WO2022058423A1 - Souche bacterienne appartenant au genre christensenella et compositions - Google Patents

Souche bacterienne appartenant au genre christensenella et compositions Download PDF

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WO2022058423A1
WO2022058423A1 PCT/EP2021/075475 EP2021075475W WO2022058423A1 WO 2022058423 A1 WO2022058423 A1 WO 2022058423A1 EP 2021075475 W EP2021075475 W EP 2021075475W WO 2022058423 A1 WO2022058423 A1 WO 2022058423A1
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diseases
dsm
bacterial strain
composition
chosen
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Application number
PCT/EP2021/075475
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English (en)
Inventor
Georges Rawadi
Sandrine Paule CLAUS
Ccori Silbina MARTINEZ TUPPIA
Katy Nicole LECORF
Wilfrid Bernard Philippe MAZIER
Marion Sophie Madeleine SOTO
Frédéric Elustondo
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Ysopia Biosciences
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Publication date
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K2035/115—Probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a new bacterial strain belonging to the genus Christensenella, to a composition comprising it and to its uses, in particular as a medicament in the treatment and/or prevention of diseases such as metabolic diseases, inflammatory diseases, cancers or diseases associated with dysbiosis of the microbiota.
  • intestinal microbiota or "intestinal flora” is made up of a set of bacteria, viruses, parasites and non-pathogenic fungi, i.e. 10 12 to 10 14 microorganisms present in the digestive tract of each individual, which represents 2 10 times more than the number of cells present in our body. Therefore, its role has been increasingly studied in recent years.
  • a microbiologist identified and cultured a new species from human faeces: Christensenella minuta, belonging to the gram-negative Clostridiales. (Morotomi et al., Description of Christensenella minuta gen. nov.,sp.
  • Microbial ecology has thus been increasingly studied in recent years as a regulator of the metabolic functions of the host and its central role in the establishment of a healthy ecosystem.
  • An absence or deficiency of bacteria of the genus Christensenella would in particular be implicated in obesity, metabolic diseases, heart and vascular diseases, liver and bile duct diseases, kidney diseases, joint diseases linked to overweight, cancers, in particular cancers linked to metabolism and/or dysbiosis of the microbiota, autoimmune diseases, atopic dermatological diseases, chronic inflammatory bowel diseases, pneumonia, infectious diarrhea, food allergies, inflammatory nephrology and neurological diseases including degenerative diseases or neuropsychiatric diseases such as anxiety-related disorders or eating disorders (eg bulimia).
  • An objective of the present invention is therefore to provide a solution which is simple, effective and economical for restoring a healthy intestinal microbiota, treating dysbiosis of the microbiota and reduce the prevalence of diseases associated with gut microbiota imbalance globally, such as obesity/overweight, inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancers and other diseases associated with gut microbiota dysbiosis.
  • the invention provides a new specific bacterial strain of Christensenella minuta deposited with the Leibniz DSMZ Institute (Deutsche Sammlung von Mikro expn und Zellkulturen GmbH, in French German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) under number DSM 33407.
  • the invention relates to a bacterial strain of Christensenella minuta deposited under the number DSM 33407, having for 16S rDNA sequence, the sequence SEQ ID NO: 1, as well as all strains comprising a nucleotide sequence having at least 99 90% identity of ANI (Average Nucleotide Identity - Average Nucleotide Identity) with the nucleotide sequence of the genome of the bacterial strain DSM 33407.
  • ANI Average Nucleotide Identity
  • the invention also relates to the culture supernatant of the bacterial strain according to the invention and/or of a derived strain.
  • the invention also relates to a composition comprising at least said bacterial strain according to the invention and/or the culture supernatant, in a physiologically acceptable medium.
  • the invention is particularly suitable for using said bacterial strain, said supernatant or said composition according to the invention as a medicament, in particular in the prevention and/or treatment of a dysbiosis of the microbiota or diseases associated with a gut microbiota dysbiosis.
  • the invention aims to prevent and/or treat obesity and metabolic diseases, and/or chronic inflammatory bowel diseases.
  • the invention also relates to a non-therapeutic use of the strain bacteria according to the invention, and/or of the supernatant according to the invention, and/or of the composition according to the invention for maintaining and/or strengthening the intestinal microbiota and/or supporting the diversity of the intestinal microbiota and/or promoting the increase in beneficial bacteria in the intestinal microbiota in a healthy subject.
  • Figure 1 is an image of a Christensenella minuta bacterium according to the invention corresponding to the DSM 33407 strain produced by transmission electron microscopy in negative staining (magnification: 36kX).
  • Figure 2 shows the immunomodulatory effect of the supernatant of DSM 33 407 on the colon adenocarcinoma line HT-29 producing IL-8 after stimulation with TNF- ⁇ . 6 independent experiments were carried out, in duplicate.
  • Figure 3 shows fasting plasma resistin levels measured after 12 weeks of exposure to either a standard diet or a high fat diet with or without treatment with DSM 33407.
  • Resistin is a cytokine also produced by adipose tissue in mice, and it accelerates the differentiation of preadipocytes into adipocytes.
  • FIG 4 shows the effect of the DSM 33407 strain on the integrity of the intestinal barrier measured by the TEER method (Transepithelial Electrical Resistance) on Caco2 cells (carcinoma of the human colon).
  • the TEER method is based on the measurement of transmembrane electrical resistance as an indicator of tight junction cohesion.
  • the membrane is destabilized by the addition of a pro-inflammatory agent (TNF-a) in the presence or absence of DSM 33407 bacteria.
  • the control (Ctrl) +/- TNF-a corresponds to PBS 1X/Glycerol 10%, medium re-suspension of bacteria strain DSM 33407.
  • Figure 5A represents the efficacy on weight loss.
  • HFD45 type rich diet providing 45% of calories in the form of fat
  • DSM 33407 protects against weight gain.
  • Figure 5B shows feed efficiency.
  • an obesogenic diet of the HFD45 type rich diet providing 45% of calories in the form of fat
  • daily treatment with DSM 33407 limits food efficiency (ie weight gain per gram of food ingested).
  • Figure 6A represents the efficacy on weight loss at different doses.
  • all the doses of DSM 33407 tested between 1.10 7 and 1.10 10 CFU/mL protected the animals from weight gain.
  • Figure 6B shows the feed efficiency (FE) at different doses.
  • FE feed efficiency
  • FIG. 7A represents the persistence of the effect of the DSM 33407 treatment after stopping the treatment.
  • daily treatment with Orlistat used here as a control
  • DSM 33407 protects against weight gain.
  • FIG. 7B represents the persistence of the effect of the DSM 33407 treatment after stopping the treatment.
  • daily treatment with Orlistat used here as a control
  • DSM 33407 protects against weight gain.
  • FIG. 7C represents the persistence of the effect of the DSM 33407 treatment after stopping the treatment. When the treatments were stopped, the animals under Orlistat rapidly gained weight, unlike the animals treated with DSM 33407.
  • ND Standard maintenance diet for the animals.
  • Figure 8A represents the effectiveness on weight loss after a change in diet less rich in fat in obese mice. Animals treated with DSM 33407 show greater weight loss compared to the group treated with placebo.
  • Figure 8B represents the effectiveness on weight loss after a change in diet less rich in fat in obese mice. Animals treated with DSM 33407 show greater weight loss compared to the group treated with placebo.
  • Figure 8C shows the food efficiency after a change to a lower fat diet in obese mice. Feed efficiency was reduced in animals treated with DSM 33407 compared to placebo.
  • Figure 9A shows the effect of treatment on weight gain and fat accumulation. When exposed to an HFD45-type obesogenic diet, DSM 33407 protects against weight gain.
  • Figure 9B shows the effect of treatment on weight gain and fat accumulation. During exposure to an HFD45-type obesogenic diet, DSM 33407 limits the accumulation of fat mass.
  • Figure 9C shows the effect of treatment on weight gain and fat accumulation.
  • DSM 33407 When exposed to an HFD45-type obesogenic diet, DSM 33407 exhibits a tendency to limit lean mass loss associated with weight gain.
  • Figure 9D represents the effect of the treatment on the adipocyte hypertrophy.
  • Treatment with DSM 33407 shows a strong tendency to prevent visceral adipocyte hypertrophy induced by exposure to an HFD45 diet.
  • Figure 10 shows the effect of treatment on leptin levels.
  • DSM 33407 prevented the increase in circulating leptin (A) levels classically observed after 12 weeks of exposure to HFD45.
  • Leptin is in particular a hormone produced by adipose tissue (adipocytes), depending on the volume of fatty tissue and is a marker of adiposity.
  • Figure 11A shows the effect on compulsive eating behaviors. DSM 33407 induces a strong tendency to reduce body weight gain (Figure 11A).
  • Figure 11B shows the effect on compulsive eating behaviors.
  • DSM 33407 induces a strong tendency to reduce the reactive hyperphagia induced following a 12-hour fast.
  • Figure 12A shows the effect of daily treatment with DSM 33407 on the increase in fasting plasma glucose levels typically observed upon exposure to an HFD45 diet for 4 weeks.
  • FIG. 12B represents the gene expression level of the glucokinase (Gck) gene relative to the HFD-Veh control group which did not receive treatment and therefore the effect on hepatic glycolysis.
  • Gck glucokinase
  • Figure 13 represents the effect on the balance of bile acids, in particular the effect of DSM 33407 on the ratio of cholic acid (CA) to taurocholic acid (TCA) circulating after 6 weeks under a control diet (NC) or high fat (HFD).
  • CA cholic acid
  • TCA taurocholic acid
  • NC control diet
  • HFD high fat
  • Figure 14A represents the beneficial effect of DSM 33407 on an obese human microbiota.
  • DSM 33407 induces a significant and persistent increase in the synthesis of SCFAs (Short Chain Fatty Acids) (acetate, propionate, and butyrate).
  • SCFAs Short Chain Fatty Acids
  • Figure 14B represents the beneficial effect of DSM 33407 on a human microbiota obese. DSM 33407 induces a significant and persistent reduction in the synthesis of AGCBr (Branched Chain Fatty Acids).
  • AGCBr Branched Chain Fatty Acids
  • Figure 14C shows the effect of DSM 33407 on the Firmicutes/Bacteroidetes ratio in the distal colon.
  • Figure 14D shows the effect on the relative abundance of Firmicutes and the increase in Bacteroidetes.
  • Figure 15A shows metagenome composition in murine faecal samples (A).
  • Figure 15B represents the unsupervised hierarchical classification of the mouse metagenome after 8 weeks of a high-fat diet and with or without treatment with the DSM 33407 bacterium.
  • Figure 16A represents the anti-proliferative effect of DSM 33407 (48 h) on HCT-116 cells (adenocarcinoma of the colon).
  • Figure 16B represents the anti-proliferative effect of DSM 33407 (72h) on HCT-116 cells (adenocarcinoma of the colon).
  • Figure 16C represents the anti-proliferative effect of DSM 33407 on HepG2 cells (hepatocarcinoma).
  • Figure 17 represents the anti-inflammatory effect of the DSM 33407 strain on mice subjected to a fatty diet for 6 weeks on levels of cytokines IL-6 (A), RANTES (B), and TNF ⁇ (C ).
  • Figure 18 shows the anti-inflammatory effect of DSM33407 in vitro on human immune cells by measuring the amount of cytokine (resistin) produced by human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Figure 19 represents the protective effect of the DSM 33407 strain on the intestinal barrier by measuring the level of expression of the tight junction proteins mZol (A), Ocln (B) and Cldnl (C) in the colon.
  • Figure 20 shows the anti-inflammatory effect of DSM 33407 during a diet leading to weight loss by measuring hepatic levels of IL-6 (A), IFNy (B) and TNF ⁇ (C) .
  • Figure 21 represents the impact of DSM33407 on the bile acid cycle during an obesity induction protocol by measuring the level of hepatic expression of TgR5 (A) and FxR (B) and the ileal expression level of Fgfl5 (C).
  • Figure 22 represents the protective effect of DSM33407 on liver function during a protocol for the induction of obesity by a fatty diet by measuring the level of expression of Fasn (A) and Cd36 (B) .
  • Figure 23 represents the impact of daily force-feeding with DSM33407 on the activity of the intestinal microbiota of the animal during a protocol for the induction of obesity by a fatty diet by measuring the concentration of acetate (A), butyrate (B) and propionate (C) in faeces.
  • bacteria within the meaning of the invention, is meant a unicellular microorganism capable of reproducing by cell division. Bacteria are classified by family, genus, species. Each bacterial species includes a diversity of bacterial strains.
  • the bacterial strain according to the invention belongs to the Christensenellaceae family, the Christensenella genus and the minuta species.
  • bacterial strain or “strain” within the meaning of the invention, is therefore meant a specific bacterial strain but also all the bacteria derived from the strain or obtained from the strain or corresponding to the bacterial strain and having the same functions metabolic, for example, at least one bacterium taken from a colony derived from the strain.
  • bacteria(s) according to the invention within the meaning of the invention, is meant a bacterial strain according to the invention.
  • derived bacterial strain or “mutant strain” or “derived strain” or “derived bacteria” within the meaning of the invention, is meant a bacterial strain having a strong similarity with the bacterial strain deposited under the number DSM 33407
  • the strain comprises a nucleotide sequence having at least 99.90% identity of ANI with the nucleotide sequence of the genome of the bacterial strain DSM 33407, more preferably at least 99.91%, at least 99.92% , at least 99.93%, at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97%, at least 99.98%, or at least 99.99%
  • ANL ID ANL ID
  • “supernatant” within the meaning of the invention is meant the culture supernatant of the bacterial strain according to the invention or of the derived strain optionally comprising compounds and/or cellular debris of said strain, and/or metabolites and/or molecules secreted by said strain.
  • prevention within the meaning of the invention, is meant the reduction to a lesser degree the risk or the probability of occurrence of a given phenomenon, that is to say, in the context of the present invention, a dysbiosis of the intestinal microbiota and the associated diseases, for example obesity.
  • treatment within the meaning of the invention, is meant a reduction in the progression of the disease, a stabilization, an inversion or regression, or even an interruption or inhibition of the progression of a dysbiosis of the intestinal microbiota, and / or a disease such as a metabolic disease, for example obesity, or an inflammatory disease or cancer.
  • these terms also apply to one or more symptoms of said diseases of the present invention.
  • subject within the meaning of the invention, is preferably meant a human or non-human animal subject.
  • physiologically acceptable medium within the meaning of the invention is meant a medium which is compatible with the body of the individual to whom said composition is to be administered. It can be, for example, a non-toxic solvent such as water. In particular, said medium is compatible with oral administration.
  • pharmaceutically acceptable excipient within the meaning of the invention is meant any compound making it possible to facilitate the shaping of the composition and not modifying the nature of the biological activity of the active principle.
  • a pharmaceutically acceptable excipient can be a solvent, plasticizer, lubricant, dispersing medium, absorption retarding agents, flow agent, etc.
  • disease associated with a dysbiosis of the intestinal microbiota within the meaning of the invention, is meant the diseases associated with a dysbiosis of the intestinal microbiota such as certain metabolic diseases, for example diseases linked to obesity whose obesity, diabetes, NASH, hepatic or pancreatic steatosis; inflammatory diseases such as inflammatory bowel diseases, for example Crohn's disease, gastritis, pancreatitis, or irritable bowel syndrome; chronic diseases associated with dysbiosis, heart and vascular diseases, cancers, for example metabolism-related cancers.
  • certain metabolic diseases for example diseases linked to obesity whose obesity, diabetes, NASH, hepatic or pancreatic steatosis
  • inflammatory diseases such as inflammatory bowel diseases, for example Crohn's disease, gastritis, pancreatitis, or irritable bowel syndrome
  • chronic diseases associated with dysbiosis heart and vascular diseases, cancers, for example metabolism-related cancers.
  • the present invention therefore relates to a bacterial strain of Christensenella minuta deposited under number DSM 33407 hereinafter referred to as strain DSM 33407 or strain according to the invention or bacterial strain according to the invention.
  • strain DSM 33407 or strain according to the invention or bacterial strain according to the invention.
  • the inventors have discovered a bacterial strain of Christensenella minuta deposited under number DSM 33407 and isolated from the faeces of a healthy human donor. The inventors have thus demonstrated in preclinical models of obesity that the administration of such a strain makes it possible to prevent weight gain and the associated metabolic diseases, including in the context of a high-calorie diet. Surprisingly, a persistent effect of the treatment on weight loss was demonstrated after discontinuation of treatment and in the context of a high-calorie diet.
  • liver diseases such as NASH (Metabolic Steatohepatitis) or cirrhosis
  • Said bacterial strain of Christensenella minuta was thus deposited with the Leibniz DSMZ Institute (Deutsche Sammlung von Mikroorganisationn und Zellkulturen GmbH, in French German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) under the number DSM 33407, the 09/03/2020.
  • Said strain has the 16S rDNA sequence, the sequence SEQ ID NO:1.
  • the skilled person by his general knowledge is able to determine the complete sequence of the genome of the bacterium according to the invention from the strain deposited and accessible from the DSMZ under the number DSM 33407.
  • the scientific classification of the bacterial strain DSM 33407 is as follows: Domain: Bacteria; Phylum: Firmicutes; Class: Clostridia; Order: Clostridiales; Family: Christensenellaceae; Genus: Christensenella; Species: C. minuta.
  • Another object of the invention relates to a bacterial strain of Christensenella minuta derived from the bacterial strain deposited under number DSM 33407.
  • Said strain maintains or improves the capacities described within the framework of the present invention.
  • Said derived strain can thus be produced naturally or intentionally, by mutagenesis methods known in the state of the art.
  • the mutagenesis methods that can be implemented in the context of the present invention are the growth of the original microorganism in the presence of mutagenic or stress-producing agents, or by genetic engineering aimed at modifying genes specific or not such as directed mutagenesis or random mutagenesis.
  • the strain derived from the DSM 33407 strain of C. minuta is a genetically modified mutant.
  • said derived strain comprises a 16S rRNA sequence having at least 99% identity with the 16S rRNA sequence of the bacterial strain DSM 33407.
  • 16S ribosomal RNA (16S rRNA) is the ribosomal RNA constituting the small subunit of the ribosomes of prokaryotes.
  • the genes encoding this RNA are called 16S rDNA.
  • the 16S rRNA or 16S rDNA sequence is widely used in phylogeny because of its highly conserved structure which makes it possible to reconstruct the evolutionary history of organisms and in particular prokaryotes and bacteria.
  • the percentage identity of the 16S rDNA sequence between two bacterial strains, more particularly between two strains of C. minuta can be determined by the so-called BLAST method which is a heuristic research method well known to man. art. It makes it possible to find the similar regions between two or more sequences of nucleotides or amino acids, and to achieve an alignment of these homologous regions.
  • the 16S rDNA sequence does not always make it possible to differentiate between two strains of the same species which nevertheless have different properties, for example anti-inflammatory properties. Consequently, the person skilled in the art with his general knowledge is able to characterize a bacterial strain according to other parameters such as the calculation of phylogenetic distance based on the complete genome (ANI), the size of the genome, the number of CDS (Coding DNA Sequence or in French Coding DNA Sequence), but also the identification of genes specific to said strain of interest.
  • ANI complete genome
  • CDS Coding DNA Sequence
  • French Coding DNA Sequence French Coding DNA Sequence
  • ANI means, in the sense of the invention, the mean percentage of nucleotide identity calculated from the two-by-two comparison of all the genome sequences shared between the two bacterial strains.
  • genomic DNA can be extracted from a pure bacterial culture derived from said strain of interest, followed by DNA sequencing according to various well-known methods, for example Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore, then the sequenced genome is assembled by bioinformatics and the sequences obtained are analyzed.
  • the invention also relates to a bacterial strain derived from Christensenella minuta, characterized in that it comprises a nucleotide sequence having at least 99.90% identity of ANI with the nucleotide sequence of the bacterial strain DSM 33407.
  • said strain according to the invention comprises a nucleotide sequence having at least 99.91%, at least 99.92%, at least 99.93%, at least 99.94%, at least 99.95%, at least 99.96%, at least 99.97%, at least 99.98%, at least 99.99% identity of ANI with the nucleotide sequence of the bacterial strain DSM 33407.
  • Such a strain is therefore a bacterial strain of Christensenella minuta derived from the bacterial strain deposited under the number DSM 33407 making it possible to maintain or improve the described capacities of the strain DSM 33407 in the context of the present invention.
  • Said derived strain can thus be produced naturally or intentionally, by mutagenesis methods known in the state of the art.
  • the bacterial strain DSM 33407 and/or the strain derived from the latter can be used in any form producing the expected effects and the efficacy described in the present application.
  • the strain can be in living form (cultivable or not), dead, semi-living, attenuated or inactivated.
  • the dead, semi-living, attenuated or inactivated form can be obtained by various techniques known to those skilled in the art. Mention will be made, for example, of the following techniques: irradiation, thermal inactivation or freeze-drying, in particular by heat, exposure to an appropriate pH, to UV, gamma rays, X-rays or high pressure.
  • the term “semi-active” thus designates a bacterium with low physiological activity whose ability to proliferate is reduced, temporarily or permanently.
  • the term “inactivated” designates a bacterium which is no longer capable, temporarily or permanently, of proliferating.
  • the term “dead” designates a bacterium which is no longer capable, definitively, of proliferating. Dead or inactivated bacteria may have intact or ruptured cell membranes. Thus the term “inactivated” also designates the extracts and lysates of bacteria obtained.
  • Another object of the invention relates to the culture supernatant obtained from the bacterial strain DSM 33407 and/or the derived strain.
  • the culture supernatant comprises and at least one of the constituents chosen from a bacterial cell compound, a bacterial cell debris, a metabolite and / or one (of) molecule (s) secreted (s) by the strain and / or the strain derivative, or combinations thereof.
  • the cellular compounds and/or cellular debris can be wall components, nucleic acids, membrane components, proteins, lipids, etc.
  • the metabolites or molecules secreted can be any molecule produced or modified by the bacterium due to its metabolic activity during its growth, its use in technological processes (for example, but not limited to, production of food or medicine).
  • the metabolites or molecules can be proteins, amino acids, enzymes, lipids, nucleic acids, etc.
  • metabolite and/or one (of) molecule(s) secreted by the strain and/or the derived strain is meant a molecule produced and exported or released outside the bacterium by the bacterium.
  • the strain(s) according to the invention or derived strain(s) and/or the culture supernatant described above and the bacteria derived from said strains are advantageously administered in a composition.
  • Said composition comprising, in a physiologically acceptable medium, at least the strain(s), useful bacterium(ies) and/or their supernatant.
  • composition comprising at least one bacterial strain deposited under number DSM 33407 and/or at least one bacterial strain derived from the bacterial strain deposited under number DSM 33407, and/or at least one culture supernatant obtained from the DSM 33407 strain and/or the derived strain, hereinafter referred to as composition according to the invention.
  • the composition according to the invention comprises a physiologically acceptable medium.
  • the composition according to the invention further comprises at least one additional compound.
  • An additional compound can be an ingredient, a molecule, an active principle, a microorganism, a bacterium or a mixture of bacteria.
  • the additional compound is a different microorganism from the bacterial strain according to the invention or from the derived strain.
  • the microorganism is a bacterium of the genus Christensenella.
  • the additional compound is a probiotic and/or a prebiotic.
  • the prebiotic may, for example, be at least one prebiotic chosen from galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, inulins, arabinoxylans, beta-glucans, lactoglobulins and/or beta-caseins.
  • the additional compound can be:
  • At least one bacterium producing lactic acid which makes it possible to create an anaerobic environment favorable to Christensenellacées, such as at least one bacterium chosen from bacteria of the genus Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. and or
  • At least one other organism favoring the anaerobic conditions necessary for the survival of Christensenellacées such as at least one yeast chosen from Saccharomyces spp. or microorganisms of the Methanobacteriaceae family, and/or
  • At least one bacterium associated with the Christensenellaceae ecosystem because they facilitate their survival in the intestine, such as at least one bacterium chosen from bacteria of the phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, and Verrucomicrobia, and/or
  • At least one polyphenol such as for example at least one polyphenol chosen from quercetin, kaempferol, resveratrol, flavones (such as luteolin), flavan-3-ols or catechins, flavanones (such as naringinin), isoflavones, anthocyanidins, oligo-proanthocyanidins, and/or
  • non-steroidal anti-inflammatories antibodies directed against pro-inflammatory targets (such as anti-TNFalpha or anti-IL6), anti-rheumatics, analgesics, antimicrobials, corticosteroids, anabolic steroids, antidiabetics, thyroid agents, antidiarrheals, antitussives, antiemetics, antiulcers, laxatives, anticoagulants, erythropoietin, immunoglobulins, immunosuppressants, growth hormones, hormonal drugs, receptor modulators estrogens, alkylating agents, antimetabolites, mitotic inhibitors, radiopharmaceuticals, antidepressants, antipsychotics, anxiolytics, hypnotics, sympathomimetics, stimulants, donepezil, tacrine, asthma medications, beta-agonists, inhaled steroids, leukotriene blockers, cromo glycates or cromoglycidic acids, epin
  • composition according to the invention is in any form acceptable for administration to a subject, preferably a human or non-human animal subject.
  • composition according to the invention is in solid, liquid or freeze-dried form.
  • composition when in liquid form, it may in particular comprise bacterial strains according to the invention and/or the derived strain and/or a culture medium for said bacteria which makes it possible to preserve them, such as for example preferentially Columbia agar anaerobic medium enriched with sheep's blood, or an equivalent medium that does not contain any derivative product of animal origin.
  • the bacterial strains according to the invention and/or the derived strain may be present in freeze-dried form, and may also comprise excipients such as, for example, cellulose microcrystalline, lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum, calcium lactate, magnesium sulphate, sodium citrate, calcium stearate, polyvinylpyrrolidone, maltodextrin, galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, pectins, beta-glucans, lactoglobulins, isomaltooligosaccharides, polydextroses, mannitol, sorbitol and/or glycerol.
  • excipients such as, for example, cellulose microcrystalline, lactose, sucrose, fructose, levulose, starches, stachyose, raffinose, amylum, calcium lactate,
  • composition according to the invention is in a form suitable for oral, nasal, parenteral, rectal, sublingual, ocular, auricular, inhaled or cutaneous administration.
  • composition can be in any suitable form.
  • the composition according to the invention may be in a form chosen from a powder, microencapsulated powder, gelatin capsule, capsule, tablet, lozenge, granules, emulsion, suspension, suppository and a syrup.
  • the composition according to the invention may be in a gastro-resistant form, for example a coated tablet containing microencapsulated bacteria.
  • Said composition can thus be provided with an enteric coating that is resistant to gastric juice, in order to ensure that the bacterium(ies) comprised in said composition can cross the stomach. Release of the bacterium(s) may thus occur for the first time in the upper intestinal tract.
  • composition according to the invention can also be in the form of a food product, a drink, a nutraceutical, a food additive, a food supplement or a dairy product.
  • composition according to the invention when included in a food supplement for oral administration, it may be present in capsules, gelatin capsules, soft capsules, tablets, sugar-coated tablets, pills, pastes, lozenges, gummies, drinkable solutions or emulsions, syrup or gel.
  • a food supplement according to the present invention may further comprise a sweetener, a stabilizer, an antioxidant, an additive, a flavoring agent and/or a colorant.
  • the formulation thereof is carried out by means of the usual methods for producing sugar-coated tablets, capsules, gels, hydrogels for controlled release, emulsions, tablets or capsules.
  • a composition according to the present invention can also be in the form of a nutritional composition.
  • a nutritional composition according to the present invention may be in the form of a yoghurt, a cereal bar, a breakfast cereal, a dessert, a frozen food, a soup, a pet food, a suspension liquid, powder, tablet, gum or candy.
  • a nutritional composition according to the present invention may also comprise at least one ingredient chosen from: antioxidants, fish oils, DHA, EPA, vitamins, minerals, phytonutrients, a protein, a lipid, probiotics , prebiotics and combinations thereof.
  • the composition comprises 10 4 to 10 12 colony forming units (CFU) of bacteria per daily dose of composition to be administered, preferably 10 6 to 10 12 colony forming units (CFU) of bacteria per daily dose of composition to be administered.
  • CFU colony forming units
  • this corresponds to a daily dose of bacteria to be administered, regardless of the weight of the person or the animal.
  • this dose is administered all at once.
  • the useful composition comprises 10 7 to 10 11 CFU of bacteria per daily dose to be administered, even more preferentially 10 9 CFU.
  • the bacteria are a mixture of bacteria corresponding to or derived from the bacterial strain DSM 33407 and/or corresponding to the derived strain.
  • CFU Cold Forming Unit
  • UFC Coldy Forming Unit
  • the daily dose is measured per gram or milliliter of the composition according to the final invention.
  • the composition according to the invention comprises a mixture of bacteria, said mixture comprising at least live bacteria
  • the composition preferably comprises at least 1% of live bacteria (in number), more preferably at least least 10% of living bacteria (by number), even more preferably at least 50% (by number).
  • Live bacteria are a mixture of bacteria corresponding to the strain bacterial DSM 33407 and/or corresponding to the strain derived or derived from said strains.
  • the composition according to the invention including it may in particular comprise a content of it between 0.1 and 99% by weight. , in particular from 5 to 95% by weight, in particular from 10 to 90% by weight and more particularly from 15 to 85% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • a composition according to the invention may comprise a content of between 0.1 and 99% by weight, in particular from 5 to 95%, in particular from 10 to 90% by weight, more particularly from 15 to 85% by weight, of supernatant relative to the total weight of the composition.
  • composition according to the invention also comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • composition according to the invention is advantageously a pharmaceutical composition.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the ingredient(s) included in the composition according to the invention and according to any of the embodiments described previously.
  • Said pharmaceutical composition according to the invention has at least one application in improving the physical, physiological or psychological well-being of a sick subject, which results in an improvement in the general state of health of said subject or reduced risk of disease.
  • Said pharmaceutical composition can be a drug.
  • another aspect of the invention relates to the bacterial strain according to the invention and/or the derived strain, the supernatant according to the invention, or the composition according to the invention, or the pharmaceutical composition according to the invention. for its use as a medicine.
  • the invention makes it possible to provide an effective quantity of bacterial strains according to the invention or of the derived strain, for use as a medicament.
  • Such a use as a medicament necessarily has a preventive and/or therapeutic effect, that is to say reducing to a lesser degree the risk of becoming ill and/or reducing or stabilizing or reversing or interrupting the progression of the disease. .
  • Use as a medicament in the context of the present invention refers to human or veterinary use, said medicament is then administered to a human subject or a non-human animal subject.
  • human subject we also mean an adult or a child or a baby, including a newborn or an infant.
  • the invention relates to the bacterial strain according to the invention and/or the derived strain, or the bacteria derived from said strains according to the invention, the supernatant according to the invention, or the composition according to the invention, or the pharmaceutical composition according to the invention for its use as a medicament, in particular in the prevention and/or treatment of dysbiosis of the microbiota, in particular of the intestinal microbiota and/or diseases associated with dysbiosis of the intestinal microbiota and/or chronic diseases and/or obesity and/or metabolic diseases and/or inflammatory diseases and/or cancers.
  • the invention also relates to the bacterial strain according to the invention and/or the derived strain, the supernatant according to the invention, or the composition according to the invention, or the pharmaceutical composition according to invention for its use as a medicament, in the prevention and/or treatment of chronic diseases associated with dysbiosis of the microbiota and/or metabolic diseases, preferentially metabolic diseases associated with dysbiosis of the microbiota and/or obesity and/ or inflammatory diseases, preferentially inflammatory diseases associated with a dysbiosis of the microbiota and/or cancers, preferentially cancers linked to metabolism.
  • the invention relates to the bacterial strain according to the invention and/or the derived strain, the supernatant according to the invention, or the composition according to the invention, or the pharmaceutical composition according to the invention for its use as medicinal product, in the prevention and/or treatment of at least one disease chosen from:
  • Metabolic diseases chosen from non-insulin-dependent diabetes, gestational diabetes, NASH, hepatic steatosis, pancreatic steatosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, infertility linked to overweight, urinary incontinence linked to overweight,
  • - cardiac and vascular diseases chosen from among atherosclerosis, thrombopathies, acute pericarditis and chronic constrictive pericarditis, arterial hypertension, vasculitis - diseases of the liver and bile ducts, chosen from hepatitis, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, cirrhosis, hepatic encephalopathy, vesicular lithiasis
  • osteopenia chosen from osteopenia, osteoporosis, osteoarthritis, inflammation of the vertebral discs
  • Alzheimer's disease Parkinson's disease
  • motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, primary lateral sclerosis and Kennedy's disease
  • cancers linked to metabolism and/or dysbiosis of the microbiota chosen from hepatocarcinomas, cancers of the digestive tract such as esophagus, stomach and colorectal cancer, pancreatic carcinoma, neuroendocrine tumors (NET) of the gastroenteropancreatic system, hepatic tumors, tumors of the gallbladder and bile ducts, kidney tumors, glioblastomas, lymphomas, multiple myelomas, chronic myeloid leukemia, chronic myeloproliferative diseases, lung carcinomas
  • hepatocarcinomas cancers of the digestive tract such as esophagus, stomach and colorectal cancer
  • pancreatic carcinoma neuroendocrine tumors (NET) of the gastroenteropancreatic system
  • hepatic tumors tumors of the gallbladder and bile ducts
  • kidney tumors glioblastomas
  • lymphomas multiple myelomas
  • chronic myeloid leukemia chronic myelop
  • autoimmune diseases chosen from insulin-dependent diabetes, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus, polyendocrine autoimmune syndrome
  • SAOS sleep apnea syndrome
  • - pneumonia chosen from infectious pneumonia, influenza pneumonia and avian flu, severe acute respiratory syndrome (SARS), pneumocystis pneumonia
  • Infectious diarrhoea chosen from Clostridium difficile infection, EHEC infection, Salmonella gastroenteritis, Campylobacter enteritis, food poisoning by enterotoxin-producing bacteria, cholera, yersiniosis, shigellosis, cryptosporidiosis, listeriosis
  • nephrology linked to a dysbiosis of the microbiota, chosen from urethritis, chronic renal failure, urolithiasis
  • the invention relates to the prevention and/or treatment of at least two diseases chosen from the preceding list, preferentially at least three, more preferentially at least four and even more preferentially at least five.
  • the invention also relates to a non-therapeutic use of a bacterial strain according to the invention, and/or of a supernatant according to the invention, and/or composition according to the invention for maintaining and /or strengthen the intestinal microbiota and/or support the diversity of the intestinal microbiota and/or promote the increase of beneficial bacteria in the intestinal microbiota and/or promote weight loss in a healthy subject, preferably a non-human or animal subject. human.
  • health subject within the meaning of the invention, is meant a subject who is not sick and not suffering from a disease, in particular not suffering from a disease chosen from:
  • Metabolic diseases chosen from non-insulin-dependent diabetes, gestational diabetes, NASH, hepatic steatosis, pancreatic steatosis, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, infertility linked to overweight, urinary incontinence linked to overweight,
  • vascular diseases chosen from among atherosclerosis, thrombopathies, acute pericarditis and chronic constrictive pericarditis, arterial hypertension, vasculitis
  • liver and bile ducts chosen from hepatitis, cirrhosis primary biliary, primary sclerosing cholangitis, cirrhosis, hepatic encephalopathy, cholelithiasis
  • osteopenia chosen from osteopenia, osteoporosis, osteoarthritis, inflammation of the vertebral discs
  • Alzheimer's disease Parkinson's disease
  • motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, primary lateral sclerosis and Kennedy's disease
  • cancers linked to metabolism and/or dysbiosis of the microbiota chosen from hepatocarcinomas, cancers of the digestive tract such as esophagus, stomach and colorectal cancer, pancreatic carcinoma, neuroendocrine tumors (NET) of the gastroenteropancreatic system, hepatic tumors, tumors of the gallbladder and bile ducts, kidney tumors, glioblastomas, lymphomas, multiple myelomas, chronic myeloid leukemia, chronic myeloproliferative diseases, lung carcinomas
  • hepatocarcinomas cancers of the digestive tract such as esophagus, stomach and colorectal cancer
  • pancreatic carcinoma neuroendocrine tumors (NET) of the gastroenteropancreatic system
  • hepatic tumors tumors of the gallbladder and bile ducts
  • kidney tumors glioblastomas
  • lymphomas multiple myelomas
  • chronic myeloid leukemia chronic myelop
  • autoimmune diseases chosen from insulin-dependent diabetes, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus, polyendocrine autoimmune syndrome
  • SAOS sleep apnea syndrome
  • - pneumonia chosen from infectious pneumonia, influenza pneumonia and avian flu, severe acute respiratory syndrome (SARS), pneumocystis pneumonia
  • Infectious diarrhoea chosen from Clostridium difficile infection, EHEC infection, Salmonella gastroenteritis, Campylobacter enteritis, food poisoning by enterotoxin-producing bacteria, cholera, yersiniosis, shigellosis, cryptosporidiosis, listeriosis
  • nephrology linked to a dysbiosis of the microbiota, chosen from urethritis, chronic renal failure, urolithiasis
  • Example 1 Characterization of C. minuta according to the invention filed under number DSM 33407.
  • the bacterial strain C. minuta DSM 33407 can be characterized by the following method.
  • the native bacteria of the DSM 33407 strain (10 ⁇ L of culture medium dosed at 10 9 CFU/mL) were deposited on ionized carbon grids (Delta Microscopy, Toulouse, France) and a negative staining was carried out with Nano-Tungsten (Nano-W, Nanoprobes, LFG Distribution, France).
  • the observation of the bacteria mounted on a grid was carried out with a transmission electron microscope (Talos F200S G2 - Thermofisher - Eindhoven) at 200 kV, equipped with a 4K*4K One View camera (Gatan, Paris, France).
  • the preparation of the samples, as well as the acquisitions were carried out at the Bordeaux Imaging Center (member of France-Biolmaging, ANR-10-INBS-04).
  • Gram staining was performed following the Classic procedure.
  • the bacterium according to the invention has the following characteristics: gram negative, strict anaerobic, without formation of spores and resistant to bile acids.
  • FIG. 1 represents the image of a bacterium Christensenella minuta according to the invention produced by transmission electron microscopy in negative staining (magnification: 36kX).
  • Example 2 Comparison between the strain according to the invention (DSM 33407) and strains of C. minuta of the prior art.
  • the inventors also compared the strain according to the invention (DSM 33407) with other strains of C. minuta such as the reference strain deposited under number DSM 22607, the strain deposited under number DSM 32891 and the strain deposited under the number DSM 33715 according to several parameters such as the sequence of the 16S rDNA, the size of the genome in base pair (bp), the phylogenetic distance based on the complete genome (ANI), the number of coding sequence ( CDS) and examples of strain-specific genes. The results are presented in Tables 1 to 3 below.
  • strain according to the invention (DSM 33407) has the same rDNA sequence
  • Example 3 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention.
  • the study protocol is as follows.
  • the HT-29 cells (ECACC) were seeded in 24-well plates at 3x10 5 cells per well in McCoy's 5A medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Gibco) and incubated at 37°C/5 % CO2 for 24 hours.
  • the cells were washed with PBS-1X (Gibco) and cultured for an additional 24 h in McCoy's 5A medium at 2% FCS.
  • the cells were then stimulated for 6 hours with 5 ng/ml of TNF- ⁇ in the presence of 10% stationary phase supernatant of DSM 33407 or bacterial culture medium as control (ctrl).
  • IL-8 assay was performed by specific BioLegend ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 460 nm was read using the FluoStar Omega microplate reader, BMG Labtech.
  • the HT-29 cells were stimulated with the pro-inflammatory cytokine TNF- ⁇ and the supernatant of DSM 33407 in stationary phase for 6 hours.
  • the chemokine IL-8 is secreted by HT-29 in a state inflammation induced by TNF-a (Ctrl).
  • the values represent the average normalized in percentage compared to the control + TNF-a, representing the secretion of IL-8 induced by stimulation with TNF-a, that is to say 100%.
  • Figure 2 shows that in the presence of the supernatant of the DSM 33407 strain, the secretion of IL-8 is reduced by 50% compared to the control (p ⁇ 0.0001, Dunnett's multiple comparisons test).
  • the supernatant of the DSM 33407 strain therefore has an immunomodulatory and anti-inflammatory effect.
  • Example 4 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention.
  • the inventors studied the anti-inflammatory effect of the DSM 33407 strain on a total of 30 male mice.
  • the study protocol is as follows. A total of thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet) or a high-fat diet (HFD45: 45% of calorie intake comes from of fat) for 12 consecutive weeks. During this time, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group) or with its vehicle (control group). During the study, weight and food intake were monitored. Each group consisted of 10 mice. Blood levels of an adipokyne considered an indirect inflammatory marker, resistin, were measured. The quantification was carried out using custom-built BIORAD plates (Biorad, Marnes la Coquette, France). All samples were evaluated in duplicate.
  • results were analyzed by a one-factor ANOVA with multiple comparisons (Benamini, Krieger and Yegutieli test) using the Prism8 software (Graphpad). All results are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyses.
  • Figure 3 shows that fasting plasma resistin levels measured after 12 weeks of exposure to HFD45 were significantly reduced in the group of animals treated with DSM 33407.
  • daily administration of DSM 33407 significantly reduced circulating (fasting blood) levels of resistin.
  • Example 5 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention.
  • the inventors studied the anti-inflammatory effect of the strain DSM 33407 on a total of 30 male mice according to the protocol described in Example 3 with the difference that the diet lasts 6 consecutive weeks.
  • the animals were sacrificed and the tissues of interest, here the livers, were immediately removed and frozen pending their analysis.
  • the frozen tissues were transformed into nitrogen powder.
  • the ground materials were then lysed and cold homogenized.
  • the extracted proteins were diluted and the samples normalized to 1 mg/mL (lysis buffer with 1% Bovine serum Albumin).
  • the assay of the proteins of interest (IL-6 for Interleukin 6, RANTES for regulated on activation, normal T cell expressed and secreted; TNF ⁇ for tumor necrosis factor alpha) were carried out according to the manufacturer's recommendations of the quantification kit (BioLegend).
  • the quantification data were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro-Wilk test), then via (ii) a one-way ANOVA with multiple comparison (Dunett) via Prism9 software (GraphPad). The data are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyses. (Statistical symbols on graphs: *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001).
  • Example 6 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention on an in vitro model.
  • the study aims to evaluate the anti-inflammatory effect of DSM33407 in an in vitro model based on human immune cells by measuring the amount of chemokine (resistin) produced by human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after stimulation with LPS in the presence or absence of DSM 33407 (bacteria or supernatant).
  • the study protocol is as follows.
  • the PBMCs isolated from the blood of healthy donors and cryopreserved (Lonza Biosciences) were thawed then placed in RPMI-1640 Glutamax medium (Gibco) containing 10% FBS (Gibco) in a humidified atmosphere at 5% CO2 for 24 hours before the start of the study.
  • PBMCs were seeded at 1 million per 24-well plate.
  • LPS lipopolysaccharide
  • MOI 50 bacteria/eukaryotic cell
  • the resistin quantification data present in the medium were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro-Wilk test) then via (ii) a one-factor ANOVA with multiple comparison (Dunett) via Prism9 software (GraphPad). The data are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyses. (Statistical symbols on graphs: *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001)
  • Example 7 Effect of the strain according to the invention on the integrity of the intestinal barrier.
  • the study protocol is as follows.
  • the Caco-2 cells (ECACC) were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells per well in 24-well plates containing inserts with a transwell polyester permeable membrane (Corning Life Science).
  • the cells were cultured in DMEM medium supplemented with 20% fetal calf serum (FCS, Gibco) and incubated at 37°C/5% CO2.
  • Transepithelial electrical resistance (TEER) was checked daily from the seventh day of culture using an EVOM3 ohmmeter (WPI). The medium was replaced every 2 days for 8 to 10 days, until the optimum TEER was reached (2000 Q.cm 2 ).
  • the cells were treated in the apical compartment with DSM 33407 at an MOI of 50 or PBS IX/Glycerol 10% (control) for 3 hours, then 100 ng/ml of TNF-a was added or not in the basal compartment.
  • the TEER was measured just before the addition of TNF-a (T0) and 6h (T6H) after the addition of TNF-a.
  • the polarized monolayer Caco-2 cells were pretreated with DSM 33407, then sensitized with TNF- ⁇ .
  • TEER was compared to T0 (before addition of TNF) and T6H. Values represent mean normalized to control - TNF- ⁇ , representing basal TEER.
  • Example 8 Protective effect of the strain according to the invention on the intestinal barrier.
  • the inventors studied the protective effect of DSM33407 on the intestinal barrier during a protocol for the induction of obesity by a fatty diet by studying the level of expression (mRNA) of tight junction proteins of the colon .
  • the study protocol is as follows. Thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet) or a high-fat diet (HFD: 45% of calorie intake comes from fat) for 4 consecutive weeks. During this period, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group) or with a vehicle (Placebo; control group). At the end of the study, the animals were sacrificed and the tissues of interest, here the colons, were immediately removed and frozen pending their analysis.
  • ND normal diet
  • HFD high-fat diet
  • RNAs The extraction of the messenger RNAs was carried out using Rneasy Plus kits (Qiagen), the complementary DNAs generated by reverse transcription (iScript Advanced cDNA synthesis, Bio-Rad) and the amplification carried out by real-time quantitative PCR (SsoAdvanced SYBR Green Universal Supermix (Bio-Rad).
  • the specific primers for the genes of interest (Zol for zonula occludens 1, Ocln for Occludinl, Cldn 1 for Claudinel) have been developed and validated beforehand (Bio-Rad).
  • PCR cycle data were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro-Wilk test), then via (ii) a one-way ANOVA with multiple comparison (Dunett) via Prism9 software (GraphPad). Data are expressed as the mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance level is set at p ⁇ 0.05 for all analyses. (Statistical symbols on the graphs: *p ⁇ 0.05, * *p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001).
  • Example 9 Effect on weight gain and food efficiency of the strain according to the invention.
  • the study protocol is as follows. A total of thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a normal diet (ND for normal diet; 10 mice) or a high-fat diet (HFD45, 45% of caloric intake comes from fat) for 4 consecutive weeks (20 mice). During this time, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group) or with its vehicle (control group). Each group consisted of 10 mice. During the study, weight and food intake were monitored, thus making it possible to estimate food efficiency (FE for Feed Efficiency; in g/kcal). To compare the impact of the treatments on the EF, the area under the curve (AUC for area under curve) was measured between D0 and D27.
  • Example 10 Effect on weight gain and food efficiency of the strain according to the invention at different doses.
  • the study protocol is as follows. A total of thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet; 10 mice) or a high-fat diet (HFD45, 45% of the calorie intake comes from fat; 20 mice) for 6 consecutive weeks. During this time, the animals were treated daily by oral gavage, either with 4 different doses of DSM 33407 (treated group), or with its vehicle (Placebo control group). The doses tested were 1.5.10 7 CFU/mL, 1.5.10 8 CFU/mL, 1.5.10 9 CFU/mL (reference dose), and 1.5.10 10 CFU/mL . Each group consisted of 10 mice.
  • Example 11 Effect on weight gain and persistence of the effect, including after stopping treatment.
  • the study protocol is as follows. A total of forty (40) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet; 10 mice) or a high-fat diet (HFD45, 45% of the calorie intake comes from fat; 30 mice) for 7 consecutive weeks. During this time, the animals were treated daily by oral gavage with DSM 33407 (treated group; 1.10 9 CFU/mL), either with its vehicle (Placebo control group), or with Orlistat (standard obesity treatment). All the treatments were stopped and the animals remained under HFD45 for an additional 3 weeks. Each group consisted of 10 mice. The objective here was to test the potential persistence of the effect of DSM 33407 on weight gain. To compare the impact of the treatments on weight gain, the area under the curve was measured between D0 and D48 (treatment period) and between D48 and D67 (washing period).
  • the daily weight monitoring results were analyzed by two-way ANOVA with multiple comparisons (Benamini, Krieger and Yegutieli test), and the area under the curve results were analyzed by one-way ANOVA with multiple comparisons. (Tukey's test). All the results are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 (statistical symbols on the graphs: *p ⁇ 0.05, ***p ⁇ 0.001).
  • Example 12 Effect of the strain according to the invention on weight loss during a change in diet.
  • the study protocol is as follows. A total of thirty (30) 18-week-old obese C57BI6 male mice reared on a very high fat diet (HFD60, 60% of caloric intake from fat) were force-fed with DSM 33407 vehicle for one week. At DO, some animals were placed on a standard diet (ND for normal diet; 10 mice) for 4 weeks. The other animals were placed on a lower fat diet (HFD45, 45% of caloric intake from fat; 20 mice) for 4 weeks. These animals were treated with DSM 33407 (1.5 ⁇ 10 9 CFU/mL; 10 mice), or with its vehicle (placebo control group). During the study, weight and food intake were monitored, thus making it possible to estimate food efficiency (FE for Feed Efficiency; in g/kcal). The main objective of the study was to evaluate the impact of treatment with DSM 33407 under the weight of the animals during a change in diet. To compare the impact of treatments on weight and EF, the area under the curve (AUC) was measured between D0 and D28.
  • the treatment with DSM 33407 potentiates the weight loss during the passage towards a diet less rich in fat in obese mice as represented in FIG. 8.
  • the passage from an HFD60 diet to ND induces a drastic weight loss.
  • the animals treated with DSM 33407 showed greater weight loss compared to the group treated with the placebo ( Figures 8A and 8B).
  • Feed efficiency was reduced in animals treated with DSM 33407 compared to placebo ( Figure 8C).
  • Example 13 Anti-inflammatory effect of the strain according to the invention during a diet enabling weight loss.
  • the study aims to measure the anti-inflammatory effect of DSM33407 on the liver of obese mice during a protocol aimed at causing the animals to lose weight by exposing them to a diet with a reduced fat content by measuring the amount of hepatic cytokines (chemokines) after 4 weeks.
  • chemokines hepatic cytokines
  • the animal protocol is identical to that of Example 8.
  • the animals were sacrificed and the tissues of interest, here the livers, were immediately removed and frozen pending their analysis.
  • the frozen tissues were transformed into nitrogen powder.
  • the ground materials were then lysed and cold homogenized.
  • the extracted proteins were diluted and the samples normalized to 1 mg/mL (lysis buffer with 1% Bovine serum Albumin).
  • the assay of the proteins of interest (IL-6 for Interleukin 6, IFNy for interferon gamma; TNF ⁇ for tumor necrosis factor alpha) were carried out according to the manufacturer's recommendations of the quantification kit (BioLegend).
  • the quantification data were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro-Wilk test), then via (ii) a one-way ANOVA with multiple comparison (Dunett) via Prism9 software (GraphPad). The data are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyses. (Statistical symbols on graphs: *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001).
  • Example 14 Effect of the strain according to the invention on adipogenesis in adipose tissue.
  • the main objective of the study was to assess the impact of treatment with DSM 33407 on changes in the weight and body composition of animals during exposure to a high-fat diet. for 12 weeks.
  • the study protocol is as follows. A total of thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet) or a high-fat diet (HFD45: 45% of calorie intake comes from of fat) for 12 consecutive weeks. During this period, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group), or with its vehicle (control group). During the study, the weight of the animals was measured and measurements of body composition (fat mass and lean mass) by magnetic resonance were performed at the end of the study (D84). Each group consisted of 10 mice.
  • the main objective of the study was to evaluate the impact of treatment with DSM 33407 on the change in weight and body composition of the animals during exposure to an obesogenic diet.
  • the animals under HFD45 all gained significantly more weight than the animals which remained under ND.
  • Treatment with DSM 33407 significantly prevented weight gain and visceral adipocyte hypertrophy.
  • the body composition analysis showed that in these animals the accumulation of fat mass was also significantly reduced compared to the animals on placebo.
  • the DSM 33407 treatment also showed a strong tendency to limit the loss of lean mass associated with the induction of obesity by a fatty diet.
  • Example 15 Effect of the strain according to the invention on adipogenesis in adipose tissue (leptin).
  • the study protocol is as follows. A total of thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet) or a high-fat diet (HFD45: 45% of calorie intake comes from of fat) for 12 consecutive weeks. During this period, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group), or with its vehicle (control group). At the end of the study, the animals were fasted and blood was taken in order to extract the plasma and measure the leptin levels. These measurements were carried out with customized BIORAD plates (Biorad, Marnes la Coquette, France). All samples were evaluated in duplicate.
  • results were analyzed by a one-way ANOVA with multiple comparisons (Benamini, Krieger and Yegutieli test) using Prism8 software (Graphpad). All results are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyzes (statistical symbols on the graphs: *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01 , ***p ⁇ 0.001).
  • Example 16 Effect of the strain according to the invention on eating behaviors of the compulsive type (anorectic effect).
  • the objective of this study was to evaluate the capacity of DSM 33407 to impact the eating behavior of animals subjected to an obesogenic diet. To do this, a paradigm of fasting followed by re-exposure to food was used, in order to induce reactive hyperphagia in the animals.
  • the study protocol is as follows. A total of twenty (20) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a high-fat diet (HFD45: 45% of caloric intake from fat) for 2 consecutive weeks. During this period, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group), or with its vehicle (control group). On the 14th day, the animals were weighed and fasted for 12 hours. On the morning of the 15th day, the feeders were replaced in the cages. Then the food intake of the animals was measured after 1, 2, 4, 8, 24, 48, and 72h. The animals were weighed once a day.
  • HFD45 high-fat diet
  • results were analyzed by a two-way ANOVA with multiple comparisons (uncorrected LSD test) using Prism8 software (Graphpad). All results are expressed as the mean ⁇ standard deviation at the average (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyzes (statistical symbols on the graphs: *p ⁇ 0.05).
  • Example 17 Effect of the strain according to the invention on plasma glucose levels and on hepatic glycolysis.
  • the study protocol on the plasma glucose level is as follows. A total of thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a normal diet (ND for normal diet; 10 mice) or a high-fat diet (HFD45, 45% of caloric intake comes from fat) for 4 consecutive weeks (20 mice). During this time, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group) or with its vehicle (control group). Each group consisted of 10 mice. During the study, the animals were fasted and blood was taken in order to extract the plasmas at different times (0 and 4 weeks). Circulating glucose levels were measured using custom-built BIORAD plates (Biorad, Marnes la Coquette, France). All samples were evaluated in duplicate.
  • results were analyzed by a one-way ANOVA with multiple comparisons (Benamini, Krieger and Yegutieli test) using Prism8 software (Graphpad). All the results are expressed as the mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all the analyzes (statistical symbols on the graphs: ***p ⁇ 0.001).
  • glucokinase was measured by quantitative PCR using a pair of specific primers (Bio-Rad). Briefly, RNAs were extracted mouse livers according to and with the RNeasy Lipid tissue kit from Qiagen. Synthesis of cDNAs was performed with the iScript Advanced cDNA synthesis kit from Bio-Rad, according to the instructions. Finally, from the cDNAs, a quantitative PCR was carried out using the SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix kit from Bio-Rad, according to the instructions with the CFX 96 Touch device from Bio-Rad.
  • the pairs of primers used for this study are pairs designated and validated by Bio-Rad. All the data used for the statistical analysis were extracted using Bio-Rad's CFX Maestro software. Statistical analysis was performed with R (v. 3.6.2). An ANOVA was performed with the treatment factor followed by a Tukey post-hoc test to obtain a p value adjusted for the multiple comparison.
  • Example 18 Effect of the strain according to the invention on the balance of bile acids.
  • Bile acids play a major role in the intestinal absorption of lipids. Bile acids are secreted by the liver into bile in the form of conjugate acids, of which taurocholic acid (TCA) is the major component in mice. TCA is then deconjugated by bacteria in the gut microbiota to form cholic acid (CA). 95% of the bile acids secreted by the bile are reabsorbed in the small intestine during digestion, forming the enterohepatic cycle of bile acids. The circulating CA/TCA ratio is therefore an indicator of enterohepatic cycle activity and reflects the metabolic balance of the liver and microbiota.
  • TCA taurocholic acid
  • CA cholic acid
  • Example 19 Effect of the strain according to the invention on the bile acid cycle.
  • the trial aims to study the impact of DSM33407 on the bile acid cycle during a protocol for the induction of obesity by a fatty diet via the expression level (mRNA) of the bile acid receptors in the liver and endocrine hormones of the digestive tract (ileum) sensitive to bile acids.
  • mRNA expression level of the bile acid receptors in the liver
  • ileum endocrine hormones of the digestive tract
  • the study protocol for the animal part is identical to that of Example 6. At the end of the study, the animals were sacrificed and the tissues of interest, here the livers and ileums, were immediately removed and frozen pending analysis.
  • the messenger RNAs were extracted using Rneasy Plus kits (Qiagen), the complementary DNAs generated by reverse transcription (iScript Advanced cDNA synthesis, Bio-Rad) and the amplification carried out by real-time quantitative PCR (SsoAdvanced SYBR Green Universal Supermix (Bio-Rad).
  • the specific primers for the genes of interest (Tgr5 for G-protein coupled bile acid receptor, Fxr for farnesoid X receptor, Fgfl5 for Fibroblast growth factor 15) have been developed and validated in (Bio-Rad) The experiment is carried out in triplicate The PCR cycle data were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro-Wilk test), then via (ii) a one-way ANOVA with multiple comparison (Dunett) via Prism9 software (GraphPad). Data are expressed as the mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance level is set at p ⁇ 0.05 for all analyses. (Statistical symbols on the graphs : *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001).
  • Example 20 Effect of the strain according to the invention on hepatic function.
  • the trial aims to study the protective effect of DSM33407 on liver function during a protocol for the induction of obesity by a fatty diet via the level of expression (mRNA) of proteins involved in the metabolism hepatic lipids.
  • mRNA level of expression
  • the study protocol is as follows. Thirty (20) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to a high-fat diet (HFD: 45% of calorie intake comes from fat) for 12 consecutive weeks. During this period, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group) or with a vehicle (Placebo; control group). At the end of the study, the animals were sacrificed and the tissues of interest, here the livers, were immediately removed and frozen pending their analysis.
  • HFD high-fat diet
  • the messenger RNAs were extracted using Rneasy Plus kits (Qiagen), the complementary DNAs generated by reverse transcription (iScript Advanced cDNA synthesis, Bio-Rad) and the amplification carried out by real-time quantitative PCR (SsoAdvanced SYBR Green Universal Supermix (Bio-Rad).
  • the primers specific to the genes of interest (Fasn for fatty acid synthase, Cd36 for fatty acid translocase Cd36) were developed and validated beforehand (Bio-Rad).
  • the experiment is performed in triplicate.
  • the PCR cycle data were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro-Wilk test), then via (ii) a one-way ANOVA with multiple comparison (Dunett) via Prism9 software (GraphPad) Data are expressed as the mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance level is set at p ⁇ 0.05 for all analyzes (Statistical symbols on the graphs: *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001).
  • Example 21 Effect of the strain according to the invention on the microbiota of an obese human subject.
  • the study protocol is as follows.
  • the SHIME® Human Intestinal Microbial Ecosystem Simulator
  • the microbiota of 2 obese human subjects were isolated from the faeces of donors pre-selected for their lack of Christensenellaceae and injected into the SHIME system. After 4 weeks of stabilization of the microbiota and controls, the DSM 33407 treatment was inoculated for 3 weeks (2.10 9 CFU/day).
  • Example 22 Effect of the strain according to the invention on the beneficial bacteria of the microbiota and on the diversity of the intestinal microbiota in animals.
  • the composition of the microbiota was obtained by the shotgun sequencing method.
  • DNA extraction from mouse stool samples was performed using Qiagen's DNeasy Power Soil Pro Kit DNA Extraction Kit and following the manufacturer's recommended protocol.
  • Extracted DNA samples were quantified using a Qubit 4 fluorometer and the QubitTM dsDNA HS Kit assay (Thermofisher Scientific).
  • DNA libraries were prepared using the Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina) and the Nextera Index Kit (Illumina) following the manufacturer's protocol.
  • DNA libraries were quantified using a Qubit 4 fluorometer and the QubitTM dsDNA HS Assay Kit. Pairwise sequencing (2X150 bp) was performed on Illumina HiSeq4000 with an average sequencing depth of 5 million reads.
  • the data were analyzed by Principal Component Analysis, in order to identify groups with no priors and presented in FIG. 15A.
  • C. minuta DSM 33407 supports the development of other bacteria such as Bifidobacteriaceae and Ruminococcaceae known for their beneficial metabolism, respectively production of lactic acid and butyric acid indicating a beneficial effect on the microbiota intestinal.
  • the unsupervised hierarchical classification was obtained using a Python 3 script exploiting the clustermap function of the Seaborn v. 0.10.1.
  • the function calculates the matrix of Euclidean distances between families of bacteria and then classifies them using the Voor Hees algorithm.
  • the matrix is colored according to the correlation parameter "r".
  • mice treated for 8 weeks with a high-fat diet and supplemented or not with DSM 33407 favor families of beneficial bacteria such as Ruminococcaceae, Rikenellaceae, Lactobacillaceae and Akkermansiaceae (Group B).
  • families of bacteria rich in opportunistic pathogens such as Enterobacteriaceae, Yersiniaceae, Neisseriaceae and Xanthomonaceae (Group A) are clustered quite distinctly away from the group supported by Christensenellaceae.
  • Example 23 Effect of the strain according to the invention on the activity of the intestinal microbiota in animals.
  • the study aims to demonstrate the impact of daily force-feeding with DSM33407 on the activity of the animal's intestinal microbiota during a protocol for the induction of obesity by a fatty diet by quantifying certain acids short-chain fatty acids (SCFA) present in the cecum.
  • the study protocol is as follows. Thirty (30) 7-week-old male C57BI6 mice were exposed to either a standard diet (ND for normal diet) or a high-fat diet (HFD: 45% of calorie intake comes from fat) for 12 consecutive weeks. During this period, the animals were treated daily by oral gavage, either with DSM 33407 (treated group), or with a vehicle (Placebo; control group). At the end of the study, the animals were sacrificed and the tissues of interest, here the colon including the cecum, were immediately removed and frozen pending their analysis.
  • the caeca were homogenized (Precellys), filtered twice (0.2 pm, lh, 15°C and 10000g, then 10kDa, lh, 15°C and lOOOOxg.
  • the filtrates were mixed with the various elements making it possible to quantify by nuclear magnetic resonance (NMR), i.e. DSS-d6 (internal standard), DFTMP (pH indicator), and D2O (NMR spin lock).
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • DSS-d6 internal standard
  • DFTMP pH indicator
  • D2O NMR spin lock
  • the NMR data were analyzed (Chenomx NMR 8.6) then the amounts of AGCC of interest, Acetate, Butyrate, and Propionate, were related to the volume and weight of the initial samples.
  • the quantification data of AGCC were analyzed by (i) evaluating their distribution (Shapiro -Wilk test), then via (ii) a one-way ANOVA with multiple comparison (Dunett) via the software Prism9 (GraphPad). The data are expressed as mean ⁇ standard deviation from the mean (SEM) and the significance threshold is set at p ⁇ 0.05 for all analyses. (Statistical symbols on graphs: *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001, ****p ⁇ 0.0001)
  • Example 24 Anti-proliferative effect of the strain according to the invention.
  • HCT-116 and HepG2 cell lines were obtained from Sigma-Aldrich.
  • HCT-116 were maintained in culture in McCoy's 5A medium (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco) and 1% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich) and HepG2 were cultured in DMEM medium ( Gibco) supplemented with 10% FCS (Gibco), in an incubator in a humid atmosphere at 37° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were seeded at a density of 10,000 cells/well in a total volume of 100 ⁇ l in a 96-well plate. After 24 hours of incubation, the culture medium was removed from the adherent cells and new medium supplemented with 10% of stationary phase supernatant of DSM 33407 was added and in GAM control (bacterial culture medium). Akt inhibitor VIII was used as a positive control. Each condition was done in 4 replicates. Cells were incubated for an additional 48 or 72 hours.
  • the cell proliferation was determined by using the Cel ITiter-G lo 2.0 assay kit (Promega). The measurements were carried out according to the manufacturer's instructions. Briefly, the plates were removed from the incubator and allowed to equilibrate at room temperature for 30 min and an equal volume of CelITiter-GIo 2.0 reagent was added directly to the wells (100 ⁇ l). The plates were agitated at 300 rpm for 2 min using a rotary shaker, then incubated at room temperature for 10 min. The reaction mixture was then transferred to a white-walled 96-well plate and the luminescent signal was measured using a microplate reader (FLUOstar Omega, BMG Labtech).
  • a microplate reader FLUOstar Omega, BMG Labtech
  • Akt Inhibitor VIII is used as a cell proliferation blockade control.
  • the supernatant of the DSM 33407 strain induces a reduction in the proliferation of the HCT-116 and HepG2 tumor lines, suggesting a potential role in the inhibition of tumor development.
  • the microorganism identified under I. above was accompanied by:
  • 11118 International Depositary Authority accepts the microorganism identified under!, above, which was received by it on 2020-01-15 (Date of the original deposit) 1 .
  • microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on 2020-01-15 (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on 2020-09-08 (date of receipt of request for conversion).

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Abstract

La présente invention concerne une souche bactérienne appartenant au genre Christensenella et les bactéries qui en sont issues, une composition la ou les comprenant et ses utilisations notamment dans le traitement et/ou la prévention de maladies telles que l'obésité, les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires de l'intestin, les cancers, et les maladies associées à une dysbiose du microbiote.

Description

SOUCHE BACTERIENNE APPARTENANT AU GENRE
CHRISTENSENELLA ET COMPOSITIONS
[0001] Domaine technique
[0002] L'invention porte sur une nouvelle souche bactérienne appartenant au genre Christensenella, sur une composition la comprenant et ses utilisations, notamment comme médicament dans le traitement et/ou la prévention de maladies telles que les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires, les cancers ou les maladies associées à la dysbiose du microbiote.
[0003] Etat de l'art
[0004] Notre microbiote intestinal ou « flore intestinale » est constitué d'un ensemble de bactéries, virus, parasites et champignons non pathogènes, soit 1012 à 1014 micro-organismes présents dans le tube digestif de chaque individu, ce qui représente 2 à 10 fois plus que le nombre de cellules présent dans notre corps. Dès lors, son rôle est de plus en plus étudié ces dernières années. En 2012, un microbiologiste a identifié et cultivé à partir de fèces humaines une nouvelle espèce : Christensenella minuta, appartenant aux Clostridiales gram-négatifs. (Morotomi et al., Description of Christensenella minuta gen. nov.,sp. nov., isolated from human faeces, which forms a distinct branch in the order Clostridiales, and proposal of Christensenellaceae fam. nov., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2012), 62, 144-149).
[0005] En 2014, Goodrich et al. ont identifié Christensenella minuta comme le taxon bactérien le plus héréditaire chez l'homme et ont également suggéré son potentiel thérapeutique.
[0006] A ce jour, il est admis par la communauté scientifique que le microbiote intestinal humain est lié à l'apparition de certaines pathologies dites « non transmissibles » et associées à une dysbiose du microbiote, telles que l'obésité, le diabète, les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires intestinales, ou encore la dépression. Or, la prévalence de ces maladies ne cesse d'augmenter, sans aucun traitement satisfaisant.
[0007] À l'échelle mondiale, le nombre de cas d'obésité a presque triplé depuis 1975. Ainsi, 39% des adultes sont considérés en surpoids et 13% souffrent d'obésité. Les complications associées sont bien connues telles que les maladies métaboliques, en particulier le diabète de type 2 dont 44% des cas sont imputables au surpoids/obésité, les maladies cardiaques dont 23% des cas sont imputables, les cancers qui représentent entre 7% et 41% des cas imputables au surpoids/obésité et les maladies inflammatoires intestinales. Le surpoids/obésité entraîne ainsi le décès d'au moins 2,8 millions personnes chaque année ce qui en fait la cinquième cause de mortalité selon l'OMS.
[0008] Malgré des progrès dans la compréhension et la prise en charge des patients, la médecine moderne n'a pas de solution satisfaisante, ce qui cause des problèmes de santé publique majeurs. Autrefois cantonnée dans les pays à hauts revenus, l'obésité est dorénavant présente dans les pays à faibles revenus ou revenus intermédiaires.
[0009] Les traitements médicamenteux sont très limités et les traitements chirurgicaux sont réservés aux formes les plus sévères associées à des complications et entraînent des contraintes lourdes pour le patient.
[0010] L'écologie microbienne est ainsi de plus en plus étudiée ces dernières années en tant que régulateur des fonctions métaboliques de l'hôte et son rôle central dans l'établissement d'un écosystème sain.
[0011] Certaines bactéries du genre Christensenella ont été associées à un indice de masse corporelle bas dans de nombreuses cohortes humaines et d'autres études ont suggéré un rôle protecteur dans la régulation de l'inflammation.
[0012] Une absence ou une carence des bactérie du genre Christensenella seraient notamment impliquées dans l'obésité, les maladies métaboliques, les maladies cardiaques et vasculaires, les maladies du foie et des canaux biliaires, du rein, les maladies articulaires liées au surpoids, les cancers en particulier les cancers liés au métabolisme et/ou dysbiose du microbiote, les maladies auto-immunes, les maladies dermatologiques atopiques, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les pneumonies, les diarrhées infectieuses, les allergies alimentaires, les néphrologies inflammatoires et les maladies neurologiques dont les maladies dégénératives ou les maladies neuropsychiatriques telles que les désordres liés à l'anxiété ou les désordres alimentaires (par ex. la boulimie).
[0013] Toutefois actuellement, aucune solution satisfaisante n'est à disposition des malades.
[0014] Il existe donc un besoin médical fort pour un produit capable d'agir sur le microbiote intestinal, en particulier sur la dysbiose du microbiote intestinal afin de prévenir et/ou traiter les maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal.
[0015] Un objectif de la présente invention est donc d'apporter une solution qui soit simple, efficace et économique pour restaurer un microbiote intestinal sain, traiter la dysbiose du microbiote et faire reculer la prévalence des maladies associées à un déséquilibre du microbiote intestinal dans le monde, telles que l'obésité/surpoids, les maladies inflammatoires, les maladies métaboliques et les cancers et autres maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal.
[0016] Résumé de l'invention
[0017] Pour répondre à cet objectif, l'invention propose une nouvelle souche bactérienne de Christensenella minuta spécifique déposée auprès de l'institut Leibniz DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en français Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH) sous le numéro DSM 33407.
[0018] Parmi la multitude de bactéries présentes dans le microbiote intestinal, les inventeurs ont pu identifier cette souche bactérienne de Christensenella minuta spécifique particulièrement adapté à la prévention et/ou au traitement de pathologies dites « non transmissibles » et associées à une dysbiose du microbiote intestinal, en particulier les maladies telles que l'obésité et les maladies métaboliques, les maladies inflammatoires, les cancers, et d'autres qui seront détaillées dans la description qui va suivre.
[0019] Ainsi, l'invention concerne une souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33407, ayant pour séquence d'ADNr 16S, la séquence SEQ ID NO :1, ainsi que toutes souches comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI (Average Nucleotide Identity - Identité Nucléotidique Moyenne) avec la séquence nucléotidique du génome de la souche bactérienne DSM 33407.
[0020] L'invention vise aussi le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention et/ou d'une souche dérivée.
[0021] L'invention se rapporte également à une composition comprenant au moins ladite souche bactérienne selon l'invention et/ou le surnageant de culture, dans un milieu physiologiquement acceptable.
[0022] Enfin, l'invention est particulièrement adaptée pour utiliser ladite souche bactérienne, ledit surnageant ou ladite composition selon l'invention comme médicament, en particulier dans la prévention et/ou le traitement d'une dysbiose du microbiote ou maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal.
[0023] Préférentiellement, l'invention vise à prévenir et/ou traiter l'obésité et les maladies métaboliques, et/ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
[0024] Enfin, l'invention concerne également une utilisation non thérapeutique de la souche bactérienne selon l'invention, et/ou du surnageant selon l'invention, et/ou de la composition selon l'invention pour maintenir et/ou renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l'augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal chez un sujet sain.
[0025] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
[0026] Brève description des Figures
[0027] La Figure 1 est une image d'une bactérie Christensenella minuta selon l'invention correspondant à la souche DSM 33407 réalisée en microscopie électronique à transmission en coloration négative (grossissement : 36kX).
[0028] La Figure 2 représente l'effet immunomodulateur du surnageant de DSM 33 407 sur la lignée d'adénocarcinome du côlon HT-29 productrice d'IL-8 après stimulation au TNF-a. 6 expériences indépendantes ont été réalisées, en duplicat.
[0029] La Figure 3 représente les niveaux de résistine plasmatique à jeun mesurés après 12 semaines d'exposition, soit à un régime standard, soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses avec ou sans traitement avec DSM 33407. La résistine est une cytokine aussi produite par le tissu adipeux chez la souris, et elle accélère la différenciation des préadipocytes en adipocytes.
[0030] La Figure 4 représente l'effet de la souche DSM 33407 sur l'intégrité de la barrière intestinale mesurée par la méthode TEER (Résistance Electrique Transépithéliale) sur des cellules Caco2 (carcinome du côlon humain). La méthode de TEER est basée sur la mesure de la résistance électrique transmembranaire comme indicateur de cohésion des jonctions serrées. La membrane est déstabilisée par l'ajout d'un agent pro-inflammatoire (TNF-a) en présence ou non de bactéries DSM 33407. Le contrôle (Ctrl) +/- TNF-a correspond au PBS lX/Glycérol 10%, milieu de re-suspension des bactéries souche DSM 33407.
[0031] La Figure 5A représente l'efficacité sur la perte de poids. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45 (régime riche apportant 45% des calories sous forme de gras), le traitement quotidien avec DSM 33407 protège de la prise de poids.
[0032] La Figure 5B représente l'efficacité alimentaire. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45 (régime riche apportant 45% des calories sous forme de gras), le traitement quotidien avec DSM 33407 limite l'efficacité alimentaire (soit le gain de poids par gramme de nourriture ingéré). [0033] La Figure 6A représente l'efficacité sur la perte de poids à différentes doses. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45 (45% des calories apportées par la matière grasse), toutes les doses de DSM 33407 testées entre 1.107 et 1.1010 CFU/mL ont protégé les animaux de la prise de poids.
[0034] La Figure 6B représente l'efficacité alimentaire (FE) à différentes doses. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45 (45% des calories apportées par la matière grasse), toutes les doses de DSM 33407 testées entre 1.107 et 1.1010 CFU/mL ont limité l'efficacité alimentaire.
[0035] La Figure 7A représente la persistance de l'effet du traitement DSM 33407 après l'arrêt du traitement. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45, un traitement quotidien avec Orlistat (utilisé ici comme contrôle) ou DSM 33407 protège de la prise de poids. [0036] La Figure 7B représente la persistance de l'effet du traitement DSM 33407 après l'arrêt du traitement. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45, un traitement quotidien avec Orlistat (utilisé ici comme contrôle) ou DSM 33407 protège de la prise de poids. [0037] La Figure 7C représente la persistance de l'effet du traitement DSM 33407 après l'arrêt du traitement. A l'arrêt des traitements, les animaux sous Orlistat ont rapidement pris du poids, contrairement aux animaux traités avec DSM 33407. ND : Régime de maintenance standard des animaux.
[0038] La Figure 8A représente l'efficacité sur la perte de poids après un changement de régime alimentaire moins riche en graisse chez la souris obèse. Les animaux traités avec DSM 33407 présentent une perte de poids plus importante en comparaison au groupe traité avec le placebo.
[0039] La Figure 8B représente l'efficacité sur la perte de poids après un changement de régime alimentaire moins riche en graisse chez la souris obèse. Les animaux traités avec DSM 33407 présentent une perte de poids plus importante en comparaison au groupe traité avec le placebo.
[0040] La Figure 8C représente l'efficacité alimentaire après un changement de régime alimentaire moins riche en graisse chez la souris obèse. L'efficacité alimentaire a été réduite chez les animaux traités avec DSM 33407 en comparaison avec le placebo.
[0041] La Figure 9A représente l'effet du traitement sur la prise de poids et l'accumulation de matière grasse. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45, DSM 33407 protège de la prise de poids. [0042] La Figure 9B représente l'effet du traitement sur la prise de poids et l'accumulation de matière grasse. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45, DSM 33407 limite l'accumulation de masse grasse.
[0043] La Figure 9C représente l'effet du traitement sur la prise de poids et l'accumulation de matière grasse. Lors de l'exposition à un régime obésogène de type HFD45, DSM 33407 présente une tendance à limiter la perte de masse maigre associée à la prise de poids.
[0044] La Figure 9D représente l'effet du traitement sur l'hypertrophie adipocytaires. Le traitement avec DSM 33407 présente une forte tendance à prévenir l'hypertrophie adipocytaire viscérale induite par l'exposition à un régime HFD45.
[0045] La Figure 10 représente l'effet du traitement sur les niveaux de leptine. DSM 33407 a permis de prévenir l'augmentation des niveaux de leptine (A) circulants classiquement observées après 12 semaines d'exposition à du HFD45. La leptine est notamment une hormone produite par le tissu adipeux (adipocytes), selon le volume du tissu graisseux et est un marqueur d'adiposité.
[0046] La Figure 11A représente l'effet sur les comportements alimentaires compulsifs. DSM 33407 induit une forte tendance à la réduction de la reprise de poids corporel (Figure 11A).
[0047] La Figure 11B représente l'effet sur les comportements alimentaires compulsifs. DSM 33407 induit une forte tendance à la réduction de l'hyperphagie réactionnelle induite suite à une mise à jeun de 12h.
[0048] La Figure 12A représente l'effet d'un traitement quotidien avec DSM 33407 sur l'augmentation des niveaux de glucose plasmatiques à jeun classiquement observée lors de l'exposition à un régime HFD45 durant 4 semaines.
[0049] La Figure 12B représente le niveau d'expression génique du gène de la glucokinase (Gck) relatifs au groupe contrôle HFD-Veh n'ayant pas reçu de traitement et donc l'effet sur la glycolyse hépatique.
[0050] La Figure 13 représente l'effet sur la balance des acides biliaires, en particulier l'effet de DSM 33407 sur le ratio acide cholique (CA) sur acide taurocholique (TCA) circulant après 6 semaines sous un régime contrôle (NC) ou riche en graisse (HFD).
[0051] La Figure 14A représente l'effet bénéfique de DSM 33407 sur un microbiote d'humain obèse. DSM 33407 induit une augmentation significative et persistante de la synthèse d'AGCC (Acides Gras à Chaînes Courtes) (acetate, propionate, et butyrate).
[0052] La Figure 14B représente l'effet bénéfique de DSM 33407 sur un microbiote d'humain obèse. DSM 33407 induit une réduction significative et persistante de la synthèse d'AGCBr (Acides Gras à Chaînes Branchées).
[0053] La Figure 14C représente l'effet de DSM 33407 sur le ratio Firmicutes/Bacteroidetes dans le colon distal.
[0054] La Figure 14D représente l'effet sur l'abondance relative des Firmicutes et l'augmentation des Bacteroidetes.
[0055] La Figure 15A représente la composition du métagénome dans des échantillons fécaux murins (A).
[0056] La Figure 15B représente la classification hiérarchique non supervisée du métagénome de souris après 8 semaines de régime riche en graisse et avec ou sans traitement avec la bactérie DSM 33407.
[0057] La Figure 16A représente l'effet anti-prolifératif de DSM 33407 (48h) sur des cellules HCT-116 (adénocarcinome du colon).
[0058] La Figure 16B représente l'effet anti-prolifératif de DSM 33407 (72h) sur des cellules HCT-116 (adénocarcinome du colon).
[0059] La Figure 16C représente l'effet anti-prolifératif de DSM 33407 sur des cellules HepG2 (hépatocarcinome).
[0060] La Figure 17 représente l'effet anti-inflammatoire de la souche DSM 33407 sur des souris soumises à un régime gras pendant 6 semaines sur des niveaux de cytokines IL-6 (A), RANTES (B), et TNFa (C).
[0061] La Figure 18 représente l'effet anti-inflammatoire de DSM33407 in vitro sur des cellules immunitaires humaines en mesurant la quantité de cytokine (résistine) produite par des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC).
[0062] La Figure 19 représente l'effet protecteur de la souche DSM 33407 sur la barrière intestinale en mesurant le niveau d'expression des protéines de jonctions serrées mZol (A), Ocln (B) et Cldnl (C) dans le côlon.
[0063] La Figure 20 représente l'effet anti-inflammatoire de DSM 33407 lors d'un régime alimentaire conduisant à une perte de poids en mesurant les niveaux hépatiques d'IL-6 (A), IFNy (B) etTNFa (C).
[0064] La Figure 21 représente l'impact de DSM33407 sur le cycle des acides biliaires lors d'un protocole d'induction de l'obésité en mesurant le niveau d'expression hépatique de TgR5 (A) et de FxR (B) et le niveau d'expression iléal de Fgfl5 (C). [0065] La Figure 22 représente l'effet protecteur de DSM33407 sur la fonction hépatique lors d'un protocole d'induction de l'obésité par une régime gras en mesurant le niveau d'expression de Fasn (A) et Cd36 (B).
[0066] La Figure 23 représente l'impact d'un gavage quotidien avec DSM33407 sur l'activité du microbiote intestinal de l'animal lors d'un protocole d'induction de l'obésité par un régime gras en mesurant la concentration d'acétate (A), de butyrate (B) et de propionate (C) dans les fécès.
[0067] Description détaillée de l'invention
[0068] Définition
[0069] Par « bactérie » au sens de l'invention, on entend un microorganisme unicellulaire capable de se reproduire par division cellulaire. Les bactéries sont classées par famille, genre, espèce. Chaque espèce bactérienne comprend une diversité de souches bactériennes. La souche bactérienne selon l'invention appartient à la famille Christensenellaceae, le genre Christensenella et l'espèce minuta. Par « souche bactérienne » ou « souche » au sens de l'invention, on entend donc une souche bactérienne spécifique mais également toutes les bactéries issues de la souche ou obtenues à partir de la souche ou correspondant à la souche bactérienne et ayant les mêmes fonctions métaboliques, par exemple, au moins une bactérie prélevée d'une colonie issue de la souche. Par « bactérie(s) selon l'invention », au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne selon l'invention.
[0070] Par « souche bactérienne dérivée » ou « souche mutante » ou « souche dérivée » ou « bactéries dérivées » au sens de l'invention, on entend une souche bactérienne ayant une forte similarité avec la souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33407. Préférentiellement, la souche comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique du génome de la souche bactérienne DSM 33407, plus préférentiellement au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, ou au moins 99,99% d'identité d'ANL
[0071] Par « surnageant » au sens de l'invention, on entend, le surnageant de culture de la souche bactérienne selon l'invention ou de la souche dérivée comprenant éventuellement des composés et/ou débris cellulaires de ladite souche, et/ou des métabolites et/ou des molécules sécrétées par ladite souche.
[0072] Par « prévention » au sens de l'invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d'occurrence d'un phénomène donné, c'est-à-dire, dans le contexte de la présente invention, une dysbiose du microbiote intestinal et les maladies associées, par exemple l'obésité.
[0073] Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression d'une dysbiose du microbiote intestinal, et/ou d'une maladie telle qu'une maladie métabolique, par exemple l'obésité, ou une maladie inflammatoire ou un cancer. Dans le contexte de l'invention, ces termes s'appliquent également sur un ou plusieurs symptômes desdites maladies de la présente invention.
[0074] Par « sujet » au sens de l'invention, on entend préférentiellement un sujet humain ou animal non-humain.
[0075] Par « milieu physiologiquement acceptable » au sens de l'invention on entend un milieu qui est compatible avec l'organisme de l'individu auquel ladite composition doit être administrée. Il peut s'agir, par exemple, d'un solvant non toxique tel que l'eau. En particulier, ledit milieu est compatible avec une administration orale.
[0076] Par « excipient pharmaceutiquement acceptable » au sens de l'invention on entend tout composé permettant de faciliter la mise en forme de la composition et ne modifiant pas la nature de l'activité biologique du principe actif. Un excipient pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant, plastifiant, lubrifiant, milieu de dispersion, agents retardant l'absorption, agent d'écoulement, etc.
[0077] Par « maladie associée à une dysbiose du microbiote intestinal » au sens de l'invention, on entend les maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal telles que certaines maladies métaboliques, par exemple les maladies liées à l'obésité dont l'obésité, le diabète, la NASH, la stéatose hépatique ou pancréatique ; des maladies inflammatoires telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, par exemple la maladie de Crohn, les gastrites, les pancréatiques, ou le syndrome du côlon irritable ; des maladies chroniques associées à une dysbiose, des maladies cardiaques et vasculaires, des cancers, par exemple les cancers liés au métabolisme.
[0078] Souche bactérienne ou surnageant selon l'invention
[0079] La présente invention a donc pour objet une souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33407 ci-après dénommée souche DSM 33407 ou souche selon l'invention ou souche bactérienne selon l'invention. [0080] Les inventeurs ont découvert une souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33407 et isolée à partir de fèces d'un donneur humain sain. Les inventeurs ont ainsi démontré dans des modèles précliniques d'obésité que l'administration d'une telle souche permet de prévenir la prise de poids et les maladies métaboliques associées, y compris dans le cadre d'un régime alimentaire riche en calorie. De façon surprenante, il a été démontré un effet persistant du traitement sur la perte de poids après un arrêt du traitement et dans le cadre d'un régime alimentaire riche en calorie.
[0081] Les inventeurs ont également démontré dans divers modèles que la souche bactérienne DSM 33407 permettait :
- de limiter les comportements alimentaires compulsifs suggérant un effet anorexigène,
- d'inhiber la glycolyse hépatique et ainsi agir sur le métabolisme hépatique et donc prévenir l'accumulation des lipides,
- d'obtenir un effet immunomodulateur et anti-inflammatoire périphérique et ainsi, de prévenir et traiter les maladies inflammatoires,
- d'obtenir un effet protecteur de la fonction hépatique permettant de prévenir ou traiter les maladies du foie telle que la NASH (Stéatohépatite Métabolique) ou la cirrhose,
- de restaurer la balance des acides biliaires et ainsi prévenir et/ou traiter les maladies liées à un désordre de la production de bile telles que les lithiases biliaires et autres pathologies des canaux biliaires comme la cholangite sclérosante primitive,
- d'obtenir un effet anti-prolifératif suggérant un effet dans la prévention et le traitement des cancers,
- de promouvoir des bactéries bénéfiques au microbiote telles que Ruminococcaceae et Bifidobacteriaceae et maintenir la diversité du microbiote intestinal.
[0082] Ladite souche bactérienne de Christensenella minuta a ainsi été déposée auprès de l'institut Leibniz DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en français Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH) sous le numéro DSM 33407, le 09/09/2020. Ladite souche a pour séquence d'ADNr 16S, la séquence SEQ ID NO :1. En outre, l'Homme du métier de par ses connaissances générales est en mesure de déterminer la séquence complète du génome de la bactérie selon l'invention à partir de la souche déposée et accessible auprès de la DSMZ sous le numéro DSM 33407. [0083] La classification scientifique de la souche bactérienne DSM 33407 est la suivante : Domaine : Bactéries ; Phylum : Firmicutes ; Classe : Clostridia ; Ordre : Clostridiales ; Famille : Christensenellaceae ; Genre : Christensenella ; Espèce : C. minuta.
[0084] Un autre objet de l'invention concerne une souche bactérienne de Christensenella minuta dérivée de la souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33407. Ladite souche maintien ou améliore les capacités décrites dans le cadre de la présente invention. Ladite souche dérivée peut ainsi être produite naturellement ou intentionnellement, par des méthodes de mutagénèse connues dans l'état de la technique. A titre d'exemple les méthodes de mutagénèse pouvant être mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont la croissance du micro-organisme original en présence d'agents mutagènes ou producteurs de stress, ou par le génie génétique visant à modifier des gènes spécifiques ou non telle que la mutagénèse dirigée ou la mutagénèse aléatoire. Selon un mode de réalisation préféré, la souche dérivée de la souche DSM 33407 de C. minuta est un mutant génétiquement modifié. [0085] Préférentiellement, ladite souche dérivée comprend une séquence d'ARNr 16S ayant au moins 99% d'identité avec la séquence d'ARNr 16S de la souche bactérienne DSM 33407.
[0086] L'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) est l'ARN ribosomique constituant la petite sous- unité des ribosomes des procaryotes. Les gènes codant cet ARN sont appelés ADNr 16S (16S rDNA en anglais). La séquence ARNr 16S ou ADNr 16S est très utilisée en phylogénie du fait de sa structure très conservée qui permet de reconstruire l'histoire évolutive des organismes et en particulier des procaryotes et bactéries.
[0087] Le pourcentage d'identité de la séquence d'ADNr 16S entre deux souches bactériennes, plus particulièrement entre deux souches de C. minuta peut être déterminé par la méthode dite BLAST qui est une méthode de recherche heuristique bien connue de l'homme de l'art. Elle permet de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs séquences de nucléotides ou d'acides aminés, et de réaliser un alignement de ces régions homologues.
[0088] Or, la séquence d'ADNr 16S ne permet pas toujours de différencier deux souches d'une même espèce ayant pour autant des propriétés différentes, par exemples des propriétés anti-inflammatoires. Par conséquent, l'Homme du métier de par ses connaissances générales est en mesure de caractériser une souche bactérienne selon d'autres paramètres tels que le calcul de distance phylogénétique basé sur le génome complet (ANI), la taille du génome, le nombre de CDS (Coding DNA Sequence ou en Français Séquence d'ADN Codante), mais également l'identification de gènes spécifiques à ladite souche d'intérêt.
[0089] Par « ANI », on entend au sens de l'invention le pourcentage d'identité moyen des nucléotides calculé à partir de la comparaison deux-à-deux de toutes les séquences de génome partagées entre les deux souches bactériennes. Selon les connaissances générales bien connues de l'Homme du métier, à partir de ladite souche d'intérêt déposée auprès de la DSMZ, l'ADN génomique peut être extrait à partir d'une culture bactérienne pure issue de ladite souche d'intérêt, suivi du séquençage de l'ADN selon différentes méthodes bien connues, par exemple Sanger, Roche 454, Illumina, Oxford Nanopore puis le génome séquencé est assemblé par bio-informatique et les séquences obtenues sont analysées.
Enfin, les génomes d'intérêt sont comparés deux à deux pour calculer l'ANI.
[0090] Selon une variante, l'invention se rapporte également à une souche bactérienne dérivée de Christensenella minuta, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,90% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique de la souche bactérienne DSM 33407.
[0091] Préférentiellement ladite souche selon l'invention comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 99,91%, au moins 99,92%, au moins 99,93%, au moins 99,94%, au moins 99,95%, au moins 99,96%, au moins 99,97%, au moins 99,98%, au moins 99,99% d'identité d'ANI avec la séquence nucléotidique de la souche bactérienne DSM 33407.
[0092] Une telle souche est donc une souche bactérienne de Christensenella minuta dérivée de la souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33407 permettant de maintenir ou d'améliorer les capacités décrites de la souche DSM 33407 dans le cadre de la présente invention.
[0093] Ladite souche dérivée peut ainsi être produite naturellement ou intentionnellement, par des méthodes de mutagénèse connues dans l'état de la technique.
[0094] Selon un mode de réalisation, la souche bactérienne DSM 33407 et/ou la souche dérivée de celle-ci, peut être utilisée sous toute forme produisant les effets escomptés et l'efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée. La forme morte, semi- vivante, atténuée ou inactivée peut être obtenue par différentes techniques connues de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l'exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.
[0095] Le terme « semi-actif » désigne ainsi une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues.
[0096] Un autre objet de l'invention se rapporte au surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne DSM 33407 et/ou la souche dérivée. Préférentiellement, le surnageant de culture comprend et au moins un des constituants choisis parmi un composé cellulaire bactérien, un débris cellulaires bactérien, un métabolite et/ou une(des)molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée, ou leurs combinaisons.
[0097] Ainsi, les composés cellulaires et/ou débris cellulaires peuvent être des composants de la paroi, des acides nucléiques, des composants membranaires, des protéines, lipides etc. Les métabolites ou molécules sécrété(s) peuvent être toute molécule produite ou modifiée par la bactérie en raison de son activité métabolique au cours de sa croissance, de son utilisation dans des procédés technologiques (par exemple, mais sans s'y limiter, des procédés de production d'aliments ou de médicaments). A titre d'exemple, les métabolites ou molécules peuvent être des protéines, acides aminées, enzymes, lipides, acides nucléiques etc. Par « métabolite et/ou une(des)molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée », on entend une molécule produite et exportée ou libérée à l'extérieur de la bactérie par la bactérie. [0098] Composition selon l'invention
[0099] La ou les souches selon l'invention ou souche(s) dérivée(s) et/ou le surnageant de culture précédemment décrit et les bactéries issues desdites souches, sont avantageusement administrées dans une composition. Ladite composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins la ou les souche(s), bactérie(s) utile(s) et/ou leur surnageant.
[0100] Ainsi, un autre aspect de l'invention concerne une composition comprenant au moins une souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33407 et/ou au moins une souche bactérienne dérivée de la souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33407, et/ou au moins un surnageant de culture obtenu depuis la souche DSM 33407 et/ou la souche dérivée, ci-après dénommée composition selon l'invention.
[0101] Préférentiellement, la composition selon l'invention comprend un milieu physiologiquement acceptable.
[0102] Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend en outre au moins un composé additionnel. Un composé additionnel peut être un ingrédient, une molécule, un principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries.
[0103] Préférentiellement, le composé additionnel est un microorganisme différent de la souche bactérienne selon l'invention ou de la souche dérivée. Plus préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Christensenella. A titre d'exemple on peut citer une bactérie appartenant à l'espèce C. minuta, C. timonensis, C. massiliensis et leurs mélanges.
[0104] Selon une variante, le composé additionnel est un probiotique et/ou un prébiotique. Le prébiotique peut-être, par exemple au moins un prébiotique choisi parmi les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les arabinoxylans, les béta- glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines.
[0105] Selon une autre variante, le composé additionnel peut être :
- au moins une bactérie produisant de l'acide lactique qui permet de créer un environnement anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. et/ou
- au moins une bactérie produisant de l'acide butyrique qui permet de créer un environnement favorable aux Christensenellacées telle qu'une bactérie du genre Ruminococcaceae,
- au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à la survie des Christensenellacées telle qu'au moins une levure choisie parmi des Saccharomyces spp. ou des micro-organismes de la famille des Methanobacteriaceae, et/ou
- au moins une bactérie associée à l'écosystème des Christensenellacées car elles facilitent leur survie dans l'intestin telle qu'au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du phylum Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Tenericutes, et Verrucomicrobia, et/ou
- au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi parmi la quercetin, le kaempférol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline), les flavan-3-ols ou les catéchines, les flavanones (comme la naringinine), les isoflavones, les anthocyanidines, les oligo-proanthocyanidines, et/ou
- au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou
- au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi les antiinflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles proinflammatoires (tel que anti-TNFalpha ou anti-IL6), les antirhumatismaux, les analgésiques, les antimicrobiens, les corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents thyroïdiens, les antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les laxatifs, les anticoagulants, l'érythropoïétine, les immunoglobulines, les immunosuppresseurs, les hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des récepteurs aux œstrogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs mitotiques, les radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les antipsychotiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrine, les médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les inhibiteurs de leucotriène, les cromoglycates ou acides cromoglycidiques, l'épinéphrine, la dornase alpha, les cytokines, les antagonistes de cytokines, les inhibiteurs de la Janus Kinase, les immunomodulateurs, les hypolipémiants, les hypocholestérolémiant, les anti-hypertenseurs.
[0106] Selon un objet préféré, la composition selon l'invention se présente sous toute forme acceptable pour être administrée à un sujet, préférentiellement un sujet humain ou animal non-humain. Préférentiellement composition selon l'invention se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[0107] Lorsque la composition se présente sous forme liquide, elle peut notamment comprendre des souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée et/ou un milieu de culture desdites bactéries qui permet de les conserver, comme par exemple préférentiellement le milieu Columbia agar anaérobique enrichi en sang de mouton, ou un milieu équivalent ne contenant pas de produit dérivé d'origine animale.
[0108] Lorsque la composition selon l'invention se présente sous forme solide, les souches bactériennes selon l'invention et/ou de la souche dérivée peuvent être présentes sous forme lyophilisée, et peuvent comprendre également des excipients tels que par exemple la cellulose microcrystalline, le lactose, le saccharose, le fructose, le lévulose, les amidons, le stachyose, le raffinose, l'amylum, le lactate de calcium, le sulfate de magnésium, le citrate de sodium, le calcium stearate, la polyvinylpyrrolidone, la maltodextrine, les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les pectines, les béta-glucans, les lactoglobulines, les isomaltooligosaccharides, les polydextroses, le mannitol, le sorbitol et/ou le glycérol.
[0109] Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention est sous une forme adaptée à une administration parvoie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, inhalée ou cutanée.
[0110] La composition peut se présenter sous toute forme adaptée. Ainsi, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme choisie parmi une poudre, poudre microencapsulée, gélule, capsule, comprimé, pastille, granulés, émulsion, suspension, suppositoire et un sirop.
[0111] Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, la composition selon l'invention peut se présenter sous une forme gastro-résistante, par exemple un comprimé enrobé contenant des bactéries microencapsulées. Ladite composition peut ainsi être pourvue d'un enrobage gastro-résistant soit résistant au suc gastrique, afin d'assurer que la ou les bactérie(s) comprise(s) dans ladite composition puisse traverser l'estomac. La libération de(s) la bactérie(s) peut ainsi se produire pour la première fois dans le tractus intestinal supérieur.
[0112] La composition selon l'invention peut également se présenter sous forme d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[0113] Lorsque, la composition selon l'invention est comprise dans un complément alimentaire pour une administration par la voie orale, celle-ci peut être présente dans des capsules, des gélules, des capsules molles, des comprimés, des comprimés dragéifiés, des pilules, des pâtes, des pastilles, des gommes, des solutions ou émulsions buvables, un sirop ou un gel.
[0114] Un complément alimentaire selon la présente invention peut comprendre en outre un édulcorant, un stabilisant, un antioxydant, un additif, un agent aromatisant et/ou un colorant. La formulation de celui-ci est effectuée au moyen des procédés usuels pour produire des comprimés dragéifiés, des gélules, des gels, des hydrogels pour libération contrôlée, des émulsions, des comprimés ou des capsules.
[0115] Une composition selon la présente invention peut également être sous la forme d'une composition nutritionnelle. Une telle composition nutritionnelle selon la présente invention peut être sous la forme d'un yaourt, une barre de céréale, des céréales pour le petit-déjeuner, un dessert, un aliment congelé, une soupe, un aliment pour animaux de compagnie, une suspension liquide, une poudre, un comprimé, une gomme ou un bonbon.
[0116] Une composition nutritionnelle selon la présente invention peut comprendre en outre au moins un ingrédient choisi parmi : des antioxydants, des huiles de poisson, DHA, EPA, des vitamines, des minéraux, des phytonutriments, une protéine, un lipide, des probiotiques, des prébiotiques et des combinaisons de ceux-ci.
[0117] Selon un autre objet de l'invention, la composition comprend 104 à 1012 unités formant des colonies (CFU) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer préférentiellement 106 à 1012 unités formant des colonies (CFU) de bactéries par dose quotidienne de composition à administrer.
[0118] Préférentiellement cela correspond à une dose quotidienne de bactéries à administrer, quel que soit le poids de la personne ou de l'animal. De façon préférée, cette dose est administrée en une seule fois. Plus préférentiellement, la composition utile comprend 107 à 1011 CFU de bactéries par dose quotidienne à administrer, encore plus préférentiellement 109 CFU. Les bactéries sont un mélange de bactéries correspondant ou issu de la souche bactérienne DSM 33407 et/ou correspondant à la souche dérivée.
[0119] Le terme CFU (Colony Forming Unit) ou UFC (Unité Formant Colonie) est une unité permettant de dénombrer le nombre de bactéries capables de donner naissance à une colonie lors de la propagation, c'est-à-dire des bactéries viables. Il faut comprendre que des bactéries non viables peuvent également être présentes dans les compositions et qu'en général, elles ne devraient pas avoir d'effet négatif sur les propriétés des bactéries vivantes de la composition, et au contraire, elles peuvent exercer un effet sur elles-mêmes.
[0120] Préférentiellement, la dose quotidienne est mesurée par gramme ou millilitre de la composition selon l'invention finale.
[0121] Selon un autre objet préféré, lorsque la composition selon l'invention comprend un mélange de bactérie, ledit mélange comprenant au moins des bactéries vivantes, la composition comprend préférentiellement au moins 1% de bactéries vivantes (en nombre), plus préférentiellement au moins 10% de bactéries vivantes (en nombre), encore plus préférentiellement au moins 50% (en nombre).
[0122] Les bactéries vivantes sont un mélange de bactéries correspondant à la souche bactérienne DSM 33407 et/ou correspondant à la souche dérivée ou issues desdites souches. [0123] Dans le cas de la mise en œuvre d'un surnageant de l'une quelconque des souches bactériennes susmentionnées, la composition selon l'invention l'incluant peut notamment en comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 % en poids, en particulier de 10 à 90 % en poids et plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
[0124] Ainsi, une composition selon l'invention peut comprendre une teneur comprise entre 0,1 et 99 % en poids, notamment de 5 à 95 %, en particulier de 10 à 90 % en poids, plus particulièrement de 15 à 85 % en poids, de surnageant par rapport au poids total de la composition.
[0125] Selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend également au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0126] Lorsque la composition comprend un tel excipient pharmaceutiquement acceptable, la composition selon l'invention est avantageusement une composition pharmaceutique.
[0127] Ainsi, selon un autre objet, l'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant le ou les ingrédients inclus dans la composition selon l'invention et selon l'un des quelconques modes de réalisation décrits précédemment.
[0128] Ladite composition pharmaceutique selon l'invention a au moins une application dans l'amélioration du bien-être physique, physiologique ou psychologique d'un sujet malade, qui se traduit par une amélioration de l'état général de santé dudit sujet ou une réduction du risque de maladie. Ladite composition pharmaceutique peut être un médicament.
[0129] Utilisation thérapeutique et non thérapeutique
[0130] Ainsi, un autre aspect de l'invention concerne la souche bactérienne selon l'invention et/ou la souche dérivée, le surnageant selon l'invention, ou la composition selon l'invention, ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation comme médicament. [0131] En particulier, l'invention permet de fournir une quantité efficace de souches bactérienness selon l'invention ou de la souche dérivée, pour une utilisation comme médicament.
[0132] Une telle utilisation comme médicament a nécessairement un effet préventif et/ou thérapeutique c'est-à-dire réduire à un degré moindre le risque d'être malade et/ou diminuer ou stabiliser ou inverser ou interrompre la progression de la maladie.
[0133] L'utilisation comme médicament dans le contexte de la présente invention se réfère à une utilisation humaine ou vétérinaire, ledit médicament est alors administré à un sujet humain ou un sujet animal non-humain.
[0134] Par sujet humain, on entend également un adulte ou un enfant ou un bébé, y compris un nouveau-né ou un nourrisson.
[0135] Préférentiellement, l'invention concerne la souche bactérienne selon l'invention et/ou la souche dérivée, ou les bactéries issues desdites souches selon l'invention, le surnageant selon l'invention, ou la composition selon l'invention, ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation comme médicament, en particulier dans la prévention et/ou le traitement d'une dysbiose du microbiote, en particulier du microbiote intestinal et/ou des maladies associées à une dysbiose du microbiote intestinal et/ou des maladies chroniques et/ou de l'obésité et/ou des maladies métaboliques et/ou des maladies inflammatoires et/ou des cancers.
[0136] Selon un mode de réalisation, l'invention concerne également la souche bactérienne selon l'invention et/ou la souche dérivée, le surnageant selon l'invention, ou la composition selon l'invention, ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation comme médicament, dans la prévention et/ou le traitement des maladies chroniques associées à une dysbiose du microbiote et/ou des maladies métaboliques, préférentiellement des maladies métaboliques associées à une dysbiose du microbiote et/ou de l'obésité et/ou des maladies inflammatoires, préférentiellement des maladies inflammatoires associées à une dysbiose du microbiote et/ou des cancers, préférentiellement des cancers liés au métabolisme. [0137] Préférentiellement, l'invention concerne la souche bactérienne selon l'invention et/ou la souche dérivée, le surnageant selon l'invention, ou la composition selon l'invention, ou la composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation comme médicament, dans la prévention et/ou le traitement d'au moins une maladie choisie parmi :
- Les maladies métaboliques, choisies parmi le diabète non-insulinodépendant, le diabète gestationnel, la NASH, la stéatose hépatique, la stéatose pancréatique, les hyperlipidémies, les hypercholestérolémie, l'infertilité liée au surpoids, l'incontinence urinaire liée au surpoids,
- Les autres maladies métaboliques chroniques, dont les thyroïdites,
- les maladies cardiaques et vasculaires, choisies parmi l'athérosclérose, les thrombopathies, les péricardites aiguës et la péricardite chronique constrictive, l'hypertension artérielle, les vascularites - les maladies du foie et des canaux biliaires, choisies parmi les hépatites, la cirrhose biliaire primitive, la cholangite sclérosante primitive, la cirrhose, l'encéphalopathie hépatique, les lithiases vésiculaires
- les maladies articulaires liées au surpoids, choisies parmi l'ostéopénie, l'ostéoporose, l'arthrose, l'inflammation des disques vertébraux
- les maladies neurodégénératives, choisies parmi la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, les maladies du motoneurone telles que la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primitive et la maladie de Kennedy
- les cancers liés au métabolisme et/ou à une dysbiose du microbiote, choisies parmi les hépatocarcinomes, les cancers du tube digestif tel que de l'œsophage, de l'estomac et cancer colorectal, carcinome pancréatique, les tumeurs neuroendocrines (TNE) du système gastro-entéro-pancréatique, les tumeurs hépatiques, les tumeurs de la vésicule biliaire et des voies biliaires, les tumeurs rénales, les glioblastomes, les lymphomes, les myélomes multiples, la leucémie myéloïde chronique, les maladies myéloprolifératives chroniques, les carcinomes pulmonaires
- les maladies auto-immunes, choisies parmi le diabète insulino-dépendant, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, le lupus érythémateux disséminé, le syndrome auto-immun polyendocrinien
- les maladies dermatologiques atopiques, choisies parmi l'eczéma, le psoriasis
- les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, choisies parmi la maladie de Crohn, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'oesophagite, gastrites, les pancréatites, l'ulcère gastro-duodénal, le syndrome du côlon irritable
- les troubles de la fonction respiratoire, choisies parmi l'asthme, la mucoviscidose, les maladies pulmonaires chroniques obstructives et bronchite chronique, les maladies pulmonaires interstitielles et fibroses pulmonaires, le syndrome d'apnée du sommeil (SAOS)
- les pneumonies, choisies parmi les pneumonies infectieuses, la pneumonie à influenza et la grippe aviaire, le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), la pneumonie à pneumocystis
- Les diarrhées infectieuses, choisies parmi l'infection par Clostridium difficile, l'infection par EHEC, la gastro-entérite à salmonelles, l'entérite à Campylobacter, les toxiinfections alimentaires par bactéries productrices d'entérotoxines, le choléra, la yersiniose, la shigellose, la cryptosporidiose, la listériose
- Les allergies alimentaires, choisies parmi la maladie cœliaque, l'intolérance au lactose, le syndrome de malabsorption des sels biliaires
- Les néphrologies inflammatoires ou en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'urétrite, l'insuffisance rénale chronique, les urolithiases
- Autres désordres inflammatoires, choisies parmi la sclérose en plaque, la lymphangite
- Les maladies neurologiques en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'anorexie, la boulimie, la dépression, le syndrome bipolaire, l'autisme, la schizophrénie, le syndrome de Tourette.
[0138] Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne la prévention et/ou le traitement d'au moins deux maladies choisies parmi la liste précédente, préférentiellement au moins trois, plus préférentiellement au moins quatre et encore plus préférentiellement au moins cinq.
[0139] Selon un dernier objet, l'invention concerne également une utilisation non thérapeutique d'une souche bactérienne selon l'invention, et/ou d'un surnageant selon l'invention, et/ou composition selon l'invention pour maintenir et/ou renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l'augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal et/ou promouvoir la perte de poids chez un sujet sain, préférentiellement un sujet humain ou animal non-humain.
[0140] Par « sujet sain », au sens de l'invention on entend un sujet non malade et ne souffrant pas de maladie, en particulier ne souffrant pas d'une maladie choisie parmi :
- Les maladies métaboliques, choisies parmi le diabète non-insulinodépendant, le diabète gestationnel, la NASH, la stéatose hépatique, la stéatose pancréatique, les hyperlipidémies, les hypercholestérolémie, l'infertilité liée au surpoids, l'incontinence urinaire liée au surpoids,
- Les autres maladies métaboliques chroniques, dont les thyroïdites
- les maladies cardiaques et vasculaires, choisies parmi l'athérosclérose, les thrombopathies, les péricardites aiguës et la péricardite chronique constrictive, l'hypertension artérielle, les vascularites
- les maladies du foie et des canaux biliaires, choisies parmi les hépatites, la cirrhose biliaire primitive, la cholangite sclérosante primitive, la cirrhose, l'encéphalopathie hépatique, les lithiases vésiculaires
- les maladies articulaires liées au surpoids, choisies parmi l'ostéopénie, l'ostéoporose, l'arthrose, l'inflammation des disques vertébraux
- les maladies neurodégénératives, choisies parmi la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, les maladies du motoneurone telles que la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primitive et la maladie de Kennedy
- les cancers liés au métabolisme et/ou à une dysbiose du microbiote, choisies parmi les hépatocarcinomes, les cancers du tube digestif tel que de l'œsophage, de l'estomac et cancer colorectal, carcinome pancréatique, les tumeurs neuroendocrines (TNE) du système gastro-entéro-pancréatique, les tumeurs hépatiques, les tumeurs de la vésicule biliaire et des voies biliaires, les tumeurs rénales, les glioblastomes, les lymphomes, les myélomes multiples, la leucémie myéloïde chronique, les maladies myéloprolifératives chroniques, les carcinomes pulmonaires
- les maladies auto-immunes, choisies parmi le diabète insulino-dépendant, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, le lupus érythémateux disséminé, le syndrome auto-immun polyendocrinien
- les maladies dermatologiques atopiques, choisies parmi l'eczéma, le psoriasis
- les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, choisies parmi la maladie de Crohn, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'oesophagite, gastrites, les pancréatites, l'ulcère gastro-duodénal, le syndrome du côlon irritable
- les troubles de la fonction respiratoire, choisies parmi l'asthme, la mucoviscidose, les maladies pulmonaires chroniques obstructives et bronchite chronique, les maladies pulmonaires interstitielles et fibroses pulmonaires, le syndrome d'apnée du sommeil (SAOS)
- les pneumonies, choisies parmi les pneumonies infectieuses, la pneumonie à influenza et la grippe aviaire, le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), la pneumonie à pneumocystis
- Les diarrhées infectieuses, choisies parmi l'infection par Clostridium difficile, l'infection par EHEC, la gastro-entérite à salmonelles, l'entérite à Campylobacter, les toxiinfections alimentaires par bactéries productrices d'entérotoxines, le choléra, la yersiniose, la shigellose, la cryptosporidiose, la listériose
- Les allergies alimentaires, choisies parmi la maladie cœliaque, l'intolérance au lactose, le syndrome de malabsorption des sels biliaires
- Les néphrologies inflammatoires ou en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'urétrite, l'insuffisance rénale chronique, les urolithiases
- Autres désordres inflammatoires, choisies parmi la sclérose en plaque, la lymphangite
- Les maladies neurologiques en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'anorexie, la boulimie, la dépression, le syndrome bipolaire, l'autisme, la schizophrénie, le syndrome de Tourette.
[0141] L'invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries utiles selon l'invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de compositions les contenant et des résultats d'essais démontrant l'efficacité de l'invention qui sont présentés à titre d'illustration uniquement.
[0142] Exemples
[0143] Exemple 1 : Caractérisation de C. minuta selon l'invention déposée sous le numéro DSM 33407.
[0144] La souche bactérienne C. minuta DSM 33407 peut être caractérisée par la méthode suivante.
[0145] Les bactéries natives de la souche DSM 33407 (10 pL de milieu de culture dosé à 109 CFU/mL) ont été déposées sur des grilles en carbone ionisé (Delta Microscopy, Toulouse, France) et une coloration négative a été réalisée avec du Nano-Tungsten (Nano-W, Nanoprobes, LFG Distribution, France).
[0146] L'observation des bactéries montées sur grille a été réalisée avec un microscope électronique à transmission (Talos F200S G2 - Thermofisher - Eindhoven) à 200kV, équipé d'une camera 4K*4K One View (Gatan, Paris, France). La préparation des échantillons, ainsi que les acquisitions ont été réalisées au Bordeaux Imaging Center (membre de France- Biolmaging, ANR-10-INBS-04). La coloration de Gram a été réalisée en suivant la procédure Classique. La bactérie selon l'invention possède les caractéristiques suivantes : gram négatif, anaérobie stricte, sans formation de spores et résistante aux acides biliaires. A partir de la souche DSM 33407, le temps de génération (G) est compris entre 3h et 12h et le taux de croissance (K) est de 0,11 G/heures. [0147] La Figure 1 représente l'image d'une bactérie Christensenella minuta selon l'invention réalisée en microscopie électronique à transmission en coloration négative (grossissement : 36kX). Les dimensions moyennes d'une bactérie de la souche DSM 33407 sont : longueur 1,77 +- 0,34 mm ; largeur= 1,52 +- 0,03 mm ; avec une épaisseur de membrane= 35 nm (moyenne réalisée à partir de 40 bactéries).
[0148] Exemple 2 : Comparaison entre la souche selon l'invention (DSM 33407) et des souches de C. minuta de l'art antérieur.
[0149] Les inventeurs ont également comparé la souche selon l'invention (DSM 33407) à d'autres souches de C. minuta telles que la souche de référence déposée sous le numéro DSM 22607, la souche déposée sous le numéro DSM 32891 et la souche déposée sous le numéro DSM 33715 selon plusieurs paramètres tels que la séquence de l'ADNr 16S, la taille du génome en paire de base (bp), la distance phylogénétique basée sur le génome complet (ANI), le nombre de séquence codante (CDS) et des exemples de gènes spécifiques à la souche. [0150] Les résultats sont présentés dans les tableaux 1 à 3 ci-après.
[0151] [Tableau 1]
Figure imgf000025_0001
[0152] [Tableau 2]
Figure imgf000025_0002
[0153] [Tableau 3]
Figure imgf000026_0001
[0154] Ainsi, la souche selon l'invention (DSM 33407) possède la même séquence d'ADNr
16S que les trois autres souches de C. minuta et ce malgré des propriétés métaboliques et un potentiel anti-inflammatoire différent. Toutefois, la taille du génome, l'ensemble du génome, le nombre de séquence codante et certains gènes spécifiques de ladite souche permettent de la différencier des autres souches de C. minuta.
[0155] Exemple 3 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention.
[0156] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet immunomodulateur et antiinflammatoire de la souche DSM 33407.
[0157] Le protocole d'étude est le suivant. Les cellules HT-29 (ECACC) ont été ensemencées en plaques 24 puits à 3xl05 cellules par puits en milieu McCoy's 5A (Gibco) supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (SVF, Gibco) et incubées à 37°C/5% CO2 pendant 24h. Les cellules ont été lavées au PBS-1X (Gibco) et cultivées pendant 24h supplémentaire en milieu McCoy's 5A à 2% de SVF. Les cellules ont ensuite été stimulées pendant 6 heures avec 5 ng/ml de TNF-a en présence de 10% de surnageant en phase stationnaire de DSM 33407 ou de milieu de culture bactérien comme contrôle (ctrl). Après 6h, les surnageants de culture cellulaire ont été collectés et stockés à - 80°C jusqu'à la quantification de l'IL-8 par ELISA. Le dosage de l'IL-8 a été effectué par ELISA spécifique de BioLegend, selon les instructions du fabricant. L'absorbance à 460 nm a été lue en utilisant le lecteur de microplaques FluoStar Omega, BMG Labtech.
[0158] Pour évaluer l'effet immunomodulateur de la souche DSM 33407, les cellules HT-29 ont été stimulées avec la cytokine pro-inflammatoire TNF-a et le surnageant de DSM 33407 en phase stationnaire pendant 6H. La chimiokine IL-8 est sécrétée par les HT-29 dans un état inflammatoire induit par le TNF-a (Ctrl). Les valeurs représentent la moyenne normalisée en pourcentage par rapport au contrôle + TNF-a, représentant la sécrétion d'IL-8 induite par stimulation au TNF-a, soit 100%.
[0159] La Figure 2 montre qu'en présence du surnageant de la souche DSM 33407, la sécrétion de l'IL-8 est diminuée de 50% par rapport au contrôle (p<0.0001, Dunnett's multiple comparisons test). Le surnageant de la souche DSM 33407 a donc un effet immunomodulateur et anti-inflammatoire.
[0160] Exemple 4 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention.
[0161] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet anti-inflammatoire de la souche DSM 33407 sur un total de 30 souris mâles.
[0162] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45: 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 12 semaines consécutives. Pendant ce temps, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle). Au cours de l'étude, le poids, les apports alimentaires ont été surveillés. Chaque groupe était composé de 10 souris. Les niveaux sanguins d'une adipokynes considérée comme un marqueurs inflammatoire indirect, la résistine, ont été mesurés. La quantification a été réalisée en utilisant des plaques BIORAD construites à façon (Biorad, Marnes la Coquette, France). Tous les échantillons ont été évalués en duplicat.
[0163] Les résultats ont été analysés par une ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli) en utilisant le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p < 0,05 pour toutes les analyses.
[0164]
[0165] La Figure 3 montre que les niveaux de résistine plasmatique à jeun mesurés après 12 semaines d'exposition au HFD45 étaient significativement réduits dans le groupe d'animaux traités avec DSM 33407. Ainsi, en association avec une limitation de la prise de poids, l'administration quotidienne de DSM 33407 a permis de réduire significativement les niveaux circulants (sang à jeun) de résistine.
[0166] Exemple 5 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention.
[0167] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet anti-inflammatoire de la souche DSM 33407 sur un total de 30 souris mâles selon le protocole décrit à l'Exemple 3 à la différence que le régime alimentaire dure 6 semaines consécutives. En fin d'étude les animaux ont été sacrifiés et les tissus d'intérêt, ici les foies, ont été immédiatement prélevés et congelés en attendant leur analyse. Les tissues congelés ont été transformés en poudre azotée. Les broyats ont ensuite été lysés et homogénéisés à froid.
[0168] Après quantification (Bradford), les protéines extraites ont été diluées et les échantillons normalisés à lmg/mL (tampon de lyse avec 1% de Bovine serum Albumine). Le dosage des protéines d'intérêts (IL-6 pour Interleukine 6, RANTES pour regulated on activation, normal T cell expressed and secreted ; TNFa pour tumor necrosis factor alpha) ont été fait selon les recommandations fabricant du kit de quantification (BioLegend). Les données de quantification ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test), puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
[0169] Les résultats sont présentés en Figure 17. L'exposition à un régime gras durant 6 semaines a induit une augmentation significative des niveaux de cytokines IL-6 ; RANTES, et TNFa chez les souris ayant reçu le placebo. Cette augmentation des cytokines hépatiques n'a pas été observée chez les animaux sous régime gras traités avec DSM 33407. En effet, les concentrations de ces 3 protéines sont significativement plus basse que dans le groupe placebo, et similaires aux animaux sous régime standard.
[0170] Exemple 6 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention sur un modèle in vitro.
[0171] L'étude vise à évaluer l'effet anti-inflammatoire de DSM33407 dans un modèle in vitro basé sur des cellules immunitaires humaines en mesurant la quantité de chimiokine (résistine) produite par des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) humaines après stimulation au LPS en présence ou en absence de DSM 33407 (bactérie ou surnageant). [0172] Le protocole d'étude est le suivant. Les PBMC isolées du sang de donneurs sains et cryopréservées (Lonza Biosciences) ont été décongelées puis passées en milieu RPMI-1640 Glutamax (Gibco) contenant 10% de FBS (Gibco) dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 pendant 24 heures avant le début de l'étude. Les PBMCs ont été ensemencées à 1 million par plaque de 24 puits. La stimulation a été réalisée avec un lipopolysaccharide (LPS ; O111B4 E.Coli à 100 ng/ml ). 50pL de milieu de culture (contrôle), de surnageant de culture de DSM 33407, ou de bactéries DSM 33407 (MOI = 50 bactéries/cellule eucaryote) ont été ajoutés en fonction de la condition testée. Les co-cultures ont été maintenues pendant 24 heures. Ensuite, les surnageants finaux ont été collectés et la résistine a été quantifiée par ELISA (R&D systems), en suivant les directives du fabricant. L'absorbance a été lue à 450 nm (FLUOStar Omega ; BMG Labtech). Les données de quantification de résistine présente dans le milieu ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test) puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001)
[0173] Les résultats sont présentés en Figure 18. L'administration de la bactérie seule DSM 33407 ou de son surnageant a permis d'induire une sécrétion de résistine par les PBMCs. L'application du LPS, puissant pro-inflammatoire, a induit une forte augmentation de la résistine. Cette augmentation était significativement plus forte que celle induite en présence de DSM 3407. La présence de DSM 33407 (bactérie ou surnageant) a permis de limiter très fortement l'augmentation de résistine normalement induite par une application de LPS. [0174]
[0175] Exemple 7 : Effet de la souche selon l'invention l'intégrité de la barrière intestinale.
[0176] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet protecteur sur l'épithélium intestinal de la souche DSM 33407.
[0177] Le protocole d'étude est le suivant. Les cellules Caco-2 (ECACC) ont été ensemencées à 2xl04 cellules par puits en plaques 24 puits contenant des inserts avec une membrane perméable en polyester Transwell (Corning Life Science). Les cellules ont été cultivées en milieu DMEM supplémenté de 20% de sérum de veau fœtal (SVF, Gibco) et incubées à 37°C / 5% CO2. La résistance électrique transépithéliale (TEER, transepithelial electrical resistance) a été vérifiée tous les jours à partir du septième jour de culture à l'aide d'un ohmmètre EVOM3 (WPI). Le milieu a été remplacé tous les 2 jours durant 8 à 10 jours, jusqu'à ce que la TEER optimale ait été atteinte (2000 Q.cm2). A l'atteinte de la TEER de référence, les cellules ont été traitées dans le compartiment apical avec DSM 33407 à une MOI de 50 ou du PBS IX/ Glycérol 10% (contrôle) pendant 3h, puis 100 ng/ml de TNF-a a été ajouté ou non dans le compartiment basal. La TEER a été mesurée juste avant l'addition de TNF-a (T0) et 6h (T6H) après l'ajout de TNF-a.
[0178] Pour évaluer la capacité de la souche DSM 33407 à restaurer ou renforcer la barrière intestinale, les cellules Caco-2 en monocouche polarisées ont été prétraitées avec DSM 33407, puis sensibilisées au TNF-a. La TEER a été comparée à T0 (avant ajout du TNF) et T6H. Les valeurs représentent la moyenne normalisée par rapport au contrôle - TNF-a, représentant la TEER basale.
[0179] Les résultats en Figure 4 indiquent que le traitement des Caco-2 avec le TNF-a induit une augmentation de la perméabilité (Ctrl + TNF-a). La souche DSM 33407 est ainsi capable de restaurer la barrière épithéliale, avec un retour au niveau basal (Ctrl - TNF-a).
[0180] Exemple 8 : Effet protecteur de la souche selon l'invention sur la barrière intestinale.
[0181] Les inventeurs ont étudié l'effet protecteur de DSM33407 sur la barrière intestinale lors d'un protocole d'induction de l'obésité par une régime gras en étudiant le niveau d'expression (ARNm) de protéines de jonctions serrées du côlon.
[0182] Le protocole d'étude est le suivant. Trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD: 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 4 semaines consécutives. Durant cette période, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec un véhicule (Placebo ; groupe contrôle). En fin d'étude les animaux ont été sacrifiés et les tissus d'intérêt, ici les côlons, ont été immédiatement prélevés et congelés en attendant leur analyse.
[0183] L'extraction des ARN messagers a été faite grâce à des kits Rneasy Plus (Qiagen), les ADN complémentaires générés par transcription inverse (iScript Advanced cDNA synthesis, Bio-Rad) et l'amplification réalisée par PCR quantitative en temps réel (SsoAdvanced SYBR Green Universal Supermix (Bio-Rad). Les primers spécifiques des gènes d'intérêt (Zol pour zonula occludens 1, Ocln pour Occludinl, Cldn 1 pour Claudinel) ont été élaborés et validés au préalable (Bio-Rad). L'étude a été réalisée en triplicat. Les données de cycle de PCR ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test), puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
[0184] Les résultats en Figure 19 permettent d'observer une augmentation significative des niveaux d'expression pour les protéines Zol, Ocln, et Cldn 1 après 6 semaines de traitement chez les animaux sous régime gras et traités avec DSM 33407 en comparaison avec les animaux recevant le placebo. Cette étude permet ainsi de confirmer le rôle protecteur de la souche selon l'invention sur la barrière intestinale de sujet souffrant d'obésité puisque ces protéines sont responsables du maintien de l'étanchéité de la barrière.
[0185] Exemple 9 : Effet sur la prise de poids et l'efficacité alimentaire de la souche selon l'invention.
[0186] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet de la souche DSM 33407 sur la prise de poids.
[0187] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime normal (ND pour normal diet ; 10 souris) à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45, 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 4 semaines consécutives (20 souris). Pendant ce temps, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle). Chaque groupe était composé de 10 souris. Au cours de l'étude, le poids, les apports alimentaires ont été surveillés, permettant ainsi d'estimer l'efficacité alimentaire (FE pour Feed Efficiency ; en g/kcal). Pour comparer l'impact des traitements sur la FE, l'aire sous la courbe (AUC pour area under curve) a été mesuré entre D0 et D27. Les résultats ont été analysés par ANOVA à deux facteurs avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli ou test de Dunett) via le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
[0188] Les animaux sous HFD45 ont tous pris significativement plus de poids que les animaux restés sous ND. Le traitement avec DSM 33407 a prévenu de façon significative la prise de poids induite par l'exposition au régime obésogène HFD45 (Figure 5). Les premiers effets significatifs sur la prise de poids apparaissent dès le nème jour de traitement. Dans le groupe traité avec DMS 33407, l'efficacité alimentaire était significativement réduite en comparaison au groupe d'animaux sous Placebo.
[0189] Exemple 10 : Effet sur la prise de poids et l'efficacité alimentaire de la souche selon l'invention à différentes doses.
[0190] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet de la souche DSM 33407 à différentes doses sur la prise de poids.
[0191] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet ; 10 souris), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45, 45% de l'apport calorique provient de graisses ; 20 souris) durant 6 semaines consécutives. Pendant ce temps, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec 4 doses différentes de DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle Placebo). Les doses testées étaient de 1,5 ,107 CFU/mL, 1,5 ,108 CFU/mL, 1,5 ,109 CFU/mL (dose de référence), et 1,5 ,1010 CFU/mL. Chaque groupe était composé de 10 souris. Au cours de l'étude, le poids, les apports alimentaires ont été surveillés, permettant ainsi d'estimer l'efficacité alimentaire (FE pour Feed Efficiency (efficacité alimentaire) ; en g/kcal). Pour comparer l'impact des traitements sur la FE, l'aire sous la courbe (AUC pour area under curve) a été mesuré entre D0 et D40.
[0192] Les résultats ont été analysés par ANOVA à deux facteurs avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli ou test de Dunett) via le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
[0193] Les animaux sous HFD45 ont tous pris significativement plus de poids que les animaux restés sous ND. Toutes les doses de DSM 33407 testées entre 1.107 et 1.1010 CFU/mL ont prévenu de façon significative la prise de poids induite par l'exposition au régime obésogène HFD45 (Figure 6). Les premiers effets significatifs sur la prise de poids sont apparus dès le 18ème jour de traitement. Les quatre concentrations ont présenté des effets similaires. Dans tous les groupes traités avec DSM 33407, l'efficacité alimentaire était significativement réduite en comparaison au groupe d'animaux sous Placebo.
[0194] Exemple 11 : Effet sur la prise de poids et la persistance de l'effet, y compris après arrêt du traitement.
[0195] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet de la souche DSM 33407 sur la prise de poids et la poursuite de cet effet après arrêt du traitement.
[0196] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de quarante (40) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet ; 10 souris), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45, 45% de l'apport calorique provient de graisses ; 30 souris) durant 7 semaines consécutives. Pendant ce temps, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral avec DSM 33407 (groupe traité ; 1.109 CFU/mL), soit avec son véhicule (groupe contrôle Placebo), soit avec Orlistat (standard traitement obésité). L'ensemble des traitements ont été arrêté et les animaux restaient sous HFD45 pour 3 semaines supplémentaire. Chaque groupe était composé de 10 souris. L'objectif ici était de tester la potentielle persistance d'effet de DSM 33407 sur la prise de poids. Pour comparer l'impact des traitements sur la prise de poids, l'aire sous la courbe a été mesuré entre D0 et D48 (période de traitement) et entre D48 et D67 (période de lavage).
[0197] Les résultats de suivi de poids quotidien ont été analysés par ANOVA à deux facteurs avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli), et les résultats d'aire sous la courbe ont été analysés par ANOVA un facteur avec comparaisons multiples (test de Tukey). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 (symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, ***p<0.001).
[0198] Là encore, les animaux sous HFD45 ont tous pris significativement plus de poids que les animaux restés sous ND. Le traitement avec DSM 33407 a prévenu de façon significative la prise de poids induite par l'exposition au régime obésogène HFD45 telle que représenté en Figure 7. L'effet observé est comparable à celui observé chez les animaux traités avec un traitement standard de l'obésité (Orlistat). Durant les 3 semaines suivant l'arrêt des traitements, les animaux qui étaient sous Orlistat ont eu une accélération de leur prise de poids, les rapprochant rapidement du groupe d'animaux qui étaient sous Placebo. A l'inverse, les animaux sous DSM 33407 ont présenté un maintien de la protection contre la prise de poids. Ces résultats indiquent une persistance des effets bénéfiques de DSM 33407 durant les 3 semaines suivant l'arrêt du traitement, lors de l'exposition à un régime obésogène.
[0199] Exemple 12 : Effet de la souche selon l'invention sur la perte de poids au cours d'un changement de régime alimentaire.
[0200] Dans la présente étude, les inventeurs ont étudié l'effet de la souche DSM 33407 sur la perte de poids au cours d'un changement de régime alimentaire afin d'évaluer l'impact d'un traitement avec DSM 33407 sur le poids d'animaux obèses lors d'un changement de régime alimentaire.
[0201] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 obèses âgées de 18 semaines élevées sous un régime à très forte teneur en graisse (HFD60, 60% de l'apport calorique provient de graisses) ont été gavées avec le véhicule de DSM 33407 durant une semaine. A DO, certains animaux ont été placés sous un régime standard (ND pour normal diet ; 10 souris) durant 4 semaines. Les autres animaux ont été passés sous un régime alimentaire à moins forte teneur en graisses (HFD45, 45% de l'apport calorique provient de graisses ; 20 souris) durant 4 semaines. Ces animaux, était traités avec DSM 33407 (l,5.109 CFU/mL ; 10 souris), soit avec son véhicule (groupe contrôle placebo). Au cours de l'étude, le poids, les apports alimentaires ont été surveillés, permettant ainsi d'estimer l'efficacité alimentaire (FE pour Feed Efficiency ; en g/kcal). L'objectif principal de l'étude était d'évaluer l'impact d'un traitement avec DSM 33407 sous le poids des animaux lors d'un changement de régime alimentaire. Pour comparer l'impact des traitements sur le poids et la FE, l'aire sous la courbe (AUC pour area under curve) a été mesuré entre D0 et D28.
[0202] Les résultats de suivi de poids quotidien ont été analysés par ANOVA à deux facteurs avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli), et les résultats d'aire sous la courbe ont été analysés par ANOVA un facteur avec comparaisons multiples (test de Tukey). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 (symboles statistiques sur les graphiques : ***p<0.001).
[0203] Le traitement avec DSM 33407 potentialise la perte de poids lors du passage vers un régime moins riche en graisse chez la souris obèse telle que représenté en Figure 8. Le passage d'un régime HFD60 vers ND induit une perte de poids drastique. Parmi les animaux ayant été passés d'un régime HFD60 vers HFD45, les animaux traités avec DSM 33407 présentaient une perte de poids plus importante en comparaison au groupe traité avec le placebo (Figure 8A et 8B). L'efficacité alimentaire était réduite chez les animaux traités avec DSM 33407 en comparaison avec le placebo (Figure 8C).
[0204] Les résultats ont ainsi confirmé que le passage d'un régime HFD60 vers ND induit une perte de poids drastique chez les souris obèses. Chez les souris obèses passées sur un régime moins riche en graisse (HFD45) et traités avec DSM 33407, une perte de poids et une diminution de l'efficacité alimentaire ont été observées. Malgré le passage vers le régime HFD45, les animaux ayant reçu le placebo ont continué à prendre du poids durant les 4 semaines de suivi. Ces résultats indiquent un effet potentialisateur de DSM 33407 sur la perte de poids chez l'animal obèse.
[0205] Exemple 13 : Effet anti-inflammatoire de la souche selon l'invention lors d'un régime alimentaire permettant la perte de poids. [0206] L'étude vise à mesurer l'effet anti-inflammatoire de DSM33407 sur le foie de souris obèses lors d'un protocole visant à faire perdre du poids au animaux en les exposant à un régime ayant une teneur réduite en graisse en mesurant la quantité de cytokines (chimiokines) hépatiques après 4 semaines.
[0207] Le protocole animal est identique à celui de l'Exemple 8. En fin d'étude les animaux ont été sacrifiés et les tissus d'intérêt, ici les foies, ont été immédiatement prélevés et congelés en attendant leur analyse. Les tissues congelés ont été transformés en poudre azotée. Les broyats ont ensuite été lysés et homogénéisés à froid. Après quantification (Bradford), les protéines extraites ont été diluées et les échantillons normalisés à lmg/mL (tampon de lyse avec 1% de Bovine serum Albumine). Le dosage des protéines d'intérêts (IL-6 pour Interleukine 6, IFNy pour interféron gamma ; TNFa pour tumor necrosis factor alpha) ont été fait selon les recommandations fabricant du kit de quantification (BioLegend). Les données de quantification ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test), puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
Les résultats sont présentés en Figure 20. Dans le groupe exposé à un régime réduit en gras durant 4 semaines et recevant le placebo, apparaît une augmentation significative de IFNy et TNFa. Dans le groupe de souris sous régime réduit en graisse et recevant DSM 33407, une amélioration de l'inflammation hépatique était observée par la forte réduction de l'IL-6, IFNy et TNFa.
[0208] Exemple 14 : Effet de la souche selon l'invention sur l'adipogénèse dans le tissu adipeux. [0209] L'objectif principal de l'étude était d'évaluer l'impact d'un traitement avec DSM 33407 sur l'évolution du poids et de la composition corporelle des animaux lors de l'exposition à un régime alimentaire riche en graisse durant 12 semaines.
[0210] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45: 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 12 semaines consécutives. Durant cette période, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle). Au cours de l'étude, le poids des animaux a été mesurés et des mesures de composition corporelle (masse grasse et masse maigre) par résonance magnétique ont été réalisés en fin d'étude (D84). Chaque groupe était composé de 10 souris.
[0211] L'objectif principal de l'étude était d'évaluer l'impact d'un traitement avec DSM 33407 sur l'évolution poids et de la composition corporelle des animaux lors de l'exposition à un régime alimentaire obésogène.
[0212] Les résultats de suivi de poids quotidien ont été analysés par ANOVA à deux facteurs avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli), et les résultats de composition corporelle ont été analysés par ANOVA un facteur avec comparaisons multiples (test de Fischer LSD). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 (symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
[0213] Lors de l'exposition au régime obésogène de type HFD45, un traitement quotidien avec DSM 33407 protège de la prise de poids (Figure 9A) et limite l'accumulation de masse grasse (Figure 9B), et présente une tendance à limiter la perte de masse maigre associée à la prise de poids (Figure 9C).
[0214] Une augmentation très significative de l'hypertrophie adipocytaire (réduction de l'atrophie) a également été observée chez les animaux placés sous HFD45 et traités avec le Placebo. En revanche, le traitement avec DSM 33407 présente une forte tendance à prévenir l'hypertrophie adipocytaire viscérale induite par l'exposition à un régime HFD45 (Figure 9D).
[0215] Les animaux sous HFD45 ont tous pris significativement plus de poids que les animaux restés sous ND. Le traitement avec DSM 33407 a prévenu de façon significative la prise de poids et l'hypertrophie adipocytaire viscérale. En fin d'étude, l'analyse de composition corporelle a montré que chez ces animaux l'accumulation de masse grasse était également significativement réduite en comparaison aux animaux sous placebo. Le traitement DSM 33407 présentait également une forte tendance à limiter la perte de masse maigre associée à l'induction de l'obésité par un régime gras.
[0216] Exemple 15 : Effet de la souche selon l'invention sur l'adipogénèse dans le tissu adipeux (leptine).
[0217] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45: 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 12 semaines consécutives. Durant cette période, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle). En fin d'étude, les animaux ont été mis à jeun et du sang a été prélevé afin d'en extraire le plasma et mesurer les niveaux de leptine. Ces mesures étaient réalisée avec des plaques BIORAD construites à façon (Biorad, Marnes la Coquette, France). Tous les échantillons ont été évalués en duplicat. Les résultats ont été analysés par une ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli) en utilisant le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p < 0,05 pour toutes les analyses (symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
[0218] Un traitement quotidien avec DSM 33407 a permis de prévenir l'augmentation des niveaux de leptine (Figure 10A) circulants classiquement observées après 12 semaines d'exposition à du HFD45%.
[0219] L'exposition à un régime riche en graisse a ainsi induit une augmentation très significative des niveaux de leptine circulants chez les animaux sous Placebo. Dans le groupe d'animaux traités quotidiennement avec DSM 33407, cette augmentation a été significativement réduite pour la leptine.
[0220] Exemple 16 : Effet de la souche selon l'invention sur les comportements alimentaires de type compulsif (effet anorexigène).
[0221] L'objectif de cette étude était d'évaluer la capacité de DSM 33407 à impacter le comportement alimentaire d'animaux soumis à un régime obésogène. Pour se faire un paradigme de mise à jeun suivi d'une réexposition à la nourriture a été utilisé, afin d'induire une hyperphagie réactive chez les animaux.
[0222] Le protocole d'étude est le suivant. Un total de vingt (20) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45 : 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 2 semaines consécutives. Durant cette période, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle). Au 14ème jour, les animaux étaient pesés et mis à jeun pour 12h. Au matin du 15ème jour, les mangeoires étaient replacées dans les cages. Ensuite la prise alimentaire des animaux était mesurée après 1, 2, 4, 8, 24, 48, et 72h. Les animaux étaient pesés une fois par jour. Les résultats ont été analysés par une ANOVA à deux facteurs avec comparaisons multiples (test LSD non corrigés) en utilisant le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p < 0,05 pour toutes les analyses (symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05).
[0223] Chez des animaux soumis à un régime riche en graisse (HFD45), une mise à jeun de 12h induit une perte de poids. A la réexposition à de la nourriture les animaux reprennent rapidement beaucoup de poids et présenté une hyperphagie réactionnelle. Les animaux traités quotidiennement avec DSM 33407 induit une forte tendance à la réduction de la reprise de poids corporel (Figure 11A) visible à partir de 48h. En parallèle, la quantité de calorie ingérées (en cumulé) durant la phase d'hyperphagie induite par le jeûne était réduite dans le groupe traité (Figure 11B) avec DSM 33407.
[0224] Exemple 17 : Effet de la souche selon l'invention sur les niveaux de glucose plasmatique et sur la glycolyse hépatique.
[0225] Le protocole d'étude sur le niveau de glucose plasmatique est le suivant. Un total de trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime normal (ND pour normal diet ; 10 souris) à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD45, 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 4 semaines consécutives (20 souris). Pendant ce temps, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec son véhicule (groupe contrôle). Chaque groupe était composé de 10 souris. Au cours de l'étude, les animaux étaient mis à jeun et du sang était prélevé afin d'en extraire les plasmas à différents temps (0 et 4 semaines). Les niveaux de glucose circulants ont été mesuré en utilisant des plaques BIORAD construites à façon (Biorad, Marnes la Coquette, France). Tous les échantillons ont été évalués en duplicat. Les résultats ont été analysés par une ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples (test de Benjamini, Krieger and Yegutieli) en utilisant le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p < 0,05 pour toutes les analyses (symboles statistiques sur les graphiques : ***p<0.001).
[0226] L'exposition à un régime riche en graisse durant 4 semaines a induit une augmentation très significative des niveaux de glucose plasmatiques à jeun chez les animaux sous Placebo représenté en Figure 12A. Dans le groupe d'animaux traités quotidiennement avec DSM 33407, cette augmentation a été totalement prévenue.
[0227] Le protocole d'étude de la glycolyse hépatique est identique à celui précédemment décrit. En complément, l'expression de la glucokinase (Gck) a été mesurée par PCR quantitative en utilisant un couple de primers spécifiques (Bio-Rad). Brièvement, les ARNs ont été extraits des foies des souris selon et avec le kit RNeasy Lipid tissue de Qiagen. La synthèse des ADN complémentaires a été réalisé avec le kit iScript Advanced cDNA synthesis de Bio-Rad, selon les instructions. Enfin, à partir des ADNc, une PCR quantitative a été réalisé en utilisant le kit SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix de Bio-Rad, selon les instructions avec l'appareil CFX 96 Touch de Bio-Rad. Les couples d'amorces utilisés pour cette étude (Gck, Gapdh, Tbpl, Hrpt) sont des couples désignés et validés par Bio-Rad. L'ensemble des données utilisées pour l'analyse statistique ont été extraites via le logiciel CFX Maestro de Bio-Rad. L'analyse statistique a été réalisée avec R (v. 3.6.2). Une ANOVA a été réalisée avec le facteur traitement suivi d'un test post-hoc de Tukey permettant d'obtenir une valeur de p ajustée à la comparaison multiple.
[0228] Les animaux soumis à un régime riche en gras (HFD-Veh) ont développé une surexpression du gène de la glucokinase (Gck), un régulateur clé de la glycolyse hépatique, par rapport au groupe contrôle (NC-Veh). Le traitement avec C. minuta DSM 33407 (HFD-DSM 33407) inhibe totalement la surexpression de Gck induite par le régime riche en graisse. Par conséquent, on peut en conclure que C. minuta DSM 33407 agit sur le métabolisme hépatique à travers la régulation des voies énergétiques afin de prévenir l'accumulation de lipides (Figure 12B).
[0229] Exemple 18 : Effet de la souche selon l'invention sur la balance des acides biliaires.
[0230] Le protocole d'étude est identique à celui présenté dans l'exemple 5. Dans le cadre de cette étude, la dose de C. minuta DSM 33407 de 109 CFU a été utilisée. Les acides biliaires ont été mesurés à partir d'un échantillon de sérum prélevé à jour 40 (D40) par une méthode HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
[0231] Les acides biliaires jouent un rôle prépondérant dans l'absorption intestinale des lipides. Les acides biliaires sont sécrétés par le foie dans la bile sous la forme d'acides conjugués, dont l'acide taurocholique (TCA) est le principal composant chez la souris. Le TCA est ensuite déconjugué par les bactéries du microbiote intestinal pour former l'acide cholique (CA). 95% des acides biliaires sécrétés par la bile sont réabsorbés dans l'intestin grêle au cours de la digestion, ce qui forme le cycle entéro-hépatique des acides biliaires. Le ratio de CA/TCA circulant est donc un indicateur de l'activité du cycle entérohépatique et reflète l'équilibre métabolique du foie et du microbiote. Lorsque les animaux sont nourris pendant 6 semaines avec un régime riche en graisse, le ratio CA/TCA est augmenté de manière significative (Figure 13). Ce déséquilibre est totalement évité par le traitement avec C. minuta DSM 33407, ce qui indique que le traitement est efficace pour traiter des maladies liées à un désordre de la production de bile comme les lithiases biliaires et autres pathologies des canaux biliaires comme la cholangite sclérosante primitive.
[0232] Exemple 19 : Effet de la souche selon l'invention sur le cycle des acides biliaires.
[0233] L'essai vise à étudier l'impact de DSM33407 sur le cycle des acides biliaires lors d'un protocole d'induction de l'obésité par une régime gras via le niveau d'expression (ARNm) des récepteurs aux acides biliaires dans le foie et d'hormones endocrines du tube digestif (iléon) sensibles aux acides biliaires.
[0234] Le protocole d'étude pour la partie animale est identique à celui de l'Exemple 6. En fin d'étude les animaux ont été sacrifiés et les tissus d'intérêt, ici les foies et iléons, ont été immédiatement prélevés et congelés en attendant leur analyse.
[0235] L'extraction des ARN messagers a été faite grâce à des kits Rneasy Plus (Qiagen), les ADN complémentaires générés par transcription inverse (iScript Advanced cDNA synthesis, Bio-Rad) et l'amplification réalisée par PCR quantitative en temps réel (SsoAdvanced SYBR Green Universal Supermix (Bio-Rad). Les primers spécifiques des gènes d'intérêt (Tgr5 pour G- protein coupled bile acid receptor, Fxr pour farnesoid X receptor, Fgfl5 pour Fibroblast growth factor 15) ont été élaborés et validés au préalable (Bio-Rad). L'expérience est réalisée en triplicat. Les données de cycle de PCR ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test), puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
[0236] Les résultats sont présentés en Figure 21. Pour les animaux recevant le placebo, l'exposition à un régime gras n'a pas eu d'effet sur les niveaux d'expression de Tgr5 et Fxr dans le foie, mais a induit une forte réduction de Fgfl5 dans l'iléon. A l'inverse, les animaux sous DSM 33407 ont montré de fortes augmentations pour les 3 marqueurs suivis.
[0237] Exemple 20 : Effet de la souche selon l'invention sur la fonction hépatique.
[0238] L'essai vise à étudier l'effet protecteur de DSM33407 sur la fonction hépatique lors d'un protocole d'induction de l'obésité par une régime gras via le niveau d'expression (ARNm) de protéines impliquées dans le métabolisme des lipides hépatiques.
[0239] Le protocole d'étude est le suivant. Trente (20) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD: 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 12 semaines consécutives. Durant cette période, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec un véhicule (Placebo ; groupe contrôle). En fin d'étude les animaux ont été sacrifiés et les tissus d'intérêt, ici les foies, ont été immédiatement prélevés et congelés en attendant leur analyse.
[0240] L'extraction des ARN messagers a été faite grâce à des kits Rneasy Plus (Qiagen), les ADN complémentaires générés par transcription inverse (iScript Advanced cDNA synthesis, Bio-Rad) et l'amplification réalisée par PCR quantitative en temps réel (SsoAdvanced SYBR Green Universal Supermix (Bio-Rad). Les primers spécifiques des gènes d'intérêt (Fasn pour fatty acid synthase, Cd36 pour fatty acid translocase Cd36) ont été élaborés et validés au préalable (Bio-Rad). L'expérience est réalisée en triplicat. Les données de cycle de PCR ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test), puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
[0241] Les résultats sont présentés en Figure 22. Le traitement des animaux avec DSM 33407 sur 12 semaines en parallèle à l'exposition à un régime gras a permis de significativement augmenter les niveaux d'expression de Fasn et diminuer l'expression de Cd36.
[0242] Exemple 21 : Effet de la souche selon l'invention sur le microbiote de sujet humain obèse.
[0243] Le protocole d'étude est le suivant. Le SHIME® (Simulateur d'écosystème microbien intestinal humain) est un système in vitro validé permettant d'étudier la biodistribution DSM 33407 et son impact sur le microbiote. Il consiste en une succession de 5 réacteurs simulant les différentes parties du tractus gastro-intestinal humain. Les microbiotes de 2 sujets humains obèses ont été isolés à partir des fèces de donneurs présélectionnés pour leur manque en Christensenellaceae et injectés dans le système SHIME. Après 4 semaines de stabilisation du microbiote et de contrôles, le traitement DSM 33407 a été inoculé pendant 3 semaines (2.109 CFU/jour). Enfin, une période de lavage (sans traitement) d'une semaine a réalisée à la fin du traitement afin d'évaluer la persistance présumée de l'effet du produit. La production d'AGCC (acide gras à chaînes courtes ; acetate, propionate, butyrate) et d'AGCCr (AGCC ramifies ; isobutyric acid, isovaleric acid and isocaproic acid) ont été mesurés tout au long de l'étude (Figure 14A et 14B). Les résultats ont été analysés par une ANOVA un facteur ou à modèle mixte avec comparaisons multiples (test de Fischer LSD non corrigé) en utilisant le logiciel Prism8 (Graphpad). Tous les résultats (Figure 14A et 14B) sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses (symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, **p<0.001).
[0244] Tout au long de l'étude des prélèvements ont été réalisés dans le système afin de pouvoir suivre l'évolution de la composition des microbiote inoculés en réponse au traitement avec DSM 33407 (Figure 14C et 14D).
[0245] L'ADN des échantillons du microbiote a été extrait avec un kit spécifique. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses (symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, **p<0.001).
[0246] Les résultats présentés en Figure 14 permettent de montrer les effets bénéfiques d'un traitement quotidien avec DSM 33407 sur un microbiote d'humain obèse. En effet, une augmentation significative, rapide, et durable des niveaux des 3 AGCC (Acide Gras à Chaîne Courte) principaux (acetate, propionate, butyrate) mesurés dans le côlon proximal (Figure 14A). La production de ces AGCC traduit une augmentation des activités bénéfiques de fermentation saccharolytique dans le colon distal (Figure 14B). En parallèle, une diminution significative et durable des niveaux d'AGCBr (Acide Gras à Chaîne Branchée) était mesurée. La production d'AGCBr indique une réduction des activités de protéolytiques au sein du microbiote traités. Il est intéressant de noter qu'au cours de la période de lavage, les niveaux d'AGCC et AGCBr sont restés à leur niveau sans revenir aux concentrations initiales. Ce qui suggère l'établissement d'effets bénéfiques de DSM 33407 à long terme persistants après l'arrêt du traitement.
[0247] Les résultats présentés en Figure 14C et 14D montrent une diminution significative du ratio Firmicutes/Bacteroidetes dans le colon distal observée lorsque DSM 33407 a été inoculé (TRI, TR2 et TR3). Cet effet est resté constant après une semaine sans inoculation de la bactérie. La diminution de ce ratio s 'explique par la diminution de l'abondance relative de Firmicutes et l'augmentation de Bacteroidetes (Figure D). Ces résultats montrent ainsi, l'effet bénéfique de DSM 33407 dans le rétablissement du microbiote sain des personnes obèses. De fait, le ratio Bacteroidetes/Firmicutes est connu pour être réduit chez les personnes obèses ou souffrant de maladies inflammatoires de l'intestin.
[0248] Exemple 22 : Effet de la souche selon l'invention sur les bactéries bénéfiques du microbiote et sur la diversité du microbiote intestinal chez l'animal.
[0249] Le protocole d'étude est identique à celui présenté en Exemple 5.
[0250] Etude des bactéries bénéfiques.
[0251] La composition du microbiote a été obtenue par la méthode de séquençage shotgun. L'extraction d'ADN à partir des échantillons de selles de souris a été réalisée en utilisant le kit d'extraction d'ADN DNeasy Power Soil Pro Kit de Qiagen et suivant le protocole recommandé par le fabricant. Les échantillons d'ADN extraits ont été quantifiés à l'aide d'un fluoromètre Qubit 4 et du test Qubit ™ dsDNA HS Kit (Thermofisher Scientific). Les bibliothèques d'ADN ont été préparées en utilisant le kit de préparation de bibliothèque d'ADN Nextera XT (Illumina) et le Kit Index Nextera (Illumina) suivant le protocole du fabricant. Les bibliothèques d'ADN ont été quantifiées en utilisant un fluoromètre Qubit 4 et le kit de test Qubit ™ dsDNA HS. Le séquençage par paires (2X150 pb) a été effectué sur Illumina HiSeq4000 avec une profondeur de séquençage moyen de 5 millions de reads.
[0252] Le traitement des séquences a été réalisé en utilisant la plateforme en ligne de CosmosID "Metagenomics Cloud". Les données annotées au rang de la famille ont été exportées, puis les analyses statistiques effectuées dans Python 3.
[0253] Les données ont été analysées par Analyse en Composante Principale, afin d'identifier des groupes sans a priori et présentées en Figure 15A.
[0254] Le traitement à base de C. minuta DSM 33407 soutient le développement d'autres bactéries comme les Bifidobacteriaceae et les Ruminococcaceae connues pour leur métabolisme bénéfique, respectivement production d'acide lactique et d'acide butyrique indiquant un effet bénéfique sur le microbiote intestinal.
[0255] Etude de la diversité du microbiote.
[0256] La classification hiérarchique non supervisée a été obtenue en utilisant un script Python 3 exploitant la fonction clustermap de la librairie Seaborn v. 0.10.1. La fonction calcule la matrice de distances euclidiennes entre les familles de bactéries puis les classe en utilisant l'algorithme de Voor Hees. La matrice est colorée selon le paramètre de correlations "r".
[0257] Les résultats sont présentés en Figure 15B et montre que les souris traitées pendant 8 semaines avec un régime riche en graisse et supplémentée ou non avec DSM 33407, favorise les familles de bactéries bénéfiques comme les Ruminococcaceae, les Rikenellaceae, les Lactobacillaceae et les Akkermansiaceae (Groupe B). Par opposition, les familles de bactéries riches en pathogènes opportunistes comme les Enterobacteriaceae, les Yersiniaceae, les Neisseriaceae et les Xanthomonaceae (Groupe A) sont regroupées de manière bien distinctes à l'écart du groupe soutenu par les Christensenellaceae.
[0258] Exemple 23 : Effet de la souche selon l'invention sur l'activité du microbiote intestinal chez l'animal.
[0259] L'étude vise à démontrer l'impact d'un gavage quotidien avec DSM33407 sur l'activité du microbiote intestinal de l'animal lors d'un protocole d'induction de l'obésité par un régime gras en quantifiant certains acides gras à courte chaîne (AGCC) présents dans le caecum. [0260] Le protocole d'étude est le suivant. Trente (30) souris mâles C57BI6 âgées de 7 semaines ont été exposées soit à un régime standard (ND pour normal diet), soit à un régime alimentaire à forte teneur en graisses (HFD: 45% de l'apport calorique provient de graisses) durant 12 semaines consécutives. Durant cette période, les animaux ont été traités quotidiennement par gavage oral, soit avec DSM 33407 (groupe traité), soit avec un véhicule (Placebo ; groupe contrôle). En fin d'étude les animaux ont été sacrifiés et les tissus d'intérêt, ici le colon dont le caecum, a été immédiatement prélevés et congelés en attendant leur analyse.
[0261] Les caeca ont été homogénéisés (Precellys), filtrés deux fois (0,2pm, lh, 15°C and 10000g, puis lOkDa, lh, 15°C and lOOOOxg. Les filtrats étaient mélangés avec les différents éléments permettant de quantifier par raisonnance magnétique nucléaire (RMN), c'est-à-dire du DSS-d6 (standard interne), du DFTMP (indicateur pH), et du D2O (RMN spin lock). Des contrôles ne contenant pas d'échantillons caecales ont été réalisés. Les solutions étaient transférées dans des tubes dédiés (3mm SampleJet) puis passés dans l'autosampler (SampleJet) en attente d'analyses RMN (Avance 600Mhz NMR, Bruker, noesygpprl). Les données de RMN ont été analysées (Chenomx NMR 8.6) puis les quantités d'AGCC d'intérêt, Acetate, Butyrate, et Propionate, ont été rapportées au volume et au poids des échantillons initiaux. Les données de quantification d'AGCC ont été analysées en (i) évaluant leur distribution (Shapiro-Wilk test), puis via (ii) une ANOVA un facteur avec comparaison multiple (Dunett) via le logiciel Prism9 (GraphPad). Les données sont exprimées en moyenne ± écart standard à la moyenne (SEM) et le seuil de significativité est fixé à p<0,05 pour toutes les analyses. (Symboles statistiques sur les graphiques : *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001)
[0262] Les résultats sont présentés en Figure 23. L'exposition à un régime riche en graisse durant 12 semaines a abouti à une réduction des niveaux de butyrate et de propionate dans les caeca des animaux sous placebo. Aucun effet du régime n'a été observé sur les niveaux d'acétate. Le traitement avec DSM 33407 a permis une augmentation notable des niveaux d'acétate, un maintien des niveaux normaux de butyrate et de propionate.
[0263] Exemple 24 : Effet anti-prolifératif de la souche selon l'invention.
[0264] Le protocole d'étude est le suivant. Les lignées cellulaires HCT-116 et HepG2 ont été obtenues de Sigma-Aldrich. Les HCT-116 ont été maintenues en culture en milieu McCoy's 5A (Gibco) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Gibco) et 1% de pénicilline/streptomycine (Sigma-Aldrich) et les HepG2 ont été cultivées en milieu DMEM (Gibco) supplémenté avec 10% de SVF (Gibco), dans un incubateur en atmosphère humide à 37°C et 5% de CO2.
[0265] Les cellules ont été ensemencées à une densité de 10000 cellules / puits dans un volume total de 100 pl en plaque 96-puits. Après 24h d'incubation, le milieu de culture a été retiré des cellules adhérentes et du nouveau milieu supplémenté avec 10% de surnageant en phase stationnaire de DSM 33407 a été ajouté et en contrôle GAM (milieu de culture bactérien). L'inhibiteur VIII d'Akt a été utilisé comme contrôle positif. Chaque condition a été faite en 4 réplicats. Les cellules ont été incubées pendant 48h ou 72h supplémentaires.
[0266] La prolifération cellulaire a été déterminée par l'utilisation du kit Cel ITiter-G lo 2.0 assay (Promega). Les mesures ont été réalisées selon les instructions du fabricant. Brièvement, les plaques ont été retirées de l'incubateur et laissées s'équilibrer à température ambiante pendant 30 min et un volume égal de réactif CelITiter-GIo 2.0 a été ajouté directement aux puits (100 pl). Les plaques ont été mises sous agitation à 300 tr/ min pendant 2 min en utilisant un agitateur rotatif, puis incubées à température ambiante pendant 10 min. Le mélange réactionnel a ensuite été transféré dans une plaque 96 puits à paroi blanche et le signal luminescent a été mesuré à l'aide d'un lecteur de microplaques (FLUOstar Omega, BMG Labtech).
[0267] Les résultats présentés en Figure 16 permettent d'observer l'influence de la souche DSM 33407 sur la prolifération de cellules tumorales, en particulier l'effet sur une lignée cellulaire humaine d'adénocarcinome du colon, la lignée HCT-116, et sur une lignée d'hépatocarcinome humain, la lignée HepG2. L'effet du surnageant sur la prolifération a été évaluée à 48h (A) et 72h (B) sur les cellules HCT-116 et à 48h (C) sur les HepG2. Le surnageant de DSM 33407 réduit significativement la prolifération par rapport au contrôle, correspondant aux cellules traitées avec le milieu de culture bactérien (milieu de culture bactérien vs DSM 33407 : p=0.0049 (A), p<0.0001 (B) et p=0.0019 (C), Dunnett's multiple comparisons test). L'inhibiteur VIII d'Akt est utilisé comme contrôle du blocage de la prolifération cellulaire.
[0268] Le surnageant de la souche DSM 33407 induit une diminution de la prolifération des lignées tumorales HCT-116 et HepG2, suggérant un potentiel rôle dans l'inhibition du développement tumoral.
WO 2022/058423 BUDAPESTER VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE PCT/EP2021/075475.
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FOR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
DSMZ
INTERNATIONALES FORMBLATT til * I O J*
LNC Therapeutics
EMPFANGSBESTÀTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG,
17 Place de la Bourse ausgestellt gemâB Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
33076 Bordeaux Cedex
FRANCE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte ETNGANGSNUMMER;
LX05
DSM 33407
H. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZETCHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) cine wisscnschaftlichc Beschrcibung
( X ) Cine vorgcschlagcnc taxonomischc Bezeichnung eingereicht.
(Zutreffcndes ankrcuzcn).
III. E1NGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2020-01 - 15 (Datum der Ersthinterlegung)1 eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Intemationalen Hinterlegungsstelle am 2020-01 -15 eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemaB Budapester Vertrag ist am 2090-00-08 eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung). zuzu-w-vo
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung Unterschrift(en) der zur Vertretung der intemationalen Hinterlegungsstelle von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH befugten Pcrson(en) odcr des (der) von ihr ermachtigten Bedienstctcn:
Anschrift: Inhoffenstr. 7 B
D-38124 Braunschweig
X -TZ. .- v
Datum: 2020-09-09
Falls Regel 6.4 Buchstabc d zutrifft, ist dies dor Zcitpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden 1st.
Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 07/2019 WO 2022/058423 BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL PCT/EP2021/075475 RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE
DSMZ
INTERNATIONAL FORM
.
LNC Therapeutics
17 Place de la Bourse RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7.1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page
33076 Bordeaux Cedex
FRANCE
I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM
Identification reference given by the pEPOSnOR: Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY;
LX05
DSM 33407 n. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION
The microorganism identified under I. above was accompanied by:
( ) a scientific description
( x ) a proposed taxonomic designation
(Mark with a cross where applicable).
HI. RECEIPT AND ACCEPTANCE
11118 International Depositary Authority accepts the microorganism identified under!, above, which was received by it on 2020-01- 15 (Date of the original deposit)1.
IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION
The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on 2020-01-15 (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on 2020-09-08 (date of receipt of request for conversion).
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Signature(s) of person(s) having the power to represent the
Microorganisms and Cell Cultures International Depositary Authority or of authorized official(s):
Address: Inhoffenstr. 7 B
D-38124 Braunschweig
Date: 2020-09-09
1 Where Rule 6.4 (d) applies, such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired. Form DSMZ-BP/4 (sole page) 07/2019

Claims

Revendications
[Revendication 1] Souche bactérienne de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33407.
[Revendication 2] Souche bactérienne dérivée de la souche bactérienne selon la revendication 1.
[Revendication 3] Souche bactérienne selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'ARNr 16S ayant au moins 99% d'identité avec la séquence d'ARNr 16S de la souche selon la revendication 1.
[Revendication 4] Souche bactérienne selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est vivante, morte, atténuée ou inactivée.
[Revendication 5] Surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne selon l'une des revendications 1 à 4.
[Revendication 6] Surnageant de culture selon la revendication précédente caractérisé en ce que le surnageant est choisi parmi au moins un composé cellulaire bactérien, un débris cellulaire bactérien, un métabolite et/ou une molécule sécrétée ou leur combinaison.
[Revendication 7] Composition comprenant au moins une souche bactérienne selon l'une des revendications 1 à 4 et/ou au moins un surnageant selon la revendication 5 ou 6.
[Revendication 8] Composition selon la revendication précédente comprenant en outre au moins un composé additionnel.
[Revendication 9] Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que le composé additionnel est un microorganisme différent de la souche bactérienne selon l'une des revendications 1 à 4.
[Revendication 10] Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le microorganisme est une bactérie du genre Christensenella.
[Revendication 11] Composition selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que le composé est un probiotique.
[Revendication 12] Composition selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend également au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[Revendication 13] Composition selon l'une des revendications 7 à 12, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme solide, liquide ou lyophilisée.
[Revendication 14] Composition selon l'une des revendications 7 à 13, ladite composition étant sous une forme adaptée à une administration par voie orale, nasale, parentérale, rectale, sublinguale, oculaire, auriculaire, inhalée ou cutanée.
[Revendication 15] Composition selon l'une des revendications 7 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 50% de bactéries selon l'une des revendications 1 à 4, vivantes (en nombre).
[Revendication 16] Composition selon l'une des revendications 7 à 15, dans laquelle la composition se présente sous forme de poudre, poudre microencapsulée, de gélule, de capsule, de comprimé, de pastille, de granulés, d'émulsion, de suspension, de suppositoire, de sirop.
[Revendication 17] Composition selon l'une des revendications 7 à 15, dans laquelle la composition se présente sous forme d'un produit alimentaire, d'une boisson, d'un nutraceutique, d'un additif alimentaire, d'un complément alimentaire ou d'un produit laitier.
[Revendication 18] Souche bactérienne selon l'une des revendications 1 à 4, surnageant selon la revendication 5 ou 6, ou une composition selon l'une des revendication 7 à 17, pour son utilisation comme médicament.
[Revendication 19] Souche bactérienne surnageant ou composition pour son utilisation selon la revendication précédente caractérisée en ce qu'elle est administrée à un sujet humain ou un animal non-humain.
[Revendication 20] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 ou 19, dans la prévention et/ou le traitement d'une dysbiose du microbiote.
[Revendication 21] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 à 20, dans la prévention et/ou le traitement des maladies chroniques.
[Revendication 22] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 à 20, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l'obésité.
[Revendication 23] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 à 20, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies métaboliques.
[Revendication 24] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 à 20, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires.
[Revendication 25] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 à 20, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des cancers.
[Revendication 26] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon la revendication précédente, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des cancers liés au métabolisme.
[Revendication 27] Souche bactérienne, surnageant ou composition pour son utilisation selon l'une des revendications 18 ou 19, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'au moins une maladie choisie parmi :
Les maladies métaboliques, choisies parmi le diabète non-insulinodépendant, le diabète gestationnel, la NASH, la stéatose hépatique, la stéatose pancréatique, les hyperlipidémies, les hypercholestérolémie, l'infertilité liée au surpoids, l'incontinence urinaire liée au surpoids,
Les autres maladies métaboliques chroniques, dont les thyroïdites, les maladies cardiaques et vasculaires, choisies parmi l'athérosclérose, les thrombopathies, les péricardites aiguës et la péricardite chronique constrictive, l'hypertension artérielle, les vascularites les maladies du foie et des canaux biliaires, choisies parmi les hépatites, la cirrhose biliaire primitive, la cholangite sclérosante primitive, la cirrhose, l'encéphalopathie hépatique, les lithiases vésiculaires les maladies articulaires liées au surpoids, choisies parmi l'ostéopénie, l'ostéoporose, l'arthrose, l'inflammation des disques vertébraux les maladies neurodégénératives, choisies parmi la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, les maladies du motoneurone telles que la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primitive et la maladie de
Kennedy les cancers liés au métabolisme et/ou à une dysbiose du microbiote, choisies parmi les hépatocarcinomes, les cancers du tube digestif tel que de l'œsophage, de l'estomac et cancer colorectal, carcinome pancréatique, les tumeurs neuroendocrines (TNE) du système gastro-entéro-pancréatique, les tumeurs hépatiques, les tumeurs de la vésicule biliaire et des voies biliaires, les tumeurs rénales, les glioblastomes, les lymphomes, les myélomes multiples, la leucémie myéloïde chronique, les maladies myéloprolifératives chroniques, les carcinomes pulmonaires les maladies auto-immunes, choisies parmi le diabète insulino-dépendant, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante, le rhumatisme psoriasique, le lupus érythémateux disséminé, le syndrome auto-immun polyendocrinien les maladies dermatologiques atopiques, choisies parmi l'eczéma, le psoriasis les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, choisies parmi la maladie de Crohn, la recto-colite ulcéro-hémorragique, la diverticulite, l'cesophagite, gastrites, les pancréatites, l'ulcère gastro-duodénal, le syndrome du côlon irritable les troubles de la fonction respiratoire, choisies parmi l'asthme, la mucoviscidose, les maladies pulmonaires chroniques obstructives et bronchite chronique, les maladies pulmonaires interstitielles et fibroses pulmonaires, le syndrome d'apnée du sommeil (SAOS) les pneumonies, choisies parmi les pneumonies infectieuses, la pneumonie à influenza et la grippe aviaire, le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), la pneumonie à pneumocystis
Les diarrhées infectieuses, choisies parmi l'infection par Clostridium difficile, l'infection par EHEC, la gastro-entérite à salmonelles, l'entérite à Campylobacter, les toxiinfections alimentaires par bactéries productrices d'entérotoxines, le choléra, la yersiniose, la shigellose, la cryptosporidiose, la listériose
Les allergies alimentaires, choisies parmi la maladie cœliaque, l'intolérance au lactose, le syndrome de malabsorption des sels biliaires
Les néphrologies inflammatoires ou en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'urétrite, l'insuffisance rénale chronique, les urolithiases Autres désordres inflammatoires, choisies parmi la sclérose en plaque, la lymphangite
Les maladies neurologiques en lien avec une dysbiose du microbiote, choisies parmi l'anorexie, la boulimie, la dépression, le syndrome bipolaire, l'autisme, la schizophrénie, le syndrome de Tourette.
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