WO2022071671A1 - 안정성이 개선된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 조성물 - Google Patents

안정성이 개선된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 조성물 Download PDF

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botulinum toxin
protein
composition
light chain
stabilizer
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박지예
안병준
천혜연
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    • A61K2800/52—Stabilizers

Definitions

  • the present disclosure relates to compositions with improved stability of recombinant botulinum toxin light chain proteins.
  • Botulinum toxin is a polypeptide product of the anaerobic bacterium Clostridium botulinum , and is a kind of neurotoxin.
  • the toxin causes muscle paralysis by blocking the presynaptic release of the neurotransmitter acetylcholine at the mammalian neuromuscular junction.
  • botulinum toxin is therapeutically used to treat involuntary muscle movement disorders.
  • Involuntary muscle movement disorders include strabismus, idiopathic blepharospasm, hemifacial, torticollis, mandibular dystonia, spastic dysphonia, and various types of muscle spasms and seizures.
  • Botulinum toxin is recently used to non-surgically reduce wrinkles on the face by paralyzing the muscles that create wrinkles around the eyes, forehead, and forehead. there is.
  • Botulinum toxin is classified into eight neurotoxins, and seven of them (A, B, C, D, E, F, G) can cause nerve paralysis.
  • the size of botulinum toxin is about 150 kDa, and it is composed of a complex of non-toxin in addition to botulinum toxin protein.
  • the size of each complex can be up to 900 kDa depending on the type of toxin.
  • the type of action, target, and duration of action vary depending on the botulinum toxin type. Among them, botulinum toxin type A is known as one of the deadly biological agents.
  • Botulinum toxin is expressed as a single polypeptide, and is divided into a heavy chain (Heavy chain, H chain) of about 100 kDa and a light chain (Light chain, L chain) of about 50 kDa by a reconstitution process after expression. Again, the H and L chains are linked by disulfide bonds. Although they have different targets depending on the botulinum toxin type, in common, the H chain binds to a receptor of a nerve cell and forms an endosome containing the toxin through endocytosis. This endosome allows the botulinum toxin to enter the interior. After entering the cell, the L chain exits the endosome and cuts the SNARE protein in the cytoplasm to suppress the secretion of acetylcholine, resulting in muscle paralysis.
  • H chain heavy chain
  • L chain Light chain
  • protein preparations tend to have poor stability due to protein denaturation, aggregation, and the like.
  • the instability of these protein preparations increases with the lapse of storage time of the protein preparation.
  • the main purpose in formulating a protein preparation is to maintain the solubility, stability, bioactivity, etc. of the protein.
  • bioactivity of enzymes varies greatly depending on their three-dimensional structure.
  • purified botulinum toxin crystals are diluted with physiological saline or water, biological activity and pharmaceutical properties are lost.
  • Botulinum toxin distributed for pharmaceutical purposes is usually a toxin complex comprising a non-toxin protein and a botulinum toxin protein molecule.
  • the non-toxin protein serves to stabilize the botulinum toxin molecule in the toxin complex and protect it from denaturation, thereby protecting the activity of the botulinum toxin.
  • it is necessary to have a toxicity attenuation process and skin permeability. Therefore, there has been a demand for the development of a composition capable of maintaining the activity of a botulinum toxin with only the L chain, rather than in the form of a toxin complex with a non-toxin protein.
  • the light chain of botulinum toxin is an endopeptidase that can hydrolyze peptide bonds.
  • Botulinum toxin type A cleaves SNAP-25 among the SNARE proteins. Therefore, it can be said that the inhibition of acetylcholine secretion by neurons is possible with the light chain alone. Taking this into consideration, an attempt was made to develop a composition having only a botulinum toxin light chain having a muscle paralysis effect, preferably in a form capable of transdermal delivery.
  • an object of the present disclosure is to provide a stable composition containing a recombinant botulinum toxin light chain protein.
  • the present disclosure is further intended to provide a composition that maintains the endopeptidase activity of botulinum toxin even when stored for a long time at room temperature as well as under refrigerated conditions. More preferably, the present disclosure intends to provide a composition in a liquid form rather than a freeze-dried form as a preparation form for resolving inconvenience in use.
  • the present inventors have found a surprising effect of maintaining the biological activity of the recombinant botulinum toxin light chain protein at a usable level while sufficiently ensuring the stability of the recombinant botulinum toxin light chain protein through a specific stabilizing agent, thereby completing the present invention.
  • the composition containing recombinant botulinum toxin light chain protein contains any one or more of various stabilizing agents for protein stabilization, such as sugar alcohol, polyol, high molecular compound, surfactant, and antioxidant, to improve protein stability at room temperature.
  • various stabilizing agents for protein stabilization such as sugar alcohol, polyol, high molecular compound, surfactant, and antioxidant.
  • the sugar alcohol according to the present invention is typically an organic compound derived from sugar, and is a substance in which one hydroxyl group (-OH) is attached to each carbon atom.
  • the length of the chain varies according to the number of carbons, and various types of isomers exist depending on the direction of the hydroxyl group.
  • the sugar alcohol may be classified as a polyol, but in the present specification, the polyol and the sugar alcohol are distinguished, and the polyol is defined as a material having a hydroxyl group excluding the sugar alcohol.
  • compositions comprising a botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof and a stabilizing agent, wherein the stabilizing agent is a sugar alcohol.
  • the botulinum toxin type A light chain protein according to one aspect of the present disclosure is a botulinum toxin type A light chain protein comprising the 448 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the botulinum toxin type A light chain protein according to the present invention consists of SEQ ID NO: 1.
  • the botulinum toxin type A light chain protein may further include an additional amino acid sequence for the purpose of protein production, protein purification, etc. in addition to the light chain protein amino acid sequence.
  • the botulinum toxin type A light chain protein of the present invention may further include an additional amino acid sequence such as the 21 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a fragment having the same efficacy may be used instead of the botulinum toxin type A light chain protein according to the present invention.
  • a botulinum toxin type A light chain protein fragment including the 425 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be used as the fragment.
  • the botulinum toxin type A light chain protein fragment according to the present invention consists of the sequence of SEQ ID NO:2.
  • the botulinum toxin type A light chain protein fragment may further include an additional amino acid sequence for the purpose of protein production, protein purification, etc. in addition to the amino acid sequence of the fragment.
  • the botulinum toxin type A light chain protein fragment according to an aspect of the present disclosure may further include an additional amino acid sequence such as the 21 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof is not changed.
  • the botulinum toxin type A light chain protein is a recombinant protein using the amino acid sequence of the N-terminal portion having enzymatic activity among the amino acid sequence of the botulinum toxin type A protein.
  • the term “recombinant” protein is a protein encoded by a heterologous (eg, recombinant) nucleic acid introduced into a host cell, such as a bacterial or eukaryotic cell. That is, it refers to a protein that has undergone genetic manipulation so that it can be produced in large quantities.
  • the protein or fragment thereof according to the present invention can be prepared according to a conventional method known in the art.
  • the method mentioned in US Patent No. 10,300,118 and the like can be used.
  • the composition is a liquid composition.
  • the liquid form of the composition can improve the inconvenience of use compared to the freeze-dried form.
  • the liquid form is advantageous in terms of economics because it does not require a nitrogen filling process in the manufacturing process of cosmetics.
  • a nitrogen filling process is required to secure stability.
  • stability is poor in a liquid form, but the composition of the present disclosure has a great advantage that it can maintain stability even in such a liquid form.
  • the composition according to the present invention is preferably a cosmetic composition, and more preferably a cosmetic composition for improving skin wrinkles.
  • wrinkle improvement refers to suppressing or delaying the generation of wrinkles on the skin, or alleviating the already generated wrinkles.
  • the cosmetic composition may be formulated as a solution, suspension, emulsion, lotion, oil, lotion, soft water, etc., which are formulations commonly prepared in the art, but is not limited thereto. More specifically, it can be prepared in cosmetic formulations such as softening lotion, nutrient lotion, skin, skin softener, skin toner, astringent, milk lotion, moisture lotion, nutrient lotion, emulsion, emulsion, essence, nutritional essence, etc. It is not limited.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers.
  • the cosmetically acceptable carrier that may be included in the cosmetic composition varies depending on the formulation.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, Benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol, fatty acid ester of sorbitan, etc. may be used alone or in combination.
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol as a carrier component
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters
  • microcrystalline cellulose aluminum metahydroxide; bentonite; Baby; Tracanth and the like
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters
  • microcrystalline cellulose aluminum metahydroxide; bentonite; Baby; Tracanth and the like
  • the cosmetic composition may be prepared using a conventional cosmetic preparation method, and the cosmetic composition of the present invention may be prepared in the form of cosmetics.
  • Such cosmetics can be appropriately formulated by selecting additional ingredients arbitrarily.
  • it may contain conventional ingredients such as thickeners, surfactants, humectants, abrasives, sweeteners, pH adjusters, preservatives, binders, wetting agents, foaming agents, solubilizers, pigments or flavoring agents.
  • the stabilizing agent according to the invention is a sugar alcohol.
  • sugar alcohols were very effective in stabilizing the botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof according to the present invention.
  • the stabilizer according to the present invention is preferably a sugar alcohol having 6 or less carbon atoms, more preferably 2 to 6 carbon atoms.
  • the stabilizer according to the present invention preferably has a solubility in water of at least 150 mg/mL at 20°C, more preferably a solubility in water at 20°C of 150 mg/mL to 10,000 It is a sugar alcohol in mg/mL.
  • the stabilizer according to the present invention is a sugar alcohol having a solubility in water of 150 mg/mL or more at 20°C among sugar alcohols having 6 or less carbon atoms.
  • the stabilizer is a sugar alcohol having 2 to 6 carbon atoms and a solubility of 150 mg/mL to 10,000 mg/mL in water at 20°C.
  • the stabilizer according to the present invention is ethylene glycol, glycerol, erythritol, Threitol, arabitol, xylitol, Ribitol, Sorbitol, Iditol, or a mixture thereof.
  • the stabilizing agent of the present invention is glycerol, xylitol, sorbitol, or a mixture thereof, and more preferably, glycerol. Glycerol showed a much better effect than other stabilizers.
  • the present invention provides a composition wherein the stabilizer is 50% by weight or less, preferably 20 to 50% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the stabilizer of the present invention should be composed of 20% by weight or more based on the total weight of the composition.
  • stable refers to the storage of recombinant botulinum toxin light chain protein at 25° C. or less, and the enzymatic activity of the original enzyme when reconstituted into a specific composition. It means that it is maintained at more than 1/3 level of activity.
  • 'enzyme activity is at least 1/3 level' is the same as the definition in US Patent No. 8,617,568.
  • U.S. Patent No. 8,617,568 when the existing botulinum toxin protein is evaluated, it is evaluated that the activity is significant if it shows activity of 1 unit or more by treating 3 units, and the stabilization of the present specification also refers to exhibiting this level of activity.
  • composition for cosmetic or personal care according to the present invention contains the ingredients according to the present invention within the content limit allowed by the relevant laws and regulations of each country.
  • the present disclosure provides a composition comprising a botulinum toxin type A light chain protein or fragment thereof having improved stability, that is, the effect can be maintained for a long period of time.
  • the composition of the present invention can ensure stability even in a liquid formulation.
  • 1 shows the stability period for a recombinant botulinum toxin light chain protein in a composition containing various stabilizers.
  • 3 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition comprising 0.2 wt% of polysorbate 20 and 0.3 wt% of methionine.
  • 5 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 3% by weight of troxerutin.
  • 6 is a result of evaluation of botulinum toxin enzyme activity of a composition containing 20 or 50% by weight of glycerol.
  • DPG dipropylene glycol
  • Endopeptidase activity capable of cleaving SNARE protein was confirmed by fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based botulinum toxin type A enzyme activity evaluation method (SNAPtide® 521, List Biological Laboratories, Inc.).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a composition containing a specific stabilizer for protein stabilization and recombinant botulinum toxin type A light chain protein (hereinafter referred to as 'recombinant botulinum toxin light chain protein') was stored at 25° C., and the stability was evaluated by the SNAPtide® evaluation method.
  • the recombinant botulinum toxin protein stable for more than 10 weeks was found to be stabilized with a specific sugar alcohol, such as glycerol, sorbitol, or xylitol. It was confirmed that the shorter the carbon chain length among the three suggested sugar alcohols, the greater the effect of stabilizing the recombinant botulinum toxin light chain protein.
  • the recombinant botulinum toxin type A light chain protein a protein obtained by adding the sequence of SEQ ID NO: 3 to the protein of SEQ ID NO: 2 was used.
  • the sequence of SEQ ID NO: 3 is only added to facilitate evaluation in the experiments described below, and is substantially the same as the effect of SEQ ID NO: 2.
  • the protein of SEQ ID NO: 2 is a protein of SEQ ID NO: 1 with some proteins irrelevant to the function deleted. It can be recognized or can be easily confirmed experimentally.
  • Combinations of recombinant botulinum toxin light chain protein with various stabilizing agents were evaluated. Through this, the stabilizing effect of the recombinant botulinum toxin light chain protein of the stabilizing agent was confirmed.
  • the weight, excluding the combination of stabilizer and protein, consisted of water and a small amount of pH adjusting agent.
  • potassium phosphate (KH 2 PO 4 ) and disodium phosphate (Na 2 HPO 4 ) were used as pH adjusters.
  • Combination stabilizer weight% protein weight% combination 14 Polysorbate 20 0.2 Recombinant botulinum toxin light chain protein 0.01 combination 15 Polysorbate 20 0.2 methionine 0.3 combination 16 Poloxamer 188 One combination 17 troxerutin 3
  • Protein stability was evaluated through changes in endopeptidase activity, which is a biological function of the recombinant botulinum toxin light chain protein used in the present invention.
  • a composition containing a recombinant botulinum toxin light chain protein and a stabilizer was prepared according to the combination of [Table 1], [Table 2] and [Table 3] and stored at 25 ° C. Enzyme activity was tracked. Through this, the effect of improving protein stability was evaluated.
  • Mannitol is an isomer of sorbitol, and due to its similar structure, a protein stabilizing effect at a level similar to that of sorbitol was expected, but a significant protein stabilizing effect was not obtained due to low solubility.
  • compositions excluding sugar alcohols
  • FIGS. 9 and 10 the experimental results of compositions (Combinations 10 to 13) containing polyols having a short linear structure similar to glycerol and widely used as cosmetics are shown in FIGS. 9 and 10 .

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Abstract

본 개시는 안정성이 개선된 재조합 보툴리눔 독소 단백질을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시에 따른 조성물은 안정화제로 당 알코올을 포함한다. 더욱 상세하게는, 본 개시는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 기능적 절편을 포함하고, 안정화제로 탄소 원자의 개수가 6개 이하 및/또는 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 이상인 당 알코올을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 안정화제를 통해 보툴리눔 독소 단백질의 안정성을 충분히 확보하면서, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 생물학적 활성을 사용 가능한 수준으로 유지하는 효과를 발휘할 수 있다.

Description

안정성이 개선된 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 조성물
본 출원은 2020년 9월 29일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0127249호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 개시는 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성을 개선시킨 조성물에 관한 것이다.
보툴리눔 독소는 혐기성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 폴리펩타이드 생성물이며, 신경독소의 일종이다. 이 독소는 포유류 신경근 접합부에서 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 시냅스 전 방출을 차단함으로써 근육 마비를 야기한다.
인체 부작용이 없는 용량 이하를 주사약으로 사용하면 주사 부위의 근육만 부분적으로 마비시킬 수 있는 원리를 이용해, 보툴리눔 독소는 불수의근 운동 장애를 치료하는 데 있어서 치료학적으로 사용되고 있다. 불수의근 운동 장애에는 사시, 특발성 안검경련, 반측안면, 사경, 구하악골 근긴장 이상, 경련성 발성 장애, 및 다양한 종류의 근육 경련 및 발작이 포함된다.
보툴리눔 독소는 최근 눈가, 미간, 이마 등에 주름살을 만드는 근육을 마비시킴으로써 안면 상의 주름살을 비외과적으로 감소시키는데 사용되며, 모공 축소, 여드름, 탄력 부여, 사각턱 완화 등의 심미적, 미용학적 분야에서도 사용되고 있다.
보툴리눔 독소는 8가지 신경독소로 분류되며, 이 중 7종(A, B, C, D, E, F, G)은 신경의 마비를 유발할 수 있다.
보툴리눔 독소의 크기는 약 150 kDa으로, 보툴리눔 독소 단백질 이외에 비독소 단백질(non-toxin)의 복합체로 구성된다. 각 복합체의 크기는 독소형의 종류에 따라 최대 900 kDa까지 생성된다. 보툴리눔 독소형에 따라 작용 형태와 대상, 활성기간 등이 달라지는데 그 중 보툴리눔 독소 A형은 치명적인 생물학적 작용제 중 하나로 알려져 있다.
독소형에 관계없이, 보툴리눔 독소의 분자적 메커니즘은 유사한 것으로 보인다. 보툴리눔 독소는 하나의 폴리펩타이드로 발현되어, 발현 후 재구성 과정에 의해 약 100 kDa의 중쇄(Heavy chain, H 사슬)와 약 50 kDa의 경쇄(Light chain, L 사슬)로 나뉘어진다. 다시 H 사슬과 L 사슬은 디설파이드 결합으로 연결된다. 보툴리눔 독소형에 따라 상이한 표적을 갖지만, 공통적으로 H 사슬은 신경세포의 수용체와 결합하여 엔도시토시스를 통해 독소를 포함하는 엔도좀을 형성한다. 이 엔도좀을 통해 보툴리눔 독소가 내부로 들어갈 수 있도록 한다. L 사슬은 세포 안으로 들어간 후 엔도좀을 빠져나와 세포질 내의 SNARE 단백질을 절단하여 아세틸콜린 분비를 억제시켜 근육 마비 효과를 나타낸다.
일반적으로 단백질 제제는 단백질의 변성, 응집 등에 의하여 안정성이 저하되기 쉽다. 이러한 단백질 제제의 불안정성은 단백질 제제의 보관 시간이 경과됨에 따라 증가된다. 단백질 제제의 제형화에 있어서 주요 목적은 단백질의 용해도, 안정성, 생활성도 등을 유지하는 것이다. 특히, 단백질 제제 가운데 효소는 그들의 3차원적 구조에 따라 생활성도가 크게 달라진다. 정제된 보툴리눔 독소 결정을 생리식염수 또는 물로 희석하는 경우, 생물학적 활성 및 약제학적 특성이 상실된다. 또한, 40℃이상의 온도에서 쉽게 변성됨이 알려져 있다. 즉, 적합한 안정화제가 없으면 보툴리눔 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다.
약제학적 목적으로 유통되는 보툴리눔 독소는 대개 비-독소 단백질(non-toxin protein)과 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 독소 복합체이다. 비-독소 단백질은 독소 복합체에서 보툴리눔 독소 분자를 안정화시키고, 변성으로부터 보호하여 보툴리눔 독소의 활성을 보호하는 역할을 한다. 화장료의 목적으로 보툴리눔 독소를 사용하기 위해서는 약독화(toxicity attenuation) 과정과 피부 투과성을 갖춰야 한다. 따라서, 비-독소 단백질과의 함께 독소 복합체 형태가 아닌, L 사슬만으로 보툴리눔 독소의 활성을 유지할 수 있도록 하는 조성물의 개발이 요구되었다.
보툴리눔 독소의 경쇄는 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는 엔도펩티다제(endopeptidase)이다. 보툴리눔 독소 A형의 경우, SNARE 단백질 가운데 SNAP-25를 절단한다. 따라서, 신경세포의 아세틸콜린 분비 억제는 경쇄 단독으로도 가능하다고 할 수 있다. 이에 착안하여, 근육 마비 효과를 가지는 보툴리눔 독소 경쇄만을 가지는 조성물을 개발하고자 하였으며, 바람직하게는 경피 전달이 가능한 형태로 개발하고자 하였다.
따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질을 함유한 안정한 조성물을 제공하는 것이다.
특히, 본 개시는 더 나아가 냉장 조건에서뿐만 아니라 상온에서 장시간 보관 시에도, 보툴리눔 독소의 엔도펩티다제(endopeptidase) 활성을 유지하는 조성물을 제공하고자 한다. 더욱 바람직하게는, 본 개시는 사용상의 불편함을 해소하기 위한 제제 형태로서 동결건조형태가 아닌 액상형태의 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명자들은, 특정한 안정화제를 통해 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성을 충분히 확보하면서, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 생물학적 활성을 사용 가능한 수준으로 유지하는 놀라운 효과를 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
구체적으로, 본 발명자들은 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 함유 조성물에 당 알코올, 폴리올, 고분자 화합물, 계면활성제, 산화방지제 등 다양한 단백질 안정화를 위한 안정화제들 중 어느 하나 이상을 포함시켜 실온에서 단백질 안정성이 증진된 조성물을 제조하고자 시도했다. 그러나, 안정화제의 종류에 따라 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 안정성이 크게 다름을 확인하였다.
각종 단백질 안정화제 중에서, 당 알코올(Sugar alcohol)만이 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편(실질적으로 동일한 효능을 가지는 절편)의 안정성을 크게 증진시켰으며, 본 발명자들은 이러한 예기치 못한 실험결과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따른 당 알코올은 전형적으로 당으로부터 유도된 유기화합물로, 각각의 탄소 원자에 하나의 하이드록시기(-OH)가 부착된 물질이다. 탄소수에 따라 사슬의 길이가 다양하며, 하이드록시기의 방향에 따라 여러 종류의 이성질체가 존재한다. 당 알코올이 여러 개의 하이드록시기를 포함하고 있을 경우 폴리올(Polyol)로 분류될 수 있지만, 본 명세서에서는 폴리올과 당 알코올을 구분하여, 폴리올을 당 알코올을 제외한 하이드록시기를 갖는 물질로 정의한다.
본 개시의 일 양태는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편 및 안정화제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 안정화제는 당 알코올이다.
바람직하게, 본 개시의 일 양태에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 서열 번호: 1의 448개의 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질이다. 본 개시의 바람직한 일 양태에서, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 서열 번호: 1로 이루어진다.
본 개시의 일 양태에서, 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 경쇄 단백질 아미노산 서열 이외에 단백질 생산, 단백질 정제 등의 목적으로 추가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 서열 번호: 3의 21개 아미노산 서열과 같은 추가적인 아미노산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 대신 이와 동일한 효능을 가진 절편이 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 절편으로 서열 번호: 2의 425개의 아미노산 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편이 이용될 수 있다. 본 개시의 일 양태에서, 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편은 서열 번호: 2의 서열로 이루어진다.
본 개시의 일 양태에서, 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편은 절편의 아미노산 서열 이외에 단백질 생산, 단백질 정제 등의 목적으로 추가적인 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 일 양태에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 절편은 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 서열 번호: 3의 21개 아미노산 서열과 같은 추가적인 아미노산 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.
다만, 추가적인 아미노산 서열을 더 포함하더라도 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편의 기능이 달라지는 것은 아니다.
본 개시의 일 양태에서, 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질은 보툴리눔 독소 A형 단백질의 아미노산 서열 가운데 효소 활성을 갖는 N-말단 부분의 아미노산 서열을 이용한 재조합 단백질이다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합" 단백질은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 또는 진핵생물 세포 내로 도입된 이종 (예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 코딩되는 단백질이다. 즉 대량으로 생산될 수 있도록 유전자 조작을 거친 단백질을 지칭한다.
본 발명에 따른 단백질 또는 이의 절편은 당해 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 등록특허 제10,300,118호 등에 언급된 방법이 이용될 수 있다.
본 개시의 바람직한 일 양태에서, 조성물은 액상 조성물이다. 액상 형태의 조성물은 동결건조형태에 비해 사용상의 불편함을 개선할 수 있다. 뿐만 아니라, 액상 형태는 화장품의 제조 과정에 있어서 질소 충전 과정을 필요로 하지 않아 경제적인 측면에서 유리하다. 화장품 제조 시 동결건조형태의 단백질을 이용하게 되면 안정성을 확보하기 위해 질소 충전 과정이 필요하다. 통상적으로 액상 형태에서 안정성이 떨어지는데, 본 개시의 조성물은 이러한 액상 형태에서도 안정성을 유지할 수 있다는 큰 장점이 있다.
본 개시의 일 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 화장료 조성물이며, 더욱 바람직하게는 피부 주름 개선용 화장료 조성물이다.
본 발명에 있어서, 용어 "주름 개선"이란 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 지연시키거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 개시의 일 양태에 있어, 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형인 용액, 현탁액, 유탁액, 로션, 오일, 화장수, 유연수 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 유액, 에멀젼, 에센스, 영양에센스 등의 화장품 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 일 양태에 있어, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있다. 본 개시의 일 양태에 있어, 화장료 조성물에 포함될 수 있는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 개시의 일 양태에 있어, 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다.
본 개시의 일 양태에 있어, 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스; 알루미늄 메타히드록시드; 벤토나이트; 아가; 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다.
본 개시의 일 양태에 있어, 화장료 조성물은 통상적인 화장료 제조법을 이용하여 제조될 수 있으며, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 화장품은 추가의 성분을 임의로 선정하여 적절히 배합할 수 있다. 예를 들어, 점증제, 계면활성제, 보습제, 연마제, 감미제, pH조정제, 방부제, 결합제, 습윤제, 기포제, 용해화제, 안료 또는 향료와 같은 통상적인 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안정화제는 당 알코올이다. 당 알코올, 폴리올, 고분자 화합물 등을 포함하는 다양한 물질들 중에 당 알코올이 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편의 안정성에 매우 효과적이었다.
본 개시의 일 양태에서, 본 발명에 따른 안정화제는 바람직하게는 탄소수가 6 이하이며, 더 바람직하게는 탄소수가 2 내지 6인 당 알코올이다.
본 개시의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 안정화제는 바람직하게는 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 이상이며, 더 바람직하게는 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 내지 10,000 mg/mL인 당 알코올이다.
본 개시의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 안정화제는 탄소수가 6 이하인 당 알코올 가운데, 20℃에서 물에서의 용해도가 150 mg/mL 이상인 당 알코올이다. 바람직하게는, 상기 안정화제는 탄소수가 2 내지 6이고, 20℃ 물에서 150 mg/mL 내지 10,000 mg/mL의 용해도를 갖는 당 알코올이다.
본 개시의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 안정화제는 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 글리세롤(Glycerol), 에리스리톨(Erythritol), 트레이톨(Threitol), 아라비톨(Arabitol), 자일리톨(Xylitol), 리비톨(Ribitol), 솔비톨(Sorbitol), 이디톨(Iditol) 또는 이들의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 안정화제는 글리세롤(Glycerol), 자일리톨(Xylitol), 솔비톨(Sorbitol) 또는 이들의 혼합물이며, 더욱 바람직하게는, 글리세롤이다. 글리세롤이 다른 안정화제들보다 훨씬 더 좋은 효과를 나타내었다.
본 개시의 일 양태에서, 본 발명은 안정화제가 조성물 총 중량 대비 50 중량% 이하, 바람직하게는 20 내지 50 중량%인 조성물을 제공한다. 본 발명의 안정화제가 유효한 단백질 안정화 효과를 갖기 위하여 조성물 총 중량 대비 20 중량% 이상 구성되어야 한다.
본 명세서에 사용된 용어 "안정한", "안정화하는", "안정화시키다" 또는 "안정화"는 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질을 25℃이하에서 보관하고, 특정 조성물로 재구성되었을 때의 효소 활성이 원래의 효소 활성의 1/3 수준 이상으로 유지되는 것을 의미한다. 본 명세서에서, '효소 활성이 1/3 수준 이상'은 미국 등록특허 제8,617,568호에서의 정의와 같다. 미국 등록특허 제8,617,568호에서는 기존 보툴리눔 독소 단백질의 평가 시 3 유닛(Unit) 처리하여 1 유닛 이상의 활성을 보이면 그 활성이 유의미하다고 평가하였으며, 본 명세서의 안정화도 이러한 수준의 활성을 보이는 것을 말한다.
본 발명에 기재된 모든 성분은, 바람직하게는, 한국, 중국, 미국, 유럽, 일본 등의 관련 법규, 규범 (예를 들어, 화장품 안전 기준 등에 관한 규정(한국), 화장품 안전 기술 규범(중국), 위생 규범(중국)) 등에서 규정한 최대사용치를 초과하지 않는다. 즉, 바람직하게, 본 발명에 따른 화장료 또는 퍼스널 케어용 조성물은 각국의 관련 법규, 규범에서 허용되는 함량 한도로 본 발명에 따른 성분들을 포함한다.
본 개시는 안정성이 개선된, 즉, 그 효과가 장기간 유지될 수 있는 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편을 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 조성물은 액상인 제형에서도 안정성이 확보될 수 있다.
도 1은 다양한 안정화제를 포함하는 조성물에서 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성 확보 기간을 나타낸 것이다.
도 2는 폴리솔베이트 20를 0.2중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 3은 폴리솔베이트 20 0.2중량%와 메티오닌 0.3중량%를 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 4는 폴록사머 188을 1중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 5는 트록세루틴을 3중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 6은 글리세롤을 20 또는 50중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 7은 자일리톨을 20 또는 50중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 8은 솔비톨을 20 또는 50중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 9는 1,3-부틸렌글라이콜(1,3-BG)을 20중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
도 10은 디프로필렌글라이콜(DPG)을 20중량% 포함하는 조성물의 보툴리눔 독소 효소 활성 평가 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
SNARE 단백질을 절단할 수 있는 엔도펩티다제 활성은 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 기반의 보툴리눔 독소 A형 효소 활성 평가 방법(SNAPtide® 521, List Biological Laboratories, Inc.)을 통해 확인하였다.
단백질 안정화를 위한 특정 안정화제와 재조합 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질(이하, '재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질'이라 지칭함)을 포함하는 조성물을 25℃에서 보관하고, 그 안정성을 SNAPtide® 평가법으로 평가하였다. 그 결과 10주 이상 안정한 재조합 보툴리눔 독소 단백질은 특정 당 알코올, 그 예로, 글리세롤, 솔비톨, 또는 자일리톨을 안정화제로 한 경우로 나타났다. 제시한 세 가지의 당 알코올 가운데 탄소 사슬의 길이가 짧을수록 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질을 안정화시키는 효과가 큼을 확인하였다.
후술하는 실험에서 재조합 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질로는 서열 번호: 2의 단백질에 서열 번호: 3의 서열을 추가한 단백질을 이용하였다. 여기에서, 서열 번호: 3의 서열은 후술하는 실험에서 평가를 용이하게 수행하기 위해 추가가 된 것일 뿐, 서열 번호: 2의 효과와 실질적으로 동일하다. 서열 번호: 2의 단백질은 서열 번호: 1의 단백질에서 기능에 상관 없는 일부 단백질을 삭제한 것으로서, 서열 번호: 2의 단백질의 성능이 서열 번호: 1의 성능과 동등할 것임은 당업자에 의해 용이하게 인식될 수 있거나 실험적으로 용이하게 확인할 수 있다.
1. 조합 구성
재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 다양한 안정화제와의 조합을 평가하였다. 이를 통해 안정화제가 미치는 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정화 효과를 확인하였다. 안정화제와 단백질의 조합을 제외한 중량은 물과 소량의 pH 조절제로 구성되었다. 본 발명의 실시예에서는 pH 조절제로 인산칼륨(KH2PO4)과 인산이나트륨(Na2HPO4)을 사용하였다. 인산칼륨 0.14중량%, 인산이나트륨 0.8중량%, 염화나트륨(NaCl) 9중량%, 및 물 90.06중량%의 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)로 안정화제와 단백질을 제외한 중량을 채워 대조군과 조합 1 내지 17을 완성하였다.
재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 당 알코올 계열의 안정화제와의 조합에 의한 단백질 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 위하여 구체적인 일례는 다음 (1) 내지 (9)와 같이 구성하였다.
안정화제 중량% 단백질 중량%
대조군 - - 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 0.01
조합 1 글리세롤 10
조합 2 글리세롤 20
조합 3 글리세롤 50
조합 4 자일리톨 20
조합 5 자일리톨 50
조합 6 솔비톨 20
조합 7 솔비톨 50
조합 8 만니톨 5
조합 9 만니톨 15
재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 당 알코올 이외의 폴리올 계열 안정화제와의 조합에 의한 단백질 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 위하여 구체적인 일례는 다음 (10) 내지 (13)와 같이 구성하였다.
안정화제 중량% 단백질 중량%
조합 10 1,3-부틸렌글라이콜 20 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 0.01
조합 11 1,3-부틸렌글라이콜 50
조합 12 디프로필렌글라이콜 20
조합 13 디프로필렌글라이콜 50
재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 폴리올 계열 이외 안정화제와의 조합에 의한 단백질 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 위하여 구체적인 일례는 다음 (14) 내지 (17)와 같이 구성하였다.
조합 안정화제 중량% 단백질 중량%
조합 14 폴리솔베이트 20 0.2 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질 0.01
조합 15 폴리솔베이트 20 0.2
메티오닌 0.3
조합 16 폴록사머 188 1
조합 17 트록세루틴 3
실험예. 엔도펩티다제 활성 평가
본 발명에서 사용한 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 생물학적 기능인 엔도펩티다제 활성의 변화를 통해 단백질 안정성을 평가하였다.
상기 [표 1], [표 2] 및 [표 3]의 조합에 따라 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질과 안정화제를 포함하는 조성물을 만들어 25℃에서 보관하였으며, SNAPtide® 평가법을 통해 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 효소 활성을 추적하였다. 이를 통해 단백질 안정성 개선 효과를 평가하였다.
(1) 약제학적 목적으로 유통되는 보툴리눔 독소의 비-단백질 안정화제로 사용되는 계면활성제, 그리고 계면활성제와 아미노산의 혼합 조성물(조합 14, 15)의 보툴리눔 독소 효소 활성을 추적하였다. 실험 결과는 도 2와 도 3에 명시하였다.
실험 결과, 계면활성제인 폴리솔베이트 20(Polysorbate 20)을 0.2중량% 혼합하였을 때, 어떠한 안정화제의 추가도 없는 조성물(대조군)에 비해 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정성 확보 기간이 증가하지만, 그 정도가 매우 미미하여 이용이 어려웠다.
또한, 폴리솔베이트 20 0.2중량%에 메티오닌(Methionine)을 0.3중량% 혼합하였을 때, 오히려 대조군과 유사한 단백질 안정성 확보 기간을 가졌다. 즉, 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정화를 위해서는 기존 보툴리눔 독소의 안정화에 사용된 안정화제가 아닌 새로운 안정화제의 사용이 필요함을 확인하였다(도 2, 도 3).
(2) 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 안정화제를 탐색하기 위해, 다른 종류의 화합물인 고분자 중합체와 산화방지제가 포함된 조성물(조합 16, 17)의 보툴리눔 독소 효소 활성을 추적하였다. 실험 결과는 도 4과 도 5에 명시하였다.
실험 결과, 고분자 중합체인 폴록사머 188(Poloxamer 188)을 혼합하거나, 산화방지제인 트록세루틴(Troxerutin)을 혼합하였을 때, 대조군에 비해 단백질 안정성 확보 기간이 증가하지만, 실용적인 수준은 아님을 확인하였다(도 4, 도 5).
(3) 당 알코올을 포함하는 조성물(조합 1 내지 9)의 실험 결과는 도 6 내지 8에 명시하였다.
실험 결과, 자일리톨과 솔비톨을 각각 포함하는 조성물의 재조합 보툴리눔 독소 경쇄 단백질의 활성을 추적하였을 때, 탄소 사슬의 길이가 더 짧은 자일리톨이 탄소 사슬의 길이가 더 긴 솔비톨보다 단백질 안정화 효과가 뛰어남을 확인하였다. 만니톨(Mannitol)은 솔비톨의 이성질체로, 유사한 구조로 인해 솔비톨과 유사한 수준의 단백질 안정화 효과를 기대하였으나, 낮은 용해도로 인하여 유의미한 단백질 안정화 효과를 얻지 못하였다.
단백질 안정화 효과를 보이는 세 가지의 당 알코올, 즉, 글리세롤, 자일리톨, 솔비톨은 모두 농도와 안정화 효과가 비례하며 화합물의 크기가 작을수록 안정화 효과가 큼을 확인하였다(도 6 내지 8).
(4) 당 알코올을 제외한 폴리올 가운데, 글리세롤과 유사한 짧은 선형의 구조를 가지며, 화장료로 널리 사용하고 있는 폴리올을 포함하는 조성물(조합 10 내지 13)의 실험 결과는 도 9과 도 10에 명시하였다.
실험 결과, 제시된 두 가지의 폴리올(1,3-부틸렌글라이콜(1,3-Butylene Glycol, 1,3-BG), 디프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol, DPG) 각각을 20 중량% 포함하는 조합의 경우, 대조군에 비해 단백질 안정성 확보 기간이 증가하지만, 실용적인 수준은 아님을 확인하였다. 또한, 상기 두 가지 폴리올은 당 알코올과 달리 농도와 안정화 효과가 비례하지 않음을 확인하였다(도 9, 도 10).
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 유효성분으로 보툴리눔 독소 A형 경쇄 단백질 또는 이의 절편을 포함하고, 추가로 안정화제를 포함하는 조성물이며,
    상기 안정화제는 당 알코올(Sugar alcohol)인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 탄소수가 2 내지 6의 당 알코올인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 20℃ 물에서 150 mg/mL 내지 10,000 mg/mL의 용해도를 갖는 당 알코올인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 탄소수가 2 내지 6이고, 20℃ 물에서 150 mg/mL 내지 10,000 mg/mL의 용해도를 갖는 당 알코올인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 에틸렌 글라이콜(Ethylene glycol), 글리세롤(Glycerol), 에리스리톨(Erythritol), 트레이톨(Threitol), 아라비톨(Arabitol), 자일리톨(Xylitol), 리비톨(Ribitol), 솔비톨(Sorbitol), 이디톨(Iditol) 또는 이들의 혼합물인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 글리세롤(Glycerol), 자일리톨(Xylitol), 솔비톨(Sorbitol) 또는 이들의 혼합물인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제는 조성물 총 중량 대비 20 내지 50 중량%인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 액상인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료인, 조성물.
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