CN115349011A - 调节性t细胞的诱导方法 - Google Patents

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CN115349011A CN202180024409.5A CN202180024409A CN115349011A CN 115349011 A CN115349011 A CN 115349011A CN 202180024409 A CN202180024409 A CN 202180024409A CN 115349011 A CN115349011 A CN 115349011A
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森田明理
益田秀之
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Abstract

本发明提供在不使用添加剂的情况下诱导调节性T细胞的方法。调节性T细胞的诱导方法包括从生物体抽取血液的步骤和对抽取的血液照射260nm以上且320nm以下的波长范围的紫外线的步骤。优选在照射紫外线的步骤中对抽取的血液照射260nm以上且290nm以下的波长范围的紫外线。通过对血液照射上述特定波长范围的紫外线,即使不向从生物体抽取的血液中添加物质也可诱导调节性T细胞。

Description

调节性T细胞的诱导方法
技术领域
本发明涉及诱导血液中的调节性T细胞的方法。
背景技术
人体具有免疫作为用于防止异物、病毒从体外侵入的机制。负责防御外敌的细胞(效应T细胞)与将该细胞的功能调节为抑制方向的细胞(调节性T细胞)参与免疫,两者的平衡是重要的。已知自身免疫疾病、花粉症等过敏性疾病是由于上述平衡被破坏、效应T细胞相对于调节性T细胞功能相对变强而产生的。
因此,近年来,为了治疗自身免疫疾病、过敏疾病,进行了诱导调节性T细胞的研究(例如参照专利文献1、2、3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2018/117090号公报
专利文献2:日本特开2019-080497号公报
专利文献3:日本特开2019-058182号公报
发明内容
发明所要解决的问题
但是,上述各专利文献记载的方法均通过对血液给予添加剂(例如刺激物质等)来进行调节性T细胞的诱导。这样的添加剂在调节性T细胞的诱导以外的方面,担心对人体产生影响。
因此,本发明的目的在于提供在不使用添加剂的情况下诱导血液中的调节性T细胞的方法。
用于解决问题的方法
为了解决上述问题,本发明的调节性T细胞的诱导方法的一个方式包括从生物体抽取血液的步骤和对抽取的上述血液照射260nm以上且320nm以下的波长范围的紫外线的步骤。
像这样,仅通过对从生物体(例如人体)抽取的血液照射上述特定波长范围的紫外线,就能够诱导血液中的调节性T细胞。即,可以在不使用添加物的情况下诱导血液中的调节性T细胞。需要说明的是,诱导调节性T细胞是指增加血液中的辅助性T细胞(CD4阳性细胞)中的调节性T细胞(CD25阳性、Foxp3阳性细胞)的比例。
另外,在上述的调节性T细胞的诱导方法中,在上述照射紫外线的步骤中,可以对上述抽取的血液照射260nm以上且290nm以下的波长范围的紫外线。
这种情况下,即使是比较少的紫外线照射量,也能够诱导调节性T细胞。因此,能够缩短紫外线的照射时间。
此外,上述调节性T细胞的诱导方法还包括将照射了上述紫外线的上述血液培养2天以上的步骤。
这种情况下,能够适当地诱导血液中的调节性T细胞。
另外,上述调节性T细胞的诱导方法还包括将上述抽取的血液导入到流道中的步骤,上述照射紫外线的步骤是透过上述流道的壁部对导入到上述流道内的上述血液照射上述紫外线的步骤,上述流道中的上述紫外线的照射方向的长度可以为70μm以上且500μm以下。
像这样,通过将血液导入到紫外线的照射方向的长度比白细胞略大的流道中,能够创造出白细胞容易沿着流道的长度方向(流通方向)排列的环境。因此,能够使透过流道的壁部的紫外线适当地照射到白细胞。因此,不需要从血液中仅分离白细胞并照射紫外线这样繁杂的血细胞分离处理。
发明效果
在本发明中,能够在不使用添加剂的情况下诱导调节性T细胞。
本领域技术人员通过参照附图和权利要求书的记载,能够从下述的具体实施方式(发明的详细说明)理解上述本发明的目的、方式和效果以及上文没有记载的本发明的目的、方式和效果。
附图说明
图1为表示本实施方式的紫外线照射系统的构成例的图。
图2为示意地表示本实施方式的紫外线照射装置的构成的图。
图3为表示Foxp3和CD25的阳性的程度的图表的说明图。
图4A为表示紫外线照射后的调节性T细胞的变化的图。
图4B为将调节性T细胞的比例图表化而得到的图。
图5为表示与调节性T细胞增加相关的紫外线的波长依赖性的图。
具体实施方式
以下,根据附图对本发明的实施方式进行说明。
在本实施方式中,对诱导血液中的调节性T细胞的方法进行说明。
图1为表示本实施方式的紫外线照射系统100的构成例的图。
紫外线照射系统100是如下系统:从生物体(例如患者等人体)200抽取血液,对抽取的血液照射特定波长范围的紫外线而诱导调节性T细胞后,将该血液返回到人体200的体内。
在此,诱导调节性T细胞是指增加血液中的调节性T细胞的比例、具体而言增加CD4阳性细胞中的调节性T细胞的比例,包括增加调节性T细胞的数量和减少效应T细胞的数量。
如图1所示,紫外线照射系统100具有血液抽取装置10、紫外线照射装置20和血液注入装置30。
血液抽取装置10从人体200抽取血液,并向紫外线照射装置20供给。此时,供给到紫外线照射装置20的血液为血液成分未被分离的血液(全血)。
紫外线照射装置20对利用血液抽取装置10抽取的血液照射260nm以上且320nm以下的波长范围的紫外线。关于紫外线照射装置20的具体构成,将在后面叙述。
血液注入装置30将利用紫外线照射装置20照射了紫外线的血液返回到人体200。
图2为示意地表示紫外线照射装置20的构成的图。
紫外线照射装置20具备流道21、入口侧输液管22、出口侧输液管23、输送泵24、光源25、供给用容器26和回收用容器27。
流道21为由具有紫外线透过性的材料构成的细管,被导入由血液抽取装置10抽取的血液210。流道21例如为石英细管。流道21例如可以为长度50mm、外径3mm和内径0.3mm(300μm)的圆筒形状的细管。
入口侧输液管22安装在流道21的入口侧,出口侧输液管23安装在流道21的出口侧。各输液管22、23可以分别由硅胶管构成。
输送泵24夹设在入口侧输液管22之间。例如,输送泵24由蠕动泵构成。输送泵24以预先设定的流速使血液210从入口侧输液管22经由流道21流向出口侧输液管23。
光源25设置在流道21的上部。光源25可以设定为照射包含紫外线的光的LED照射器。具体而言,LED照射器25的LED放射包含260nm以上且320nm以下、优选260nm以上且290nm以下的波长范围的紫外线的光。从光源25放射的紫外线照射到流道21,透过流道21的壁照射到流道21内的血液。
需要说明的是,光源25不限于LED照射器,可以为XeCl准分子放电灯、金属卤化物灯、荧光灯、汞灯等。另外,光源25可以为线状光源,也可以为面状光源。
另外,光源25可以具备仅使从LED元件、灯放射的光中260nm以上且320nm以下、优选260nm以上且290nm以下的波长范围的紫外线透过、并遮断除此以外的波长范围的光的滤光器。
在供给用容器26中收容有利用血液抽取装置10抽取的血液210。入口侧输液管22的入口被插入在供给用容器26中。
出口侧输液管23的出口被插入在回收用容器27中。回收用容器27回收在流道21内被照射紫外线并从出口侧输液管23输送的血液210。
以下,对紫外线照射装置20的基本工作进行说明。
紫外线照射装置20在入口侧输液管22的入口被插入在收容有利用血液抽取装置10抽取的血液210的供给用容器26中、出口侧输液管23的出口被插入在回收用容器27中的状态下,使输液泵24工作。这样,供给用容器26内的血液210被吸到入口侧输液管22中。
被吸到入口侧输液管22中的血液210被导入到由石英细管构成的流道21中。此时,血液210以预先设定的速度从流道21流动。
接着,紫外线照射装置20点亮包含LED照射器的光源25的LED,透过流道21的壁部对导入到流道21内的血液210照射紫外线。
在流道21内被照射了紫外线的血液210被送到出口侧输液管23中,从出口侧输液管23被回收到回收用容器27中。
被回收到回收用容器27中的血液210被送到血液注入装置30中,从血液注入装置30返回到人体200的体内。
需要说明的是,在本实施方式中,对流道21为由石英玻璃构成的细管的情况进行说明,但流道21可以为由碱玻璃、硼硅酸玻璃等玻璃构成的细管,也可以为由有机硅树脂、环烯烃树脂(环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)等)、丙烯酸类树脂等合成树脂构成的细管。
另外,流道21的形状不限于如上所述的形状。
流道21的长度方向(血液210的流通方向)的长度可以根据从光源25放射的紫外线的强度、在流道21内流动的血液210的流速等适当地设定,以使对流道21内的血液210的紫外线的照射量成为期望的照射量。
流道21的壁部的厚度可以根据构成流道21的材料的紫外线透过率等适当设定。
流道21中的紫外线的照射方向(图2中的上下方向)的长度只要是比白细胞略大的70μm以上且500μm以下的范围即可。需要说明的是,流道21中的紫外线的照射方向的长度优选为100μm以上且300μm以下,特别优选为200μm以上且300μm以下。
此外,流道21的形状不限于仅具有一个血液210所通过的流通路的圆筒形状,也可以为具有多个相互独立的流通路的杆体。这种情况下,杆体中的多个流通路和光源25以如下方式配置:对于全部流通路,都没有其它流通路介于之间地照射来自光源25的紫外线。
另外,血液210所通过的流通路的形状可以为任意的形状。需要说明的是,在将流通路的形状设定为截面为矩形的情况下,将紫外线的照射方向的长度如上所述设定为比白细胞略大的70μm以上且500μm以下的范围。与此同时,为了形成白细胞容易沿着长度方向排列的环境,对于与照射方向正交的所谓宽度方向的长度,也设定为比白细胞略大的70μm以上且500μm以下的范围。
如上所述,通过对从人体200抽取的血液210照射包含260nm以上且320nm以下的波长范围的紫外线的光,能够在不使用刺激物质等添加物的情况下诱导血液210中的调节性T细胞。
根据近年来的研究可知,调节性T细胞对于Foxp3这样的因子和CD25这样的因子均为阳性,如果Foxp3和CD25为阳性,则该细胞为调节性T细胞。
另外,如果使用流式细胞仪(荧光激活细胞分选(Fluorescence Activated CellSorting:FACS)),则能够图示Foxp3和CD25均为阳性的细胞、即调节性T细胞相对于要调查的样品的全部细胞以何种程度存在。
流式细胞仪是能够基于散射、荧光对细胞的功能、状态进行调查的装置。
例如,如图3所示,流式细胞仪可以制作横轴取相对于Foxp3的阳性的程度、纵轴取CD25的阳性的程度的图表。如该图中所示,该图表可以分割为四个区域[1]~[4]。在此,右上的区域[1]为对Foxp3和CD25这两者为阳性的区域,可以判断在该区域[1]中存在的细胞为调节性T细胞。
需要说明的是,图3的左上的区域[2]为对Foxp3为阴性且对CD25为阳性的区域,左下的区域[3]为对Foxp3和CD25这两者为阴性的区域。另外,图3的右下的区域[4]为对Foxp3为阳性且对CD25为阴性的区域。
<实验1>
为了通过基于本发明的方法确认照射紫外线后的血液中的调节性T细胞的变化,进行以下的实验。
构建与图2所示的紫外线照射装置20同样的循环系统,使样品血液210流入循环系统中。作为样品血液210,使用利用磷酸缓冲盐水将人外周血稀释至20%而得到的血液。
在样品血液210从作为石英细管部分的流道21通过时,从作为LED照射器的光源25照射紫外线。将照射波长设定为290nm。另外,以使流道21中的紫外线的照射量为10mJ/cm2的方式设定样品血液210的流速。
另外,将使样品血液210仅通过上述循环系统而未照射紫外线的组作为比较对象组。
回收照射了紫外线的样品血液210和未照射紫外线的样品血液210,分别加入培养液,在37℃、5%CO2的条件下,培养1天、2天、3天、5天、7天。然后,通过FACS分析,从全血对CD4阳性细胞进行设门,调查CD25、Foxp3的变化。将其结果示于图4A和图4B。
图4A的上段为未照射紫外线的样品的结果,图4A的下段为照射了紫外线的样品的结果。分别示出紫外线照射后的1天后、2天后、3天后、5天后、7天后的结果。在该图4A的图表中,各1个点对应于1个细胞。
图4B为对调节性T细胞(对Foxp3和CD25这两者为阳性的细胞(图3的区域[1]中存在的细胞)的比例进行图表化而得到的图。白色的柱状图为未照射紫外线的样品的结果,斜线的柱状图为照射了紫外线的样品的结果。图4B的值为N=3的平均值,误差棒表示标准偏差。
由图4B的结果也可知,在未照射紫外线的样品的情况下,虽然通过培养使调节性T细胞的比例稍微增加,但未大于10%。另一方面,在照射了紫外线的样品中,从培养天数第2天开始,调节性T细胞的比例增加,在3天达到峰值(约40%)。
像这样,将照射了紫外线的样品与未照射紫外线的样品进行比较,可以确认在培养天数2天后以后,调节性T细胞(对Foxp3和CD25这两者为阳性的细胞)的数量明显增加。即,可以确认通过对血液照射紫外线,能够期待调节性T细胞的增加。
<实验2>
为了确认与调节性T细胞增加相关的、对血液照射的紫外线的波长依赖性,进行以下的实验。
构建与图2所示的紫外线照射装置20同样的循环系统,使样品血液210流入循环系统中。作为样品血液210,使用利用磷酸缓冲盐水将人外周血稀释至20%而得到的血液。
在样品血液210从作为石英细管部分的流道21通过时,从作为LED照射器的光源25照射紫外线。照射波长设定为260nm、290nm、310nm、365nm。另外,以使流道21中的紫外线的照射量[mJ/cm2]成为表1所示的照射量的方式设定样品血液210的流速。
[表1]
Figure BDA0003864071220000101
回收照射了紫外线的样品血液210,加入培养液,在37℃、5%CO2的条件下培养2天。根据实验1的结果,在紫外线照射后、培养天数为2天后,明显看到调节性T细胞的诱导效果,因此使用该天的样品。
然后,通过FACS分析,从全血对CD4阳性细胞进行设门,调查CD25阳性、Foxp3阳性细胞的比例。将其结果示于图5。
在图5中,横轴为照射的紫外线的照射量[mJ/cm2],纵轴为调节性T细胞相对于样品内的全部细胞的比例[%]。
在该图5中,曲线a(■)表示波长260nm的结果,曲线b(▲)表示波长290nm的结果,曲线c(◆)表示波长310nm的结果,曲线d(×)表示波长365nm的结果。
通常,调节性T细胞的比例为3%至8%。因此,如果调节性T细胞的比例为10%以上,则可以说具有诱导调节性T细胞的效果。
在波长为365nm的情况下,即使在照射量为10mJ/cm2~1200mJ/cm2的范围内进行照射,调节性T细胞的比例也几乎不增加,未发现诱导效果。另外,在照射量为10000mJ/cm2时,由于血液在光照射时固着而形成血栓,因此不能完成照射。
另一方面,在波长为310nm的情况下,在照射量为10mJ/cm2以下的区域中,调节性T细胞的比例小于10%,但在照射量大于10mJ/cm2的区域中,调节性T细胞的比例大于10%,确认到诱导的效果。
此外,在波长为290nm、260nm的情况下,照射量为1mJ/cm2时,调节性T细胞的比例均大于10%,确认到诱导的效果。
由以上结果能够确认,通过照射波长为260nm~310nm的区域的紫外线,能够得到调节性T细胞的诱导效果。在本次试验中,作为UVB光源的代表光源,使用峰波长为310nm、光谱半峰宽为约20nm的光源。紫外线被划分为UVA、UVB、UVC,在各划分中具有大致类似的对生物体的作用。因此,由于确认到峰波长310nm下的效果,因此认为,同样地直至峰波长320nm可以得到同样的效果。此外可以确认,在波长260nm~290nm的情况下,即使照射量少,也可以得到调节性T细胞的诱导效果。即,通过使用波长为260nm~290nm范围的紫外线,能够缩短紫外线的照射时间。
如以上说明的那样,本实施方式中的调节性T细胞的诱导方法包括从生物体(人体)抽取血液的步骤和对抽取的血液照射特定波长范围的紫外线的步骤。在此,对血液照射的紫外线包含260nm以上且320nm以下的波长范围的紫外线。
像这样,通过使用光能比较强的UVB、UVC的紫外线,仅对从人体抽取的血液照射该紫外线,就能够在不使用刺激物质等添加剂的情况下诱导血液中的调节性T细胞。
已知核酸(DNA)在波长260nm附近具有吸收峰。另外,已知红细胞(血红蛋白)对波长比260nm短的波长的光的吸收变大。在血液中,与白细胞相比,含有更多的红细胞。对血液照射的紫外线被红细胞吸收时,紫外线难以照射到本来想要作用的白细胞,难以得到调节性T细胞的诱导效果。
在本实施方式中,以波长260nm为下限,对血液照射波长为260nm以上的紫外线。因此,能够照射基于DNA的吸收大、基于血红蛋白的吸收小的紫外线,能够适当地得到调节性T细胞的诱导效果。
另外,如果将对血液照射的紫外线设定为260nm以上且290nm以下的波长范围的紫外线,则如图5所示,即使照射量比较少也能够可靠地得到调节性T细胞的诱导效果,因此能够缩短紫外线照射时间。
需要说明的是,在对血液照射的紫外线的波长大于290nm的情况下(例如在310nm的情况下),为了得到调节性T细胞的诱导效果,如图5所示,需要使紫外线照射量为20mJ/cm2以上。本实施方式的方法不是像一般使用的紫外线治疗器那样通过人体的皮肤照射紫外线,而是从人体抽取(分离)血液并在体外照射紫外线,因此能够将紫外线照射量容易且适当地设定为期望的照射量。
此外,如上所述,本实施方式中的调节性T细胞的诱导方法可以包括将照射了上述特定波长范围的紫外线的血液培养2天以上的步骤。通过将照射了紫外线的血液培养2天以上,能够适当地诱导血液中的调节性T细胞。
需要说明的是,可以不培养照射了紫外线的血液而直接返回到体内。这种情况下,也能够期待在体内诱导血液中的调节性T细胞。
另外,在本实施方式的调节性T细胞的诱导方法中,如上所述,可以将从人体抽取的血液导入到紫外线的照射方向的长度为70μm以上且500μm以下的流道21中,透过流道21的壁部对导入到流道21内的血液照射紫外线。
像这样,通过使导入血液的流道21的大小比白细胞的大小略大,能够创造出白细胞容易沿着流道21的长度方向(血液的流通方向)排列的环境。因此,能够抑制透过流道21的壁部的紫外线被在流道21内流动的血液中的红细胞吸收,能够适当地照射到白细胞。因此,不需要通过离心分离将血液中的红细胞与白细胞分离、只取出白细胞并照射紫外线这样繁杂的血细胞分离处理。
如上所述,在本实施方式中,不需要离心分离等繁杂的处理,另外,能够在不使用刺激物质等添加剂的情况下,仅通过紫外线照射来诱导血液中的调节性T细胞。
需要说明的是,在上述中说明了特定的实施方式,但该实施方式仅是例示,并不意图限定本发明的范围。本说明书中记载的装置和方法可以在上述以外的方式中具体化。另外,也可以在不脱离本发明的范围的情况下对上述实施方式适当进行省略、置换和变更。进行了这样的省略、置换和变更的方式包含在权利要求书所记载的内容以及它们的均等物的范畴内,属于本发明的技术范围。
符号说明
10…血液抽取装置、20…紫外线照射装置、21…流道、22…入口侧输液管、23…出口侧输液管、24…输送泵、25…光源、26…供给用容器、27…回收用容器、30…血液注入装置、100…紫外线照射系统、
200…人体、210…血液

Claims (4)

1.一种调节性T细胞的诱导方法,其特征在于,包括:
从生物体抽取血液的步骤;和
对抽取的所述血液照射260nm以上且320nm以下的波长范围的紫外线的步骤。
2.如权利要求1所述的调节性T细胞的诱导方法,其特征在于,在所述照射紫外线的步骤中,对所述抽取的血液照射260nm以上且290nm以下的波长范围的紫外线。
3.如权利要求1或2所述的调节性T细胞的诱导方法,其特征在于,还包括将照射了所述紫外线的所述血液培养2天以上的步骤。
4.如权利要求1或2所述的调节性T细胞的诱导方法,其特征在于,
还包括将所述抽取的血液导入到流道中的步骤,
所述照射紫外线的步骤是透过所述流道的壁部对导入到所述流道内的所述血液照射所述紫外线的步骤,
所述流道中的所述紫外线的照射方向的长度为70μm以上且500μm以下。
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