ES2644978B1 - Método de screening para la identificación de agonistas de receptores tipo 2 de galanina (galr2) y/o agonistas de receptores tipo y1 del neuropéptido y (npyy1r) capaces de promover la interacción entre dichos galr2 y npyy1r así como la formación de complejos de heterorreceptores galr2/npyy1r - Google Patents

Abstract

Método de screening para la identificación de agonistas de receptores tipo 2 de galanina (GALR2) y/o agonistas de receptores tipo Y1 del neuropéptido Y (NPYY1R) capaces de promoverla interacción entre dichos GALR2 y NPYY1R así como la formación de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R, dicho método caracterizado porque comprende las etapas de administrar dichos agonistas; y evaluar la interacción entre dichos receptores GALR2 y NPYY1R y la formación de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R. La invención se refiere más particularmente un método de screening en el que dichos agonistas a administrar son al menos dos compuestos, un primer agonista de GALR2, y un segundo agonista de NPYY1R.

Description

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DESCRIPCION

METODO DE SCREENING PARA LA IDENTIFICACION DE AGONISTAS DE RECEPTORES TIPO 2 DE GALANINA (GALR2) Y/O AGONISTAS DE RECEPTORES TIPO Y1 DEL NEUROPEPTIDO Y (NPYY1R) CAPACES DE PROMOVER LA INTERACCION ENTRE DICHOS GALR2 Y NPYY1R ASI COMO LA FORMACION DE COMPLEJOS DE

HETERORRECEPTORES GALR2/NPYY1R

SECTOR DE LA INVENCION

La invention se refiere a un metodo screening para la identification de agonistas de receptores tipo 2 de galanina (GALR2) y/o agonistas de receptores tipo Y1 del neuropeptido Y (NPYY1R) capaces de promover la interaction entre dichos GALR2 y NPYY1R asi como la formation de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La formacion hipocampal esta involucrada de manera critica en diferentes funciones cerebrales como la memoria espacial, contextual y episodica
(Burgess et al. 2002) y en la respuesta al estres
(McEwen y Magarinos 1997); pero tambien en condiciones neuropsiquiatricas como la depresion
(Campbell y Macqueen 2004). Ademas, recientemente se han descrito diferentes neurotransmisores y sustancias relacionadas con los neurotransmisores que modulan las acciones depresivas en el hipocampo a corto plazo
(Hiroaki-Sato et al. 2014;
Bettio et al. 2014). Dentro de las subregiones hipocampales, el giro dentado (DG) es una region clave en la regulacion de estas funciones y esta formado por las capas celulares molecular y granular y por la region polimorfica (o hilus)
(Amaral et al. 2007). Aunque el DG recibe proyecciones fundamentalmente de la corteza entorrinal, la capa polimorfica del DG recibe proyecciones noradrenergicas del locus coeruleus
(Blackstad et al. 1967) y serotoninergicas del nucleo del rafe que contienen celulas positivas para calbindina-, calretinina-, somatostatina-, y neuropeptido Y (NPY)
(Catena-Dell'Osso et al. 2013;
Sperk et al. 2007).

Las estrategias novedosas en los desordenes psiquiatricos estan focalizadas en el DG como potencial objetivo cerebral
(Hagihara et al. 2013). Los neuropeptidos y sus receptores han recibido especial atencion en este area, especialmente el NPY, que es una diana terapeutica en desordenes emocionales, incluyendo los comportamientos depresivos
(Holmes et al. 2003;

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Kormos y Gaszner 2013).

El neuropetido Y (NPY) esta ampliamente distribuido dentro del sistema nervioso, con altas concentraciones en diferentes regiones corticales y limbicas. En el hipocampo, la mayor poblacion de celulas inmunorreactivas al NPY se encuentran en la capa polimorfica del DG, siendo todas neuronas GABAergicas
(Kohler et al. 1986;
Sperk et al. 2007). Los receptores Y1 e Y2 del neuropeptido NPY (NPYY1R y NPYY2R, respectivamente) estan tambien expresados en el hipocampo, aunque el NPYY1R esta distribuido de forma abundante a traves de todo el DG
(Dumont et al. 1996;
Paredes et al. 2003). Ademas, se ha relacionado directamente el aumento en el NPY y en la expresion de NPYY1R en el DG con el efecto antidepresivo del NPY en ratas, sugiriendose un papel del sistema NPY-NPYY1R en la pato-fisiologia de la depresion
(Jimenez-Vasquez et al. 2007;
Bjornebekk et al. 2010;
Catena-Dell'Osso et al. 2013). Asi, la administration intracerebroventricular (icv) de NPY o de [Leu31,Pro34]NPY (agonista del NPYY1R) induce un efecto antidepresivo en el test de natation forzada (FST), que se bloquea con la coadministracion de un antagonista del NPYY1R
(Redrobe et al. 2002;
Stogner y Holmes
2000). De esta forma, la potenciacion de la transmision del NPY a traves del receptor NPYY1 es uno de los mecanismos subyacentes a los antidepresivos y a las terapias electroconvulsivas
(Caberlotto et al. 1999;
Madsen et al. 2000). De forma opuesta, modelos geneticos y medioambientales de depresion en ratas muestran una disminucion de los niveles de NPY y de NPYY1R en el DG
(Mathe et al. 1998;
Jimenez-Vasquez et al. 2007).

La galanina (GAL) es tambien un neuropeptido ampliamente distribuido en el sistema nervioso central
(Jacobowitz et al. 2004). Tres receptores de la GAL (GALRs) estan involucrados en comportamientos relacionados con la depresion a traves de la modulation de los sistemas neuroendocrinos y monoaminergico, con una action diferente dependiendo del subtipo de GALR
(Fuxe et al. 2012;
Wrenn y Holmes 2006). Asi, la infusion icv de GAL o la estimulacion de GALR1 y/o GALR3 produce un fenotipo tipo-depresion, mientras que la activation de GALR2, que se expresa principalmente en el DG
(O'Donnell et al. 1999), induce un comportamiento antidepresivo en el FST
(Barr et al. 2006;
Kuteeva et al. 2007;
Kuteeva et al.
2008;
Borroto-Escuela et al. 2014;
Millon et al. 2014).

Se ha demostrado que la GAL interacciona con NPYY1R en diferentes regiones incluyendo los nucleos de la amigdala, una region clave en los comportamientos relacionados con el estres en ratas
(Diaz-Cabiale et al., 2011;
Narvaez et al., 2014). Se ha descrito como GAL, a traves de GALR2, potencia las acciones ansiolrticas mediadas por NPYY1R. Esta interaction facilitadora

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GALR2/NPYY1R tiene lugar en la amlgdala a nivel celular y de receptor involucrando la formation de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R
(Narvaez et al. 2014). Ademas, los estudios de senales intracelulares indicaron que GALR2 en el complejo heterorreceptor GALR2/NPYY1R cambia el acoplamiento de Gq a Gi/o en ambos receptores, con lo que ambos operarlan a traves de Gi/o, produciendo un efecto inhibitorio aditivo en los efectos a traves de adenilciclasa
(Narvaez et al., 2014).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

A efectos de la presente invention se entiende por agonista toda sustancia que es capaz de unirse a un receptor celular y provocar una acciion determinada en la celula similar a la producida por una sustancia fisiologica que constituya el ligando natural de dicho receptor celular.

Las interacciones entre GALR2 y NPYY1R en el DG se han evaluado mediante autorradiografla cuantitativa e hibridacion in situ. Ademas, la presencia de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R se ha analizado en las subregiones del DG por ensayo de ligazon por proximidad in situ
(Borroto-Escuela et al. 2013). Se ha encontrado una interaction GALR2/NPYY1R a nivel del comportamiento depresivo en el test de natation forzada en ratas. Ademas se ha encontrado una activation celular especlfica utilizando inmunohistoqulmica en subregiones del DG inducida por la interaccion GALR2/NPYY1R.

La galanina (GAL) y los agonistas del NPYY1R participan en la regulation del comportamiento y ambos peptidos interaccionan en diferentes funciones a nivel central. Se ha analizado la interaccion entre el receptore 2 de GAL (GALR2) y el receptor Y1 del neuropeptido Y (NPYY1R) en el giro dentado (DG) del hipocampo en relation con el comportamiento relacionado con la depresion. Utilizando autorradiografia, hibridacion in situ, y ligazon por proximidad in situ se ha demostrado la interaccion entre GALR2 y NPYY1R en el DG probablemente involucrando la formacion de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R. Estos complejos se han observado especlficamente en las subregiones polimorficas y subgranulares del DG, donde ambos receptores colocalizan. Ademas, esta interaccion GALR2/NPYY1R se ha relacionado con un aumento en el efecto antidepresivo mediado por el NPYY1R en el test de natacion forzada. Poblaciones de celulas especlficas dentro de las subregiones del DG pueden estar involucradas en este efecto a nivel de comportamiento ya que la coactivacion entre GALR2 y NPYY1R potencia la reduction de c-Fos mediada por

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NPYY1R en la region polimorfica. Estos resultados indican que la interaction entre GALR2/NPYY1R puede indicar un mecanismo novedoso en el DG en el comportamiento relacionado con la depresion y puede sentar las bases para el desarrollo de farmacos que actuen sobre los complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R en el DG del hipocampo para el tratamiento de la depresion.

De acuerdo con esto, la invention se refiere a un metodo de screening para la identification de agonistas de GALR2 y/o agonistas de NPYY1R capaces de promover la interaccion entre dichos GALR2 y NPYY1R as! como la formation de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R, comprendiendo las etapas de (i) administrar dichos agonistas y (ii) evaluar la interaccion entre dichos receptores GALR2 y NPYY1R y la formacion de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R. En una realization preferida, dichos agonistas a administrar son al menos dos compuestos, un primer agonista de un receptor tipo 2 de galanina (GALR2), y un segundo agonista de un receptor tipo Y1 del neuropeptido Y (NPYY1R), comprendiendo las etapas de de (i) administrar dichos primer y segundo agonistas y (ii) evaluar la interaccion entre dichos receptores GALR2 y NPYY1R y la formacion de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Efectos de la galanina tras su administration icv sobre el ligado de

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[ I]Leu ,Pro PYY, agonista del receptor NPYY1 (NPYY1R), con el receptor NPYY1R en el giro dentado del hipocampo. Grafica que muestra los valores especlficos del ligado

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[ I]Leu ,Pro PYY (25 pM), expresados como media ± SEM (Standard Error of the Mean, error estandar de la media). El ligado no especlfico (en presencia de NPY 1 pM) se sustrajo digitalmente de las medidas. *P <0,05 versus grupo control conforme a la prueba t de Student (n=6 por grupo). Abreviaturas: aCSF= llquido cefalorraquldeo, que indica los niveles basales de

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[ I]-Leu Pro PYY. GAL= galanina.

Figura 2. Efecto de la administracion icv de galanina en la expresion de ARNm del receptor NPYY1 (NPYY1R) en el giro dentado del hipocampo. Grafica que muestra los valores, expresados como media ± SEM, de la densidad optica del ARNm de NPYY1R (concentration

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de sonda 2,4 pmol/pl, marcada con P-dATP). ***P <0,001 versus grupo control conforme a la prueba t de Student (n=6 por grupo). Abreviaturas: aCSF= llquido cefalorraquldeo, que indica

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los niveles basales de densidad optica del ARNm del NPYY1R . GAL= galanina.

Figura 3. Detection de los complejos de heterorreceptores entre el receptor 2 de galanina (GALR2) y el receptor Y1 del NPY (NPYY1R) por ligazon por proximidad (PLA). Los clrculos blancos indican regiones PLA positivas principalmente en la capa polimorfica, pero tambien en la zona subgranular del giro dentado (Bregma -3,1mm). Los clrculos negros indican senal negativa de PLA en la capa molecular del giro dentado y en el cuerpo calloso.

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Figura 4. Efecto de la galanina y de [Leu -Pro ]NPY, agonista del receptor Y1 del neuropeptido Y (NPYY1R), en el comportamiento relacionado con la depresion en el test de natacion forzada. La potenciacion de la galanina de la accion relacionada con el comportamiento depresivo mediada por NPYY1R se bloquea por M871, un antagonista del receptor 2 de galanina (GALR2). Las graficas muestran los datos, expresados como media ± SEM, obtenidos en el test de natation forzada: (a) tiempo de inmobilidad, (b) tiempo dedicado a la natacion, (c) tiempo dedicado a escalar. ANOVA de un factor seguido del test de comparaciones multiples Newman-Keuls (n=6-8 animales en cada grupo). En (a): ***P <0,001 versus el resto de los grupos; AAAP <0,001 versus aCSF y GAL+Y1 3 nmol; aP <0,001 versus aCSF; **P <0,01 versus GAL+Y1 3 nmol. En (b): AAAP <0,001 versus aCSF, GAL 3 nmol, GAL+Y1 3 nmol; ***P <0,001 versus el resto de los grupos. En (c): ***P <0,001 versus aCSF; *P <0,05 versus Y1 3 nmol y GAL+Y1+M871 3 nmol. Abreviaturas: GAL = galanina; Y1 =

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[Leu -Pro ]NPY, agonista del receptor NPYY1; GAL+Y1 = coadministracion de GAL y [Leu -

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Pro ]NPY; GAL+Y1+M871 = coadministracion de GAL, [Leu -Pro ]NPY y M871, antagonista de GALR2.

Figura 5. Efectos de galanina y del agonista del receptor NPYY1 (NPYY1R), solos o en combination con M871, antagonista del receptor 2 de galanina (GALR2), en la expresion de cFos en las capas polimorficas y granulares del giro dentado. (a-b) Cuantificacion del numero total de nucleos c-Fos IR (esto es, c-Fos detectado mediante inmunohistoqulmica) dentro de las capas polimorficas y granular. Los datos, expresados como media ± SEM, muestran las diferencias entre los grupos despues de la inyeccion intracerebroventricular de aCSF, GAL,

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[Leu -Pro ]NPY, o la coadministracion de ambos peptidos y M871. (a) La coadministracion de

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GAL y [Leu -Pro ]NPY disminuye la expresion de c-Fos comparada con ambos peptidos solos

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y el grupo aCSF. Ademas el efecto de la coadministracion de GAL y [Leu -Pro ]NPY se

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bloquea con M871. *P<0,05 versus aCSF; ^P<0,05 versus aCSF, Y1 y GAL+Y1+M871; ***P<0,001 versus Y1 y GAL+Y1+M871; AAAP<0,001 versus aCSF y GAL. (b) La

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coadministracion de GAL y [Leu -Pro ]NPY aumenta la expresion de c-Fos comparada con ambos peptidos solos y el grupo aCSF. Ademas el efecto de la coadministracion de GAL y

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[Leu -Pro ]NPY se bloquea con M871. *P<0,05 versus GAL+Y1 3 nmol; **P<0,01 versus GAL, Y1 y GAL+Y1+M871; ***P<0,001 versus aCSF; **P<0,01 versus Y1 y GAL+Y1+M871. ANOVA de un factor seguido del test de comparaciones multiples de Newman-Keuls (n=4 en cada

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grupo). Abreviaturas: aCSF = llquido cefalorraquldeo; GAL = galanina; Y1 = [Leu -Pro ]NPY,

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agonista del receptor NPYY1; GAL + Y1 = coadministracion de GAL y [Leu -Pro ]NPY;

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GAL+Y1+M871= coadministracion de GAL, [Leu -Pro ]NPY y M871 (antagonista de GALR2). MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION

A lo largo de esta solicitud se referencian varias publicaciones. Los contenidos de todas estas publicaciones y de aquellas referenciadas dentro de las mismas se incorporan por referencia en su totalidad en esta solicitud con objeto de describir de la forma mas completa el estado de la tecnica al que pertenece esta invencion. La terminologla usada aqul lo es con el objetivo de describir realizaciones especlficas unicamente y no se pretende que sea limitante.

En concreto, se procede a continuation a detallar los diferentes aspectos y etapas del metodo

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objeto de la invencion recurriendo para su validation a los compuestos GAL y [Leu - 34

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Pro ]NPY, cuya capacidad para promovoer la interaction entre GALR2 y NPYY1R, asl como la formation de heterorreceptores GALR2/NPYY1R ha quedado nuevamente confirmada, esta vez a nivel de giro dentado (DG), tras una primera demostracion a nivel de amigdala ya comprendida en el estado de la tecnica (Narvaez et al., 2014).

Materiales y metodos

Animales

Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de CRIFFA (Barcelona; 200-250 gr) que tuvieron acceso libre a la comida y al agua. Se mantuvieron bajo las condiciones estandar de ciclos de 12 horas de luz/oscuridad, en temperatura controlada (22±2 oC) y humedad relativa (55-60%).

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Los procedimientos experimentales se aprobaron por el Comite de Etica de la Universidad de Malaga, de acuerdo con la Directiva Europea (86/609/EEC) y Espanola (Real Decreto 53/2013).

Las descripciones detalladas de la canulaciones intracerebrales y la administration de los peptidos a los animales se proporcionan mas adelante (“information complementaria”).

Autorradiografia cuantitativa

El procedimiento y las dosis de GAL estan basadas en trabajos previos
(Diaz-Cabiale et al.
2011;
Narvaez et al. 2014). Quince minutos despues de las inyecciones icv de aCSF o GAL (3 nmol) (n=6 por grupo) las ratas fueron sacrificadas por decapitation y sus cerebros fueron rapidamente sacados del hueso y congelados a -40 °C en isopentano. Las secciones coronales (14 pm de grosor) se cortaron en un criostato (HM550, Microm International) a niveles de bregma de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson
(Paxinos G. 1986) (Niveles de Bregma hipocampales DG de -2,12 mm a -4,52 mm) y se montaron en portas gelatinizados. Las secciones se preincubaron durante una hora a temperatura ambiente en un tampon Krebs- Ringer fosfato (KRP) a pH 7,4 y despues se incubaron durante 2 h en tampon KRP con 0.1% BSA, 0,05% bacitracina, 25 pM de agonista [125I]-[Leu31,Pro34]PYY ((agonista de NPYY1R; Perkin-Elmer, USA)
(Dumont et al. 1996). El ligado no especlfico se definio como el ligado en presencia de NPY 1 pM. Despues de la incubation, las secciones se lavaron cuatro veces (2 min cada vez) en tampon KRP frlo, se sumergieron en agua desionizada para quitar las sales, y rapidamente se secaron en una corriente de aire frlo. Las secciones se colocaron en casetes de rayos X y se expusieron a films Hyperfilms, (Kodak Biomax MR film, Kodak, Rochester, NY) durante 6 dlas junto con microescalas de 125I (Amersham International) como estandares de referencia.

Los autorradiogramas se analizaron en el DG del hipocampo (0,15 mm2 cuadrado) conforme a
Parrado et al. 2007.

Hibridacion In situ

La hibridacion In situ se llevo a cabo siguiendo protocolos ya descritos
(Bjornebekk et al. 2010). Brevemente, 5 horas despues de la inyeccion icv de aCSF o GAL (3 nmol) (n=6 por grupo) las secciones coronales del cerebro (14 pm) se cortaron en criostato y se montaron en portas. El

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coctel de hibridacion contenla formamida 50%, SSC 4x ( SSC 1x, NaCI 0,15 M, citrato sodico 0,015 M, pH 7,0), solution de Denhardt 1x, Sarcosyl 1%, Na3PO4 0,02 M, pH 7,0, dextrano sulfato 10%, ditiotreitol 0,06 M y ADN de esperma de salmon 0,1 mg/ml. Se utilizaron sondas de oligonucleotidos especlficas para NPYY1R. Las sondas se marcaron con 33P-dATP (Perkin- Elmer, Boston, MA). La hibridacion se realizo durante 18 horas en un camara humeda a 42°C. Despues de la hibridacion, las secciones se lavaron 4 veces 20 min cada vez en SSC 1x a 60°C. Finalmente, las secciones se lavaron durante 10 segundos en agua esterilizada en autoclave, se deshidrataron en alcohol y se secaron al aire. Despues, las secciones se expusieron en un film (Kodak Biomax MR film, Kodak, Rochester, NY) durante 7 dlas antes del revelado. Los films se escanearon y los valores en densidad optica se cuantificaron en las diferentes regiones marcadas en el DG.

Ensayo de ligazon por proximidad in situ

El ensayo de ligazon por proximidad (PLA) in situ se realizo conforme a
Borroto-Escuela et al.
2013 y
Narvaez et al. 2014. Los animales sin tratar (n=3) se perfundieron con paraformaldehido al 4%, se obtuvieron los cerebros y las secciones a nivel del DG. Las secciones se incubaron con soluciones bloqueantes (suero de cabra 5%) y permeabilizantes (Triton X100 0.3% en PBS) durante 60 minutos cada vez. Anticuerpos primarios dirigidos contra GALR2 y NPYY1R obtenidos mediante diferentes hospedadores (conejo, Alomone Lab, 1:100; y cabra, Santa Cruz Biotechnology INC, CA, 1:200; respectivamente) se incubaron durante 24 horas a 4°C. La detection de la senal PLA se realizo siguiendo las instrucciones del proveedor (kit de detection Duolink in situ PLA; Olink, Suecia) con PLA con o sin sondas para los anticuerpos de conejo o cabra. Las secciones se montaron en portas con un medio de montaje para fluorescencia (Dako) que contiene 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:200), que marca los nucleos con color azul. Para los experimentos control se utilizo solo un anticuerpo primario. Las senales PLA se visualizaron utilizando un microscopio confocal TCS-SL (Leica).

Test de natacion forzada

El comportamiento tipo depresion se analizo mediante FST, propuesto originalmente como un modelo de depresion inducido por estres
(Porsolt et al. 1977). De forma importante, la respuesta de inmovilidad en el FST puede prevenirse por diferentes tipos de tratamientos antidepresivos, incluyendo los antidepresivos triclclicos, los inhibidores de la monoamino- oxidasa, SSRIs, e inhibidores de la recaptacion de la NA
(Petit-Demouliere et al. 2005;
Kuteeva

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et al. 2008).

Los animales se adaptaron a la manipulation y se llevaron a la habitation del experimento (8090 lux) durante al menos una hora para habituarse antes de la administration icv de los peptidos. Las ratas se situaron individualmente en tanques cillndricos con una altura de 50 cm y un ancho de 20 cm, que contenlan agua (25±0.5°C) con una altura de 30 cm. Los animales fueron obligados a nadar durante un periodo de 15 minutos (pre-test) y 24 horas despues fueron sometidos a una sesion de 5 minutos (test) 15 minutos despues de la administracion de GAL, [Leu31,Pro34]NPY (agonista de NPYY1R) y M871 (antagonista de GALR2), solos o en combination (n=6-8 animales en cada grupo). Las dosis efectivas para GAL, [Leu31,Pro34]NPY y M871 se seleccionaron en base a curvas dosis-respuestas conforme a
Diaz-Cabiale et al.
2011;
Millon et al. 2014; y
Narvaez et al. 2014. El tiempo total dedicado a flotar (inmovilidad), nadar, y escalar se registro durante el test de 5 minutos. Se considera que las ratas estan inmoviles cuando flotan sin dificultad, realizando solo aquellos movimientos necesarios para mantener sus cabezas por encima del agua. Se considero que las ratas estaban en situation de natation cuando activamente nadaban alrededor del cilindro, mientras que se considero que las ratas estaban en situacion de escalada cuando realizaban un movimiento vigoroso en las paredes del cilindro. Despues de las sesiones de natacion, se sacaron las ratas del tanque, se secaron cuidadosamente en jaulas calentadas y volvieron a las jaulas originales. Los experimentos de comportamiento se realizaron siempre entre las 09:00 y las 14:00 horas.

Inmunohistoquimica c-Fos

Los animales se dividieron en cinco grupo experimentales: (1) aCSF: grupo control; (2) GAL 3 nmol: grupo tratado con galanina 3 nmol; (3) Y1 2,5nmol: grupo que recibio [Leu31,Pro34]NPY 2,5 nmol; (4) GAL 3 nmol + Y1 2,5nmol: grupo administrado con ambas sustancias; (5) GAL+Y1+M871 3 nmol: grupo inyectado con GAL, [Leu31,Pro34]NPY y M871 3 nmol (n=4 en cada grupo). Todas las dosis estan basadas en protocolos conocidos
(Parrado et al. 2007;
Kuteeva et al. 2008;
Diaz-Cabiale et al. 2011).

Las ratas anestesiadas con pentobarbital sodico (Mebumal; 100 mg/kg, i.p.) se perfundieron con paraformaldehido al 4% (peso/volumen, Sigma) 90 minutos despues de las inyecciones icv y los cerebros se cortaron en secciones coronales y se realizaron inmunohistoqulmicas basadas en protocolos conocidos
(Diaz-Cabiale et al. 2011). El anticuerpo primario, un anticuerpo contra la protelna c-Fos (1:5000, sc-52, Santa Cruz Biotechnology, CA), revelado

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con DAB + nlquel, se utilizo como marcador indirecto de actividad neuronal. El anticuerpo de Calbindina-D28k (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, CA), revelado con DAB, se utilizo para marcar la region granular dado que marca exclusivamente las celulas hipocampales granulares, aunque hay algunas interneuronas en el hilus que son inmunorreactivas a la calbindina
(Scharfman et al. 2002). Se utilizaron anticuerpos secundarios especlficos biotinilados. Las secciones se montaron en portas de vidrio y las diferentes capas del giro dentado se analizaron utilizando un metodo de fraccionador optico basado en un microscopio estereologico (microscopio BX51, Olympus, Dinamarca) conforme a
Diaz-Cabiale et al. 2011.

Analisis estadistico

Los datos se presentan como la media ± SEM y el numero de muestras (n) se indica en la description de las figuras. Todos los datos se analizaron utilizando GraphPad PRISM 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Para comparar dos condiciones experimentales, se utilizo el analisis estadistico de la prueba de t de Student sin aparear. En el resto de casos se utilizo el analisis de la varianza (ANOVA) de un factor seguido del test de Newman-Keuls. Las diferencias se consideraron significativas a p<0,05 (*p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001).

Information complementaria

Canulaciones intracerebrales

Las ratas anestesiadas intraperitonealmente con Equitesina (3,3 ml/Kg) se implantaron con una canula gula de acero inoxidable con una aguja de calibre 22 (Plastics One In) en el ventrlculo lateral derecho con las siguientes coordenadas estereotaxicas i: +1,4 mm lateral, -1 mm posterior a bregma, y 3,6 mm debajo de la superficie del hueso (Paxinos et al. 1985). Despues de la cirugla, los animales se ubicaron individualmente y se permitio su recuperation durante 7 dlas. Este metodo de canulacion y cuidado postquirurgico ha sido previamente estandarizado (Diaz-Cabiale et al. 2011; Narvaez et al. 2014).

Administration intracerebroventricular de los peptidos

Las ratas canuladas se asignaron arbitrariamente a los diferentes grupos. Los peptidos se

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prepararon nuevamente para cada administration disolviendolos en aCSF y se inyectaron en el ventrlcuio lateral. El volumen total fue de 5 pl por inyeccion con un tiempo de infusion de 1 min. La galanina, el [Leu31,Pro34]NPY (Ki=0,39 nM para NPYY1R) y el M871 (Ki=13,1 y 420 nM para GALR2 y GALR1 respectivamente) se obtuvieron de Tocris Bioscience (Bristol, UK). El grupo experimental y el tamano de cada grupo se indican en los diferentes procedimientos. Despues de los experimentos, se comprobo el sitio de inyeccion utilizando secciones obtenidas en criostato (HM550, Microm International). Los procedimientos de las inyecciones intracerebroventriculares (icv) y la preparation del llquido cefalorraquldeo (aCSF) han sido estandarizados previamente en el laboratorio de los inventores (Diaz-Cabiale et al. 2011; Narvaez et al. 2014).

Analisis de las imagenes de la autorradiografia y de la hibridacion in situ

Los autorradiogramas de los experimentos de autorradiografia y de hibridacion in situ se analizaron conforme a Parrado et al. 2007 y Razani et al. 2001, utilizando un sistema de analisis de imagen por ordenador. Brevemente, las medidas se realizaron con el sistema ImageJ (NIH, USA) bilateralmente en las distintas regiones marcadas en el DG del hipocampo (0,15 mm2). Se obtuvo una medida por region y rata, ya que se calculo la media de las medidas. Se midieron secciones duplicadas para autorradiografia y triplicadas para la hibridacion in situ para cada tratamiento. Se utilizaron pollmeros prefabricados marcados con 125I- (Amersham Microscale, Amersham, Little Chalfont, UK) para convertir los valores grises en fentomol/miligramo de protelna. Las medidas semi-cuantitativas de los autorradiogramas de la hibridacion in situ se analizaron a partir de los valores de densidad optica (DO) especlfica medidos.

Analisis estereologico de la inmunohistoquimica c-Fos

Se utilizo un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Dinamarca) conectado a un ordenador y a una camara digital de video JVC. El analisis estereologico, de las muestras positivas para cFos se realizo en la region del giro dentado (DG) a nivel rostro-caudal utilizando un fraccionador optico. Este metodo combina la diseccion optica con un sistema de fraccionador de muestras para excluir los volumenes divergentes (Gundersen et al. 1988). Utilizar una fase de contraste y la inmunorreactividad de la calbindina de la capa de celulas granulares permitio delinear el area del DG de cada section (Paxinos et al., 1985). Las secciones se tomaron cada 150 pm, empezando por la parte ventral del DG (aproximadamente 2,12 mm posterior a

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Bregma). Se termino aproximadamente 4,52 mm posterior a Bregma en la parte dorsal del DG. El numero de c-Fos IR se cuantifico en al menos cinco secciones representativas a 150 pm por animal (4 ratas por grupo). Utilizando C.A.S.T. Grid (Olympus; Albertslund, Dinamarca) se genero para cada seccion una seria aleatoria de muestras con un area conocida (frame a) . Despues de que el objeto fuera contado (IQ-) el numero total de celulas positiva se estimo como: N = IQ- x fs x fa x fh (Gundersen et al. 1988), donde fs es la fraccion numerica de la seccion utilizada, fa es la fraccion del area y fh es la fraccion linear del grosor de la seccion. El coeficiente de error (CE) para cada estimation y animal estuvo entre 0,05 y 0,1. El CE total de cada grupo se encontro entre 0,07 y 0,08. El contaje de las neuronas marcadas comenzo 5 pm por debajo de la superficie y se centro a traves del una seccion de 20 pm del plano optico. Se contaron al menos cinco secciones para cada region por animal. El numero de frames utilizado por animal en el DG fue de 90-110, representando el 20% del volumen total analizado.

Inmunofluorescencia doble

Se emplearon protocolos conocidos (Narvaez et al. 2014). Las ratas sin tratamiento (n=3) se perfundieron con paraformaldehido al 4%, se obtuvieron los cerebros y secciones a nivel del DG. Se realizo una incubation inicial en soluciones con bloqueantes (suero de cabra 5%) y permeabilizantes (Triton X100 0,3% en PBS) durante 60 minutos cada vez. El anticuerpo primario de conejo antiGALR2 (Alomone Lab, 1:100) se incubo durante 48-72 horas a 4°C y se detecto con un anticuerpo secundario rojo de raton anti-conejo DyLight 549 (Jackson inmunoResearch Laboratories, 1:100). Las secciones tambien se incubaron con un anticuerpo anti-NPYY1R de cabra (Santa Cruz Biotechnology INC, EEUU, 1:200) en una forma similar a la descrita, y se detecto en este caso con un anticuerpo secundario verde de raton anti-cabra DyLight 488 (Jackson Laboratories InmunoResearch, 1:100). Los nucleos se detectaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:200). Las secciones se montaron en portas con un medio de montaje para fluorescencia (Dako) y se visualizaron utilizando un microscopio confocal TCS- SL (Leica).

Inmunomarcaje doble c-Fos/GAD

Se emplearon protocolos para la inmunohistoqulmica doble de c-Fos y glutamato decarboxilasa (GAD) 65/67 conocidos (Narvaez et al., 2014). El anticuerpo primario utilizado GAD65/67 se ha validado para detectar neuronas GABAergicas (1:1000, sc-7513; Santa Cruz Biotechnology, CA) (Papay, 2006). De hecho, se ha utilizado el GAD 65/67 para marcar neuronas

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GABAergicas en el hilus y en la zona subgranular (Muller et al. 2001). Se utilizo el cromogeno 3-3'tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) (Sigma, Espana) con el anticuerpo GAD 65/67 para obtener una reaccion marron. La inmunohistoqulmica c-Fos (revelada con DAB + nlquel) se ha descrito anteriormente en este documento. La secciones se montaron en portas de cristal y se obtuvieron las microfotograflas (microscopio BX51, Olympus, Dinamarca).

Resultados

La galanina aumenta el ligado a NPYY1R y la expresion de ARNm de NPYY1R en el DG

La inyeccion icv de galanina 3 nmol produce un aumento de un 20% (t=1,924, p<0,05, df=10) en el ligado de [I125]-[Leu31,Pro34]PYY a 25 pM (agonista de NPYY1R) en el DG (Figura 1) sugiriendo que la galanina aumenta el reconocimiento de NPYY1R en este area. El ligado de [125I]-[Leu31,Pro34]PYY se observa fundamentalmente en las capas moleculares y granulares.

Ademas, la galanina modifica no solo el ligado a NPYY1R sino tambien la expresion de ARNm de NPYY1R en la capa granular del DG (Figura 2). Asl, 5 horas despues de la administration icv de galanina 3 nmol se detecta un aumento de un 31% (t=5,327, p<0,001, df=10) en la expresion de ARNm de NPYY1R en la capa granular del DG .

GALR2 y NPYY1R forman clusteres PLA positivos en subregiones especlficas del DG

Dentro del DG, se encuentran clusteres PLA-positivos especlficamente en la capa polimorfica y zona subgranular del DG (Figura 3, clrculos blancos). Estos clusteres PLA indican que GALR2 y NPYY1R estan muy proximos y pueden formar complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R en estas regiones. La especificidad de la senal se confirma por el hecho de que no se observan clusteres PLA ni en la capa molecular del DG, ni en el corpus callosum, una zona en la que no existe GALR2
(O'Donnell et al. 1999) (Figura 3, clrculos negros).

En la misma direction de estos resultados, se observa un colocalizacion abundante de GALR2 y NPYY1R especlficamente en la capa polimorfica y la zona subgranular del hilus.

La galanina potencia el comportamiento antidepresivo mediado por NPYY1R

En el FST, las ratas se expusieron al agua durante 15 minutos. Veinticuatro horas mas tarde, la

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inmovilidad, la natacion y la escalada se registraron durante una segunda exposition al agua de 5 minutos para estudiar los comportamientos relacionados con la depresion. La administration icv del agonista de NPYY1R (3 nmol) produce un efecto antidepresivo en el FST, ya que disminuye significativamente la inmovilidad (ANOVA de un factor, F4,30 = 44,81, p<0,001, test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4a) y aumento la natacion (ANOVA de un factor, F4,30 = 48,25, p < 0,001, test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4b). Ademas, se observa una disminucion significativa en la escalada (ANOVA de un factor, F4,30 = 14,42, p<0,001, test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4c).

Por el contrario, la icv de galanina (3 nmol) aumenta significativamente el tiempo de inmovilidad (test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4a) y disminuye el comportamiento de escalada (test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4c). Estos patrones de comportamiento indican que la galanina produce una respuesta depresiva.

Sin embargo, se observo que la galanina provoca un fuerte aumento de la action antidepresiva del agonista del NPYY1R tras la coadministracion de galanina y dicho agonista de NPYY1R. La inyeccion icv de ambas sustancias aumenta significativamente la disminucion de la inmovilidad (test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4a) y aumenta la natacion (test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4b) comparada con el agonista de NPYY1R solo. Ademas, se observa tambien una potenciacion significativa de la disminucion de la escalada (test de Newman-Keuls: p<0,05; Figura 4c).

GALR2 esta involucrado en esta interaction ya que la presencia de M871 bloquea el aumento de la disminucion de la inmovilidad (test de Newman-Keuls: p<0,01; Figura 4a) y de la escalada (test de Newman-Keuls: p<0,05; Figura 4c) asl como el aumento en la natacion (test de Newman-Keuls: p<0,001; Figura 4b) inducida por la coadministracion de galanina y del agonista del NPYY1R en el FST.

M871, solo, a la dosis de 3 nmol, no tiene efectos ni en la inmovilidad (t=1,398, p 0,096, df=10, mediaiSEM 86,9±7), escalada (t=0,475, p 0,322, df=10, mediaiSEM 44,4±6) o natacion (t=0,695, p 0,251, df=10, mediaiSEM 146±15) comparada con el control.

Patron de activation de c-Fos y poblaciones celulares involucradas tras la coadministracion de galanina y rLeu31,Pro34lNPY en las subregiones del DG

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Como se observa en la Figura 5, la inyeccion icv de [Leu31,Pro34]NPY (2,5 nmol) produce una disminucion del numero de c-Fos IR en la region polimorfica (ANOVA de un factor, F4,15 = 20,81, p<0,001, test de Newman-Keuls: p<0,05; Figura 5a), mientras que se produce un aumento de c-Fos IR en la capa granular del DG (ANOVA de un factor, F4,15 = 15,08, p<0,001, test de Newman-Keuls: p<0,01; Figura 5b). Por otro lado, la galanina (3 nmol) aumenta significativamente el numero de c-Fos IR en ambas zonas, la polimorfica (test de Newman- Keuls: p<0,05) y la capa granular del DG (test de Newman-Keuls: p<0,01) (Figura 5a,b). No se observa c-Fos IR en la capa molecular despues de la administration de forma aislada de galanina o del agonista del NPYY1R.

Sin embargo, la coinyeccion del agonista del NPYYR1 y de galanina modifican significativamente el numero de c-Fos IR comparado con el efecto de la galanina o del agonista del NPYY1R de forma aislada en ambas subregiones del DG. Dentro de la zona polimorfica, la coadministracion de galanina y [Leu31,Pro34]NPY disminuye significativamente el c-Fos IR comparado con el agonista del NPYY1R (test de Newman-Keuls: p<0,05), la galanina (test de Newman-Keuls: p<0,001) y el grupo control (test de Newman-Keuls: p<0,001) (Figura 5a). En esta region, las interneuronas GABA podrlan estar involucradas en la interaction dado que cFos IR colocaliza con el marcador GABAergico (GAD65/67) tras la inyeccion del agonista del NPYY1R.

Dentro de la capa granular, la coadministracion de galanina y del agonista de NPYY1 aumenta significativamente la expresion de c-Fos IR en la capa granular (Figura 5a) comparada con la administracion de galanina (test de Newman-Keuls: p<0,05) y de [Leu31,Pro34]NPY (test de Newman-Keuls: p<0,01) de forma aislada.

El co-tratamiento con M871 bloquea completamente el efecto de la galanina en ambas regiones, la capa polimorfica y granular del DG (Figura 5a,b), demostrando que el GALR2 esta involucrado en las acciones de la galanina.

Discusion

La presente invention demuestra por primera vez la existencia de una interaccion entre GALR2 y NPYY1R en el DG a nivel de receptor, probablemente involucrando la formation de complejos heterorreceptores GALR2/NPYY1R en base al ensayo de ligazon por proximidad. Estos complejos se observan especlficamente en las subregiones polimorficas y subgranular

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del DG, donde la expresion de ambos receptores colocalizan. Ademas, esta interaction GALR2/NPYY1R se asocia a un incremento antidepresivo que involucra una subpoblacion especlfica dentro de las subregiones del DG. Asl, la coactivacion de GALR2 y NPYY1R potencia la reduction de c-Fos IR en la region polimorfica mediada por NPYY1R. Esta respuesta puede estar ligada con el aumento de c-Fos IR observada en las celulas granulares, y puede dar un mecanismo a nivel de circuitos que explicarla el aumento en la actividad antidepresiva observada tras el co-tratamiento de galanina con [Leu31,Pro34]NPY.

En experimentos de autorradiografla se observa que la galanina interacciona a nivel de membrana con NPYY1R, ya que la galanina produce un aumento en el ligado de [125I]- [Leu31,Pro34]PYY en el DG. Esta modification del ligado del agonista del NPYY1R indica un aumento en la afinidad de NPYY1R en el DG, ya que la concentration utilizada de agonista de NPYY1R (25pM) esta en el rango del valor de Kd, donde los principales cambios son a nivel de afinidad
(Dumont et al. 1996). Este efecto podrla estar involucrado en el incremento de actividad antidepresiva observada despues del co-tratamiento con galanina y con [Leu31,Pro34]NPY en el test de natation forzada a traves de un aumento en el reconocimiento y senal del NPYY1R en el complejo heterorreceptor GALR2-NPYY1R. El GALR2 puede tambien cambiar de senales mediadas por Gq a Gi/o en este complejo receptor
(Narvaez et al. 2014). Se ha descrito previamente un aumento en el ligado del agonista del NPYY1R en la amlgdala inducido por la administracion de galanina y a su vez asociado con un aumento del efecto ansiolltico inducido por NPYY1R
(Narvaez et al. 2014).

Ademas, se ha observado que GAL tambien aumenta la expresion de ARNm del NPYY1R en el DG, efecto que se ha relacionado con los tratamientos antidepresivos. Asl, la terapia electroconvulsiva (ECT) en ratas
(Madsen et al. 2000) y ECT
(Jimenez-Vasquez et al. 2007), y la administration de escitalopram
(Bjornebekk et al. 2010) en las ratas Flinders, un modelo genetico de depresion, aumenta el ARNm del NPYY1R en el DG, y se correlaciona con el efecto antidepresivo en el test de natacion forzada. Con base en estos estudios, el aumento del ARNm del NPYY1R inducido por galanina en el DG puede ser de relevancia para los desordenes depresivos y su tratamiento.

Los resultados de comportamiento actuales demuestran que la galanina potencia los efectos antidepresivos mediados por el agonista [Leu31,Pro34]NPY, disminuyendo la inmovilidad y aumentando la natacion en el FST. El fuerte aumento de la natacion que se observa puede involucrar cambios en los niveles extracelulares de serotonina. De hecho, se conoce que los

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SSRIs selectivos producen un aumento en la natacion en el FST
(Kuteeva et al. 2008). Ya que la galanina modula la transmision serotoninergica en el hipocampo
(Yoshitake et al. 2014) no se puede excluir que la serotonina pudiera estar involucrada en las acciones antidepresivas mediadas por GAL-[Leu31,Pro34]NPY. Ademas, el GALR2 esta involucrado en la interaction GALR/NPYY1R, ya que M871 bloquea la respuesta observada y ademas el GALR2 se ha propuesto en trabajos previos que medie los efectos antidepresivos de la galanina in vivo
(Saar
et al. 2013;
Kuteeva et al. 2008). Los resultados obtenidos tras la administration de galanina y [Leu31,Pro34]NPY de forma independiente coinciden con estudios previos que confirman el papel pro-depresivo de GAL y la action antidepresiva del agonista del NPYY1R
(Redrobe et al.
2002;
Kotagale et al. 2013;
Kuteeva et al. 2008). Los efectos de comportamiento observados en el FST son independientes de la actividad motora, ya que ni la galanina, ni el agonista del NPYY1R ni su coadministracion produjeron alteration motora en diferentes pruebas de comportamiento
(Narvaez et al. 2014).

Dado que el hipocampo participa en los comportamientos depresivos en el FST
(Hiroaki-Sato et
al. 2014;
Bettio et al. 2014), nuestros resultados indican la participation especlfica del DG. Dentro de las subregiones del DG, se observa colocalizacion de GALR2 y NPYY1R y la presencia de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R en las capas polimorficas y subgranular, donde ambos receptores se han descrito previamente
(Depczynski et al. 1998;
Paredes et al. 2003). Los complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R existen en diferentes regiones, incluyendo la amlgdala
(Narvaez et al. 2014). Asl, la senal integrada del complejo de heterorreceptores GALR2/NPYY1R en el nucleo medial paracapsular de la amlgdala potencia los efectos ansiollticos inducidos por [Leu31,Pro34]NPY y se relaciona con una disminucion de c-Fos IR a nivel celular.
(Narvaez et al. 2014). De forma importante, los complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R en el DG se correlacionan con una disminucion de c-Fos en la capa polimorfica. El mecanismo para esta interaccion podrla ser que la coactivacion de los protomeros de los complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R cambian el acoplamiento de GALR2 de Gq a Gi/o junto con un aumento de la afinidad de NPYY1R
(Narvaez et al. 2014). De esta forma, ambos GALR2 y NPYY1R estarlan acoplados a Gi/o y producirlan un aumento en la inhibition de la via AC-PKA-CREB
(Narvaez et al. 2014) y la disminucion de c-Fos IR observada en el hilus despues de la coadministracion de galanina y del agonista del NPYY1R.

El aumento en el numero c-Fos IR observado en la capa de celulas granulares tras la coadministracion de GAL y del agonista de NPYY1R puede estar mediada por la disminucion

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de actividad de las interneuronas GABAergicas polimorficas en el hilus. De hecho, el agonista del NPYY1R produce una inhibition en la neuronas GABAergicas polimorficas
(Paredes et al.
2003), permitiendo una desinhibicion y aumento de la expresion de c-Fos en las celulas granulares del DG
(Andrews-Zwilling et al. 2012;
Ledri et al. 2012). Sin embargo, no se puede excluir que las proyecciones de las celulas mosy del hilus (MCs) a las celulas granulares esten tambien involucradas en este efecto, de hecho, los axones de las celulas mosy in vivo producen la excitation de las interneuronas inhibitorias que inhiben la actividad de las celulas del DG y se ha descrito una correlation inversa a nivel de los perfiles c-Fos IR entre las celulas MCs y las celulas granulares
(Jinde et al. 2012;
Duffy et al. 2013). Ademas, tambien podrlan estar involucrados mecanismos indirectos: Por ejemplo la corticosterona induce una disminucion diferente de la transcription de c-fos, fosB y fra-1 en el DG comparada con otras subregiones hipocampales
(Hansson y Fuxe 2008).

El estado de la tecnica senala un aumento en la expresion de c-Fos en las celulas granulares del DG despues de las terapias antidepresivas como la administration aguda de imipramina
(Li
et al. 2013), reboxetina y la combination con mirtazapina (Masana et al. 2012) y el ejercicio
(Clark et al. 2011). De hecho, el aumento de la actividad de las celulas granulares en el DG se ha relacionado con la disminucion de la inmovilidad en el FST
(Jinde et al. 2012;
Masana et al.
2012). Esta activation especlfica dentro del DG podrla explicar el efecto antidepresivo observado tras la coadministracion de GAL y [Leu31,Pro34]NPY.

En base a todo lo anteriormente expuesto, se demuestra la existencia de una interaction entre GALR2 y NPYY1R a nivel de receptor involucrando probablemente la formation de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R en el DG, especlficamente en las subregiones polimorficas y subgranulares. Esta interaccion GALR2/NPYY1R se asocia con un aumento en la action antidepresiva involucrando poblaciones especlficas de celulas dentro de las subregiones del DG. Asl, los datos contenidos en el presente documento ofrecen un nuevo mecanismo integrativo anti-depresivo basado en la potenciacion de la interaccion de GALR2- NPYY1R permitiendo un aumento en la senal mediada por Gi/o y un aumento del reconocimiento del NPYY1R en el DG.

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Claims (4)

1. ES 2 644 978 A1

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo de screening para la identification de agonistas de receptores tipo 2 de galanina (GALR2) y/o agonistas de receptores tipo Y1 del neuropeptido Y (NPYY1R)

   5 capaces de promover la interaction entre dichos GALR2 y NPYY1R asi como la

   formation de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R, dicho metodo caracterizado por que comprende las etapas de:

   1. administrar dichos agonistas; y
2. 2. evaluar la interaction entre dichos receptores GALR2 y NPYY1R y la formation

   10 de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R.
3. 2. Metodo segun la revindication anterior caracterizado por que dichos agonistas a administrar son al menos dos compuestos, un primer agonista de un receptor tipo 2 de galanina (GALR2), y un segundo agonista de un receptor tipo Y1 del neuropeptido Y

   15 (NPYY1R), comprendiendo las etapas de:

   1. administrar dichos primer y segundo agonistas; y
4. 2. evaluar la interaction entre dichos receptores GALR2 y NPYY1R y la formation de complejos de heterorreceptores GALR2/NPYY1R.

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