WO2021240693A1 - 質量分析方法及び質量分析装置 - Google Patents

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WO2021240693A1
WO2021240693A1 PCT/JP2020/020958 JP2020020958W WO2021240693A1 WO 2021240693 A1 WO2021240693 A1 WO 2021240693A1 JP 2020020958 W JP2020020958 W JP 2020020958W WO 2021240693 A1 WO2021240693 A1 WO 2021240693A1
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sample
mass
measurement
mass spectrometry
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PCT/JP2020/020958
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建悟 竹下
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株式会社島津製作所
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
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    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0004—Imaging particle spectrometry
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0031—Step by step routines describing the use of the apparatus
    • H—ELECTRICITY
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    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0036—Step by step routines describing the handling of the data generated during a measurement

Definitions

  • the present invention relates to a mass spectrometry method and a mass spectrometer.
  • An imaging mass spectrometer is used to measure the distribution of the target substance in a sample such as cells.
  • a plurality of measurement points arranged two-dimensionally in the region are set.
  • the laser beam is focused on the surface of the sample, the focusing points are sequentially moved between the plurality of measuring points, and the substance existing at each measuring point is ionized for mass spectrometry.
  • This movement is done intermittently. That is, the movement is stopped at each measurement point, and irradiation by the pulse laser is performed a plurality of times (for example, several tens to several hundred times).
  • the mass spectrum data of each measurement point is obtained by integrating the mass spectrum data acquired by these multiple mass spectrometrys.
  • the distribution of the target substance in the target region on the sample surface can be known (for example, Patent Document 1).
  • the imaging mass spectrometer collects the light emitted from the laser light source with a condenser lens and irradiates the surface of the sample placed on the sample stage.
  • the sample stage is configured to be movable in a total of three directions, for example, two directions (x-y direction) in a plane parallel to the surface of the sample stage and a direction (z direction) perpendicular to the surface. The movement in each of these directions is performed by each independent movement mechanism.
  • the sample stage is first fixed to the moving mechanism in the z direction, and the moving mechanism in the z direction is placed on the moving mechanism in the x-y direction.
  • the measurement When measuring multiple measurement points arranged two-dimensionally, the measurement generally starts from the measurement point located at the end.
  • the sample stage is moved in the first direction (main movement direction), which is one of the two-dimensional arrangements, and the second measurement point is aligned with the irradiation position of the pulse laser beam. And stop.
  • the pulse laser beam is irradiated and mass spectrometry is repeated a predetermined number of times.
  • the sample stage is intermittently moved along the main movement direction, and when the mass analysis at the last measurement point in the main movement direction is completed, the second direction (secondary movement direction), which is the other side of the two-dimensional arrangement, is completed.
  • the sample stage is moved to the measurement point, and the measurement is performed at the measurement point adjacent to the last measurement point. After that, mass spectrometry of each measurement point is performed again along the main movement direction.
  • the imaging mass spectrometry time it is effective to increase the moving speed of the sample stage.
  • the acceleration applied to the sample stage is increased in order to speed up the movement between the measurement points, a large vibration occurs when the sample stage is stopped at the next measurement point.
  • the pulsed laser beam is irradiated a plurality of times while the sample stage is vibrating, the irradiation position shifts for each irradiation, and there is a problem that the spatial resolution of the imaging mass spectrometry deteriorates.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a technique capable of accelerating the analysis while maintaining the spatial resolution of the imaging mass spectrometry.
  • a first moving mechanism for moving a sample stage in a plane parallel to the sample stage in a first direction and a first moving mechanism parallel to the sample stage are provided.
  • the irradiation points of the excitation beam are intermittently moved between the plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage with the first direction as the main movement direction, and the plurality of measurement points are moved. Mass spectrometry is performed in each.
  • the mass spectrometer according to the present invention which was made to solve the above problems, is The sample stage on which the sample is placed and the sample stage A first drive mechanism that moves the sample stage in the first direction in a plane parallel to the sample stage. A second drive mechanism that moves the first drive mechanism in a plane parallel to the sample stage in a second direction different from the first direction.
  • An excitation beam optical system that irradiates the sample stage with an excitation beam, The irradiation points of the excitation beam are intermittently moved between the plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage with the first direction as the main movement direction, and the plurality of measurement points are moved.
  • Each of the above is equipped with a measurement control unit that performs mass analysis.
  • the present invention is different from the first moving mechanism that moves the sample stage in the first direction in the plane parallel to the sample stage and the first direction in the plane parallel to the sample stage.
  • Mass analysis is performed using a mass analyzer equipped with a second moving mechanism for moving in the second direction.
  • the irradiation points of the excitation beam are intermittently moved between a plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage with the first direction as the main movement direction, and the plurality of measurements are performed. Perform mass spectrometry at each of the points.
  • the operation of moving the irradiation point of the excitation beam from the measurement start point to the measurement point adjacent to the main movement direction and performing mass analysis is repeated, and the end of the main movement direction is performed.
  • the mass analysis at the measurement point is completed, the sample stage is moved to the other side (secondary movement direction) of the two-dimensional arrangement, and the measurement is performed at the measurement point adjacent to the last measurement point. After that, mass spectrometry of each measurement point is performed again along the main movement direction.
  • the first drive mechanism moves only the sample stage, so the load during movement is small, and when the sample stage is moved in the second direction.
  • the vibration generated when the sample stage is stopped is smaller. Therefore, even if the acceleration is increased when the sample stage is moved in the first direction, the vibration when the sample stage is stopped when moving between the measurement points is suppressed to be small, and the irradiation position of the excitation beam is less likely to shift. Therefore, the analysis can be accelerated while maintaining the spatial resolution of the imaging mass spectrometry.
  • FIG. 3 is a block diagram of a main part of an imaging mass spectrometer, which is an embodiment of the mass spectrometer according to the present invention.
  • the figure which shows the schematic structure of the ion part of the imaging mass spectrometer of this Example.
  • the flowchart of the imaging mass spectrometry method which is an Example of the mass spectrometry method which concerns on this invention.
  • a graph showing a change in the magnitude of vibration that occurs when the sample stage is stopped in a conventional mass spectrometry method.
  • the graph which shows the change of the magnitude of the vibration which occurs when the sample stage is stopped in the mass spectrometry method of this Example.
  • the imaging mass spectrometric method and the imaging mass spectrometric apparatus which are examples of the mass spectrometric method and the mass spectrometric apparatus according to the present invention, will be described below with reference to the drawings.
  • the imaging mass spectrometer 1 of this embodiment generates ions by a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method for mass spectrometry, and is used for mass spectrometry of a sample placed on a sample stage. Ions are generated at each of the multiple measurement points on the surface for mass spectrometry.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • the imaging mass spectrometer 1 is roughly divided into an ionization unit 10, a mass spectrometer 20, and a control / processing unit 30.
  • the ionization unit 10 is detachably attached to the mass spectrometry unit 20.
  • FIG. 2 shows the schematic configuration of the ionization unit 10.
  • the ionization unit 10 includes a laser light source 11, a reflecting mirror 12, and a condenser lens 13.
  • the laser light source 11, the reflecting mirror 12, and the condenser lens 13 (hereinafter, these are also referred to as “excited beam optical systems”) are directly or indirectly fixed to the housing 19 via a holding member (frame). ..
  • the ionization unit 10 includes a sample stage 14, a stage moving mechanism 15, and a microscope 16.
  • An opening 17 is formed on one side surface of the housing 19.
  • the stage moving mechanism 15 is fixed to the housing 19.
  • the sample stage 14 can be moved in three directions orthogonal to each other by the stage moving mechanism 15.
  • the stage moving mechanism 15 has a first linear guide 151 for moving the sample stage 14 in the vertical direction (x direction), and a first linear guide 151 for moving the sample stage 14 and the first linear guide 151 in the horizontal direction (y direction). It includes two linear guides 152, a third linear guide 153 for moving the sample stage 14, the first linear guide 151, and the second linear guide 152 in the horizontal direction (z direction), and a drive source for operating them. ..
  • This drive source includes, for example, a stepping motor.
  • a microscope 16 for observing the sample placed on the sample stage 14 is provided in the housing 19, and the sample stage 14 is moved to the observation position (front of the microscope 16) by the microscope 16.
  • the area of interest of the sample is set as the target area.
  • a plurality of measurement points are set in the target area.
  • the sample stage 14 When executing the imaging mass spectrometer, the sample stage 14 is moved so that the target area on the sample surface is located in front of the opening 17 formed on the side surface of the housing 19. Then, the light emitted from the laser light source 11 and reflected by the reflecting mirror 12 is condensed by the condenser lens 13 and irradiated to the measurement point in the target region on the sample surface. The ions generated from the sample by the irradiation of the laser beam are emitted from the opening 17 to the outside of the housing 19.
  • the ionization unit 10 is detachably attached to the mass spectrometry unit 20.
  • An opening 21 is formed on the side surface of the housing of the mass spectrometry unit 20 on the side to which the ionization unit 10 is attached at a position corresponding to the opening 17 of the ionization unit 10.
  • the mass spectrometric unit 20 mass spectrometrically analyzes the ions incident through the opening 21.
  • the mass spectrometer 20 includes an ion optical system such as an ion lens that focuses incident ions, and a mass separation unit such as a quadrupole mass filter that separates the ions focused by the ion optical system according to the mass-to-charge ratio. , And an ion detector that detects the ions separated by the mass separator is housed.
  • the control / processing unit 30 controls the operations of the ionization unit 10 and the mass spectrometry unit 20, and also performs processing such as creating imaging mass spectrometry data based on the output signal from the ion detector of the mass spectrometry unit 20.
  • the control / processing unit 30 includes a measurement control unit 321, a measurement point setting unit 322, and an imaging mass spectrometric data creation unit 323 as functional blocks.
  • the substance of the control / processing unit 30 is a general computer, and by executing the pre-installed mass spectrometry software 32 on the processor, the measurement control unit 321 and the measurement point setting unit 322, and the imaging mass spectrometry data creation unit The function of 323 is embodied. Further, the control / processing unit 30 is connected to an input unit 40 for the user to perform an appropriate input operation and a display unit 50 for displaying various information.
  • This embodiment is characterized in the order in which mass spectrometry of a plurality of measurement points set in the region of interest on the sample surface is performed when performing imaging mass spectrometry.
  • the flow of imaging mass spectrometry in this embodiment will be described with reference to the flowchart of FIG.
  • the user sets the sample on the sample stage 14 prior to performing the imaging mass spectrometry.
  • This sample is prepared, for example, by applying a matrix substance that easily absorbs laser light to a section cut out from a biological sample.
  • the measurement control unit 321 operates the stage moving mechanism 15 to observe the sample stage 14 at the observation position (front of the microscope 16). Move to. Then, the observation image of the sample surface is acquired by the microscope 16, and the observation image is displayed on the screen of the display unit 50.
  • the user confirms the observation image displayed on the screen of the display unit 50, and sets an area of interest, which is an area of interest for performing imaging mass spectrometry, on the sample surface.
  • the size of the region of interest can be, for example, 20 mm square at a distance on the surface of the sample.
  • the measurement control unit 321 stores the observation image of the sample surface in the storage unit 31 together with the region of interest as the target region.
  • the measurement point setting unit 322 displays a screen for setting a plurality of measurement points in the target area on the display unit 50.
  • This screen is provided with, for example, a field for inputting the interval of measurement points to be set in the target area, and when the user inputs the interval of measurement points in the field, a plurality of measurement points are input in the target area based on the input value.
  • the measurement point of is set (step 1).
  • This input value can be, for example, 5 to 20 ⁇ m in distance on the surface of the sample.
  • a plurality of measurement starting points points at the corners of a rectangular target region
  • the measurement point of is set two-dimensionally.
  • the measurement points can also be set by inputting the number of measurement points (for example, the number of measurement points in each of the two directions orthogonal to each other in the target region).
  • the measurement control unit 321 operates the stage moving mechanism 15 again, and sets the measurement start point at the condensing position of the laser beam by the excitation beam irradiation system. Stop at the same time.
  • the measurement start point is irradiated with pulsed laser light, and the ions generated from the measurement start point are taken into the mass spectrometer 20 through the openings 17 and 21, and separated and measured according to the mass-to-charge ratio (step 2). ..
  • the ion detection signal obtained by the mass spectrometry unit 20 is associated with the position information of the measurement start point and stored in the storage unit 31.
  • pulsed laser light is irradiated one or more times, and the ions generated by the irradiation are mass-analyzed. For example, the irradiation of the pulsed laser beam is performed ten to several hundred times, and the mass spectrometry is performed for each irradiation of the pulsed laser beam one or more times.
  • the measurement control unit 321 After completing the mass spectrometry at the measurement start point, the measurement control unit 321 confirms whether the mass spectrometry of the measurement point located at the end in the x direction has been completed. At this point, the mass spectrometry of the measurement start point is only completed, and there is an unmeasured point located in the x direction from the measurement start point (YES in step 3). When there is an unmeasured point adjacent to the x direction in this way, the sample stage 14 is moved in the x direction along the first linear guide 151, and the next measurement point is adjusted to the focusing position of the laser beam. Stop (step 4).
  • the pulse laser beam is irradiated and the mass spectrometry of the ions generated by the irradiation is performed at this measurement point (step 5), and the ion detection signal obtained by the mass spectrometer 20 is obtained. It is stored in the storage unit 31 in association with the position information of the measurement point.
  • the presence or absence of unmeasured points adjacent in the x direction is sequentially determined, and if there are unmeasured points (YES in step 3), the first linear guide is used.
  • the sample stage 14 is moved and stopped in the x direction (step 4), irradiation with pulsed laser light and mass analysis are performed (step 5), and the ion detection signal is stored in association with the position information of the measurement point. Save in part 31.
  • the measurement control unit 321 is in the y direction from the measurement point.
  • Check for unmeasured points adjacent to If there is an unmeasured point adjacent to the y direction (YES in step 6), the sample stage is moved in the y direction along the second linear guide 152, and the sample stage is adjacent to the last measurement point in the y direction.
  • the measurement point to be measured is adjusted to the focusing position of the laser beam and stopped (step 7).
  • irradiation of pulsed laser light and mass spectrometry of ions generated by the irradiation are performed at the measurement point (step 8), and the ion detection signal obtained by the mass spectrometry unit 20 corresponds to the position information of the measurement point. Attached and stored in the storage unit 31.
  • steps 3 to 8 are repeated in the same manner as above. Then, if there is no unmeasured point in either the x-direction or the y-direction (NO in step 3 and NO in step 6), the measurement is terminated.
  • the imaging mass spectrometry data creation unit 323 reads out the ion detection signal of each measurement point stored in the storage unit 31 and creates mass spectrum data for each measurement point. (Step 9). When mass spectrometry is performed multiple times at each measurement point, the ion detection signals are integrated at each measurement point to create mass spectrum data. Further, the imaging mass spectrometric data creation unit 323 creates imaging mass spectrometric data in which the mass spectrometric data of each measurement point is mapped to a target region according to the position information of the measurement point (step 10).
  • the imaging mass spectrometric data creation unit 323 After creating the imaging mass spectrometric data, when the user inputs the mass-to-charge ratio of the ion, the imaging mass spectrometric data creation unit 323 reads out the detection intensity of the ion of the mass-to-charge ratio at each measurement point, and corresponds to the intensity. An imaging mass spectrometric image in which colors are mapped to a target region is displayed (step 11). By inputting the mass-to-charge ratio of ions characteristic of the substance to be analyzed, the user can know how the substance is distributed on the surface of the sample.
  • the sample stage 14 when performing mass spectrometry of a plurality of measurement points set two-dimensionally in a target region on the sample surface, first, the sample stage 14 is moved along a first linear guide 151 that moves only the sample stage 14. Repeatedly move and stop, and perform mass spectrometry by adjusting each measurement point adjacent to the x direction to the condensing position of the laser beam. After mass spectrometry of all measurement points adjacent in the x direction, the sample stage 14 is moved in the y direction along the second linear guide 152. Then, again, the sample stage 14 is repeatedly moved and stopped along the first linear guide 151 that moves only the sample stage 14, and mass spectrometry is performed by adjusting each measurement point adjacent to the x direction to the focusing position of the laser beam. conduct.
  • the main movement is in the x direction, which is the movement direction of the sample stage 14 by the first linear guide 151, between a plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage 14.
  • the irradiation points of the laser beam are intermittently moved as the direction, and mass analysis is performed at each of the plurality of measurement points.
  • the main moving direction is to move the sample stage 14 in two directions and intermittently place the irradiation point of the excitation beam between a plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage. It can be said that the direction in which the number of movements when moving and performing mass analysis at each of the plurality of measurement points is larger, or the direction in which the total movement distance is longer. Further, in the main movement direction, the irradiation point of the excitation beam is intermittently moved between a plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage by moving the sample stage 14 in two directions.
  • the directions in which three or more adjacent measurement points are sequentially mass-analyzed typically, the adjacent measurement points are sequentially arranged from one end to the other end). It can also be said that it is the direction of mass analysis).
  • the second linear guide 152 moves both the sample stage 14 and the first linear guide 151
  • the first linear guide 151 moves only the sample stage 14, so that the load during movement is small and the second linear guide is small.
  • the vibration generated when the sample stage 14 is stopped is smaller when the sample stage 14 is moved in the x direction by the first linear guide. Therefore, even if the acceleration is increased when the sample stage is moved in the x direction, the vibration when the sample stage 14 is stopped when moving between the measurement points is suppressed to be small, and the irradiation position of the laser beam is less likely to shift.
  • the acceleration when moving the sample stage 14 in the y direction should be suppressed to be smaller than when moving to the x direction. Since the number of times the sample stage 14 moves in the y direction is less than the number of times the sample stage 14 moves in the x direction, the total execution time of imaging mass spectrometry even if the acceleration during movement of the sample stage 14 in the y direction is kept small. The effect on is small. For example, when mass spectrometry is performed by setting 100 points ⁇ 100 measurement points in the target area of the sample as in the above embodiment, the number of movements of the sample stage 14 in the x direction is 9900 times.
  • the number of movements of the sample stage 14 in the y direction is as small as 100 times.
  • the movement time of the sample stage 14 in the y direction is set to be smaller than the acceleration when the sample stage 14 moves in the x direction. Even if it takes five times the travel time of the sample stage 14, the travel time of the sample stage 14 in the entire imaging mass analysis is only increased by about 4%. The larger the number of measurement points, the smaller the above effect. When the number of measurement points is small, the time required for imaging mass spectrometry is not so long in the first place, so it is not necessary to discuss the movement time of the sample stage 14.
  • first linear guide 151 and the second linear guide 152 may have the same configuration, and the measurement control unit 321 may transmit different forms of control signals to both.
  • reducing the weight of the parts that generate a load when the sample stage 14 is moved is also an effective means of reducing vibration.
  • the vibration of the sample stage 14 can be suppressed while further increasing the acceleration of the sample stage 14. It is also effective to increase the rigidity of the stage itself.
  • these measures are not indispensable in the present invention, and may be appropriately implemented as needed and in consideration of cost.
  • FIG. 4 shows the magnitude of vibration generated when the sample stage is moved by a conventional imaging mass spectrometry method and measured with a laser displacement meter.
  • the stage moving mechanism 15 similar to that of the above embodiment is used, and the sample stage 14 is moved with the y direction, which is the moving direction of the sample stage 14 by the second linear guide 152, as the main direction.
  • the sample stage position vibrates by a maximum of about ⁇ 2 ⁇ m until about 50 msec elapses after the sample stage is stopped.
  • the irradiation position of the laser beam varies by up to ⁇ 2 ⁇ m. That is, the irradiation position of the laser beam is deviated by a maximum of 4 ⁇ m, and even if the laser is focused to 5 ⁇ m or less, the spatial resolution commensurate with it cannot be obtained.
  • the moving mechanism located at the lowermost position performs mass analysis with the direction in which the sample stage is moved as the main direction.
  • the two moving mechanisms are moved and stopped at the same time (that is, the moving mechanism that moves and stops more than the conventional example described above). Since the number is increased by one), it is easily presumed that the load generated when the sample stage is moved and stopped is larger than that of the above-mentioned conventional example, and the vibration larger than that shown in FIG. 4 is generated.
  • FIG. 5 shows the magnitude of vibration generated when the sample stage is moved by the imaging mass spectrometry method of the above embodiment and measured by a laser displacement meter. From the comparison with FIG. 4, it can be seen that the magnitude of the vibration generated when the sample stage 14 is stopped is reduced to about half of the conventional one.
  • the measurement control unit 321 controls the operation of the stage moving mechanism 15 to move the sample stage 14, but the user himself operates the stage moving mechanism 15 to move the sample stage 14. May be good.
  • mass analysis is performed by sequentially moving from the measurement start point to the measurement points adjacent to the measurement points in the positive direction of the x-axis, and y from the measurement point located at the end in the x-direction.
  • the mass analysis was performed by moving to the measurement points adjacent to the negative direction of the x-axis in order, but the order of movement between the measurement points is not limited to this.
  • FIG. 7 after mass-analyzing the measurement points arranged in the x direction from one end side to the other end side, the measurement points are moved to the measurement points adjacent to the measurement points on the one end side in the y direction, and the measurement points are moved from the measurement points.
  • FIGS. 6 and 7 show an example in which a plurality of measurement points are arranged in a grid pattern, they may be arranged in a honeycomb shape or the like.
  • the ionization unit 10 is configured so that the stage surface of the sample stage 14 faces a vertical surface, but the ionization unit 10 may be configured so that the stage surface is a horizontal plane.
  • ions are generated by the MALDI method and mass spectrometrically analyzed, but the same configuration as described above can also be used when ions are generated by the LDI (laser desorption / ionization) method that does not use a matrix substance. .. Further, in the above embodiment, the substance on the sample surface is ionized by using the laser beam, but the same configuration as in the above embodiment can be used when using another type of excitation beam such as an electron beam.
  • One aspect is different from the first moving mechanism that moves the sample stage in the first direction in the plane parallel to the sample stage and the first direction in the plane parallel to the sample stage. It is a mass analysis method using a mass analyzer equipped with a second movement mechanism for moving in a second direction.
  • the irradiation points of the excitation beam are intermittently moved between the plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage with the first direction as the main movement direction, and the plurality of measurement points are moved. Mass spectrometry is performed in each.
  • FIG. 2 Another aspect of the mass spectrometer is The sample stage on which the sample is placed and the sample stage A first drive mechanism that moves the sample stage in the first direction in a plane parallel to the sample stage. A second drive mechanism that moves the first drive mechanism in a plane parallel to the sample stage in a second direction different from the first direction.
  • An excitation beam optical system that irradiates the sample stage with an excitation beam, The irradiation points of the excitation beam are intermittently moved between the plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage with the first direction as the main movement direction, and the plurality of measurement points are moved.
  • Each of the above is equipped with a measurement control unit that performs mass analysis.
  • a first moving mechanism for moving the sample stage in a plane parallel to the sample stage in a first direction and the first moving mechanism.
  • Mass spectrometry is performed using a mass spectrometer equipped with a second moving mechanism that moves the sample in a second direction different from the first direction in a plane parallel to the sample stage.
  • the first direction is mainly used among a plurality of measurement points two-dimensionally arranged on the sample placed on the sample stage.
  • the irradiation points of the excitation beam are intermittently moved as the moving direction, and mass spectrometry is performed at each of the plurality of measurement points. That is, after mass analysis is performed at the measurement start point, the operation of moving the irradiation point of the excitation beam from the measurement start point to the measurement point adjacent to the main movement direction and performing mass analysis is repeated, and the end of the main movement direction is performed.
  • the mass analysis at the measurement point is completed, the sample stage is moved to the other side (secondary movement direction) of the two-dimensional arrangement, and the measurement is performed at the measurement point adjacent to the last measurement point. After that, mass spectrometry of each measurement point is performed again along the main movement direction.
  • the first drive mechanism moves only the sample stage, so the load during movement is small, and when the sample stage is moved in the second direction.
  • the vibration generated when the sample stage is stopped is smaller. Therefore, even if the acceleration is increased when the sample stage is moved in the first direction, the vibration when the sample stage is stopped when moving between the measurement points is suppressed to be small, and the irradiation position of the excitation beam is less likely to shift. Therefore, the analysis can be accelerated while maintaining the spatial resolution of the imaging mass spectrometry.
  • the acceleration when the sample stage is moved in the first direction (main movement direction) by the first drive mechanism is the acceleration when the sample stage is moved in the second direction by the second drive mechanism. Make it larger than the acceleration of. As a result, the time required for the sample stage to move in the first direction (main movement direction) can be shortened, and the vibration generated when the sample stage moves in the second direction can be suppressed.
  • the mass spectrometer according to the third item may satisfy the above requirements by using different configurations for the first drive mechanism and the second drive mechanism, and the first drive mechanism and the second drive mechanism may be satisfied.
  • the same configuration may be used for the above requirements, and the above requirements may be satisfied by transmitting control signals of different forms from the measurement control unit to both.
  • the excitation beam optical system includes a laser light source that emits laser light and a condenser lens that collects the laser light emitted from the laser light source.
  • the laser light can be focused to a particularly small diameter, and the mass with high spatial resolution is achieved by using the laser light focused to a small diameter as in the mass spectrometer described in Section 4.
  • the mass spectrometer according to the second or third paragraph can be preferably used.
  • the mass spectrometer according to the fourth item is particularly suitable for a device that performs high spatial resolution imaging mass spectrometry using a laser beam focused to a diameter of 5 ⁇ m or less, such as the mass spectrometer described in the fifth item. Can be used for.
  • the sample is a mixture of a matrix substance that absorbs the laser beam.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • the mass spectrometry unit has also accelerated the analysis, enabling mass spectrometry of dozens of measurement points per second. By using these, it has become possible to analyze the entire sample section (20 to 30 mm square) with a high spatial resolution of 5 ⁇ m or less in a realistic time. That is, as the device for ionizing the sample by the MALDI method and performing imaging mass spectrometry as described in Section 6, the mass spectrometer described in Section 4 or 5 can be suitably used.
  • the distance between the excitation beam optical system and the sample stage is changed, and the distance is adjusted so that the excitation beam is focused on the surface of the sample placed on the sample stage. Can be done.
  • Imaging mass spectrometer 10 Ionization unit 11 ... Laser light source 12 ... Reflector 13 ... Condensing lens 14 ... Sample stage 15 ... Stage movement mechanism 151 ... 1st linear guide 152 ... 2nd linear guide 153 ... 3rd linear guide 16 ... Microscope 17 ... Opening 19 ... Housing 20 ... Mass spectrometry 21 ... Opening 30 ... Control / processing unit 31 ... Storage unit 32 ... Mass spectrometry software 321 ... Measurement control unit 322 ... Measurement point setting unit 323 ... Imaging mass spectrometry Data creation unit 40 ... Input unit 50 ... Display unit

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Abstract

試料ステージ１４を該試料ステージ１４に平行な面内の第１方向に移動させる第１移動機構１５１と、第１移動機構１５１を試料ステージ１４に平行な面内の第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２移動機構１５２とを備えた質量分析装置１を用いた質量分析方法において、試料ステージ１４に載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、第１方向を主移動方向として励起ビームの照射点を間欠移動させ（ステップ４）、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う（ステップ５）。

Description

質量分析方法及び質量分析装置
　本発明は、質量分析方法及び質量分析装置に関する。
　細胞等の試料における目的物質の分布を測定するために、イメージング質量分析装置が用いられている。イメージング質量分析装置では、試料表面の目的とする領域の目的物質の分布を測定するために、該領域内に二次元的に配置された複数の測定点を設定する。そして、レーザ光を試料表面に集光させ、該集光点をそれら複数の測定点間で順次移動させ、各測定点に存在する物質をイオン化して質量分析する。この移動は間欠的に行われる。すなわち、各測定点において移動は停止され、パルスレーザによる照射が複数回（例えば数十～数百回）行われる。これら複数回の質量分析で取得したマススペクトルデータを積算することにより、各測定点のマススペクトルデータを得る。こうして得た各測定点のマススペクトルデータから、目的物質に特徴的なイオンの質量電荷比のマスピークの強度を抽出し、各測定点におけるマスピークの強度を目的領域にマッピングした画像を作成することにより、試料表面の目的領域における目的物質の分布を知ることができる（例えば特許文献１）。
　イメージング質量分析装置では、レーザ光源から発せられる光を集光レンズで集光して、試料ステージ上に載置された試料の表面に照射する。試料ステージは、例えば、該試料ステージの表面に平行な面内の二方向（x-y方向）と該表面に垂直な方向（z方向）の合計三方向に移動可能に構成される。これら各方向の移動は独立したそれぞれの移動機構により行われる。この場合、試料ステージがまずz方向の移動機構に固定され、該z方向への移動機構がx-y方向への移動機構上に載置される。
　二次元的に配置された複数の測定点の測定を行う場合、一般に、測定は、端部に位置する測定点から開始される。測定開始点における質量分析を完了すると、二次元配置のうちの一つの方向である第１方向（主移動方向）に試料ステージを移動させ、2番目の測定点をパルスレーザ光の照射位置に合わせて停止する。そして、測定開始点と同様に、パルスレーザ光を照射して質量分析を所定回数繰り返し行う。こうして、主移動方向に沿って試料ステージを間欠的に移動させてゆき、主移動方向の最後の測定点における質量分析が完了すると、二次元配置のもう一方である第２方向（副移動方向）に試料ステージを移動させ、該最後の測定点に隣接する測定点について測定を行う。その後、再び主移動方向に沿って各測定点の質量分析を行っていく。
特開２０１３－０６８５６５号公報
　近年、レーザ光を5μm程度の微小径に集光すること、また数十kHzという高周波数（パルスレーザ光の繰り返し周波数）でパルスレーザ光を発することが可能なレーザ光源が開発されている。微小径に集光されたレーザ光を用いることでより高空間分解能のイメージング質量分析が可能となる。また、高周波数のパルスレーザ光を用いることにより各測定点の質量分析に要する時間が短縮されることから、より大きな試料をイメージング質量分析することが可能になりつつある。
　イメージング質量分析時間の短縮には、試料ステージの移動速度を速くすることが有効である。しかし、測定点間の移動を速くするために試料ステージに与える加速度を大きくすると、次の測定点で試料ステージを停止したときに大きな振動が生じる。試料ステージが振動した状態のままパルスレーザ光を複数回照射すると、照射位置が照射毎にずれてしまい、イメージング質量分析の空間分解能が悪くなるという問題があった。
　ここでは試料表面に存在する物質をイオン化する励起ビームとしてレーザ光を使用する場合を例に説明したが、電子線等の他の種類の励起ビームを使用する場合にも上記同様の問題があった。
　本発明が解決しようとする課題は、イメージング質量分析の空間分解能を維持しつつ該分析を高速化することができる技術を提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明は、試料ステージを該試料ステージに平行な面内の第１方向に移動させる第１移動機構と、該第１移動機構を該試料ステージに平行な面内の該第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２移動機構とを備えた質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
　前記試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、前記第１方向を主移動方向として励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う
　ものである。
　また、上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析装置は、
　試料が載置される試料ステージと、
　前記試料ステージを該試料ステージに平行な面内の前記第１方向に移動させる第１駆動機構と、
　前記第１駆動機構を該試料ステージに平行な面内の前記第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２駆動機構と、
　前記試料ステージに励起ビームを照射する励起ビーム光学系と、
　前記試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、前記第１方向を主移動方向として前記励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う測定制御部と
　を備える。
　本発明は、試料ステージを該試料ステージに平行な面内の第１方向に移動させる第１移動機構と、該第１移動機構を該試料ステージに平行な面内の該第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２移動機構とを備えた質量分析装置を用いて質量分析を行う。本発明では、試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、第１方向を主移動方向として励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う。即ち、測定開始点において質量分析を行ったあと、測定開始点から主移動方向に隣接する測定点に励起ビームの照射点を移動させて質量分析を行うという動作を繰り返し行い、主移動方向の最後の測定点における質量分析が完了すると、二次元配置のもう一方（副移動方向）に試料ステージを移動させ、該最後の測定点に隣接する測定点について測定を行う。その後、再び主移動方向に沿って各測定点の質量分析を行っていく。
　第２駆動機構が試料ステージと第１駆動機構の両方を移動させるのに対し、第１駆動機構は試料ステージのみを移動させるため移動時の負荷が小さく、第２方向に試料ステージを移動させる時に比べて、第１方向に試料ステージを移動させる時の方が、試料ステージの停止時に生じる振動が小さくなる。従って、第１方向への試料ステージの移動時に加速度を大きくしても測定点間の移動時に試料ステージを停止する際の振動が小さく抑えられ、励起ビームの照射位置にずれが生じにくくなる。従って、イメージング質量分析の空間分解能を維持しつつ該分析を高速化することができる。
本発明に係る質量分析装置の一実施例である、イメージング質量分析装置の要部構成図。 本実施例のイメージング質量分析装置のイオン部の概略構成を示す図。 本発明に係る質量分析方法の一実施例である、イメージング質量分析方法のフローチャート。 従来の質量分析方法において試料ステージを停止したときに生じる振動の大きさの変化を示すグラフ。 本実施例の質量分析方法において試料ステージを停止したときに生じる振動の大きさの変化を示すグラフ。 本実施例の質量分析方法における測定点間の移動順を説明する図。 測定点間の移動順に関する別の例を説明する図。
　本発明に係る質量分析方法及び質量分析装置の一実施例である、イメージング質量分析方法及びイメージング質量分析装置について、以下、図面を参照して説明する。
　本実施例のイメージング質量分析装置１は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法によりイオンを生成して質量分析するものであり、試料ステージ上に載置した試料の表面の複数の測定点のそれぞれにおいてイオンを生成して質量分析する。
　イメージング質量分析装置１は、図１にブロック図で示すように、大別してイオン化部１０、質量分析部２０、及び制御・処理部３０から構成される。イオン化部１０は質量分析部２０に着脱可能に取り付けられる。
　図２にイオン化部１０の概略構成を示す。イオン化部１０は、レーザ光源１１、反射鏡１２、及び集光レンズ１３を備えている。レーザ光源１１、反射鏡１２、及び集光レンズ１３（以下、これらを「励起ビーム光学系」とも呼ぶ。）は直接または保持部材（フレーム）を介して間接的に筐体１９に固定されている。
　また、イオン化部１０は、試料ステージ１４、ステージ移動機構１５、及び顕微鏡１６を備えている。筐体１９の一側面には開口１７が形成されている。ステージ移動機構１５は筐体１９に対して固定されている。
　試料ステージ１４は、ステージ移動機構１５によって互いに直交する三方向に移動可能になっている。ステージ移動機構１５は、鉛直方向（x方向）に試料ステージ１４を移動させるための第１リニアガイド１５１と、試料ステージ１４及び第１リニアガイド１５１を水平方向（y方向）に移動させるための第２リニアガイド１５２と、試料ステージ１４及び第１リニアガイド１５１並びに第２リニアガイド１５２を水平方向（z方向）に移動させるための第３リニアガイド１５３と、それらを動作させる駆動源を備えている。この駆動源は、例えばステッピングモータを含む。
　また、筐体１９内には試料ステージ１４上に載置された試料を観察するための顕微鏡１６が設けられており、試料ステージ１４を観察位置（顕微鏡１６の正面）に移動させて顕微鏡１６により試料表面を観察することにより、試料の関心領域を目的領域として設定する。また、該目的領域内に複数の測定点を設定する。
　イメージング質量分析装置を実行する際には、試料表面の目的領域が筐体１９の側面に形成された開口１７の正面に位置するように試料ステージ１４を移動させる。そして、レーザ光源１１から発せられ反射鏡１２で反射された光を集光レンズ１３により集光し、試料表面の目的領域内の測定点に照射する。レーザ光の照射によって試料から生成されたイオンは、開口１７から筐体１９の外部に出射する。
　質量分析部２０にはイオン化部１０が着脱可能に取り付けられる。質量分析部２０の筐体の、イオン化部１０が取り付けられる側の側面には、イオン化部１０の開口１７に対応する位置に開口２１が形成されている。質量分析部２０は、該開口２１を通じて入射するイオンを質量分析する。質量分析部２０には、入射したイオンを集束させるイオンレンズ等のイオン光学系、該イオン光学系で集束されたイオンを質量電荷比に応じて分離する、四重極マスフィルタ等の質量分離部、及び該質量分離部で分離されたイオンを検出するイオン検出器が収容されている。
　制御・処理部３０は、イオン化部１０及び質量分析部２０の動作を制御するとともに、質量分析部２０のイオン検出器からの出力信号に基づいてイメージング質量分析データを作成する等の処理を行うものである。制御・処理部３０には、記憶部３１のほか、機能ブロックとして、測定制御部３２１、測定点設定部３２２、及びイメージング質量分析データ作成部３２３を備えている。制御・処理部３０の実体は一般的なコンピュータであり、予めインストールされた質量分析用ソフトウェア３２をプロセッサで実行することにより、測定制御部３２１、測定点設定部３２２、及びイメージング質量分析データ作成部３２３の機能が具現化される。また、制御・処理部３０には、使用者が適宜の入力操作を行うための入力部４０及び各種の情報を表示するための表示部５０が接続されている。
　本実施例は、イメージング質量分析を行う際に、試料表面の関心領域内に設定される複数の測定点の質量分析を実行する順序に特徴を有する。図３のフローチャートを参照して、本実施例におけるイメージング質量分析の流れを説明する。
　使用者は、イメージング質量分析の実行に先立ち、試料ステージ１４上に試料をセットする。この試料は、例えば生体試料から切り出した切片に、レーザ光を吸収しやすいマトリックス物質を塗布することにより作成される。その後、使用者が、イメージング質量分析の開始を指示する所定の入力操作を行うと、測定制御部３２１は、ステージ移動機構１５を動作させて、該試料ステージ１４を観察位置（顕微鏡１６の正面）に移動させる。そして、顕微鏡１６により試料表面の観察画像を取得し、表示部５０の画面上に該観察画像を表示する。
　使用者は、表示部５０の画面に表示された観察画像を確認し、試料表面に、イメージング質量分析を実行する対象の領域である関心領域を設定する。関心領域の大きさは、例えば試料の表面における距離で20mm四方とすることができる。使用者が関心領域を設定すると、測定制御部３２１は、試料表面の観察画像とともに、該関心領域を目的領域として記憶部３１に保存する。
　試料の目的領域が保存されると、測定点設定部３２２は、該目的領域内に複数の測定点を設定させる画面を表示部５０に表示する。この画面には、例えば、目的領域内に設定する測定点の間隔を入力する欄が設けられ、使用者がその欄に測定点の間隔を入力すると、その入力値に基づいて目的領域内に複数の測定点が設定される（ステップ１）。この入力値は、例えば試料の表面における距離で5～20μmとすることができる。具体的には、例えば、予め決められた測定開始点（矩形状の目的領域の角部の点）を起点とし、目的領域内において互いに直交する二方向に、上記入力値の距離だけ離間する複数の測定点が二次元的に設定される。測定点の設定は、その他、測定点の数（例えば目的領域内において互いに直交する二方向のそれぞれにおける測定点の数）を入力することにより行うこともできる。
　目的領域内に二次元配置された複数の測定点が設定されると、測定制御部３２１は、再びステージ移動機構１５を動作させ、励起ビーム照射系によるレーザ光の集光位置に測定開始点を合わせて停止する。
　次に、測定開始点にパルスレーザ光を照射し、該測定開始点から生成されたイオンを開口１７、２１を通じて質量分析部２０に取り込み、質量電荷比に応じて分離し測定する（ステップ２）。質量分析部２０で得られたイオンの検出信号は、該測定開始点の位置情報と対応付けられて記憶部３１に保存する。なお、測定開始点では、1乃至複数回パルスレーザ光を照射し、該照射により生成されるイオンを質量分析する。例えば、パルスレーザ光の照射を十～数百回行い、1乃至複数回のパルスレーザ光の照射毎に質量分析を行う。
　測定開始点における質量分析を終えると、測定制御部３２１は、x方向の端部に位置する測定点の質量分析を完了したかを確認する。この時点では測定開始点の質量分析を完了したのみであり、該測定開始点からx方向に位置する未測定点が存在する（ステップ３でＹＥＳ）。このようにx方向に隣接する未測定点が存在する場合には、第１リニアガイド１５１に沿って試料ステージ１４をx方向に移動させ、次の測定点をレーザ光の集光位置に合わせて停止する（ステップ４）。そして、測定開始点と同様に、この測定点でもパルスレーザ光の照射と該照射により生成されるイオンの質量分析を行い（ステップ５）、質量分析部２０で得られたイオンの検出信号を、測定点の位置情報と対応付けて記憶部３１に保存する。
　3番目以降の測定点についても、上記同様に、順次、x方向に隣接する未測定点の有無を判定し、未測定点が存在する場合には（ステップ３でＹＥＳ）、第１リニアガイドに沿って試料ステージ１４をx方向に移動及び停止し（ステップ４）、パルスレーザ光の照射及び質量分析を行って（ステップ５）、イオンの検出信号を、測定点の位置情報と対応付けて記憶部３１に保存する。
　測定開始点からx方向に隣接する最後の測定点について質量分析を終えると（即ちx方向に隣接する未測定点がなくなる。ステップ３でＮＯ）、測定制御部３２１は、該測定点からy方向に隣接する未測定点の有無を確認する。そして、y方向に隣接する未測定点が存在する場合には（ステップ６でＹＥＳ）、第２リニアガイド１５２に沿って試料ステージをy方向に移動させ、該最後の測定点からy方向に隣接する測定点をレーザ光の集光位置に合わせて停止する（ステップ７）。そして、当該測定点においてパルスレーザ光の照射と該照射により生成されるイオンの質量分析を行い（ステップ８）、質量分析部２０で得られたイオンの検出信号を、測定点の位置情報と対応付けて記憶部３１に保存する。
　その後も上記同様に、ステップ３～８の処理を繰り返し行う。そして、x方向及びy方向のいずれにも未測定点が存在しなければ（ステップ３でＮＯ、さらにステップ６でもＮＯ）、測定を終了する。
　複数の測定点の全てにおける質量分析が完了すると、イメージング質量分析データ作成部３２３は、記憶部３１に保存された、各測定点のイオンの検出信号を読み出し、測定点毎にマススペクトルデータを作成する（ステップ９）。各測定点で複数回の質量分析を行っている場合には、測定点毎にイオンの検出信号を積算してマススペクトルデータを作成する。さらに、イメージング質量分析データ作成部３２３は、各測定点のマススペクトルデータを測定点の位置情報に応じて目的領域にマッピングした、イメージング質量分析データを作成する（ステップ１０）。
　イメージング質量分析データの作成後、使用者がイオンの質量電荷比を入力すると、イメージング質量分析データ作成部３２３は、各測定点における該質量電荷比のイオンの検出強度を読み出し、その強度に応じた色を目的領域にマッピングしたイメージング質量分析画像を表示する（ステップ１１）。使用者は、分析対象の物質に特徴的なイオンの質量電荷比を入力することで、該物質が試料表面にどのように分布しているかを知ることができる。
　本実施例では、試料表面の目的領域に二次元的に設定された複数の測定点の質量分析を行う際に、まず、試料ステージ１４のみを移動させる第１リニアガイド１５１に沿って試料ステージ１４の移動及び停止を繰り返し、x方向に隣接する各測定点をレーザ光の集光位置に合わせて質量分析を行う。x方向に隣接する全ての測定点の質量分析を終えると、第２リニアガイド１５２に沿って試料ステージ１４をy方向に移動する。そして、再び、試料ステージ１４のみを移動させる第１リニアガイド１５１に沿って試料ステージ１４の移動及び停止を繰り返し、x方向に隣接する各測定点をレーザ光の集光位置に合わせて質量分析を行う。つまり、本実施例では試料ステージ１４に載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、第１リニアガイド１５１による試料ステージ１４の移動方向であるx方向を主移動方向としてレーザ光の照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う。
　ここで、主移動方向は、試料ステージ１４を二方向に移動させて該試料ステージ上に載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で励起ビームの照射点を間欠移動させて該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う際の移動回数がより多い方向、あるいは総移動距離がより長い方向ということができる。また、主移動方向は、試料ステージ１４を二方向に移動させて該試料ステージ上に載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で励起ビームの照射点を間欠移動させて該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う際に、隣接する3以上の測定点が順に質量分析される方向（典型的には、一端から他端に向かって隣接する測定点が順に質量分析される方向）であるということもできる。
　第２リニアガイド１５２が試料ステージ１４と第１リニアガイド１５１の両方を移動させるのに対し、第１リニアガイド１５１は試料ステージ１４のみを移動させるため、移動時の負荷が小さく、第２リニアガイド１５２によって試料ステージ１４をy方向に移動させる時に比べると、第１リニアガイドによって試料ステージ１４をx方向に試料ステージを移動させる時の方が、試料ステージ１４の停止時に生じる振動が小さくなる。従って、x方向への試料ステージの移動時に加速度を大きくしても測定点間の移動時に試料ステージ１４を停止する際の振動が小さく抑えられ、レーザ光の照射位置にずれが生じにくくなる。
　y方向への試料ステージ１４への移動時の振動を抑えるためには、試料ステージ１４のy方向への移動時の加速度をx方向への移動時よりも小さく抑えればよい。y方向への試料ステージ１４の移動回数はx方向への試料ステージ１４の移動回数よりも少ないため、y方向への試料ステージ１４の移動時の加速度を小さく抑えてもイメージング質量分析の全実行時間への影響は小さい。例えば、試料の目的領域に100点×100点の測定点を設定して上記実施例のように質量分析を行う場合、x方向への試料ステージ１４の移動回数が9900回であるのに対し、y方向への試料ステージ１４の移動回数は100回と少ない。仮にy方向への試料ステージ１４の移動時の加速度をx方向への試料ステージ１４の移動時の加速度よりも小さくした結果、y方向への試料ステージ１４の移動時間がx方向への試料ステージ１４の移動時間の5倍かかるとしても、イメージング質量分析全体における試料ステージ１４の移動時間は4%程度増えるに過ぎない。測定点の数がより多くなると、上記の影響はより小さくなる。測定点の数が少ない場合は、そもそもイメージング質量分析に要する時間そのものがそれほど長くないため、試料ステージ１４の移動時間を議論する必要がない。
　試料ステージ１４の移動時の加速度をx方向への移動時よりも小さくするには、第１リニアガイド１５１と第２リニアガイド１５２に異なる構成のものを用いればよい。あるいは、第１リニアガイド１５１と第２リニアガイド１５２に同じ構成のものを使用し、測定制御部３２１から両者に異なる形態の制御信号を送信するようにしてもよい。
　なお、試料ステージ１４の移動時に負荷を生じさせる部品を軽量化することも振動を減らす有効な手段である。上記実施例において、こうした部品を軽量化すれば、さらに試料ステージ１４の加速度を大きくしつつ試料ステージ１４の振動が抑制することが可能になる。また、ステージ自体の剛性を上げることも有効である。ただし、これらの方策は、本発明において必須ではなく、必要に応じて、またコストを勘案して適宜行えばよい。
　以下、本実施例の質量分析方法及び質量分析装置により得られる効果を確認した実験の結果を説明する。
　図４は、従来のイメージング質量分析方法により試料ステージを移動させ、停止時に生じる振動の大きさをレーザ変位計で測定したものである。図４では、上記実施例同様のステージ移動機構１５を使用し、第２リニアガイド１５２による試料ステージ１４の移動方向であるy方向を主方向として試料ステージ１４を移動した。このような従来の質量分析方法では、試料ステージの停止後、50msec程度経過するまで試料ステージ位置が最大±2μm程度振動している。このように試料ステージが振動している状態のままで数十kHzもの高速のパルスレーザ光を照射すると、レーザ光の照射位置が最大±2μmばらつく。つまり、レーザ光の照射位置が最大で4μmもずれることになり、たとえ5μm以下までレーザを集光していたとしても、それに見合うだけの空間分解能は得られない。
　上記のような空間分解能の悪化を避けるためには、従来、試料ステージの振動が減衰するまで待つか、パルスレーザ光の繰り返し周波数を遅くしなければならず、イメージング質量分析の高速化を妨げる要因になっていた。なお、従来のイメージング質量分析装置の中には、試料ステージを３方向にそれぞれ移動させる移動機構のうち、最も下方に位置する移動機構により試料ステージを移動する方向を主方向として質量分析を行うものもあるが、こうした装置では、試料ステージを主方向に移動及び停止する際に、2つの移動機構を同時に移動及び停止させることになる（つまり上記の従来例よりも、移動及び停止する移動機構の数が1つ多くなる）ため、試料ステージの移動及び停止時に生じる負荷が上記の従来例よりもさらに大きく、図４に示すよりも大きな振動が生じることが容易に推測される。
　図５は、上記実施例のイメージング質量分析方法により試料ステージを移動させ、停止時に生じる振動の大きさをレーザ変位計で測定したものである。図４との比較から、試料ステージ１４の停止時に生じる振動の大きさが従来の半分程度にまで減少していることがわかる。
　上記実施例は一例であって、本発明の趣旨に沿って適宜に変更することができる。上記実施例では、測定制御部３２１によってステージ移動機構１５の動作を制御して試料ステージ１４を移動する構成としたが、使用者が自らステージ移動機構１５を動作させて試料ステージ１４を移動してもよい。
　また、上記実施例では、図６に示すように、測定開始点からx軸の正方向に隣接する測定点に順に移動して質量分析を行い、x方向の端部に位置する測定点からy方向に隣接する測定点に移動したあと、x軸の負方向に隣接する測定点に順に移動して質量分析を行ったが、測定点間を移動する順序はこれに限定されない。例えば、図７に示すように、x方向に並ぶ測定点を一端側から他端側まで質量分析したあと、該一端側の測定点とy方向に隣接する測定点に移動し、該測定点から順に、x方向に並ぶ測定点を一端側から他端側まで質量分析する（即ち、y方向に関して同じ位置にある複数の測定点間をx軸の正方向のみに移動して質量分析する）ようにしてもよい。また、図６及び図７では複数の測定点を格子状に配置した例を示したが、ハニカム状等の配置とすることもできる。
　さらに、上記実施例では、試料ステージ１４のステージ面が鉛直面となるようにイオン化部１０を構成したが、ステージ面が水平面となるようにイオン化部１０を構成してもよい。
　上記実施例はMALDI法によりイオンを生成して質量分析するものとしたが、マトリックス物質を使用しないLDI（レーザ脱離イオン化）法によりイオンを生成する場合にも上記同様の構成を用いることができる。また、上記実施例ではレーザ光を用いて試料表面の物質をイオン化したが、電子線等の他の種類の励起ビームを使用する場合にも上記実施例と同様の構成を用いることができる。
［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）
　一態様は、試料ステージを該試料ステージに平行な面内の第１方向に移動させる第１移動機構と、該第１移動機構を該試料ステージに平行な面内の該第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２移動機構とを備えた質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
　前記試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、前記第１方向を主移動方向として励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う
　ものである。
（第２項）
　別の一態様である質量分析装置は、
　試料が載置される試料ステージと、
　前記試料ステージを該試料ステージに平行な面内の前記第１方向に移動させる第１駆動機構と、
　前記第１駆動機構を該試料ステージに平行な面内の前記第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２駆動機構と、
　前記試料ステージに励起ビームを照射する励起ビーム光学系と、
　前記試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、前記第１方向を主移動方向として前記励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う測定制御部と
　を備える。
　第１項に記載の質量分析方法及び第２項に記載の質量分析装置では、試料ステージを該試料ステージに平行な面内の第１方向に移動させる第１移動機構と、該第１移動機構を該試料ステージに平行な面内の該第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２移動機構とを備えた質量分析装置を用いて質量分析を行う。第１項に記載の質量分析方法及び第２項に記載の質量分析装置では、試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、第１方向を主移動方向として励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う。即ち、測定開始点において質量分析を行ったあと、測定開始点から主移動方向に隣接する測定点に励起ビームの照射点を移動させて質量分析を行うという動作を繰り返し行い、主移動方向の最後の測定点における質量分析が完了すると、二次元配置のもう一方（副移動方向）に試料ステージを移動させ、該最後の測定点に隣接する測定点について測定を行う。その後、再び主移動方向に沿って各測定点の質量分析を行っていく。
　第２駆動機構が試料ステージと第１駆動機構の両方を移動させるのに対し、第１駆動機構は試料ステージのみを移動させるため移動時の負荷が小さく、第２方向に試料ステージを移動させる時に比べて、第１方向に試料ステージを移動させる時の方が、試料ステージの停止時に生じる振動が小さくなる。従って、第１方向への試料ステージの移動時に加速度を大きくしても測定点間の移動時に試料ステージを停止する際の振動が小さく抑えられ、励起ビームの照射位置にずれが生じにくくなる。従って、イメージング質量分析の空間分解能を維持しつつ該分析を高速化することができる。
（第３項）
　第２項に記載の質量分析装置において、
　前記第１駆動機構により前記試料ステージを移動させる際の加速度が、前記第２駆動機構により前記試料ステージを移動させる際の加速度よりも大きい。
　第１駆動機構が移動させる対象物が試料ステージのみであるのに対し、第２駆動機構が移動させる対象物は試料ステージ及び第１駆動機構であり、後者の方が重い。第３項に記載の質量分析装置では、第１駆動機構により試料ステージを第１方向（主移動方向）に移動させる際の加速度が、第２駆動機構により試料ステージを第２方向に移動させる際の加速度よりも大きくする。これにより、第１方向（主移動方向）への試料ステージの移動に要する時間を短縮し、また第２方向への試料ステージの移動時に生じる振動を抑制することができる。
　第１方向（主移動方向）への試料ステージの移動回数に比べて第２方向への移動回数は少ないため、第２方向に試料ステージを移動させる際の加速度を第１方向に試料ステージを移動させる際の加速度よりも低く抑えても質量分析の全実行時間への影響は小さく抑えられる。なお、第３項に記載の質量分析装置は、第１駆動機構と第２駆動機構に異なる構成のものを用いることによって上記要件を満たすようにしてもよく、第１駆動機構と第２駆動機構に同じ構成のものを用い、測定制御部から両者に異なる形態の制御信号を送信する等によって上記要件を満たすようにしてもよい。
（第４項）
　第２項又は第３項に記載の質量分析装置において、
　前記励起ビーム光学系が、レーザ光を発するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられるレーザ光を集光する集光レンズを含む。
　励起ビームの中でもレーザ光は特に微小径に集光することが可能であり、第４項に記載の質量分析装置のように、微小径に集光されたレーザ光を用いて高空間分解能の質量分析を行う場合に、第２項又は第３項に記載の質量分析装置を好適に用いることができる。
（第５項）
　第４項に記載の質量分析装置において、
　前記集光レンズによるレーザ光の集光径が5μm以下である。
　第４項に記載の質量分析装置は、第５項に記載の質量分析装置のように、5μm以下の径に集光したレーザ光を用いた高空間分解能のイメージング質量分析を行う装置において特に好適に用いることができる。
（第６項）
　第４項又は第５項に記載の質量分析装置において、
　前記試料が、前記レーザ光を吸収するマトリックス物質が混合されたものである。
　最近では、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（MALDI）法を使用するイメージング質量分析装置が広く普及している。MALDIをはじめとするレーザイオン化法では、信頼性の高いデータを取得するために、通常、各測定点で数十～数百回のレーザ光の照射及び質量分析を行って、測定点毎に複数のマススペクトルデータを取得し、それらを積算、平均する等の処理を行っている。近年では、MALDIに適した紫外領域のレーザにおける高周波数化が急速に進み、数十kHzもの高速繰り返し周波数で動作可能な紫外半導体レーザが登場している。また質量分析部においても分析が高速化され、1秒間に数十の測定点の質量分析が可能になっている。これらを用いることにより、現実的な時間で試料切片全体(20～30mm角)を5μm以下の高空間分解能で分析することも可能になってきている。つまり、第６項に記載のようにMALDI法で試料をイオン化してイメージング質量分析を行う装置として、第４項又は第５項に記載の質量分析装置を好適に用いることができる。
（第７項）
　第２項から第６項のいずれかに記載の質量分析装置において、さらに、
　前記第２駆動機構を前記試料ステージの試料載置面と非平行な第３方向に移動させる第３駆動機構
　を備える。
　第７項の質量分析装置では、例えば励起ビーム光学系と試料ステージの間の距離を変化させ、試料ステージ上に載置される試料の表面に励起ビームを集束させるように該距離を調整することができる。
１…イメージング質量分析装置
１０…イオン化部
　１１…レーザ光源
　１２…反射鏡
　１３…集光レンズ
　１４…試料ステージ
　１５…ステージ移動機構
　　１５１…第１リニアガイド
　　１５２…第２リニアガイド
　　１５３…第３リニアガイド
　１６…顕微鏡
　１７…開口
　１９…筐体
２０…質量分析部
　２１…開口
３０…制御・処理部
　３１…記憶部
　３２…質量分析用ソフトウェア
　　３２１…測定制御部
　　３２２…測定点設定部
　　３２３…イメージング質量分析データ作成部
４０…入力部
５０…表示部

Claims (7)

  1. 　試料ステージを該試料ステージに平行な面内の第１方向に移動させる第１移動機構と、該第１移動機構を該試料ステージに平行な面内の該第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２移動機構とを備えた質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
    　前記試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、前記第１方向を主移動方向として励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う、質量分析方法。
  2. 　試料が載置される試料ステージと、
    　前記試料ステージを該試料ステージに平行な面内の前記第１方向に移動させる第１駆動機構と、
    　前記第１駆動機構を該試料ステージに平行な面内の前記第１方向とは異なる第２方向に移動させる第２駆動機構と、
    　前記試料ステージに励起ビームを照射する励起ビーム光学系と、
    　前記試料ステージに載置される試料に二次元的に配置された複数の測定点の間で、前記第１方向を主移動方向として前記励起ビームの照射点を間欠移動させ、該複数の測定点のそれぞれにおいて質量分析を行う測定制御部と
    　を備える質量分析装置。
  3. 　前記第１駆動機構により前記試料ステージを移動させる際の加速度が、前記第２駆動機構により前記試料ステージを移動させる際の加速度よりも大きい、請求項２に記載の質量分析装置。
  4. 　前記励起ビーム光学系が、レーザ光を発するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられるレーザ光を集光する集光レンズを含む、請求項２に記載の質量分析装置。
  5. 　前記集光レンズによるレーザ光の集光径が5μm以下である、請求項４に記載の質量分析装置。
  6. 　前記試料が、前記レーザ光を吸収するマトリックス物質が混合されたものである、請求項４に記載の質量分析装置。
  7. 　さらに、
    　前記第２駆動機構を前記試料ステージの試料載置面と非平行な第３方向に移動させる第３駆動機構
    　を備える、請求項２に記載の質量分析装置。
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