich die Öffnung 182 befindet, aber nicht im unteren Abschnitt des Innenrohrs 181 , so dass das Innenrohr 181 teilweise in der schweren Phase 140 freiliegt.
Das Überrohr 183 und das Innenrohr 181 bilden einen Zwischenraum aus, in den die Flüssigkeit der Phase, in die das untere Ende 183a des Überrohrs 183 eintaucht, hochsteigt (nicht gezeigt) und dann durch die Öffnung 182 im Innenrohr 181 austreten kann. Hierdurch wird das Herauf- und Herunterbewegen der Öffnung 182 im Innenrohr 181 kann wie folgt verdeutlicht werden: Die Öffnung 182 kann durch Herauf- und Herunterbewegen so positioniert werden, dass die im Zwischenraum hochsteigende Phasenflüssigkeit abfließen kann. Wird die Öffnung 182 höher positioniert, kann die Phasenflüssigkeit nicht mehr durch die Öffnung 182 abfließen und das Tauchrohr 180 ist außer Funktion. Zudem entscheidet die Position der Öffnung 182 aufgrund des hydroststischen Drucks wie schnell die Phasenflüssigkeit ausströmt.
Die Phasenflüssigkeit (hier: schwere Phase 140) muss daher zunächst in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr 183 strömen, bevor diese zur Öffnung 182 im Innenrohr 181 gelangt (durchgezogene Pfeile in Figur 2, die zur Öffnung 182 zeigen) und durch diese dann ausströmen kann (gepunkteter Pfeil im Innenrohr 181 in Figur 2).
Das Vorliegen eines Überrohrs 183, dessen Ende 183a sich in der zu entnehmenden Phase 140 befindet, ist vorteilhaft. Die Öffnung 182 im Innenrohr 181 wird vom Überrohr 183 abgeschirmt und geschützt. Die zu entnehmende Phase 140 steigt in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr 183 auf und gelangt erst dann zur Öffnung 182. Ein direkter Zutritt der Flüssigkeit zur Öffnung 182 wird dadurch verhindert. Das Überrohr 183 erhöht damit die Sicherheit, dass wirklich nur die gewünschte Phase 140 ausströmen kann.
Beispielweise kann auch die Länge des Überrohrs 183 und dessen Durchmesser, d.h. insbesondere die Größe des Zwischenraums zwischen Innenrohr 181 und Überrohr 183, derart gewählt werden, dass der Zutritt von Schwebstoffen, Flocken und anderen festen und halbfesten Bestandteilen zur Öffnung 182 verhindert werden kann, damit kein Verstopfen der Öffnung 182 oder des Innenrohrs 181 auftritt.
Der Fachmann kann die Dimensionen des Überrohrs 183 in einfacher Weise entsprechend auswählen und einstellen.
Andere Ausführungen des Tauchrohrs 180 sind ebenfalls möglich.
Das Innenrohr 181 des Tauchrohrs 180 ist mit dem Auslass 150.1 in flüssigkeitsdichter Weise verbunden, wobei das Innenrohr 181 jedoch bewegbar bleibt. Das Tauchrohr 180 ist damit nach wie vor höhenverstellbar. Die Höhenverstellbarkeit oder Höhenveränderung wird durch den Pfeil 189 in Figur 2 dargestellt und durch den Motor 125, beispielweise einen Schrittmotor, erreicht, der die Höhenverstellung des Tauchrohrs 180 in der Trennvorrichtung 100 vornimmt. Die Höhenverstellbarkeit bezieht sich im gezeigten Beispielfall nur auf das Innenrohr 181 , genauer gesagt die Öffnung 182 im Innenrohr 181 , die je nach Bedarf, herauf- und heruntergefahren werden kann. Die schwere Phase 140 dringt in den Zwischenraum zwischen Überrohr 183 und Innenrohr 181 ein, steigt in diesem hoch und zwar bis zur öffnung 182 im Innenrohr 181 , wo die Flüssigkeit dann aus der Trennvorrichtung 100 in den Auslass 150.1 abfließen kann. Die Pfeile bei der Öffnung 182 symbolisieren das Fließen der schweren Phase 140 in diesen Zwischenraum hinein bis hin zur öffnung 182 und der gepunktete Pfeil im Innenrohr 181 symbolisiert das Abfließen dieser schweren Phase 140 durch das Innenrohr 181 nach unten und zum Auslass 150.1 hinaus. Das Innenrohr 181 ist daher mit dem Auslass 150.1 direkt verbunden. Andere Ausführungsformen sind ebenfalls möglich. Das Abfließen der schweren Phase 140 erfolgt in der gezeigten Ausführungsform nur mit Hilfe der Schwerkraft.
In der dargestellten Ausführungsform befindet sich das Ende 183a des Überrohrs 183 in der schweren Phase 140, so dass nur die schwere Phase 140 in den Zwischenraum eintritt und aus der Öffnung 182 abfließen kann.
In Figur 2 ist die Sonde 160.2 für die leichte Phase 120 in der Trennvorrichtung 100 tiefer angeordnet als der obere Auslass 150.2. Dies ist zweckmäßig, damit zuerst die elektrische Leitfähigkeit gemessen und bestätigt wird, dass nur leichte Phase 120 vorliegt und dann erst die leichte Phase 120 aus dem oberen Auslass 150.2 austritt.
Die Sonde 160.1 für die schwere Phase 140 ist in Figur 2 tiefer angeordnet als das untere Ende 183a des Überrohrs 183. Es kann jedoch auch vorteilhaft sein, wenn die Sonde 160.1 in der schweren Phase 140 höher liegt als das untere Ende 183a des Überrohrs 183. Damit kann man ein zu starkes Absinken der leichten Phase 120 und/oder Zwischenphase 130 mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr 183 hochsteigen und über die Öffnung 182 des Tauchrohrs 180 abfließen.
In dem beschriebenen kontinuierlichen Extraktionsverfahren gemäß Figur 2 dient das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeiten der Phasen 120 und 140 gemäß Schritt e. des erfindungsgemäßen Verfahrens dazu, das höhenverstellbare Tauchrohr 180 derart anzusteuern und dessen Höhe bzw. Eintauchtiefe und gegebenenfalls auch die Dauer der Entnahme in Abhängigkeit von der Lage der Phasen bzw. deren Phasengrenzflächen so zu regulieren, dass durch die im Tauchrohr 180 vorhandene Öffnung 182 die schwere Phase 140 abfließen kann. Ein Regler 135 dient dazu die Höhenverstellung des Tauchrohrs 180 automatisch in Abhängigkeit von den gemessenen Werten für die elektrische Leitfähigkeit zu steuern.
Die Regelung des höhenverstellbaren Tauchrohrs 180 funktioniert wie folgt: Den jeweiligen Sonden 160.1 und 160.2 werden jeweils Sollwert-Bereiche für die elektrischen Leitfähigkeiten der Phasen zugeordnet, die sich aus dem verwendeten wässrigen Zwei-Phasen-System ergeben. Wie aus obiger Tabelle 1 ersichtlich, weist beispielweise ein wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem für die leichte Phase elektrische Leitfähigkeiten im Bereich von 10-25 mS/cm, für die Zwischenphase: 40-50 mS/cm und für die schwere Phase: 60-80 mS/cm auf. Diese Sollwert-Bereiche dienen zur Bestimmung und Kontrolle, wo sich die einzelnen Phasen in der Trennvorrichtung 100 im Hinblick auf das Ende 183a des Überrohrs 183 befinden.
Das Innenrohr 181 des Tauchrohrs 183 ist mit dem unteren Auslass 150.1 in der Trennvorrichtung 100 verbunden, um schwere Phase 140 abfließen zu lassen. Im kontinuierlichen Betrieb kann nun in Figur 2 die schwere Phase 140 mit dem Tauchrohr 180 kontinuierlich entnommen werden. Da sich das Ende 183a des Überrohrs 183 in der schweren Phase 140 befindet, steigt die schwere Phase 140 in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr 183 auf. In der gezeigten Ausführungsform von Figur 2 befindet sich im Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr 183 im kontinuierlichen Betrieb daher immer nur schwere Phase 140. Dadurch fließt über die Öffnung 182 des Innenrohrs 181 im kontinuierlichen Betrieb kontinuierlich schwere Phase 140 ab und verlässt die Trennvorrichtung 100 durch den Auslass 150.1 . Gleichzeitig strömt die wässrige Zwei-Phasen-System (ATPS) 110 kontinuierlich in die Trennvorrichtung 100 und die leichte Phase 120 kontinuierlich über den oberen Auslass 150.2 aus der Trennvorrichtung 100 hinaus.
Im Idealfall liegt ein Gleichgewicht zwischen der Menge an einfließender Flüssigkeit (wässrigem Zwei- Phasen-System) und der Menge an ausströmenden Flüssigkeiten (schwere Phase 140 fließt über das Tauchrohr 180 ab und leichte Phase fließt über den Auslass 150.2 ab) vor. Das System läuft kontinuierlich.
Wenn sich während des kontinuierlichen Betriebs die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 nach oben oder nach unten verschiebt, was regelmäßig der Fall ist, kann das Innenrohr 181 des Tauchrohres 180 und damit die Öffnung 182 verstellt werden, wodurch die Entnahmegeschwindigkeit der schweren Phase 140 aus der Trennvorrichtung 100 gesteuert werden kann:
Wenn die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 absinkt, nimmt der Wert für die elektrische Leitfähigkeit der Sonde 160.1 der schweren Phase 140 ab. Die Öffnung 182 des Innenrohrs 181 wird nach oben bewegt. Es liegt dann ein niedrigerer hydrostatischer Druck vor und die Entnahmegeschwindigkeit der schweren Phase 140 nimmt ab.
Alternativ könnte auch das Entnehmen der schweren Phase 140 mit dem Tauchrohr 180 ganz gestoppt werden, beispielsweise indem die Öffnung 182 über den Flüssigkeitspiegel in der Trennvorrichtung 100 gestellt wird. Dann würde sich die schwere Phase 140 wieder ansammeln und die Phasen- grenzfläche(n)/Zwischenphase 130 steigt wieder an. Dann könnte die Öffnung 182 des Innenrohrs
181 wieder auf seine ursprüngliche Position gesetzt werden, wenn der Wert der elektrischen Leitfähigkeit an der Sonde 160.1 für die schwere Phase 140 wieder im Sollwert-Bereich liegt und den zu erwartenden Leitfähigkeitswert für die schwere Phase 140 anzeigt.
Wenn die Sonde 160.2 für die leichte Phase 120 einen erhöhten Wert für die elektrische Leitfähigkeit detektiert, kann die Öffnung 182 des Innenrohrs 181 nach unten verschoben werden. Es resultiert ein höherer hydrostatischer Druck. Die Entnahmegeschwindigkeit der schweren Phase 140 wird größer. Dadurch sinkt die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 wieder ab. Danach kann die Öffnung
182 wieder auf die ursprüngliche Position gesetzt werden.
Zum Beibehalten des Gleichgewichts erfolgt daher ein ständiges Herauf- und Herunterbewegen des Tauchrohrs 180 (genauer gesagt des Innenrohrs 181) während des kontinuierlichen Betriebs, was einer typischen Zick-Zack-Bewegung entspricht. Das Tauchrohr 180 wird kontinuierlich eingesetzt. Vorteilhafterweise wird die Öffnung 182 des Innenrohrs 181 nur innerhalb des Überrohrs 183 herauf- und herunterbewegt, um den Zulaufschutz des Überrohrs 183 auszunutzen.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Tauchrohr 180 auch diskontinuierlich eingesetzt werden. Beispielsweise kann im kontinuierlichen Betrieb ein Gleichgewicht dadurch hergestellt werden, dass leichte Phase 120 aus dem oberen Auslass 150.2 und schwere Phase 140 aus dem Auslass 150.3 kontinuierlich ausfließen.
Wenn hier jetzt eine Störung des Gleichgewichts auftritt, kann das Tauchrohr 180 zum Einsatz kommen, um die Störungen auszugleichen. Das Tauchrohr 180 kann hierbei mit oder ohne Überrohr 183 vorliegen.
In diesem Beispielfall wird durch das Tauchrohr 180 nicht kontinuierlich eine Phase entnommen, sondern nur im Störfall. Das Tauchrohr 180 ist wieder mit dem Auslass 150.1 am Boden der Trennvorrichtung 100 verbunden.
Wenn die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 steigt, wird das Tauchrohr 180 von der Ausgangstellung, beispielweise über dem Flüssigkeitsspiegel der leichten Phase 120 oder oberhalb des Flüssigkeitsspiegels im Zwischenraum, beispielsweise in die schwere Phase 140 bewegt, so dass diese zusätzlich zum Auslaufen aus dem Auslass 150.3 auch aus der Öffnung 182 im Tauchrohr 180 auslaufen kann. Damit steigt insgesamt die Ausflussmenge und -geschwindigkeit der schweren Phase 140 aus der Trennvorrichtung 100 und die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 sinkt wieder ab. Dann kann die Öffnung 182 des Tauchrohrs 180 wieder in die Ausgangsposition, beispielsweise oberhalb des Spiegels der leichten Phase 120 oder einfach oberhalb des Flüssigkeitsspiegels im Zwischenraum hinaufgefahren werden.
Damit die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 sinkt, kann das Tauchrohr 180 auch nur in der schweren Phase 140 nach oben bewegt werden und es fließt dann weniger schwere Phase 130 aus und die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 steigt wieder an.
Wenn für das Tauchrohr 180 ein Überrohr 183 verwendet wird, kann das Überrohr 183 hinsichtlich seiner Länge variabel sein oder nicht. Wenn die Länge des Überrohrs 183 im Betrieb nicht variabel ist, so ist es zweckmäßig die geeignete Länge des Überrohrs 183 vor Beginn der Extraktion auszuwählen. Je nach der gewünschten Ausführungsform, kann das Überrohr 183 dann in der passenden Größe ausgewählt und so dimensioniert werden, dass dieses in die betreffende Phase hineinreicht. Wenn ein in der Länge variables Überrohr 183 zum Einsatz kommt, kann dessen Länge während des Betriebs in geeigneter Weise geändert werden. Der Fachmann kann dies ohne weiteres umsetzen.
Das Überrohr 183 verhindert insbesondere den Zutritt von unerwünschter Phase(n) (hier: Zwischenphase 130 und/oder leichte Phase 120), sofern die Phasengrenzfläche(n) nicht zu weit ab- sinkt(absinken). Das Tauchrohr 180 dient daher im kontinuierlichen Betrieb der Trennvorrichtung 100 entweder auf kontinuierliche oder diskontinuierliche Weise zur Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen zugeführten und abgeführten Phasen.
Im gezeigten Beispielfall von Figur 2 dient das höhenverstellbare Tauchrohr 180 mit sich von oben nach unten erstreckendem Überrohr 183 daher als Auslass für die schwere Phase 140.
Das Zielprodukt, hier: ein Protein, wird in der gezeigten Ausführungsform von Figur 2 in der leichten Phase 120 erhalten, die durch den Auslass 150.2 entnommen wird (Schritt g. des Verfahrens).
In einer alternativen Ausführungsform zu Figur 2 könnte das Überrohr 183 anstatt von oben nach unten auch von unten nach oben reichen (nicht gezeigt) und dann bis in der leichte Phase 120 reichen, wobei alle anderen Bauteile in Figur 2 identisch übernommen werden könnten.
In dieser Ausführungsform würde das Tauchrohr als Auslass für die leichte Phase 120 dienen. Die leichte Phase 120 fließt dabei zunächst in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr und die Zwischenphase füllt sich von unten nach oben nur mit leichter Phase 120 bis diese bei der Öffnung 182 im Innenrohr 181 ankommt und dort dann in den Auslass 150.1 abfließen kann.
In dieser Ausführungsform (nicht gezeigt) wäre es zweckmäßig, wenn die Sonde 160.2 in der leichten Phase 120 tiefer als das obere Ende des sich von unten nach oben erstreckenden Überrohrs angeordnet würde. Damit könnte man ein zu hohes Ansteigen der schweren Phase 140 (untere Phase) und/oder gegebenenfalls der Zwischenphase 130 mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 181 und Überrohr hineinfließen und bis zur Öffnung 182 des Tauchrohrs gelangen könnten.
Ein sich von unten nach oben erstreckendes Überrohr (nicht gezeigt) würde den Zutritt von unerwünschter Phase (hier: Zwischenphase und/oder schwere Phase), sofern die Phasengrenzfläche(n) nicht zu weit ansteigt(ansteigen) verhindern.
Die obigen Ausführungen zu Figur 2 gelten in dieser Ausführungsform mit sich von unten nach oben erstreckendem Überrohr daher analog.
In Figur 3 ist eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer weiteren beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung 100, die eine kontinuierliche Extraktion mit zwei Sonden (160.1 , 160.2) zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen zu einem anderen Zeitpunkt als Figur 2 darstellt.
In Figur 3 ist dargestellt, wie durch gezieltes Erhöhen bzw. Anheben der Phasengrenzflächenposition in der Trennvorrichtung 100 ein Großteil der leichten Phase 120, welche ansonsten in der Trennvor- richtung 100 stehen bleiben würde, zurückgewonnen werden kann. Um eine möglichst vollständige Rückgewinnung der leichten Phase 120 zu ermöglichen, wird die verbliebene leichte Phase 120 durch Spülen (engl. Flush) mit einer Spüllösung 115, beispielweise durch einen Anteil des verwendeten wässrigen Zwei-Phasen-Systems, nach oben verdrängt.
Das gezielte Erhöhen bzw. Anheben des Flüssigkeitsspiegels in der Trennvorrichtung 100 wird beispielweise dadurch erreicht, dass zur Trennvorrichtung 100 mehr schwere Phase 140 zugegeben wird, so dass die leichte Phase 120 nach oben gedrückt und so durch den Auslass 150.2 in einfacher Weise entnommen werden kann. Das Verdrängen der leichten Phase 120 kann in einer kontinuierlichen Extraktion auch dadurch erreicht werden, dass das Tauchrohr 180 hochgefahren wird, dadurch keine schwere Phase 140 mehr entnommen wird und sich diese in der Trennvorrichtung 100 aufstaut und dadurch die leichte Phase 120 nach oben verdrängt.
Analog zu obigen Vorgehensweisen könnte auch schwere Phase 140 nach unten verdrängt werden.
Die Verschiebung der Phasengrenzfläche, sofern keine Zwischenphase vorliegt oder - wie im gezeigten Beispielfall - wenn eine Zwischenphase vorliegt, die Verschiebung der gesamten Zwischenphase 130 und schweren Phase 140 in der Trennvorrichtung 100 nach oben, wird wieder anhand der kontinuierlich gemessenen Werte für die elektrische Leitfähigkeit durch die 2 Sonden 160.1 und 160.2 überwacht.
Alternativ kann es auch zweckmäßig sein, gezielt die Phasengrenzfläche zwischen oberer und unterer Phase oder auch eine etwaig vorliegende Zwischenphase (und damit auch die beiden Phasen) nach unten zu verschieben. Dies gelingt beispielweise, wie bereits erläutert, durch gezieltes Ablassen bzw. Entnehmen der entsprechenden Phase(n).
In Figur 3 sind Einführöffnungen 157.1 und 157.2 in der Wand 155 der Trennvorrichtung 100 vorgesehen, wobei die Sonde 160.1 in der Einführöffnung 157.1 und die Sonde 160.2 in der Einführöffnung 157.2 vorliegen. Dabei sind die Einführöffnungen 157.1 und 157.2 und damit auch die Sonden 160.1 und 160.2 in der Wand 155 der Trennvorrichtung axial angeordnet, d.h. die Einführöffnungen 157.1 und 157.2 sind in der Wand 155 der Trennvorrichtung 100 so angeordnet, dass diese auf einer geraden Verbindungslinie liegen. In Figur 3 verläuft die gerade Verbindungslinie in der Wand 155 der Trennvorrichtung 100.
Die gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten werden im Schaubild 202 oberhalb von Figur 3 schematisch gezeigt. Man ersieht hieraus den Verlauf der kontinuierlichen Extraktion, wobei die Kurve für die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase 120c zunächst konstant bleibt bis die Sonde 160.2 auf die Zwischenphase 130, gezeigt mit der Kurve 130c, trifft. Die Sonde 160.1 erfasst mit der Kurve 140c die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase 140, die konstant bleibt. Kurve 140d und 120d zeigen wieder die Trübung von schwerer Phase 140 und leichter Phase 120. Figur 4 zeigt eine schematische Seitenansicht im Schnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung 100, die eine kontinuierliche Extraktion mit zwei Sonden (160.1 160.2) zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen darstellt.
In der gezeigten weiteren beispielhaften Ausführungsform der Erfindung von Figur 4 ist das Tauchrohr 190 in einer anderen Variante als in den Figuren 2 und 3 abgebildet. Das Tauchrohr 190 weist in dieser Ausführungsform eine Öffnung 192 am Ende des Innenrohrs 191 auf sowie ein Überrohr 193. Das Tauchrohr 190 ist anders als in den Figuren 2 und 3 nicht mit dem unteren Auslass 150.1 verbunden.
Das Überrohr 193 hat Vorteile, da es im gezeigten Beispielfall nur den Zutritt der schweren Phase 140 zur Öffnung 192 zulässt. Gemäß einer Ausführungsform kann das Überohr 193 möglichst weit nach unten, nahezu bis zum Boden der Trennvorrichtung 100 reichen, damit auch bei kurzzeitigem Absinken der Phasengrenzfläche(n) verhindert wird, dass in den Zwischenraum zwischen dem Überrohr 193 und dem Innenrohr 191 leichte Phase 120 und/oder Zwischenphase 130 gelangt. Das Ende 193a des Überrohres 193 befindet sich in der schweren Phase 140. Die Position der Öffnung 192 spielt dann nur noch für die Entnahmegeschwindigkeit eine Rolle.
Die Pfeile in Figur 4 symbolisieren wie die schwere Phase 140 erst in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 191 und Überrohr 193 strömt und dann in die Öffnung 192 gesaugt wird. Der gepunktete Pfeil im Innenrohr 191 des Tauchrohrs 190 zeigt die Fließrichtung der Flüssigkeit im Innenrohr 191 an, die zu einem oberen Auslass (nicht gezeigt) führt.
Im kontinuierlichen Betrieb läuft beispielsweise leichte Phase 120 am oberen Auslass 150.2 aus und die schwere Phase 140 wird durch das Tauchrohr 190 abgezogen, beispielweise durch eine Pumpe (nicht gezeigt) oder Anlegen von Unterdrück. Für ein Gleichgewicht wird die Pumpe bzw. der Unterdrück so eingestellt, dass die Summe der Ausflussmenge der leichten Phase 120 und der schweren Phase 140 und gegebenenfalls der Zwischenphase 130 genauso groß eingestellt wird wie die Menge des einströmenden Zwei-Phasen-Systems (ATPS) 110.
Kommt es nun zu Schwankungen und die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 sinkt beispielweise ab, dann kann die Pumpgeschwindigkeit leicht vermindert werden und weniger schwere Phase 140 wird abgezogen, bis die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 steigt, was durch einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit der Sonde 160.1 der schweren Phase 140 (= untere Sonde in Figur 4), der dann wieder im Sollwert-Bereich liegt, festgestellt werden kann. Dann wird beispielsweise wieder die ursprüngliche Pumpgeschwindigkeit/der ursprüngliche Unterdrück am Tauchrohr 190 angelegt.
Steigt die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 an, so kann die Pumpgeschwindigkeit bzw. der Unterdrück erhöht werden und mehr schwere Phase 140 wird abgezogen. Es sinkt die Phasengrenz- fläche(n)/Zwischen phase 130 wieder ab, bis die Sonde 160.2 für die leichte Phase 120 wieder die elektrische Leitfähigkeit im Sollwert-Bereich anzeigt. Die Pumpgeschwindigkeit bzw. der Unterdrück am Tauchrohr 190 kann dann beispielweise wieder auf Ausgangsgeschwindigkeit eingestellt werden. Die Pfeile in Figur 4 symbolisieren wie die schwere Phase 140 erst in den Zwischenraum strömt und dann zur Öffnung 192 hinausgesaugt wird. Der gepunktete Pfeil im Innenrohr 191 des Tauchrohrs 190 zeigt die Fließrichtung der Flüssigkeit im Innenrohr 191 an, die zu einem oberen Auslass (nicht gezeigt) führt.
Das Tauchrohr 190 arbeitet in diesem Fall kontinuierlich.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann das Tauchrohr 190 auch diskontinuierlich verwendet werden, um je nach Stand der Phasengrenzfläche(n) leichte Phase 120, Zwischenphase 130 oder schwere Phase 140 zeitweise abzuziehen. Dazu muss im Tauchrohr 190 kein Überrohr 193 vorliegen; dies ist aber möglich.
Beispielsweise fließt die leichte Phase 120 aus dem oberen Auslass 150.2 und die schwere Phase 140 über den unteren Auslass 150.1 kontinuierlich aus der Trennvorrichtung 100 aus. Das kontinuierliche Einströmen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems (ATPS) 110 in die Trennvorrichtung 100 hinein, kann auch eine Rolle für das Ausströmverhalten an den Auslässen 150.1 und 150.2 spielen. Die Öffnung 192 des Tauchrohres 190 taucht dann beispielweise in keine der Phasen ein.
Steigt die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 an (die Leitfähigkeitssonde 160.2 für die leichte Phase 120 zeigt eine höhere elektrische Leitfähigkeit an), so wird die Öffnung 192 des Tauchrohres 190 in die schwere Phase 140 verstellt (das Tauchrohr 190 wird heruntergefahren) und schwere Phase 140 kann zusätzlich abgepumpt/abgesaugt werden (beispielweise unter Verwendung einer Pumpe, die einen Unterdrück erzeugt), bis der Wert, den die Leitfähigkeitssonde 160.2 in der leichten Phase 120 misst, wieder im Sollwert-Bereich liegt. Dann kann das Tauchrohr 190 wieder in die Ausgangsposition gestellt und die Pumpe abgeschaltet werden.
Sinkt die Phasengrenzfläche(n)/Zwischenphase 130 ab (die Leitfähigkeitssonde 160.1 für die schwere Phase 140 zeigt eine geringere elektrische Leitfähigkeit an als für die schwere Phase 140) kann das Tauchrohr 190 in die leichte Phase 120 verstellt werden (das Tauchrohr wird hochgefahren und nachpositioniert) und leichte Phase 120 wird abgepumpt (beispielsweise abgesaugt mit Unterdrück, der durch eine Pumpe erzeugt wird) bis der Wert, den die Leitfähigkeitssonde 160.1 in der schweren Phase 140 misst, wieder im Sollwert-Bereich liegt. Das Tauchrohr 190 kann dann wieder in die Ausgangstellung zurückkehren und die Pumpe kann abgeschaltet werden. Alternativ muss das Tauchrohr 190 nach Beseitigung der Störung nicht immer in die Ausgangstellung. Es reicht hier auch aus, wenn die Pumpe abgeschaltet / der Unterdrück entfernt wird.
In der in Figur 4 gezeigten Ausführungsform wird daher ein Überrohr 193 eingesetzt, das von oben nach unten reicht. In einer zu Figur 4 analogen Ausführungsform könnte sich das Überrohr auch von unten nach oben erstrecken, wobei das Tauchrohr dann als Auslass für die leichte Phase 120 dienen könnte. Bis auf das Überrohr wäre Figur 4 dann identisch. Ein sich von unten nach oben erstreckendes Überrohr ist vorteilhaft, da nur leichte Phase 120 in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 191 und Überrohr hineinfließen würde und so ein Zutritt von Zwischenphase 130 oder schwerer Phase 140 zur Öffnung 192 im Innenrohr 191 erschwert würde.
Wenn gemäß dieser weiteren Ausführungsform (nicht gezeigt) das Überrohr sich von unten nach oben erstrecken würde und in die leichte Phase 120 reichen würde, um die leichte Phase 120 mit der Öffnung 192 im Innenrohr 191 zu entnehmen, so wäre es zweckmäßig, wenn die Sonde 160.2 in der leichten Phase 120 tiefer als das obere Ende des Überrohrs angeordnet würde. Damit könnte man ein zu hohes Ansteigen der schweren Phase 140 (untere Phase) und/oder gegebenenfalls der Zwischenphase mit den elektrischen Leitfähigkeitswerten erfassen, bevor diese in den Zwischenraum zwischen Innenrohr 191 und Überrohr hineinfließen und bis zur Öffnung 192 des Tauchrohrs gelangen könnten.
Ein sich von unten nach oben erstreckendes Überrohr (nicht gezeigt) würde daher den Zutritt von unerwünschter Phase (hier: Zwischenphase 130 und/oder schwere Phase 140), sofern die Phasengrenzfläche^) nicht zu weit ansteigt(ansteigen) verhindern.
Die obigen Ausführungen zu Figur 4 gelten in dieser Ausführungsform mit sich von unten nach oben erstreckendem Überrohr daher analog.
Figur 5 zeigt einen Querschnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung 100 mit 4 Einführöffnungen 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4, denen jeweils 4 Sonden
162.1 , 162.2, 162.3, 162.4 zugeordnet sind, in einer radialen Anordnung (links) und eine Seitenansicht hiervon (rechts);
In der Ausführungsform gemäß Figur 5 sind 4 Sonden 162.1 , 162.2, 162.3 und 162.4 in 4 Einführöffnungen 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4 gezeigt, die in der Trennvorrichtung 100 zum Einsatz kommen sollen. Auf der linken Seite der Figur 5 ist eine Seitenansicht im Schnitt einer Trennvorrichtung 100 mit einer leichten Phase 120, einer Zwischenphase 130 und einer schweren Phase 140 gezeigt, wobei die 4 Einführöffnungen 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4, in denen sich jeweils eine der Sonden 162.1 , 162.2, 162.3 und 162.4 befindet, in einer radialen Anordnung in der Außenwand 155 der Trennvorrichtung 100 angeordnet sind. Die Sonde 162.1 ist für die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase 140, die Sonde 162.2 für die Zwischenphase 130 und die Sonden 162.3 und 162.4 für die leichte Phase vorgesehen. Wie man aus Figur 5 ersehen kann, sind die 4 Einführöffnungen 158.1 ,
158.2, 158.3, 158.4, auf einem Kreisbogen angeordnet, der im gezeigten Beispiel der Form der Außenwand 155 oder dem Umfang der Trennvorrichtung 100 entspricht.
Auf der rechten Seite von Figur 5 ist eine Seitenansicht der 4 Einführöffnungen 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4 mit den 4 Sonden 162.1 , 162.2, 162.3 und 162.4 der Trennvorrichtung 100 dargestellt. Diese Anordnung ist im Hinblick auf eine exaktere Feststellung und zuverlässigere Detektion der Position der einzelnen Phasen anhand der gemessenen Leitfähigkeitswerte vorteilhaft und ermöglicht daher eine schnellere und robustere Erfassung, Regelung und Kontrolle des Verfahrens.
In Figur 6 ist ebenfalls ein Querschnitt einer beispielhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Trennvorrichtung 100 mit den 4 Sonden 163.1 , 163.2, 163.3 und 163.4 in 4 Einführöffnungen 159.1 , 159.2, 159.3, 159.4 dargestellt. Jedoch sind die 4 Einführöffnungen 159.1 , 159.2, 159.3, 159.4 in einer radialen Anordnung mit horizontaler Verteilung (links) und eine Seitenansicht hiervon (rechts) gezeigt. Eine radial versetze Anordnung jeweils der Einführöffnungen 159.1 , 159.2, 159.3, 159.4 führt ebenfalls zu einer zuverlässigeren Erfassung der einzelnen Phasen und somit schnelleren und robusteren Verfahrensregelung und -kontrolle.
In den Figuren 1 bis 6 können die gezeigten ein oder mehreren Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit auch durch Sonden zur Messung der Trübung ersetzt werden.
Gemäß einer Ausführungsform können nur Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit in der Trennvorrichtung eingesetzt werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können auch nur Sonden zur Messung der Trübung in der Trennvorrichtung zum Einsatz kommen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann auch eine Kombination aus Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit und aus Sonden zur Messung der Trübung in der Trennvorrichtung vorgesehen sein.
Nachfolgend wird das Verfahren der Erfindung anhand von Beispielen weiter veranschaulicht, ohne die Erfindung hierauf zu beschränken.
Ausführungsbeispiele
Das Verfahren der Erfindung wird in den Beispielen im Einzelnen anhand verschiedener Ausführungsformen erläutert.
Vorbemerkungen
Als Trennvorrichtung wird in den Beispielen ein Abscheider mit einem wässrigen Zwei-Phasen-System gefüllt und jeweils die elektrischen Leitfähigkeiten oder Trübung der Phasen an den Positionen der Sonden über die Zeit aufgenommen. Die Versuche werden mit einem Abscheider-Füllvolumen von 920 ml und 470 ml durchgeführt. Untersucht werden wässrige Zwei-Phasen-Phosphat-, Zwei-Phasen- Citrat- und Zwei-Phasen-Ammonium-Systeme aus den Ausgangsmaterialien Polymer/Salz/ Wasser. Es bilden sich eine polymerreiche, leichte Phase und eine salzreiche, schwere Phase. Die phasenbildenden Komponenten oder getrennten Phasen werden in Behältern vorgegeben, aus denen entsprechende Pumpen die Komponenten fördern. Bevor die Flüssigkeiten in den Abscheider gegeben werden, durchlaufen die Flüssigkeiten einen Massenflussmesser und erreichen einen statischen Mischer. Nachdem der Mischer passiert wurde, läuft das Flüssigkeitsgemisch in den Abscheider, in dem sich die spezifischen Phasen absetzen. Die leichte Phase kann oben an einem Auslass entnommen werden. Wenn ein Tauchrohr eingesetzt wird, kann dieses beispielweise die schwere Phase durch eine Öffnung in Form eines Überlaufventils entnehmen. In den Abscheider ragen zwei Leitfähigkeitssonden, um die jeweiligen Phasenstände zu überwachen. Die elektrischen Leitfähigkeiten werden mithilfe eines Gerätemanagers zur Messwerterfassung und Steuerung aufgenommen und aufgezeichnet. Bei den Versuchen, bei denen als zu trennendes Ausgangsmaterial eine Zellkultur eingesetzt wurde, fand zudem eine Trübungssonde Verwendung, die innerhalb des Zuführstroms platziert wurde.
Wenn in den Beispielen ein Tauchrohr zum Einsatz kommt, so wird dieses Tauchrohr mit einem Überrohr eingesetzt.
Kontinuierliche Extraktionsversuche
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit drei unterschiedlichen Maßstäben durchgeführt: zwei verschiedene Labormaßstäbe mit einem Abscheider DN35 und einem Abscheider DN50 und ein Pilotmaßstab mit einem Abscheider DN150. „DN“ ist die Nennweite und gibt den Innendurchmesser eines Rohrs an und legt damit die Größe im Gerätebau fest. DN35 und DN50 stellen daher Labormaßstab dar und DN150 (80L-Maßstab) ist bereits Pilotmaßstab, d.h. ein größerer Maßstab, der die Herstellung größerer Produktmengen ermöglicht.
Für die drei untersuchten Maßstäbe kommen jeweils geometrisch-ähnliche Abscheider zum Einsatz. Sofern nicht explizit anders angegeben, werden zur Phasendurchmischung statische Mischelemente (Typ Kenics) verwendet. Für die unterschiedlichen Maßstäbe kommen entsprechend geometrisch ähnliche, aber den Durchsätzen angepasste Mischstrecken zum Einsatz. Die Überwachung der Durchflüsse erfolgt mittels Massendurchflussmesser. Die Messung der elektrischen Leitfähigkeit an geeigneten Höhenpositionen erfolgt durch die Verwendung zweier Leitfähigkeitsmesssonden. Die wichtigsten Komponenten und Spezifikationen des Versuchsaufbaus zur Durchführung der kontinuierlichen Extraktionsversuche in den Versuchsanlagen sind in der folgenden Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2:
Nummer Bezeichnung Kommentar
1 Zahnradpumpe - im 80L-Maßstab durch Peristaltikpumpe er-
(Ismatec) setzt
2 Massendurchflussmesser - Ausführung M14, Labormaßstab
(Bronckhorst)
3 Massendurchflussmesser - 80L-Maßstab
(Endress+Hauser)
4 Mischstrecke Labor - Kenics-Helices (Eigenanfertigung)
5 Mischstrecke Pilot Kenics-Helices
(Eigenanfertigung)
6 Abscheider (DN35) Kleinster Maßstab, kein Sondenanschluss
7 Abscheider (DN50) Typischer Labormaßstab, mit Sondenanschluss
8 Abscheider (DN 150) Pilomaßstab, mit Sondenanschluss und automatisierter Füllstandsregelung
9 Leitfähigkeitsmesssonde Teil des Detektionssystems (Hamilton)
10 Trübungsmesssonde Transmission, alpha=880nm (Exxner)
11 Labbox Zur Messwerterfassung und Steuerung (Hitec Zang)
Alle zu regelnden und/oder zu messenden Prozessgrößen werden durch den Gerätemanager (Labbox) erfasst und ggf. angesteuert. Die Umsetzung der grafischen Benutzeroberfläche und die Bedienung erfolgen durch die Software Labvision (HiTec Zang GmbH, Herzogenrath, Deutschland).
Labormaßstab DN35 und DN50
Hierzu werden in den Beispielen 5.1 bis 5.3 die phasenbildenden Komponenten und eine Zellkultur zunächst in eine statische Mischstrecke gefördert. Aufgrund der Durchmischung und den gleichzeitig vorliegenden beiden wässrigen Phasen findet ein Stoffübergang von Zielprodukt und Nebenkomponenten statt. Ebenso wird durch die ständige Durchmischung eine Dispergierung von Biopartikeln in einer der Phasen erreicht, wodurch eine Zwischenphase entsteht, die zwischen ihren beiden Phasengrenzflächen Biopartikel bindet, die jedoch das Zielprodukt nicht mehr enthält.
Nach Durchlaufen der Mischstrecke schließt sich unmittelbar der Abscheider an, der wie in Figur 2 dargestellt, aufgebaut ist. Das eintretende Gemisch trennt sich dort entlang der Strömungsrichtung in eine leichte und eine schwere Phase auf. Gleichzeitig kommt es zur Ausbildung einer charakteristischen Zwischenphase, die eine durch die Biopartikel stabilisierte Dispersion der schweren Phase darstellt. Durch gezielte Höheneinstellung des Tauchrohrs, das eine Öffnung aufweist und daher wie ein Überlaufventil fungiert, wird kontinuierlich die schwere Phase als auch die Zwischenphase aus dem Abscheider entfernt. Die leichte Phase strömt ab einer kritischen Füllhöhe aus dem oberen Auslass für die leichte Phase aus. Alle Phasen werden in Gefäßen aufgefangen.
Nur der Vollständigkeit halber wird nochmals darauf hingewiesen, dass der „hochgefahrene“ Zustand des Tauchrohrs bedeutet, dass ein Nachjustieren der Höhe des Tauchrohrs, und zwar nach oben, erfolgt. Im Falle, dass das Tauchrohr vollständig hochgefahren wird, befindet sich die Öffnung beispielweise oberhalb des Flüssigkeitsspiegels in der Trennvorrichtung oder die Öffnung ist so weit hochgefahren, dass keine Flüssigkeit mehr aus dieser ausströmen kann. Das Tauchrohr ist dann außer Funktion. Dies wird in den Beispielen jeweils im Einzelnen erläutert.
Der „heruntergefahrene“ Zustand des Tauchrohrs bedeutet, dass ein Nachjustieren der Höhe des Tauchrohrs, und zwar nach unten, erfolgt. Das Tauchrohr befindet sich während des Hoch- als auch Herunterfahrens in Funktion, sofern nicht anders angegeben.
Es sind in den Figuren nicht immer alle Vorgänge des Herauf- und Herunterfahrens des Tauchrohrs dargestellt, da dies zu unübersichtlich wird und sich diese aus den Erläuterungen ergeben.
Pilotmaßstab DN150
Der Versuchsaufbau im Pilotmaßstab, wie in Beispiel 5.4 beschrieben, entspricht grundlegend den oben aufgeführten Angaben für den Labormaßstab. Der Versuchsaufbau im Pilotmaßstab unterscheidet sich von demjenigen im Labormaßstab hinsichtlich der in Tabelle 2 aufgeführten Pumpen, Massendurchflussmesser, statischen Mischstrecken und der Größe des eigentlichen Abscheiders.
Störanfälligkeit des Verfahrens
Es werden auch Versuche zur Störanfälligkeit des Verfahrens (s. Beispiel 4) durchgeführt. Die Störversuche werden durchgeführt, um zu bestimmen, inwiefern die Detektion der Phasengrenzfläche(n) mithilfe der Leitfähigkeitssonden dazu geeignet ist, Rückschlüsse auf das eingestellte System zu ziehen. Hierfür wurden variierende Systeme beim Anfahren und im kontinuierlichen Betrieb nach dem Anfahren mit einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem in den Abscheidern untersucht. Das Anfahren ist in den Versuchen die Zeitspanne, während der sich die Phasen im Abscheider absetzen und bevor und während sich die Phasen entmischen und aus dem Abscheider entnommen werden.
In Beispiel 4.1 , wo der Störfall im kontinuierlichen Betrieb erfolgt, wurde der Abscheider zuerst gefüllt und dann mithilfe eines Tauchrohrs ein kontinuierlicher Betrieb eingestellt. Dann wurde auf ein Störsystem gewechselt und die Veränderung der elektrischen Leitfähigkeit aufgenommen.
Bei den Anfahrstörversuchen der Beispiele 4.2, 4.3 und 4.4 wurde das Störsystem von Anfang an in den Abscheider gegeben und der kontinuierliche Betrieb eingestellt. Sobald dieser erreicht war, wurde auf die korrekte Systemzusammensetzung gewechselt und die elektrischen Leitfähigkeiten aufgenommen.
Ein Störsystem ist hier ein System, das entweder einphasig anstelle des Zwei-Phasen Systems ist oder eine Zusammensetzung aufweist, die von der üblichen Zusammensetzung dadurch abweicht, das eine Komponente des wässrigen Zwei-Phasen-Systems mit 10% mehr oder 10% weniger eingesetzt wird. In den Störversuchen wird die Zellkultur durch VE-Wasser ersetzt.
Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen sind nachfolgend zusammengefasst: Liste der verwendeten Abkürzungen
Figure imgf000073_0001
Beispiel 1 :
Veranschaulichung des Beginns einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystem
In Beispiel 1 wird der Beginn einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider unter Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystems beschrieben. Man bezeichnet den Beginn der Extraktion auch als Anfahren, d.h. die Phasen setzen sich ab, werden aber noch nicht entnommen. Das wässrige Zwei-Phasen-Phosphat-System ist wie folgt aufgebaut:
Tabelle 1 : Massenanteile wässriges Zwei-Phasen-Phosphat-System
Figure imgf000073_0002
Bei diesem Versuch werden die fertig hergestellten und vorbereiteten spezifischen Phasen des Zwei- Phasen-Phosphatsystems in den Abscheider gefördert. Hierbei wurde ein Gesamtmassenstrom von 100 g/min eingestellt, wobei die leichte Phase mit 60 g/min und die schwere Phase mit 40 g/min gefördert wird, um dem Phasenverhältnis des verwendeten Systems zu entsprechen. Es wurden daher die getrennt vorliegenden Phasen zusammengegeben, damit das Zwei-Phasen-System genau charakterisiert werden kann. Der Versuch dient daher der Veranschaulichung der Messung der elektrischen Leitfähigkeit. Zudem kann in dieser Art und Weise ein Vorversuch ausgestaltet sein, um vorab die zu erwartenden elektrischen Leitfähigkeiten zu bestimmen.
Mithilfe der Leitfähigkeitssonden werden die elektrischen Leitfähigkeiten über die Zeit aufgenommen. Die erste Sonde (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) ist für die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase und die zweite Sonde (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2) für die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase vorgesehen. Damit die Leitfähigkeitsverläufe möglichst vergleichbar sind, werden sie so dargestellt, dass die erste Sonde bei t = 0 die leichte Phase erfasst. So lassen sich die Verläufe bei verschiedenen Versuchen besser vergleichen. Der verwendete Abscheider hat hier ein Volumen von 920 ml. Das Anfahrverhalten wird solange aufgenommen, bis zum ersten Mal leichte Phase aus dem oberen Ablauf tropft.
In Figur 7a sind die elektrischen Leitfähigkeits-Messwerte der ersten Sonde während des Anfahrens dargestellt, wobei die erste Sonde (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) die schwere Phase erfassen soll. In Figur 7a ist eine Hüllkurve dargestellt, umfassend die oberen und unteren Grenzen der Mittelwerte mit den jeweiligen Standardabweichungen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren mindestens Duplikate.
In der Kurve von Figur 7a wird das Anfahren des Verfahrens anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit bei der ersten Sonde über die Zeit aufgetragen und in die Abschnitte I, II und III unterteilt. Im Abschnitt I von etwa 0 bis 200 s wird zu Beginn des Anfahrens von der ersten Sonde zunächst die leichte Phase detektiert. Mit zunehmender Flüssigkeit des in den Abscheider strömenden Zwei- Phasen-Systems taucht die Sonde dann in Abschnitt II in der Kurve bei etwa 200 bis etwa 400 s zunehmend in die schwere Phase ein, d.h. die Werte für die elektrische Leitfähigkeit nehmen stetig zu. In Abschnitt III der Kurve wird von der ersten Sonde dann nur noch die schwere Phase detektiert.
In Figur 7b sind die elektrischen Le itfähigke its- Messwerte der zweiten Sonde (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2) während des Anfahrens über die Zeit in [s] aufgetragen, wobei die zweite Sonde die leichte Phase erfasst. In Figur 7b ist wieder eine Hüllkurve dargestellt, umfassend die oberen und unteren Grenzen der Mittelwerte mit den jeweiligen Standardabweichungen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren mindestens Duplikate. Aus der Kurve von Figur 7b ist die elektrische Leitfähigkeit der zweiten Sonde im Laufe der Zeit zu ersehen. Sobald die obere leichte Phase die Sonde erreicht, wird eine nahezu konstante elektrische Leitfähigkeit gemessen, welche zeigt, dass die leichte Phase am Ort der Sondenmessung nahezu konstant vorliegt. Beispiel 2:
Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen- Phosphatsystem
In Beispiel 2 wird ein Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider unter Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystems beschrieben und die gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten von zwei Sonden, wie beispielweise in Figur 2 dargestellt, erläutert. In Figur 8 sind die Messwerte der beiden Sonden in zwei Kurven K1 und K2 dargestellt. Die erste Sonde (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) misst die elektrische Leitfähigkeit [mS/cm] der schweren Phase über die Zeit [s], dargestellt in Kurve K1 . Die zweite Sonde (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2) misst die elektrische Leitfähigkeit [mS/cm] der leichten Phase über die Zeit [s], dargestellt in Kurve K2.
Die Zusammensetzung des wässrigen Zwei-Phasen-Phosphatsystems ist wie in Beispiel 1 beschrieben.
Wie aus Figur 8 zu entnehmen, gliedert sich das Verfahren in drei Abschnitte, das Anfahren von 0 bis etwa 980 s, den kontinuierlichen Betrieb von etwa 980 s bis etwa 4580 s und das Abfahren ab etwa 4580 s.
Der kontinuierliche Betrieb ist nur für eine beispielhafte Zeitspanne dargestellt und selbstverständlich auch deutlich länger möglich; beispielweise kann ein kontinuierlicher Betrieb über mehrere Stunden oder auch länger durchgeführt werden.
In Figur 8 sind der Soll-Leitfähigkeitsbereich für die schwere Phase (in Figur 8 als „Soll-Leitfähigkeit“ angegeben), oben in Figur 8, und der Soll-Leitfähigkeitsbereich für die leichte Phase (in Figur 8 als „Soll-Leitfähigkeit“ angegeben), unten in Figur 8, jeweils als Bereich mit gestrichelter Ober- und Untergrenze angegeben. In den Sollwert-Bereichen für die jeweiligen elektrischen Leitfähigkeiten liegt die entsprechende Phase vor. Ein Verlassen der Sollwert-Bereiche bedeutet, dass die Sonde nicht mehr in die entsprechende Phase eintaucht. Wenn der Leitfähigkeits-Sollwert-Bereich verlassen wird, muss daher nachjustiert werden. Dies erfolgt durch das in Figur 2 gezeigte Tauchrohr 180 mit einer Öffnung 182 und mit Überrohr 183. In Beispiel 2 dient das Tauchrohr dazu, schwere Phase abzuführen.
Nachdem die passenden Massenströme eingestellt sind, wird die Zuleitung an den Abscheider angeschlossen und das Anfahren des Verfahrens beginnt (0 bis etwa 980 s). Nach 4 Minuten detektiert die erste Leitfähigkeitssonde zum ersten Mal leichte Phase (in Kurve K1 der erste Anstieg der elektrischen Leitfähigkeit), welche nach ungefähr e Minuten die zweite Sonde erreicht (in Kurve K2 der erste Anstieg der elektrischen Leitfähigkeit). Ab 7,5 Minuten beginnt der Leitfähigkeitsmesswert der ersten Sonde auf das Maximum von etwa 62 mS/cm bei 15 Minuten zu steigen (Kurve K1). Nach 9 Minuten wird zum ersten Mal leichte Phase oben am Auslauf abgelassen. Nach 13,5 Minuten kommt das Tauchrohr zum ersten Mal zum Einsatz und wird heruntergefahren, um die sich aufstauende schwere Phase abzuziehen. Das Tauchrohr fungiert in Beispiel 2 daher als eine Art Überlaufventil, das dazu dient, die schwere Phase gezielt abzulassen.
Das Herunterfahren des Tauchrohrs wird in Figur 8 durch ein Sternchen repräsentiert und das Hochfahren des Tauchrohrs durch ein Sternchen im Kreis symbolisiert. Genauer gesagt wird hier die Öffnung des Innenrohrs herauf- und herunterbewegt. Das Hoch- und Herunterfahren des Tauchrohrs wird in beiden Kurven K1 und K2 jeweils gleichzeitig angegeben, da sich dies in unterschiedlichem Maße auf beide Kurven auswirken kann. Das Tauchrohr wird daher in den beiden Kurven K1 und K2 nicht unterschiedlich bewegt, sondern eine Auf- oder Ab-Bewegung des Tauchrohrs wird gleichzeitig in beiden Kurven K1 und K2 angegeben.
Das Tauchrohr wurde nach 18 Minuten hochgefahren, um die Veränderung der Leitfähigkeit in den beiden Kurven K1 und K2 festzustellen. D.h. das Tauchrohr wird so weit hochgefahren, bis es keine Flüssigkeit mehr entnehmen kann. Dabei wurde gefunden, dass sich der Leitfähigkeitsmesswert der zweiten Sonde (Kurve K2) deutlich erhöht, während die erste Sonde (Kurve K1) kaum eine Veränderung misst. Dies bestätigt, dass die erste Sonde im kontinuierlichen Betrieb direkt in der schweren Phase hängt und die Leitfähigkeit dieser wiedergibt.
Beispiel 3:
Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen- Citratsystem
In Beispiel 3 wird ein Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem beschrieben und die gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten von zwei Sonden in Figur 9a und Figur 9b dargestellt.
Das wässrige Zwei-Phasen-Citrat-System ist wie folgt aufgebaut:
Tabelle 2: Massenanteile wässriges Zwei-Phasen-Citrat-System
Figure imgf000076_0001
In Figur 9a sind die elektrischen Leitfähigkeiten in [mS/cm] der schweren Phase über die Zeit [s] aufgetragen, die die erste Sonde (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) misst. In Figur 9b sind die elektrischen Leitfähigkeiten in [mS/cm] der leichten Phase über die Zeit [s] aufgetragen, die die zweite Sonde (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2) misst. In Figur 9a sind die elektrischen Leitfähigkeits-Messwerte der ersten Sonde, die in der schweren Phase gemessen werden, während des Anfahrens und auch während des kontinuierlichen Betriebs danach dargestellt. In Figur 9a ist wieder eine Hüllkurve dargestellt, umfassend die oberen und unteren Grenzen der Mittelwerte mit den jeweiligen Standardabweichungen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren mindestens Duplikate.
Die Messkurve in Figur 9a, die den Verlauf der aufgenommenen Leitfähigkeitsmesswerte der ersten Sonde dargestellt, die die schwere Phase detektieren soll, kann wieder in die Abschnitte I, II und III unterteilt werden. Im Abschnitt I von etwa 0 bis etwa 110 s wird von der ersten Sonde zunächst die leichte Phase detektiert. Mit zunehmendem Volumen des im Abscheider befüllten Zwei-Phasen- Systems taucht die Sonde dann in Abschnitt II in der Kurve zwischen etwa 110s und etwa 300 s zunehmend in die schwere Phase ein, d.h. die Werte für die elektrische Leitfähigkeit nehmen stetig zu. In Abschnitt III der Kurve ab etwa 300 s wird von der ersten Sonde dann die schwere Phase detektiert.
Sobald in Figur 9a der Flüssigkeitsspiegel die Sonde erreicht, steigt der Wert der elektrischen Leitfähigkeit daher plötzlich auf 8 mS/cm an. Zu diesem Zeitpunkt wird zum ersten Mal die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase detektiert (Abschnitt I in Figur 9a). Im weiteren Verlauf steigt der Wert erst schwächer und dann nahezu linear auf knapp unter 35 mS/cm und dann bis auf 45 mS/cm an. Zu diesem Zeitpunkt wird zum ersten Mal reine schwere Phase detektiert (Abschnitt II in Figur 9a). Dieser Wert für die elektrische Leitfähigkeit bleibt über die weitere Versuchsdauer nahezu konstant, da die erste Sonde immer die schwere Phase detektiert und diese in den Versuchen auch nicht absinkt (Abschnitt III in Figur 9a). Um zu gewährleisten, dass die schwere Phase nicht zu weit ansteigt oder absinkt, wird ein verwendetes Tauchrohr mit einer Öffnung in Abhängigkeit von den aufgenommenen elektrischen Leitfähigkeiten gegebenenfalls eingesetzt und nachjustiert.
Wenn sich das Zielprodukt in der leichten Phase befindet, ist es zweckmäßig, wenn am Ende des kontinuierlichen Betriebes, beim sogenannten Abfahren, das Tauchrohr wieder hochgefahren wird (das Tauchrohr aufhört, schwere Phase zu entnehmen), damit sich schwere Phase ansammelt und dadurch möglichst viel leichte Phase und damit Produkt aus dem Abscheider verdrängt. Dies ist beispielweise auch in Figur 8 bei etwa 4580 s dargestellt, wo das Tauchrohr hochgefahren wird. Dieses Vorgehen, anhand von Verdrängung der leichten Phase durch zusätzliche schwere Phase die Ausbeute an leichter Phase zu erhöhen, wird oben bei Figur 3 detailliert geschildert.
Das Hoch- und Herunterfahren des Tauchrohrs ersieht man besonders deutlich aus Figur 9b. In Figur 9b ist der Verlauf die elektrischen Le itfähigke its- Messwerte der zweiten Sonde (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2), die die leichte Phase detektieren soll, während des Anfahrens und dem nachfolgenden kontinuierlichen Betrieb über die Zeit in [s] aufgetragen. In Figur 9b ist wieder eine Hüllkurve dargestellt, umfassend die oberen und unteren Grenzen der Mittelwerte mit den jeweiligen Standardabweichungen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen repräsentieren mindestens Duplikate. Aus der Kurve von Figur 9b sind somit die gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte der zweiten Sonde im Laufe der Zeit zu ersehen. Sobald die zweite Leitfähigkeitssonde in die Flüssigkeit eintaucht, springt der Leitfähigkeitsmesswert auf etwa 8 mS/cm. Zuerst steigt der Messwert langsam an, sobald eine Leitfähigkeit von 10 mS/cm erreicht ist, steigt der Messwert nahezu linear auf einen Maximalwert an. Der deutliche Anstieg lässt sich damit erklären, dass sobald am oberen Auslass leichte Phase ausgetreten ist, das Tauchrohr nicht direkt heruntergefahren wurde. Dadurch staut sich die schwere Phase auf, was die zweite Sonde durch eine Erhöhung des Leitfähigkeitsmesswerts anzeigt.
Zu diesem Zeitpunkt, d.h. bei etwa 300 s wird das Tauchrohr dann heruntergefahren (angegeben durch das Sternchen in der Kurve). Die elektrische Leitfähigkeit ist zu diesem Zeitpunkt auf etwas über 20 mS/cm angestiegen und hat daher den Sollwert-Bereich für die elektrischen Leitfähigkeitswerte der leichten Phase von wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystemen im Bereich von 5-15 mS/cm verlassen. Mit anderen Worten, die schwere Phase nähert sich der zweiten Sonde an.
Das Tauchrohr wird daher heruntergefahren (Sternchen in der Kurve in Figur 9b) und ab diesem Zeitpunkt fließt durch das Tauchrohr schwere Phase ab, wodurch die schwere Phase im Abscheider abnimmt. Gleichzeitig sinkt auch die leichte Phase ab, so dass sich die zweite Sonde wieder in reiner leichter Phase befindet. Dies zeigt sich in Figur 9b durch das Absinken der elektrischen Leitfähigkeitswerte auf etwa 10 mS/cm. Sobald die obere leichte Phase die zweite Sonde wieder erreicht hat, wird eine nahezu konstante elektrische Leitfähigkeit gemessen, welche zeigt, dass die leichte Phase am Ort der Sondenmessung nahezu konstant vorliegt. Bei einem Messwert von etwa 10 mS/cm detek- tiert die zweite Sonde hier daher reine, leichte Phase.
Das Tauchrohr in der Ausführungsform mit Überrohr, dessen Öffnung im Innenrohr vorliegt, kann dabei wie ein Überlaufventil betrieben werden, wie dies beispielweise in den Figuren 2 und 3 beschreiben wird. Die Flüssigkeit lässt man hierbei durch Schwerkraft abfließen. Alternativ kann das Tauchrohr mit seiner Öffnung aber auch die schwere Phase absaugen, wie in Figur 4 erläutert. Die eigentliche Verfahrensweise wird hierdurch nicht verändert.
Nachdem, wie in Figur 9b gezeigt, der stationäre Zustand eine relativ kurze Zeit bei etwa 10 mS/cm gehalten wurde, nur um den kontinuierlichen Betrieb darzustellen, beginnt das Abfahren. Selbstverständlich könnte der kontinuierliche Betrieb sehr viel länger auftrechterhalten werden, beispielweise mehrere Stunden oder noch länger. Dies würde jedoch an den zur Verfügung stehenden Informationen und deren Aussagekraft nichts ändern.
Zum Abfahren wird das Tauchrohr nach etwa 1000 s hochgefahren (angegeben durch das Sternchen im Kreis in Figur 9b). Dies bedeutet, dass das Tauchrohr nicht länger in Betrieb ist, so dass sich die schwere Phase wieder aufstaut. Dadurch steigt der Leitfähigkeitsmesswert wieder an, bis er den Wert der schweren Phase erreicht hat. Dies zeigt auch die großen Unterschiede der elektrischen Leitfähigkeiten der schweren Phase (Citratsystem, schwere Phase: 30-50 mS/cm, s. Tabelle 1) gegenüber der leichten Phase (Citratsystem, leichte Phase: 5-15 mS/cm, s. Tabelle 1). Sobald die zweite Messsonde den Leitfähigkeitsmesswert der schweren Phase anzeigt, wird der Versuch beendet, da ein weiteres Ansteigen der schweren Phase nicht mehr detektiert werden kann.
Beispiel 4:
Untersuchung der Störanfälligkeit des Verfahrens
Bei der Untersuchung der Störanfälligkeit des Verfahrens soll festgestellt werden, wie zuverlässig das Verfahren arbeitet und inwiefern durch die Phasendetektion Rückschlüsse auf das im Abscheider eingestellte System im kontinuierlichen Betrieb gezogen werden können.
Beispiel 4.1 :
In Beispiel 4.1 wird anstelle eines Zwei-Phasen-Systems ein einphasiges System in den Abscheider gegeben. Dieses einphasige System wird auch als Störsystem bezeichnet.
Als Ausgangssystem wird ein wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem verwendet. Das Störsystem wird dadurch hergestellt, dass 50 % weniger Phosphatpuffer eingebracht wird. Dadurch wird das Störsystem einphasig. In Figur 10 sind die Leitfähigkeitsmesswerte von Beispiel 4.1 dargestellt. Kurve K1 gibt die elektrischen Leitfähigkeitswerte der ersten Sonde an, welche die schwere Phase misst. Kurve K2 gibt die elektrischen Leitfähigkeitswerte der zweiten Sonde an, welche die leichte Phase misst.
Zunächst erfolgt in üblicher weise das Anfahren mit einem Zwei-Phasen-Phosphatsystem, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben. Nachdem das Anfahren mit dem Phosphatsystem abgeschlossen ist, wird das Störsystem bei (S1.1) in den Abscheider eingebracht. Sobald das einphasige Störsystem in den Abscheider gefördert wird, fällt die Leitfähigkeit der Sonde für die schwere Phase (Kurve K1) ab. Das Abfallen der Leitfähigkeit bis auf einen Wert von 60 mS/cm lässt sich durch die Einstellung des Tauchrohrs (nicht gezeigt) erklären, das hier wieder als Überlaufventil fungiert. Das Tauchrohr wurde in diesem Versuch anschließend nicht mehr verstellt und auf einer konstanten Einstellung gehalten, die bei normalem Zwei-Phasen-Phosphatsystem angewendet wird. Der Leitfähigkeitswert fällt anschließend nahezu linear auf 40 mS/cm ab und senkt sich dann mit geringerer Geschwindigkeit auf 25 mS/cm ab. Das erneute Einbringen von Störsystem bei (S1 .2) in den Abscheider führt zu keinen großen Veränderungen mehr. Die Leitfähigkeit der zweiten Sonde, dargestellt in Kurve K2, steigt langsam von 20 mS/cm auf 30 mS/cm an.
Beispiel 4.2:
In Beispiel 4.2 wird der Wassergehalt von schwerer und leichter Phase jeweils variiert. Es wird ein wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem im kontinuierlichen Betrieb verwendet.
Die aufgenommenen Werte für die Leitfähigkeiten sind in Figur 11 über die Zeit in [s] aufgetragen. Es werden die elektrischen Leitfähigkeiten der schweren Phase mit der ersten Sonde und der leichten Phase mit der zweiten Sonde gemessen. Es wurden zwei Versuche durchgeführt: Im ersten Versuch mit einem Zwei-Phasen-Phosphatsystem, das einen Wassergehalt von -10 Gew.-% gegenüber einem Zwei-Phasen-Phosphat-System mit korrekter Wassermenge enthält, und im zweiten Versuch mit einem Zwei-Phasen-Phosphat-System, das einen Wassergehalt von +10 Gew.-% gegenüber einem Zwei-Phasen-Phosphat-System mit korrekter Wassermenge enthält. In der folgenden Tabelle 3 sind die verwendeten Mengen angegeben.
Tabelle 3: wässriges Zwei-Phasen-Phosphat-System mit variierender Wassereinwaage
Figure imgf000080_0001
Beide Versuche sind in Figur 11 wiedergegeben. Die Beschriftung von Figur 11 ist wie folgt:
Kurve 2.1 schwere Phase mit -10 Gew.-% Wasser;
Kurve 2.2 schwere Phase mit +10 Gew.-% Wasser;
Kurve 2.3 leichte Phase mit -10 Gew.-% Wasser;
Kurve 2.4 leichte Phase mit +10 Gew.-% Wasser.
Der Pfeil in Figur 11 zeigt Luftblasen im System an, die zu Messfehlern führen.
Die Formulierung “schwere Phase mit -10 Gew.-% Wasser“ bedeutet, dass die elektrische Leitfähigkeit für die schwere Phase in der Kurve in Figur 11 gezeigt wird, wobei das verwendete Zwei-Phasen- P h os p hatsystem einen um 10 Gew.-% geringeren Wassergehalt aufweist als ein übliches Zwei- Phasen-Phosphatsystem mit korrektem Wassergehalt.
Die Formulierung “schwere Phase mit +10 Gew.-% Wasser“ bedeutet, dass die elektrische Leitfähigkeit für die schwere Phase in der Kurve in Figur 11 gezeigt wird, wobei das verwendete Zwei-Phasen- Phosphatsystem einen um 10 Gew.-% höheren Wassergehalt aufweist als ein übliches Zwei-Phasen- Phosphatsystem mit korrektem Wassergehalt.
Beispiel 4.3:
In Beispiel 4.3 wird der Polymergehalt des Polyethylenglykols (PEG) von schwerer und leichter Phase jeweils variiert. Es wird ein wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem verwendet. Es wird im kontinuierlichen Betrieb gearbeitet.
Die aufgenommenen Werte für die Leitfähigkeiten sind in Figur 12 über die Zeit in [s] aufgetragen. Es werden die elektrischen Leitfähigkeiten der schweren Phase mit der ersten Sonde und der leichten Phase mit der zweiten Sonde gemessen. Es wurden zwei Versuche durchgeführt: Im ersten Versuch mit einem Zwei-Phasen-Phosphatsystem, das einen Polymergehalt von -10 Gew.-% gegenüber einem Zwei-Phasen-Phosphat-System mit korrekter Polymermenge enthält, und im zweiten Versuch mit einem Zwei-Phasen-Phosphat-System, das einen Polymergehalt von +10 Gew.-% gegenüber einem Zwei-Phasen-Phosphat-System mit korrekter Polymermenge enthält.
In der folgenden Tabelle 4 sind die verwendeten Mengen angegeben.
Tabelle 4: wässriges Zwei-Phasen-Phosphat-Systems mit variierender Polymereinwaage
Figure imgf000081_0001
Beide Versuche sind in Figur 12 wiedergegeben. Die Beschriftung von Figur 12 ist wie folgt:
Kurve 3.1 schwere Phase mit + 10 Gew.-% PEG;
Kurve 3.2 schwere Phase mit - 10 Gew.-% PEG;
Kurve 3.3 leichte Phase mit + 10 Gew.-% PEG;
Kurve 3.4 leichte Phase mit - 10 Gew.-% PEG;
Beispiel 4.4:
In Beispiel 4.4 wird das Puffersalz in Form des Phosphatsalzes eines wässrigen Zwei-Phasen- Phosphatsystems in der schweren und leichten Phase jeweils variiert. Es wird im kontinuierlichen Betrieb gearbeitet.
Die aufgenommenen Werte für die Leitfähigkeiten sind in Figur 13 über die Zeit in [s] aufgetragen. Es werden die elektrischen Leitfähigkeiten der schweren Phase mit der ersten Sonde und der leichten Phase mit der zweiten Sonde gemessen. Es wurden zwei Versuche durchgeführt: Im ersten Versuch mit einem Zwei-Phasen-Phosphat-System, das einen Puffersalzgehalt von -10 Gew.-% gegenüber einem Zwei-Phasen-Phosphat-System mit korrekter Puffersalzmenge enthält, und im zweiten Versuch mit einem Zwei-Phasen-Phosphat-System, das einen Puffersalzgehalt von +10 Gew.-% gegenüber einem Zwei-Phasen-Phosphat-System mit korrekter Puffermenge enthält.
In Beispiel 4.4. wird die Trennvorrichtung direkt mit der Störzusammensetzung befüllt. In der folgenden Tabelle 5 sind die verwendeten Mengen angegeben. Tabelle 5: wässriges Zwei-Phasen-Phosphat-Systems mit variierender Puffersalzeinwaage
Figure imgf000082_0001
Beide Versuche sind in Figur 13 wiedergegeben. Die Beschriftung von Figur 13 ist wie folgt:
Kurve 4.1 schwere Phase mit + 10 Gew.-% Phosphatpuffer;
Kurve 4.2 schwere Phase mit - 10 Gew.-% Phosphatpuffer;
Kurve 4.3 leichte Phase mit + 10 Gew.-% Phosphatpuffer;
Kurve 4.4 leichte Phase mit - 10 Gew.-% Phosphatpuffer.
Anhand sämtlicher Versuche in den Beispielen 4.1 bis 4.4 und den vier unterschiedlichen wässrigen Systemen (Variation der Phasenzahl sowie des Gehalts von Wasser, von Puffer und von Polymer), dargestellt in den Figuren 10, 11 , 12 und 13, lassen sich mit dem Messprinzip anhand des Leitfähigkeitsprofils selbst geringe Abweichungen vom Soll-Zustand erkennen. Auch über längere Prozesszeiten (>3 Stunden) ist die Messung zuverlässig (wie nachfolgend auch noch belegt werden wird) und ermöglicht somit eine optimale Effizienz bei der Abtrennung von leichter und schwerer Phase, wodurch die Ausbeute des Prozesses maximiert wird.
Beispiel 5
Kontinuierliche Extraktion im Abscheider mit Zellkultur zur Reinigung und Anreicherung von Antikörpern
Im Nachfolgenden wird anhand von mehreren Beispielen gezeigt, dass sich die elektrischen Leitfähigkeiten der schweren und leichten Phase bei Anwesenheit von Biopartikeln verändern und dass die dabei gebildete Zwischenphase und schwere Phase ebenfalls elektrische Leitfähigkeitswerte aufweisen können, die sich von den zu erwartenden Leitfähigkeiten unterscheiden. Die Zwischenphase stellt dabei eine Mischung aus schwerer Phase in dispergierter Form zusammen mit Zellen dar. Sowohl die Zwischenphase als auch die schwere Phase können zum Teil eine deutlich reduzierte elektrische Leitfähigkeit aufweisen, als zu erwarten wäre, was auf die Anwesenheit von Zellen und anderen leitfähigkeitssenkenden Biopartikeln zurückgeführt wird.
In Beispiel 5 wird gezeigt, wie die Detektion der elektrischen Leitfähigkeit verwendet wird, um das Zielprodukt in der Zielphase (in diesem Beispiel die leichte Phase) von der Gegenphase (in diesem Beispiel die schwere Phase) und der Zwischenphase mit Zellen getrennt werden können. Beispiel 5.1
DN50-Maßstab - Citratsystem
In Beispiel 5.1 wird eine kontinuierliche Extraktion gemäß dem Messprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Abscheider mit Zellkultur beschrieben. Der Versuch dient zur Orientierung und Veranschaulichung des Messprinzips und wurde im Labormaßstab durchgeführt. Es wurde ein Zwei- Phasen-Citratsystem verwendet, um aus einer Zellkultur das Zielprodukt, hier ein Antikörper, zu reinigen und anzureichern. Die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Zellkultur sowie die eingestellten Massenanteile sind in Tabelle 6 zusammengefasst:
Tabelle 6: Einwaage und Massenanteile für Beispiel 5.1
Figure imgf000083_0001
Das wässrige Zwei-Phasen-Citratsystem, das wie in Tabelle 6 angegeben aufgebaut ist, wurde bereits in geeigneter Weise durchmischt, so dass sich die Komponenten der Zellkultur zwischen den Phasen aufgeteilt haben. Das Zielprodukt sammelt sich in Beispiel 5.1 in der leichten Phase an. Die Mischung wird dann über eine Pumpe mit einem Massenstrom von 28 g/min in einen Abscheider gefördert. Bei dieser Förderrate dauert es ungefähr 17 Minuten bis die leichte Phase, umfassend das Zielprodukt in Form von Antikörpern, oben am Auslauf austritt. Die Versuchsübersicht zu Beispiel 5.1 ist in der folgenden Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7: Versuchsübersicht zu Beispiel 5.1
Figure imgf000083_0002
Die aufgenommenen elektrischen Leitfähigkeiten des Beispiels 5.1 unter Verwendung von zwei Sonden, eine Sonde für die schwere Phase (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) und eine Sonde für die leichte Phase (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2), sind in Figur 14 gegen die Zeit in [s] aufgetragen. Das Verfahren lässt sich wieder in drei Abschnitte gliedern: dem Anfahren von 0 bis etwa 810 s, dem kontinuierlichen Betrieb von etwa 810 s bis 4680 s und dem Abfahren ab etwa 4680 s. Beim Anfahren ist der typische Verlauf erkennbar. Die erste tiefer liegende Sonde, die die schwere Phase detektieren soll, zeigt als erstes leichte Phase mit einem Wert für die elektrische Leitfähigkeit von etwa 8 mS/cm an und steigt dann bis 15 mS/cm nahezu konstant an (Kurve K1). Bei 15 mS/cm ist ein Knick der Steigung erkennbar. Hier wird die Zwischenphase mit den Zellen detektiert. Die Zwischenphase wird in Figur 14 mit Z bezeichnet und die Pfeile zeigen deren Detektion an. Die zweite Sonde zeigt einen ähnlichen Verlauf beim Anfahren (Kurve K2). Die elektrische Leitfähigkeit springt plötzlich auf 8 mS/cm. Hier wird zum ersten Mal leichte Phase detektiert. Anfänglich steigt die elektrische Leitfähigkeit nicht so stark an, bis sie in einen nahezu linearen Anstieg übergeht. Bei 15 mS/cm ist erkennbar, dass die Werte für die elektrische Leitfähigkeit weniger stark steigen, hier wird die Zwischenphase Z mit den Zellen detektiert. Sobald die zweite Sonde einen Leitfähigkeitswert von 17 mS/cm erreicht, wird das Tauchrohr heruntergefahren (Sternchen in Figur 14) und ein kontinuierlicher Prozess eingestellt. Dabei ist ein Unterschied der elektrischen Leitfähigkeiten zwischen den Phasen von 5 mS/cm erkennbar.
Anders als erwartet hat die schwere Phase eine deutlich geringere Leitfähigkeit als erwartet. Dies liegt wahrscheinlich an den vorhandenen Zellen und anderen leitfähigkeitssenkenden Biopartikeln.
Am Ende des kontinuierlichen Betriebs ist ein Absacken der elektrischen Leitfähigkeiten erkennbar. Dies hängt damit zusammen, dass hier das Tauchrohr tiefer eingestellt wird (Nachjustieren des Tauchrohrs), wodurch mehr schwere Phase aufgrund des höheren hydrostatischen Drucks abgezogen wird. Dadurch sollte die Reaktion des Systems getestet und die elektrischen Leitfähigkeiten erfasst werden. Die Werte für die elektrische Leitfähigkeit sinken mit Herunterfahren des Tauchrohrs (Sternchen in Figur 14) direkt ab: Dabei fällt der Messwert der zweiten Sonde (Kurve K2) bis auf den der kontinuierlichen leichten Phase, in Figur 14 als LP bezeichnet, ab. Die detektierte elektrische Leitfähigkeit der ersten Sonde sinkt im gleichen Maße ab; allerdings ist der Unterschied nicht so groß wie bei der zweiten Sonde. Der niedrigste Wert für die elektrische Leitfähigkeit liegt bei 15 mS/cm, hier wird gerade noch die Zwischenphase Z mit den Zellen erfasst. Das Tauchrohr wird dann vollständig hochgefahren (Sternchen im Kreis in Figur 14), um zu verhindern, dass die Zwischenphase durch ein weiteres Absinken der schweren Phase nicht mehr detektiert werden kann. Das Abfahren beginnt daher mit dem vollständigen Hochfahren des Tauchrohrs bei etwa 4680s (Sternchen im Kreis in Figur 14), wodurch die Messwerte für die elektrische Leitfähigkeit schnell ansteigen. Bei etwa 15 mS/cm ist bei der zweiten Sonde (Kurve K2) wieder ein Knick erkennbar. Hier wird wieder die Zwischenphase Z mit Zellen detektiert; dies wird in Figur 14 mit Pfeilen zu Z (Z bedeutet Zwischenphase) angegeben. Anders als erwartet liegen die Werte für die elektrische Leitfähigkeit der Zwischenphase mit Zellen nicht im Bereich von 30-40 mS/cm. Dies wird auf die Anwesenheit von Zellen und anderen leitfähigkeitssenkenden Biopartikeln zurückgeführt. Die Werte für die elektrische Leitfähigkeit steigen dann bis auf über 20 mS/cm. Die elektrischen Leitfähigkeiten der beiden Sonden nähern sich schließlich schnell demselben Wert an.
Sobald das Tauchrohr bei etwa 4200 s heruntergefahren wurde (siehe Sternchen in Figur 14), sinkt der Leitfähigkeitsmesswert der zweiten Sonde (Kurve K2) sofort auf die elektrische Leitfähigkeit der reinen leichten Phase (5 bis 15 mS/cm) ab. Die elektrische Leitfähigkeit kann somit dazu dienen, die Zwischenphase in diesem System zu lokalisieren. Die erste Sonde hat im kontinuierlichen Betrieb zwar keine reine schwere Phase detektiert, deren elektrische Leitfähigkeit im Bereich von 30 bis 50 mS/cm liegen sollte, dennoch lässt sich mithilfe der elektrischen Leitfähigkeitswerte des Anfahrens bestimmen, welcher Messwert für die elektrische Leitfähigkeit zur Zwischenphase gehört. Der Leitfähigkeitsmesswert der Zwischenphase Z kann im ersten Plateau nach Detektion der leichten Phase LP erfasst werden. In der Zwischenphase, die hier in die schwere Phase übergeht, liegt ein Leitfähigkeitsgradient vor, wodurch der Beginn der Zwischenphase mithilfe des erfassten elektrischen Leitfähigkeitswertes gut abgeschätzt werden kann.
In Figur 15 ist die Zellzahl in [105 Zellen/mL] der in Beispiel 5.1 eingesetzten Zellkultur sowie die Zellzahl der während des Verfahrens gewonnenen leichten Phase (Kurve K2), die das Zielprodukt enthält, dargestellt. Es ist zu erkennen, dass in der erhaltenen leichten Phase jederzeit konstant weniger Zellen enthalten sind als in der Zellkultur. Die reduzierte Zellzahl kann auch in der nach der Extraktion gewonnen leichten Phase beobachtet werden (Leichte Phase Pool in Figur 15).
Somit kann anhand von Beispiel 5.1 gezeigt werden, dass die Produktphase (leichte Phase) mithilfe der Messung der elektrischen Leitfähigkeiten eindeutig identifiziert und konstant über die kontinuierliche Extraktion von den anderen Phasen getrennt werden kann.
Die Antikörper liegen in der in Beispiel 5.1 . abgetrennten leichten Phase angereichert und in gereinigter Form vor. Es konnten dabei die Zellen mit 1 .4 log-Stufen abgereichert werden.
Beispiel 5.2
DN50-Maßstab - wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem
- Referenzbeispiel -
In Beispiel 5.2 wird eine kontinuierliche Extraktion gemäß dem Messprinzip des vorliegenden Verfahrens in einem Abscheider unter Verwendung einer Zellkultur beschrieben. Der Versuch dient nur zur Orientierung und Veranschaulichung des Messprinzips und wurde im Labormaßstab durchgeführt. Es wurde ein Zwei-Phasen-Phosphatsystem verwendet, um aus einer Zellkultur das Zielprodukt, hier Antikörper, zu reinigen und anzureichern. Die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Zellkultur sowie die eingestellten Massenanteile sind in Tabelle 8 zusammengefasst:
Tabelle 8: Einwaage und Massenanteile
Figure imgf000085_0001
Das wässrige Zwei-Phasen-Phosphatsystem, das wie in Tabelle 8 angegeben aufgebaut ist, wurde bereits in geeigneter Weise in einem statischen Mischer durchmischt, so dass sich die Komponenten der Zellkultur zwischen den Phasen aufteilen. Das Zielprodukt, hier: Antikörper, sammelt sich in Beispiel 5.2 in der leichten Phase an. Die Mischung wird dann über eine Pumpe mit einem Gesamtmassenstrom von 50,7 g/min in einen Abscheider gefördert. Die Edukte werden in Bechergläsern vorgelegt und mit Zahnradpumpen in die statischen Mischer und dann in den Abscheider gefördert. Die leichte und die schwere Phase werden aufgefangen.
Eine Versuchsübersicht zu Beispiel 5.2 ist in der folgenden Tabelle 9 angegeben.
Tabelle 9: Versuchsübersicht zu Beispiel 5.2
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Die aufgenommenen elektrischen Leitfähigkeiten des Beispiels 5.2 unter Verwendung von zwei Sonden, eine Sonde für die schwere Phase (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) und eine Sonde für die leichte Phase (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2), sind in Figur 16 gegen die Zeit in [s] aufgetragen.
In Figur 16 zeigt Kurve K1 die Messwerte für die elektrische Leitfähigkeit der ersten Sonde, die die schwere Phase detektieren soll und Kurve K2 die Messwerte für die elektrische Leitfähigkeit der zweiten Sonde, die die leichte Phase detektieren soll. Die Messwerte der elektrischen Leitfähigkeit der ersten Sonde in Kurve K1 steigt während des Anfahrens von 0 mS/cm auf 16 mS/cm schnell an. Die Leitfähigkeitskurven der beiden Sonden schneiden sich bei 19 mS/cm. Danach steigt der Messwert für die elektrische Leitfähigkeit der ersten Sonde in Kurve K1 nahezu linear auf einen Wert von 65 mS/cm an. Hier flacht die Kurve ab. Das Tauchrohr wird heruntergefahren (Sternchen in der Kurve K1 in Figur 16), entnimmt dann kontinuierlich schwere Phase und ein kontinuierliches Verfahren wird hierdurch eingestellt. Der Leitfähigkeitsmesswert der ersten Sonde schwankt für die schwere Phase zwischen 63,2 mS/cm und 69,3 mS/cm. Dies stellt den kontinuierlichen Betrieb des Verfahrens dar.
Zum Abfahren der kontinuierlichen Extraktion wird das Tauchrohr hochgefahren (Sternchen im Kreis in Kurve K1 in Figur 16) und hört damit auf, schwere Phase zu entnehmen. Die elektrischen Leitfähigkeitswerte der ersten Sonde nähern sich hiernach asymptotisch einem Wert von 77 mS/cm.
In der Kurve K2, den von der zweiten Sonde für die leichte Phase gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten, detektiert die Sonde zu Anfang einen Wert von 17 mS/cm. Dieser steigt dann auf 20 mS/cm. Dieser Wert wird eine kurze Zeit konstant detektiert und steigt im weiteren Verlauf auf 25 mS/cm an. Zu diesem Zeitpunkt wird das Tauchrohr heruntergefahren (Sternchen in der Kurve K2 in Figur 16) und das Tauchrohr beginnt die schwere Phase zu entnehmen. Dies kann durch Schwerkraft erfolgen, wobei die im Tauchrohr, d.h. im Innenrohr vorhandene Öffnung in eine Position gebracht wird, so dass die schwere Phase abfließt. Das Tauchrohr arbeitet dann wie ein Überlaufventil. Gemäß einer anderen Ausführungsform des Tauchrohrs kann die schwere Phase auch durch das Tauchrohr abgesaugt werden. Beide Alternativen sind gleichermaßen geeignet und einsetzbar, um die schwere Phase zu entfernen.
Der Einsatz des Tauchrohrs ist am Absinken der elektrischen Leitfähigkeiten in Kurve K2 erkennbar. Die gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten durch die zweite Sonde sinken im gesamten kontinuierlichen Betrieb nahezu stetig ab, bis am Ende ein Wert von 22 mS/cm erreicht wird. Die elektrische Leitfähigkeit steigt dann auf knapp 25 mS/cm an.
Im Anschluss wird das Tauchrohr hochgefahren (Sternchen im Kreis in Kurve K2 in Figur 16) und hört daher auf, schwere Phase zu entnehmen; die gemessenen Leitfähigkeiten der zweiten Sonde steigen daraufhin nahezu linear an (Kurve K2), bis der Messwert der ersten Sonde erreicht wird (Kurve K1).
Eine Analyse der schweren und leichten Phase zeigt, dass die Aufteilung von Zielprodukt in die leichte Phase und Verunreinigungen, insbesondere Zellen, in die schwere Phase und/oder Zwischenphase nicht stattgefunden hat. Auch an der deutlichen Trübung der leichten Phase lässt sich erkennen, dass in diesem System die Zellernte nicht funktioniert hat und die Zellen in der leichten Phase verharren. Die leichte Phase ist eine disperse Phase und sollte eigentlich klarer sein. Demgegenüber setzt sich die schwere Phase schneller ab als zu erwarten wäre und ist zudem sehr klar. Zwischen den beiden Phasen ist eine Zwischenphase mit Zellen erkennbar. Die Zellen verharren in der leichten Phase und können vom Tauchrohr nicht abgezogen werden, da dieses ausgelegt ist, um die schwere Phase zu entnehmen. Es sind zudem deutliche Schlieren an Zellen im Einlauf des Abscheiders erkennbar. Somit ist es zu einer Phaseninversion im System gekommen. Dies wird auf eine unzureichende Durchmischung zurückgeführt. Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Erhalt eines Stoffaustauschs durchgeführt, so dass sich das Zielprodukt angereichert hat und im Wesentlichen nur noch in einer der Phasen befindet und zwar in der zu erwartenden Phase und die Verunreinigungen sich angereichert haben und im Wesentlichen in der Gegenphase vorliegen.
Die elektrischen Leitfähigkeiten der schweren Phase in Beispiel 5.1. liegen im Bereich der reinen schweren Phase (ohne Zellen), wie diese in Beispiel 4.2 (Figur 11) in einem der Versuche bei der Untersuchung der Störanfälligkeit des Verfahrens und Variation des Wassergehalts erhalten wurde. Diese Leitfähigkeit ist vergleichbar mit der Leitfähigkeit einer zellfreien Phase mit Produkt. Somit ist es hier nicht zur Ausbildung einer Zwischenphase aus nicht koaleszierter schwerer Phase und Zellen gekommen. Dieser unerwünschte Effekt dient hier als Negativbeispiel. Es ist in diesem Zusammenhang explizit darauf hinzuweisen, dass Beispiel 5.2. kein erfindungsgemäßes Beispiel darstellt, da hier keine Durchmischung unter Stoffaustausch, wie in der Lehre des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben, durchgeführt wurde.
Bemerkenswert ist, dass das Messprinzip gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren dennoch funktioniert, d.h. die schwere Phase und die leichte Phase konnten durch ihre elektrischen Leitfähigkeiten identifiziert und voneinander getrennt werden. Der Fehler liegt hierbei in der mangelnden Durchmischung die ohne weiteres vermieden werden kann.
Beispiel 5.3
DN50-Maßstab - wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem
Um zu belegen, dass eine ausreichende Durchmischung in Beispiel 5.2. die dort auftretenden Probleme ausräumt, wurde Beispiel 5.2 wiederholt und die beiden Phasen erneut in den Abscheider überführt. Der Volumenstrom wird jedoch von 50,7 g/min auf 25 g/min verringert. Dadurch soll die Verweilzeit in den statischen Mischern verlängert werden, um eine höhere Durchmischung zu erzeugen. Es werden 810 ml leichte Phase und 310 ml schwere Phase in den Abscheider gefördert. Für die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Zellkultur sowie die eingestellten Massenanteile wird auf Tabelle 8 verwiesen. Eine Versuchsübersicht zu Beispiel 5.3 ist in der folgenden Tabelle 10 angegeben.
Tabelle 10: Versuchsübersicht zu Beispiel 5.3
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Die aufgenommenen elektrischen Leitfähigkeiten des Beispiels 5.3 unter Verwendung von zwei Sonden, eine Sonde für die schwere Phase (z.B. Sonde 160.1 in Figur 2) und eine Sonde für die leichte Phase (z.B. Sonde 160.2 in Figur 2), sind in Figur 17 gegen die Zeit in [s] aufgetragen.
Wie in Figur 17 und den gemessenen Kurven K1 und K2 zu ersehen, sind durch den niedriger eingestellten Massenstrom die Verläufe der Leitfähigkeitsmesswerte flacher, jedoch lassen sich alle charakteristischen Merkmale erkennen.
Aus Figur 17 erkennt man, dass die Werte für die elektrische Leitfähigkeit der ersten Sonde in Kurve K1 unvermittelt von 0 mS/cm auf 13 mS/cm ansteigt. Die elektrische Leitfähigkeit steigt dann auf 16- 17 mS/cm und wird sodann konstant detektiert. Die zweite Sonde (Kurve K2) zeigt den gleichen Messwert wie die erste Sonde an, allerdings etwas zeitverzögert. Nachdem beide Sonden die leichte Phase detektiert haben, steigt der Messwert für die elektrische Leitfähigkeit der ersten Sonde an (Kurve K1) und erreicht sein Maximum bei 50 mS/cm, wobei ab einem Messwert von 43 mS/cm ein erster asymptotischer Verlauf erkennbar ist. Die erste Sonde detektiert daher ab etwa 40 mS/cm eigentlich die Zwischenphase (im vorliegenden Fall schwere Phase mit Zellen) mit einer elektrischen Leitfähigkeit im Bereich von 40-50 mS/cm. Da keine schwere Phase bei 60-80 mS/cm gemessen wurde, wird angenommen, dass die gesamte schwere Phase quasi in die Zwischenphase übergegangen ist bzw. dass die Leitfähigkeits-Sonde nur noch Zwischenphase misst. Die Zwischenphase entspricht in diesem Beispiel daher der schweren Phase.
Der Messwert für die elektrische Leitfähigkeit der zweiten Sonde (Kurve K2) bleibt länger auf dem konstanten Wert von 15 bis 16 mS/cm und steigt dann sehr langsam auf ungefähr 24,5 mS/cm an. Zu diesem Zeitpunkt wird das Tauchrohr kurz heruntergefahren (Sternchen in Kurve K1 und K2 in Figur 17) und wieder hochgefahren (Sternchen im Kreis in Kurve K1 und K2 in Figur 17). Aus diesem Grund verlaufen in diesem Fall die Anfahr- und die Abfahrkurve deutlich unterschiedlicher.
Schließlich steigen beide Messwerte auf 50 mS/cm an. Sobald die zweite Messsonde den gleichen Wert wie die erste anzeigt, wird der Versuch beendet und die Pumpen werden abgestellt.
In der folgenden Tabelle 11 sind die elektrischen Leitfähigkeitsmesswerte für die Beispiele 5.2 und 5.3 angegeben:
Tabelle 11 : Elektrische Leitfähgkeiten für Beispiel 5.2 und 5.3
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*Pool bedeutet die nach der Extraktion erhaltene Phase Der kontinuierliche Betrieb wurde hier nur sehr kurz durchgeführt, um das Messprinzip aufzuzeigen. Dieser kann selbstverständlich auch deutlich länger, z.B. mehrere Stunden oder auch noch länger durchgeführt werden.
In Figur 18 ist die Zellzahl in [106 Zellen/mL] der in Referenzbeispiel 5.2 und Beispiel 5.3 eingesetzten Zellkultur (11 ,1*106 Zellen/ml) sowie die Zellzahl der während des Verfahrens gewonnenen leichten Phase, die das Zielprodukt enthalten soll, in einem Balkendiagramm dargestellt.
Die leichte Phase von Referenzbeispiel 5.2. zeigt in Figur 18 keine Abreicherung von Zellen (linke Seite von Figur 18). Die elektrische Leitfähigkeit der in Referenzbeispiel 5.2 gewonnenen schweren Phase lässt diese unzureichende Abtrennung durch den Leitfähigkeitswert von 60-70 mS/cm erkennen, da dieser der reinen schweren Phase ohne Zellen entspricht. „Pool“ in Figur 18 bezeichnet die nach der Extraktion erhaltene Phase.
Bei Beispiel 5.3 auf der rechten Seite von Figur 18 ist zu erkennen, dass in der leichten Phase, in der das Produkt vorliegt, zu jedem Zeitpunkt während des Extraktionsverfahrens konstant weniger Zellen enthalten sind als in der Zellkultur. Die reduzierte Zellzahl kann auch in der gesamten leichten Phase nach erfolgter Extraktion beobachtet werden. Die erfolgreiche Abtrennung der Zellen kann wieder aus der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase ersehen werden. Diese weist mit einem Leitfähigkeitsbereich von 40-50 mS/cm eine deutlich reduzierte elektrische Leitfähigkeit auf, was auf die Anwesenheit von Zellen und anderer Leitfähigkeitssenkender Biopartikel schließen lässt.
Eine Analyse zeigt, dass die Antikörper in der abgetrennten leichten Phase von Beispiel 5.3 angereichert und in gereinigter Form vorliegen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht daher, die Produktphase (leichte Phase) mithilfe der Leitfähigkeitsmessung/Phasengrenzstandssteuerung konstant über die kontinuierliche Extraktion von der schweren Phase zu trennen.
Durch die Verringerung des Volumenstroms konnte die Zellernte mit dem Phosphatsystem erfolgreich durchgeführt werden. Somit wurde bestätigt, dass es durch die geringe Durchmischung des Systems im Anfahrbereich zu einer Phaseninversion des Systems in Beispiel 5.2 (Referenzbeispiel) kam, die in Beispiel 5.3. (erfindungsgemäßes Beispiel) mit einer Durchmischung mit ausreichendem Stoffaustausch vermieden werden konnte.
Beispiel 5.4
DN150-Maßstab - wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem
Beispiel 5.4 zeigt wie die automatisierte Einstellung der Höhe bzw. Eintauchtiefe des Tauchrohrs in Abhängigkeit von den ermittelten Leitfähigkeitswerten für 2 Sonden durchgeführt wird. Es wird ein wässriges Zwei-Phasen-Phosphatsystem im kontinuierlichen Betrieb eingesetzt. Im gezeigten Beispiel befindet sich das Zielprodukt in der leichten Phase und das Tauchrohr in der Ausführungsform mit Überrohr, das bis in die schwere Phase reicht, soll schwere Phase und Zwischenphase aus dem Abscheider entnehmen.
In Figur 19 sind für einen Extraktionsprozess die beiden elektrischen Leitfähigkeitsprofile der beiden Sonden (Figur 19A) und die automatisierte Höheneinstellung für ein Tauchrohr (Figur 19B) dargestellt. Kurve K1 in Figur 19A gibt die elektrischen Leitfähigkeiten, die von der ersten Sonde in der schweren Phase gemessen werden, und Kurve K2 in Figur 19A gibt die elektrischen Leitfähigkeiten, die von der zweiten Sonde in der leichten Phase gemessen werden, an. Figur 19A und 19B sind jeweils gegen die Verfahrenszeit in [min] aufgetragen.
Figur 19B zeigt das Herunterfahren und Herauffahren des Tauchrohrs anhand der Position der Öffnung im Tauchrohr, das als Überlaufventil fungiert. Die Höhenangaben in Figur 19B repräsentieren daher die Position des Überlaufventils, bei der Höhe der Öffnung, wo die Flüssigkeit abfließt. Zu Beginn befindet sich das Tauchrohr bei der Höhe 0 cm in seiner Ausgangstellung (entlang der x-Achse in Figur 19B). Das Tauchrohr befindet sich daher im hochgefahrenen Zustand und entnimmt keine Phase aus der Trennvorrichtung. Nach etwa 27 min wird das Tauchrohr dann auf etwa 1 ,5 cm heruntergefahren und dann bei etwa 32 min wieder in die Ausgangsstellung (Höhe 0 cm) hochgefahren. Wie zu erkennen ist, gleicht die gezeigte automatisierte Regelung die Abweichung des Messwerts der elektrischen Leitfähigkeit vom Sollwert durch ein Verstellen der Tauchrohrposition, d.h. der Position der Öffnung im Tauchrohr, aus.
Die leichte Phase, repräsentiert durch die elektrischen Leitfähigkeitswerte von Kurve K2, weist über den gesamten Versuch die in diesem System typische Leitfähigkeit von 20-30 mS/cm auf. Zu Beginn des Versuchs misst die erste Sonde in Kurve K1 zunächst die elektrischen Leitfähigkeitswerte für die leichte Phase, da der Abscheider befüllt wird (bis etwa 25 min). Sobald der Abscheider vollständig mit System gefüllt ist, misst die erste Sonde (Kurve K1) die elektrischen Leitfähigkeitswerte der reinen schweren Phase (60-80 mS/cm). Das Tauchrohr wird heruntergefahren, um schwere Phase solange abzulassen, bis die Zwischenphase (im vorliegenden Fall hauptsächlich schwere Phase mit Zellen) mit einer niedrigeren elektrischen Leitfähigkeit im Bereich von 40-50 mS/cm detektiert wird. Die automatische Einstellung der Höhe bzw. Eintauchtiefe des Tauchrohrs regelt daher gezielt die Position der Zwischenphase im Abscheider herunter. Wenn keine Zwischenphase vorliegen sollte, wird hierdurch die Phasengrenzfläche zwischen schwerer und leichter Phase entsprechend im Abscheider abgesenkt.
Etwa ab 50 min kommt es bei der Extraktion in Kurve K1 zur charakteristischen Abwechslung von detektierter schwerer Phase (Ausschlag von Kurve K1 in Figur 19A nach oben) und Detektion der Zwischenphase (Ausschlag von Kurve K1 in Figur 19A nach unten). Dies hängt damit zusammen, dass kontinuierlich gearbeitet wird, und daher ständig zu trennendes wässriges Zwei-Phasen-System in den Abscheider geleitet wird. Gleichzeitig wird das Tauchrohr zwischen schwerer Phase und Zwischenphase hin- und herbewegt (Figur 19B), um die schwere Phase und Zwischenphase aus dem Abscheider abfließen zu lassen und zu gewährleisten, dass die erste Sonde zwischen schwerer Phase und Zwischenphase bleibt. Hierdurch wird sichergestellt, dass die leichte Phase nicht mit der schweren Phase verloren geht und dass in regelmäßigen Abständen, die sich im Abscheider aufstauende Zwischenphase, durch das Tauchrohr abgelassen wird.
Eine Analyse zeigt, dass die Antikörper in der abgetrennten leichten Phase angereichert und in gereinigter Form vorliegen.
Beispiel 6
Kontinuierliche Extraktion im Abscheider mit Zellkultur zur Reinigung und Anreicherung von PlasmidDNA in einem wässrigen Zwei-Phasen-Citratsystem
In Beispiel 6 werden kontinuierliche Abscheiderversuche mit Zelllysat aus einer E. coli-Fermentation beschrieben. Das Zelllysat wird über eine alkalische Lyse erhalten, die im Anschluss notwendige Neutralisation erfolgt mit dem für die wässrige Zwei-Phasen-Extraktion (ATPE) ebenfalls notwendigen Salzpuffer (in diesem Beispiel: Citrat). Vorteilhaft ist, dass damit die für die APTE notwenige Salzmenge bereits im Lyseschritt vollständig zugegeben werden kann.
Im Unterschied zu den zuvor beschriebenen Beispielen 5.1 bis 5.4, ist die Zielkomponente in Beispiel 6 Plasmid-DNA (pDNA) anstatt eines monoklonalen Antikörpers. Zudem weist dieses System eine Verteilung der Zielkomponente in die schwere Phase auf, d.h. die Plasmid-DNA ist nach dem Durchmischen mit ausreichendem Stoffaustausch in der schweren Phase angereichert, die vom Rest abgetrennt werden soll. Die Zwischenphase stellt dabei eine Mischung aus nicht koaleszierten Tropfen, dazwischen gebundenen Ausfällungen und aufgeschlossener E. coli-Zellen dar. Das eingesetzte Zwei-Phasen-System verwendet zur Zweiphasenbildung anstelle von Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekularmasse von 400 g/mol (PEG400) ein Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekularmasse von 1450 g/mol (PEG1450). Ähnlich wie in den vorhergehenden Beispielen bilden sich eine polymerreiche, leichte Phase und eine salzreiche, schwere Phase. Ziel- und Nebenkomponenten verteilen sich in diesem Mehrphasensystem so, dass sich das Zielprodukt in der schweren Phase angereichert hat und im Wesentlichen in dieser vorliegt und die unerwünschten Komponenten sich in der Zwischen- und leichten Phase angereichert haben und im Wesentlichen in diesen vorliegen.
Somit kann wieder die Detektion der elektrischen Leitfähigkeit verwendet werden, um das Zielprodukt in der Zielphase (in diesem Beispiel die schwere Phase) von der Gegenphase (in diesem Beispiel die leichte Phase) und der Zwischenphase mit Zelllysat zu trennen.
Zu der in Beispiel 6 durchgeführten kontinuierlichen Extraktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Zwei-Phasen-Citratsystem verwendet, um aus einer Zellkultur das Zielprodukt, hier Plasmid-DNA, zu reinigen und anzureichern. Die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Zellkultur sowie die eingestellten Massenanteile sind in Tabelle 12 zusammengefasst: Tabelle 12: Einwaage und Massenanteile für Beispiel 6
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Das wässrige Zwei-Phasen-Citratsystem wurde bereits in geeigneter Weise in einem statischen Mischer durchmischt, so dass sich die Komponenten zwischen den Phasen aufteilen. Das Zielprodukt sammelt sich in Beispiel 6 in der schweren Phase an. Das wässrige Zwei-Phasen-Citratsystem wird über eine Pumpe mit einem Massenstrom von 60 g/min in den Abscheider gefördert. Bei dieser Förderrate dauert es ungefähr 10 Minuten bis die leichte Phase oben am Auslauf austritt.
Der Versuchsübersicht zu Beispiel 6 ist in der folgenden Tabelle 13 angegeben.
Tabelle 13: Versuchsübersicht zu Beispiel 6
Figure imgf000093_0002
Die gemessenen elektrischen Leitfähigkeiten von Beispiel 6 sind in Figur 20 gegen die Verfahrenszeit in [min] aufgetragen. Beim Anfahren der kontinuierlichen Extraktion ist wieder der typische Verlauf erkennbar. Die erste Sonde (Kurve K1) zeigt als erstes die elektrischen Leitfähigkeitswerte für die leichte Phase mit etwa 5-10 mS/cm an. Die Kurve K1 steigt dann bis etwa 40 mS/cm nahezu konstant an. Bei etwa 40 mS/cm ist ein Abflachen der Steigung erkennbar. Hier wird die Zwischenphase mit Biomasse/Zelllysat detektiert. Die zweite Sonde (Kurve K2) zeigt einen ähnlichen Verlauf beim Anfahren. Die elektrische Leitfähigkeit springt plötzlich auf 10 mS/cm. Hier wird zum ersten Mal leichte Phase detektiert. Ab Minute 35 ist erkennbar, dass die Messwerte für die elektrische Leitfähigkeit sich von denen in den Beispielen 5.1 bis 5.4 unterscheiden. Etwa ab 35 Minuten wird in Kurve K2 die Zwischenphase mit den Zellen detektiert. Sobald die Kurve K2 einen Leitfähigkeitswert von über 25 mS/cm erreicht, wird das Tauchrohr heruntergefahren (nicht dargestellt), das wieder als Überlaufventil eingesetzt wird. Mit dem Tauchrohr wird leichte Phase und Zwischenphase entnommen.
Die elektrische Leitfähigkeit, die an der zweiten Sonde gemessen wird (Kurve K2) beginnt zu sinken, da durch die Veränderung der Tauchrohr-Position die Position der Zwischenphase im Abscheider sinkt und so die leichte Phase (ohne Biomasse und schwere Phase-Tropfen) detektiert wird. Im Laufe des Verfahrens wird diese Regelung der Lage der Zwischenphase (und damit auch die Lage der bei- den Phasengrenzflächen zur schweren und leichten Phase) im Abscheider noch zweimal notwendig (bei Minute 70 und bei Minute 110) (in Figur 20 nicht explizit gezeigt).
Es ist in diesem Zusammenhang darauf hinzuweisen, dass die in Tabelle 1 angegebenen Bereiche für die elektrischen Leitfähigkeiten nur zur Orientierung dienen und auch in hiervon abweichenden Bereichen, wie im vorliegenden Beispiel, liegen können. So liegt der Sollwert-Bereich für die elektrischen Leitfähigkeiten für die schwere Phase hier ab etwa 40 mS/cm, für die leichte Phase ab etwa 10 mS/cm und die Zwischenphase ab etwa 25 mS/cm. Dies ist jedoch unproblematisch, da durch eine Analyse der einzelnen Phase deren Zusammensetzung feststellbar ist. Zudem ist im vorliegenden Beispiel die Trennung der Phasen in einfacher Weise möglich, da der Unterschied der elektrischen Leitfähigkeiten zwischen schwerer Phase einerseits und Zwischenphase und leichter Phase andererseits relativ groß ist und das Zielprodukt in der schweren Phase vorliegt.
Die Ausbeute des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens ist in Figur 21 dargestellt und beträgt 2,43 mg pDNAZ gWCP (nasse Zellmasse; Wet cell paste) und liegt damit in dem für pDNA-Prozesse typischen Bereich von 2-3 mg/g. Durch das verwendete wässrige Zwei-Phasen-System (ATPS) kommt es zu einer erwarteten Erhöhung der Konzentration um den Faktor 3 (Batch-Experiment). Diese durch die Zwei-Phasen-Extraktion (ATPE) beeinflusste Konzentrationsänderung konnte im kontinuierlichen Verfahren mit dem verwendeten System ebenfalls erreicht werden. Somit konnte in Beispiel 6 auch gezeigt werden, dass es nicht zu Verlusten von schwerer Zielphase durch die gesteuerte Position der Zwischenphase im Abscheider kommt.
Beispiel 7
Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen- Citratsystem unter Verwendung von zwei Pumpen
Es wird analog zu Beispiel 6 vorgegangen, jedoch wird die Position der Zwischenphase über zwei Pumpen gesteuert. Zur Einstellung der Position der Zwischenphase im Abscheider werden wieder die Leitfähigkeitsprofile eingesetzt.
Es wird daher eine kontinuierliche Extraktion gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines Zwei-Phasen-Citratsystems durchgeführt, um aus einer Zellkultur das Zielprodukt, hier Plasmid-DNA, zu reinigen und anzureichern. Das Zielprodukt befindet sich im Wesentlichen in der schweren Phase. Die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Zellkultur sowie die eingestellten Massenanteile sind in Tabelle 14 zusammengefasst:
Tabelle 14: Einwaage und Massenanteile für Beispiel 7
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Die in Beispiel 7 eingesetzte Zelllysat-Löung ist bereits mit Citrat-Puffer (35 Gew.-%, pH 6.0) neutralisiert. Das Verhältnis von nicht-neutralisiertem Zelllysat und Puffer ist ca. 1 ,6 (Zelllysat:Citrat-Puffer).
Der Versuchsübersicht zu Beispiel 7 ist in der folgenden Tabelle 15 angegeben.
Tabelle 15: Versuchsübersicht zu Beispiel 7
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Im Unterschied zu Beispiel 6, wo die Entnahme an schwerer Phase über die Höheneinstellung eines Tauchrohrs mit einer Öffnung, das als Überlaufventil fungiert, gesteuert wird, wird in Beispiel 7 die schwere Phase aktiv mit einer Pumpe aus dem Abscheider gefördert. Ebenso wird die leichte Phase über eine zweite Pumpe aus dem Abscheider gefördert.
Um sicherzustellen, dass jeweils nur reine schwere bzw. leichte Phase aus dem Abscheider entnommen wird, werden - wie bereits in den vorangehenden Beispielen erläutert - wieder die Leitfähigkeitsprofile herangezogen.
Sinkt die elektrische Leitfähigkeit an der ersten Sonde zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase unterhalb eines vordefinierten Grenzwertes ab (Kurve M1), wird die Fördergeschwindigkeit der “Schwere Phase”-Pumpe gedrosselt. Steigt wiederum die elektrische Leitfähigkeit der zweiten Sonde zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase (Kurve M2) oberhalb eines vordefinierten Grenzwertes wird die Fördergeschwindigkeit der “Schwere Phase”- Pumpe erhöht.
In Figur 22 sind die Pumpenströme während des Verfahrens zusammengestellt.
Die Beschriftung von Figur 22 ist wie folgt:
Kurve M1 Massenfluss schwere Phase;
Kurve M2 Massenfluss leichte Phase (PEG1450) und
Kurve M3 Massenfluss Zelllysat.
Beispiel 8
Extraktion einer Charge mit einer Ausgangslösung zur Reinigung und Anreicherung von Virus- Capsiden in wässrigen Zwei-Phasen-System im Abscheider. Die Extraktion wird wie in Figur 1 beschrieben durchgeführt. Dabei werden beispielhaft zwei Abscheideversuche mit Virus-Capsiden der Adeno-assoziierten Viren (AAV) aus einer Zellkultur durchgeführt. In den beschriebenen Beispielen mit Virus-Capsiden wird einmal die Zielkomponente in der oberen leichten Phase (Beispiel 8.1) und einmal in der unteren schweren Phase angereichert (Beispiel 8.2).
Im Unterschied zu den zuvor beschriebenen Beispielen 5.1 bis 7, wird für die Zielkomponente ein Virus-Capsid eines Adeno-assoziierten Virus anstatt eines monoklonalen Antikörpers oder PlasmidDNA verwendet. Weiterhin wird ein Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekülmasse von 8000 g/mol sowie ein Ammoniumsulfat-Puffer (siehe Beispiel 8.2) eingesetzt.
Beispiel 8.1
Das im Beispiel 8.1 verwendete System erzeugt eine Verteilung der Zielkomponente in die leichten Phase, d.h. die Virus-Capside befinden sich nach dem Durchmischen mit ausreichendem Stoffaustausch in der leichten Phase angereichert, insbesondere im Wesentlichen in dieser, die vom Rest abgetrennt werden soll.
Im eingesetzten Zwei-Phasen-System wird zur Zweiphasenbildung Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekularmasse von 400 g/mol (PEG400) und ein Phosphatpuffer eingesetzt. Ähnlich wie in den vorhergehenden Beispielen bilden sich eine polymerreiche, leichte Phase und eine salzreiche, schwere Phase. Die Komponenten verteilen sich in diesem Mehrphasensystem so, dass das Zielprodukt, hier: Adeno-assoziierte Viren, in der leichten Phase angereichert ist, insbesondere im Wesentlichen in dieser vorliegt, und unerwünschte Komponenten in der schweren Phase angereichert sind, insbesondere im Wesentlichen in dieser vorliegen.
Die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Virus-Ausgangslösung sowie die eingestellten Massenanteile sind in Tabelle 16 zusammengefasst:
Tabelle 16: Einwaage und Massenanteile für Beispiel 8.1
Einwaage Massenanteil Ist
[g] [Gew.%]
Viruslösung 4,405 44,05
Phosphatpuffer (40 Gew.%, pH 3,875 38,75
8.0)
PEG 400 1 ,720 17,20
Das wässrige Zwei-Phasen-Phosphatsystem wird dabei in geeigneter Weise in dem Trenngefäß gemischt, so dass sich die Komponenten zwischen den Phasen aufteilen können. Das Zielprodukt sammelt sich in Beispiel 8.1 in der leichten Phase bei einer Leitfähigkeit von 6,24 mS/cm an. Die Leitfähigkeit der schweren Phase beträgt 78,7 mS/cm. Beispiel 8.2
Das im Beispiel 8.2 verwendete System erzeugt eine Verteilung der Zielkomponente in der schweren Phase, d.h. die Virus-Capside befinden sich nach dem Durchmischen mit ausreichendem Stoffaustausch in der schweren Phase angereichert, insbesondere im Wesentlichen in dieser, die vom Rest abgetrennt werden soll.
Das eingesetzte Zwei-Phasen-System verwendet zur Zweiphasenbildung Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekularmasse von 8000 g/mol (PEG8000) und Ammoniumsulfat-Puffer. Ähnlich wie in den vorhergehenden Beispielen bilden sich eine polymerreiche, leichte Phase und eine salzreiche, schwere Phase. Die Komponenten verteilen sich in diesem Mehrphasensystem so, dass das Zielprodukt, hier: Adeno-assoziierte Viren, in der schweren Phase angereichert ist, insbesondere im Wesentlichen in dieser Phase vorliegt, und unerwünschte Komponenten in der leichten Phase angereichert sind, insbesondere im Wesentlichen in dieser Phase vorliegen.
Die Einwaage an phasenbildenden Komponenten und Zellkultur sowie die eingestellten Massenanteile sind in Tabelle 17 zusammengefasst. Die Viruslösung hatte eine Ausgangkonzentration von 2,17x 10A9 Capside/ml.
Tabelle 17: Einwaage und Massenanteile für Beispiel 8.2
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Das wässrige Zwei-Phasen-Ammoniumsystem wird dabei in geeigneter Weise in dem Abscheider gemischt, so dass sich die Komponenten zwischen den Phasen aufteilen. Das Zielprodukt sammelt sich in Beispiel 8.2 in der unteren schweren Phase an. Die Leitfähigkeit der unteren schweren Phase beträgt 175,2 mS/cm. Die Leitfähigkeit der oberen leichten Phase beträgt 10,4 mS/cm.
Die Viruslösung hatte bei den Extraktionsversuchen der Beispiele 8.1 und 8.2, durchgeführt in jeweils einer Charge, eine Ausgangkonzentration von 2.17x 10A9 Capside/ml. Die Capside konnten sich komplett in den Zielphasen anreichern. Es konnte in der Gegenphase kein Virus-Capsid bestimmt werden.
Auf Grund der Leitfähigkeitsunterschiede der leichten und schweren Phase, könnten die virenhaltigen Lösungen auch mittels Leitfähigkeitsdetektion und Überführung in Trenngefäße im kontinuierlichen Betrieb getrennt werden (siehe Tabelle 18) Tabelle 18:
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*....“< LLD“ bedeutet das der Capsid-Gehalt unterhalb der Bestimmungsgrenze (engl. Lower Limit of Detection, LLD) liegt.
Beispiel 9
Verlauf einer kontinuierlichen Extraktion in einem Abscheider in einem wässrigen Zwei-Phasen- System unter Verwendung einer Trübungssonde
Zur Darstellung der Umsetzung des Verfahrens mit einer alternativen Messsonde, wird das im Beispiel 6 beschriebene System mit einer Trübungssonde eingesetzt. In diesem Ausführungsbeispiel kommt lediglich eine Sonde, anstelle von zwei Sonden, zum Einsatz. In zeitlichen Abständen wird die Position der Sonde verändert, so dass auch die Trübung der anderen Phasen gemessen werden kann. Mit anderen Worten kann die Sonde hoch- und heruntergefahren werden, um die einzelnen Phasen messen zu können. In Figur 23 ist die zeitliche Aufnahme der Messung gezeigt, um das Messprinzip im Einzelnen zu veranschaulichen. In Figur 23 bedeutet LP leichte Phase, SP schwere Phase und IP Zwischenphase. Die durch senkrechte Striche in Figur 23 markierten, freien Bereiche zwischen der Messung der leichten Phase, schweren Phase und Zwischenphase stellen die Übergänge dar, in denen die Einzelsonde umgestellt, d.h. hoch- oder heruntergefahren wird.
In Figur 23 wird mit der Messung der Trübung in der leichten Phase (LP) gestartet. Nach 9 Minuten wird die Position der Sonde nach unten verlagert, sodass die Trübung der schweren Phase (SP) gemessen werden kann. Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden, sodass auch mit nur einer Sonde die Eigenschaften zweier bzw. dreier Phasen in kurzen Abständen erfasst werden können. Im oberen Bereich von Figur 23 liegt eine hohe (starke) Trübung vor, im unteren Bereich eine geringe Trübung. Die leichte Phase LP weist daher eine hohe Trübung auf, wohingegen die schwere Phase SP eine geringe Trübung zeigt. Bei der Zwischenphase IP zeigen sich überlappende Trübungseigenschaften.
Figur 23 dient daher zur Orientierung und Veranschaulichung des Messprinzips. Für das in diesem Beispiel eingesetzte System kann daher gezeigt werden, dass auch die Trübung ein geeigneter Indikator ist, um zwischen zwei bzw. drei Phasen zu unterscheiden. Eine Trennung der Phasen, basierend auf der Trübungsmessung mit einer oder auch mehr Sonden, kann daher über einen geeigneten Zeitraum ohne weiteres durchgeführt werden. Die Erfindung umfasst Aspekte, die in den nachfolgenden Sätzen offenbart sind, die Teil der Beschreibung darstellen, aber keine Ansprüche sind:
SÄTZE
1 . Verfahren zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes, ausgewählt aus Immunglobulinen oder anderen Proteinen; oder
Plasmid-DNA, genomischer DNA, RNA oder anderen Nukleinsäuren; oder Viren, umfassend die folgenden Schritte: a. Bereitstellen einer Ausgangslösung, die das Zielprodukt enthält; b. Überführen der Ausgangslösung in ein wässriges Zwei-Phasen-System durch Zugeben mindestens eines Polymers und mindestens eines Salzes in geeigneter Konzentration, oder durch Zugeben mindestens zweier Polymere in geeigneter Konzentration; c. Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Erhalt eines ausreichenden Stoff- austauschs, so dass sich das Zielprodukt in der leichten Phase (20, 120) oder in der schweren Phase (40, 140) anreichert; d. Entmischen lassen der Phasen in einer Trennvorrichtung (10, 100) in eine leichte Phase (20, 120), eine schwere Phase (40, 140) und, sofern eine Zwischenphase vorhanden ist, eine Zwischenphase (30, 130); e. kontinuierliches Messen in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) zum Bestimmen der Position der beiden Phasen (20, 120, 40, 140) und der Phasengrenzfläche oder bei Vorliegen einer Zwischenphase (30, 130) der Position der Zwischenphase (30, 130) und der zwei Phasengrenzflächen; f. Entnehmen jeweils der leichten Phase (20, 120), der schweren Phase (40, 140) und bei Vorliegen einer Zwischenphase (30, 130) der Zwischenphase aus der Trennvorrichtung (10, 100) anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeit mindestens einer der Phasen; und g. Gewinnen der Phase mit dem Zielprodukt.
2. Verfahren nach Satz 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) mit einem oder mehreren Leitfähigkeitsmessgeräten in Form von einer, zwei, drei oder mehr Sonden (60, 160.1 , 160.2, 162.1 , 162.2, 162.3, 162.4, 163.1 , 163.2, 163.3, 163.4) durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Satz 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase (140) mindestens eine Sonde (160.1 , 162.1 , 163.1) und zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase (20, 120) mindestens eine Sonde (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) an geeigneter Position in der Trennvorrichtung (100) eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Trennvorrichtung (10) ein Auslass (50) vorgesehen wird und das Entnehmen der Phasen (10, 20, 30) aus der Trennvorrichtung (10) durch den Auslass (50) gemäß Schritt f. durch Schwerkraft oder unter Verwendung von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird; oder in der Trennvorrichtung (100) ein oberer Auslass (150.2) vorgesehen wird und das Entnehmen der leichten Phase (120) aus dem oberen Auslass (150.2) der Trennvorrichtung (100) unter Verwendung von Schwerkraft oder von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird, und in der Trennvorrichtung (100) ein unterer Auslass (150.1) vorgesehen wird und das Entnehmen der schweren Phase (140) aus einem unteren Auslass (150.1) der Trennvorrichtung (100) unter Verwendung von Schwerkraft oder von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe aus der Trennvorrichtung (100) durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Entnehmen einer Phase gemäß Schritt f. im kontinuierlichen Betrieb durch ein höhenverstellbares Tauchrohr (180, 182) durchgeführt wird, das eine Öffnung (190, 192) aufweist, die in die zu entnehmende Phase eingetaucht wird, wobei das Tauchrohr (180) mit dem unteren Auslass (150.2) derart verbunden wird, dass durch die Öffnung (182) im Tauchrohr (180) die Phase unter Schwerkraft zum Auslass (150.1) abfließen kann oder das Tauchrohr (190) eine Öffnung (192) aufweist, durch die das Entnehmen der Phase unter Verwendung von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das höhenverstellbare Tauchrohr (180, 190) mit einem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr (183, 193) eingesetzt wird, wobei das Tauchrohr (180, 190) aus einem höhenverstellbaren Innenrohr (181 , 191), welches eine Öffnung (182, 192) zur Entnahme einer der Phasen aufweist, und einem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr (183, 193) ausgebildet wird, und die Länge des Überrohrs (183) durch ein oberes Ende, das oberhalb der leichten Phase (120) angeordnet ist und ein unteres Ende (183a, 193a) festgelegt wird, wobei der Durchmesser des Überrohrs (183, 193) größer eingestellt wird als der Durchmesser des Innenrohrs (181 , 191), so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr (183, 193) gebildet wird, und die Länge des Überrohrs (183) so gewählt wird, dass das Überrohr (183, 193) über die Öffnung (182, 192) des Innenrohrs (181 , 191) hinausragt und das untere Ende (183a, 193a) des Überrohrs (183, 193) in die schwere Phase (140) oder, sofern vorhanden, in die Zwischenphase (130) eingetaucht wird, so dass die Flüssigkeit der Phase, in die das untere Ende (183a, 193a) des Überrohrs (183, 193) eintaucht, im Zwischenraum hochsteigt und durch die Öffnung (182, 192) im Innenrohr (181 , 191) austreten kann.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das höhenverstellbare Tauchrohr (180, 190) mit einem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr eingesetzt wird, wobei das höhenverstellbare Tauchrohr aus einem höhenverstellbaren Innenrohr (181 , 191), welches eine Öffnung (182, 192) zur Entnahme einer der Phasen aufweist, und einem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr ausgebildet wird, und die Länge des Überrohrs durch ein unteres Ende, das unterhalb der schweren Phase (140) angeordnet ist und ein oberes Ende festgelegt wird, wobei der Durchmesser des Überrohrs größer eingestellt wird als der Durchmesser des Innenrohrs, so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr gebildet wird, und die Länge des Überrohrs so gewählt wird, dass das Überrohr über die Öffnung (182, 192) des Innenrohrs (181 , 191) hinausragt und das obere Ende des Überrohrs in die leichte Phase (120) oder, sofern vorhanden, in die Zwischenphase (130) eingetaucht wird, so dass die Flüssigkeit der Phase, in die das obere Ende des Überrohrs eintaucht, in den Zwischenraum hineinfließt und durch die Öffnung (182, 192) im Innenrohr (181 , 191) austreten kann.
8. Verfahren nach Satz 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des sich von oben nach unten erstreckenden Überrohrs (183, 193) und dessen Durchmesser derart gewählt werden, dass der Zutritt von Schwebstoffen, Flocken und anderen festen oder halbfesten Bestandteilen, in den Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr (183, 193) durch das Überrohr (183, 193) verhindert wird; oder die Länge des sich von unten nach oben erstreckenden Überrohrs und dessen Durchmesser derart gewählt werden, dass der Zutritt von Schwebstoffen, Flocken und anderen festen oder halbfesten Bestandteilen, in den Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr durch das Überrohr verhindert wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde(n) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) für die leichte Phase (120) in der Trennvorrichtung (100) tiefer als der obere Auslass (150.2) positioniert wird (werden) und die Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) für die schwere Phase (140) in der Trennvorrichtung (100) höher als der untere Auslass (150.1) angeordnet wird (werden); und/oder ein Tauchrohr (180, 190) mit oder ohne Überrohr (183, 193) eingesetzt wird, wobei bei Verwendung eines Tauchrohrs (180, 190) ohne Überrohr (183, 193) sich die Öffnung (182, 192) des Tauchrohrs (180, 190) zum Entnehmen der schweren Phase (140) tiefer als die Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) in der schweren Phase (140) befindet (befinden) und wobei sich die Öffnung (182, 192) eines Tauchrohrs (180, 190) zum Entnehmen der leichten Phase (120) höher als die Sonde^) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) in der leichten Phase (120) befindet (befinden); und wobei bei Verwendung eines Tauchrohrs (180, 190) mit sich von oben nach unten erstreckendem Überrohr (183, 193) bei der Entnahme der schweren Phase (140) durch die Öffnung (182, 192) des Tauchrohres (180, 190) sich das untere Ende (183a, 193a) des Überrohrs (183, 193) zum Entnehmen der schweren Phase (140) tiefer als die Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) in der schweren Phase (140) befindet (befinden); und wobei bei Verwendung eines Tauchrohrs mit sich von unten nach oben erstreckendem Überrohr bei der Entnahme der leichten Phase (120) durch die Öffnung (182, 192) des Tauchrohres das obere Ende des Überrohrs zum Entnehmen der leichten Phase (120) höher als die Sonde(n) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) in der leichten Phase (120) befindet (befinden).
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase (120) in der Trennvorrichtung (100) in Schritt e. für eine oder mehrere Sonde(n) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) jeweils einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit ergibt, der mit einem Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase (120) verglichen wird und bei Überschreiten des Sollwert-Bereichs schwere Phase (140) entnommen wird, wobei die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer für die schwere Phase (140) so geregelt werden, dass die gemessene Leitfähigkeit der leichten Phase (120) wieder im Sollwert-Bereich liegt; oder das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase (140) in der Trennvorrichtung (100) in Schritt e. für eine oder mehrere Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) jeweils einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit ergibt, der mit einem Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase verglichen wird und bei Unterschreiten des Sollwert-Bereichs weniger schwere Phase (140) entnommen wird, wobei die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer für die schwere Phase (140) so geregelt werden, dass die gemessene Leitfähigkeit der leichten Phase (120) wieder im Sollwert-Bereich liegt.
11 . Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Leitfähigkeitswerte dazu eingesetzt werden im kontinuierlichen Betrieb die Position der Phasen und Phasengrenzfläche(n) zu variieren, indem eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen kontrolliert und gesteuert werden: die Entnahmegeschwindigkeit für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmegeschwindigkeit für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmemenge für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmemenge für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmedauer für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmedauer für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahme der leichten oder schweren Phase unterbrochen wird; die Zuführmenge des in die Trennvorrichtung (100) einströmenden wässrigen Zwei-Phasen- System, mit oder ohne das Zielprodukt, erhöht oder verringert wird, wobei das wässrigen Zwei-Phasen-System ohne Zielprodukt eine Spüllösung darstellt; die Zuführgeschwindigkeit des in die Trennvorrichtung einströmendenm wässrigen Zwei- Phasen-Systems, mit oder ohne Zielprodukt, erhöht oder verringert wird, wobei das wässrigen Zwei-Phasen-System ohne Zielprodukt eine Spüllösung darstellt; und/oder das Tauchrohr zum Abfließen lassen oder Absaugen einer oder zweier Phasen hoch- oder heruntergefahren wird und gegebenenfalls nach oben oder unten nachpositioniert wird; wobei die ein oder mehreren Entnahme-Vorrichtungen und/oder Mittel zur Durchführung der obigen Maßnahmen eingesetzt werden können:
Schwerkraft;
Überdruck;
Unterdrück; eine oder mehrere Pumpen; und/oder
Entnahme-Vorrichtungen zum kontrollierten Ablassen oder Unterbrechen der Entnahme der Phasen am Auslass, ausgewählt aus stufenlos regelbaren Ventilen mit unterschiedlichem Öff- nungsgrad, regelbaren Schlauchquetschklemmen, regelbaren Absperrhähnen oder regelbaren Durchflussbegrenzern.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) zwei, drei, vier oder mehr Sonden (160.1 , 160.2, 162.1 , 162.2, 162.3, 162.4, 163.1 , 163.2, 163.3,
163.4) jeweils in eine Einführöffnung (157.1 , 157.2, 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4, 159.1 , 159.2, 159.3,
159.4) in der Wand (155) der Trennvorrichtung (100) eingeführt und eingesetzt werden, wobei die Einführöffnungen (157.1 , 157.2, 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4, 159.1 , 159.2, 159.3, 159.4) eine Anordnung aufweisen, die ausgewählt wird aus: einer axialen Anordnung der Einführöffnungen (157.1 , 157.2), wobei die Einführöffnungen (157.1 , 157.2) auf einer geraden Verbindungslinie angeordnet werden; einer radialen Anordnung der Einführöffnungen (158.1 , 158.2, 158.3, 158.4), wobei die Einführöffnungen (158.1 , 158.2, 158.3, 158.4) in einem Kreisbogen, angeordnet werden; oder einer radial versetzten Anordnung der Einführöffnungen (159.1 , 159.2, 159.3, 159.4), wobei die Einführöffnungen (159.1 , 159.2, 159.3, 159.4) in einem Kreisbogen und zusätzlich in eine Vorzugsrichtung verschoben, angeordnet werden.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Erhalt eines ausreichenden Stoffaustauschs durchgeführt wird, indem ein aktives Durchmischen und/oder ein statisches Durchmischen eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt wird: das Verfahren wird kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt; als Ausgangslösung wird eine Zellkultur, ein Zellkulturüberstand oder ein Zelllysat verwendet, worin das Zielprodukt enthalten ist; mit der Ausgangslösung wird ein wässriges Zwei-Phasen-System hergestellt, bei dem ein Phasenverhältnis von der Phase, enthaltend das Zielprodukt, zur Gegenphase von > 1 ,1 vorliegt; ein Dichteverhältnis von leichter Phase (20, 120) zu schwerer Phase (40, 140) von mindestens 1 ,06 wird eingesetzt; im wässrigen Zwei-Phasen-System wird als Polymer oder als eines der Polymere Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol (PPG), Dextran, PEG-PPG-PEG-Copolymer (EOPO) oder Mischungen dieser eingesetzt; im wässrigen Zwei-Phasen-System wird als Polymer Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 8000 g/mol eingesetzt; im wässrigen Zwei-Phasen-System wird mindestens ein Polymer in einer Konzentration von 5 bis 35 Gewichts-%, bezogen auf die Gesamtmenge an wässrigem Zwei-Phasen-System, eingesetzt.; als Salz oder als eines der Salze im wässrigen Zwei-Phasen-System wird ein Phosphatsalz, Ammoniumsalz, Kaliumsalze, Acetatsalze, Natriumsalze oder Citratsalz oder Mischungen dieser eingesetzt; anstelle eines Salzes wird eine Säure, ausgewählt aus Zitronensäure oder Essigsäure eingesetzt; dem wässrigen Zwei-Phasen-System werden stabilisierende Komponenten, ausgewählt aus Amminosäuren, Zucker oder anderen stabilisierenden Additiven, zugegeben; das Verfahren wird kontinuierlich durchgeführt, aber die Schritte a. und/oder d. werden semikontinuierlich durchgeführt. 15. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden leichten Phase (120) der Trennvorrichtung (100) eine Spüllösung (115) zugegeben wird, die die Zielprodukt enthaltende leichte Phase (120) aus der Trennvorrichtung (100) verdrängt und diese somit durch den oben angeordneten Auslass (150.2) entnommen werden kann und/oder am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden leichten Phase (120) keine schwere Phase (140) mehr entnommen wird, diese sich dadurch aufstaut und die leichte Phase (120) nach oben verdrängt, so dass die leichte Phase (120) durch den oben angeordneten Auslass (150.2) entnommen werden kann.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Sätze 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden schwere Phase (140) der Trennvorrichtung (100) eine Spüllösung (115) zugegeben wird, die die Zielprodukt enthaltende schwere Phase (140) aus der Trennvorrichtung (100) verdrängt und diese somit durch den unten angeordneten Auslass (150.1 , 150.3) entnommen werden kann und/oder am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden schweren Phase (140) keine leichte Phase (120) mehr entnommen wird, diese sich dadurch aufstaut und die schwere Phase (140) nach unten verdrängt, so dass die schwere Phase (140) durch den unten angeordneten Auslass (150.1 , 150.3) entnommen werden kann.
17. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Sätze 1 bis 16, umfassend eine Trennvorrichtung (10, 100) zum Trennen der Phasen; mindestens einen Auslass (50, 150.1 , 150.2) in der Trennvorrichtung (10, 100); mindestens eine Sonde (60, 160.1 , 160.2, 162.1 , 162.2, 162.3, 162.4, 163.1 , 163.2, 163.3, 163.4) zum Messen der elektrischen Leitfähigkeit in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100); eine oder mehrere Entnahme-Vorrichtung(en) und/oder Mittel zur Regelung und/oder Steuerung der Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer der leichten Phase (20, 120), der schweren Phase (40, 140) und, sofern vorhanden, der Zwischenphase (30, 130), basierend auf den Messwerten der elektrischen Leitfähigkeit in mindestens einer Phase.
18. Verwendung des Verfahrens nach einem der Sätze 1 bis 16 oder der Vorrichtung nach Satz 17 zum Einstellen der Lage der Phasen in einer Trennvorrichtung (10, 100) und Abtrennen der Phasen anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte mindestens einer der Phasen. BEZUGSZEICHENLISTE:
10, 100 Trennvorrichtung
15 Rührwelle
20, 120 leichte Phase
25, 125 Motor
30, 130 Zwischenphase
40, 140 schwere Phase
50, 150.1 , 150.2 Auslass
60 Sonde zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit
110 zu trennende ATPS-Lösung
115 Spüllösung
120a, 120c Kurve für die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase
120b, 120d Kurve für die Trübung der leichten Phase
130c Kurve für die elektrische Leitfähigkeit der Zwischenphase
135 Regler
140a, 140c Kurve für die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase
140b, 140d Kurve für die Trübung der schweren Phase
150.1 , 150.2, 150.3 Auslass
155 Wand der Trennvorrichtung
157.1 , 157.2, 158.1 , 158.2, Einführöffnungen für die Sonden
158.3, 158.4, 159.1 , 159.2Einführöffnungen für die Sonden
159.3, 159.4 Einführöffnungen für die Sonden
160.1 Sonde für die schwere Phase
160.2 Sonde für die leichte Phase
162.1 , 162.2, 162.3, 162.4Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit
163.1 , 163.2, 163.3, 163.4Sonden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit
180, 190 Tauchrohr
181 , 191 Innenrohr
182, 192 Öffnung
183, 193 Überrohr oder Hüllrohr
183a, 193a Ende des Überrohrs
189, 199 Höhenverstellbarkeit des Tauchrohrs
200, 202 Schaubild
Anfahren kontinuierlicher Betrieb
III Abfahren LITERATURVERZEICHNIS:
1. Sommerfeld, S.; Strube, J. Challenges in biotechnology production - Generic processes and process optimization for monoclonal antibodies. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification 2005, 44, 1123-1137, doi:10.1016/j.cep.2005.03.006;
2. Gronemeyer, P.; Ditz, R.; Strube, J. Trends in Upstream and Downstream Process Development for Antibody Manufacturing. Bioengineering 2014, 1 , 188-212, doi : 10.3390/bioengineeringl 040188;
3. Urthaler, J.; Buchinger, W.; Necina, R. Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy, Acta Biochim Pol 2019, 52, 703-711 , doi:10.18388/abp.2005_3434;
4. Merten, Otto-Wilhelm, et al., 26: Production and purification of viral vectors and safety considerations related to their use, Advanced Textbook on Gene Transfer, Gene Therapy and Genetic Pharmacology: Principles, Delivery and Pharmacological and Biomedical Applications of Nucleotide-Based Therapies, 2014, 493-515;
5. Luechau, F.; Ling, T.C.; Lyddiatt, A. A descriptive model and methods for up-scaled process routes for interfacial partition of bioparticles in aqueous two-phase systems. Biochemical Engineering Journal 2010, 50, 122-130, doi:10.1016/j.bej.2010.04.006;
6. Leonard, R.A. Recent Advances in Centrifugal Contactor Design. Separation Science and Technology 1988, 23, 1473-1487, doi:10.1080/01496398808075643;
7. WO 2014/135420 A1 ;
8. Frerix, A., et al., Scalable recovery of plasmid DNA based on aqueous two-phase separation, Biotechnology and Applied Biochemistry, 2005, 42(1): S. 57-66;
9. DE 44 00 397 A1 ;
10. DE 199 23 901 A1 ;
11. KR 101 143 889 B1 ;
12. US 3 220 930 A;
13. EP 1 059 105 A2 und
14. EP 1 762 616 A1.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zum Reinigen und Anreichern eines Zielproduktes, ausgewählt aus Immunglobulinen oder anderen Proteinen; oder
Plasmid-DNA, genomischer DNA, RNA oder anderen Nukleinsäuren; oder Viren, umfassend die folgenden Schritte: a. Bereitstellen einer Ausgangslösung, die das Zielprodukt enthält; b. Überführen der Ausgangslösung in ein wässriges Zwei-Phasen-System durch Zugeben mindestens eines Polymers und mindestens eines Salzes in geeigneter Konzentration, oder durch Zugeben mindestens zweier Polymere in geeigneter Konzentration; c. Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems unter Erhalt eines Stoffaustauschs, so dass sich das Zielprodukt in der leichten Phase (20, 120) oder in der schweren Phase (40, 140) anreichert; d. Entmischen lassen der Phasen in einer Trennvorrichtung (10, 100) in eine leichte Phase (20, 120), eine schwere Phase (40, 140) und, sofern eine Zwischenphase vorhanden ist, eine Zwischenphase (30, 130); e. kontinuierliches Messen der elektrischen Leitfähigkeit in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) zum Bestimmen der Position der beiden Phasen (20, 120, 40, 140) und der Phasengrenzfläche oder bei Vorliegen einer Zwischenphase (30, 130) der Position der Zwischenphase (30, 130) und der zwei Phasengrenzflächen; f. Entnehmen jeweils der leichten Phase (20, 120), der schweren Phase (40, 140) und bei Vorliegen einer Zwischenphase (30, 130) der Zwischenphase aus der Trennvorrichtung (10, 100) anhand der kontinuierlich gemessenen elektrischen Leitfähigkeit mindestens einer der Phasen in Schritt e.; und g. Gewinnen der Phase mit dem Zielprodukt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) mit einem oder mehreren Leitfähigkeitsmessgeräten in Form von einer, zwei, drei oder mehr Sonden (60, 160.1 , 160.2, 162.1 , 162.2, 162.3, 162.4, 163.1 , 163.2, 163.3, 163.4) durchgeführt wird, insbesondere zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase (140) mindestens eine Sonde (160.1 , 162.1 , 163.1) und zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase (20, 120) mindestens eine Sonde (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) an geeigneter Position in der Trennvorrichtung (100) eingesetzt wird.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der Trennvorrichtung (10) ein Auslass (50) vorgesehen wird und das Entnehmen der Phasen (10, 20, 30) aus der Trennvorrichtung (10) durch den Auslass (50) gemäß Schritt f. durch Schwerkraft oder unter Verwendung von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird; oder in der Trennvorrichtung (100) ein oberer Auslass (150.2) vorgesehen wird und das Entnehmen der leichten Phase (120) aus dem oberen Auslass (150.2) der Trennvorrichtung (100) unter Verwendung von Schwerkraft oder von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird, und in der Trennvorrichtung (100) ein unterer Auslass (150.1) vorgesehen wird und das Entnehmen der schweren Phase (140) aus einem unteren Auslass (150.1) der Trennvorrichtung (100) unter Verwendung von Schwerkraft oder von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe aus der Trennvorrichtung (100) durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Entnehmen einer Phase gemäß Schritt f. im kontinuierlichen Betrieb durch ein höhenverstellbares Tauchrohr (180, 182) durchgeführt wird, das eine Öffnung (190, 192) aufweist, die in die zu entnehmende Phase eingetaucht wird, wobei das Tauchrohr (180) mit dem unteren Auslass (150.2) derart verbunden wird, dass durch die Öffnung (182) im Tauchrohr (180) die Phase unter Schwerkraft zum Auslass (150.1) abfließen kann oder das Tauchrohr (190) eine Öffnung (192) aufweist, durch die das Entnehmen der Phase unter Verwendung von Überdruck oder Unterdrück, erzeugt mit oder ohne eine Pumpe, oder einer Pumpe durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das höhenverstellbare Tauchrohr (180, 190) mit einem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr (183, 193) eingesetzt wird, wobei das Tauchrohr (180, 190) aus einem höhenverstellbaren Innenrohr (181 , 191), welches eine Öffnung (182, 192) zur Entnahme einer der Phasen aufweist, und einem sich von oben nach unten erstreckenden Überrohr (183, 193) ausgebildet wird, und die Länge des Überrohrs (183) durch ein oberes Ende, das oberhalb der leichten Phase (120) angeordnet ist und ein unteres Ende (183a, 193a) festgelegt wird, wobei der Durchmesser des Überrohrs (183, 193) größer eingestellt wird als der Durchmesser des Innenrohrs (181 , 191), so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr (183, 193) gebildet wird, und die Länge des Überrohrs (183) so gewählt wird, dass das Überrohr (183, 193) über die Öffnung (182, 192) des Innenrohrs (181 , 191) hinausragt und das untere Ende (183a, 193a) des Überrohrs (183, 193) in die schwere Phase (140) oder, sofern vorhanden, in 108 die Zwischenphase (130) eingetaucht wird, so dass die Flüssigkeit der Phase, in die das untere Ende (183a, 193a) des Überrohrs (183, 193) eintaucht, im Zwischenraum hochsteigt und durch die Öffnung (182, 192) im Innenrohr (181 , 191) austreten kann; oder das höhenverstellbare Tauchrohr (180, 190) mit einem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr eingesetzt wird, wobei das höhenverstellbare Tauchrohr aus einem höhenverstellbaren Innenrohr (181 , 191), welches eine Öffnung (182, 192) zur Entnahme einer der Phasen aufweist, und einem sich von unten nach oben erstreckenden Überrohr ausgebildet wird, und die Länge des Überrohrs durch ein unteres Ende, das unterhalb der schweren Phase (140) angeordnet ist und ein oberes Ende festgelegt wird, wobei der Durchmesser des Überrohrs größer eingestellt wird als der Durchmesser des Innenrohrs, so dass ein Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr gebildet wird, und die Länge des Überrohrs so gewählt wird, dass das Überrohr über die Öffnung (182, 192) des Innenrohrs (181 , 191) hinausragt und das obere Ende des Überrohrs in die leichte Phase (120) oder, sofern vorhanden, in die Zwischenphase (130) eingetaucht wird, so dass die Flüssigkeit der Phase, in die das obere Ende des Überrohrs eintaucht, in den Zwischenraum hineinfließt und durch die Öffnung (182, 192) im Innenrohr (181 , 191) austreten kann.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des sich von oben nach unten erstreckenden Überrohrs (183, 193) und dessen Durchmesser derart gewählt werden, dass der Zutritt von Schwebstoffen, Flocken und anderen festen oder halbfesten Bestandteilen, in den Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr (183, 193) durch das Überrohr (183, 193) verhindert wird; oder die Länge des sich von unten nach oben erstreckenden Überrohrs und dessen Durchmesser derart gewählt werden, dass der Zutritt von Schwebstoffen, Flocken und anderen festen oder halbfesten Bestandteilen, in den Zwischenraum zwischen Innenrohr (181 , 191) und Überrohr durch das Überrohr verhindert wird.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde(n) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) für die leichte Phase (120) in der Trennvorrichtung (100) tiefer als der obere Auslass (150.2) positioniert wird (werden) und die Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) für die schwere Phase (140) in der Trennvorrichtung (100) höher als der untere Auslass (150.1) angeordnet wird (werden); und/oder ein Tauchrohr (180, 190) mit oder ohne Überrohr (183, 193) eingesetzt wird, 109 wobei bei Verwendung eines Tauchrohrs (180, 190) ohne Überrohr (183, 193) sich die Öffnung (182, 192) des Tauchrohrs (180, 190) zum Entnehmen der schweren Phase (140) tiefer als die Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) in der schweren Phase (140) befindet (befinden) und wobei sich die Öffnung (182, 192) eines Tauchrohrs (180, 190) zum Entnehmen der leichten Phase (120) höher als die Sonde^) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) in der leichten Phase (120) befindet (befinden); und wobei bei Verwendung eines Tauchrohrs (180, 190) mit sich von oben nach unten erstreckendem Überrohr (183, 193) bei der Entnahme der schweren Phase (140) durch die Öffnung (182, 192) des Tauchrohres (180, 190) sich das untere Ende (183a, 193a) des Überrohrs (183, 193) zum Entnehmen der schweren Phase (140) tiefer als die Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) in der schweren Phase (140) befindet (befinden); und wobei bei Verwendung eines Tauchrohrs mit sich von unten nach oben erstreckendem Überrohr bei der Entnahme der leichten Phase (120) durch die Öffnung (182, 192) des Tauchrohres das obere Ende des Überrohrs zum Entnehmen der leichten Phase (120) höher als die Sonde(n) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) in der leichten Phase (120) befindet (befinden).
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der leichten Phase (120) in der Trennvorrichtung (100) in Schritt e. für eine oder mehrere Sonde(n) (160.2, 162.3, 162.4, 163.3, 163.4) jeweils einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit ergibt, der mit einem Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit der leichten Phase (120) verglichen wird und bei Überschreiten des Sollwert-Bereichs schwere Phase (140) entnommen wird, wobei die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer für die schwere Phase (140) so geregelt werden, dass die gemessene Leitfähigkeit der leichten Phase (120) wieder im Sollwert-Bereich liegt; oder das kontinuierliche Messen der elektrischen Leitfähigkeit der schweren Phase (140) in der Trennvorrichtung (100) in Schritt e. für eine oder mehrere Sonde(n) (160.1 , 162.1 , 163.1) jeweils einen Wert für die elektrische Leitfähigkeit ergibt, der mit einem Sollwert-Bereich für die elektrische Leitfähigkeit der schweren Phase verglichen wird und bei Unterschreiten des Sollwert-Bereichs weniger schwere Phase (140) entnommen wird, wobei die Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer für die schwere Phase (140) so geregelt werden, dass die gemessene Leitfähigkeit der leichten Phase (120) wieder im Sollwert-Bereich liegt.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Leitfähigkeitswerte dazu eingesetzt werden im kontinuierlichen Betrieb die Position der Phasen und Phasengrenzfläche(n) zu variieren, indem eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen kontrolliert und gesteuert werden: die Entnahmegeschwindigkeit für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmegeschwindigkeit für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmemenge für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; 110 die Entnahmemenge für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmedauer für die schwere Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahmedauer für die leichte Phase erhöht oder verringert wird; die Entnahme der leichten oder schweren Phase unterbrochen wird; die Zuführmenge des in die Trennvorrichtung (100) einströmenden wässrigen Zwei-Phasen- System, mit oder ohne das Zielprodukt, erhöht oder verringert wird, wobei das wässrigen Zwei-Phasen-System ohne Zielprodukt eine Spüllösung darstellt; die Zuführgeschwindigkeit des in die Trennvorrichtung einströmenden wässrigen Zwei- Phasen-Systems, mit oder ohne Zielprodukt, erhöht oder verringert wird, wobei das wässrigen Zwei-Phasen-System ohne Zielprodukt eine Spüllösung darstellt; und/oder das Tauchrohr zum Abfließen lassen oder Absaugen einer oder zweier Phasen hoch- oder heruntergefahren wird und gegebenenfalls nach oben oder unten nachpositioniert wird; wobei die ein oder mehreren Entnahme-Vorrichtungen und/oder Mittel zur Durchführung der obigen Maßnahmen eingesetzt werden können:
Schwerkraft;
Überdruck;
Unterdrück; eine oder mehrere Pumpen; und/oder
Entnahme-Vorrichtungen zum kontrollierten Ablassen oder Unterbrechen der Entnahme der Phasen am Auslass, ausgewählt aus stufenlos regelbaren Ventilen mit unterschiedlichem Öff- nungsgrad, regelbaren Schlauchquetschklemmen, regelbaren Absperrhähnen oder regelbaren Durchflussbegrenzern.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) zwei, drei, vier oder mehr Sonden (160.1 , 160.2, 162.1 , 162.2, 162.3, 162.4, 163.1 , 163.2, 163.3,
163.4) jeweils in eine Einführöffnung (157.1 , 157.2, 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4, 159.1 , 159.2, 159.3,
159.4) in der Wand (155) der Trennvorrichtung (100) eingeführt und eingesetzt werden, wobei die Einführöffnungen (157.1 , 157.2, 158.1 , 158.2, 158.3, 158.4, 159.1 , 159.2, 159.3, 159.4) eine Anordnung aufweisen, die ausgewählt wird aus: einer axialen Anordnung der Einführöffnungen (157.1 , 157.2), wobei die Einführöffnungen (157.1 , 157.2) auf einer geraden Verbindungslinie angeordnet werden; einer radialen Anordnung der Einführöffnungen (158.1 , 158.2, 158.3, 158.4), wobei die Einführöffnungen (158.1 , 158.2, 158.3, 158.4) in einem Kreisbogen, angeordnet werden; oder einer radial versetzten Anordnung der Einführöffnungen (159.1 , 159.2, 159.3, 159.4), wobei die Einführöffnungen (159.1 , 159.2, 159.3, 159.4) in einem Kreisbogen und zusätzlich in eine Vorzugsrichtung verschoben, angeordnet werden. 111
11 . Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Durchmischen des wässrigen Zwei-Phasen-Systems durchgeführt wird, indem ein aktives Durchmischen und/oder ein statisches Durchmischen eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt wird: das Verfahren wird kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt; als Ausgangslösung wird eine Zellkultur, ein Zellkulturüberstand oder ein Zelllysat verwendet, worin das Zielprodukt enthalten ist; mit der Ausgangslösung wird ein wässriges Zwei-Phasen-System hergestellt, bei dem ein Phasenverhältnis von der Phase, enthaltend das Zielprodukt, zur Gegenphase von > 1 ,1 vorliegt; ein Dichteverhältnis von leichter Phase (20, 120) zu schwerer Phase (40, 140) von mindestens 1 ,06 wird eingesetzt; im wässrigen Zwei-Phasen-System wird als Polymer oder als eines der Polymere Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol (PPG), Dextran, PEG-PPG-PEG-Copolymer (EOPO) oder Mischungen dieser eingesetzt; im wässrigen Zwei-Phasen-System wird als Polymer Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 8000 g/mol eingesetzt; im wässrigen Zwei-Phasen-System wird mindestens ein Polymer in einer Konzentration von 5 bis 35 Gewichts-%, bezogen auf die Gesamtmenge an wässrigem Zwei-Phasen-System, eingesetzt.; als Salz oder als eines der Salze im wässrigen Zwei-Phasen-System wird ein Phosphatsalz, Ammoniumsalz, Kaliumsalze, Acetatsalze, Natriumsalze oder Citratsalz oder Mischungen dieser eingesetzt; anstelle eines Salzes wird eine Säure, ausgewählt aus Zitronensäure oder Essigsäure eingesetzt; dem wässrigen Zwei-Phasen-System werden stabilisierende Komponenten, ausgewählt aus Amminosäuren, Zucker oder anderen stabilisierenden Additiven, zugegeben; das Verfahren wird kontinuierlich durchgeführt, aber die Schritte a. und/oder d. werden semikontinuierlich durchgeführt.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle oder zusätzlich zum kontinuierlichen Messen der elektrischen Leitfähigkeit die Trübung in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100) kontinuierlich gemessen wird, wobei die Trübung mit einem oder mehreren Trübungsmessgeräten in Form von einer, zwei, drei oder mehr Sonden durchgeführt werden kann. 112
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden leichten Phase (120) der Trennvorrichtung (100) eine Spüllösung (115) zugegeben wird, die die Zielprodukt enthaltende leichte Phase (120) aus der Trennvorrichtung (100) verdrängt und diese somit durch den oben angeordneten Auslass (150.2) entnommen werden kann und/oder am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden leichten Phase (120) keine schwere Phase (140) mehr entnommen wird, diese sich dadurch aufstaut und die leichte Phase (120) nach oben verdrängt, so dass die leichte Phase (120) durch den oben angeordneten Auslass (150.2) entnommen werden kann; oder am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden schwere Phase (140) der Trennvorrichtung (100) eine Spüllösung (115) zugegeben wird, die die Zielprodukt enthaltende schwere Phase (140) aus der Trennvorrichtung (100) verdrängt und diese somit durch den unten angeordneten Auslass (150.1 , 150.3) entnommen werden kann und/oder am Ende des Extraktionsverfahrens zur Restentleerung einer das Zielprodukt enthaltenden schweren Phase (140) keine leichte Phase (120) mehr entnommen wird, diese sich dadurch aufstaut und die schwere Phase (140) nach unten verdrängt, so dass die schwere Phase (140) durch den unten angeordneten Auslass (150.1 , 150.3) entnommen werden kann.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend eine Trennvorrichtung (10, 100) zum Trennen der Phasen; mindestens einen Auslass (50, 150.1 , 150.2) in der Trennvorrichtung (10, 100); mindestens eine Sonde (60, 160.1 , 160.2, 162.1 , 162.2, 162.3, 162.4, 163.1 , 163.2, 163.3, 163.4) zum Messen der elektrischen Leitfähigkeit und/oder mindestens eine Sonde zum Messen der Trübung in mindestens einer der Phasen in der Trennvorrichtung (10, 100); eine oder mehrere Entnahme-Vorrichtung(en) und/oder Mittel zur Regelung und/oder Steuerung der Entnahmemenge, Entnahmegeschwindigkeit und/oder Entnahmedauer der leichten Phase (20, 120), der schweren Phase (40, 140) und, sofern vorhanden, der Zwischenphase (30, 130), basierend auf den Messwerten der elektrischen Leitfähigkeit und/oder basierend auf den Messwerten der Trübung in mindestens einer Phase.
16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder der Vorrichtung nach Anspruch 15 zum Einstellen der Lage der Phasen in einer Trennvorrichtung (10, 100) und Abtrennen der Phasen anhand der gemessenen elektrischen Leitfähigkeitswerte mindestens einer der Phasen und/oder anhand der gemessenen Trübungswerte mindestens einer der Phasen.
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