WO2022019584A1 - 암 치료제 - Google Patents

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WO2022019584A1
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김태경
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강원호
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present disclosure relates to a cancer treatment agent, and more particularly, to a cancer treatment agent including botulinum toxin as an active ingredient, used in combination with an immunotherapeutic agent.
  • Botulinum toxin (Botulinum neurotoxin, BoNT) is a polypeptide product of the anaerobic bacterium Clostridium botulinum, and is a toxic substance that specifically acts on nerve cells. Botulinum toxin is a toxic substance that intrinsically causes lethality, but it is associated with a number of conditions including: It is used to treat urologic disease, migraine, and the like.
  • International Publication No. WO2010/062955 discloses that a therapeutically effective amount of botulinum toxin is administered in combination with an anticancer drug or anticancer therapy to a nonneoplastic area near a neoplasia, but a therapeutically effective amount of botulinum toxin penetrates the neoplasm A method for inhibiting the growth or metastasis of a neoplasm, which does not do so, is disclosed.
  • International Publication No. WO2006/094539 discloses a method for sensitizing cancer treatment by cytotoxic therapy, such as chemotherapy or radiation therapy, comprising administering a pharmaceutical composition comprising a botulinum toxin to cancer tissue or cells. and compositions therefor.
  • Anticancer immunotherapy is a treatment that activates the body's immune system to increase autoimmunity so that immune cells attack cancer cells.
  • Immunotherapeutic agents can be largely classified into immune checkpoint inhibitors, immune cell therapy, therapeutic antibodies, anticancer vaccines, and oncolytic viruses.
  • Immune checkpoint inhibitors are drugs that attack cancer cells by activating T cells by blocking the activity of immune checkpoint proteins involved in T cell suppression, and typically recognizes CTLA-4, PD-1, and PD-L1. antibody is used.
  • Immune cell therapy is a drug that strengthens cellular immunity against cancer cells by collecting, strengthening and transforming T cells from the patient's body, and injecting them back into the body.
  • Therapeutic antibody is a drug that attacks cancer cells by releasing the drug when the antibody-drug conjugate binds to cancer cells
  • an antibody-drug conjugate ADC
  • Anticancer vaccines are to activate the immune system by administering to cancer patients a tumor-specific antigen or a protein or peptide molecule that can improve the overall immune response of cancer cells, thereby activating the immune function in the body to attack cancer cells.
  • Anticancer virus is a virus that attacks cancer and directly kills cancer cells, but in addition, it induces activation of immune cells to enhance anticancer ability.
  • a first object of the present disclosure is to provide a composition for treating cancer in combination with an immunotherapeutic agent, comprising botulinum toxin as an active ingredient.
  • a second object of the present disclosure is to provide a method for treating cancer by administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of botulinum toxin in combination with an immunotherapeutic agent.
  • a third object of the present disclosure is to provide a botulinum toxin for use as a cancer therapeutic agent in combination with an immunotherapeutic agent.
  • a fourth object of the present disclosure relates to the use of botulinum toxin as a cancer therapeutic agent in combination with an immunotherapeutic agent.
  • a first aspect of the present disclosure relates to a composition for treating cancer in combination with an immunotherapeutic agent, comprising botulinum toxin as an active ingredient.
  • a second aspect of the present disclosure relates to a method of treating cancer by administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a botulinum toxin in combination with an immunotherapeutic agent.
  • a third aspect of the present disclosure relates to a botulinum toxin for use as a cancer treatment in combination with an immunotherapeutic agent.
  • a fourth aspect of the present disclosure relates to the use of botulinum toxin as a cancer therapeutic agent in combination with an immunotherapeutic agent.
  • 'botulinum toxin' refers to a botulinum toxin protein molecule produced by bacteria or recombinantly, including all serotypes and variants or fusion proteins thereof.
  • the Clostridium botulinum strain produces immunologically distinct neurotoxins (types A-G).
  • the molecular masses of type A-G neurotoxin (NTX) are about 150 kDa (7S).
  • NTX neurotoxin
  • PTX progenitor toxins
  • 12S toxin consists of NTX and a nontoxic nonhemagglutinin (named NTNH) having no hemagglutinin activity
  • 19S and 16S toxin consists of NTX, NTNH and hemagglutinin.
  • Type A strains produce three types of toxins (19S, 16S and 12S).
  • Type B, C and D strains produce 16S and 12S toxins. Under alkaline conditions, PTX dissociates into NTX and non-toxic components, 19S and 16S toxins dissociate into NTX and NTNH and non-toxic components (complex) of hemagglutinin, and 12S toxins dissociate into NTX and NTNH.
  • the botulinum toxin may be of any of the above-described forms, for example, may have a molecular weight of 19S, 16S, 12S, or 7S.
  • Botulinum toxin includes botulinum toxin derivatives.
  • the botulinum toxin derivative may be a botulinum toxin, a natural botulinum toxin having activity, or a recombinant native botulinum toxin part or a derivative containing one or more chemical or functional modifications on a partial chain.
  • the botulinum toxin derivative may be a modified toxin having one or more amino acids deleted, modified or substituted.
  • the botulinum toxin may be a recombinant peptide, a fusion protein, or a hybrid neurotoxin prepared, for example, from subunits or domains of different toxin serotypes.
  • the botulinum toxin may also be a part of a whole molecule having a toxin activity, and may be used in combination or as part of a conjugated molecule, for example, a fusion protein.
  • the botulinum toxin is a botulinum toxin that does not comprise a chemical or functional modification, e.g., a natural botulinum toxin or a recombinant prototoxin or a portion thereof, e.g., a complexed botulinum toxin (eg 19S toxin) or a non- complexed botulinum toxin (eg, 7S toxin).
  • a complexed botulinum toxin eg 19S toxin
  • a non- complexed botulinum toxin eg, 7S toxin
  • immunotherapeutic agent refers to a compound, composition or treatment that indirectly or directly enhances, stimulates or increases the body's immune response to cancer cells and/or reduces the side effects of other anticancer therapies.
  • immunotherapeutic agents include cytokines, cancer vaccines, monoclonal antibodies, non-cytokine adjuvants, anti-cancer viruses, immune cells (T cells, NK cells, dendritic cells, B cells, etc.), immune checkpoint inhibitors, and the like. do.
  • the term 'combination' refers to any form of two or more different therapeutic agents such that a second therapeutic agent is administered while the previously administered therapeutic agent is still effective in the body.
  • two therapeutic agents are simultaneously effective in a subject, which may include a synergistic effect of the two therapeutic agents.
  • the different therapeutic agents may be administered simultaneously or sequentially as a single agent or as separate agents.
  • administering' or 'administering' refers to a step of providing a pharmaceutical composition or an active ingredient to a subject.
  • the pharmaceutical composition may be administered via a variety of suitable routes.
  • “Pharmaceutical composition” means a formulation containing an active ingredient.
  • the term 'agent' means that in addition to the active ingredient (eg botulinum toxin), at least one additional ingredient, for example albumin (human serum albumin or recombinant human albumin) and/or sodium chloride, is present in the pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition is a formulation suitable for administration to a subject, such as a human patient.
  • the pharmaceutical composition may be in lyophilized form, for example a solution formed after reconstitution of the lyophilized pharmaceutical composition with saline or water, or in the form of a solution that does not require reconstitution.
  • Pharmaceutical compositions may be liquid or solid.
  • the pharmaceutical composition may be free of animal-derived proteins and/or albumin.
  • 'therapeutically effective amount means the level, amount or concentration of a pharmaceutical composition comprising an agent, e.g., botulinum toxin or botulinum toxin, required to treat a disease, disorder or condition without causing significant adverse or adverse side effects do.
  • an agent e.g., botulinum toxin or botulinum toxin
  • 'Treat', 'treating' or 'treatment' refers to, for example, healing of wounded or damaged tissue, or altering, altering, enhancing, ameliorating, ameliorating and improving an existing or perceived disease, disorder or condition. Alleviation or reduction (including partial reduction, significant reduction, near complete reduction and complete reduction), resolution or prevention (temporary or permanent) of a disease, disorder or condition, which results in the achievement of the desired therapeutic outcome by beautifying means
  • 'treatment' is a concept including prevention. By 'prevention' is meant delaying the onset of a disease, disorder or condition. Prevention may be considered complete if the onset of the disease, disorder or condition is delayed for a predetermined period.
  • 'treatment' refers to the treatment of a disease, disorder, or medical condition in a patient, such as a mammal (especially a human), comprising one or more of the following:
  • the present disclosure is based on the discovery that a botulinum toxin or a composition comprising the same can be useful as a therapeutic agent for cancer in combination with an immunotherapeutic agent.
  • the present disclosure is based on the discovery that a botulinum toxin or a composition comprising the same can be useful as a therapeutic agent for metastatic cancer in combination with an immunotherapeutic agent.
  • the botulinum toxin can be used without limitation of serotype, type A (BoNT/A), B (BoNT/B), C (BoNT/C), D (BoNT/D), E (BoNT/E) ), F(BoNT/F), G(BoNT/G), H(BoNT/H), X(BoNT/X), Enterococcus sp.
  • botulinum toxin J eBoNT/J
  • mosaic botulinum toxin and/or variants thereof It may be selected from the group consisting of.
  • mosaictoxins include BoNT/DC, BoNT/CD and BoNT/FA.
  • type A can be used.
  • the botulinum toxin is selected from various BoNT/A subtypes, eg, A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A9, A10; BoNT/B subtypes such as B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, Bnp and Bbv; BoNT/C subtypes such as C and CD; BoNT/D subtypes such as D and DC; BoNT/E subtypes such as E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9; BoNT/F subtypes such as F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7; and from the BoNT/G subtype, eg, subtype G.
  • BoNT subtypes include chimeric BoNTs, such as BoNT/DC, BoNT/CD, BoNT/FA, and the like.
  • the immunotherapeutic agent may use any substance or therapy known in the art, and may include cytokines, cancer vaccines, oncolytic viruses, monoclonal antibodies, non-cytokine adjuvants, immune cells (T cells, NK cells, dendritic cells, B cells, etc.), and immune checkpoint inhibitors.
  • the immunotherapeutic agent is an immune checkpoint inhibitor.
  • Immune checkpoint inhibitors include peptides, antibodies, nucleic acid molecules and small molecules.
  • an immune checkpoint inhibitor may be administered to enhance the proliferative, migratory, persistence and/or cytotoxic activity of CD8+ T cells in a subject, and particularly tumor invasiveness of CD8+ T cells in a subject.
  • checkpoint inhibitors are activated T lymphocytes, such as cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4) and programmed cell death 1 (PD-1), or the killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) family.
  • CTL4 cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4
  • PD-1 programmed cell death 1
  • KIR killer cell immunoglobulin-like receptor
  • an immune checkpoint inhibitor is an antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-L2 antibody, an anti-CTLA-4 antibody, an anti-TIM-3 antibody, an anti-LAG3 antibody, an anti-IDO1 antibody.
  • immune checkpoint inhibitors include Ipilimumab (Yervoy®, BMS/Ono), Tremelimumab (AstraZeneca), atezolizumab (Tecentric®, Roche), and nivolumab (nivolumab) (Opdivo®, BMS/Ono), Pembrolizumab (Keytruda®, MSD), Avelumab (Bavencio®, Pfizer/Germany)
  • Merck Durvalumab (Impingi®, AstraZeneca/MedImmune), and antigen-binding fragments thereof may be at least one selected from, but not limited to.
  • the cancer may be exosome-mediated.
  • Exosomes are a type of extracellular vesicles, and have a size of approximately 100 nm in diameter. They are surrounded by a lipid bilayer and are secreted by most cells. Exosomes are generated as an intraluminal membrane vesicle (ILV) within the endocytic system and are secreted during the fusion of the cell membrane and the multivesicular body (MVB). It has been reported that exosomes contribute to maintaining tissue homeostasis by regulating cell-cell communication. Exosomes released from cancer cells are involved in cancer progression. Proliferative cancer cells (1) expand cancer tissue using angiogenesis, (2) acquire the ability to migrate and invade, and (3) acquire the ability to evade attack from immune cells, and ultimately metastatic lesion , and exosomes may be involved in each of these processes.
  • IMV intraluminal membrane vesicle
  • the cancer may be a solid tumor.
  • Non-limiting examples of solid cancer include breast cancer, lung cancer, head or neck cancer, colorectal cancer, esophageal cancer, laryngeal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, skin cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, perianal cancer, Colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer , chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brain tumor such as glioma (eg astrocytoma) , gli
  • the cancer may be metastatic cancer.
  • composition in one aspect, can be used in subjects with increased exosome secretion.
  • composition comprising botulinum toxin may further comprise one or more pharmaceutically acceptable excipients or additives.
  • compositions or additives include stabilizers, ionic compounds, surfactants, buffers, lyophilization protectants, or combinations thereof, such as amino acids (eg methionine), salts (eg NaCl). ), buffers, nonionic surfactants (e.g. polysorbate, e.g. polysorbate 20), sugars (e.g. disaccharides such as sucrose), sugar alcohols (e.g. sorbitol), or their It can be a combination.
  • amino acids eg methionine
  • salts eg NaCl
  • nonionic surfactants e.g. polysorbate, e.g. polysorbate 20
  • sugars e.g. disaccharides such as sucrose
  • sugar alcohols e.g. sorbitol
  • composition may not contain albumin or animal-derived components or polysaccharides.
  • compositions include, for example, those disclosed in WO2009-008595 A1 or WO2012-134240 A2, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
  • compositions include, without limitation, commercially available pharmaceutical compositions containing botulinum toxin, such as, for example, BOTOX® (botulinum toxin type A neurotoxin complex with human serum albumin and sodium chloride) (Allergan, Inc.) (Allergan, Inc: Irvine, CA, USA), DYSPORT® (a powder reconstituted with 0.9% sodium chloride prior to use, Clostridium botulinum type A toxin hemagglutinin with human serum albumin and lactose in the formulation complex) (Ipsen Limited (Berkshire, UK)), MYOBLOCTM (injection solution containing botulinum toxin type B, human serum albumin, sodium succinate, and sodium chloride (approximately pH 56)) (Solstice Neurosciences) , Inc.
  • BOTOX® botulinum toxin type A neurotoxin complex with human serum albumin and sodium chloride
  • DYSPORT® a powder reconstituted with 0.9%
  • the composition may be Medytoxin®, Innotox®, Coretox®, or one or more combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the composition may be formulated in any form, such as a solid or liquid formulation, for example, a lyophilized powder, a liquid, or a pre-filled syringe formulation.
  • the composition may be a formulation for local administration.
  • topical administration may be intratumoral or precancerous tissue administration or peritumoral administration, and is typically accomplished by intratumoral injection or peritumoral injection of an aqueous botulinum toxin solution.
  • the formulation can be administered subcutaneously or into a soft tissue, eg, intramuscularly.
  • the composition can inhibit tumor growth or inhibit tumor development at a location away from the location by intratumoral or peripheral administration at a specific location, and the composition can exhibit systemic effects when administered locally.
  • a therapeutically effective amount of botulinum toxin is about 0.01 U/kg to about 100 U/kg, about 0.1 U/kg to about 100 U/kg, about 0.2 U/kg to about 100 U/kg, about 0.2 U/kg kg to about 50 U/kg, from about 0.2 U/kg to about 30 U/kg, from about 0.2 U/kg to about 10 U/kg, from about 0.2 U/kg to about 1 U/kg.
  • unit refers to the LD50 dose, defined as the amount of botulinum toxin that killed 50% of mice receiving a botulinum toxin injection. , are used interchangeably within a product.
  • the botulinum toxin may be administered in single or multiple treatment sessions. Dosages may be administered as single or divided injections at the site of injection. In multiple treatment sessions, botulinum toxin may be administered at intervals of up to 6 months. In the multiple treatment session, the administration interval of the botulinum toxin includes the first treatment and the second treatment, and the dose of the second treatment may be less than, more than, or the same as the dose of the first treatment.
  • the dose, administration time, administration method, administration period or interval, etc. of the botulinum toxin may be appropriately selected and used by a person skilled in the art according to the patient's weight, age, sex, health condition, severity of disease, and the like.
  • the botulinum toxin may be administered concurrently or sequentially with the immunotherapeutic agent.
  • the botulinum toxin may be administered with the immunotherapeutic agent as a single agent or as separate agents.
  • the immunotherapeutic agent is an oral formulation such as a solution, suspension, powder, granule, tablet, capsule, pill, extract, emulsion, syrup, aerosol, etc., according to a conventional method for each purpose of use, sterile injection It can be formulated and used in various forms such as parenteral formulations such as solution injections.
  • the immunotherapeutic agent may be administered orally or parenterally via various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, intramuscular, spinal, spinal, or rectal administration or injection.
  • the dosage may vary depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, administration period or interval, excretion rate, constitutional specificity, properties of the preparation, severity of disease, etc. It may be appropriately selected by a person skilled in the art. For example, it may be in the range of about 0.1 to 10,000 mg/kg, but is not limited thereto, and may be administered in divided doses from once to several times a day.
  • a method of treating exosome-mediated cancer may comprise the steps of:
  • the secreted exosomes can be separated and quantified from a biological sample of a subject, for example, blood according to a conventional method known in the art, and there is no particular limitation on the type of sample, separation and quantification method.
  • the subject to which the botulinum toxin or a composition comprising the same is administered may include, without limitation, a human or an animal, for example, a human, a pig, a dog, a cat, a cow, a horse, a rat, and the like.
  • a botulinum toxin or a composition comprising the same may be useful as a cancer treatment agent in combination with an immunotherapeutic agent, for example, an immune checkpoint inhibitor.
  • FIG. 1 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and an anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 1 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and an anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 2A is a graph showing the percentage of total viable cells based on CD4+ T cells infiltrating the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 2A is a graph showing the percentage of total viable cells based on CD4+ T cells infiltrating the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 2B is a graph showing the percentage of total viable cells based on CD8+ T cells infiltrating the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 2B is a graph showing the percentage of total viable cells based on CD8+ T cells infiltrating the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • 2C is a graph showing the actual number of CD4+ T cells in the tumor based on the total viable cells infiltrated into the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 1 is a graph showing the actual number of CD4+ T cells in the tumor based on the total viable cells infiltrated into the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 2D is a graph showing the actual number of CD8+ T cells in the tumor based on the total viable cells infiltrated into the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 2D is a graph showing the actual number of CD8+ T cells in the tumor based on the total viable cells infiltrated into the tumor after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the number of exosomes in the blood of the vehicle group and each test group after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the number of exosomes in the blood of the vehicle group and each test group after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody by dose in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody by dose in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 2.
  • 5 is a graph showing the survival rate of mice after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody by dose in the mouse malignant melanoma transplantation model described in Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of complex botulinum toxin or non-complex botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 3.
  • FIG. 6 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of complex botulinum toxin or non-complex botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma transplant model described in Example 3.
  • FIG. 7 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and anti-CTLA4 antibody in the mouse lung tumor transplantation model described in Example 4.
  • 8A is a graph showing tumor growth in the right side over time after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5;
  • 8B is a graph showing tumor growth in the left side over time after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5;
  • FIG. 9 is a graph showing the survival rate of mice after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • FIG. 10A is a graph showing the percentage of viable cell-based CD11b+ cells infiltrating the left non-administered tumor in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • FIG. 10A is a graph showing the percentage of viable cell-based CD11b+ cells infiltrating the left non-administered tumor in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • 10B is a graph showing the percentage of viable CD4+ T cells infiltrating the left non-administered tumor in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • FIG. 10B is a graph showing the percentage of viable CD4+ T cells infiltrating the left non-administered tumor in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • FIG. 10C is a graph showing the percentage of viable CD8a+ T cells infiltrating the left untreated tumor in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • FIG. 10C is a graph showing the percentage of viable CD8a+ T cells infiltrating the left untreated tumor in the mouse malignant melanoma bilateral transplant model described in Example 5.
  • 11 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody or propranolol and anti-PD-1 antibody co-administration in the mouse colorectal cancer transplantation model described in Example 6.
  • FIG. 12 is a graph showing the survival rate of mice after co-administration of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody or propranolol and anti-PD-1 antibody co-administration in the mouse colorectal cancer transplantation model described in Example 6.
  • FIG. 13 is a graph showing tumor growth over time after co-administration of botulinum toxin and anti-CTLA4 antibody in the mouse colorectal cancer transplantation model described in Example 6.
  • FIG. 14 is a graph showing the survival rate of mice after co-administration of botulinum toxin and anti-CTLA4 antibody in the mouse colorectal cancer transplantation model described in Example 6.
  • Example 1 Anticancer efficacy test of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody against mouse malignant melanoma transplantation model
  • mice Male 6-week-old C57BL/6 (place of purchase: Orient Bio) mice were purchased, acclimatized and quarantined for 1 week, and 7-week-old mice were used for the experiment.
  • For feed sterilized solid feed for laboratory animals (R40-10, SAFE, France) was freely fed, and negative water was fed freely by autoclaving tap water at high temperature.
  • the mouse was set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, illumination time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination intensity of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This experiment was conducted after review and approval (A-2020-004) by the Animal Experimental Ethics Committee of Medytox Co., Ltd.
  • a B16-F10 mouse malignant melanoma cell line (KCLB No: 80008) was obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB).
  • B16-F10 cells were cultured in DMEM medium (CAT No: 11965-092, Gibco) containing 10% FBS (CAT No: 10082-147, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (CAT No: 15140-122, Gibco). °C, 5% CO 2 Conditions were cultured in an incubator. Using a syringe, 0.1 ml of 5 ⁇ 10 5 cells were transplanted into the right flank of anesthetized C57BL/6 mice.
  • sterile physiological saline solution Lit No: M8T7AF3, Daehan Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 100 units Coretox Lit No: NSA19007A, Medytox
  • Anti-PD-1 antibody (Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 760220J1) was purchased from Bio X cell and used.
  • test substance was prepared and administered according to Table 1 below.
  • a 100 units vial of botulinum toxin 6.667 ml of sterile physiological saline was added to prepare a concentration of 15 units/ml, and administered intratumorally at a dose of 1 ml/kg and 15 units/kg.
  • the anti-PD-1 antibody was prepared at a final concentration of 1 mg/ml using sterile PBS (Cat No: 10010, Gibco) on the day of administration, and administered intraperitoneally at a dose of 5 ml/kg and 5 mg/kg.
  • mice On the 8th day after transplantation of mouse malignant melanoma, the body weight and tumor size were measured, and the mice were randomly assigned to each group at an average size of about 33 mm 3 without any difference between the test groups.
  • Vehicle and botulinum toxin were administered intratumorally according to Table 1 based on body weight on day 8 after tumor implantation.
  • Anti-PD-1 antibody was administered intraperitoneally on days 8, 11, 14, and 17 of tumor implantation according to Table 1.
  • Tumor size was measured twice a week after tumor transplantation. The tumor size was measured with a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the following equation using the measurements.
  • Tumor volume (mm3) (W 2 ⁇ L)/2
  • W (mm) width (short axis of tumor)
  • L (mm) length of tumor (long axis of tumor)
  • Tumor growth inhibition (1- Average tumor size test group / Average tumor size vehicle ) ⁇ 100
  • Dosing frequency One 9 * vehicle 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal Once (8 days after tumor transplantation) 2 times a week, 4 times in total 2 10 botulinum toxin 15 units/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 3 10 anti-PD-1 antibody 5 mg/kg intraperitoneal 2 times a week, 4 times in total 4 9 * botulinum toxin + anti-PD-1 antibody 15 units/kg; 5 mg/kg within the tumor, intraperitoneal Once (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total
  • test groups 1 and 4 one animal each was excluded from the experiment because severe wounds around the tumor occurred due to an individual fight.
  • the tumor tissue is separated into single cells using a gentle MACS C tube (Cat No: 130-093-237, Miltenyi Biotec) and then LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain (Cat No: L34957, Invitrogen), Fc block (Cat No: 553142, BD), CD45-PECy7 (Cat No: 25-0451-82, eBioscience), TCRbeta-FITC (Cat No: 109206, Biolegend), CD4-pacific blue (Cat No: 100428, Biolegend) ), stained with CD8a-PerCPCy55 (Cat No: 100734, Biolegend) antibody and analyzed by flow cytometry.
  • MACS C tube Cat No: 130-093-237, Miltenyi Biotec
  • LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Cat No: L34957, Invitrogen
  • Fc block Cat No: 553142, BD
  • CD45-PECy7 Cat No: 25-0451-82, eBioscience
  • the number of CD4+ and CD8+ T cells in the tumor was calculated based on the tumor weight, and the ratio indicated the ratio of CD45 + TCRbeta + CD4 + and CD45 + TCRbeta + CD8a + T cells based on viable cells.
  • Exosomes in blood were isolated using Exoquick exosome precipitation solution (Cat No: EXOQ20A-1, Lot No: 200107-001, System Biosciences), and ExoELISA-ULTRA Complet Kit (Cat No: EXEL-ULTRA-CD63-1, Lot) No: 200226-002, System Biosciences).
  • the measurement results of the tumor growth inhibition rate are shown in Table 2 and FIG. 1 .
  • the results of measuring the number of exosomes in the blood are shown in FIG. 3 .
  • the number of exosomes in the blood showed a tendency to decrease in the botulinum toxin administration group compared to the vehicle treatment group, and significantly decreased in the anti-PD-1 antibody and botulinum toxin + anti-PD-1 antibody administration group.
  • the number of exosomes in the blood was significantly reduced in the group administered with the botulinum toxin and the anti-PD-1 antibody in combination, compared to the group administered with the botulinum toxin and the anti-PD-1 alone.
  • Example 2 Anticancer efficacy test of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody by dose in mouse malignant melanoma transplantation model
  • mice Male 6-week-old C57BL/6 (place of purchase: Orient Bio) mice were purchased, acclimatized and quarantined for 1 week, and 7-week-old mice were used for the experiment.
  • For feed sterilized solid feed for laboratory animals (R40-10, SAFE, France) was freely fed, and negative water was fed freely by autoclaving tap water at high temperature.
  • the mouse was set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, illumination time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination intensity of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This experiment was conducted after review and approval (A-2020-004) by the Animal Experimental Ethics Committee of Medytox Co., Ltd.
  • a B16-F10 mouse malignant melanoma cell line (KCLB No: 80008) was obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB).
  • B16-F10 cells were cultured in DMEM medium (CAT No: 11965-092, Gibco) containing 10% FBS (CAT No: 10082-147, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (CAT No: 15140-122, Gibco). °C, 5% CO 2 Conditions were cultured in an incubator. Using a syringe, 0.1 ml of 5 ⁇ 10 5 cells were transplanted into the right flank of anesthetized C57BL/6 mice.
  • botulinum toxin As a vehicle, only botulinum toxin was excluded from the botulinum toxin product, and the same placebo was used for the rest of the excipient ingredients, and 100 units of botulinum toxin (Lot No: NSA19007A, Medytox) was used.
  • Anti-PD-1 antibody (Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 780120J2) was purchased from Bio X cell and used. Each test substance was prepared and administered according to Table 3 below. Sterile physiological saline was added to 100 units vial of botulinum toxin to prepare concentrations of 1, 3, and 10 units/ml, and administered intratumorally at doses of 1 ml/kg, 1, 3, and 10 units/kg. The anti-PD-1 antibody was prepared at a final concentration of 1 mg/ml using sterile PBS (Cat No: 10010, Gibco) on the day of administration and administered intraperitoneally at a dose of 5 ml/kg and
  • tumor size was measured, and mice were randomly assigned to 12 mice according to the test group without any difference between the test groups.
  • vehicle and botulinum toxin were administered intratumorally according to the composition of the test group.
  • Anti-PD-1 antibody was administered intraperitoneally twice a week for a total of 4 times according to Table 3.
  • Tumor size was measured twice a week after tumor transplantation. The tumor size was measured with a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the equation shown in Example 1 using the measurements.
  • Dosing frequency One 12 vehicle 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 2 12 1 U/kg botulinum toxin 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 3 12 3 U/kg botulinum toxin 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 4 12 10 U/kg botulinum toxin 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 5 12 1 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti-PD-1 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal Once (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 6 12 3 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti-PD-1 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal Once (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 6 12 3 U/kg botulinum toxin + 5 mg
  • Graphpad Prism version 7.05, GraphPad Software Inc, CA, USA
  • SPSS software version 25.0, SPSS Inc, IL, USA
  • Excel version 2013, MS, USA
  • the tumor size measurement results are shown in FIG. 4 ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • FIG. 4 in a mouse malignant melanoma model, when botulinum toxin was administered in a single tumor at a dose of 1, 3, or 10 U/kg, significant tumor growth inhibition was observed in the 10 U/kg administration group on the 14th day.
  • no significant tumor growth inhibitory effect was observed in the test group administered with botulinum toxin alone and the test group administered with vehicle + 5 mg/kg anti-PD1 antibody compared to the vehicle administration group.
  • the test group administered with 3 or 10 U/kg botulinum toxin and 5 mg/kg anti-PD1 antibody a significant tumor growth inhibitory effect was observed compared to the vehicle-administered group.
  • the results of measuring the survival rate are shown in FIG. 5 .
  • the mouse survival rate was significantly increased in the test group in which 3 or 10 U/kg botulinum toxin and 5 mg/kg anti-PD1 antibody were co-administered.
  • a significant increase in survival was also observed in the vehicle + 5 mg/kg anti-PD1 administration group. From the above results, it was confirmed that when co-administered with an anti-PD1 antibody at a dose of 3 U/kg or more of botulinum toxin in a mouse melanoma model, there was a tumor growth inhibitory effect.
  • Example 3 Anti-PD-1 antibody co-administration anticancer efficacy test of complexed botulinum toxin and non-complexed botulinum toxin in mouse malignant melanoma transplantation model
  • mice Male 6-week-old C57BL/6 (place of purchase: Orient Bio) mice were purchased, acclimatized and quarantined for 1 week, and 7-week-old mice were used for the experiment.
  • For feed sterilized solid feed for laboratory animals (R40-10, SAFE, France) was freely fed, and negative water was fed freely by autoclaving tap water at high temperature.
  • the mouse was set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, illumination time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination intensity of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This experiment was conducted after review and approval (A-2020-004) by the Animal Experimental Ethics Committee of Medytox Co., Ltd.
  • a B16-F10 mouse malignant melanoma cell line (KCLB No: 80008) was obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB).
  • B16-F10 cells were cultured in DMEM medium (CAT No: 11965-092, Gibco) containing 10% FBS (CAT No: 10082-147, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (CAT No: 15140-122, Gibco). °C, 5% CO 2 Conditions were cultured in an incubator. Using a syringe, 0.1 ml of 5 ⁇ 10 5 cells were transplanted into the right flank of anesthetized C57BL/6 mice.
  • Sterile physiological saline was added to a vial of 100 units of botulinum toxin to prepare a concentration of 15 units/ml, and administered intratumorally at a dose of 1 ml/kg and 15 units/kg.
  • the anti-PD-1 antibody was prepared at a final concentration of 1 mg/ml using sterile PBS (Cat No: 10010, Gibco) on the day of administration and administered intraperitoneally at a dose of 5 ml/kg and 5 mg/kg.
  • tumor size was measured, and mice were randomly assigned to 12 mice according to the test group without any difference between the test groups.
  • vehicle and botulinum toxin were administered intratumorally according to the composition of the test group.
  • Anti-PD-1 antibody was administered intraperitoneally twice a week for a total of 4 times according to Table 4.
  • Tumor size was measured twice a week after tumor transplantation. The tumor size was measured with a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the equation shown in Example 1 using the measurements.
  • FIG. 6 The results are shown in FIG. 6 ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01). As shown in FIG. 6 , on day 19 after transplantation of mouse malignant melanoma, 15 U/kg of non-complexed botulinum toxin was complexed. Significant tumor growth inhibition was observed when the botulinum toxin was co-administered with 5 mg/kg anti-PD1 antibody. No significant difference was observed between the non-complexed botulinum toxin and the test group in which the complexed botulinum toxin was administered alone.
  • Example 4 Anticancer efficacy test of botulinum toxin and anti-CTLA4 antibody against mouse lung tumor transplantation model
  • mice Male 6-week-old C57BL/6 (place of purchase: Orient Bio) mice were purchased, acclimatized and quarantined for 1 week, and 7-week-old mice were used for the experiment.
  • For feed sterilized solid feed for laboratory animals (R40-10, SAFE, France) was freely fed, and negative water was fed freely by autoclaving tap water at high temperature.
  • the mouse was set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, illumination time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination intensity of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This experiment was conducted after review and approval (A-2020-004) by the Animal Experimental Ethics Committee of Medytox Co., Ltd.
  • LLC1 mouse lung cancer cell line (ATCC No: CRL-1642) was obtained from ATCC. LLC1 cells were cultured in DMEM medium (CAT No: LM001-05, Welgene) containing 10% FBS (CAT No: 10082-147, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (CAT No: 15140-122, Gibco) at 37 °C, It was cultured in an incubator under 5% CO 2 conditions. Using a syringe, 0.1 ml of 5 ⁇ 10 5 cells were transplanted into the right flank of anesthetized C57BL/6 mice.
  • DMEM medium CAT No: LM001-05, Welgene
  • FBS CAT No: 10082-147, Gibco
  • penicillin-streptomycin CAT No: 15140-122, Gibco
  • botulinum toxin As a vehicle, only botulinum toxin was excluded from the botulinum toxin product, and the same placebo was used for the remaining excipient ingredients, and 100 units Coretox (Lot No: NSA19007A, Medytox) was used as the botulinum toxin.
  • Anti-CTLA4 antibody (Clone: 9H10, Cat No: BE0131, Lot No: 704019A2) was purchased from Bio X cell and used. Each test substance was prepared and administered according to Table 5 below. Sterile physiological saline was added to a 100 units vial of botulinum toxin to prepare a concentration of 15 units/ml, and administered intratumorally at a dose of 1 ml/kg and 15 units/kg.
  • the anti-CTLA4 antibody was prepared at a final concentration of 1 mg/ml using sterile PBS (Cat No: 10010, Gibco) on the day of administration, and administered intraperitoneally at a dose of 5 ml/kg and 5 mg/kg.
  • the tumor size was measured on the 8th day after transplantation of the mouse LLC1 lung tumor cell line, and 10 mice were randomly assigned to each group according to the test group so that there was no difference between the test groups.
  • vehicle and botulinum toxin were administered intratumorally according to the composition of the test group.
  • Anti-CTLA4 antibody was administered intraperitoneally twice a week for a total of 4 times according to Table 5.
  • Tumor size was measured twice a week after tumor transplantation. The tumor size was measured with a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the equation shown in Example 1 using the measurements.
  • Dosing frequency One 10 vehicle 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 2 10 15 U/kg botulinum toxin 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 3 10 15 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti-CTLA4 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 4 10 vehicle + 5 mg/kg anti-CTLA4 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total
  • the 15 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti-CTLA4 administration group was significantly compared to the test group administered with 15 U/kg botulinum toxin alone and the vehicle + 5 mg/kg anti-CTLA4 antibody alone administration group The tumor volume was reduced. From the above results, it was confirmed that the tumor growth inhibitory effect by the co-administration of botulinum toxin and anti-CTLA4 antibody in the mouse LLC1 lung tumor model.
  • Example 5 Anticancer efficacy test of botulinum toxin and anti-PD-1 antibody against both mouse malignant melanoma transplantation model
  • mice Male 6-week-old C57BL/6 (place of purchase: Orient Bio) mice were purchased, acclimatized and quarantined for 1 week, and 7-week-old mice were used for the experiment.
  • sterilized solid feed for laboratory animals R40-10, SAFE, France
  • negative water was fed freely by autoclaving tap water at high temperature.
  • the mouse was set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, illumination time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination intensity of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This experiment was conducted after review and approval (A-2020-004) by the Animal Experimental Ethics Committee of Medytox Co., Ltd.
  • a B16-F10 mouse malignant melanoma cell line (KCLB No: 80008) was obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB).
  • B16-F10 cells were cultured in DMEM medium (CAT No: 11965-092, Gibco) containing 10% FBS (CAT No: 10082-147, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (CAT No: 15140-122, Gibco). °C, 5% CO 2 Conditions were cultured in an incubator.
  • 0.1 mL of 5 x 10 5 cells were transplanted into the right flank of anesthetized C57BL/6 mice using a syringe, and 5 days later, 0.1 mL of 2 ⁇ 2.5 x 10 5 cells were transplanted into the left flank of an anesthetized C57BL/6 mouse using a syringe.
  • botulinum toxin As a vehicle, only botulinum toxin was excluded from the botulinum toxin product, and the same placebo was used for the rest of the excipient ingredients, and 100 units of botulinum toxin Coretox (Lot No: NSA20015, Medytox) was used.
  • Anti-PD-1 antibody (Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 780120J3 or 798921J1C) was purchased from Bio X cell and used. Each test substance was prepared and administered according to Table 6 below.
  • Sterile physiological saline was added to a vial of 100 units of botulinum toxin to a concentration of 15 units/mL, and administered intratumorally at a dose of 1 mL/kg and 15 units/kg.
  • the anti-PD-1 antibody was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg/kg using PBS (Cat No: LB004-02, Welgene).
  • the tumor size was measured on the 8th day after transplantation of malignant melanoma in the right flank, and 12 mice were randomly assigned to each group according to the test group without any difference between the test groups.
  • vehicle and botulinum toxin were administered into the tumor of the right flank according to the composition of the test group.
  • Anti-PD-1 antibody was intraperitoneally administered twice a week for a total of 4 times according to the composition of the test group.
  • the size of the transplanted tumor on the right and left sides was measured twice a week.
  • the tumor size was measured with a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the equation shown in Example 1 using the measurements.
  • Dosing frequency One 12 vehicle 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 2 12 15 U/kg botulinum toxin 1 ml/kg within the tumor Once (8 days after tumor transplantation) 3 12 vehicle + 5 mg/kg anti-PD-1 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 4 12 15 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti-PD-1 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (8 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total
  • Immune cell analysis in the tumor tissue is performed by separating the tumor tissue into single cells using a gentle MACS C tube (Cat No: 130-093-237, Miltenyi Biotec) and then using LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain (Cat No: L34957, Invitrogen), Fc block (Cat No: 553142, BD), CD45-PE-Cy7 (Cat No: 25-0451-82, eBioscience), TCRbeta-APC-eFluor780 (Cat No: 47-5961-82, Invitrogen), CD4-pacific Blue (Cat No: 100428, Biolegend), CD8a-PerCP-Cy55 (Cat No: 100734, Biolegend), and CD11b-A647 (Cat No: 101218, Biolegend) antibodies were stained and analyzed by flow cytometry.
  • the ratio of CD4+ and CD8a+ T cells and CD11b+ cells in the tumor represents the ratio of CD45 + TCRbeta + CD4 + , CD45 + TCRbeta + CD8a + , and CD45 + CD11b + cells based on viable cells.
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  • Excel version 2013, MS, USA
  • the tumor growth of the right and left sides over time was shown in terms of tumor volume (mm 3 ) as shown in FIGS. 8A and 8B ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • the size of the right tumor compared to the vehicle A significant decrease was observed, and a significant decrease was observed compared to the test group in which the botulinum toxin and the anti-PD-1 antibody were administered alone ( FIG. 8A ).
  • the size of the left tumor was significantly reduced in the test group in which botulinum toxin and anti-PD-1 antibody were co-administered compared to the vehicle-administered group ( FIG. 8b ).
  • Table 7 shows the presence or absence of left tumor formation ( * p ⁇ 0.05 vs G3 anti-PD-1 antibody)
  • the formation rate of the left tumor was significantly decreased in the group administered with the botulinum toxin and the anti-PD-1 antibody in combination compared to the group administered with the anti-PD-1 antibody alone.
  • the ratio of viable cell-based CD11b+ cells and CD4+ and CD8a+ T cells infiltrating the left untreated tumor was calculated using a two-tailed t -test (* p ⁇ 0.05).
  • a significant decrease was observed in the ratio of CD11b+ cells in the botulinum toxin and anti-PD1 antibody combination group compared to the vehicle administration group ( 10a)
  • CD4+ T cells were significantly increased compared to the anti-PD-1 antibody alone group ( FIG. 10b )
  • the ratio of CD8a+ T cells was vehicle and botulinum toxin in the botulinum toxin and anti-PD-1 antibody combination group It was significantly increased compared to the single administration group (FIG. 10c).
  • Example 6 Co-administration anticancer efficacy test of botulinum toxin and immunotherapy (anti-PD-1 and anti-CTLA4) in mouse colon cancer transplantation model
  • mice Female 6-week-old C57BL/6 (purchased from: Orient Bio) mice were purchased, acclimatized and quarantined for 1 week, and 7-week-old mice were used for the experiment.
  • For feed sterilized solid feed for laboratory animals (R40-10, SAFE, France) was freely fed, and negative water was fed freely by autoclaving tap water at high temperature.
  • the mouse was set at a temperature of 23 ⁇ 3 °C, relative humidity of 55 ⁇ 15%, illumination time of 12 hours (8:00 am to 8:00 pm), ventilation frequency of 15 times/hour, and illumination intensity of 150 to 300 Lux. Raised under specific-pathogen-free conditions. This experiment was conducted after review and approval (A-2020-004) by the Animal Experimental Ethics Committee of Medytox Co., Ltd.
  • the mouse colorectal cancer MC38 cell line (ENH204-FP) was obtained from Kerafast.
  • the MC38 cell line was treated with 10% FBS (CAT No: 10082-147, Gibco) and 1% penicillin-streptomycin (CAT No: 15140-122, Gibco), 10 mM HEPES (CAT No: 15630-080, Gibco), 0.1 mM In DMEM medium (CAT No: 11965-092, Gibco) containing MEM NEAA (CAT No: 11140-050, Gibco), 1 mM sodium pyruvate (CAT No: 11360-070, Gibco) at 37 °C, 5% It was cultured in an incubator under CO 2 conditions. Using a syringe, 0.1 mL of 2.5 ⁇ 10 5 cells were transplanted into the right flank of anesthetized C57BL/6 mice.
  • botulinum toxin As a vehicle, only botulinum toxin was excluded from the botulinum toxin product, and the same placebo was used for the rest of the excipient ingredients, and 100 units of botulinum toxin (Lot No: NSA20015, Medytox) was used.
  • Anti-PD-1 antibody (Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 798921J1C)
  • anti-CTLA4 antibody (Clone: 9H10, Cat No: BE0131, Lot No: 755620A2) were purchased from Bio X cell was used. Each test substance was prepared and administered according to Table 6 below.
  • Sterile physiological saline was added to a 100-unit vial of botulinum toxin to prepare a concentration of 15 units/mL, and administered intratumorally at a dose of 1 mL/kg and 15 units/kg.
  • Anti-PD-1 and anti-CTLA4 antibodies were administered intraperitoneally at a dose of 5 mg/kg using PBS (Cat No: LB004-02, Welgene).
  • Propranolol (Cat No: P0884, Sigma) was prepared at 2 mg/mL using PBS and administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg.
  • the tumor size was measured on the 7th day after transplantation of the mouse colon cancer cell line, and the mice were randomly assigned to each test group by 10 mice without any difference between the test groups. On the 7th day after tumor transplantation, vehicle and botulinum toxin were administered intratumorally according to the composition of the test group.
  • vehicle and botulinum toxin were administered intratumorally according to the composition of the test group.
  • anti-PD-1 and anti-CTLA4 antibodies according to Table 8 2 times a week were administered intraperitoneally for a total of 4 times, and propranolol was intraperitoneally administered a total of 8 times between 7 and 16 days after tumor transplantation, and a week after tumor transplantation.
  • Tumor size was measured twice. The tumor size was measured with a vernier caliper and the tumor volume was calculated using the equation shown in Example 1 using the measurements.
  • Dosing frequency One 10 vehicle 1 ml/kg within the tumor Once (7 days after tumor transplantation) 2 10 15 U/kg botulinum toxin 1 ml/kg within the tumor Once (7 days after tumor transplantation) 3 10 vehicle + 5 mg/kg anti-PD-1 antibody 1 mL/kg, 5 mL/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (7 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 4 10 vehicle + 5 mg/kg anti-CTLA4 antibody 1 mL/kg, 5 mL/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (7 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 5 10 15 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti-PD-1 antibody 1 ml/kg, 5 ml/kg within the tumor, intraperitoneal 1 time (7 days after tumor transplantation), 2 times a week, 4 times in total 6 10 15 U/kg botulinum toxin + 5 mg/kg anti
  • FIG. 11 and 13 show tumor growth over time in terms of tumor volume (mm 3 ) (FIG. 11: ** p ⁇ 0.01 vs vehicle, FIG. 13: ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs vehicle).
  • FIG. 11 ** p ⁇ 0.01 vs vehicle
  • FIG. 13 ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs vehicle.
  • significant tumor growth inhibition was observed in the group administered with 15 U/kg botulinum toxin and 5 mg/kg anti-PD-1 antibody compared to the group administered with vehicle, botulinum toxin, and anti-PD-1 alone ( Fig. 11).
  • FIG. 12 and 14 show the survival rate of mice (FIG. 12: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 vs vehicle, a p ⁇ 0.05 vs anti-PD-1, FIG. 14: *** p ⁇ 0.001 vs. Vehicle, a p ⁇ 0.05 vs anti-CTLA4)
  • the mouse survival rate was significantly increased compared to the group administered with vehicle and anti-PD-1 antibody alone, and 10 mg/kg propranolol
  • the survival rate was significantly increased compared to the vehicle and the anti-PD-1 antibody alone group.

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Abstract

면역요법제, 예를 들어 면역관문 억제제와 병용하는 암 치료제가 개시된다.

Description

암 치료제
본 개시는 암 치료제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유효성분으로 보툴리눔 독소를 포함하는, 면역요법제와 병용하는 암 치료제에 관한 것이다.
보툴리눔 독소(Botulinum neurotoxin, BoNT)는 혐기성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 폴리펩티드 생성물로서, 신경세포에 특이적으로 작용하는 독성물질이다. 보툴리눔 독소는 본래 치사를 일으키는 독성 물질이지만, 연축성 사경(cervical dystonia: CD), 안검경련(blepharospasm), 다한증(hyperhidrosis), 사시(strabismus), 이완불능(achalasia), 신경성 방광(neurogenic bladder), 비뇨기 질환(urologic disease), 편두통(migraine) 등의 치료를 위해 사용되고 있다.
국제공개 WO2010/062955호는 신생물 근처의 비-신생성 부위(nonneoplastic area)에 치료 유효량의 보툴리눔 독소를 항암 약물이나 항암 요법과 병용 투여하되, 치료 유효량의 보툴리눔 독소가 신생물을 투과(penetrate)하지 않는, 신생물의 성장이나 전이를 저해하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 국제공개 WO2006/094539호는 보툴리눔 독소를 포함하는 제약 조성물을 암 조직 또는 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법 또는 방사선 요법과 같은 세포독성 요법에 의한 암 치료를 감작시키는(sensitizing) 방법 및 이를 위한 조성물을 개시하고 있다.
항암 면역요법(immunotherapy)은 인체의 면역체계를 활성화시켜 자가면역력을 높여 면역세포가 암세포를 공격하도록 하는 치료법이다. 면역요법제는 크게 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)와 면역세포 치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody), 항암 백신(anticancer vaccine), 항암 바이러스(oncolytic virus)로 분류할 수 있다. 면역관문 억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)의 활성을 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서, 대표적으로 CTLA-4, PD-1, PD-L1을 인식하는 항체를 사용한다. 면역세포 치료제는 환자 체내의 T 세포를 채취하여 강화 및 변형시켜 다시 체내에 주입하여 암세포에 대한 세포성 면역을 강화시키는 약제로 NK 세포치료제, T 세포치료제, CAR-T 세포치료제 등이 있다. 치료용 항체는 항체-약물 결합체가 암세포에 결합하면 약물이 유리되어 암세포를 공격하는 약제로서 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)를 대표적인 예로 들 수 있다. 항암 백신은 암세포가 갖고 있는 종양특이적 항원 또는 체내 전반적인 면역반응을 향상시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드 분자를 암환자에게 투여하여 면역체계를 활성화시킴으로써 체내 면역기능이 활발하게 만들어 암세포를 공격하도록 하는 것이다. 항암 바이러스는 암을 공격하는 바이러스로 직접 암세포를 사멸시키는 작용을 하지만 이에 더하여 면역세포의 활성화를 유도하여 항암 능력을 증강시킨다.
지금까지 보툴리눔 독소를 면역요법제와 병용하여 암을 치료하려는 시도는 알려져 있지 않았다.
본 개시의 제1 목적은 유효성분으로 보툴리눔 독소를 포함하는, 면역요법제와 병용하여 암을 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시의 제2 목적은 치료 유효량의 보툴리눔 독소를 면역요법제와 병용하여 이를 필요로 하는 대상에게 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 제3 목적은 면역요법제와 병용하여 암 치료제로 사용하기 위한 보툴리눔 독소를 제공하는 것이다.
본 개시의 제4 목적은 보툴리눔 독소의 면역요법제와 병용하는 암 치료제로서의 사용에 관한 것이다.
본 개시의 제1 측면은 유효성분으로 보툴리눔 독소를 포함하는, 면역요법제와 병용하여 암을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 제2 측면은 치료 유효량의 보툴리눔 독소를 면역요법제와 병용하여 이를 필요로 하는 대상에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 제3 측면은 면역요법제와 병용하여 암 치료제로 사용하기 위한 보툴리눔 독소에 관한 것이다.
본 개시의 제4 측면은 보툴리눔 독소의 면역요법제와 병용하는 암 치료제로서의 사용에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 '보툴리눔　독소(botulinum toxin)'는 모든 혈청형(serotype) 및 이것의 변이체 또는 융합 단백질을 포함하여 세균 또는 재조합에 의해 생성되는 보툴리눔　독소　단백질 분자를 의미한다.
클로스트리디움 보툴리눔　균주는 면역학적으로 구별되는 신경독소(타입 A-G)를 생산한다. 타입 A-G 신경독소(NTX)의 분자량(molecular masses)은 약 150 kDa(7S)이다. 산성 조건을 갖는 배양 배지 및 식품에서, NTX는 비독성 성분과 결합하여 PTX(progenitor toxins)라고 불리는 큰 복합체를 형성한다. 900kDa(19S), 500kDa(16S) 및 300kDa(12S)의 분자량을 갖는 PTX가 발견된다. 12S 독소는 NTX와 헤마글루티닌 활성을 갖지 않는 비독성 성분(nontoxic nonhemagglutinin; NTNH로 명명)으로 이루어지며, 19S 및 16S 독소는 NTX, NTNH 및 헤마글루티닌으로 이루어진다. 타입 A 균주는 3가지 형태의 독소(19S, 16S 및 12S)를 생산한다. 타입 B, C 및 D 균주는 16S와 12S 독소를 생산한다. 알칼리 조건에서, PTX는 NTX와 비독성 성분으로 해리되고, 19S 및 16S 독소는 NTX와 NTNH 및 헤마글루티닌의 비독성 성분(복합체)으로 해리되며, 12S 독소는 NTX와 NTNH로 해리된다. 본 명세서에서, 보툴리눔 독소는 상기한 어떠한 형태의 것일 수도 있으며, 예를 들어 19S, 16S, 12S, 또는 7S의 분자량을 갖는 것일 수 있다.
보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 유도체를 포함한다. 보툴리눔　독소 　유도체는　보툴리눔　독소　활성을 갖는 천연　보툴리눔　독소　또는 재조합 원형(recombinant native)　보툴리눔　독소의 일부 또는 일부 사슬 상에 하나 이상의 화학적 또는 기능적 변형을 포함하는 유도체일 수 있다. 예를 들어,　보툴리눔 독소　유도체는 결실, 변형 또는 치환된 하나 이상의 아미노산을 갖는 변형된　독소일 수 있다. 보툴리눔　독소는 재조합 펩티드, 융합 단백질, 또는 예를 들어, 상이한　독소　혈청형의 서브유닛 또는 도메인으로부터 제조된 하이브리드 신경독소일 수 있다.　보툴리눔　독소는 또한　독소　활성을 갖는 전체 분자의 일부일 수 있으며, 이것의 조합 또는 컨쥬게이션된 분자, 예를 들어, 융합 단백질의 일부로서 이용될 수 있다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소는 화학적 또는 기능적 변형을 포함하지 않는 보툴리눔 독소, 예를 들어 천연　보툴리눔　독소　또는 재조합 원형　보툴리눔　독소 또는 그의 일부, 예를 들어 복합체화된 보툴리눔 독소(예: 19S 독소) 또는 비-복합체화된 보툴리눔 독소(예: 7S 독소)일 수 있다.
용어 '면역요법제'는 암세포에 대한 신체의 면역 반응을 간접적으로 또는 직접적으로 증강, 자극 또는 증가시키고/거나 다른 항암 요법의 부작용을 감소시키는 화합물, 조성물 또는 치료를 의미한다. 면역요법제의 비제한적인 예는 사이토카인, 암 백신, 단일클론 항체, 비사이토카인 보조제, 항암 바이러스, 면역 세포(T 세포, NK 세포, 수지상 세포, B 세포 등), 면역관문 억제제 등을 포함한다.
용어 '병용'은 사전에 투여된 치료제가 체내에서 여전히 유효한 동안 제2 치료제가 투여되도록 하는 2종 이상의 상이한 치료제의 임의의 형태를 가리킨다. 예를 들어, 2종의 치료제는 대상에서 동시에 유효하며, 이는 2종의 치료제의 상승 효과를 포함할 수 있다. 상이한 치료제는 단일의 제제 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
'투여' 또는 '투여하는 것'은 제약 조성물 또는 유효성분을 대상에게 제공하는 단계를 의미한다. 제약 조성물은 다양한 적절한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
'제약 조성물'은 유효성분을 함유하는 제제를 의미한다. '제제'라는 용어는　유효성분(예: 보툴리눔 독소) 이외에 적어도 1종의 추가적인 성분, 예를 들면 알부민(인간 혈청 알부민 또는 재조합 인간 알부민) 및/또는 소듐 클로라이드가 제약 조성물 중에 존재한다는 것을 의미한다. 제약 조성물은 인간 환자와 같은 대상에의 투여에 적합한 제제이다. 제약 조성물은 동결건조된 형태, 예를 들면 식염수 또는 물을 사용한 동결건조된 제약 조성물의 재구성 후 형성되는 용액, 또는 재구성을 필요로 하지 않는 용액 형태일 수 있다. 제약 조성물은 액체 또는 고체일 수 있다. 제약 조성물에는 동물 유래 단백질 및/또는 알부민이 없을 수 있다.
'치료 유효량'은 유의성 있는 부정적이거나 불리한 부작용을 야기하지 않으면서 질환, 장애 또는 이상을 치료하는 데에 요구되는 작용제, 예를 들어 보툴리눔　독소 또는　보툴리눔　독소를 포함하는 제약 조성물의 수준, 양 또는 농도를 의미한다.
'치료하다', '치료하는 것' 또는 '치료'는 예를 들어 상처를 입거나 손상된 조직의 치유, 또는 기존의 것이거나 인지된 질환, 장애 또는 이상을 변경, 변화, 강화, 개선, 개량 및/또는 미화하는 것에 의해, 원하는 치료상의 결과를 달성하도록 하는, 질환, 장애 또는 이상의 경감 또는 감소(일부 감소, 상당한 감소, 거의 완전한 감소 및 완전한 감소 포함), 해결 또는　예방(일시적이거나 영구적인 것)을 의미한다. 본 명세서에서, '치료'는 예방을 포함하는 개념이다. '예방'은 질병, 장애 또는 질환의 발병의 지연을 의미한다. 질병, 장애 또는 질환의 발병이 예정된 기간 동안 지연된 경우 예방은 완전한 것으로 간주될 수 있다.
일 태양에서, '치료(treatment)'는, 하기 중 하나 이상을 포함하는, 포유동물 (특히, 인간)과 같은 환자에서, 질환, 장애, 또는 의학적 병태의 치료를 의미한다:
(a) 상기 질환, 장애, 또는 의학적 병태의 발생 방지, 즉 상기 질환 또는 의학적 병태의 재발 방지 또는 상기 질환 또는 의학적 병태에 걸리기 쉬운 (pre-disposed) 환자의 예방적 치료(prophylactic　treatment);
(b) 다른 치료제의 효과에 길항 작용을 하는 것을 포함하여, 상기 질환, 장애, 또는 의학적 병태의 개선(ameliorating), 즉 환자에서 상기 질환, 장애, 또는 의학적 병태를 제거 또는 퇴행(regression);
(c) 상기 질환, 장애, 또는 의학적 병태의 억제(suppressing), 즉 환자에서 상기 질환, 장애, 또는 의학적 병태의 발전을 둔화 또는 저지; 또는
(d) 환자에서 상기 질환, 장애, 또는 의학적 병태의 증상 완화.
본 개시는 보툴리눔 독소 또는 이를 포함하는 조성물이 면역요법제와 병용하여 암의 치료제로 유용할 수 있음을 발견한 것에 기초한 것이다.
본 개시는 보툴리눔 독소 또는 이를 포함하는 조성물이 면역요법제와 병용하여 전이성 암의 치료제로 유용할 수 있음을 발견한 것에 기초한 것이다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소는 혈청형에 제한 없이 사용 가능하며, 타입 A(BoNT/A), B(BoNT/B), C(BoNT/C), D(BoNT/D), E(BoNT/E), F(BoNT/F), G(BoNT/G), H(BoNT/H), X(BoNT/X), 엔테로코커스 종 보툴리눔 독소 J(eBoNT/J) 및 모자이크　보툴리눔 독소 및/또는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.　모자이크　독소의 예는 BoNT/DC, BoNT/CD 및 BoNT/FA를 포함한다. 예를 들어 타입 A를 사용할 수 있다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소는 다양한 BoNT/A 서브타입, 예를 들어 A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A9, A10; BoNT/B 서브타입, 예를 들어 B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, Bnp 및 Bbv; BoNT/C 서브타입, 예를 들어 C 및 CD; BoNT/D 서브타입, 예를 들어 D 및 DC; BoNT/E 서브타입, 예를 들어 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9; BoNT/F 서브타입, 예를 들어 F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7; 및 BoNT/G 서브타입, 예를 들어 서브타입 G로부터 유래된다. BoNT 서브타입은 키메라 BoNT, 예를 들어 BoNT/DC, BoNT/CD, BoNT/FA 등을 포함한다.
일 태양에서, 면역요법제는 당업계에 알려져 있는 어떠한 물질이나 요법도 사용 가능하며, 사이토카인, 암 백신, 항암 바이러스(oncolytic virus), 단일클론 항체, 비사이토카인 보조제, 면역 세포(T 세포, NK 세포, 수지상 세포, B 세포 등), 면역관문 억제제를 포함할 수 있다. 구체예에서, 면역요법제는 면역관문 억제제이다. 면역관문 억제제는 펩티드, 항체, 핵산 분자 및 소형 분자를 포함한다. 예를 들어, 면역관문 억제제는 대상에서 CD8+ T 세포의 증식성, 이동성, 지속성 및/또는 세포독성 활성, 및 특히 대상의 CD8+ T 세포의 종양 침윤성을 증강시키기 위해 투여될 수 있다. 전형적으로, 면역관문 억제제는 활성화된 T 림프구, 예를 들어 세포독성 T 림프구-연관 단백질 4(CTLA4) 및 프로그램된 세포사멸 1(PD-1), 또는 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 패밀리의 다양한 구성원과 같은, NK 세포에 의해 발현되는 면역억제성 수용체를 차단하는 길항제이거나, 이들 수용체의 주요 리간드, 예를 들어 PD-1 리간드 CD274(PD-L1 또는 B7-H1로 가장 잘 알려짐)를 차단하는 길항제이다. 예를 들어, 면역관문 억제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 구체적으로, 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM-3 항체, 항-LAG3 항체, 항-IDO1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-BTLA 항체, 및 항-B7H6 항체, 및 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 면역관문　억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)(여보이®, BMS/오노), 트레멜리무맙(Tremelimumab)(아스트라제네카), 아테졸리주맙(atezolizumab)(티쎈트릭®, 로슈), 니볼루맙(nivolumab)(옵디보®, BMS/오노), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab)(키트루다®, MSD), 아벨루맙(Avelumab)(바벤시오®, 화이자/독일
머크), 더발루맙(Durvalumab)(임핀지®, 아스트라제네카/메드이뮨), 및 이의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 태양에서, 암은 엑소좀-매개된(exosome-mediated) 것일 수 있다.
엑소좀(exosomes)은 세포외 소낭(extracellular vesicles)의 일종으로, 대략 직경 100 ㎚의 크기를 갖는다. 이들은 지질 이중막으로 둘러싸여 있으며 대부분의 세포로부터 분비된다. 엑소좀은 엔도사이틱 시스템(endocytic system) 내에서 ILV(intraluminal membrane vesicle)로 생성되며 세포막과 MVB(multivesicular body)의 융합 동안 분비된다. 엑소좀이 세포-세포 소통(cell-cell communication)을 조절하여 조직 항상성(homeostasis) 유지에 기여하는 것으로 보고된 바 있다. 암 세포로부터 방출된 엑소좀은 암 진행에 관여한다. 증식성 암 세포는 (1) 혈관신생을 이용한 암 조직의 확장, (2) 이동 및 침투 능력 획득, 및 (3) 면역 세포로부터의 공격을 회피하는 능력 획득, 및 궁극적으로 전이성 병변(metastatic lesion)의 형성을 나타내며, 엑소좀은 이들 과정의 각각에 관여할 수 있다.
일 태양에서, 암은 고형암(solid tumor)일 수 있다.
고형암의 비제한적인 예들은 유방암, 폐암, 두부 또는 경부암, 대장암, 식도암, 후두암, 위암, 간암, 췌장암, 골암, 피부암, 피부 또는 안구내　흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌종양, 예를 들어 신경교종(예: 성상 세포종(astrocytoma), 교모세포종(glioblastoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 상의세포종(ependymoma), 배아세포종, 수막종, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종, 신경초종, 선천성종양, 두개인두종, 전이성 뇌종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고형암은 흑색종, 대장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 방광암, 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 태양에서, 암은 전이성 암(metastatic cancer)일 수 있다.
일 태양에서, 조성물은 엑소좀 분비가 증가된 대상에서 사용할 수 있다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 안정화제, 이온 화합물(ionic compound), 계면활성제, 완충제, 동결건조 보호제, 또는 이들의 조합, 예를 들어 아미노산(예를 들어 메티오닌), 염(예를 들어 NaCl), 완충액, 비이온성 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20), 당(예를 들어 백당 등과 같은 다이사카라이드), 당 알코올(예를 들어 소르비톨), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 조성물은 알부민 또는 동물 유래 성분이나 폴리사카라이드를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 조성물은 예를 들어 WO2009-008595 A1 또는 WO2012-134240 A2에 개시되어 있는 것들을 포함하며, 상기 특허의 내용은 그 전체로 본 명세서에서 참조로 인용된다.
상기 조성물은 상업적으로 입수가능한　보툴리눔　독소　함유 제약 조성물을 제한 없이 포함하며, 예를 들어 보톡스(BOTOX)®(인간 혈청 알부민 및 염화나트륨과의　보툴리눔　독소　타입 A 신경독소　복합체)(알러간, 인코포레이티드(Allergan, Inc: 미국 캘리포니아주 얼바인)), 디스포트(DYSPORT)®(사용 전 0.9% 염화나트륨으로 재구성되는 분제로서, 제제 중 인간 혈청 알부민 및 락토스와의 클로스트리디움　보툴리눔　타입 A　독소　헤마글루티닌 복합체)(입센 리미티드 (Ipsen Limited: 영국 버크셔)), 미오블록(MYOBLOC)™(보툴리눔　독소　타입 B, 인간 혈청 알부민, 숙신산 나트륨, 및 염화나트륨을 포함하는 주사액(약 pH 56))(솔스티스 뉴로사이언시즈, 인크.(Solstice Neurosciences, Inc: 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)), 메디톡신®(클로스트리디움 보툴리눔독소 A형, 사람혈청알부민 및 염화나트륨을 포함하는 동결건조 분말 제제)(㈜메디톡스, 한국), 이노톡스®(클로스트리디움 보툴리눔독소　A형, L-메티오닌, 폴리소르베이트20　, 염화나트륨　및 주사용수를 포함하는 액상 제제)(㈜메디톡스, 한국), 코어톡스®(클로스트리디움 보툴리눔독소 A형(150kD), 폴리소르베이 트20, 백당 및 염화나트륨을 포함하는 동결건조 분말 제제)(㈜메디톡스, 한국)를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 조성물은 메디톡신®, 이노톡스®, 코어톡스® 또는 이들의 하나 이상의 조합일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 태양에서, 상기 조성물은 고체 또는 액체 제제, 예를 들어 동결건조 분말, 액상, 또는 프리필드 시린지(pre-filled syringe) 제제 등 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다.
일 태양에서, 상기 조성물은 국소로(local) 투여하기 위한 제제일 수 있다. 예를 들어, 국소 투여는 종양 또는 전암성 조직 내 투여 또는 종양 또는 전암성 조직 주변 투여일 수 있으며, 전형적으로 보툴리눔　독소 수용액의 종양 내 주사(intratumoral injection) 또는 종양 주변 주사(peritumoral injection)에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제제는 피하 또는 연부조직, 예를 들어 근육 내로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 특정 위치의 종양 내 또는 주변 투여에 의해 상기 위치로부터 떨어진 위치에서 종양 성장을 억제하거나 종양 발생을 저지할 수 있는바, 상기 조성물은 국소 투여로 전신적인 효과를 나타낼 수 있다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소의 치료 유효량은 약 0.01 U/㎏ 내지 약 100 U/㎏, 약 0.1 U/㎏ 내지 약 100 U/㎏, 약 0.2 U/㎏ 내지 약 100 U/㎏, 약 0.2 U/㎏ 내지 약 50 U/㎏, 약 0.2 U/㎏ 내지 약 30 U/㎏, 약 0.2 U/㎏ 내지 약 10 U/㎏, 약 0.2 U/㎏ 내지 약 1 U/㎏이다. 다른 태양에서, 체중 60 ㎏ 성인 기준으로 약 1 U 내지 약 10,000 U, 약 1 U 내지 약 5,000 U, 약 1 U 내지 약 2,500 U, 약 1 U 내지 약 1,000 U, 약 1 U 내지 약 500 U, 약 1 U 내지 약 300 U, 약 1 U 내지 약 200 U, 약 10 U 내지 약 200 U, 약 10 U 내지 약 100 U, 약 10 U 내지 약 50 U일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "유닛", "unit(s)", 또는 "U"라는 용어는 보툴리눔 독소 주사를 맞은 마우스 중 50%를 사멸시킨 보툴리눔 독소의 양으로서 정의되는, LD50 용량을 지칭하는 것으로, 한 제품 내에서 호환 가능하게 사용된다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소는 단회 또는 다회 치료 세션으로 투여될 수 있다. 투여량은 주사 부위에 단일 또는 분할 주입으로 투여될 수 있다. 다회 치료 세션에서 보툴리눔 독소는 6개월 이하의 간격으로 투여할 수 있다. 다회 치료 세션에서 보툴리눔 독소의 투여간격은 1차 치료와 2차 치료를 포함하며, 2차 치료의 투여량은 1차 치료의 투여량보다 적거나, 많거나 또는 동일할 수 있다.
보툴리눔 독소의 투여 용량, 투여 시간, 투여 방법, 투여 기간 또는 간격 등은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 질환의 중증도 등에 따라 통상의 기술자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소는 면역요법제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일 태양에서, 보툴리눔 독소는 면역요법제와 단일의 제제 또는 별개의 제제로 투여될 수 있다.
일 태양에서, 면역요법제는 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등의 비경구 제형과 같이 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 면역요법제는 경구 투여되거나,　정맥　내, 복강 내, 피하, 피내, 근육 내, 척추, 척추강 또는 직장 내 국소 투여 또는 주입 등을 포함한 다양한 경로를 통해 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 투여 기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질, 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 약 0.1 내지 10,000 ㎎/㎏의 범위일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수 회에 나누어 투여될 수 있다.
일 태양에서, 엑소좀-매개된 암을 치료하는 방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있다:
1) 대상으로부터 수득된 생물학적 시료에서 분비된 엑소좀을 정량하는 단계; 및,
2) 엑소좀 분비가 증가된 대상에게 치료 유효량의 보툴리눔 독소를 면역요법제와 단일의 제제 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차적으로 병용하여 투여하는 단계.
분비된 엑소좀은 당업계에 알려져 있는 통상적인 방법에 따라, 대상의 생물학적 시료, 예를 들어 혈액으로부터 분리하여 정량할 수 있으며, 시료의 종류, 분리 및 정량 방법에 특별한 제한이 있는 것은 아니다.
보툴리눔 독소 또는 이를 포함하는 조성물이 투여되는 대상은 인간이나 동물, 예를 들어 인간, 돼지, 개, 고양이, 소, 말, 쥐 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 개시에 따르면, 보툴리눔 독소 또는 이를 포함하는 조성물은 면역요법제, 예를 들어 면역관문 억제제와 병용하여 암 치료제로 유용할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 경시적인 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 2a는 실시예 1에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 종양에 침윤된 총 생존 세포 기준 CD4+ T 세포의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 2b는 실시예 1에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 종양에 침윤된 총 생존 세포 기준 CD8+ T 세포의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 2c는 실시예 1에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 종양에 침윤된 총 생존 세포 기준 실제 종양 내 CD4+ T 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 2d는 실시예 1에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 종양에 침윤된 총 생존 세포 기준 실제 종양내 CD8+ T 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 3은 실시예 1에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 비히클군과 각 시험군의 혈액 내 엑소좀 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 용량별 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 경시적인 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 5는 실시예 2에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 용량별 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 6은 실시예 3에 기재된 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 복합체 보툴리눔 독소, 또는 비-복합체 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 경시적인 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 7은 실시예 4에 기재된 마우스 폐종양 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 항체 병용 투여 후 경시적인 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 8a는 실시예 5에 기재된 마우스 악성 흑색종 양측 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 경시적인 우측의 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 8b는 실시예 5에 기재된 마우스 악성 흑색종 양측 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 경시적인 좌측의 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 9는 실시예 5에 기재된 마우스 악성 흑색종 양측 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 후 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 10a는 실시예 5에 기재된 마우스 악성 흑색종 양측 이식 모델에서 좌측 비투여 종양에 침윤된 생존 세포 기준 CD11b+ 세포의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 10b는 실시예 5에 기재된 마우스 악성 흑색종 양측 이식 모델에서 좌측 비투여 종양에 침윤된 생존 세포 기준 CD4+ T 세포의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 10c는 실시예 5에 기재된 마우스 악성 흑색종 양측 이식 모델에서 좌측 비투여 종양에 침윤된 생존 세포 기준 CD8a+ T 세포의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 11은 실시예 6에 기재된 마우스 대장암 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 또는 프로프라놀롤과 항-PD-1 항체 병용 투여 후 경시적인 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 12는 실시예 6에 기재된 마우스 대장암 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여 또는 프로프라놀롤과 항-PD-1 항체 병용 투여 후 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 13은 실시예 6에 기재된 마우스 대장암 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 항체 병용 투여 후 경시적인 종양 성장을 보여주는 그래프이다.
도 14는 실시예 6에 기재된 마우스 대장암 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 항체 병용 투여 후 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다.
이하 본 개시를 실시예를 들어 보다 상세히 설명하나, 이는 본 개시를 설명하기 위한 것일 뿐 그 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 마우스 악성 흑색종 이식 모델에 대한 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체의 항암 효능 시험
수컷 6주령 C57BL/6(구입처: 오리엔트바이오) 마우스를 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(R40-10, SAFE, France)를 자유 급이하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압멸균(autoclave)하여 자유 급이하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 실험은 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인(A-2020-004) 후 수행되었다.
B16-F10 마우스 악성 흑색종 세포주(KCLB No: 80008)를 한국세포주 은행(KCLB: Korean Cell Line Bank)으로부터 수득하였다. B16-F10 세포를 10% FBS(CAT No: 10082-147, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CAT No: 15140-122, Gibco) 함유 DMEM 배지(CAT No: 11965-092, Gibco)에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 마취된 C57BL/6 마우스 우측 옆구리에 주사기를 이용하여 5×105 세포를 0.1 ㎖ 이식하였다.
비히클로서 보툴리눔 독소 조제에 사용된 멸균 생리식염수(Lot No: M8T7AF3, 대한약품공업)를 사용하였으며, 보툴리눔 독소로서 100 units 코어톡스 (Lot No: NSA19007A, 메디톡스)를 사용하였다. 항-PD-1 항체(Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 760220J1)는 Bio X cell에서 구매하여 사용하였다.
각 시험물질은 아래 표 1에 따라 조제하여 투여하였다. 보툴리눔 독소 100 units 바이알에 멸균 생리식염수 6.667 ㎖을 첨가하여 15 units/㎖ 농도로 조제하여 1 ㎖/㎏, 15 units/㎏ 용량으로 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체는 투여일에 멸균 PBS(Cat No: 10010, Gibco)를 이용하여 최종 1 mg/㎖ 농도로 조제하여 5 ㎖/㎏, 5 ㎎/㎏ 용량으로 복강 내로 투여하였다.
마우스 악성 흑색종 이식 후 8일째 체중 및 종양 크기를 측정하여 평균 약 33 ㎣ 크기에서 마우스를 시험군에 따라 각 그룹 당 10마리씩 시험군간 차이가 없게 무작위 배정하였다. 종양 이식 후 8일째 체중을 바탕으로 비히클 및 보툴리눔 독소를 표 1에 따라 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체의 경우 표 1에 따라 종양 이식 8, 11, 14, 17일 째 복강 내로 투여하였다. 종양 이식 후 주 2회 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 다음의 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다.
종양 부피(㎣)=(W2×L)/2
W(㎜)=너비(종양의 단축), L(㎜)=종양의 길이(종양의 장축)
종양성장 억제율(TGI; tumor growth inhibition)(%)=(1- 평균 종양크기시험군/평균종양크기비히클)×100
군 동물수 투여물질 용량 투여경로 투여빈도
1 9* 비히클 1 ㎖/㎏, 5 ㎖/㎏ 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째)
주 2회, 총 4회
2 10 보툴리눔 독소 15 units/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
3 10 항-PD-1 항체 5 mg/㎏ 복강 내 주 2회, 총 4회
4 9* 보툴리눔 독소
+ 항-PD-1 항체		 15 units/㎏,
5 mg/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
* 1, 4번 시험군에서 각 1마리씩은 개체간 다툼으로 종양 주변 심한 상처가 발생되어 실험에서 제외됨.
종양 이식 후 19일째, 종양의 크기가 2000 ㎣에 도달하기 전에 모든 동물을 안락사하였다. 종료 후 종양 조직을 적출하고 무게를 측정하였으며, 종양 조직 내 T 세포의 수를 유세포분석기(FACSVerse, BD)를 이용하여 측정하였다. 종양 조직 내 T 세포 분석은 종양 조직을 gentle MACS C tube(Cat No: 130-093-237, Miltenyi Biotec)를 이용해 단세포로 분리 후 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain(Cat No: L34957, Invitrogen), Fc block(Cat No: 553142, BD), CD45-PECy7(Cat No: 25-0451-82, eBioscience), TCRbeta-FITC(Cat No: 109206, Biolegend), CD4-pacific blue(Cat No: 100428, Biolegend), CD8a-PerCPCy55(Cat No: 100734, Biolegend) 항체로 염색하여 유세포분석기로 분석하였다. 종양 내 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수는 종양 무게를 바탕으로 계산되었으며, 비율은 생존세포 기준으로 CD45+TCRbeta+CD4+ 및 CD45+TCRbeta+CD8a+ T 세포의 비율을 나타내었다.
혈액 내 엑소좀을 Exoquick exosome precipitation solution(Cat No: EXOQ20A-1, Lot No: 200107-001, System Biosciences)을 이용하여 분리하였고 ExoELISA-ULTRA Complet Kit(Cat No: EXEL-ULTRA-CD63-1, Lot No: 200226-002, System Biosciences)을 이용해 측정하였다.
Graphpad Prism(version 7.05, GraphPad Software Inc, CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software(version 25.0, SPSS Inc, IL, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 모수 데이터는 양측(two-tailed) t-검정을 수행하였고 비 모수 데이터는 Mann-Whitney 검정 통계분석을 유의 수준 p = 0.05에서 수행되었다.
종양 성장 억제율 측정 결과를 표 2 및 도 1에 나타내었다.
군 투여물질 평균 종양 크기1)
(평균 ㎣±SEM)		 평균 종양 무게2)
(평균 g±SEM)		 TGI(%)1)
1 비히클 1684±284 2.02±038 0
2 보툴리눔 독소 1433±348 1.29±035 15
3 항-PD-1 항체 1415±121 1.83±018 16
4 보툴리눔 독소
+ 항-PD-1 항체		 489±165 **, †, ‡ 0.46±0.1 2 **, †, ‡ 71
1) 종양 이식 후 18일째의 결과, 2) 종양 이식 후 19일째의 결과, ** p<0.01, vs 비히클. † p<0.05, vs 보툴리눔 독소, ‡ p<0.001, vs 항-PD-1항체, 양측 t-검정.
표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스 악성 흑색종 이식 후 18일째, 보툴리눔 독소 단독 종양 내 투여에 의해 평균 1433 ㎣의 종양 크기와 15%의 종양 성장 억제율을 보였으며, 항-PD-1 항체는 평균 1415 ㎣, 16% 종양 성장 억제율을 보였으나 비히클 투여군과 비교하여 통계적 유의미성은 없었다. 이에 비해, 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체를 병용 투여한 경우 평균 종양 크기가 평균 489 ㎣, 71% 종양 성장 억제율을 보여 각각을 단독 투여한 경우 보다 유의적으로 종양 성장이 억제된 것을 확인하였다. 또한, 종양 이식 후 19일째 종양을 적출하여 무게를 측정한 경우에도 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체를 병용 투여한 경우 비히클 투여군과 보툴리눔 독소, 항-PD-1 항체 단독 투여군 보다 유의적으로 종양의 무게가 감소되었다.
종양 조직을 적출하여 종양 내 침윤된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분석한 결과, 보툴리눔 독소를 단독 투여한 경우 종양 내 CD8+ T 세포의 수가 비히클 처리군 대비 증가하는 경향을 보인다(도 2a, 도 2b). CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 보툴리눔 독소 및 항-PD-1 항체를 단독 투여한 경우 비히클 처리군과 유의미한 차이가 없으나, 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체를 함께 처리한 군에서 비히클군에 비하여 유의적으로 많은 비율의 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 종양 내 침윤된 것을 확인할 수 있다(도 2c, 도 2d). 이는 항-PD-1 항체 단독 처리군보다 유의적으로 증가된 것이다. 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체를 함께 처리한 군에서 두 물질간 상승작용에 의해 종양 내 T 세포가 유의적으로 증가되어 종양 성장이 유의적으로 감소되었음을 설명할 수 있다.
혈액 내 엑소좀의 수를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 혈액 내 엑소좀의 수는 보툴리눔 독소 투여군에서 비히클 처리군 대비 감소하는 경향을 보이며, 항-PD-1 항체 및 보툴리눔 독소+항-PD-1 항체 투여군에서 유의적으로 감소되었다. 또한, 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여군은 보툴리눔 독소 및 항-PD-1 단독 투여군에 비해 혈액 내 엑소좀의 수가 유의적으로 감소되었다.
실시예 2: 마우스 악성 흑색종 이식 모델에 대한 용량별 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체의 항암 효능 시험
수컷 6주령 C57BL/6(구입처: 오리엔트바이오) 마우스를 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(R40-10, SAFE, France)를 자유 급이하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압멸균(autoclave)하여 자유 급이하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 실험은 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인(A-2020-004) 후 수행되었다.
B16-F10 마우스 악성 흑색종 세포주(KCLB No: 80008)를 한국세포주 은행(KCLB: Korean Cell Line Bank)으로부터 수득하였다. B16-F10 세포를 10% FBS(CAT No: 10082-147, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CAT No: 15140-122, Gibco) 함유 DMEM 배지(CAT No: 11965-092, Gibco)에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 마취된 C57BL/6 마우스 우측 옆구리에 주사기를 이용하여 5×105 세포를 0.1 ㎖ 이식하였다.
비히클로서 보툴리눔 독소 제품에서 보툴리눔 독소만 제외되고 나머지 부형제 성분은 동일한 플라시보(placebo)가 사용되었고, 보툴리눔 독소는 100 units 코어톡스(Lot No: NSA19007A, 메디톡스)가 사용되었다. 항-PD-1 항체 (Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 780120J2)는 Bio X cell에서 구매하여 사용하였다. 각 시험물질은 아래 표 3에 따라 조제하여 투여되었다. 보툴리눔 독소 100 units 바이알에 멸균 생리식염수를 첨가하여 1, 3, 10 units/㎖ 농도로 조제하여 1 ㎖/㎏, 1, 3, 10 units/㎏ 용량으로 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체는 투여일에 멸균 PBS(Cat No: 10010, Gibco)를 이용하여 최종 1 ㎎/㎖ 농도로 조제하여 5 ㎖/㎏, 5 ㎎/㎏ 용량으로 복강 내로 투여하였다.
마우스 악성 흑색종 이식 후 8일째 종양 크기를 측정하여 마우스를 시험군에 따라 각 그룹 당 12마리씩 시험군간 차이가 없게 무작위 배정하였다. 종양 이식 후 8일째 비히클 및 보툴리눔 독소를 시험군 구성에 따라 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체의 경우 표 3에 따라 주 2회 총 4회 복강 내로 투여하였다. 종양 이식 후 주 2회 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 실시예 1에 나타낸 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다.
군 동물수 투여물질 용량 투여경로 투여빈도
1 12 비히클 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
2 12 1 U/㎏ 보툴리눔 독소 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
3 12 3 U/㎏ 보툴리눔 독소 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
4 12 10 U/㎏ 보툴리눔 독소 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
5 12 1 U/㎏ 보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
6 12 3 U/㎏ 보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
7 12 10 U/㎏ 보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
8 12 비히클 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
종양 이식 후 각 마우스의 종양의 크기가 2000 ㎣에 도달할 때까지 측정을 진행하였으며 안락사 기준(2000 ㎣)을 초과한 개체는 즉시 안락사하고 사망한 것으로 기록하였다.
Graphpad Prism(version 7.05, GraphPad Software Inc, CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software(version 25.0, SPSS Inc, IL, USA) 및 Excel (2013, MS, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 종양 크기는 양측(two-tailed) t-검정을 수행하였고, 생존율은 만텔-콕스 로그 등급분석을 유의수준 p = 0.05에서 수행되었다.
종양 크기 측정 결과를 도 4에 나타내었다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 도 4에 나타낸 바와 같이, 마우스 악성 흑색종 모델에서 보툴리눔 독소를 1, 3, 10 U/㎏ 용량으로 단회 종양 내 투여한 경우 14일째 10 U/㎏ 투여군에서 유의적인 종양 성장 억제가 관찰되었다. 종양 이식 후 18일째에는 보툴리눔 독소를 단독 투여한 시험군과 비히클 + 5 ㎎/㎏ 항-PD1 항체를 투여한 시험군에서 비히클 투여군 대비 유의적인 종양 성장 억제 효과는 관찰되지 않았다. 그러나, 3 또는 10 U/㎏ 보툴리눔 독소와 5 ㎎/㎏ 항-PD1 항체를 병용 투여한 시험군에서는 비히클 투여군 대비 유의적인 종양 성장 억제 효과를 관찰할 수 있었다.
생존률 측정 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 3 또는 10 U/㎏ 보툴리눔 독소와 5 ㎎/㎏ 항-PD1 항체를 병용 투여한 시험군에서 유의적으로 마우스 생존율이 증가되었다. 또한 비히클 + 5 ㎎/㎏ 항-PD1 투여군에서도 유의적인 생존율 증가가 관찰되었다. 상기 결과로부터 마우스 흑색종 모델에서 보툴리눔 독소 3 U/㎏ 이상의 용량에서 항-PD1 항체와 병용 투여할 경우 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3: 마우스 악성 흑색종 이식 모델에서 복합체화된 보툴리눔 독소와 비-복합체화된 보툴리눔 독소의 항-PD-1 항체 병용 투여 항암 효능 시험
수컷 6주령 C57BL/6(구입처: 오리엔트바이오) 마우스를 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(R40-10, SAFE, France)를 자유 급이하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압멸균(autoclave)하여 자유 급이하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 실험은 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인(A-2020-004) 후 수행되었다.
B16-F10 마우스 악성 흑색종 세포주(KCLB No: 80008)를 한국세포주 은행(KCLB: Korean Cell Line Bank)으로부터 수득하였다. B16-F10 세포를 10% FBS(CAT No: 10082-147, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CAT No: 15140-122, Gibco) 함유 DMEM 배지(CAT No: 11965-092, Gibco)에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 마취된 C57BL/6 마우스 우측 옆구리에 주사기를 이용하여 5×105 세포를 0.1 ㎖ 이식하였다.
비히클로서 비-복합체화된 보툴리눔 독소 제품에서 보툴리눔 독소만 제외되고 나머지 부형제 성분은 동일한 플라시보가 사용되었다. 비-복합체화된 보툴리눔 독소로는 100 units 코어톡스(Lot No: NSA19007A, 메디톡스)가 사용되었고, 복합체화된 보툴리눔 독소로는 100 units 메디톡신(Lot No: TFAA20024, 메디톡스)이 사용되었다. 항-PD-1 항체(Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 780120J2)는 Bio X cell에서 구매하여 사용하였다. 각 시험물질은 아래 표 4에 따라 조제하여 투여되었다. 보툴리눔 독소 100 units 바이알에 멸균 생리식염수를 첨가하여 15 units/㎖ 농도로 조제하여 1 ㎖/㎏, 15 units/㎏ 용량으로 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체는 투여일에 멸균 PBS(Cat No: 10010, Gibco)를 이용하여 최종 1 ㎎/㎖ 농도로 조제하여 5 ㎖/㎏, 5 ㎎/㎏ 용량으로 복강 내로 투여하였다.
마우스 악성 흑색종 이식 후 8일째 종양 크기를 측정하여 마우스를 시험군에 따라 각 그룹 당 12마리씩 시험군간 차이가 없게 무작위 배정하였다. 종양 이식 후 8일째 비히클 및 보툴리눔 독소를 시험군 구성에 따라 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체의 경우 표 4에 따라 주 2회 총 4회 복강 내로 투여하였다. 종양 이식 후 주 2회 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 실시예 1에 나타낸 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다.
군 동물수 투여물질 용량 투여경로 투여빈도
1 12 비히클 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
2 12 15 U/㎏ 비-복합체화된
보툴리눔 독소		 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
3 12 15 U/㎏ 복합체화된
보툴리눔 독소		 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
4 12 15 U/㎏ 비-복합체화된
보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
5 12 15 U/㎏ 복합체화된
보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
6 12 비히클 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
종양 이식 후 19일째 종양의 크기가 2000 ㎣에 도달하기 전에 모든 동물을 안락사하고 종료하였다.
Graphpad Prism(version 7.05, GraphPad Software Inc, CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software(version 25.0, SPSS Inc, IL, USA) 및 Excel (2013, MS, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 종양 크기는 양측(two-tailed) t-검정을 유의수준 p = 0.05에서 수행되었다.
그 결과를 도 6에 나타내었다(* p<0.05, ** p<0.01) 도 6에 나타난 바와 같이, 마우스 악성 흑색종 이식 후 19일째, 15 U/㎏의 비-복합체화된 보툴리눔 독소와 복합체화된 보툴리눔 독소를 5 ㎎/㎏ 항-PD1 항체와 병용 투여하였을 경우 유의적인 종양 성장 억제를 관찰하였다. 비-복합체화된 보툴리눔 독소와 복합체화된 보툴리눔 독소를 단독투여한 시험군 사이의 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 또한 비-복합체화된 보툴리눔 독소 + 항-PD1 항체 투여군과 복합체화된 보툴리눔 독소 + 항-PD1 항체와 투여군 간의 유의적인 차이도 관찰되지 않았다. 상기 결과로부터 비-복합체화된 보툴리눔 독소와 복합체화된 보툴리눔 독소 모두 항-PD1 항체와 병용 투여하였을 경우 보툴리눔 독소의 종류에 관계 없이 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 4: 마우스 폐종양 이식 모델에 대한 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 항체의 항암 효능 시험
수컷 6주령 C57BL/6(구입처: 오리엔트바이오) 마우스를 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(R40-10, SAFE, France)를 자유 급이하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압멸균(autoclave)하여 자유 급이하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 실험은 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인(A-2020-004) 후 수행되었다.
LLC1 마우스 폐암 세포주(ATCC No: CRL-1642)를 ATCC로부터 수득하였다. LLC1 세포를 10% FBS(CAT No: 10082-147, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CAT No: 15140-122, Gibco) 함유 DMEM 배지(CAT No: LM001-05, Welgene)에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 마취된 C57BL/6 마우스 우측 옆구리에 주사기를 이용하여 5×105 세포를 0.1 ㎖ 이식하였다.
비히클로서 보툴리눔 독소 제품에서 보툴리눔 독소만 제외되고 나머지 부형제 성분은 동일한 플라시보가 사용되었고 보툴리눔 독소로는 100 units 코어톡스 (Lot No: NSA19007A, 메디톡스)가 사용되었다. 항-CTLA4 항체(Clone: 9H10, Cat No: BE0131, Lot No: 704019A2)는 Bio X cell에서 구매하여 사용하였다. 각 시험물질은 아래 표 5에 따라 조제하여 투여되었다. 보툴리눔 독소 100 units 바이알에 멸균 생리식염수를 첨가하여 15 units/㎖ 농도로 조제하여 1㎖/㎏, 15 units/㎏ 용량으로 종양 내로 투여하였다. 항-CTLA4 항체는 투여일에 멸균 PBS(Cat No: 10010, Gibco)를 이용하여 최종 1 ㎎/㎖ 농도로 조제하여 5㎖/㎏, 5 ㎎/㎏ 용량으로 복강 내로 투여하였다.
마우스 LLC1 폐종양 세포주 이식 후 8일째 종양 크기를 측정하여 마우스를 시험군에 따라 각 그룹 당 10마리씩 시험군간 차이가 없게 무작위 배정하였다. 종양 이식 후 8일째 비히클 및 보툴리눔 독소를 시험군 구성에 따라 종양 내로 투여하였다. 항-CTLA4 항체의 경우 표 5에 따라 주 2회 총 4회 복강 내로 투여하였다. 종양 이식 후 주 2회 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 실시예 1에 나타낸 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다.
군 동물수 투여물질 용량 투여경로 투여빈도
1 10 비히클 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
2 10 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
3 10 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-CTLA4 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회 (종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
4 10 비히클 +
5 ㎎/㎏ 항-CTLA4 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회 (종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
종양 이식 후 21일째 종양의 크기가 2000 ㎣에 도달하기 전에 모든 동물을 안락사하고 종료하였다.
Graphpad Prism(version 7.05, GraphPad Software Inc, CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software(version 25.0, SPSS Inc, IL, USA) 및 Excel (2013, MS, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 종양 크기는 양측(two-tailed) t-검정을 유의수준 p = 0.05에서 수행되었다.
그 결과를 도 7에 나타내었다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 도 7에 나타난 바와 같이, 마우스 폐종양 이식 후 21일째, 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 또는 비히클 + 5 ㎎/㎏ 항-CTLA4 항체 투여군에서는 비히클 시험군 대비 유의적인 종양 성장 억제 효과가 관찰되지 않았으나, 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 + 5 ㎎/㎏ 항-CTLA4 병용 투여군에서 비히클 시험군 대비 유의적인 종양 성장 억제 효과가 관찰하였다. 또한, 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 + 5 ㎎/㎏ 항-CTLA4 투여군은 15 U/㎏ 보툴리눔 독소를 단독 투여한 시험군과 비히클 + 5 ㎎/㎏ 항-CTLA4 항체를 단독투여한 군 대비 유의적으로 종양 부피가 감소되었다. 상기 결과로부터 마우스 LLC1 폐종양 모델에서 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 항체의 병용 투여에 의한 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5: 마우스 악성 흑색종 양쪽 이식 모델에 대한 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체의 항암 효능 시험
수컷 6주령 C57BL/6(구입처: 오리엔트바이오) 마우스를 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(R40-10, SAFE, France)를 자유 급이하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압멸균(autoclave) 하여 자유 급이하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건하에서 사육되었다. 본 실험은 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인 (A-2020-004) 후 수행되었다.
B16-F10 마우스 악성 흑색종 세포주(KCLB No: 80008)를 한국세포주 은행(KCLB: Korean Cell Line Bank)으로부터 수득하였다. B16-F10 세포를 10% FBS(CAT No: 10082-147, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CAT No: 15140-122, Gibco) 함유 DMEM 배지(CAT No: 11965-092, Gibco)에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 마취된 C57BL/6 마우스 우측 옆구리에 주사기를 이용하여 5 x 105 세포를 0.1 mL 이식하였으며, 5일 뒤 좌측 옆구리에 주사기를 이용하여 2 ~ 2.5 x 105 세포를 0.1 mL 이식하였다.
비히클로서 보툴리눔 독소 제품에서 보툴리눔 독소만 제외되고 나머지 부형제 성분은 동일한 플라시보가 사용되었고, 보툴리눔 독소는 100 units 코어톡스(Lot No: NSA20015, 메디톡스)가 사용되었다. 항-PD-1 항체(Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 780120J3 또는 798921J1C)는 Bio X cell에서 구매하여 사용하였다. 각 시험물질은 아래 표 6에 따라 조제하여 투여되었다. 보툴리눔 독소 100 units 바이알에 멸균 생리식염수를 첨가하여 15 units/mL 농도로 조제하여 1 mL/kg, 15 units/kg 용량으로 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체는 PBS(Cat No: LB004-02, Welgene)를 이용하여 5 mg/kg 용량으로 복강 내로 투여하였다.
실험은 동일한 시험군 및 방법으로 2회 반복하여 수행되었다. 우측 옆구리에 악성 흑색종 이식 후 8일째 종양 크기를 측정하여 마우스를 시험군에 따라 각 그룹 당 12마리씩 시험군간 차이가 없게 무작위 배정하였다. 우측 옆구리에 종양 이식 후 8일째 비히클 및 보툴리눔 독소를 시험군 구성에 따라 우측 옆구리의 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 항체의 경우 시험군 구성에 따라 주 2회 총 4회 복강 내로 투여하였다. 종양 이식 후 주 2회 우측 및 좌측에 이식된 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 실시예 1에 나타낸 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다.
군 동물수 투여물질 용량 투여경로 투여빈도
1 12 비히클 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
2 12 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 8일째)
3 12 비히클 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회 (종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
4 12 15 U/kg 보툴리눔 독소 +
5 ㎎/㎏ 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회 (종양 이식 후 8일째),
주 2회, 총 4회
우측 종양 이식 후 21일째, 모든 동물을 안락사하여 실험을 종료하였다. 종료 후 모든 개체의 좌측 옆구리에 이식된 종양 조직 유무를 관찰하였고 좌측 종양을 적출하여 종양 조직 내 면역세포를 유세포분석기(FACSVerse, BD)를 이용하여 분석하였다. 종양 조직 내 면역세포 분석은 종양 조직을 gentle MACS C tube(Cat No: 130-093-237, Miltenyi Biotec)를 이용해 단세포로 분리 후 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain(Cat No: L34957, Invitrogen), Fc block(Cat No: 553142, BD), CD45-PE-Cy7(Cat No: 25-0451-82, eBioscience), TCRbeta-APC-eFluor780(Cat No: 47-5961-82, Invitrogen), CD4-pacific blue(Cat No: 100428, Biolegend), CD8a-PerCP-Cy55(Cat No: 100734, Biolegend), CD11b-A647(Cat No: 101218, Biolegend) 항체로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였다. 종양 내 CD4+ 및 CD8a+ T 세포와 CD11b+ 세포의 비율은 생존세포 기준으로 CD45+TCRbeta+CD4+, CD45+TCRbeta+CD8a+, CD45+CD11b+ 세포의 비율을 나타낸다.
종양 이식 후 각 마우스의 우측 및 좌측 종양 크기의 합이 2000 ㎣에 도달한 경우 해당 개체는 사망한 것으로 기록하였다.
Graphpad Prism(version 7.05, GraphPad Software Inc, CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software(version 25.0, SPSS Inc, IL, USA) 및 Excel(2013, MS, USA)은 통계 분석에 사용되었다. 종양 크기는 양측(two-tailed) t-검정을 수행하였고 좌측 종양 형성률은 피어슨 카이-제곱 테스트를 수행하였으며 생존율은 만텔-콕스 로그 등급분석을 유의수준 p = 0.05에서 수행되었다.
경시적인 우측 및 좌측의 종양 성장을 종양 부피(㎣)로 도 8a, 도 8b와 같이 나타내었다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 우측 및 좌측에 이식된 악성 흑색종 모델에서 보툴리눔 독소를 15 U/kg 용량으로 단회 우측 종양 내 투여하고 5 mg/kg 항-PD-1 항체를 복강으로 병용 투여할 경우 우측 종양의 크기가 비히클 대비 유의적으로 감소된 것이 관찰되었으며, 보툴리눔 독소 및 항-PD-1 항체를 각각 단독으로 투여한 시험군 대비하여 유의적으로 감소된 것이 관찰되었다(도 8a). 좌측 종양 크기의 경우 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체를 병용 투여한 시험군에서 비히클 투여군 대비 유의적으로 감소되었다(도 8b).
표 7에 좌측 종양 형성 유무를 나타내었다(* p<0.05 vs G3 항-PD-1 항체)
군 투여물질 좌측 옆구리 종양 형성
관찰됨 (마리수) 관찰되지 않음 (마리수)
1 비히클 18 4
2 15 U/㎏ 보툴리눔 독소 21 3
3 비히클 +
5 mg/kg 항-PD-1 항체		 18 2
4 15 U/kg 보툴리눔 독소 +
5 mg/kg 항-PD-1 항체		 14 8*
표 7에 나타낸 바와 같이, 좌측 종양의 형성률은 항-PD-1 항체 단독 투여군 대비 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여군에서 유의적으로 감소되었다.
도 9에 마우스의 생존율을 나타내었다(** p<0.01) 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체를 병용 투여한 시험군에서 생존율이 유의적으로 개선된 것을 확인하였다.
좌측 비투여 종양에 침윤된 생존 세포 기준 CD11b+ 세포와 CD4+ 및 CD8a+ T 세포의 비율을 양측(two-tailed) t-검정을 사용하여 계산하였다(* p<0.05). 좌측에 이식된 종양 조직을 적출하여 종양 내 침윤된 CD4+ 및 CD8a+ T 세포와 CD11b+ 세포를 분석한 결과, 보툴리눔 독소와 항-PD1 항체 병용 투여군에서 CD11b+ 세포 비율은 비히클 투여군 대비 유의적인 감소가 관찰되었고(도 10a), CD4+ T 세포의 경우 항-PD-1 항체 단독 투여군 대비 유의적으로 증가되었으며(도 10b), CD8a+ T 세포의 비율은 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체 병용 투여군에서 비히클 및 보툴리눔 독소 단독 투여군 대비 유의적으로 증가되었다(도 10c).
상기 결과로부터 마우스 양쪽 흑색종 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 항체가 병용 투여될 경우 생존율의 유의적인 개선과 보툴리눔 독소가 투여된 종양의 성장뿐만 아니라 투여되지 않은 종양의 형성 및 성장 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6: 마우스 대장암 이식 모델에서 보툴리눔 독소와 면역항암제(항-PD-1 및 항-CTLA4)의 병용 투여 항암 효능 시험
암컷 6주령 C57BL/6(구입처: 오리엔트바이오) 마우스를 구입하여 1주간 순화 및 검역 후 7주령 마우스를 실험에 사용하였다. 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(R40-10, SAFE, France)를 자유 급이하였으며, 음수는 상수도수를 고온고압멸균(autoclave)하여 자유 급이하였다. 순화, 검역 및 실험기간 동안 마우스는 온도 23±3 ℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전8시~오후8시), 환기횟수 15회/시간 및 조도 150~300 Lux로 설정된 특정-병원체-부재 조건 하에서 사육되었다. 본 실험은 ㈜메디톡스 동물실험윤리위원회의 검토 및 승인 (A-2020-004) 후 수행되었다.
마우스 대장암 MC38 세포주(ENH204-FP)를 Kerafast로부터 수득하였다. MC38 세포주를 10% FBS(CAT No: 10082-147, Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(CAT No: 15140-122, Gibco), 10 mM HEPES(CAT No: 15630-080, Gibco), 0.1 mM MEM NEAA(CAT No: 11140-050, Gibco), 1 mM 소듐 파이루베이트(CAT No: 11360-070, Gibco)를 함유하는 DMEM 배지(CAT No: 11965-092, Gibco)에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 마취된 C57BL/6 마우스 우측 옆구리에 주사기를 이용하여 2.5×105 세포를 0.1 mL 이식하였다.
비히클로서 보툴리눔 독소 제품에서 보툴리눔 독소만 제외되고 나머지 부형제 성분은 동일한 플라시보가 사용되었고 보툴리눔 독소는 100 units 코어톡스(Lot No: NSA20015, 메디톡스)가 사용되었다. 항-PD-1 항체(Clone: RMP1-14, Cat No: BE0146, Lot No: 798921J1C)와 항-CTLA4 항체(Clone: 9H10, Cat No: BE0131, Lot No: 755620A2)는 Bio X cell 에서 구매하여 사용하였다. 각 시험물질은 아래 표 6에 따라 조제하여 투여되었다. 보툴리눔 독소 100 units 바이알에 멸균 생리식염수를 첨가하여 15 units/mL 농도로 조제하여 1 mL/kg, 15 units/kg 용량으로 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 및 항-CTLA4 항체는 PBS (Cat No: LB004-02, Welgene)를 이용하여 5 mg/kg 용량으로 복강 내로 투여하였다. 프로프라놀롤 (Cat No: P0884, Sigma)은 PBS를 이용해 2 mg/mL으로 제조하여 10 mg/kg 용량으로 복강 내로 투여하였다.
마우스 대장암 세포주 이식 후 7일째 종양 크기를 측정하여 마우스를 시험군에 따라 각 그룹 당 10마리씩 시험군간 차이가 없게 무작위 배정하였다. 종양 이식 후 7일째 비히클 및 보툴리눔 독소를 시험군 구성에 따라 종양 내로 투여하였다. 항-PD-1 및 항-CTLA4 항체의 경우 표 8에 따라 주 2회 총 4회 복강 내로 투여하였으며, 프로프라놀롤은 종양 이식 후 7일에서 16일 사이 총 8회 복강 내로 투여하고, 종양 이식 후 주 2회 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼로 측정하였고 측정치를 사용해 실시예 1에 나타낸 식을 이용하여 종양 부피를 계산하였다.
군 동물수 투여물질 용량 투여경로 투여빈도
1 10 비히클 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 7일째)
2 10 15 U/kg 보툴리눔 독소 1 ㎖/㎏ 종양 내 1회(종양 이식 후 7일째)
3 10 비히클 +
5 mg/kg 항-PD-1 항체		 1 mL/kg,
5 mL/kg		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 7일째),
주 2회, 총 4회
4 10 비히클 +
5 mg/kg 항-CTLA4 항체		 1 mL/kg,
5 mL/kg		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 7일째),
주 2회, 총 4회
5 10 15 U/kg 보툴리눔 독소 +
5 mg/kg 항-PD-1 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 7일째),
주 2회, 총 4회
6 10 15 U/kg 보툴리눔 독소 +
5 mg/kg 항-CTLA4 항체		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회(종양 이식 후 7일째),
주 2회, 총 4회
7 10 비히클 +
10 mg/kg Propranolol		 1 ㎖/㎏,
5 ㎖/㎏		 종양 내,
복강 내		 1회 (종양 이식 후 7일째)
총 8회 (종양이식 후 7~16일째)
8 10 10 mg/kg Propranolol +
5 mg/kg 항-PD-1 항체		 10 mL/kg,
5 mL/kg		 종양 내,
복강 내		 총 8회 (종양이식 후 7~16일째)
주 2회, 총 4회
종양 이식 후 각 마우스의 종양의 크기가 2000 ㎣ 에 도달할 때까지 측정을 진행하였으며 안락사 기준 (2000 ㎣)을 초과한 개체는 즉시 안락사하고 사망한 것으로 기록하였다.
Graphpad Prism(version 705, GraphPad Software Inc, CA, USA)은 그래프 제시에 사용되었으며 SPSS software (version 25.0, SPSS Inc, IL, USA) 및 Excel (2013, MS, USA)는 통계 분석에 사용되었다. 종양 크기는 양측 (two-tailed) t-검정을 수행하였고 생존율은 만텔-콕스 로그 등급분석을 유의수준 p = 0.05에서 수행되었다.
도 11 및 도 13에 경시적인 종양 성장을 종양 부피(㎣)로 나타내었다(도 11: ** p<0.01 vs 비히클, 도 13: ** p<0.01, *** p<0.001 vs 비히클). 마우스 대장암 이식 후 20일째, 15 U/kg 보툴리눔 독소와 5 mg/kg 항-PD-1 항체 병용 투여군에서 비히클과 보툴리눔 독소, 항-PD-1 단독 투여군 대비 유의적인 종양 성장 억제를 관찰하였다(도 11). 또한 대장암 이식 후 20일째, 5 mg/kg 항-CTLA4 단독 투여군과 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 병용 투여군에서 비히클 투여군 대비 유의적인 종양 성장 억제가 관찰되었다(도 13).
도 12 및 도 14에 마우스의 생존율을 나타내었다(도 12: * p<0.05, ** p<0.01 vs 비히클, a p<0.05 vs 항-PD-1, 도 14: *** p<0.001 vs 비히클, a p<0.05 vs 항-CTLA4) 보툴리눔 독소와 항-PD1 항체를 병용 투여한 시험군에서 비히클 및 항-PD-1 항체 단독 투여군 대비 유의적으로 마우스 생존율이 증가되었으며, 10 mg/kg 프로프라놀롤과 항-PD-1 항체를 병용 투여한 시험군에서도 비히클 및 항-PD-1 항체 단독 투여군 대비 유의적으로 생존율이 증가되었다. 항-CTLA4 항체 단독 투여군에서도 유의적인 생존율 증가가 관찰되었으며, 보툴리눔 독소와 항-CTLA4 항체 병용 투여군에서 비히클 및 항-CTLA4 항체 단독 투여군 대비 유의적으로 증가된 생존율이 관찰되었다(도 14).
상기 결과로부터, 마우스 대장암 모델에서 보툴리눔 독소와 항-PD-1 또는 항-CTLA4 면역항암제와의 병용 투여로 인한 종양 성장 억제 상승효과(synergistic effect) 및 생존율 개선 효과를 확인하였다. 그리고, 베타 차단제(propranolol)의 면역항암제와 병용 투여에 의한 상승효과를 확인하였고, 보툴리눔 독소와 면역항암제를 병용 투여할 경우 베타 차단제와 면역항암제 병용 투여군 대비 동등 이상의 효과를 확인하였다.

Claims (23)

  1. 유효성분으로 보툴리눔 독소(botulinum neurotoxin)를 포함하는, 면역요법제(immunotherapeutic agent)와 병용하여 암을 치료하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 보툴리눔 독소가 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, H, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 면역요법제는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 면역관문 억제제는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, VISTA 길항제, BTLA 길항제 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 면역관문 억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-VISTA 항체, 항-BTLA 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 면역관문　억제제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 또는 이의 항원-결합 단편인 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 엑소좀-매개된(exosome-mediated) 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 고형암(solid tumor)인 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 고형암이 흑색종, 대장암, 유방암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 방광암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 전이성 암(metastatic cancer)인 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소좀 분비가 증가된 대상에서 사용하기 위한 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 안정화제, 이온 화합물, 계면활성제, 완충제, 동결건조 보호제, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제는 아미노산, 염, 완충액, 비이온성 계면활성제, 당, 당 알코올, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 또는 동물 유래 성분이나 폴리사카라이드는 포함하지 않는 조성물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 분말, 액상, 또는 프리필드 시린지 제제 형태의 조성물.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 투여하기 위한 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 종양 내 또는 종양 주변으로 투여하기 위한 조성물.
  19. 제1항 내지 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소를 0.01 내지 100 units/㎏으로 포함하는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소는 면역요법제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 보툴리눔 독소는 면역요법제와 단일의 제제 또는 별개의 제제로 투여되는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 면역요법제는 비경구 투여되는 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 면역요법제는 정맥　내, 복강 내, 피하, 피내, 근육 내, 척추, 척추강 또는 직장 내 국소 투여 또는 주입되는 것인 조성물.
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