WO2022004136A1 - 制御性ｔ細胞の誘導方法 - Google Patents

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明理 森田
秀之 益田
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Ushio Denki KK
Nagoya City University
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Ushio Denki KK
Nagoya City University
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing regulatory T cells in blood.
  • the human body is equipped with immunity as a mechanism to prevent invasion from foreign substances and viruses from outside the body.
  • Immunity involves cells that are responsible for defense from foreign enemies (effector T cells) and cells that regulate the action of these cells in a suppressive direction (regulatory T cells), and the balance between the two is important. It has been found that autoimmune diseases and allergic diseases such as pollinosis are caused by the above-mentioned imbalance and the effector T cells becoming more active relative to regulatory T cells. Therefore, in recent years, studies have been conducted to induce regulatory T cells for the treatment of autoimmune diseases and allergic diseases (see, for example, Patent Documents 1, 2 and 3).
  • one aspect of the method for inducing regulatory T cells is a step of extracting blood from a living body and ultraviolet rays in a wavelength range of 260 nm or more and 320 nm or less with respect to the extracted blood. Including the step of irradiating.
  • regulatory T cells in the blood can be induced only by irradiating the blood extracted from the living body (for example, the human body) with ultraviolet rays in the above-mentioned specific wavelength range. That is, regulatory T cells in blood can be induced without the use of additives.
  • Inducing regulatory T cells means increasing the proportion of regulatory T cells (CD25-positive, Foxp3-positive cells) in the helper T cells (CD4 positive cells) in the blood.
  • the extracted blood in the step of irradiating the ultraviolet rays, may be irradiated with ultraviolet rays in a wavelength range of 260 nm or more and 290 nm or less.
  • regulatory T cells can be induced even with a relatively small amount of ultraviolet irradiation. Therefore, the irradiation time of ultraviolet rays can be shortened.
  • the method for inducing regulatory T cells may further include the step of culturing the blood irradiated with ultraviolet rays for 2 days or more.
  • regulatory T cells in the blood can be appropriately induced.
  • the method for inducing regulatory T cells further includes a step of introducing the extracted blood into the flow path, and the step of irradiating the ultraviolet rays is a step of introducing the blood into the flow path. It is a step of irradiating the ultraviolet rays through the wall portion of the flow path, and the length of the ultraviolet rays in the flow path in the irradiation direction may be 70 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the leukocytes can be appropriately irradiated with the ultraviolet rays transmitted through the wall of the flow path. Therefore, complicated blood cell separation processing such as separating only leukocytes from blood and irradiating them with ultraviolet rays becomes unnecessary.
  • regulatory T cells can be induced without the use of additives.
  • the above-mentioned object, aspect and effect of the present invention and the above-mentioned object, aspect and effect of the present invention not described above are to be used by those skilled in the art to carry out the following invention by referring to the accompanying drawings and the description of the scope of claims. Can be understood from the form of (detailed description of the invention).
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration example of an ultraviolet irradiation system according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the configuration of the ultraviolet irradiation device in the present embodiment.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of a graph showing the degree of positivity of Foxp3 and CD25.
  • FIG. 4A is a diagram showing changes in regulatory T cells after UV irradiation.
  • FIG. 4B is a graph showing the proportion of regulatory T cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the wavelength dependence of ultraviolet rays on the increase of regulatory T cells.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration example of the ultraviolet irradiation system 100 according to the present embodiment.
  • the ultraviolet irradiation system 100 extracts blood from a living body (for example, a human body such as a patient) 200, irradiates the extracted blood with ultraviolet rays in a specific wavelength range to induce regulatory T cells, and then applies the blood to the human body 200. It is a system that returns to the body.
  • inducing regulatory T cells means increasing the proportion of regulatory T cells in the blood, specifically, the proportion of regulatory T cells in CD4 positive cells, and the number of regulatory T cells. Includes increasing and decreasing the number of effector T cells.
  • the ultraviolet irradiation system 100 includes a blood extraction device 10, an ultraviolet irradiation device 20, and a blood injection device 30.
  • the blood extraction device 10 extracts blood from the human body 200 and supplies it to the ultraviolet irradiation device 20.
  • the blood supplied to the ultraviolet irradiation device 20 is blood (whole blood) from which blood components have not been separated.
  • the ultraviolet irradiation device 20 irradiates the blood extracted by the blood extraction device 10 with ultraviolet rays in a wavelength range of 260 nm or more and 320 nm or less. The specific configuration of the ultraviolet irradiation device 20 will be described later.
  • the blood injection device 30 returns the blood irradiated with ultraviolet rays by the ultraviolet irradiation device 20 to the human body 200.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the configuration of the ultraviolet irradiation device 20.
  • the ultraviolet irradiation device 20 includes a flow path 21, an inlet side infusion tube 22, an outlet side infusion tube 23, a transport pump 24, a light source 25, a supply container 26, and a recovery container 27.
  • the flow path 21 is a thin tube made of a material having ultraviolet transparency, and the blood 210 extracted by the blood extraction device 10 is introduced.
  • the flow path 21 is, for example, a quartz tube.
  • the flow path 21 can be, for example, a cylindrical thin tube having a length of 50 mm, an outer diameter of 3 mm, and an inner diameter of 0.3 mm (300 ⁇ m).
  • the inlet side infusion tube 22 is attached to the inlet side of the flow path 21, and the outlet side infusion tube 23 is attached to the outlet side of the flow path 21.
  • Each of the infusion tubes 22 and 23 can be made of a silicon tube.
  • the transport pump 24 is interposed in the infusion tube 22 on the inlet side.
  • the transport pump 24 comprises a peristaltic pump.
  • the transport pump 24 causes the blood 210 to flow from the inlet side infusion tube 22 to the outlet side infusion tube 23 via the flow path 21 at a preset flow rate.
  • the light source 25 is provided above the flow path 21.
  • the light source 25 can be an LED irradiator that irradiates light including ultraviolet rays.
  • the LED of the LED irradiator 25 emits light including ultraviolet rays in a wavelength range of 260 nm or more and 320 nm or less, preferably 260 nm or more and 290 nm or less.
  • the ultraviolet rays emitted from the light source 25 irradiate the flow path 21, pass through the wall of the flow path 21, and irradiate the blood in the flow path 21.
  • the light source 25 is not limited to the LED irradiator, and may be a XeCl excima discharge lamp, a metal halide lamp, a fluorescent lamp, a mercury lamp, or the like. Further, the light source 25 may be a linear light source or a planar light source. Further, the light source 25 is an optical filter that transmits only ultraviolet rays in the wavelength range of 260 nm or more and 320 nm or less, preferably 260 nm or more and 290 nm or less, and blocks light in other wavelength ranges among the light radiated from the LED element or the lamp. It may be provided with a filter.
  • the supply container 26 contains the blood 210 extracted by the blood extraction device 10.
  • the inlet of the infusion tube 22 on the inlet side is inserted into the supply container 26.
  • the outlet of the infusion tube 23 on the outlet side is inserted into the collection container 27.
  • the collection container 27 is irradiated with ultraviolet rays in the flow path 21, and collects the blood 210 transported through the outlet-side infusion tube 23.
  • the inlet of the inlet side infusion tube 22 is inserted into the supply container 26 containing the blood 210 extracted by the blood extraction device 10, and the outlet of the outlet side infusion tube 23 is inserted into the collection container 27.
  • the infusion pump 24 is operated.
  • the blood 210 in the supply container 26 is sucked up by the infusion tube 22 on the inlet side.
  • the blood 210 sucked up by the infusion tube 22 on the inlet side is introduced into the flow path 21 made of a quartz capillary tube.
  • the blood 210 flows through the flow path 21 at a preset speed.
  • the ultraviolet irradiation device 20 lights the LED of the light source 25 including the LED irradiator, and irradiates the blood 210 introduced into the flow path 21 with the ultraviolet rays through the wall portion of the flow path 21.
  • the blood 210 irradiated with ultraviolet rays in the flow path 21 is sent to the outlet side infusion tube 23, and is collected from the outlet side infusion tube 23 to the collection container 27.
  • the blood 210 collected in the collection container 27 is sent to the blood injection device 30, and is returned from the blood injection device 30 to the body of the human body 200.
  • the flow path 21 is a thin tube made of quartz glass
  • the flow path 21 may be a thin tube made of glass such as alkaline glass or borosilicate glass, or a silicone resin.
  • Cycloolefin resin cycloolefin polymer (COP), cycloolefin copolymer (COC), etc.
  • a thin tube made of a synthetic resin such as an acrylic resin.
  • the shape of the flow path 21 is not limited to the shape as described above.
  • the length of the flow path 21 in the longitudinal direction is based on the intensity of ultraviolet rays radiated from the light source 25, the flow velocity of the blood 210 flowing in the flow path 21, and the like, and the blood in the flow path 21.
  • the irradiation amount of ultraviolet rays to 210 can be appropriately set so as to be a desired irradiation amount.
  • the thickness of the wall portion of the flow path 21 can be appropriately set according to the ultraviolet transmittance of the material constituting the flow path 21 and the like.
  • the length of the ultraviolet ray irradiation direction (vertical direction in FIG.
  • the length of the ultraviolet rays in the flow path 21 in the irradiation direction is preferably 100 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less, and particularly preferably 200 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • the shape of the flow path 21 is not limited to a cylindrical shape having only one flow path through which the blood 210 passes, and may be a rod body having a plurality of flow paths independent of each other.
  • the plurality of flow paths and the light source 25 in the rod body are arranged so that the ultraviolet rays from the light source 25 are irradiated to all the flow paths without passing through the other flow paths.
  • the shape of the flow path through which the blood 210 passes can be any shape.
  • the length in the irradiation direction of ultraviolet rays shall be in the range of 70 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, which is slightly larger than that of leukocytes as shown above.
  • the length in the so-called width direction which is orthogonal to the irradiation direction, is set to a range of 70 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, which is slightly larger than that of leukocytes.
  • the blood 210 extracted from the human body 200 by irradiating the blood 210 extracted from the human body 200 with light containing ultraviolet rays in the wavelength range of 260 nm or more and 320 nm or less, the blood 210 is contained in the blood 210 without using additives such as stimulants. Regulatory T cells can be induced.
  • a flow cytometer is a device that can examine the function and state of cells based on scattering and fluorescence. For example, as shown in FIG. 3, the flow cytometer can create a graph in which the horizontal axis is the degree of positivity for Foxp3 and the vertical axis is the degree of positivity for CD25.
  • This graph can be divided into four regions [1] to [4] as shown in the figure.
  • the upper right region [1] is a region positive for both Foxp3 and CD25, and it can be determined that the cells existing in this region [1] are regulatory T cells.
  • the upper left region [2] in FIG. 3 is a region negative for Foxp3 and positive for CD25, and the lower left region [3] is a region negative for both Foxp3 and CD25.
  • the lower right region [4] in FIG. 3 is a region positive for Foxp3 and negative for CD25.
  • the sample blood 210 passed through the flow path 21 which is a quartz capillary tube portion, ultraviolet rays were irradiated from the light source 25 which is an LED irradiator.
  • the irradiation wavelength was 290 nm.
  • the flow velocity of the sample blood 210 was set so that the irradiation amount of ultraviolet rays in the flow path 21 was 10 mJ / cm 2.
  • the group that was not irradiated with ultraviolet rays only by passing the sample blood 210 through the circulatory system was used as the comparison target group.
  • the sample blood 210 irradiated with ultraviolet rays and the sample blood 210 not irradiated with ultraviolet rays were collected, and a culture solution was added to each of them under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 day, 2 days and 3 days.
  • the cells were cultured for 5 days and 7 days.
  • CD4 positive cells were gated from whole blood by FACS analysis, and changes in CD25 and Foxp3 were examined.
  • FIGS. 4A and 4B The results are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • the upper part of FIG. 4A is the result of the sample not irradiated with ultraviolet rays
  • the lower part of FIG. 4A is the result of the sample irradiated with ultraviolet rays.
  • the results are shown 1 day, 2 days, 3 days, 5 days, and 7 days after the ultraviolet irradiation, respectively.
  • one dot corresponds to one cell.
  • FIG. 4B is a graph of the proportion of regulatory T cells (cells present in the region [1] of FIG. 3) positive for both Foxp3 and CD25.
  • the white bar graph is irradiated with ultraviolet light. It is the result of the sample not used, and the shaded bar graph is the result of the sample irradiated with ultraviolet rays.
  • the proportion of regulatory T cells was slightly increased by the culture, but did not exceed 10%.
  • the proportion of regulatory T cells increased from the 2nd day of culture and reached a peak (about 40%) in 3 days.
  • the number of regulatory T cells is clear in the UV-irradiated sample as compared with the UV-irradiated sample after 2 days of culture. It was confirmed that it increased to. That is, it was confirmed that the increase of regulatory T cells can be expected by irradiating the blood with ultraviolet rays.
  • the sample blood 210 passed through the flow path 21 which is a quartz capillary tube portion, ultraviolet rays were irradiated from the light source 25 which is an LED irradiator.
  • the irradiation wavelengths were 260 nm, 290 nm, 310 nm, and 365 nm. Further, the flow velocity of the sample blood 210 was set so that the irradiation amount [mJ / cm 2 ] of the ultraviolet rays in the flow path 21 was the irradiation amount shown in Table 1.
  • the sample blood 210 irradiated with ultraviolet rays was collected, a culture solution was added, and the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 2 days. According to the results of Experiment 1, a sample of this day was used because the effect of inducing regulatory T cells was clearly observed 2 days after the irradiation with ultraviolet rays. Then, by FACS analysis, CD4 positive cells were gated from whole blood, and the ratio of CD25 positive and Foxp3 positive cells was examined. The results are shown in FIG.
  • the horizontal axis is the irradiation amount of ultraviolet rays to be irradiated [mJ / cm 2 ], and the vertical axis is the ratio of regulatory T cells to all cells in the sample [%].
  • the curve a ( ⁇ ) shows the result of the wavelength of 260 nm
  • the curve b ( ⁇ ) shows the result of the wavelength of 290 nm
  • the curve c ( ⁇ ) shows the result of the wavelength of 310 nm
  • the curve d ( ⁇ ) shows the result of the wavelength of 365 nm.
  • the proportion of regulatory T cells is 3% to 8%. Therefore, if the proportion of regulatory T cells is 10% or more, it can be said that there is an effect of inducing regulatory T cells.
  • the proportion of regulatory T cells In the case of a wavelength of 365 nm, even if the irradiation amount was in the range of 10 mJ / cm 2 to 1200 mJ / cm 2 , the proportion of regulatory T cells hardly increased, and no inducing effect was observed. Further, at an irradiation amount of 10000 mJ / cm 2 , the irradiation could not be completed because the blood stuck at the time of light irradiation and a thrombus was formed.
  • the proportion of regulatory T cells is less than 10% in the region where the irradiation amount is 10 mJ / cm 2 or less, but in the region where the irradiation amount exceeds 10 mJ / cm 2 , regulatory T cells.
  • the ratio of swelling exceeded 10%, and the effect of induction was confirmed.
  • the irradiation amount was 1 mJ / cm 2 and the ratio of regulatory T cells exceeded 10%, and the effect of induction was confirmed.
  • the wavelength is 260 nm to 290 nm
  • the effect of inducing regulatory T cells can be obtained even with a small irradiation dose. That is, by using ultraviolet rays having a wavelength in the range of 260 nm to 290 nm, it is possible to shorten the irradiation time of the ultraviolet rays.
  • the method for inducing regulatory T cells in the present embodiment includes a step of extracting blood from a living body (human body) and a step of irradiating the extracted blood with ultraviolet rays in a specific wavelength range.
  • the ultraviolet rays irradiating the blood include ultraviolet rays in a wavelength range of 260 nm or more and 320 nm or less.
  • the blood extracted from the human body is simply irradiated with the ultraviolet rays, and the blood contains no additives such as stimulants.
  • Regulatory T cells can be induced.
  • Nucleic acid is known to have an absorption peak near a wavelength of 260 nm. Further, it is known that erythrocytes (hemoglobin) absorb more light having a wavelength shorter than 260 nm. Blood contains more red blood cells than white blood cells. When the ultraviolet rays irradiated to the blood are absorbed by the red blood cells, it is difficult to irradiate the leukocytes that are originally desired to act with the ultraviolet rays, and it is difficult to obtain the effect of inducing regulatory T cells.
  • the blood is irradiated with ultraviolet rays having a wavelength of 260 nm or more with the wavelength of 260 nm as the lower limit. Therefore, it is possible to irradiate ultraviolet rays having a large absorption by DNA and a small absorption by hemoglobin, and an appropriate effect of inducing regulatory T cells can be obtained.
  • the ultraviolet rays irradiated to the blood are ultraviolet rays in the wavelength range of 260 nm or more and 290 nm or less, as shown in FIG. 5, the effect of inducing regulatory T cells can be surely obtained even with a relatively small irradiation amount.
  • the ultraviolet irradiation time can be shortened.
  • the wavelength of the ultraviolet rays irradiated to the blood exceeds 290 nm (for example, when the wavelength is 310 nm)
  • the ultraviolet irradiation amount is 20 mJ / cm as shown in FIG. Must be 2 or more.
  • the method in the present embodiment does not irradiate ultraviolet rays through the skin of the human body as in a commonly used ultraviolet treatment device, but extracts (separates) blood from the human body and irradiates the ultraviolet rays outside the body. Therefore, the ultraviolet irradiation amount can be easily and appropriately set to a desired irradiation amount.
  • the method for inducing regulatory T cells in the present embodiment may include a step of culturing blood irradiated with ultraviolet rays in the specific wavelength range for 2 days or more.
  • culturing the blood irradiated with ultraviolet rays for 2 days or more regulatory T cells in the blood can be appropriately induced.
  • the blood irradiated with ultraviolet rays may be directly returned to the body without being cultured. In this case as well, induction of regulatory T cells in blood can be expected in the body.
  • blood extracted from the human body is introduced into the flow path 21 having a length of 70 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less in the irradiation direction of ultraviolet rays, and flows.
  • the blood introduced into the passage 21 may be irradiated with ultraviolet rays by passing through the wall portion of the flow path 21.
  • an environment in which the leukocytes are easily aligned along the longitudinal direction (blood flow direction) of the flow path 21 is created. be able to.
  • regulatory T cells in blood can be obtained only by irradiation with ultraviolet rays without requiring complicated treatment such as centrifugation and without using additives such as stimulants. Can be guided.

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Abstract

添加剤を用いることなく、制御性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。　制御性Ｔ細胞の誘導方法は、生体から血液を抽出する工程と、抽出された血液に対して２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射する工程と、を含む。好ましくは、紫外線を照射する工程では、抽出された血液に対して２６０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射する。上記の特定波長域の紫外線を血液に対して照射することで、生体から抽出された血液に物質を添加しなくとも制御性Ｔ細胞が誘導される。

Description

制御性Ｔ細胞の誘導方法
　本発明は、血液中の制御性Ｔ細胞を誘導する方法に関する。
　人体には、体外からの異物やウイルスからの侵入を防ぐための機構として免疫が備わっている。免疫には、外敵からの防御を担う細胞（エフェクターＴ細胞）と、その細胞の働きを抑制方向に調節する細胞（制御性Ｔ細胞）とが関与しており、両者のバランスが重要である。自己免疫疾患や、花粉症などのアレルギー疾患は、上記のバランスが崩れ、エフェクターＴ細胞が制御性Ｔ細胞に対して相対的に働きが強くなることにより生じることが分かってきている。
　そこで、近年、自己免疫疾患や、アレルギー疾患の治療のために、制御性Ｔ細胞を誘導する研究がなされている（例えば特許文献１、２、３参照）。
国際公開第２０１８／１１７０９０号公報 特開２０１９－０８０４９７号公報 特開２０１９－０５８１８２号公報
　しかしながら、上記各特許文献に記載されている方法は、いずれも血液に添加剤（例えば刺激物質など）を投与することにより制御性Ｔ細胞の誘導を行っている。このような添加剤は、制御性Ｔ細胞の誘導以外の点において、人体に与える影響について懸念がある。
　そこで、本発明は、添加剤を用いることなく、血液中の制御性Ｔ細胞を誘導する方法を提供することを課題としている。
　上記課題を解決するために、本発明に係る制御性Ｔ細胞の誘導方法の一態様は、生体から血液を抽出する工程と、抽出された前記血液に対して２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射する工程と、を含む。
　このように、生体（例えば人体）から抽出された血液に対して上記の特定波長域の紫外線を照射することのみで、血液中の制御性Ｔ細胞を誘導することができる。つまり、添加物を用いることなく血液中の制御性Ｔ細胞を誘導することができる。なお、制御性Ｔ細胞を誘導するとは、血液中のヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）における制御性Ｔ細胞（ＣＤ２５陽性、Ｆｏｘｐ３陽性細胞）の割合を増やすことをいう。
　また、上記の制御性Ｔ細胞の誘導方法において、前記紫外線を照射する工程では、前記抽出された血液に対して２６０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射してもよい。
　この場合、比較的少ない紫外線照射量であっても制御性Ｔ細胞を誘導することができる。したがって、紫外線の照射時間を短縮することができる。
　さらに、上記の制御性Ｔ細胞の誘導方法は、前記紫外線が照射された前記血液を２日以上培養する工程をさらに含んでもよい。
　この場合、血液中の制御性Ｔ細胞を適切に誘導することができる。
　また、上記の制御性Ｔ細胞の誘導方法は、前記抽出された血液を流路に導入する工程をさらに含み、前記紫外線を照射する工程は、前記流路内に導入された前記血液に対して前記流路の壁部を透過して前記紫外線を照射する工程であり、前記流路における前記紫外線の照射方向の長さが、７０μｍ以上５００μｍ以下であってよい。
　このように、紫外線の照射方向の長さが白血球よりも若干大きい流路に血液を導入することで、流路の長手方向（流通方向）に沿って白血球が整列されやすい環境を創出することができる。そのため、流路の壁部を透過した紫外線を適切に白血球に照射することができる。したがって、血液から白血球のみを分離して紫外線を照射するといった煩雑な血球分離処理が不要となる。
　本発明では、添加剤を用いることなく、制御性Ｔ細胞を誘導することができる。
　上記した本発明の目的、態様及び効果並びに上記されなかった本発明の目的、態様及び効果は、当業者であれば添付図面及び請求の範囲の記載を参照することにより下記の発明を実施するための形態（発明の詳細な説明）から理解できるであろう。
図１は、本実施形態における紫外線照射システムの構成例を示す図である。 図２は、本実施形態における紫外線照射装置の構成を模式的に示す図である。 図３は、Ｆｏｘｐ３およびＣＤ２５の陽性の度合い表すグラフの説明図である。 図４Ａは、紫外線照射後の制御性Ｔ細胞の変化を示す図である。 図４Ｂは、制御性Ｔ細胞の割合をグラフ化した図である。 図５は、制御性Ｔ細胞増加に関する紫外線の波長依存性を示す図である。
　以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
　本実施形態では、血液中の制御性Ｔ細胞を誘導する方法について説明する。
　図１は、本実施形態における紫外線照射システム１００の構成例を示す図である。
　紫外線照射システム１００は、生体（例えば、患者等の人体）２００から血液を抽出し、抽出した血液に特定波長域の紫外線を照射して制御性Ｔ細胞を誘導した後、当該血液を人体２００の体内に戻すシステムである。
　ここで、制御性Ｔ細胞を誘導するとは、血液中の制御性Ｔ細胞の割合、具体的にはＣＤ４陽性細胞中の制御性Ｔ細胞の割合を増やすことをいい、制御性Ｔ細胞の数を増やすこととエフェクターＴ細胞の数を減らすこととを含む。
　図1に示すように、紫外線照射システム１００は、血液抽出装置１０と、紫外線照射装置２０と、血液注入装置３０と、を備える。
　血液抽出装置１０は、人体２００から血液を抽出し、紫外線照射装置２０へ供給する。このとき紫外線照射装置２０に供給される血液は、血液成分が分離されていない血液（全血）である。
　紫外線照射装置２０は、血液抽出装置１０により抽出された血液に対して、２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射する。紫外線照射装置２０の具体的構成については後述する。
　血液注入装置３０は、紫外線照射装置２０により紫外線が照射された血液を人体２００に戻す。
　図２は、紫外線照射装置２０の構成を模式的に示す図である。
　紫外線照射装置２０は、流路２１と、入口側輸液チューブ２２と、出口側輸液チューブ２３と、輸送ポンプ２４と、光源２５と、供給用容器２６と、回収用容器２７と、を備える。
　流路２１は、紫外線透過性を有する材料により構成された細管であり、血液抽出装置１０により抽出された血液２１０が導入される。流路２１は、例えば石英細管である。流路２１は、例えば、長さ５０ｍｍ、外径３ｍｍ、内径０．３ｍｍ（３００μｍ）の円筒形状の細管とすることができる。
　入口側輸液チューブ２２は、流路２１の入口側に取り付けられ、出口側輸液チューブ２３は、流路２１の出口側に取り付けられている。各輸液チューブ２２、２３は、各々シリコンチューブにより構成することができる。
　輸送ポンプ２４は、入口側輸液チューブ２２に介在されている。例えば、輸送ポンプ２４は、ペリスタリックポンプよりなる。輸送ポンプ２４は、予め設定された流速で、血液２１０を、入口側輸液チューブ２２から流路２１を介して出口側輸液チューブ２３へと流す。
　光源２５は、流路２１の上部に設けられている。光源２５は、紫外線を含む光照射するＬＥＤ照射器とすることができる。具体的には、ＬＥＤ照射器２５のＬＥＤは、２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下、好ましくは２６０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の波長域の紫外線を含む光を放射する。光源２５から放射された紫外線は流路２１に照射され、流路２１の壁を透過して流路２１内の血液に照射される。
　なお、光源２５はＬＥＤ照射器に限定されるものではなく、ＸｅＣｌエキシマ放電ランプ、メタルハライドランプ、蛍光ランプ、水銀ランプなどであってもよい。また、光源２５は、線状光源であってもよいし、面状光源であってもよい。
　また、光源２５は、ＬＥＤ素子やランプから放射される光のうち、２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下、好ましくは２６０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の波長域の紫外線のみを透過し、それ以外の波長域の光を遮断する光学フィルタを備えていてもよい。
　供給用容器２６には、血液抽出装置１０により抽出された血液２１０が収容されている。供給用容器２６には、入口側輸液チューブ２２の入り口が差し込まれる。
　回収用容器２７には、出口側輸液チューブ２３の出口が差し込まれる。回収用容器２７は、流路２１内において紫外線が照射され、出口側輸液チューブ２３を輸送された血液２１０を回収する。
　以下、紫外線照射装置２０の基本動作について説明する。
　紫外線照射装置２０は、血液抽出装置１０により抽出された血液２１０を収容した供給用容器２６に入口側輸液チューブ２２の入り口が差し込まれ、出口側輸液チューブ２３の出口が回収用容器２７に差し込まれた状態で、輸液ポンプ２４を動作させる。すると、入口側輸液チューブ２２に供給用容器２６内の血液２１０が吸い上げられる。
　入口側輸液チューブ２２に吸い上げられた血液２１０は、石英細管からなる流路２１に導入される。このとき、予め設定された速度で、血液２１０が流路２１を流れる。
　次に、紫外線照射装置２０は、ＬＥＤ照射器からなる光源２５のＬＥＤを点灯し、流路２１内に導入された血液２１０に対して流路２１の壁部を透過して紫外線を照射する。
　流路２１内において紫外線が照射された血液２１０は、出口側輸液チューブ２３に送られ、出口側輸液チューブ２３から回収用容器２７に回収される。
　回収用容器２７に回収された血液２１０は、血液注入装置３０に送られ、血液注入装置３０から人体２００の体内に戻される。
　なお、本実施形態では、流路２１が石英ガラスよりなる細管である場合について説明するが、流路２１は、アルカリガラスや硼珪酸ガラスなどのガラスよりなる細管であってもよいし、シリコーン樹脂、シクロオレフィン樹脂（シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）やシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）など）、アクリル樹脂などの合成樹脂によりなる細管であってもよい。
　また、流路２１の形状は、上述したような形状に限定されるものではない。
　流路２１の長手方向（血液２１０の流通方向）の長さは、光源２５から放射される紫外線の強度や、流路２１内を流れる血液２１０の流速などに基づいて、流路２１内における血液２１０に対する紫外線の照射量が所望の照射量となるように適宜設定することができる。
　流路２１の壁部の厚さは、流路２１を構成する材料の紫外線透過率などに応じて適宜設定することができる。
　流路２１における紫外線の照射方向（図２における上下方向）の長さは、白血球よりも若干大きい７０μｍ以上５００μｍ以下の範囲であればよい。なお、流路２１における紫外線の照射方向の長さは、１００μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以上３００μｍ以下であることが特に好ましい。
　さらに、流路２１の形状は、血液２１０が通る流通路を１つのみ有する円筒形状に限定されるものではなく、互いに独立した流通路を複数有するロッド体であってもよい。この場合、ロッド体における複数の流通路と光源２５とは、全ての流通路について、他の流通路を介さないで光源２５からの紫外線が照射されるように配置する。
　また、血液２１０が通る流通路の形状は、任意の形状とすることができる。なお、流通路の形状を、断面が矩形状とする場合は、紫外線の照射方向の長さを、上記に示したように白血球よりも若干大きい７０μｍ以上５００μｍ以下の範囲とする。それとともに、長手方向に白血球が整列されやすい環境をつくるために、照射方向と直交する、いわゆる幅方向の長さについても、白血球よりも若干大きい７０μｍ以上５００μｍ以下の範囲とする。
　以上のように、人体２００から抽出された血液２１０に対して、２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の紫外線を含む光を照射することで、刺激物質などの添加物を用いることなく、血液２１０中の制御性Ｔ細胞を誘導することができる。
　近年の研究により、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３という因子とＣＤ２５という因子とについて、ともに陽性であり、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５とが陽性であれば、その細胞が制御性Ｔ細胞であることがわかってきている。
　また、フローサイトメーター（蛍光活性化セルソーター（Fluorescence Activated Cell Sorting：ＦＡＣＳ））を用いれば、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５とがともに陽性である細胞、即ち制御性Ｔ細胞が、調査するサンプルの全細胞に対してどの程度存在するかを図示することができる。
　フローサイトメーターは、散乱や蛍光に基づき細胞の機能や状態を調べることができる装置である。
　例えば、フローサイトメーターは、図３に示すように、横軸にＦｏｘｐ３に対する陽性の度合い、縦軸にＣＤ２５の陽性の度合いを取ったグラフを作ることができる。このグラフは、同図に示すように四つの領域［１］～［４］に分割することができる。ここで、右上の領域［１］は、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５との両方に陽性な領域であり、この領域［１］に存在する細胞は制御性Ｔ細胞であると判断することができる。
　なお、図３の左上の領域［２］は、Ｆｏｘｐ３に陰性であり、ＣＤ２５に陽性な領域であり、左下の領域［３］は、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５との両方に陰性な領域である。また、図３の右下の領域［４］は、Ｆｏｘｐ３に陽性であり、ＣＤ２５に陰性な領域である。
＜実験１＞
　本発明に基づく方法によって紫外線を照射した後の血液中の制御性Ｔ細胞の変化を確認するために、以下の実験を行った。
　図２に示す紫外線照射装置２０と同様の循環系を構築し、サンプル血液２１０を循環系に流した。サンプル血液２１０としては、ヒト末梢血をリン酸緩衝食塩水にて２０％に希釈したものを用いた。
　サンプル血液２１０が石英細管部分である流路２１を通過する際に、ＬＥＤ照射器である光源２５から紫外線を照射した。照射波長は２９０ｎｍとした。また、流路２１における紫外線の照射量が１０ｍＪ／ｃｍ２となるようにサンプル血液２１０の流速を設定した。
　また、サンプル血液２１０を上記循環系に通しただけで紫外線未照射の群を、比較対象群とした。
　紫外線を照射したサンプル血液２１０と、紫外線を未照射のサンプル血液２１０とを回収し、それぞれ、培養液を加えて３７℃５％ＣＯ２の条件下にて、１日、２日、３日、５日、７日間培養した。その後、ＦＡＣＳ解析により、全血からＣＤ４陽性細胞をゲーティングし、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３の変化を調べた。その結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。
　図４Ａの上段は紫外線を照射していないサンプルの結果、図４Ａの下段は紫外線を照射したサンプルの結果である。それぞれ、紫外線照射後の１日後、２日後、３日後、５日後、７日後の結果を示している。この図４Ａのグラフにおいて、各ドット１個が１個の細胞に対応している。
　図４Ｂは、制御性Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５との両方に陽性な細胞（図３の領域［１］に存在する細胞）の割合をグラフ化したものである。白抜きの棒グラフが紫外線を照射していないサンプルの結果であり、斜線の棒グラフが紫外線を照射したサンプルの結果である。図４Ｂの値はＮ＝３の平均値であり、エラーバーは標準偏差を示す。
　図４Ｂの結果からも明らかなように、紫外線を照射していないサンプルの場合、培養により制御性Ｔ細胞の割合はわずかに増加したものの、１０％を超えることはなかった。一方、紫外線を照射したサンプルでは、培養日数２日目から制御性Ｔ細胞の割合が増加し、３日でピーク（約４０％）に達した。
　このように、紫外線を照射したサンプルは、紫外線を照射していないサンプルを比較して、培養日数２日後以降、制御性Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５との両方に陽性な細胞）の数が、明らかに増加することが確認できた。即ち、血液に対して紫外線を照射することにより、制御性Ｔ細胞の増加が期待できることが確認できた。
＜実験２＞
　制御性Ｔ細胞増加に関する、血液に照射する紫外線の波長依存性を確認するために、以下の実験を行った。
　図２に示す紫外線照射装置２０と同様の循環系を構築し、サンプル血液２１０を循環系に流した。サンプル血液２１０としては、ヒト末梢血をリン酸緩衝食塩水にて２０％に希釈したものを用いた。
　サンプル血液２１０が石英細管部分である流路２１を通過する際に、ＬＥＤ照射器である光源２５から紫外線を照射した。照射波長は２６０ｎｍ、２９０ｎｍ、３１０ｎｍ、３６５ｎｍとした。また、流路２１における紫外線の照射量［ｍＪ／ｃｍ２］は、表１に示す照射量となるようにサンプル血液２１０の流速を設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　紫外線を照射したサンプル血液２１０を回収し、培養液を加えて３７℃５％ＣＯ２の条件下にて、２日間培養した。実験１の結果によれば、紫外線照射後、培養日数が２日後に、明らかに制御性Ｔ細胞の誘導効果が見られたため、この日のサンプルを用いた。
　その後、ＦＡＣＳ解析により、全血からＣＤ４陽性細胞をゲーティングし、ＣＤ２５陽性、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の割合を調べた。その結果を図５に示す。
　図５において、横軸は、照射する紫外線の照射量［ｍＪ／ｃｍ２］、縦軸は、サンプル内の全細胞に対する制御性Ｔ細胞の割合［％］である。
　この図５において、曲線ａ（■）は波長２６０ｎｍの結果、曲線ｂ（▲）は波長２９０ｎｍの結果、曲線ｃ（◆）は波長３１０ｎｍの結果、曲線ｄ（×）は波長３６５ｎｍの結果を示している。
　通常、制御性Ｔ細胞の割合は３％から８％である。そこで、制御性Ｔ細胞の割合が１０％以上になれば、制御性Ｔ細胞を誘導する効果があるといえる。
　波長３６５ｎｍの場合は、照射量１０ｍＪ／ｃｍ２～１２００ｍＪ／ｃｍ２の範囲で照射しても、制御性Ｔ細胞の割合はほとんど増加せず、誘導効果は見られなかった。また、照射量１００００ｍＪ／ｃｍ２においては、血液が光照射時に固着し血栓ができたことにより、照射を完了できなかった。
　一方で、波長３１０ｎｍの場合は、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ２以下の領域では制御性Ｔ細胞の割合が１０％未満であるが、照射量が１０ｍＪ／ｃｍ２を超える領域で、制御性Ｔ細胞の割合が１０％を超え、誘導の効果が認められた。
　さらに、波長２９０ｎｍ、２６０ｎｍの場合は、ともに照射量が１ｍＪ／ｃｍ２で制御性Ｔ細胞の割合が１０％を超え、誘導の効果が認められた。
　以上の結果より、波長２６０ｎｍから３１０ｎｍの領域の紫外線を照射することにより、制御性Ｔ細胞の誘導効果が得られることが確認できた。今回の試験ではＵＶＢ光源の代表光源として、ピーク波長３１０ｎｍでスペクトル半値幅が約２０ｎｍの光源を用いた。紫外線はＵＶＡ、ＵＶＢ、ＵＶＣに区分されており、各区分においては概ね類似した生体への作用を有する。そのため、ピーク波長３１０ｎｍでの効果が確認されたことから、同様にピーク波長３２０ｎｍまでは同様の効果が得られると考えられる。さらに、波長２６０ｎｍから２９０ｎｍの場合は、少ない照射量でも制御性Ｔ細胞の誘導効果が得られることが確認できた。つまり、波長２６０ｎｍから２９０ｎｍの範囲の紫外線を用いることにより、紫外線の照射時間の短縮化を図ることができる。
　以上説明したように、本実施形態における制御性Ｔ細胞の誘導方法は、生体（人体）から血液を抽出する工程と、抽出された血液に対して特定波長域の紫外線を照射する工程と、を含む。ここで、血液に対して照射する紫外線は、２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の紫外線を含む。
　このように、光エネルギーの比較的強いＵＶＢやＵＶＣの紫外線を用いることで、人体から抽出された血液に対して当該紫外線を照射するだけで、刺激物質などの添加剤を用いることなく血液中の制御性Ｔ細胞を誘導することができる。
　核酸（ＤＮＡ）は、波長２６０ｎｍ付近に吸収ピークを有することが知られている。また、赤血球（ヘモグロビン）は、波長２６０ｎｍよりも短波長の光に対して吸収が大きくなることが知られている。血液中には、白血球に比して赤血球が多く含有されている。血液に対して照射した紫外線が赤血球に吸収されてしまうと、本来作用させたい白血球に紫外線が照射されにくく、制御性Ｔ細胞の誘導効果が得られにくい。
　本実施形態では、波長２６０ｎｍを下限として、血液に対して波長２６０ｎｍ以上の紫外線を照射する。したがって、ＤＮＡによる吸収が大きく、ヘモグロビンによる吸収が小さい紫外線を照射することができ、適切に制御性Ｔ細胞の誘導効果を得ることができる。
　また、血液に対して照射する紫外線を２６０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の波長域の紫外線とすれば、図５に示すように、比較的少ない照射量でも確実に制御性Ｔ細胞の誘導効果が得られるため、紫外線照射時間を短縮することができる。
　なお、血液に対して照射する紫外線の波長が２９０ｎｍを超える場合（例えば３１０ｎｍの場合）、制御性Ｔ細胞の誘導効果を得るためには、図５に示すように、紫外線照射量を２０ｍＪ／ｃｍ２以上とする必要がある。本実施形態における方法は、一般的に用いられているような紫外線治療器のように人体の皮膚を通して紫外線を照射するものではなく、人体から血液を抽出（分離）して体外にて紫外線を照射するので、紫外線照射量を所望の照射量に容易かつ適切に設定することができる。
　さらに、本実施形態における制御性Ｔ細胞の誘導方法は、上述したように、上記の特定波長域の紫外線を照射した血液を２日以上培養する工程を含んでいてもよい。紫外線を照射した血液を２日以上培養することで、血液中の制御性Ｔ細胞を適切に誘導することができる。
　なお、紫外線を照射した血液を培養せずに直接体内に戻してもよい。この場合にも、体内において血液中の制御性Ｔ細胞の誘導が期待できる。
　また、本実施形態における制御性Ｔ細胞の誘導方法においては、上述したように、人体から抽出された血液を、紫外線の照射方向の長さが７０μｍ以上５００μｍ以下の流路２１に導入し、流路２１内に導入された血液に対して流路２１の壁部を透過して紫外線を照射してもよい。
　このように、血液を導入する流路２１の大きさを白血球の大きさよりも若干大きくすることで、流路２１の長手方向（血液の流通方向）に沿って白血球が整列されやすい環境を創出することができる。そのため、流路２１の壁部を透過した紫外線が流路２１内を流れる血液中の赤血球によって吸収されることを抑制し、白血球に適切に照射させることができる。したがって、遠心分離により血液中の赤血球と白血球とを分離し、白血球のみを取り出して紫外線を照射するといった煩雑な血球分離処理が不要となる。
　以上のように、本実施形態においては、遠心分離などの煩雑な処理を必要とすることなく、また、刺激物質などの添加剤を用いることなく、紫外線照射のみにより血液中の制御性Ｔ細胞を誘導することができる。
　なお、上記において特定の実施形態が説明されているが、当該実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定する意図はない。本明細書に記載された装置及び方法は上記した以外の形態において具現化することができる。また、本発明の範囲から離れることなく、上記した実施形態に対して適宜、省略、置換及び変更をなすこともできる。かかる省略、置換及び変更をなした形態は、請求の範囲に記載されたもの及びこれらの均等物の範疇に含まれ、本発明の技術的範囲に属する。
　１０…血液抽出装置、２０…紫外線照射装置、２１…流路、２２…入口側輸液チューブ、２３…出口側輸液チューブ、２４…輸送ポンプ、２５…光源、２６…供給用容器、２７…回収用容器、３０…血液注入装置、１００…紫外線照射システム、２００…人体、２１０…血液

 

Claims (4)

  1. 　生体から血液を抽出する工程と、
    　抽出された前記血液に対して２６０ｎｍ以上３２０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射する工程と、を含むことを特徴とする制御性Ｔ細胞の誘導方法。
  2. 　前記紫外線を照射する工程では、
    　前記抽出された血液に対して２６０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の波長域の紫外線を照射することを特徴とする請求項１に記載の制御性Ｔ細胞の誘導方法。
  3. 　前記紫外線が照射された前記血液を２日以上培養する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の制御性Ｔ細胞の誘導方法。
  4. 　前記抽出された血液を流路に導入する工程をさらに含み、
    　前記紫外線を照射する工程は、
    　前記流路内に導入された前記血液に対して前記流路の壁部を透過して前記紫外線を照射する工程であり、
    　前記流路における前記紫外線の照射方向の長さが、７０μｍ以上５００μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の制御性Ｔ細胞の誘導方法。
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