WO2021245315A1 - Prevención y/o tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia - Google Patents

Prevención y/o tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia Download PDF

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WO2021245315A1
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galr2
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survival
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Manuel NARVAÉZ PELÁEZ
Miguel Ángel BARBANCHO FERNÁNDEZ
Natalia GARCÍA CASARES
Kjell Fuxe
Dasiel Óscar BORROTO ESCUELA
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Universidad De Málaga
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    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Definitions

  • the present invention belongs to the medical field. Particularly, the present invention refers to agonists of the galanin receptor 2 (GALR2) and agonists of the neuropeptide Y receptor Y1 (NPYY1 R), to be used, in combination, in the protection and neuronal survival, preferably in the prevention and / or the treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, such as Alzheimer's disease.
  • GLR2 galanin receptor 2
  • NPYY1 R neuropeptide Y receptor Y1
  • Central Nervous System (CNS) disorders including neurodevelopmental, psychiatric and neurodegenerative diseases, represent a high morbidity in terms of human suffering and economic cost. According to the WHO, each year 38.2% of the total EU population suffers from at least one CNS disorder, corresponding to approximately 164.7 million people.
  • dementia is a syndrome, generally of a chronic or progressive nature, characterized by the deterioration of cognitive function (that is, the ability to process thought) beyond what could be considered a consequence of normal aging.
  • Dementia affects memory, thinking, orientation, understanding, calculation, learning ability, language, and judgment. Consciousness is not affected.
  • Impairment of cognitive function is often accompanied, and sometimes preceded, by impairment of emotional control, social behavior, or motivation.
  • AD Alzheimer's disease
  • FDA Food and Drug Administration
  • drugs available for Alzheimer's patients are those that target the cholinergic system (for example, donepezil, tacrine, rivastigmine, and galantamine) or the glutamatergic system (for example, memantine ).
  • cholinergic system for example, donepezil, tacrine, rivastigmine, and galantamine
  • glutamatergic system for example, memantine
  • Brain-derived neurotrophic factor is a member of the neurotrophin family, which induces maintenance and repair of specific neuronal populations.
  • BDNF values are significantly reduced in the hippocampus and parietal cortex of Alzheimer's patients.
  • Neuropeptides and their receptors have received special attention as they emerge as important mediators of neuronal mechanisms in the hippocampus.
  • Neuropeptide Y is one of the most abundant neuropeptides in the central nervous system (CNS). It is a 36 amino acid polypeptide that is phylogenetically highly conserved, with a high concentration in various limbic and cortical regions.
  • NPYY1R NPYY1R
  • NPYY2 receptors are the ones that are mostly expressed in the hippocampus, and although NPYY1 R is found throughout the GD.
  • NPY is selectively released by GABAergic interneurons located in the hilus or polymorphic zone, which innervates the granule cell layer and the ZSG.
  • GAL Galanin
  • GALR1 Three GAL receptor subtypes have been described in the CNS, GALR1, GALR2, and GALR3.
  • the GALR2 receptor is widely expressed in the rat brain, where the hippocampus is among the areas of greatest expression.
  • GAL has recently been shown to interact with NPYY1R in several regions of the CNS associated with anxiety and depression, including the dorsal nucleus of the Rafe, nuclei of the amygdala, and in the ventral hippocampus.
  • the function of the The ventral hippocampus is associated with emotional processes, while the dorsal hippocampus is associated with cognitive and memory functions.
  • these effects have been shown to be mediated by GALR2 receptors (the effect of GAL is blocked by a specific GALR2 antagonist) and NPYY1 R receptors (using NPYY1R agonists, such as NPY, and blocking its effect by a specific antagonist of NPYY1 R). Therefore, similar effects to those obtained in the present invention would be expected with any GALR2 or NPYY1 R agonist.
  • Document ES2589165B2 refers to the effect on the ventral hippocampus and its possible therapeutic use in depression.
  • the effects on the ventral hippocampus have been shown to be related to mood disorders such as depression; however, actions in the dorsal hippocampus are associated with cognitive functions such as memory.
  • the present invention relates to the actions in the dorsal hippocampus and its possible therapeutic use in cognitive disorders associated with dementia.
  • document ES2644978B1 it has been described that said interaction occurs in the ventral hippocampus and in the short term, in minutes.
  • the present invention refers to said interaction, but produced in the dorsal hippocampus and in the medium / long term, in days or weeks.
  • a GALR2 agonist enhances the neuronal protection induced by an NPYY1 R agonist, creating a synergistic relationship between the two.
  • this effect is described both in the dorsal hippocampus in rats and in neuronal cultures of the hippocampus 24 hours after the administration of the corresponding agonists.
  • Evidence of the involvement of GALR2 receptors in GAL-mediated actions based on the use of M871, a specific GALR2 antagonist, is also shown. This increase in neuronal protection was evidenced by the detection of BDNF.
  • the combination of GALR2 and NPYY1 R agonists produces an increase in the expression of the anti-apoptotic protein BCL2, which is key to the survival of hippocampal neurons.
  • the data provided here allow proposing the therapeutic use of a GALR2 agonist in combination with an NPYY1 R agonist as a novel strategy in neuronal protection and survival, preferably in the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, such as Alzheimer disease.
  • the present invention refers to GALR2 agonists in combination with an NPYY1 R agonist, or analogues thereof, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates, or a pharmaceutical composition comprising them, to be used in neuronal protection and survival.
  • neuronal protection and survival is characterized or evidenced by a statistically significant increase in the expression or level of BDNF and / or BCL2 with respect to a pre-established threshold value (preferably observed in patients with neuronal involvement).
  • Figures 3 and 4 show that the number of pLA signals achieved with GAL treatment are similar to the control with CSF and when GAL + Y1 is combined a synergistic effect is achieved.
  • the co-administration of GAL with the Y1 agonist caused an antagonistic interaction, that is, in a manner contrary to that shown in the present invention.
  • These effects were observed at the level of central cardiovascular control in the nucleus of the solitary tract (Diaz-cabiale Z, 2006), in the regulation of intake in the hypothalamic arcuate nucleus (Parrado C, 2007) and in neurons of the dorsal raphe (Diaz -Cabiale Z, 2011).
  • the co-administration of GAL with the Y1 agonist achieves a synergistic effect on the expression of neuronal protective factors BDNF and neuronal survival factors BCL-2.
  • the present invention further includes the use of a combination comprising at least one GALR2 agonist and at least one NPYY1R agonist, or analogs thereof, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates. ; or alternatively "the compounds of the invention", in the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, preferably in the prevention and / or treatment of Alzheimer's disease.
  • the effect achieved in the present invention is due to the action of the agonists precisely on both targets (GALR2 and NPYY1R), and this can be achieved with any compound that is capable of acting as an agonist on them.
  • GALR2 agonists, or functional derivatives or fragments thereof are well known and commercially available, such as AR-M 1896, galanin (1-29), galanin, galanin (1-15), galanin (1-30), galanin (2-29), galnon, M1145, galmic, NAX5055, D-Gal (7-Ahp) -B2, galanin 2-11 amide, M1153, CYM2503.
  • GALR2 agonists are selected from those shown in the following document which is included by reference for the purpose of becoming part of the present disclosure: [Gundlach AL, Ryan PJ. Galanin receptors (version 2019.4) in the IUPHAR / BPS Guide to Pharmacology Database. IUPHAR / BPS Guide to Pharmacology CITE. 2019; 2019 (4). Available from: https://doi.org/10.2218/gtopdb/F27/2019.4j.
  • non-limiting examples of such NPYY1R agonists, or derivatives or functional fragments thereof are well known and commercially available, such as neuropeptide Y, [Leu31, Pro34] -neuropeptide Y.
  • NPYY1R agonists are selected from those shown in the following document which is included by reference for the purpose of being part of this description: [Beck-Sickinger A, Colmers WF, Cox HM, Doods HN, Herzog H, Larhammar D , Michel MC, Quirion R, Schwartz T, Westfall T. Neuropeptide Y receptors (version 2019.4) in the IUPHAR / BPS Guide to Pharmacology Database. IUPHAR / BPS Guide to Pharmacology CITE. 2019; 2019 (4). Available from: https://doi.org/10.2218/gtopdb/F46/2019.4j.
  • solvate includes both pharmaceutically acceptable solvates; that is, solvates that can be used in the manufacture of a medicament, such as pharmaceutically unacceptable solvates, that can be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable solvates or salts.
  • pharmaceutically acceptable solvate is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • the solvate is a hydrate.
  • the solvates can be obtained by conventional solvation methods known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to the use of a combination comprising a GALR2 agonist and an NPYY1 R agonist, or analogues thereof, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates, in the prevention and / or the treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, including symptomatic organic mental disorders.
  • these disorders may include, according to the International Classification of Diseases (ICD-10) system, the following: (FOO) Dementia in Alzheimer's disease. (FOO.O) Dementia in early-onset Alzheimer's disease. (FOO.1) Dementia in late-onset Alzheimer's disease. (FOO.2) Dementia in atypical or mixed Alzheimer's disease.
  • Vascular dementia Dementia in Alzheimer's disease, unspecified.
  • F01 Vascular dementia.
  • F01.0 Acute-onset vascular dementia.
  • F01.1 Multi-infarct dementia.
  • F01.2) Subcortical vascular dementia.
  • F01.3) Mixed cortical and subcortical vascular dementia.
  • F01.8 Other vascular dementia.
  • Vascular dementia unspecified.
  • the invention relates to the use of a combination comprising the compounds of the invention in the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia in Alzheimer's disease.
  • the use is preventive and the administration of the pharmaceutical composition comprising the compounds of the invention is carried out before the complete onset of cognitive impairment.
  • the use is preventive and the administration of the pharmaceutical composition comprising the compounds of the invention is carried out during the appearance of the first signs and / or symptoms of cognitive impairment.
  • the use is for the treatment and the administration of the pharmaceutical composition comprising the compounds of the invention is carried out during the appearance of the first signs and / or symptoms of cognitive impairment.
  • the use is for the treatment and the administration of the pharmaceutical composition comprising the compounds of the invention is carried out after the appearance of the first signs and / or symptoms of cognitive impairment.
  • GALR2 and / or NPYY1 R agonists, or their analogs, or their salts, esters, tautomers, solvates, or hydrates would preferably be in a substantially pure or pharmaceutically acceptable form, i.e., with a level of pharmaceutically acceptable purity and excluding normal pharmaceutical additives such as diluents and carriers, and excluding materials considered toxic at normal dosage levels.
  • Purity levels are preferably above 50%, more preferably above 70%, and still more preferably above 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95% in GALR2 and / or NPYY1 R agonists, or their analogues, or their salts, esters, tautomers, solvates or hydrates.
  • the present invention relates to the use of a combination comprising a GALR2 agonist and an NPYY1 R agonist, or their analogs, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • said pharmaceutical composition comprises GALR2 and NPYY1R agonists, or their analogues, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates, although said pharmaceutical composition may optionally comprise pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents or excipients.
  • a combination comprising a GALR2 agonist and an NPYY1 R agonist, or their analogues, or their salts, esters, tautomers, solvates or hydrates, pharmaceutically acceptable thereof, for the preparation of a pharmaceutical composition as indicated above, adapted for the simultaneous administration of the active ingredients.
  • said pharmaceutical compositions can contain the active ingredients within the same unit dosage form, for example in the same capsule or tablet.
  • Such unit dosage forms may contain the active ingredients as a homogeneous mixture or in separate compartments of the unit dosage form.
  • the present invention relates to the use of a combination comprising a GALR2 agonist and an NPYY1 R agonist, or their analogues, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates thereof, to the preparation of a pharmaceutical composition as above, adapted for the sequential administration of the active ingredients.
  • said pharmaceutical compositions may contain the active ingredients in individual unit dosage forms (pharmaceutical kit), for example individual tablets or capsules containing any of the active ingredients. These individual unit dosage forms can be contained in the same container or package, for example a blister pack.
  • pharmaceutical kit used in the document means a pharmaceutical composition that contains each of the active ingredients, but in individual unit dosage forms, and said active ingredients can be packaged together, for example in a blister, or not, in in which case the composition results from the combined use of said active ingredients, the term “combined use” being understood as the administration of the active ingredients in association with each other but not necessarily simultaneously.
  • an appropriate amount of the active principles is combined, in the form of a salt or in the form of a base, in an intimate mixture with a pharmaceutically acceptable carrier, which can take a great variety of forms depending on the desired preparation form for administration.
  • compositions are desirably in unit dosage form suitable for administration nasally, orally, rectally, percutaneously, or by parenteral injection.
  • any of the usual pharmaceutical media can be used, such as, for example, water, glycols, oils, alcohols and others in the case of oral liquid preparations such as suspensions, syrups , elixirs and solutions; or solid vehicles such as starches, sugars, kaolin, lubricants, binders, disintegrants and the like in the case of powders, pills, capsules and tablets. Because of their ease of administration, tablets and capsules represent the most advantageous oral dosage unit form, in which case solid pharmaceutical carriers are obviously used.
  • unit dosage form refers to physically separate units suitable as unit doses, in which each unit contains a predetermined quantity of active ingredient (s) calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the necessary pharmaceutical carrier.
  • examples of these dosage unit forms are tablets (including coated or scored tablets), capsules, lozenges, powder bags, wafers, injectable solutions or suspensions, teaspoons, tablespoons, and others, and segregated multiples of these. themselves.
  • the compound of the invention, or a pharmaceutical composition comprising a compound of the invention can be administered before, during or after the administration of the other active ingredient, provided that the time between the administration of the compound of the invention, or the pharmaceutical composition comprising a compound of the invention, and the administration of the other active ingredient is such that the ingredients are allowed to act synergistically in the CNS.
  • a composition may be particularly convenient containing both the compound of the invention and the other active principle.
  • Either the compound of the invention, or the pharmaceutical composition comprising a compound of the invention, and the other active ingredient can be administered separately in the form of suitable compositions.
  • Compositions can be prepared as described above.
  • the present invention also comprises products containing the compound of the invention, or the pharmaceutical composition comprising a compound of the invention, and the other active principle as a combination preparation for a simultaneous, independent or sequential use, separate or in prevention or the treatment of disorders and effects related to cognitive alterations, especially, memory impairment.
  • These products may comprise, for example, a kit comprising separate unit dosage forms containing the compound of the invention, or the pharmaceutical composition comprising a compound of the invention, and separate unit dosage forms containing the active ingredient, all this contained in the same package or container, for example, in a blister.
  • active substance means any component that potentially provides a pharmacological or other effect in diagnosis, cure, palliation, treatment or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the human body or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the manufacture of the drug and that are present in it in a modified and intended form that provides a specific activity or effect.
  • the first aspect of the present invention refers to a GALR2 agonist in combination with an NPYY1R agonist, or analogues thereof, or their salts, esters, tautomers, solvates or hydrates.
  • pharmaceutically acceptable to be used in neuronal protection and survival, preferably in the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, such as Alzheimer's disease.
  • the GALR2 agonist is selected from the following compounds: AR-M 1896, galanin, galanin (2-29), M1145, galanin 2-11 amide, M1153, CYM2503, functional derivatives or fragments of said products and the NPYY1R agonist is selected from the following compounds: neuropeptide Y, [Leu31, Pro34] -neuropeptide Y.
  • a second aspect of the present invention refers to a pharmaceutical composition or kit comprising a combination of a GALR2 agonist and an NPYY1R agonist, or analogues thereof, or their pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates or hydrates, to be used in neuronal protection and survival, preferably in the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, such as Alzheimer's disease.
  • the agonists are administered simultaneously, forming part of the same unit dosage form.
  • the agonists are administered sequentially, forming part of independent unit dosage forms.
  • a third aspect of the present invention refers to an in vitro method for the identification and / or production of compounds useful for neuronal protection and survival, preferably for the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, such as Alzheimer's disease, which comprises: a) measuring the level of expression of GALR2 and NPYY1 R after administering the candidate molecule and b) where, after administering the candidate molecule, the expression of GALR2 and NPYY1R are fully or partially activated statistically significant with respect to the expression before administering the candidate molecule, this is indicative that the candidate molecule is effective in the protection and neuronal survival, the prevention and / or the treatment of the cognitive deterioration associated with dementia syndromes, such as Alzheimer disease.
  • the method further comprises determining the neuronal protection and survival achieved by the candidate compound through of the identification of a statistically significant increase in the expression or level of BDNF and / or BCL2 with respect to a pre-established threshold value.
  • a fourth aspect of the present invention refers to an in vitro method for monitoring the response to a treatment for neuronal protection and survival, preferably for the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes, such as the disease of Alzheimer's disease, which comprises: a) measuring the level of expression of GALR2 and NPYY1R after administering the treatment and b) where, after administering the treatment, the level of expression of GALR2 and NPYY1 R is statistically activated totally or partially significant with respect to the expression before administering the treatment, this is indicative that the treatment is effective.
  • the method further comprises determining the neuronal protection and survival achieved by the candidate compound through the identification of a statistically significant increase in the expression or level of BDNF and / or BCL2 relative to a pre-established threshold value.
  • a fifth aspect of the present invention refers to a treatment method aimed at neuronal protection and survival, preferably at the prevention and / or treatment of cognitive impairment associated with dementia syndromes such as Alzheimer's disease, which comprises the administration to the patient a therapeutically effective dose of a pharmaceutical composition comprising a combination of GALR2 agonists and NPYY1 R agonists, preferably including pharmaceutically acceptable excipients.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to an excipient that can optionally be included in the compositions of the invention and that does not cause significant adverse toxicological effects for the patient.
  • therapeutically effective dose or amount of the composition of the invention is meant a dose that when administered elicits a positive therapeutic response in a subject suffering from the disease.
  • Figure 1 Analysis of neuronal protection mediated by GAL and an NPYY1 R agonist
  • FIG. 1 Study of the expression of the hippocampal survival factor BCL-2 mediated by GAL and a NPYY1R agonist
  • CSF artificial cerebrospinal fluid
  • GAL + Y1 Coadministration of Galanin and [Leu31-Pro34] NPY
  • GAL + Y1 + M871 Co-administration of GAL, [Leu31-Pro34] NPY and the GALR2 antagonist (M871).
  • FIG. 3 Detection of GALR2 / NPYY1 R heteroreceptor complexes with the Proximity Ligation Assay (ELP) in the rat dorsal hippocampus
  • ELP Proximity Ligation Assay
  • CSF artificial cerebrospinal fluid
  • GAL + Y1 Coadministration of Galanin and [Leu31-Pro34] NPY
  • GAL + Y1 + M871 Co-administration of GAL, [Leu31-Pro34] NPY and the GALR2 antagonist (M871).
  • CSF artificial cerebrospinal fluid
  • GAL + Y1 Coadministration of Galanin and [Leu31-Pro34] NPY
  • GAL + Y1 + M871 Co-administration of GAL, [Leu31-Pro34] NPY and the GALR2 antagonist (M871).
  • FIG. 5 Assessment of the intracellular MAPK cell growth pathway in hippocampal neuronal cultures by means of the level of induction of expression of an experimental plasmid that integrates the firefly luciferase gene as a gene reporter (pGL4-SRE-luc2p).
  • Control 50ng of internal control plasmid expressing Renilla luciferase (phRG-B).
  • the data is displayed as the Standard MeaniError of three independent experiments performed in triplicate. The following concentrations were used: M1145, 100 nM; M871, 1 mM; [Leu31-Pro34] NPY, 100 nM; BIBP3226, 1 mM; *** P ⁇ 0.001 M1145 versus Control and M1145 + M871. 1 1 1P ⁇ 0.001 Y1 versus Control
  • Figure 6 Object recognition test in a new location. It is observed how neither the individual intracerebroventricular (ICV) administration of Galanin nor the Y1 agonist Leu 31 -Pro 34 -NPY (both at 3nmol doses) modify the discrimination index with respect to the controls. However, significant differences (P ⁇ 0.05) were observed between the administration of GAL 3nmol and that of the Y1 agonist 3nmol. The co-administration of GAL and the Y1 agonist statistically significantly increases the discrimination index, compared to control animals (P ⁇ 0.01), the injection of GAL (P ⁇ 0.001) and the Y1 agonist (P ⁇ 0.05). ). This effect is blocked in the presence of the specific GAL type 2 receptor antagonist (M871 3nmol) (P ⁇ 0.05), demonstrating the participation of GALR2 in the interaction with Y1.
  • ICV intracerebroventricular
  • M871 3nmol specific GAL type 2 receptor antagonist
  • FIG. 7 Intranasal administration. After individual intranasal administration of the GALR2 agonist (M1145, 132 pg) and the Y1 agonist at 132 pg, no changes were observed in the discrimination index with respect to the controls, in the object recognition test in a new location. However, the co-administration of M1145 and the Y1 agonist statistically significantly increases the discrimination index, compared to the rest of the groups of treated animals (P ⁇ 0.05). This effect is blocked in the presence of the specific GAL type 2 receptor antagonist (M871 132 pg) (P ⁇ 0.05), demonstrating the specific participation of GALR2 in the interaction with Y1.
  • Intracerebral Cannulas A 22 gauge stainless steel chronic guide cannula (Plastics One In) was implanted in the right lateral cerebral ventricle to rats anesthetized intraperitoneally with Echitesin (3.3 ml / Kg). The following stereotaxic coordinates were used: + 1.4 mm lateral, -1 mm posterior to the bregma, and 3.6 mm below the surface of the skull. After surgery, the animals were housed individually and recovered for 7 days. This method of cannulation and postsurgical care has been previously standardized in our laboratory (Narváez et al., 2018).
  • Intracerebroventricular administration of peptides Cannulated rats were randomly assigned to different groups. The peptides were freshly prepared, dissolved in artificial cerebrospinal fluid (a CSF) and injected into the right lateral ventricle. The total volume was 5 ⁇ l per injection, with an infusion time of 1 minute.
  • Rats were anesthetized with sodium pentobarbital (Mebumal; 100 mg / kg, ip), intracardiacly perfused with 4% Paraformaldehyde (wt / vol, Sigma), and brains were removed for immunostaining. Correct cannula placement after icv injections was verified by cutting the brain in the coronal plane on a cryostat (HM550, Microm International). Brains were cut in a coronal plane and processed for immunostaining using previously published protocols (Narváez et al., 2018).
  • EDP In situ Proximity Bonding Assay
  • the in situ Proximity Bonding Assay (ELP) was performed as previously described (Narvaez et al. 2020). Suspension brain sections were incubated with blocking (5% goat serum) and permeabilization (0.3% newt X100 in PBS) solutions for 60 minutes each. Primary antibodies directed against GALR2 (rabbit, Alomone Lab, 1: 100) and NPYY1 R (goat, sc-21992 Santa Cruz Biotechnology INC, CA, 1: 200) were incubated for 24h. at 4 ° C.
  • ELP Duolink in situ Sigma detection kit ELP Duolink in situ Sigma detection kit
  • ELP PLUS or MINUS probes for rabbit or goat antibodies.
  • the sections were mounted on slides with fluorescent mounting medium (Dako) containing DAPI (1: 200), to stain the nuclei blue.
  • ELP signals were visualized and quantified using a TCS-SL confocal microscope (Leica) and the Duolink Image Tool software.
  • Example 1 Analysis of the neuronal protection factor BDNF mediated by GAL and the agonist NPYY1R
  • Figure 1 shows how the intracerebroventricular (icv) co-administration of GAL and the NPYY1R agonist enhances the expression of the neuronal protective factor BDNF in the dorsal hippocampus. Furthermore, it is shown that these effects are mediated by GALR2, as they are blocked in the presence of the specific GALR2 antagonist, M871.
  • Figure 1 (a) shows a representative diagram of the dorsal hippocampal areas where the expression of the neuronal protection factor BDNF has been analyzed. These effects have been demonstrated in the dentate gyrus (GD), CA1 and CA3.
  • Figure 1 (b) shows the quantification of neurons expressing BDNF in the dorsal hippocampus for the groups treated icv with artificial cerebrospinal fluid (Control), Galanin (GAL 3nmol), the agonist of Neuropeptide Y receptors Y1 (Y1 3nmol), the co-administration of both (GAL + Y1) and the co-administration in the presence of the specific antagonist GALR2 M871 (GAL + Y1 + M871). Data are represented as a percentage of the control group (100%). The icv administration of GAL does not modify the expression of BDNF in the dorsal hippocampus compared to control animals.
  • Figures 1 show representative photomicrographs of BDNF-labeled cells located in the dentate gyrus (GD), between the granule cell layer (Gcl) and the hilus (H).
  • White arrows indicate neurons that selectively express the neuronal protection factor BDNF. It is shown how the co-administration of both peptides, GAL and the Y1 agonist increases the detection of BDNF labeling ( Figure 1 d) compared to the control group ( Figure 1 c).
  • Example 2 Study of the expression of the hippocampal neuronal survival factor BCL-2 mediated by GAL and the aqonist NPYY1R
  • Figure 2 shows the potentiation of the expression of the neuronal survival factor BCL-2 in the dorsal hippocampus after intracerebroventricular (icv) co-administration of Galanin (GAL) and the Y1 receptor agonist of Neuropeptide Y (Y1). Furthermore, these effects are shown to be mediated by GALR2, as they are blocked in the presence of the specific GALR2 antagonist, M871.
  • Figure 2 (a) shows a representative diagram of the dorsal hippocampal areas where the expression of the neuronal survival factor BCL-2 has been analyzed. These effects have been demonstrated in the dentate gyrus (GD), CA1 and CA3.
  • Figure 2 (b) shows the quantification of neurons expressing BCL-2 in the dorsal hippocampus for the groups treated icv with artificial cerebrospinal fluid (Control), Galanin (GAL 3nmol), the agonist of Neuropeptide Y receptors Y1. (Y1 3nmol), the co-administration of both (GAL + Y1) and the co-administration in the presence of the specific antagonist GALR2 M871 (GAL + Y1 + M871). Data are represented as a percentage of the control group (100%). As with the expression of BDNF, the icv administration of GAL does not modify the expression of BCL-2 in the dorsal hippocampus compared to the control animals.
  • the administration of the Y1 agonist significantly (P ⁇ 0.01) increases the expression of BCL-2 in the dorsal hippocampus, compared to GAL and control animals. It is striking how the icv co-administration of GAL with the Y1 agonist significantly increases the expression of BCL-2 (P ⁇ 0.01), compared to the increase induced by the Y1 agonist alone. This effect is mediated by the GAL GALR2 receptors, since in the presence of the specific antagonist M871 the effect induced by the icv coinjection of GAL with the Y1 agonist is significantly (P ⁇ 0.01) blocked.
  • Figures 2 show representative photomicrographs of BCL-2-labeled neurons located in the dentate gyrus (GD), between the granule cell layer (Gcl) and the hilus (H).
  • White arrows indicate neurons that selectively express neuronal survival factor BCL-2. It is shown how the co-administration of both peptides, GAL and the Y1 agonist increases the detection of BCL-2 labeling ( Figure 2 d) compared to the control group ( Figure 2 c).
  • Example 3 Study of GALR2 / NPYY1R heteroreceptor complexes in the dorsal hippocampus of the rat.
  • GALR2 / NPYY1R heteroreceptor complexes have been detected with the proximity linkage assay (ELP) in the dorsal hippocampus.
  • Figure 3 shows a diagram with the presence of positive signals with ELP (red circles) in the different areas of the dorsal hippocampus, such as the dentate gyrus (GD), CA3 and CA1 and the absence of specific signals (blue circles) in the molecular layer of the GD and in the corpus callosum.
  • ELP proximity linkage assay
  • Figure 3 (b) shows how the co-administration of GAL and the NPYY1 R agonist increases the GALR2 / NPYY1R complexes. Furthermore, these effects are seen to be mediated by GALR2, as they are blocked in the presence of the specific GALR2 antagonist, M871.
  • Example 4 Study of GALR2 / NPYY1R heteroreceptor complexes in cultures of hippocampal neurons.
  • GALR2 / NPYY1R heteroreceptor complexes have been detected with the proximity linkage assay (ELP) in cultures of hippocampal neurons.
  • ELP proximity linkage assay
  • Hippocampal neurons showed a significant increase in GALR2 / NPYY1 R complexes (ELP circles) after co-administration of GAL and the NPYY1 R agonist [Figure 4 (a)]. Furthermore, these effects are seen to be mediated by GALR2, as they are blocked in the presence of the specific GALR2 antagonist, M871.
  • Figures 4 (b) and 4 (c) show a significant increase in the density of the positive circles in ELP, corresponding to the presence of GALR2 / NPYY1 R complexes, after treatment with GAL and with the NPYY1 agonist compared to the control group.
  • Example 5 Assessment of the intracellular MAPK cell growth pathway in hippocampal neuronal cultures using a chemical reporter.
  • Rat hippocampal neuronal cultures were cotransfected with 1 pg of firefly luciferase expressing the experimental plasmid (pGL4-SRE-luc2p) and 50ng of the internal control plasmid expressing Renilla luciferase (phRG-B). After 4 hours of incubation with the different agonists or antagonists, the luciferase activity was measured, observing how the co-administration of M1145 and the NPYY1R agonist enhances the expression of SRE ( Figure 5).
  • Recognition memory can be defined as the ability to discriminate the new from the familiar.
  • the protocol is adapted from Ennaceur and Delacour.
  • the open field consists of a black square (100 * 100 cm).
  • the day before the experiment the animals are habituated to the field for 10 minutes.
  • the animals are shown four different objects in terms of color and shape, but similar in size, and they are placed equidistant from the edges (10 cm).
  • the animal stands in the center of the field and is allowed to explore freely for 3 minutes.
  • An examination is considered when the animal's head is oriented towards the object and its nose is located less than 2 cm from it. 24 hours later the test is carried out (3 minutes), after exchanging one of the objects for another on the same side and the exploration time is measured.
  • results are expressed as the time exploring the new object in relation to the total exploration time (discrimination index). Data are expressed as the mean ⁇ the standard error of the mean. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by a Newman Keuls a posteriori test.

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Abstract

Prevención y/o tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia. La presente invención hace referencia a agonistas del receptor 2 de galanina (GALR2) y agonistas del receptor Y1 del neuropéptido Y (NPYY1R), y a composiciones farmacéuticas o kits que comprenden dichos agonistas para ser usados, en combinación, en la protección y supervivencia neuronal, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, preferentemente la enfermedad de Alzheimer. La presente invención incluye además un método in vitro para la identificación y/o producción de compuestos útiles en dicha indicación terapéutica y un método in vitro para monitorizar la respuesta a su tratamiento.

Description

PREVENCIÓN Y/O TRATAMIENTO DEL DETERIORO COGNITIVO ASOCIADO A
SÍNDROMES DE DEMENCIA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo médico. Particularmente, la presente invención hace referencia a agonistas del receptor 2 de galanina (GALR2) y agonistas del receptor Y1 del neuropéptido Y (NPYY1 R), para ser usados, en combinación, en la protección y supervivencia neuronal, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los trastornos del Sistema Nervioso Central (SNC), incluyendo enfermedades del neurodesarrollo, psiquiátricas y neurodegenerativas, representan una alta morbilidad en términos de sufrimiento humano y de coste económico. Según la OMS, cada año el 38,2% de la población total de la UE sufre como mínimo un trastorno del SNC, correspondiendo esto aproximadamente a 164,7 millones de personas.
Conforme establece la OMS, la demencia es un síndrome, generalmente de naturaleza crónica o progresiva, caracterizado por el deterioro de la función cognitiva (es decir, la capacidad para procesar el pensamiento) más allá de lo que podría considerarse una consecuencia del envejecimiento normal. La demencia afecta a la memoria, el pensamiento, la orientación, la comprensión, el cálculo, la capacidad de aprendizaje, el lenguaje y el juicio. La conciencia no se ve afectada. El deterioro de la función cognitiva suele ir acompañado, y en ocasiones es precedido, por el deterioro del control emocional, el comportamiento social o la motivación.
En este contexto, destaca la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad neurodegenerativa crónica más frecuente y que representa la mayor carga mundial de demencia en pacientes de edad avanzada. En la actualidad, los únicos medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) disponibles para pacientes con Alzheimer son aquellos dirigidos al sistema colinérgico (por ejemplo, donepezilo, tacrina, rivastigmina y galantamina) o el sistema glutamatérgico (por ejemplo, memantina). Sin embargo, ninguno de estos medicamentos es curativo o modificador del curso de la enfermedad, proporcionando solamente un alivio temporal y sintomático, y a un subconjunto de pacientes con Alzheimer.
La comprensión limitada de los circuitos neuronales y los mecanismos moleculares implicados es una de las razones clave de la falta de tratamientos más efectivos. Por lo tanto, la necesidad de nuevos tratamientos es uno de los principales desafíos en la investigación de la salud mental de la actualidad.
Se ha demostrado que en enfermos de Alzheimer tiene lugar una disminución en el número de células de determinadas poblaciones neuronales. Así, se ha descrito una disminución de neuronas en el hipocampo. El factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) es miembro de la familia de las neurotrofinas, que inducen mantenimiento y reparación de poblaciones neuronales específicas. Así, los valores de BDNF están significativamente reducidos en el hipocampo y la corteza parietal de pacientes con Alzheimer.
Los neuropéptidos y sus receptores han recibido una atención especial, ya que emergen como mediadores importantes de mecanismos neuronales en el hipocampo. El neuropéptido Y (NPY) es uno de los neuropéptidos más abundantes en el sistema nervioso central (SNC). Se trata de un polipéptido de 36 aminoácidos que está filogenéticamente muy conservado, con una concentración elevada en varias regiones límbicas y corticales. De los 5 receptores de NPY conocidos que se expresan en el cerebro, los receptores NPYY1 (NPYY1R) y NPYY2 son los que se expresan mayoritariamente en el hipocampo, y aunque el NPYY1 R se encuentra en todo el GD. Dentro del GD, el NPY se libera selectivamente por las interneuronas GABAérgicas localizadas en el hilus o zona polimórfica, que inerva la capa de células granulares y la ZSG. Por su parte, la Galanina (GAL) también es un neuropéptido ampliamente distribuido en el SNC. Se han descrito tres subtipos de receptores de GAL en el SNC, GALR1, GALR2 y GALR3. El receptor GALR2 se expresa ampliamente en el cerebro de la rata, donde entre las áreas de mayor expresión se encuentra el hipocampo.
Recientemente se ha demostrado que la GAL interactúa con el NPYY1R en varias regiones del SNC asociadas con la ansiedad y depresión, incluyendo el núcleo dorsal del Rafe, núcleos de la amígdala y en el hipocampo ventral. De hecho, la función del hipocampo ventral está asociada a procesos emocionales, mientras que el hipocampo dorsal se relaciona con funciones cognitivas y de memoria. Además, se ha demostrado que estos efectos están mediados por los receptores GALR2 (el efecto de GAL se bloquea mediante un antagonista específico GALR2) y los receptores NPYY1 R (usando agonistas de NPYY1R, como NPY, y bloqueando su efecto mediante un antagonista específico de NPYY1 R). Por tanto, cabría esperar efectos similares a los obtenidos en la presente invención con cualquier agonista de GALR2 o de NPYY1 R.
En la amígdala se ha observado una interacción facilitadora GALR2/NPYY1 R, al demostrarse como la GAL actuaba a través de GALR2 para potenciar la respuesta ansiolítica mediada por el NPYY1R en ratas. Usando técnicas in situ de ligazón por proximidad (ELP), se ha determinado que los núcleos intercalados paracapsulares mediales de la amígdala constituyen un área clave en esta interacción, probablemente implicando la formación de complejos de heteroreceptores GALR2/NPYY1 R. Recientemente se ha confirmado que esta interacción GALR2/NPYY1 R no sólo afecta a la actividad de la amígdala, sino también a otras estructuras fundamentales en el control de las emociones y el estado de ánimo, como el hipotálamo o la sustancia gris periacueductal.
Respecto al hipocampo, se ha descrito esta interacción entre GALR2/NPYY1 R en el giro dentado (GD) del hipocampo. Usando técnicas de autorradiografía, hibridación in situ y el ELP, se ha demostrado la interacción entre GALR2/NPYY1 R en el GD implicando la formación de complejos de heteroreceptores GALR2/NPYY1R y un aumento de actividad neuronal en dicha zona. Estos complejos se han observado específicamente en el hilus o región polimórfica y la ZSG del DG. Más recientemente se ha demostrado como la interacción de ambos neuropéptidos aumenta la proliferación neuronal en hipocampo ventral con un efecto antidepresivo.
En el documento ES2589165B2 se refiere el efecto en el hipocampo ventral y su posible uso terapéutico en la depresión. Así, se ha demostrado que los efectos en el hipocampo ventral se relacionan con trastornos del ánimo como la depresión; sin embargo, las acciones en el hipocampo dorsal se asocian con funciones cognitivas como la memoria. De hecho, la presente invención se refiere a las acciones en el hipocampo dorsal y su posible uso terapéutico en trastornos cognitivos asociados a demencia. En el documento ES2644978B1 se ha descrito que dicha interacción se produce en el hipocampo ventral y a corto plazo, en minutos. La presente invención se refiere a dicha interacción, pero producida en el hipocampo dorsal y a medio/largo plazo, en días o semanas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se describe por primera vez como un agonista de GALR2 potencia la protección neuronal inducida por un agonista de NPYY1 R, creando una relación sinérgica entre ambos. En la presente invención se describe este efecto tanto en el hipocampo dorsal en ratas como en cultivos neuronales de hipocampo transcurridas 24 horas de la administración de los correspondientes agonistas. También se muestran indicios de la implicación de los receptores GALR2 en las acciones mediadas por GAL basadas en el uso de M871 , antagonista específico de GALR2. Este aumento de la protección neuronal se evidenció mediante la detección de BDNF. Además, la combinación de agonistas de GALR2 y de NPYY1 R produce un aumento de la expresión de la proteína antiapoptótica BCL2, lo que es clave para la supervivencia de las neuronas del hipocampo.
En la presente invención se incluyen datos que demuestran el papel protector neuronal de agonistas de GALR2 y de NPYY1R en el hipocampo tanto in vitro como in vivo. La evidencia en cultivos de neuronas in vitro demuestra un efecto protector de estas neuronas, ya que aumentan las vías intracelulares para la producción de estos factores protectores.
Estos efectos se acompañan de un incremento de los complejos GALR2/NPYY1 R en el hipocampo dorsal a las 24 horas de la administración de sus correspondientes agonistas. De nuevo GALR2 está implicado en dichos efectos, ya que su antagonista, M871 , bloquea este efecto.
Los resultados indican que los agonistas de GALR2 aumentan de forma sinérgica la protección neuronal inducida por agonistas de NPYY1 R, probablemente actuando sobre el complejo heterorreceptor GALR2/NPYY1 R. Los datos aquí aportados permiten proponer el uso terapéutico de un agonista de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1 R como una estrategia novedosa en la protección y supervivencia neuronal, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, la presente invención hace referencia a agonistas de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1 R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, o una composición farmacéutica que los comprenda, para ser usados en la protección y supervivencia neuronal. De forma preferida, la protección y supervivencia neuronal se caracteriza o se evidencia por un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido (preferentemente observado en pacientes con afectación neuronal).
Tal y como se muestra en las figuras, la combinación de agonistas GALR2 con agonistas NPYY1 R consiguió potenciar de forma sinérqica la protección neuronal y supervivencia de las neuronas. Cuando se combinan ambos agonistas, se produce un efecto sinérgico en la generación de células BDNF+ y BCL-2+. La Figura 1 evidencia que el número de células BDNF+ conseguidas con el tratamiento con GAL son similares al control con CSF y cuando se combina GAL+Y1 se consigue un efecto sinérgico en la expresión de BDNF. Por su parte, la Figura 2 muestra que el número de células BCL-2+ conseguidas con el tratamiento con GAL son similares al control con CSF y cuando se combina GAL+Y1 se consigue un efecto sinérgico en la expresión de BCL2. Además, la Figuras 3 y 4 muestran que el número de señales pLA conseguidas con el tratamiento con GAL son similares al control con CSF y cuando se combina GAL+Y1 se consigue un efecto sinérgico. En este sentido, es importante hacer notar que en trabajos previos se ha demostrado como la coadministración de GAL con el agonista Y1 provocaba una interacción antagónica, es decir de forma contraria a la mostrada en la presente invención. Dichos efectos se observaron a nivel del control central cardiovascular en el núcleo del tracto solitario (Diaz-cabiale Z, 2006), en la regulación de la ingesta en el núcleo arcuato hipotalámico (Parrado C, 2007) y en neuronas del rafe dorsal (Diaz-cabiale Z, 2011). Sin embargo, tal y como se indica arriba, en el presente trabajo se demuestra como la coadministración de GAL con el agonista Y1 consigue un efecto sinérgico sobre la expresión de los factores de protección neuronal BDNF y de supervivencia neuronal BCL-2.
Conforme a lo anterior, la presente invención además incluye al uso de una combinación que comprende al menos un agonista de GALR2 y al menos un agonista de NPYY1R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables; o alternativamente “los compuestos de la invención”, en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, el efecto conseguido en la presente invención se debe a la actuación de los agonistas precisamente sobre sendas dianas (GALR2 y NPYY1R), pudiendo esto conseguirse con cualquier compuesto que sea capaz de actuar como agonista sobre las mismas. Ejemplos no limitantes de dichos agonistas de GALR2, o de derivados o fragmentos funcionales de los mismos, son bien conocidos y están disponibles comercialmente, tales como AR-M 1896, galanina (1-29), galanina, galanina (1-15), galanina (1-30), galanina (2-29), galnon, M1145, galmic, NAX5055, D-Gal(7-Ahp)-B2, galanina 2-11 amida, M1153, CYM2503. De forma preferida, los agonistas de GALR2 se seleccionan de los mostrados en el siguiente documento que se incluye como referencia con el objeto de que forme parte de la presente descripción: [Gundlach AL, Ryan PJ. Galanin receptors (versión 2019.4) in the IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology Database. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology CITE. 2019; 2019(4). Available from: https://doi.org/10.2218/gtopdb/F27/2019.4j. Por otor lado, ejemplos no limitantes de dichos agonistas de NPYY1R, o de derivados o fragmentos funcionales de los mismos, son bien conocidos y están disponibles comercialmente, tales como el neuropéptido Y, [Leu31 ,Pro34]-neuropéptido Y. De forma preferida, los agonistas de NPYY1R se seleccionan de los mostrados en el siguiente documento que se incluye como referencia con el objeto de que forme parte de la presente descripción: [Beck-Sickinger A, Colmers WF, Cox HM, Doods HN, Herzog H, Larhammar D, Michel MC, Quirion R, Schwartz T, Westfall T. Neuropeptide Y receptors (versión 2019.4) in the IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology Database. IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology CITE. 2019; 2019(4). Available from: https://doi.org/10.2218/gtopdb/F46/2019.4j. Los agonistas de GALR2 y/o NPYY1R, o sus análogos, pueden estar en su forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. En este sentido, el término «solvato», como se usa en el presente documento, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables; es decir solvatos que pueden usarse en la fabricación de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, que pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre que sea farmacéuticamente aceptable. En una realización en particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse mediante métodos convencionales de solvatación conocidos por aquellos expertos en la materia.
Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de una combinación que comprende un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1 R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, incluidos trastornos mentales orgánicos sintomáticos. Estos trastornos pudieran incluir, de acuerdo con el sistema de clasificación internacional de enfermedades (International Classification of Diseases, ICD-10), lo siguientes: (FOO) Demencia en la enfermedad de Alzheimer. (FOO.O) Demencia en la enfermedad de Alzheimer de inicio precoz. (FOO.1) Demencia en la enfermedad de Alzheimer de inicio tardío. (FOO.2) Demencia en la enfermedad de Alzheimer atípica o mixta. (FOO.9) Demencia en la enfermedad de Alzheimer sin especificación. (F01) Demencia vascular. (F01.0) Demencia vascular de inicio agudo. (F01.1) Demencia multiinfarto. (F01.2) Demencia vascular subcortical. (F01.3) Demencia vascular mixta cortical y subcortical. (F01.8) Otra demencia vascular. (F01.9) Demencia vascular sin especificación. (F02.0) Demencia en la enfermedad de Pick; (F02.1) Demencia en la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; (F02.2) Demencia en la enfermedad de Huntington; (F02.3) Demencia en la enfermedad de Parkinson; (F02.4) Demencia en el VIH; (F03) Demencia sin especificar; (F04) Síndrome amnésico orgánico, no inducido por alcohol o por otros psicotrópicos. En una realización aún más particular, la invención se refiere al uso de una combinación que comprende los compuestos de la invención en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a la demencia en la enfermedad de Alzheimer. En una realización, el uso es preventivo y la administración de la composición farmacéutica que comprende los compuestos de la invención se lleva a cabo antes de la instauración completa del deterioro cognitivo. En otra realización, el uso es preventivo y la administración de la composición farmacéutica que comprende los compuestos de la invención se realiza durante la aparición de los primeros signos y/o síntomas de deterioro cognitivo. En otra realización, el uso es para el tratamiento y la administración de la composición farmacéutica que comprende los compuestos de la invención se realiza durante la aparición de los primeros signos y/o síntomas de deterioro cognitivo. En otra realización, el uso es para el tratamiento y la administración de la composición farmacéutica que comprende los compuestos de la invención se realiza después de la aparición de los primeros signos y/o síntomas de deterioro cognitivo.
Para su uso en terapia, los agonistas de GALR2 y/o NPYY1 R, o sus análogos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos, estarían preferiblemente en una forma sustancialmente pura o farmacéuticamente aceptable, es decir, con un nivel de pureza aceptable farmacéuticamente y excluyendo los aditivos farmacéuticos normales como diluyentes y vehículos, y sin incluir materiales considerados tóxicos a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza están preferiblemente por encima del 50%, más preferiblemente por encima del 70% y, aún, más preferiblemente por encima del 90%. En una realización preferida, son mayores del 95% en agonistas de GALR2 y/o NPYY1 R, o sus análogos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de una combinación que comprende un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1 R, o sus análogos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos, farmacéuticamente aceptables para la preparación de una composición farmacéutica. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende agonistas de GALR2 y de NPYY1R, o sus análogos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos, farmacéuticamente aceptables, aunque dicha composición farmacéutica pueda comprender opcionalmente vehículos y/o diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En una realización de la invención, esta se refiere al uso de una combinación que comprende un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1 R, o sus análogos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos, farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la preparación de una composición farmacéutica como se ha indicado anteriormente, adaptada para la administración simultánea de los ingredientes activos.
En particular, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener los ingredientes activos dentro de la misma forma de dosificación unitaria, por ejemplo en la misma cápsula o comprimido. Dichas formas de dosificación unitarias pueden contener los ingredientes activos como una mezcla homogénea o en compartimentos separados de la forma de dosificación unitaria.
En otra realización, la presente invención se refiere al uso de una combinación que comprende un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1 R, o sus análogos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos, farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la preparación de una composición farmacéutica como la anterior, adaptada para la administración secuencial de los ingredientes activos. En particular, dichas composiciones farmacéuticas pueden contener los ingredientes activos en formas de dosificación unitarias individuales (kit farmacéutico), por ejemplo comprimidos o cápsulas individuales que contengan cualquiera de los ingredientes activos. Estas formas de dosificación unitarias individuales pueden estar contenidas en el mismo recipiente o paquete, por ejemplo un blister.
La expresión “kit farmacéutico” empleada en el documento significa una composición farmacéutica que contiene cada uno de los ingredientes activos, pero en formas de dosificación unitarias individuales, y pudiendo estar dichos ingredientes activos empaquetados conjuntamente, por ejemplo en un blister, o no, en cuyo caso la composición resulta del uso combinado de dichos ingredientes activos, entendiéndose por “uso combinado” la administración de los ingredientes activos de forma asociada entre sí pero no necesariamente de forma simultánea. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad apropiada de los principios activos, en forma de sal o en forma de base, en una mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede adquirir una gran variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas se encuentran deseablemente en una forma de dosificación unitaria adecuada para administración por vía nasal, oral, rectal, percutánea o mediante inyección parenteral. Por ejemplo, al preparar las composiciones en forma de dosificación oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos habituales, como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y otros en el caso de las preparaciones líquidas orales como las suspensiones, los jarabes, los elixires y las soluciones; o vehículos sólidos como almidones, azúcares, caolina, lubricantes, aglutinantes, disgregantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan la forma unitaria de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso se utilizan, obviamente, vehículos farmacéuticos sólidos.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas unitarias de dosificación para una administración fácil y uniformidad de dosis. Tal y como se usa en las especificaciones y reivindicaciones, la forma de dosificación unitaria se refiere a unidades físicamente separadas y adecuadas como dosis unitarias, en la que cada unidad contiene una cantidad predeterminada de principio(s) activo(s) calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Son ejemplos de estas formas unitarias de dosificación los comprimidos (incluyendo los comprimidos recubiertos o ranurados), las cápsulas, las pastillas, bolsas de polvos, obleas, soluciones o suspensiones inyectables, cucharaditas de café, cucharadas soperas y otros, y múltiplos segregados de los mismos.
El compuesto de la invención, o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, puede administrarse antes, durante o después de la administración del otro principio activo, siempre que el tiempo entre la administración del compuesto de la invención, o la composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, y la administración del otro principio activo sea tal que se permite a los principios actuar sinérgicamente en el SNC. Cuando se prevea una administración simultánea, puede ser particularmente conveniente una composición que contenga tanto el compuesto de la invención como el otro principio activo. O el compuesto de la invención, o la composición farmacéutica que comprenda un compuesto de la invención, y el otro principio activo, pueden administrarse por separado en forma de composiciones adecuadas. Las composiciones pueden prepararse como se describe anteriormente.
La presente invención también comprende productos que contienen el compuesto de la invención, o la composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, y el otro principio activo como una preparación de combinación para un uso simultáneo, independiente o secuencial, separado o en la prevención o el tratamiento de los trastornos y efectos relacionados con alteraciones cognitivas, especialmente, la afectación de la memoria. Estos productos pueden comprender, por ejemplo, un kit que comprende formas de dosificación unitarias independientes que contienen el compuesto de la invención, o la composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, y formas de dosificación unitarias separadas que contienen el principio activo, todo ello contenido en el mismo paquete o envase, por ejemplo, en un blíster.
Tal y como se usa en esta invención, el término «principio activo», «sustancia activa», «sustancia o sustancia farmacéuticamente activa» o «principio farmacéuticamente activo» significa cualquier componente que potencialmente proporcione un efecto farmacológico u otro tipo en el diagnóstico, curación, paliación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo humano o de otros animales.
El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la fabricación del fármaco y que están presentes en él en una forma modificada y prevista que proporciona una actividad o efecto específico.
Por lo tanto, tal y como se indica anteriormente, el primer aspecto de la presente invención hace referencia a un agonista de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados en la protección y supervivencia neuronal, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer. En una realización preferida de dicho primer aspecto, el agonista de GALR2 se selecciona entre los siguientes compuestos: AR-M 1896, galanina, galanina (2-29), M1145, galanina 2-11 amida, M1153, CYM2503, derivados o fragmentos funcionales de dichos productos y el agonista de NPYY1R se selecciona entre los siguientes compuestos: neuropéptido Y, [Leu31 ,Pro34]-neuropéptido Y .
Un segundo aspecto de la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica o kit que comprende una combinación de un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1R, o análogos de los mismos, o sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados en la protección y supervivencia neuronal, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer.
En una realización preferida de dicho segundo aspecto de la presente invención, los agonistas se administran de forma simultánea, formado parte de la misma forma de dosificación unitaria.
En otra realización preferida de dicho segundo aspecto de la presente invención, los agonistas se administran de forma secuencial, formado parte de formas de dosificación unitarias independientes.
Un tercer aspecto de la presente invención hace referencia a un método in vitro para la identificación y/o producción de compuestos útiles para la protección y supervivencia neuronal, preferentemente para la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer, que comprende: a) medir el nivel de expresión de GALR2 y NPYY1 R después de administrar la molécula candidata y b) donde, si después de administrar la molécula candidata, la expresión de GALR2 y NPYY1R son activadas total o parcialmente de forma estadísticamente significativa respecto la expresión antes de administrar la molécula candidata, esto es indicativo de que la molécula candidata es efectiva en la protección y supervivencia neuronal, la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer. En un aspecto preferido, el método además comprende determinar la protección y supervivencia neuronal conseguida por el compuesto candidato a través de la identificación de un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido.
Un cuarto aspecto de la presente invención hace referencia a un método in vitro para monitorizar la respuesta a un tratamiento para la protección y supervivencia neuronal, preferentemente para la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, tales como la enfermedad de Alzheimer, que comprende: a) medir el nivel de expresión de GALR2 y NPYY1R después de administrar el tratamiento y b) donde, si después de administrar el tratamiento, el nivel de expresión de GALR2 y NPYY1 R es activado total o parcialmente de forma estadísticamente significativa respecto la expresión antes de administrar el tratamiento, esto es indicativo de que el tratamiento es efectivo. En un aspecto preferido, el método además comprende determinar la protección y supervivencia neuronal conseguida por el compuesto candidato a través de la identificación de un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido.
Un quinto aspecto de la presente invención hace referencia a un método de tratamiento dirigido a la protección y supervivencia neuronal, preferentemente a la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia tales como la enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración al paciente de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una combinación de agonistas de GALR2 y agonistas de NPYY1 R, preferentemente incluyendo excipientes farmacéuticamente aceptables. La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que se puede incluir opcionalmente en las composiciones de la invención y que no causa efectos toxicológicos adversos significativos para el paciente. Por "dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" de la composición de la invención se entiende una dosis que cuando se administra provoca una respuesta terapéutica positiva en un sujeto que padece la enfermedad. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la afección que se está tratando, el modo de administración y similares. La cantidad "efectiva" apropiada puede ser determinada por un experto en la materia usando experimentación de rutina, en base a la información proporcionada en el estado de la técnica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Análisis de la protección neuronal mediada por GAL y un agonista de NPYY1 R (a) Imagen representativa que muestra la expresión de BDNF en las distintas zonas del hipocampo dorsal, como el giro dentado (GD), CA3 y CA1. (b) Gráfica que muestra el porcentaje de neuronas que expresan BDNF para los grupos tratados con LCRa (Control), GAL 3nmol, Y1 3nmol, GAL+Y1 y GAL+Y1+M871. Los datos se representan como porcentaje del grupo control (100%). ***P<0,001 versus aCSF y GAL; ¹¹¹P<0,001 versus el resto de grupos; dddR<0,001 versus aCSF y GAL. Estadística realizada con ANOVA de una vía seguido por el test de comparación múltiple de Newman-Keuls (n=4 animales en cada grupo) (c-d) Microfotografías representativas que muestran células marcadas con BDNF en el GD. (Bregma: -3.5mm). Abreviaturas: LCRa = Líquido cefalorraquídeo artificial; GAL + Y1 = Coadministración de Galanina y [Leu31-Pro34]NPY; GAL + Y1 + M871 = Coadministración de GAL, [Leu31-Pro34]NPY y el antagonista de GALR2 (M871).
Figura 2. Estudio de la expresión del factor de supervivencia BCL-2 hipocampal mediado por GAL y un agonista de NPYY1R (a) Imagen representativa que muestra la expresión de BCL-2 en las distintas zonas del hipocampo dorsal, como el giro dentado (GD), CA3 y CA1. (b) Gráfica que muestra el porcentaje de neuronas que expresan BCL-2 para los grupos tratados con LCRa (Control), GAL 3nmol, Y1 3nmol, GAL+Y1 y GAL+Y1+M871. Los datos se representan como porcentaje del grupo control (100%). **P<0,01 versus aCSF y GAL; ¹¹P<0,01 versus el resto de grupos; ddR<0,01 versus aCSF y GAL. Estadística realizada con ANOVA de una vía seguido por el test de comparación múltiple de Newman-Keuls (n=4 animales en cada grupo) (c-d) Microfotografías representativas que muestran células marcadas con BCL-2 en el GD. (Bregma: -3.5mm). Las flechas indican ejemplos de agrupaciones de células marcadas. Abreviaturas: LCRa = Líquido cefalorraquídeo artificial; GAL + Y1 = Coadministración de Galanina y [Leu31-Pro34]NPY; GAL + Y1 + M871 = Coadministración de GAL, [Leu31-Pro34]NPY y el antagonista de GALR2 (M871).
Figura 3. Detección de complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1 R con el ensayo de ligazón por proximidad (ELP) en el hipocampo dorsal de rata (a) Imagen representativa que muestra la expresión de complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1 R en las distintas zonas del hipocampo dorsal, como el giro dentado (GD), CA3 y CA1. Círculos rojos: señales positivas con ELP. Círculos azules: señales negativas con ELP. (Bregma: -3,1 mm). (b) Gráfica que muestra el porcentaje de señales positivas con ELP por núcleo y por campo muestral obtenidas por un experimentador blindado a las condiciones experimentales. *P<0.05 Y1 versus aCSF y GAL. ¹P<0.05 Y1 versus GAL+Y1. R <0.001 GAL+Y1 versus aCSF y GAL. <$)P<0.05 GAL+Y1 versus GAL+Y1+M871 de acuerdo con ANOVA de una vía seguido por el test de comparación múltiple de Newman-Keuls. Los datos se muestran como la MediaiError estándar y cada punto en la gráfica representa los resultados de ratas individuales de múltiples fotografías analizadas (n=4 ratas por grupo) (c-f) Microfotografías representativas de la densidad de círculos positivos en ELP en el GD. Las flechas blancas señalan las agrupaciones de ELP. Los núcleos se muestran de color azul con DAPI. Abreviaturas: LCRa = Líquido cefalorraquídeo artificial; GAL + Y1 = Coadministración de Galanina y [Leu31-Pro34]NPY; GAL + Y1 + M871 = Coadministración de GAL, [Leu31-Pro34]NPY y el antagonista de GALR2 (M871).
Figura 4. Detección de complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1 R con el ensayo de ligazón por proximidad (ELP) en cultivos de neuronas de hipocampo (a) Gráfica que muestra el porcentaje de señales positivas con ELP por núcleo y por campo muestral obtenidas por un experimentador blindado a las condiciones experimentales. ***P<0.001 Y1 versus aCSF y GAL. ¹ ¹ ¹P<0.001 Y1 versus GAL+Y1. ^^P <0.001 GAL+Y1 versus aCSF y GAL. P<0.001 GAL+Y1 versus GAL+Y1+M871 de acuerdo con ANOVA de una vía seguido por el test de comparación múltiple de Newman-Keuls. Los datos se muestran como la MediaiError estándar de múltiples microfotografías analizadas. (b,c) Microfotografías representativas de la densidad de círculos positivos en ELP. Círculos rojos: señales positivas con ELP. Las flechas blancas señalan las agrupaciones de ELP. Los núcleos se muestran de color azul con DAPI. Abreviaturas: LCRa = Líquido cefalorraquídeo artificial; GAL + Y1 = Coadministración de Galanina y [Leu31- Pro34]NPY; GAL + Y1 + M871 = Coadministración de GAL, [Leu31-Pro34]NPY y el antagonista de GALR2 (M871).
Figura 5. Valoración de la vía intracelular de crecimiento celular MAPK en cultivos neuronales de hipocampo mediante el nivel de inducción de expresión de un plásmido experimental que integra el gen de la luciferasa de luciérnaga como reportero génico (pGL4-SRE-luc2p). Control: 50ng de plásmido de control interno expresando luciferasa de Renilla (phRG-B). Los datos se muestran como la MediaiError estándar de tres experimentos independientes realizados en triplicado. Se emplearon las siguientes concentraciones: M1145, 100 nM; M871, 1 mM; [Leu31- Pro34]NPY, 100 nM; BIBP3226, 1 mM; ***P<0.001 M1145 versus Control y M1145+M871. ¹ ¹ ¹P<0.001 Y1 versus Control
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M1145+Y1 versus el resto de grupos. El análisis estadístico se realizó de acuerdo con ANOVA de una vía seguido por el test de comparación múltiple de Newman- Keuls.
Figura 6. Test de reconocimiento de objetos en una nueva ubicación. Se observa cómo ni la administración individual intracerebroventricular (icv) de Galanina ni del agonista Y1 Leu31-Pro34-NPY (ambos a dosis de 3nmol) modifican el índice de discriminación respecto a los controles. Sin embargo, se observan diferencias significativas (P<0,05) entre la administración de GAL 3nmol y la del agonista Y1 3nmol. La coadministración de GAL y el agonista Y1 aumenta de manera estadísticamente significativa el índice de discriminación, comparado con los animales control (P<0,01), la inyección de GAL (P<0,001) y del agonista Y1 (P<0,05). Este efecto se bloquea en presencia del antagonista especifico de los receptores tipo 2 de GAL (M871 3nmol) (P<0,05), lo que demuestra la participación de GALR2 en la interacción con Y1.
Figura 7. Administración intranasal. Tras la administración intranasal individual del agonista GALR2 (M1145, 132 pg) y del agonista Y1 a 132 pg no se observan modificaciones en el índice de discriminación respecto a los controles, en el test de reconocimiento de objetos en una nueva ubicación. Sin embargo, la coadministración de M1145 y el agonista Y1 aumenta de manera estadísticamente significativa el índice de discriminación, comparado con el resto de los grupos de animales tratados (P<0,05). Este efecto se bloquea en presencia del antagonista especifico de los receptores tipo 2 de GAL (M871 132 pg) (P<0,05), lo que demuestra la participación especifica de GALR2 en la interacción con Y1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención anteriormente mencionada se detalla adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes y meramente ilustrativos.
Material v métodos Sujetos: Ratas macho de la cepa Sprague-Dawley, obtenidos de CRIFFA, Barcelona. (200-250 gr.- 6-8 semanas). Los animales se estabulan con comida y agua disponibles libremente (ad libitum). Los animales se mantienen bajo temperatura controlada (20oC), humedad (55-60%) y ciclos de luz / día invertidos (12:12 h). El personal capacitado bajo la supervisión veterinaria ha brindado los cuidados pertinentes a los animales, y todos los experimentos están aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Málaga de acuerdo con la Directiva Europea (2010/63/EU) y la Directiva Española (Real Decreto 53/2013). Las ratas se empezaron a utilizar tras una aclimatación en el animalario de 1 semana.
Cánulas intracerebrales: Se implantó una cánula guía crónica de acero inoxidable del calibre 22 (Plastics One In) en el ventrículo cerebral lateral derecho a las ratas anestesiadas por vía intraperitoneal con Equitesina (3,3 ml/Kg). Se utilizaron las siguientes coordenadas estereotáxicas: + 1 ,4 mm lateral, -1 mm posterior al bregma, y 3.6 mm por debajo de la superficie del cráneo. Después de la cirugía, los animales se estabularon individualmente y se recuperaron durante 7 días. Este método de canulación y cuidado postquirúrgico se ha estandarizado previamente en nuestro laboratorio (Narváez et al., 2018).
Administración intracerebroventricular de péptidos: Las ratas canuladas se asignaron al azar a diferentes grupos. Los péptidos estaron recién preparados, disueltos en Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) e inyectados en el ventrículo lateral derecho. El volumen total fue de 5 pl por inyección, con un tiempo de infusión de 1 minuto. El agonista del NPYY1 R [Leu31 , Pro34] NPY (Ki = 0.39 nM para NPYY1 R) y el agonista GALR2 (M1145) (Ki = 13.1 y 420 nM para GALR2 y GALR1 respectivamente) se obtuvo de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Estos procedimientos de inyecciones intracerebroventriculares (icv) y preparación de LCRa ya se han estandarizado en nuestro laboratorio (Narváez et al., 2018).
Colección de muestras: Las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (Mebumal; 100 mg / kg, i.p.), se perfundieron intracardiacamente con Paraformaldehído al 4% (wt / vol, Sigma), y los cerebros se extrajeron para la inmunotinción. Se comprobó la colocación correcta de la cánula tras las inyecciones icv cortando el cerebro en el plano coronal en un criostato (HM550, Microm International). Los cerebros se cortaron en un plano coronal y se procesaron para la inmunotinción usando protocolos publicados previamente (Narváez et al., 2018).
Inmunohistoquímica: Se incubaron las secciones cerebrales en suspensión (cortadas de forma coronal en niveles de Bregma correspondientes al hipocampo dorsal y ventral: de -2.16 a -4.20) durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios diluidos a 4°C: BDNF (1: 1000, Abcam, EE. UU.), BCL-2 (1 : 500; Santa- Cruz Biotech, EE. UU.). El procedimiento se realizó utilizando el método de la peroxidasa, en series de una cada seis secciones, como previamente se ha publicado (Vega-Rivera et al., 2015). Todas las células marcadas con BDNF y BCL-2 se contaron a través de la extensión rostro-caudal del hipocampo, usando un microscopio óptico (Leica, Alemania). En el giro dentado del hipocampo, la cuantificación de las células marcadas con BDNF y BCL-2 se limitó a la capa de células granulares (CG) y a la zona subgranular (ZSG) como se ha descrito previamente (Vega-Rivera et al., 2015; Narváez et al., 2018).
Ensayo de ligazón por proximidad in situ (ELP): El Ensayo de ligazón por proximidad (ELP) in situ se realizó como se ha descrito previamente (Narvaez et al. 2020). Las secciones de cerebro en suspensión se incubaron con soluciones de bloqueo (suero de cabra al 5%) y de permeabilización (tritón X100 al 0,3% en PBS) durante 60 minutos cada una. Los anticuerpos primarios dirigidos contra GALR2 (conejo, Alomone Lab, 1 : 100) y NPYY1 R (cabra, sc-21992 Santa Cruz Biotecnology INC, CA, 1 : 200) se incubaron durante 24h. a 4°C. La detección de la señal de ELP se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de detección de ELP Duolink in situ Sigma) con sondas ELP PLUS o MINUS para anticuerpos de conejo o cabra. Las secciones se montaron en portaobjetos con medio de montaje fluorescente (Dako) que contiene DAPI (1 :200), para teñir los núcleos con color azul. Las señales de ELP se visualizaron y cuantificaron utilizando un microscopio confocal TCS-SL (Leica) y el programa informático Duolink Image Tool.
Ejemplo 1. Análisis del factor de protección neuronal BDNF mediado por GAL y el agonista NPYY1R
En la Figura 1 se observa como la coadministración intracerebroventricular (icv) de GAL y del agonista de NPYY1R potencia la expresión del factor protector neuronal BDNF en hipocampo dorsal. Además, se demuestra que estos efectos están mediados por GALR2, ya que se bloquean en presencia del antagonista específico GALR2, M871.
En la Figura 1 (a) se muestra un diagrama representativo de las zonas hipocampales dorsales donde se ha analizado la expresión del factor de protección neuronal BDNF. Se ha demostrado estos efectos en el giro dentado (GD), CA1 y CA3.
En la Figura 1(b) se muestra la cuantificación de neuronas que expresan BDNF en el hipocampo dorsal para los grupos tratados icv con líquido cefalorraquídeo artificial (Control), Galanina (GAL 3nmol), el agonista de los receptores Y1 del Neuropéptido Y (Y1 3nmol), la coadministración de ambos (GAL+Y1) y la coadministración en presencia del antagonista específico GALR2 M871 (GAL+Y1+M871). Los datos se representan como porcentaje del grupo control (100%). La administración icv de GAL no modifica la expresión de BDNF en el hipocampo dorsal comparado con los animales controles. Sin embargo, la administración del agonista Y1 aumenta de forma significativa (P<0,001) la expresión de BDNF en el hipocampo dorsal, comparado con GAL y los animales controles. Es de destacar cómo la coadministración icv de GAL con el agonista Y1 aumenta de forma significativa la expresión de BDNF (P<0,001), respecto al aumento inducido por el agonista Y1 de forma aislada. Este efecto está mediado por los receptores GALR2 de GAL, ya que en presencia del antagonista específico M871 se bloquea de forma significativa (P<0,001 ) el efecto inducido por la coinyección icv de GAL con el agonista Y1.
En las Figuras 1(c y d) se observan microfotografías representativas de células marcadas con BDNF localizadas en el giro dentado (GD), entre la capa de células granulares (Gcl) y el hilus (H). Las flechas blancas indican neuronas que expresan de forma selectiva el factor de protección neuronal BDNF. Se muestra como la coadministración de ambos péptidos, GAL y el agonista Y1 aumenta la detección del mareaje con BDNF (Figura 1 d) comparado con el grupo control (Figura 1 c).
Ejemplo 2. Estudio de la expresión del factor de supervivencia neuronal BCL-2 hipocampal mediado por GAL v el aqonista NPYY1R
En la Figura 2 se muestra la potenciación de la expresión del factor de supervivencia neuronal BCL-2 en hipocampo dorsal tras la coadministración intracerebroventricular (icv) de Galanina (GAL) y el agonista de los receptores Y1 del Neuropéptido Y (Y1). Además, se demuestra que estos efectos están mediados por GALR2, ya que se bloquean en presencia del antagonista específico GALR2, M871.
En la Figura 2 (a) se observa un diagrama representativo de las zonas hipocampales dorsales donde se ha analizado la expresión del factor de supervivencia neuronal BCL-2. Se ha demostrado estos efectos en el giro dentado (GD), CA1 y CA3.
En la Figura 2(b) se muestra la cuantificación de neuronas que expresan BCL-2 en el hipocampo dorsal para los grupos tratados icv con líquido cefalorraquídeo artificial (Control), Galanina (GAL 3nmol), el agonista de los receptores Y1 del Neuropéptido Y (Y1 3nmol), la coadministración de ambos (GAL+Y1) y la coadministración en presencia del antagonista específico GALR2 M871 (GAL+Y1+M871). Los datos se representan como porcentaje del grupo control (100%). Al igual que ocurría con la expresión de BDNF, la administración icv de GAL no modifica la expresión de BCL-2 en el hipocampo dorsal comparado con los animales controles. Sin embargo, la administración del agonista Y1 aumenta de forma significativa (P<0,01) la expresión de BCL-2 en el hipocampo dorsal, comparado con GAL y los animales controles. Llama la atención cómo la coadministración icv de GAL con el agonista Y1 aumenta de forma significativa la expresión de BCL-2 (P<0,01), respecto al aumento inducido por el agonista Y1 de forma aislada. Este efecto está mediado por los receptores GALR2 de GAL, ya que en presencia del antagonista específico M871 se bloquea de forma significativa (P<0,01) el efecto inducido por la coinyección icv de GAL con el agonista Y1.
En las Figuras 2 (c y d) se observan microfotografías representativas de neuronas marcadas con BCL-2 localizadas en el giro dentado (GD), entre la capa de células granulares (Gcl) y el hilus (H). Las flechas blancas indican neuronas que expresan de forma selectiva el factor de supervivencia neuronal BCL-2. Se muestra como la coadministración de ambos péptidos, GAL y el agonista Y1 aumenta la detección del mareaje con BCL-2 (Figura 2 d) comparado con el grupo control (Figura 2 c).
Ejemplo 3. Estudio de complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1R en el hipocampo dorsal de la rata.
Se han detectado complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1R con el ensayo de ligazón por proximidad (ELP) en el hipocampo dorsal. En la figura 3 se muestra un diagrama con la presencia de señales positivas con ELP (círculos rojos) en las distintas zonas del hipocampo dorsal, como el giro dentado (GD), CA3 y CA1 y la ausencia de señales específicas (círculos azules) en la capa molecular del GD y en el cuerpo calloso.
En la figura 3(b) se observa como la coadministración de GAL y del agonista de NPYY1 R aumenta los complejos GALR2/NPYY1R. Además, se observa que estos efectos están mediados por GALR2, ya que se bloquean en presencia del antagonista específico GALR2, M871.
Asimismo, en las figuras 3(c) - 3(f) se observa un aumento significativo de la densidad de los círculos positivos en ELP, correspondiente a la presencia de complejos GALR2/NPYY1 R, tras la coinyección de GAL y del agonista NPYY1 comparado con el grupo control.
Ejemplo 4. Estudio de complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1R en cultivos de neuronas de hipocampo.
Se han detectado complejos heteroreceptores GALR2/NPYY1R con el ensayo de ligazón por proximidad (ELP) en cultivos de neuronas de hipocampo.
Las neuronas hipocampales mostraron un aumento significativo de los complejos GALR2/NPYY1 R (Círculos ELP) tras la coadministración de GAL y del agonista de NPYY1 R [Figura 4 (a)]. Además, se observa que estos efectos están mediados por GALR2, ya que se bloquean en presencia del antagonista específico GALR2, M871.
En las figuras 4(b) y 4(c) se observa un aumento significativo de la densidad de los círculos positivos en ELP, correspondiente a la presencia de complejos GALR2/NPYY1 R, tras el tratamiento con GAL y con el agonista NPYY1 comparado con el grupo control.
Ejemplo 5. Valoración de la vía intracelular de crecimiento celular MAPK en cultivos neuronales de hipocampo mediante un reportero qénico.
Cultivos neuronales de hipocampo de rata se cotransfectaron con 1 pg de luciferasa de luciérnaga expresando el plásmido experimental (pGL4-SRE-luc2p) y 50ng del plásmido de control interno expresando luciferasa de Renilla (phRG-B). Tras 4 horas de incubación con los diferentes agonistas o antagonistas se midió la actividad de la luciferasa., observándose como la coadministración de M1145 y el agonista NPYY1R potencia la expresión de SRE (Figura 5).
Ejemplo 6. Test de reconocimiento de objetos en una nueva ubicación
Se puede definir la memoria de reconocimiento como la habilidad para discriminar lo nuevo de lo familiar. Dos investigadores, Ennaceur y Delacour, desarrollaron un paradigma animal de reconocimiento de objetos basado en la tendencia natural de los roedores a explorar más los objetos nuevos que los familiares. Se ha propuesto que esta tarea mantiene una clara analogía con las pruebas de reconocimiento que se usan ampliamente en humanos para evaluar la memoria y que sirven para caracterizar los síndromes amnésicos, ya que proporcionan un índice de la gravedad del daño de la memoria explícita. En esta prueba el hipocampo es el que parece estar más estrechamente relacionado con este tipo de aprendizaje y memoria.
El protocolo está adaptados de Ennaceur y Delacour. El campo abierto consiste en un cuadrado negro (100 * 100 cm). El día previo al experimento, los animales se habitúan con el campo durante 10 minutos. En la sesión de entrenamiento del experimento se muestran a los animales cuatro objetos diferentes en cuanto a color y forma, pero similar tamaño, y se colocan equidistantes de los bordes (10 cm). El animal se sitúa en el centro del campo y se le permite explorar libremente durante 3 minutos. Se considera exploración cuando la cabeza del animal se orienta hacia el objeto y su nariz está situada a menos de 2 cm de él. 24 horas más tarde se lleva a cabo la realización de la prueba (3 minutos), tras intercambiar uno de los objetos por otro del mismo lado y se mide el tiempo de exploración. Los resultados se expresan como el tiempo explorando el nuevo objeto en relación con el tiempo total de exploración (índice de discriminación). Los datos se expresan como la media ± el error estándar de la media. El análisis estadístico se ha realizado mediante ANOVA de una vía, seguido con un test a posteriori de Newman Keuls.
Tal y como se observa en la Figura 6, en el test de reconocimiento de objetos en una nueva ubicación se observa cómo ni la administración individual intracerebroventricular (icv) de Galanina ni del agonista Y1 Leu31-Pro34-NPY (ambos a dosis de 3nmol) modifican el índice de discriminación respecto a los controles. Sin embargo, se observan diferencias significativas (P<0,05) entre la administración de GAL 3nmol y la del agonista Y1 3nmol. La coadministración de GAL y el agonista Y1 aumenta de manera estadísticamente significativa el índice de discriminación, comparado con los animales control (P<0,01), la inyección de GAL (P<0,001) y del agonista Y1 (P<0,05). Este efecto se bloquea en presencia del antagonista especifico de los receptores tipo 2 de GAL (M871 3nmol) (P<0,05), lo que demuestra la participación de GALR2 en la interacción con Y1.
Tal y como se observa en la Figura 7, tras la administración intranasal del agonista GALR2 (M1145, 132 pg) y del agonista Y1 a 132 pg no se observan modificaciones en el índice de discriminación respecto a los controles, en el test de reconocimiento de objetos en una nueva ubicación. Sin embargo, la coadministración de M1145 y el agonista Y1 aumenta de manera estadísticamente significativa el índice de discriminación, comparado con el resto de los grupos de animales tratados (P<0,05). Este efecto se bloquea en presencia del antagonista especifico de los receptores tipo 2 de GAL (M871 132 pg) (P<0,05), lo que demuestra la participación especifica de
GALR2 en la interacción con Y1.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Agonista de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados en la protección y supervivencia neuronal.
2. Agonista de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1 R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados, según la reivindicación 1 , en la protección y supervivencia neuronal, donde la protección y supervivencia neuronal se caracteriza por un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido.
3. Agonista de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1 R o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer.
4. Agonista de GALR2 en combinación con un agonista de NPYY1 R para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agonista de GALR2 se selecciona entre los siguientes compuestos: AR-M 1896, galanina, galanina (2-29), M1145, galanina 2-11 amida, M1153, CYM2503, derivados o fragmentos funcionales de dichos productos; y el agonista de NPYY1 R se selecciona de entre los siguientes compuestos: neuropéptido Y, [Leu31 ,Pro34]-neuropéptido Y.
5. Composición farmacéutica o kit que comprende un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados en la protección y supervivencia neuronal.
6. Composición farmacéutica o kit que comprende un agonista de GALR2 y un agonista de NPYY1R, o análogos de los mismos, o sus sales, ásteres, tautómeros, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables, para ser usados, según la reivindicación 5, en la protección y supervivencia neuronal, donde la protección y supervivencia neuronal se caracteriza por un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido.
7. Composición farmacéutica o kit para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, preferentemente en la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer.
8. Composición farmacéutica o kit para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde los agonistas se administran de forma simultánea.
9. Composición farmacéutica o kit para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde los agonistas se encuentran en la misma forma de dosificación unitaria.
10. Composición farmacéutica o kit para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 7, donde los agonistas se administran de forma secuencial.
11. Composición farmacéutica o kit para ser usados, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o según la reivindicación 10, donde los agonistas se encuentran en formas de dosificación unitarias independientes.
12. Método in vitro para la identificación y/o producción de compuestos útiles para la protección y supervivencia neuronal que comprende: (a) medir el nivel de expresión de GALR2 y NPYY1R después de administrar la molécula candidata, y (b) donde, si después de administrar la molécula candidata, la expresión de GALR2 y NPYY1 R son activadas total o parcialmente de forma estadísticamente significativa respecto la expresión antes de administrar la molécula candidata, esto es indicativo de que la molécula candidata es efectiva en la protección y supervivencia neuronal.
13. Método in vitro, según la reivindicación 12, donde la protección y supervivencia neuronal se determina a través de la identificación de un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido.
14. Método in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, para la identificación y/o producción de compuestos útiles para la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, preferentemente para la identificación y/o producción de compuestos útiles para la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer.
15. Método in vitro para monitorizar la respuesta a un tratamiento frente protección y supervivencia neuronal que comprende: (a) medir el nivel de expresión de GALR2 y NPYY1 R después de administrar el tratamiento, y (b) donde, si después de administrar el tratamiento, el nivel de expresión de GALR2 y NPYY1R es activado total o parcialmente de forma estadísticamente significativa respecto la expresión antes de administrar el tratamiento, esto es indicativo de que el tratamiento es efectivo.
16. Método in vitro, según la reivindicación 15, donde la protección y supervivencia neuronal se determina a través de la identificación de un aumento estadísticamente significativo de la expresión o el nivel de BDNF y/o BCL2 respecto a un valor umbral preestablecido.
17. Método in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, para monitorizar la respuesta a un tratamiento para la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a síndromes de demencia, preferentemente para monitorizar la respuesta a un tratamiento para la prevención y/o el tratamiento del deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer.
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