WO2021244635A1 - 一种芬乐胺21位代谢物及其制备和应用 - Google Patents

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吴相君
杨青瑞
刘蕊
王宏涛
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石家庄以岭药业股份有限公司
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Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine. Specifically, the present invention relates to a 21-position metabolite of fenleramide and its preparation and application.
  • Fenleramide is a derivative of Annonamide. Its compound structure has been disclosed in Chinese Patent CN1445211 (Publication No.). This patent records the "New Annonamide Derivative and Its Preparation Method" invented by the Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences And its pharmaceutical composition and use”.
  • Fenleramide (chemical name: trans-2-(2,5-dimethoxyphenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-hydroxyphenylethyl) ) Acrylamide) molecular structure is as follows:
  • Fenleramide has a novel mechanism of action, can resist neuronal apoptosis and has neuroprotective effects.
  • the neuroprotective effect of feneramide is not satisfactory. Therefore, the development of new feneramide substitute products is a problem that needs to be solved urgently.
  • An object of the present invention is to provide a 21-position metabolite of fenleramide
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the 21-position metabolite of feneramide
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition
  • Another object of the present invention is to provide the use of the 21-position metabolite of feneramide.
  • the present invention provides a 21-position metabolite of fenendamide, wherein the 21-position metabolite of fenendamide is represented by the following formula (I):
  • the present invention also provides a method for preparing the 21-position metabolite of feneramide, wherein the method comprises preparing the 21-position feneramide represented by formula (I) by using a compound of formula (7) as a raw material Metabolites:
  • the method further comprises preparing a compound of formula (7) by using a compound of formula (6) and a compound of formula (3) as raw materials:
  • the method further comprises preparing a compound of formula (6) by using a compound of formula (5) and a compound of formula (5A) as raw materials:
  • the method further comprises preparing a compound of formula (5) by using a compound of formula (4) and a compound of formula (4A) as raw materials:
  • the method further comprises preparing the compound of formula (3) with the compound of formula (2) and CCl 3 CN as raw materials:
  • the method further comprises preparing a compound of formula (2) by using a compound of formula (1) and (NH 2 NH 2 ) 2 COCH 3 as raw materials:
  • the method includes the following steps:
  • the solvent of step 1 is selected from a mixture of one or more of DMF, dichloromethane, acetonitrile, 1,4-dioxane, DMSO, and tetrahydrofuran.
  • the solvent of step 2 is selected from a mixture of one or more of dichloromethane, DMF, acetonitrile, 1,4-dioxane, DMSO, and tetrahydrofuran.
  • step 3 wherein the solvent in step 3 is acetic anhydride.
  • step 4 and step 5 are each independently selected from one or more of dichloromethane, DMF, acetonitrile, 1,4-dioxane, DMSO and tetrahydrofuran mix.
  • the solvent in step 6 is selected from methanol or one of the following mixed solutions: methanol/water, ethanol/water, acetonitrile/water, 1,4-dioxane/ Water, DMF/water, tetrahydrofuran/water and DMSO/water.
  • step 2 is to prepare the compound of formula (3) with the compound of formula (2) and CCl 3 CN as raw materials in the presence of an organic base.
  • step 3 the compound of formula (5) is prepared by using the compound of formula (4) and the compound of formula (4A) as raw materials in the presence of a catalyst.
  • step 4 in the presence of an organic base, a compound of formula (5) and a compound of formula (5A) are used as raw materials to prepare a compound of formula (6).
  • step 5 the compound of formula (7) is prepared from the compound of formula (6) and the compound of formula (3) in the presence of a catalyst.
  • step 6 when the solvent is selected from methanol/water, ethanol/water, acetonitrile/water, 1,4-dioxane/water, DMF/water, tetrahydrofuran/water, and DMSO/water
  • step 6 is to prepare the compound of formula (I) with the compound of formula (7) as a raw material in the presence of a basic substance.
  • step 6 when the solvent is selected from methanol, step 6 is to prepare the compound of formula (I) in a methanol/sodium methoxide system or a sodium tert-butoxide/methanol system using the compound of formula (7) as a raw material.
  • organic base of step 2 is selected from DBU (1,8-diazabicycloundec-7-ene), triethylamine, diisopropylethylamine and N -One of methylimidazole.
  • the catalyst in step 3 is selected from triethylamine or diisopropylethylamine.
  • organic base in step 4 is selected from a mixture of one or more of triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylimidazole and Nmethylmorpholine.
  • the catalyst of step 5 is selected from one of BF 3 ⁇ Et 2 O, TMSOTf (trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate) and BF 3 ⁇ THF.
  • the alkaline substance in step 6 is a mixture of one or more selected from sodium carbonate, potassium carbonate and sodium hydroxide.
  • step 1 is to carry out the reaction at 10°C-30°C.
  • step 1 is to carry out the reaction at room temperature.
  • step 2 is to carry out the reaction at 10°C-30°C.
  • step 2 is to carry out the reaction at room temperature.
  • step 3 the reaction is carried out under reflux.
  • step 4 the reaction is carried out at 5°C-15°C.
  • step 5 the reaction is carried out at -30°C to -10°C.
  • step 5 the reaction is carried out at -20°C.
  • step 6 is to perform the reaction at 10°C-30°C.
  • step 6 is to carry out the reaction at room temperature.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing the 21-position metabolite of fenleramide of the present invention, and one or more pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients.
  • Shape agent a pharmaceutical composition containing the 21-position metabolite of fenleramide of the present invention, and one or more pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients.
  • the present invention also provides the application of the 21-position metabolite of fenleramide or the pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of antioxidant drugs, anti-neuroinflammatory drugs and neuroprotective drugs.
  • the present invention also provides the 21-position metabolite of feneramide of the present invention or the pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of drugs for preventing and treating Parkinson's disease, improving learning and memory disorders, treating memory loss and Alzheimer's disease Applications.
  • the present invention provides a 21-position metabolite of fenleramide and its preparation and application.
  • the feneramide 21 metabolite of the present invention has the following advantages:
  • the feneramide 21 metabolite of the present invention has good antioxidant activity, anti-neuro-inflammation and neuroprotective activity.
  • step 1
  • This test example evaluates and compares the in vitro antioxidant, anti-neuro-inflammation and neuroprotective activities of feneramide (FLZ) and the 21-position metabolite of feneramide of the present invention.
  • liver microsomes After weighing the rat liver tissue, a 10% homogenate was prepared with Tris-HC1 buffer, and the liver microsomes were separated by differential centrifugation.
  • the experiment set up blank group, model group, FLZ group and FLZ 21-bit metabolite group, with 3 replicate holes in each group.
  • Each tube of the test drug group was added with FLZ or FLZ 21 metabolites, and the final concentrations were 1 ⁇ 10 -4 , 1 ⁇ 10 -5 and 1 ⁇ 10 -6 M, respectively.
  • the blank group and the model group were added with the same volume of DMSO in each tube. Shake in a 37°C water bath for 15 minutes, add 1 ⁇ 10 -2 M FeSO 4 solution to each tube of the model group and drug-added group, add the same volume of PBS buffer to the blank group, and continue to shake in a 37°C water bath for 15 minutes. Then add TCA solution and TBA solution to each tube, and water bath at 100°C for 10 minutes. Centrifuge at 8000 rpm for 10 min. Take the supernatant and measure the absorbance (OD) at 532nm.
  • BV 2 cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and placed in an incubator at 37°C and 5% CO 2.
  • the cells in the logarithmic growth phase were divided into blank group, model group, FLZ group and FLZ 21-bit metabolite group, with 3 replicate holes in each group.
  • Add different concentrations of FLZ or FLZ 21 metabolites final concentration 1 ⁇ 10 -5 , 1 ⁇ 10 -6 , 1 ⁇ 10 -7 M
  • the blank group and model group plus the same volume of DMSO, after 1 hour, the model group and Add 500ng/mL LPS and incubate for 24h in the dosing group, and add the same volume of PBS buffer to the blank group.
  • NO inhibition rate [1-(C test compound- C blank )/(C model- C blank ] ⁇ 100%
  • SH-SY5Y nerve cells are cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and placed in an incubator containing 5% CO 2 at 37°C. Select logarithmic growth phase cells for experiment.
  • the SH-SY5Y cells were divided into blank group, model group, FLZ group and FLZ 21-bit metabolite group, with 3 replicate holes in each group. Add different concentrations of FLZ or FLZ 21 metabolites (final concentration 1 ⁇ 10 -5 , 1 ⁇ 10 -6 , 1 ⁇ 10 -7 M), 1h later, add 8mM MPP + incubate for 24h in the model group and the dosing group, blank Add the same volume of PBS buffer to the group.
  • Effective rate% (OD test compound- OD model )/(OD blank- OD model ) ⁇ 100%
  • FLZ 21 metabolite T1 has a certain inhibitory effect on the production of MDA, and has a certain dose-effect relationship (Table 1).
  • FLZ 21 metabolites have certain antioxidant, anti-neuro-inflammation and neuroprotective activities, among which high concentrations have better effects and are dose-dependent. FLZ 21 metabolites are more effective than FLZ in anti-neuritis and neuroprotective activities.

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Abstract

本发明提供了一种芬乐胺21位代谢物及其制备和应用。本发明的芬乐胺21位代谢物具有良好的抗氧化活性、抗神经炎症及神经保护活性。所述芬乐胺21位代谢物如下式(I)所示： (I)

Description

一种芬乐胺21位代谢物及其制备和应用 技术领域
本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种芬乐胺21位代谢物及其制备和应用。
背景技术
芬乐胺是番荔枝酰胺的衍生物，其化合物结构已在中国专利CN1445211(公开号)中公开，该专利记载了中国医学科学院药物研究所发明的“新的番荔枝酰胺衍生物及其制法和其药物组合物与用途”。
芬乐胺(化学名：反式-2-(2，5-二甲氧基苯基)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-N-(4-羟苯乙基)丙烯酰胺)分子结构式如下：
Figure PCTCN2021098309-appb-000001
芬乐胺治疗帕金森病(Parkinson's Disease，PD)的药效学作用与已知阳性药左旋多巴相近，活性强于左旋多巴。芬乐胺作用机制新颖，可抗神经细胞凋亡，具有神经保护作用。但芬乐胺对于神经保护的效果并不能让人满意，因此，开发新的芬乐胺替代产品是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种芬乐胺的21位代谢物；
本发明的另一目的在于提供所述芬乐胺21位代谢物的制备方法；
本发明的又一目的在于提供一种药物组合物；
本发明的再一目的在于提供所述芬乐胺21位代谢物的应用。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种芬乐胺21位代谢物，其中，所述芬乐胺21位代谢物如下式(I)所示：
Figure PCTCN2021098309-appb-000002
另一方面，本发明还提供了所述的芬乐胺21位代谢物的制备方法，其中，所述方法包括以式(7)化合物为原料制备式(I)所示的芬乐胺21位代谢物：
Figure PCTCN2021098309-appb-000003
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法还包括以式(6)化合物和式(3)化合物为原料制备式(7)化合物：
Figure PCTCN2021098309-appb-000004
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法还包括以式(5)化合物和式(5A)化合物为原料制备式(6)化合物：
Figure PCTCN2021098309-appb-000005
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法还包括以式(4)化合物和式(4A) 化合物为原料制备式(5)化合物：
Figure PCTCN2021098309-appb-000006
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法还包括以式(2)化合物和CCl 3CN为原料制备式(3)化合物：
Figure PCTCN2021098309-appb-000007
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法还包括以式(1)化合物和(NH 2NH 2) 2COCH 3为原料制备式(2)化合物：
Figure PCTCN2021098309-appb-000008
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括如下步骤：
Figure PCTCN2021098309-appb-000009
Figure PCTCN2021098309-appb-000010
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤1的溶剂选自DMF、二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧六环、DMSO和四氢呋喃中的一种或多种的混合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤2的溶剂选自二氯甲烷、DMF、乙腈、1,4-二氧六环、DMSO和四氢呋喃中的一种或多种的混合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤3的溶剂为乙酸酐。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤4和步骤5的溶剂各自独立的选自二氯甲烷、DMF、乙腈、1,4-二氧六环、DMSO和四氢呋喃中的一种或多种的混合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤6的溶剂选自甲醇、或选自如下混合溶液中的一种：甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、1,4-二氧六环/水、DMF/水、四氢呋喃/水和DMSO/水。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤2是在有机碱的存在下，以式(2)化合物和CCl 3CN为原料制备式(3)化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤3是在催化剂的存在下，以式(4)化合物和式(4A)化合物为原料制备式(5)化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤4是在有机碱的存在下，以式(5)化合物和式(5A)化合物为原料制备式(6)化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤5是在催化剂的存在下，以式(6)化合物和式(3)化合物为原料制备式(7)化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤6当溶剂选自甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、1,4-二氧六环/水、DMF/水、四氢呋喃/水和DMSO/水中的一种时，步骤6是 在碱性物质的存在下，以式(7)化合物为原料制备式(I)化合物。
或者，步骤6当溶剂选自甲醇时，步骤6是在甲醇/甲醇钠体系或叔丁醇钠/甲醇体系中，以式(7)化合物为原料制备式(I)化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤2的有机碱选自DBU(1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯)、三乙胺、二异丙基乙基胺和N-甲基咪唑中的一种。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤3的催化剂选自三乙胺或二异丙基乙基胺。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤4的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基咪唑和N甲基吗啉中的一种或多种的混合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤5的催化剂选自BF 3·Et 2O、TMSOTf(三氟甲磺酸三甲基硅酯)和BF 3·THF中的一种。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤6的碱性物质选自碳酸钠、碳酸钾和氢氧化钠中的一种或多种的混合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤1是在10℃-30℃进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤1是在室温进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤2是在10℃-30℃进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤2是在室温进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤3是在回流下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤4是在5℃-15℃进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤5是在-30℃至-10℃进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤5是在-20℃进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤6是在10℃-30℃进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤6是在室温进行反应。
又一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的芬乐胺21位代谢物，和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
再一方面，本发明还提供了本发明所述的芬乐胺21位代谢物或本发明的药物组合物在制备抗氧化药物、抗神经炎症药物和神经保护药物中的应用。
本发明还提供了本发明所述的芬乐胺21位代谢物或本发明的药物组合物在制备防治帕金森氏病、改善学习记忆障碍、治疗记忆能力减退及阿尔兹海默病的药物中的 应用。
综上所述，本发明提供了一种芬乐胺21位代谢物及其制备和应用。本发明的芬乐胺21位代谢物具有如下优点：
本发明的芬乐胺21位代谢物具有良好的抗氧化活性、抗神经炎症及神经保护活性。
具体实施方式
以下结合实施例详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围包括但是不限于此。
实施例1
步骤1：
在三口瓶中加入四乙酰葡萄糖醛酸(15.0g，39.9mmol)，DMF(150mL)，冰浴氮气保护下加入醋酸肼(4.4g，47.9mmol)，自然回温至室温搅拌4小时，TLC显示反应完全，将体系倒入水(500mL)中，EA(丙烯酸乙酯)(300mL)萃取，有机相用水洗三次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋干得化合物2(11g，收率83％)。
1HNMR CDCl 3δ:5.61-5.55(m,2H),5.23-5.16(m,1H),4.93-4.90(m,1H),4.61-4.58(d,1H,J＝10.0Hz),3.74(s,3H),2.05-2.04(m,9H)。
步骤2：
在三口瓶中加入化合物2(12.0g，35.9mmol)，二氯甲烷(150mL)，冰浴氮气保护下加入三氯乙腈(25.8g，180mmol)，DBU(2.18g，14.4mmol)，溶液变为褐色，自然回温至室温搅拌6小时，TLC显示反应完全，加入三乙胺终止反应。直接湿法硅胶柱层析(硅胶柱先用0.5％三乙胺/石油醚洗脱液润湿)纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5：1-3：1-1：1)，快速过柱得化合物3粗品(12g，收率70％)。
1HNMR CDCl 3δ:8.75(s,1H),6.66-6.65(d,1H,J＝2.8Hz),5.67-5.62(m,1H),5.29-5.26(m,1H),5.18-5.15(m,1H),4.53-4.51(d,1H,J＝10.4Hz),3.77(s,3H),2.10-2.03(m,9H)。
步骤3：
在单口瓶中加入化合物4(20.0g，102mmol)，化合物4A(15.5g，102mmol)， 乙醋酐(47.8g，469mmol)，三乙胺(6.9g，68.4mmol)，130-140℃加热回流15小时，停止反应，降温至90℃，加入水(26mL)回流1小时，减压蒸除溶剂，残留物加二氯甲烷(100mL)稀释，1N盐酸洗(50mL)，用二氯甲烷(100mL)萃取水层，合并有机相，1N盐酸(50mL)洗有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，加甲苯回流溶解，冰箱内冷藏一夜，过滤，乙醚洗滤饼，得浅黄色化合物5(30g，收率79％)。
1HNMR d6-DMSOδ:12.50-12.46(m,1H),7.71(s,1H),7.10-6.92(m,3H),6.90-6.66(m,2H),6.62-6.61(d,1H,J＝2.8Hz),3.84-3.73(m,6H),3.53(s,3H,),3.77(s,3H),2..27(s,3H)。
步骤4：
在三口瓶中加入化合物5(10.0g，26.9mmol)，DCM(二氯甲烷)(200mL)，化合物5A(3.70g，26.9mmol)，HOBT(1-羟基苯并三唑)(4.40g，32.3mmol)，EDCI(1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺)(7.70g，40.3mmol)，三乙胺(6.80g，67.2mmol)，然后在10℃搅拌7小时，TLC显示反应完全。反应体系用水洗(50mL×3)，饱和氯化钠(50mL)洗，无水硫酸钠干燥，过滤蒸除溶剂得粗品，粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)得化合物6(6.00g，收率45％)。
1HNMR CDCl 3δ:7.81(s,1H),6.93-6.87(m,5H),6.79-6.72(m,3H),6.63-6.59(m,1H),5.80-5.66(m,2H),3.71(s,3H),3.62(s,3H),3.54-3.31(m,2H),3.45(s,3H),2.73-2.69(m,2H),2..28(s,3H)。
步骤5：
在三口瓶中加入化合物6(5.00g，10.2mmol)，化合物3(9.70g，20.4mmol)，4A分子筛(24.0g)，无水二氯甲烷(1500mL)，-20℃氮气保护下滴入BF 3·Et 2O(2.89g，20.4mmol)，-20℃搅拌2小时后，TLC显示反应完全，加入1滴三乙胺终止反应。过滤，二氯甲烷洗滤饼，有机相依次水洗(30mL)，饱和氯化钠洗(30mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝6:1)，得化合物7(6g，收率73％)。
1HNMR CDCl 3δ:7.78(s,1H),6.99-6.97(m,2H),6.93-6.85(m,5H),6.76-6.71(m,1H),6.60-6.57(m,2H),5.60-5.57(m,1H),5.35-5.25(m,3H),5.10-5.08(d,1H,J＝7.6Hz),4.19-4.09(m,1H),3.78-3.69(m,6H),3.59(s,3H),3.54-3.46(m,2H),3.43(s,3H),2.74-2.67(m,2H),2..25(s,3H),2.07-2.05(m,9H)。
步骤6：
化合物7(6.00g，7.44mmol)溶于甲醇/水(135mL，v/v＝2:1)，加入Na 2CO 3(12.3g，119mmol)，室温搅拌过夜。LCMS监测反应完成。将反应液旋干，将用水溶解，反应液用1N盐酸调节pH＝5-6，过滤，滤饼为粗品，粗品用prep-HPLC纯化得化合物I(Target 1，T1)(1.1g，收率23％)。
1HNMR CD 3ODδ:7.56(s,1H),7.03-7.05(m,4H),6.96-6.98(m,2H),6.70-6.73(m,1H),6.62-6.67(m,2H),6.44-6.48(m,2H),4.93-4.95(m,1H),3.99-4.01(d,1H),3.73(s,3H),3.61-3.67(m,4H),3.46-3.53(m,4H),3.43(s,3H),2.72-2.75(t,2H)。
LC-MS:m/z＝626(M+1)。
试验例1
本试验例评价并比较芬乐胺(FLZ)及本发明的芬乐胺21位代谢物的体外抗氧化、抗神经炎症和神经保护活性。
1、实验方法
1.1、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定
制备肝微粒体：大鼠肝组织称重后，用Tris-HC1缓冲液制备10％匀浆，以差数离心法分离出肝脏微粒体。
实验设空白组、模型组、FLZ组和FLZ 21位代谢物组，每组设置3个复孔。每管加入PBS缓冲液、肝微粒体、半胱氨酸及受试药溶液。受试药组每管加FLZ或FLZ21位代谢物，终浓度分别为1×10 -4、1×10 -5和1×10 -6M，空白组、模型组每管加同体积的DMSO。于37℃水浴震荡15min，模型组和加药组每管加1×10 -2M FeSO 4溶液，空白组加同体积PBS缓冲液，继续于37℃水浴震荡15min。后每管加入TCA溶液、TBA溶液，100℃水浴10min。于8000rpm离心10min。取上清液于532nm处测吸光度(OD)。
Figure PCTCN2021098309-appb-000011
Figure PCTCN2021098309-appb-000012
1.2、抗神经炎症给药及一氧化氮(NO)含量的检测
BV 2细胞于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5％CO 2的培养箱中培养。选取对数生长期细胞分为空白组、模型组、FLZ组和FLZ 21位代谢物组， 每组设置3个复孔。加入不同浓度的FLZ或FLZ 21位代谢物(终浓度1×10 -5，1×10 -6，1×10 -7M)，空白组、模型组加同体积的DMSO，1h后模型组和加药组加入500ng/mL LPS孵育24h，空白组加同体积PBS缓冲液。每孔吸取100μL培养基，加入配置好的Griess试剂，室温静置20min。各组于540nm处测其吸光度值(OD值)。利用标准曲线将吸光度转换成NO浓度值带入公式计算。
NO抑制率＝[1-(C 待测化合物-C 空白)/(C 模型-C 空白]×100％
1.3、神经保护给药及细胞存活率的测定
SH-SY5Y神经细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，含5％CO 2的培养箱中培养。选取对数生长期细胞进行实验。将SH-SY5Y细胞分为空白组、模型组、FLZ组和FLZ 21位代谢物组，各组设3个复孔。加入不同浓度的FLZ或FLZ 21位代谢物(终浓度1×10 -5，1×10 -6，1×10 -7M)，1h后模型组和加药组加入8mM MPP +孵育24h，空白组加同体积PBS缓冲液。吸弃上清液，每孔加MTT(0.5mg/mL)100μL，继续孵育4h，于570nm波长，在酶标仪上测定吸光度值(OD值)。
有效率％＝(OD 待测化合物-OD 模型)/(OD 空白-OD 模型)×100％
2、实验结果
2.1、FLZ 21位代谢物对脂质过氧化的影响
在体外肝微粒体脂质抗氧化实验中，FLZ 21位代谢物T1对MDA的生成有一定的抑制作用，并具有一定的剂量效应关系(表1)。
表1.FLZ 21位代谢物体外抗氧化活性结果
Figure PCTCN2021098309-appb-000013
Figure PCTCN2021098309-appb-000014
2.2、FLZ及其FLZ 21位代谢物对NO释放的影响
LPS刺激BV2小胶质细胞后，培养基中NO的水平明显升高，FLZ及其FLZ 21位代谢物T1对BV2细胞释放NO有一定的抑制作用，且T1对NO的释放抑制作用强于FLZ(表2)。
表2.FLZ及FLZ 21位代谢物体外抗神经炎活性结果
Figure PCTCN2021098309-appb-000015
Figure PCTCN2021098309-appb-000016
2.3、FLZ及其FLZ 21位代谢物对细胞存活率的影响
SH-SY5Y细胞加入MPP +后细胞存活率明显降低，FLZ对细胞损伤表现出一定的保护作用，且具有剂量效应关系。T1也表现出一定保护作用，且T1效果优于FLZ(表3)。
表3.FLZ及FLZ 21位代谢物体外神经保护活性结果
Figure PCTCN2021098309-appb-000017
Figure PCTCN2021098309-appb-000018
3、结论
FLZ 21位代谢物具有一定的抗氧化、抗神经炎症及神经保护活性，其中高浓度效果较好，并且具有剂量依赖性。FLZ 21位代谢物在抗神经炎症及神经保护活性药效高于FLZ。

Claims (12)

  1. 一种芬乐胺21位代谢物，其中，所述芬乐胺21位代谢物如下式(I)所示：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100001
  2. 权利要求1所述的芬乐胺21位代谢物的制备方法，其中，所述方法包括以式(7)化合物为原料制备式(I)所示的芬乐胺21位代谢物：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100002
  3. 根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述方法还包括以式(6)化合物和式(3)化合物为原料制备式(7)化合物：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100003
  4. 根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述方法还包括以式(5)化合物和式(5A)化合物为原料制备式(6)化合物：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100004
  5. 根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述方法还包括以式(4)化合物和式(4A)化合物为原料制备式(5)化合物：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100005
  6. 根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述方法还包括以式(2)化合物和CCl 3CN为原料制备式(3)化合物：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100006
  7. 根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述方法还包括以式(1)化合物和(NH 2NH 2) 2COCH 3为原料制备式(2)化合物：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100007
  8. 根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
    Figure PCTCN2021098309-appb-100008
  9. 根据权利要求8所述的制备方法，其中：
    步骤1的溶剂选自DMF、二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧六环、DMSO和四氢呋喃中的一种或多种的混合；
    步骤2的溶剂选自二氯甲烷、DMF、乙腈、1,4-二氧六环、DMSO和四氢呋喃中的一种或多种的混合；
    步骤3的溶剂为乙酸酐；
    步骤4和步骤5的溶剂各自独立的选自二氯甲烷、DMF、乙腈、1,4-二氧六环、DMSO和四氢呋喃中的一种或多种的混合；
    步骤6的溶剂选自甲醇、或选自如下混合溶液中的一种：甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、1,4-二氧六环/水、DMF/水、四氢呋喃/水和DMSO/水。
  10. 根据权利要求8或9所述的制备方法，其中：
    步骤2是在有机碱的存在下，以式(2)化合物和CCl 3CN为原料制备式(3)化 合物；优选所述有机碱选自DBU、三乙胺、二异丙基乙基胺和N-甲基咪唑中的一种；
    步骤3是在催化剂的存在下，以式(4)化合物和式(4A)化合物为原料制备式(5)化合物；优选所述催化剂选自三乙胺或二异丙基乙基胺；
    步骤4是在有机碱的存在下，以式(5)化合物和式(5A)化合物为原料制备式(6)化合物；优选所述有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基咪唑和N甲基吗啉中的一种或多种的混合；
    步骤5是在催化剂的存在下，以式(6)化合物和式(3)化合物为原料制备式(7)化合物；优选所述催化剂选自BF 3·Et 2O、TMSOTf和BF 3·THF中的一种；
    步骤6当溶剂选自甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水、1,4-二氧六环/水、DMF/水、四氢呋喃/水和DMSO/水中的一种时，步骤6是在碱性物质的存在下，以式(7)化合物为原料制备式(I)化合物；或者，步骤6当溶剂选自甲醇时，步骤6是在甲醇/甲醇钠体系或叔丁醇钠/甲醇体系中，以式(7)化合物为原料制备式(I)化合物；优选所述碱性物质选自碳酸钠、碳酸钾和氢氧化钠中的一种或多种的混合。
  11. 一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的芬乐胺21位代谢物，和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
  12. 权利要求1所述的芬乐胺21位代谢物或权利要求11所述的药物组合物在制备抗氧化药物、抗神经炎症药物和神经保护药物中的应用；优选所述应用为所述的芬乐胺21位代谢物或所述的药物组合物在制备防治帕金森氏病、改善学习记忆障碍、治疗记忆能力减退及阿尔兹海默病的药物中的应用。
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